BRPI0616158A2 - modulação de expressão de receptor de glucagon - Google Patents

Abstract

MODULAçãO DE EXPRESSãO DE RECEPTOR DE GLUCAGON. Compostos, composições e métodos são providos para modula- ção da expressão de receptor de glucagon. As composições compreendem compostos de anti-sentido, particularmente oligonucleotídeos de anti-sentido que têm propriedades particulares in vivo, objetivados para ácidos nuclélcos que codificam receptor de glucagon. Métodos de uso destes compostos para modulação de expressão de receptor de glucagon e para tratamento de do- enças são providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA-ÇÃO DE EXPRESSÃO DE RECEPTOR DE GLUCAGON".CAMPO DA INVENÇÃO

Descrito aqui estão compostos, composições e métodos paramodulação de expressão de receptor de glucagon em uma célula, tecido ouanimal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A manutenção de glicemia normal é um evento metabólico cui-dadosamente regulado. Glucagon, o peptídeo de 29 aminoácidos responsá-vel pela manutenção dos níveis de glicose no sangue, aumenta a liberaçãode glicose a partir do fígado pela ativação de glicogenólise hepática e gluco-neogênese, e também estimula lipólise em tecido adiposo. No estado ali-mentado, quando glicose exógena é consumida conduzindo a altos níveis deglicose no sangue, a insulina inverte o intensificador mediado por glucagonde glicogenólise e gluconeogênese. Em pacientes com diabetes, a insulinaé, ou não-disponível, ou não totalmente efetiva. Enquanto o tratamento dediabetes tem tradicionalmente se focalizado no aumento dos níveis de insu-lina, o antagonismo da função de glucagon tem sido considerado como umaterapia alternativa. À medida que o glucagon exerce seus efeitos fisiológicospor sinalização através do receptor de glucagon (também conhecido comoGCGR ou GR), o receptor de glucagon tem sido proposto como um alvo te-rapêutico potencial para diabetes (Madsen et al., Curr. Pharm. Des., 1999, 5, 683-691).

O receptor de glucagon pertence a superfamília de receptoresacoplados a proteína G tendo sete domínios de transmembrana. Ele é tam-bém um membro da subfamília menor de receptores homólogos que ligampeptídeos que são estruturalmente similares a glucagon. O gene que codifi-ca receptor humano de glucagon foi clonado em 1994, e a análise da se-qüência genômica revelou íntrons múltiplos, e uma identidade de 82% para oreceptor de rato de gene de glucagon (Lok et al., Gene, 1994, 140, 203-209.;MacNeiI et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 198, 328-334). Aclonagem do receptor de rato de gene de glucagon também conduz a des-crição de variantes de união alternativas múltiplas (Maget et al., FEBS Lett.,1994, 351, 271-275). É descrito na Patente dos Estados Unidos 5.776.725uma seqüência de ácido nucléico isolado que codifica um receptor humanoou de rato de glucagon (Kindsvogel et al., 1998). O receptor humano de ge-ne de glucagon está localizado no cromossomo 17q25 (Menzel et al., Ge-nomics, 1994, 20, 327-328). A mutação sem sentido de Gly em Ser no códon40 no receptor de gene de glucagon conduz a uma afinidade 3 vezes inferiorpara glucagon (Fujisawa et al., Diabetologia, 1995, 38, 983-985), e esta mu-tação tem sido ligada a vários estados de doença, incluindo diabetes mellitusnão-dependente de insulina (Fujisawa et al., Diabetologia, 1995, 38, 983-985), hipertensão (Chambers and Morris, Nat. Genet., 1996, 12, 122), e adi-posidade central (Siani et al., Obes. Res., 2001, 9, 722-726). O rompimentoalvo do receptor de gene de glucagon em camundongos tem mostrado que,apesar de uma ausência total de receptores de glucagon e níveis de gluca-gon de plasma elevado, os camundongos mantêm glicemia perto da normale Iipidemia (Parker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 290, 839-843).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção é dirigida a compostos oligoméricos alveja-dos para e hibridizáveis com uma molécula de ácido nucléico que codificaGCGR que moduia a expressão de GCGR, e possui farmacocinéticas aper-feiçoadas conforme comparadas a oligonucleotídeos alvos para GCGRcompreendendo uma região de folga de 10-desoxinucleotídeos flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Sãoprovidos aqui oligonucleotídeos referidos como "gapmers", compreendendouma região de desoxinucleotídeo ou "folga" flanqueada em cada um de seusterminais 5' e 3' com "asas" compreendidas de um a quatro 2'-0-(2-me-toxietil) nucleotídeos. As regiões de desoxinucleotídeo dos oligonucleotídeos da invenção são compreendidas de mais do que dez desoxinucleotídeos;desse modo, os "gapmers" da presente invenção são "folgas ampliadas"conforme comparado' a compostos quiméricos compreendendo uma regiãode folga de dez desoxinucleotídeos, tais como são exemplificadas na Publi-cação dos Estados Unidos 2005-0014713, que é aqui incorporada por refe-rência em sua totalidade. As concentrações de rim dos oligonucleotídeos defolga ampliada tendo como alvo GCGR têm se verificado serem diminuídascom relação àquelas de oligonucleotídeos tendo à mesma seqüência, mascompreendendo uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada em am-bos os terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, enquantomantém os oligonucleotídeos de potência boa a excelente no fígado. Dessemodo, concretizações da presente invenção incluem oligonucleotídeos defolga ampliada tendo como alvo GCGR no qual concentrações de rim de re-ferido oligonucleotídeo são diminuídas com relação a um oligonucleotídeotendo à mesma seqüência, mas compreendendo uma região de dez desoxi-nucleotídeos flanqueada em ambos terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Outra concretização da presente invenção incluioligonucleotídeos de folga ampliada tendo como alvo GCGR no qual concen-trações de rim de referido oligonucleotídeo são comparáveis a ou diminuídascom relação àquelas de um oligonucleotídeo tendo à mesma seqüência,mas compreendendo uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada emambos os terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, en-quanto mantém ou aperfeiçoa a potência em tecidos-alvo, tal como fígado.

Em algumas concretizações, conforme comparado aos oligonu-cleotídeos tendo à mesma seqüência, frias compreendendo uma região dedez desoxinucleotídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com cinco2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, oligonucleotídeos de folga ampliada têmpotência aperfeiçoada ou comparável sem acúmulo aumentado de oligonu-cleotídeo no fígado. Desse modo, concretizações da presente invenção in-cluem oligonucleotídeos de folga ampliada que têm como alvo GCGR noqual a potência é comparável a ou melhor do que aquela de um oligonucleo-tídeo tendo à mesma seqüência, mas compreendendo uma região de dezdesoxinucleotídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com cinco 2'-o-(2-metoxietil) nucleotídeos sem acúmulo aumentado de nos tecidos-alvo.

São adicionalmente providos métodos de modulação da expres-são de GCGR em células, tecidos ou animais, compreendendo contactarreferidas células, tecidos ou animais com um ou mais dos compostos oucomposições da presente invenção. Por exemplo, em uma concretização, oscompostos ou composições da presente invenção podem ser usados parareduzir a expressão de GCGR em células, tecidos ou animais. A presenteinvenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo um oligonu-cleotídeo de anti-sentido da invenção e, opcionalmente, um veículo farma-ceuticamente aceitável, diluente, excipiente, ou intensificador.

Em uma concretização, a presente invenção proporciona métodos de abaixar glicose no sangue usando os compostos oligoméricos aquidelineados. Em outra concretização, a presente invenção proporciona méto-dos de aumentar níveis de GLP-1 usando os compostos oligoméricos aquidelineados.

Em outras concretizações, a presente invenção é dirigida a mé-todos de melhorar ou diminuir a gravidade de uma condição em um animalcompreendendo contactar o referido animal com uma quantidade efetiva deum composto oligomérico ou uma composição farmacêutica da invenção.Em outras concretizações, a presente invenção é dirigida a métodos de me-lhorar ou diminuir a gravidade de uma condição em um animal compreen-dendo contactar referido animal com uma quantidade efetiva de um compos-to oligomérico ou uma composição farmacêutica da invenção, de modo queexpressão de GCGR é reduzida, e medição de um ou mais Indicadores físi-cos de referida condição indica uma diminuição da gravidade de referidacondição. Em algumas concretizações, a doença ou condição é uma doençametabólica ou condição. Em algumas concretizações, as condições incluem,mas não estão limitadas a, diabetes, obesidade, resistência à insulina, e de-ficiência de insulina. Em algumas concretizações, a diabetes é diabetes Tipo2. Em outra concretização, a condição é síndrome metabólica. Em uma con-cretização, a obesidade é induzida por dieta. Também providos são métodosde prevenir ou retardar o começo de níveis de glicose elevados no sangueem um animal compreendendo administrar ao referido animal um compostoou composição farmacêutica da invenção. Também provido é um método depreservar a função da célula beta.O presente pedido está também relacionado ao Pedido dos Es-tados Unidos No. 60/718.685, que é aqui incorporado por referência em suatotalidade. O presente pedido está também relacionado ao Pedido dos Esta-dos Unidos No. 11/231.243 e Pedido PCT No. PCT/US2005/033837, cadaum do qual sendo aqui incorporado por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

Uma forma legível de computador da listagem de seqüência, emdisquete, contendo o arquivo denominado BIOLOO66WOSEQ.txt, que tem29.184 bytes (medido em MS-DOS) e foi criado em 19 de setembro de 2006,é aqui incorporado por referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA:

Visão Geral

São descritos aqui compostos oligoméricos, incluindo oligonu-cleotídeos de anti-sentido e outros compostos de anti-sentido para uso namodulação da expressão de moléculas de ácido nucléicos que codificamGCGR. Isto é acompanhando pela provisão de compostos oligoméricos quehibridizam com uma ou mais moléculas alvos de ácidos nucléicos que codifi-cam GCGR.

De acordo com a presente invenção são composições e méto-dos para modulação da expressão de GCGR (também conhecidos comoreceptor de glucagon ou GR). Listados ria Tabela 1 estão números de aces-so no GENBANK® de seqüências que podem ser usadas para designarcompostos oligoméricos alvejados para GCGR. Os compostos oligoméricosda invenção incluem compostos oligoméricos que hibridizam com uma oumais moléculas alvos de ácido nucléicos mostradas na Tabela 1, bem comocompostos oligoméricos que hibridizam para outras moléculas de ácido nu-cléico que codificam GCGR.

Os compostos oligoméricos podem ter como alvo qualquer regi-ão, segmento, ou sítio de moléculas de ácido nucléico que codificam GCGR.Regiões-alvo adequadas, segmentos, e sítios incluem, mas não estão limita-das a, o 5'UTR, o códon de partida, o códon de parada, a região de codifica-ção, o 3'UTR, a região de capa 5', íntrons, éxons, junções íntron-éxon, jun-ções éxon-íntron, e junções éxon-éxon.

Tabela 1

Genes Alvos

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As localizações no ácido nucléico-alvo a qual compostos oligo-méricos ativos hibridizam são aqui abaixo referidas como "segmentos-alvovalidados." Conforme aqui usado, o termo "segmento-alvo validado" é defini-do como pelo menos uma porção de 8-nucleobases de uma região-alvo aqual um composto oligomérico ativo é alvejado. Conquanto não desejandoestar ligado pela teoria, acredita-se atualmente que estes segmentos-alvorepresentam porções do ácido nucléico-alvo que são acessíveis para hibridi-zação.

A presente invenção inclui compostos oligoméricos que sãocompostos quiméricos. Um exemplo de um composto quimérico é um "gap-mer" tendo uma região de 2'-desoxinucleotídeo ou "folga" flanqueada porregiões de não-desoxinucleotídeo ou "asas". Conquanto não desejando es-iar ligado pela teoria, a folga do "gapmer" apresenta um substrato reconhe-cível por RNase H quando ligado ao RNA alvo onde as asas não são umsubstrato ótimo, mas podem conferir outras propriedades, tais como contri-buição para estabilidade dúplex ou efeitos farmacocinéticos vantajosos. Ca-da asa pode ser um ou mais monômeros de oligonucleotídeo não-desóxi.Em uma concretização, o "gapmer" é compreendido de uma região de de-zesseis 2'-desoxinucleotídeo flanqueada em cada um dos terminais 5' e 3'pelas asas de dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Isto é referido como um2-16-2 "gapmer". Desse modo, o "motivo" deste composto oligomérico qui-mérico ou "gapmer" é 2-16-2. Em outra concretização, todas as ligações deinternucleosídeos são ligações de fosforotioatos. Em outra concretização, ascitosinas do "gapmer" são 5-metilcitosinas.

Concretizações da presente invenção incluem compostos oligo-méricos compreendendo seqüências de 13 a 26 nucleotídeos de comprimen-to, e compreendendo uma região de nucleotídeo desóxi maior do que 10nucleobases de comprimento flanqueada em cada um dos terminais 5' e 3'com pelo menos um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo. Oligonucleotídeos de"folga ampliada" preferidos compreendem 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18desoxinucleotídeos na porção de folga do oligonucleotídeo. Também preferi-dos são oligonucleotídeos de anti-sentidos de 20 nucleobases de compri-mento. Regiões de flanqueamento preferidas 5' e 3' compreendem 1, 2, 3,ou 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Oligonucleotídeos preferidos de folgaampliada têm motivos incluindo 1-18-1, 1-17-2, 2-17-1, 2-16-2, 3-14-3, e 4-12-4.

Em concretizações preferidas, os compostos oligoméricos alve-jam ou hibridizam com GCGR. Em outra concretização, os compostos oli-goméricos reduzem a expressão de GCGR. Em outras concretizações, oscompostos oligoméricos reduzem a expressão de GCGR no qual a expres-são de GCGR é reduzida por pelo menos 10%, por pelo menos 20%, porpelo menos 30%, por pelo menos 40%, por pelo menos 50%, por pelo me-nos 60%, por pelo menos 70%, por pelo menos 80%, por pelo menos 90%,ou por 100%.

Os oligonucleotídeos da presente invenção preferivelmente in-cluem aqueles nos quais concentrações de rim de referido oligonucleotídeosão diminuídas com relação a um oligonucleotídeo tendo a mesma seqüên-cia, mas compreendendo uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueadaem ambos os terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Osoligonucleotídeos da presente invenção incluem aqueles nos quais concen-trações de rim de referido oligonucleotídeo são comparáveis a ou diminuídascom relação àquelas de um oligonucleotídeo tendo a mesma seqüência,mas compreendendo uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueada emambos os terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Osoligonucleotídeos da presente invenção incluem aqueles no qual potênciacom relação a redução-alvo nõ fígado ou um efeito terapêutico é comparávela ou melhor do que aquele de um oligonucleotídeo tendo a mesma seqüên-cia, mas compreendendo uma região de dez desoxinucleotídeos flanqueadaem ambos os terminais 5' e 3' com cinco 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeossem acúmulo aumentado de oligonucleotídeo em tecidos.

A presente invenção proporciona oligonucleotídeos de anti-sentido de 13 a 26 nucleobases de comprimento alvejados para uma molé-cula de ácido nucléico que codifica GCGR, no qual o oligonucleotídeo com-preende uma primeira região, uma segunda região, e uma terceira região, noqual referida primeira região compreende pelo menos 11 desoxinucleotí-deos, e no qual referida segunda região e terceira região compreendem de 1a 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, referidas segunda e terceira regiõesflanqueando a primeira região nos terminais 5' e 3' de referida primeira região.

Em concretizações preferidas, os oligonucleotídeos da invençãohibridizam especificamente para GCGR, e reduzem a expressão de GCGR.Em algumas concretizações, a região de "folga" compreende 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, ou 18 nucleobases. Em algumas concretizações, os oligonucleo-tídeos de anti-sentido são de 20 nucleobases de comprimento.

Os compostos oligoméricos podem compreender cerca de 8 acerca de 80 nucleobases (isto é, de cerca de 8 a cerca de 80 nucleosídeosligados), preferivelmente entre cerca de 13 a cerca de 26 nucleobases. Umtécnico no àssühto~apreciará que os compostos oligoméricos preferidos con-templados incluem compostos que são 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25 ou 26 nucleobases de comprimento.

Os compostos da invenção incluem seqüências de oligonucleo-tídeo que compreendem pelo menos as 8 nucleobases consecutivas a partirdo terminal 5' de um dos compostos de anti-sentido ilustrativos (as nucleo-bases remanescentes sendo um estiramento consecutivo do mesmo oligo-nucleotídeo começando imediatamente à montante do terminal 5' do com-posto de anti-sentido que é especificamente hibridizável ao ácido nucléico-alvo, e continuando até que o oligonucleotídeo compreenda cerca de 13 acerca de 26 nucleobases). Outros compostos são representados pelas se-qüências de oligonucleotídeo que compreendem pelo menos 8 nucleobasesconsecutivas a partir do terminal 3' de um dos compostos de anti-sentidoilustrativos (as nucleobases remanescente sendo um estiramento consecuti-vo do mesmo oligonucleotídeo começando imediatamente à montante doterminal 3' do composto de anti-sentido que é especificamente hibridizávelao ácido nucléico-alvo, e continuando até que o oligonucleotídeo compreen-da cerca de 13 a cerca de 26 nucleobases). É também compreendido que oscompostos podem ser representados pelas seqüências de oligonucleotídeoque compreendem pelo menos 8 nucleobases consecutivas de uma porçãointerna da seqüência de um composto ilustrativo, e podem se estender emqualquer ou ambas as direções até que o oligonucleotídeo contenha cerca de13 a cerca de 26 nucleobases.

A presente invenção proporciona oligonucleotídeos de anti-sentido compreendendo a seqüência de nucleobases de SEQ ID NO: 2 ouSEQ ID NO: 4. Em concretizações preferidas, os oligonucleotídeos da inven-ção compreendem pelo menos 8 porções de nucleobase da seqüência denucleobases de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Em uma concretização preferida, a presente invenção propor-ciona oligonucleotídeo de anti-sentidos de 20 nucleobases de comprimentoalvejada para uma molécula de ácido nucléico que codifica GCGR1 e com-preendendo pelo menos 8 porções de nucleobase de SEQ ID NO: 2 ou 4,no qual o oligonucleotídeo compreende uma região de desoxinucíéotídeo12, 13, 15, 16, 17, ou 18 nucleobases de comprimento que é flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com 1 a 4 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, e noqual o oligonucleotídeo especificamente hibridiza para e reduz expressãode GCGR.

Em uma concretização, as regiões de fIanqueamento são simé-tricas (tendo o mesmo número de nucleotídeos na região de flanqueamento5' como na região de flanqueamento 3'). Em outra concretização, as regiõesde flanqueamento são não-simétricas (tendo um número diferente de nucleo-tídeos na região de flanqueamento 5' comparado à região de flanqueamento3')·

Em outras concretizações, a presente invenção inclui oligonu^cleotídeos de anti-sentido tendo a seqüência de nucleobases de SEQ ID NO:4, ou SEQ ID NO: 2, no qual o oligonucleotídeo de anti-sentido é caracteri-zado por uma região de 12-desoxinucleotídeo flanqueada em seus terminais5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, uma região de 16-desoxinucleotídeo flanqueada em seus terminais 5' e 3' com dois 2'-0-(2-'metoxietil) nucleotídeos, uma região de 17-desoxinucleotídeo flanqueada emseus terminais 5' e 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, ouuma região de 18-desoxinucleotídeo flanqueada em seus terminais 5' e 3'com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

Os oligonucleotídeos de anti-sentido da invenção podem conterpelo menos uma ligação modificada de internucleosídeo. Ligações modifica-das de internucleosídeo incluem ligações de fosforotioato. Em uma concreti-zação, todas as ligações de internucleosídeo em um oligonucleotídeo deanti-sentido são ligações de fosforotioato. Os oligonucleotídeos de anti-sentido da invenção podem também conter pelo menos uma nucleobasemodificada. Em uma concretização, pelo menos uma citosina é uma 5-me-tilcitosina. Em outra concretização, todas as citosinas são 5-metilcitosinas.

Uma concretização da presente invenção é um oligonucleotídeode anti-sentido de 20 nucleobases de comprimento, tendo a seqüência deSEQ ID NO: 2, caracterizada por uma região de 16-desoxinucleotídeo flan-queada em seus terminais 5' e 3' com dois 2'-0-(2-rfretoxietil) nucleotídeosno qual cada ligação é uma ligação de fosforotioato, e cada citosina é uma5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, os oligonucleotídeos de anti-sentido têm a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 2, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 12-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com quatro 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma concretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especifica-mente hibridiza a e reduz expressão de GCGR. Em uma concretização adi-cional, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosfo-rotioato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 2, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 14-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com três 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Em umaconcretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especificamentehibridiza a e reduz expressão de GCGR. Em uma concretização adicional,pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosforotioato.Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metil-citosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 2, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 16-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com dois 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Em umaconcretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido especificamentehibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretização adicio-nal, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosforoti-oato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 2, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem urna região de 17-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com um ou dois 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos.Em uma concretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especifi-camente hibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretiza-ção adicional, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação defosforotioato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina éuma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 2, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 18-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com um 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Em umaconcretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especificamentehibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretização adicio-nal, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosforoti-oato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 4, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 12-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com quatro 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Emuma concretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especifica-mente hibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretizaçãoadicional, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação defosforotioato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina éuma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 4, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 14-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com três 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Em umaconcretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especificamentehibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretização adicio-nal, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosforoti-oato. Em uma concretização adiclohalTpefo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 4, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 16-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com dois 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Em umaconcretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especificamentehibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretização adicio-nal, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosforoti-oato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular^ o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 4, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 17-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com um ou dois 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos.Em uma concretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especifi-camente hibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretiza-ção adicional, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação defosforotioato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina éuma 5-metilcitosina.

Em uma concretização particular, o oligonucleotídeo de anti-sentido tem a seqüência de nucleobase de SEQ ID: 4, no qual o oligonucleo-tídeo de anti-sentido tem uma região de 18-desoxinucleotídeo flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com um 2'-0(2-metoxietil) nucleotídeos. Em umaconcretização adicional, o oligonucleotídeo de anti-sentido especificamentehibridiza para e reduz a expressão de GCGR. Em uma concretização adicio-nal, pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligação de fosforoti-oato. Em uma concretização adicional, pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

Também contemplado aqui é uma composição farmacêuticacomprèendendo um oligonucleotídeo de anti-sentido da invenção e, opcio-nalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, intensificadorou excipiente. Os compostos da invenção podem Também ser usados nafabricação de um medicamento para o tratamento de doenças e enfermida-des relacionadas a efeitos de glucagon mediados por GCGR.

Concretizações da presente invenção incluem métodos de redu-ção da expressão de GCGR em tecidos ou células compreendendo contac-tar referidas células ou tecidos com um oligonucleotídeo de anti-sentido, oucomposição farmacêutica da invenção, métodos de diminuir níveis de glicoseno sangue, níveis de triglicerídeo no sangue, ou níveis de colesterol no san-gue, em um animal compreendendo administrar ao referido animal um oligo-nucleotídeo de anti-sentido, ou uma composição farmacêutica da invenção.Os níveis de sangue podem ser níveis de plasma ou níveis de soro. Tam-bém contemplados são métodos de aperfeiçoar a sensibilidade da insulina,étodos de aumentar os níveis de GLP-1, e métodos de inibir produção deglicose hepática em um animal compreendendo administrar ao referido ani-mal um oligonucleotídeo de anti-sentido, ou uma composição farmacêuticada invenção. Um aperfeiçoamento na sensibilidade da insulina pode ser indi-cado por uma redução na circulação de níveis de insulina.

Outras concretizações da presente invenção incluem métodosde tratar um animal tendo uma doença ou condição associada com atividadede glucagon, via GCGR, compreendendo administrar ao referido animal umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente efetiva de um oligonucleo-tídeo de anti-sentido, ou uma composição farmacêutica da invenção. A do-ença ou condição pode ser uma doença ou condição metabólicas. Em algu-mas concretizações, a doença ou condição metabólicas é diabetes, hipergli-cemia, hiperlipidemia, síndrome metabólica X, obesidade, hiperglucagone-mia primária, deficiência de insulina, ou resistência à insulina. Em algumasconcretizações, a diabetes é Diabetes Tipo 2. Em algumas concretizações, aobesidade é induzida por dieta. Em algumas concretizações, hiperlipidemiaestá associada com níveis elevados de Iipfdeo no sangue. Os lipídeos inclu-em colesterol e triglicerídeos. Em uma concretização, a condição é esteato-se do fígado. Em algumas concretizações, a esteatose é esteatohepatite ouesteatohepatite não-alcoólica.

Também providos são méíõdds de prevenir ou retardar o come-ço de glicose elevada nos níveis de sangue em um animal, bem como méto-dos de preservar a função de célula beta em um animal usando os compos-tos oligoméricos aqui delineados.

Os compostos da invenção podem ser usados para modular aexpressão de GCGR em um animal em necessidade destes, tal como umser humano. Em uma concretização não-limitante, os métodos compreen-dem a etapa de administrar ao referido animal uma quantidade efetiva de umcomposto de anti-sentido que reduz a expressão de GCGR RNA. Em umaconcretização, os compostos de anti-sentido da presente invenção reduzemefetivamente os níveis ou função de GCGR RNA. Devido a redução no GC-GR, os níveis de mRNA podem conduzir a alteração nos produtos de proteí-na de GCGR de expressão também, tais alterações resultantes podendo sertambém medidas. Os compostos de anti-sentido da presente invenção quereduzem efetivamente os níveis ou função de GCGR RNA ou produtos deproteína de expressão são considerados um composto de anti-sentido ativo.Em uma concretização, os compostos de anti-sentido da invenção reduzema expressão de GCGR, causando uma redução de RNA por pelo menos10%, por pelo menos 20%, por pelo menos 25%, por pelo menos 30%, porpelo menos 40%, por pelo menos 50%, por pelo menos 60%, por pelo me-nos 70%, por pelo menos 75%, por pelo menos 80%, por pelo menos 85%,por pelo menos 90%, por pelo menos 95%, por pelo menos 98%, por pelomenos 99%, ou por 100%, conforme medido por um ensaio exemplificadoaqui.

Um técnico no assunto dotado com os compostos de anti-sentido aqui ilustrados será capaz, sem experimentação indevida, de identi-ficar outros compostos de anti-sentido.Mecanismos de Anti-sentido

"Mecanismos de anti-sentido" são todos aqueles envolvendohibridização de um composto com ácido nucléico-alvo, no qual o resultadoou efeito da hibridização é, ou degradação alvo, ou ocupação alvo, com pa-ralisação concomitante da maquinaria celular envolvendo, por exemplo,transcrição ou união.Alvos

Conforme aqui usado, os termos "ácido nucléico-alvo" e "molé-cula de ácido nucléico que codifica GCGR" foram usados por conveniênciapara envolver DNA que codifica GCGR, RNA (incluindo pré-mRNA e mRNA,ou porções destes) transcritos a partir de tal DNA, e também cDNA derivadode tal RNA.

Regiões. Segmentos, e Sítios

O processo de alvejamento usualmente também inclui a deter-minação de pelo menos uma região-alvo, segmento, ou sítio dentro do ácidonucléico-alvo para a interação de anti-sentido ocorrer tal que o efeito deseja-do, por exemplo, modulação de expressão, resultará. "Região" é definidacomo uma porção do ácido nucléico-alvo tendo pelo menos uma estrutura,função ou características identificáveis. Dentro das regiões dos ácidos nu-cléicos-alvo estão segmentos. "Segmentos" são definidos como porçõesmenores ou sub-porções de regiões dentro de um ácido nucléico-alvo. "Sí-tios," conforme usado na presente invenção, são definidos como posições denucleobase únicas dentro de um ácido nucléico-alvo.

Uma vez que uma ou mais Regiões-alvo, segmentos ou sítiostenham sido identificados, os compostos oligoméricos são designados, quesão suficientemente complementares ao alvo, isto é, hibridizam suficiente-mente bem, e com especificidade suficiente para dar o efeito desejado.

Variantes

É também conhecido na técnica que transcrições alternativas deRNA podem ser produzidas a partir da mesma região genômica de DNA.Estas transcrições alternativas são geralmente conhecidas como "variantes."Mais especificamente, "variantes pré-mRNA" são transcrições produzidas apartir do mesmo DNA genômico que difere de outras transcrições produzidasa partir do mesmo DNA genômico na, ou sua posição de partida, ou posiçãode parada, e contém ambas seqüência intrônica e exônica.

Após excisão de uma ou mais regiões de éxon ou íntron, ou por-ções destas durante união, as variantes de pré-mRNA produzem "variantesde mRNA" menores. Conseqtiéhtemehte, as variantes de mRNA são varian-tes de pré-mRNA processadas, e cada variante de pré-mRNA única devesempre produzir uma variante de mRNA única como um resultado de união.Estas variantes de mRNA são também conhecidas como "variantes de uniãoalternativas." Se nenhuma união da variante de pré-mRNA ocorre, então avariante de pré-mRNA é idêntica à variante de mRNA.

É também conhecido na técnica que variantes podem ser produ-zidas através do uso de sinais alternativos para iniciar ou cessar transcrição,e que pré-mRNAs e mRNAs podem possuir mais do que um códon de parti-da ou códon de parada. As variantes que se originam de um pré-mRNA oumRNA que usam códons de partida alternativos são conhecidas como "vari-antes de partida alternativas" daquele pré-mRNA ou mRNA. Aquelas trans-crições que usam um códon de parada alternativo são conhecidas como "va-riantes de parada alternativas" daquele pré-mRNA ou mRNA. Um tipo espe-cífico de variante de parada alternativa é a "variante polyA" na qual as trans-crições múltiplas produzidas resultam da seleção alternativa de um dos "si-nais de parada polyA" pela maquinaria de transcrição, produzindo, dessemodo, transcrições que terminam em sítios de polyA únicos. Conseqüente-mente, os tipos de variantes aqui descritos são também ácidos nucléicos-alvo adequados.

Modulação de Expressão Alvo

"Modulação" significa uma perturbação de função, por exemplo,ou um aumento (estimulação ou indução) ou uma diminuição (inibição ouredução) na expressão. Como outro exemplo, a modulação de expressãopode incluir perturbação da seleção de sítio de união de processamento depré-mRNA. A "expressão" inclui todas as funções pelas quais uma informa-ção codificada de gene é convertida em estruturas presentes e operando emuma célula. Estas estruturas incluem os produtos de transcrição e transla-ção. A "modulação de expressão" significa a perturbação de tais funções. Os"moduladores" são aqueles compostos que modulam a expressão de GC-GR, e que compreendem pelo menos uma porção de 8-nucleobases que écomplementar a um segmento-alvo validado.

A modulação de expressão~de~um ãcidò nucléico-alvo pode seralcançada através da alteração de qualquer número de funções de ácidonucléico (DNA ou RNA). As funções de DNA a serem moduladas podem in-cluir réplica e transcrição. A réplica e transcrição, por exemplo, podem ser deum gabarito celular endógeno, um vetor, um constructo de plasmídeo, ou deoutro modo. As funções de RNA a serem moduladas podem incluir funçõesde translocalização, que incluem, mas não estão limitadas a, translocaliza-ção do RNA para um sítio de translação de proteína, translocalização doRNA para sítios dentro da célula que estão distantes do sítio de síntese deRNA, e translação de proteína a partir do RNA. As funções de processamen-to de RNA que podem ser moduladas incluem, mas não estão limitadas a,uma união do RNA para produzir uma ou mais espécies de RNA, proteçãodo RNA, 3' maturação do RNA e atividade catalítica ou formação de comple-xo envolvendo o RNA que pode ser engajado em, ou facilitado pelo RNA. Amodulação de expressão pode resultar no nível aumentado de uma ou maisespécies de ácido nucléico, ou o nível diminuído de uma ou mais espéciesde ácido nucléico, ou temporalmente ou por nível de estado constante derede. Um resultado de tal interferência com a função de ácido nucléico-alvoé modulação da expressão de GCGR. Desse modo, em uma concretização,a modulação de expressão pode significar aumento ou diminuição no RNAalvo ou níveis de proteína. Em outra concretização, a modulação de expres-são pode significar um aumento ou diminuição de um ou mais produtos deunião de RNA, ou uma mudança na razão de dois ou mais produtos de uni-ão.

Hibridizacão e Complementaridade

"Hibridização" significa o emparelhamento de cepas complemen-tares de compostos oligoméricos. Conquanto não limitado a um mecanismoparticular, o mecanismo mais comum de emparelhamento envolve ligaçãode hidrogênio, que pode ser de ligação de hidrogênio de Watson-Crick, liga-ção de hidrogênio de Hoogsteen, ou ligação de hidrogênio reversa, entrenucleosídeo complementar ou bases de nucleotídeo (nucleobases) das ce-pas de compostos oligoméricos. Por exemplo, adenina e timina são nucleo-bases complementares que se emparelham através da formação de ligaçõesde hidrogênio. A hibridização pode ocorrer sob circunstâncias variadas. Umcomposto oligomérico é especificamente hibridizável quando existe um grausuficiente de complementaridade'para evitar ligação não-específica do com-posto oligomérico à seqüências de ácido não-nucléico-alvos sob condiçõesem que ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas nocaso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico, e sob condições nasquais ensaios são realizados no caso de ensaios in vitro.

"Condições de hibridização severas" ou "condições sevaras" sereferem a condições sob as quais um composto oligomérico hibridizará parasua seqüência-alvo, mas a um número mínimo de outras seqüências. Condi-ções severas são dependentes da seqüência, e serão diferentes em circuns-tâncias diferentes, e "condições severas" sob as quais compostos oligoméri-cos hibridizam a uma seqüência-alvo são determinadas pela natureza ecomposição dos compostos oligoméricos, e os ensaios nos quais estão sen-do investigados.

"Complementaridade," conforme aqui usado, se refere a capaci-dade de emparelhamento preciso entre duas nucleobases em uma ou duascepas de composto oligomérico. Por exemplo, se uma nucleobase em umacerta posição de um composto de anti-sentido é capaz de se ligar a hidrogê-nio com uma nucleobase em uma posição de um ácido nucléico-alvo, emseguida a posição de ligação de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e o áci-do nucléico-alvo é considerada ser uma posição complementar. O compostooligomérico e o DNA ou RNA adicional são complementares um ao outroquando um número suficiente de posições complementares em cada molé-cula é ocupado por nucleobases que podem ligar hidrogênio um ao outro.Desse modo, "especificamente hibridizável" e "complementar" são termosque são usados para indicar um grau suficiente de emparelhamento precisoou complementaridade sobre um número suficiente de nucleobases tal queligação estável e específica ocorre entre o composto oligomérico e um ácidonucléico-alvo.

É compreendido na técnica que a seqüência de um compostooligomérico não-necessita ser 100% complementar aquela de seu ácido nu-cléico-alvo para ser especificamente hibridizável. Além disso, um oligonucle-otídeo pode hibridizar sobre um ou mais segmentos, tal que segmentos deintervenção ou adjacentes não são envolvidos no evento de hibridização (porexemplo, uma estrutura de laço, estrutura de desequiparação, ou grampo decabelo). Os compostos oligoméricos da presente invenção compreendempelo menos 70%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos85%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 92%, ou pelo menos 95%, ou pelomenos 97%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99% da complementarida-de de seqüência para uma região-alvo dentro da seqüência de ácido nucléi-co-alvo a qual eles são alvos. Por exemplo, um composto oligomérico noqual 18 de 20 nucleobases do composto de anti-sentido são complementa-res para uma região-alvo, e, portanto, hibridizariam especificamente, e re-presentariam 90 por cento de complementaridade. Neste exemplo, as nucle-obases não-complementares remanescentes podem ser agrupadas ou inter-espersadas com nucleobases complementares, e não necessitam seremcontíguas uma à outra, ou às nucleobases complementares. Como tal, umcomposto oligomérico que é de 18 nucleobases de comprimento tendo 4(quatro) nucleobases não-complementares que são flanqueadas por duasregiões de complementaridade completa com o ácido nucléico-alvo teria77,8% de complementaridade total com o ácido nucléico-alvo e cairia, dessemodo, dentro do escopo da presente invenção. A percentagem de comple-mentaridade de um composto oligomérico com uma região de um ácido nu-cléico-alvo pode ser determinada rotineiramente usando-se programasBLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamento sítio básico) e programasPowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215,403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). A percenta-gem de homologia, identidade de seqüência ou complementaridade, podemser determinadas por, por exemplo, o programa Gap (Wisconsin SequenceAnalysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, UniversityResearch Park, Madison Wl), usando-se ajustes de omissão, que usa o al-goritmo de Smith e Watermoan (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

Compostos oHaoméricos

O termo "composto oligomérico" se refere a uma estrutura poli-mérica capaz de hibridizar a uma região de uma molécula de ácido nucléico.Este termo inclui oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos de oligonu-cleotídeo, oligonucleotídeos miméticos, e combinações quiméricas destes.Os compostos oligoméricos são rotineiramente preparados linearmente, maspodem ser unidos ou, de outro modo, preparados para serem circulares. A-lém disso, estruturas ramificadas são conhecidas na técnica. Um "compostode anti-sentido" ou "composto oligomérico de anti-sentido" se refere a umcomposto oligomérico que é pelo menos parcialmente complementar à regi-ão de uma molécula de ácido nucléico a qual ele hibridiza, e que modula(aumenta ou diminui) sua expressão. Conseqüentemente, enquanto todos oscompostos de anti-sentido podem ser referidos para serem compostos oli-goméricos, nem todos os compostos oligoméricos são compostos de anti-sentido. Um "oligonucleotídeo de anti-sentido" é um composto de anti-sentido que é um oligômero baseado em ácido nucléico. Um oligonucleotí-deo de anti-sentido pode ser quimicamente modificado. Exemplos não-Iimitativos de compostos oligoméricos incluem iniciadores, sondas, compos-tos de anti-sentido, oligonucleotídeos de anti-sentido, oligonucleotídeos deseqüência de guia externa (EGS), Iigadores alternados, e siRNAs. Como tal,estes compostos podem ser introduzidos na forma de trançado simples,trançado duplo, circular, ramificado, ou de grampo de cabelo, e podem con-ter elementos estruturais, tais como saliências internas ou terminais, ou la-ços. Os compostos oligoméricos de trançado duplo pode ser de duas trançaspara formarem compostos de duas tranças, ou de trança simples, com auto-complementaridade suficiente para permitir hibridização e formação de umcomposto totalmente ou parcialmente de trançado duplo.

Compostos oligoméricos "quiméricos" ou "quimeras," no contex-to desta invenção, são compostos oligoméricos de trançado simples ou du-plo, tais como oligonucleotídeos, que contêm duas ou mais regiões quimi-camente distintas, cada uma compreendendo pelo menos uma unidade demonômero, isto é, um nucleotídeo no caso de composto de oligonucleotídeocomposto.

Um "gapmer" é definido como um composto oligomérico, geral-mente um oligonucleotídeo, tendo uma região de 2'-deoxioligonucleotídeoflanqueada por segmentos de não-deoxioligonucleotídeo. A região central éreferida como a "folga." Os segmentos de fIanqueamento são referidos como"asas." Se uma das asas tem monômeros de não-deoxioligonucleotídeo, um"hemímero" é descrito.

NAFLD

O termo "doença de fígado de gordura não-alcoólica" (NAFLD)envolve um espectro de doença variando de acúmulo de triglicerídeo simplesem hepatócitos (esteatose hepática) a esteatose hepática com inflamação(esteatohepatite), fibrose, e cirrose. Esteatohepatite não-alcoólica (NASH)ocorre a partir da progressão de NAFLD além da deposição de triglicerídeos.Um segundo grupo capaz de induzir necrose, inflamação, e fibrose é reque-rido para desenvolvimento de NASH. Os candidatos para o segundo grupopodem ser agrupados em categorias amplas: fatores que causam um au-mento na tensão oxidante, e fatores que promovem expressão de citoquinaspró-inflamatórias. Foi sugerido que triglicerídeos aumentados no fígado con-duzem a tensão oxidante nos hepatócitos de animais e seres humanos, indi-cando um relacionamento potencial de causa e efeito entre acúmulo de tri-glicerídeo hepático, tensão oxidante, e a progressão de esteatose hepáticapara NASH (Browning and Horton, J. Clin. Invest., 2004, 114, 147-152). Ahipertrigliceridemia e hipergorduracidemia podem causar acúmulo de triglice-rídeo em tecidos periféricos (Shimamura et al., Biochem. Biophys. Res.Commun., 2004, 322, 1080-1085). Uma concretização da presente invençãoé um método de reduzir lipídeos no fígado de um animal por administrar umaquantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um compostooligomérico da invenção. Outra concretização da presente invenção é ummétodo de tratar esteatose hepática em um animal por administrar umaquantidade profilaticamente ou terapeuticamente efetiva de um compostooligomérico da invenção. Em algumas concretizações, a esteatose é estea-tohepatite. Em algumas concretizações, a esteatose é NASH.

Modificações Químicas

Nucleobases Modificadas e Alternadas

Os compostos oligoméricos da invenção também incluem varian-tes em que uma base diferente está presente em uma ou mais das posiçõesde nucleotídeo no composto. Por exemplo, se o primeiro nucleotídeo é umaadenosina, variantes podem ser produzidas contendo timidina, guanosina oucitidina nesta posição. Isto pode ser feito em quaisquer das posições docomposto oligomérico. Estes compostos são, em seguida, testados usando-se os métodos aqui descritos para determinar sua capacidade de reduzirexpressão de GCGR mRNA.

Os compostos oligoméricos podem também incluir modificaçõesou substituições de nucleobase (freqüentemente referidas na técnica comobase heterocíclica, ou simplesmente como "base"). Conforme aqui usado,nucleobases "não-modifiçadas" ou nucleobases "naturais" incluem a purinabases adenina (A) e guanina (G)1 e a pirimidina bases timina (T)1 citosina (C)e uracij (U). Uma "substituição" é a substituição de uma base não-modificadaou base natural com outra base não-modificada ou natural. As nucleobases"não-modificadas" significam outras nucleobases sintéticas e naturais, taiscomo 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetila citosina, xantina, hipoxantina,2-aminoadenina, 6-metila, e outros derivados de alquila de adenina e guani-no, 2-propila, e outros derivados de alquila de adenina e guanina, 2-tiouracil,2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracil e citosina, 5-propinila (-C=C-CH3) ura-cil e citosina, e outros derivados de alquinila de bases pirimidina, 6-azo ura-cil, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino,8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila, e outras adeninas e guaninas 8-substituídas,5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluormetila, e outros uracis e citosinas 5-substituídos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adeni-na, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deazaadenina. Nucleobases modificadas adicionais inclu-em pirimidinas tricíclicas, tais como fenoxazina citidina(1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazin-2(3H)-ona), cintas G, tais como uma fenoxazina citidina substitu-ída (por exemplo, 9-(2-aminoetóxi)-H-p1rimido(5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), carbazol citidina (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), piridoindol citidina (H-pirido(3,,2l:4,5)pirrolo(2,3-d)pirimidin-2-ona). Nucleobases modificadas po-dem também incluir aquelas em que a base de purina ou pirimidina é substi-tuída com outros heterociclos, por exemplo 7-deaza-adenina, 7-deazagua-nosina, 2-aminopiridina e 2-piridona. Outras nucleobases incluem aquelasdescritas na Patente dos Estados Unidos No. 3.687.808, aquelas descritasem The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pági-nas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquelas descri-tas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30,613, e aquelas descritas por Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Researchand Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, Β. , ed., CRCPress, 1993. Certas destas nucleobases são conhecidas aos técnicos noassunto como adequadas para aumentar a afinidade de ligação dos compos-tos da invenção. Estas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas eN-2, N-6 e 0-6 purinas substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina. Substituições de 5-metilcitosina forammostradas para aumentar a estabilidade dúplex do ácido nucléico por 0,6-1,2°C,e são atualmente substituições de base adequadas, ainda mais parti-cularmente quando combinadas com modificações de açúcar 2'-0-meto-xietila. É compreendido na técnica que a modificação da base não requertais modificações químicas para produzir substituições em uma seqüênciade ácido nucléico.

As Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinamnucleobases modificadas acima notadas, bem como outras nucleobasesmodificadas incluem, mas não estão limitadas a, a patente dos Estados Uni-das acima notada 3.687.808, bem como as patentes dos Estados Unidos.:4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272;5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540;5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617; 5.645.985; 5.830.653;5.763.588; 6.005.096; 5.681.941; e 5.750.692.

Os compostos oligoméricos da presente invenção podem tam-bém incluir compostos policíclicos heterocíclicos no íugáTde uma ou maisporções de base heterocíclicas que ocorrem naturalmente. Um número decompostos tricíclicos heterocíclicos foi anteriormente reportado. Estes com-postos são rotineiramente usados em aplicações de anti-sentido para au-mentar as propriedades de ligação da cepa modificada a um filamento-alvo.As modificações mais estudadas são alvos para guanosinas; conseqüente-mente elas foram denominadas cintas G, ou análogos de citidina. Análogosrepresentativos de citosina que produzem 3 ligações de hidrogênio com umaguanosina em um segundo filamento incluem 1,3-diazafenoxazina-2-ona(Kurchavov, et ai, Nucleosides and Nucleotídeos, 1997, 16, 1837-1846), 1,3-diazafenotiazina-2-ona , (Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem.Soe. 1995, 117, 3873-3874) e 6,7,8,9-tetrafluoM ,3-diazafenoxazina-2-ona(Wang, J.; Lin1 K.-Y., Matteucci1 Μ. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388).Incorporadas nos oligonucleotídeos, estas modificações de base foram mos-tradas para hibridizarem com guanina complementar, e a última foi tambémmostrada para hibridizar com adenina, e para aumentar estabilidade térmicahelicoidal por interações de empilhamento entendidas (ver também Publica-ções Pré-Deferidas dos Estados Unidos 20030207804 e 20030175906).

As propriedades de estabilização de espira adicionais foram ob-servadas quando um análogo/substituto de citosina tem uma porção de ami-noetóxi fixada ao esqueleto rígido de 1,3-diazafenoxazina-2-ona (Lin, K.-Y.;Matteucci, M. J. Am. Chem. Soe. 1998, 120, 8531-8532). Os estudos de li-gação demonstram que uma incorporação simples pode aumentar a afinida-de de ligação de um oligonucleotídeo modelo em seu DNA ou RNA alvocomplementar com um ATm de até 18°C relativo a 5-metila citosina (dC5me),que é um aumento de afinidade alto para uma modificação simples. Por ou-tro lado, o ganho na estabilidade de espira não compromete a especificidadedos oligonucleotídeos.

Os compostos tricíclicos heterocíclicos adicionais e métodos deuso dos mesmos que são accessíveis para uso na presente invenção sãodescritos nas Patentes dos Estados Unidos 6.028.183 e 6.007.992.

A afinidade de ligação aumentada dos derivados de fenoxazina,junto com sua especificidade dé seqüência não-comprometida, os tornamanálogos de nucleobase valiosos para o desenvolvimento de fármacos ba-seados em anti-sentido mais potentes. De fato, dados promissores foramderivados de experimentos in vitro que demonstram que heptanucleotídeoscontendo substituições de fenoxazina são capazes de ativar RNase H, au-mentar o entendimento celular, e exibem uma atividade aumentada de anti-sentido (Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soe. 1998, 120, 8531-8532). Oaumento da atividade foi ainda mais pronunciado no caso de cinta G, vistoque uma substituição simples foi mostrada para aperfeiçoar significantemen-te a potência in vitro de um 20mer 2'-deoxifosfototioato oligonucleotídeos(Flanagan, W. M.; Wolf, J.J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.;Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999, 96, 3513-3518).Compostos policíclicos heterocíclicos modificados adicionais Ci-teis como bases heterocíclicas são descritos, mas não limitados a, na Paten-te dos Estados Unidos acima notada 3.687.808, bem como nas Patentes dosEstados Unidos: 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066;5.432.272; 5.434.257; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177;'5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121, 5.596.091; 5.614.617;5.645.985; 5.646.269; 5.750.692; 5.830.653; 5.763.588; 6.005.096; e5.681.941, e Publicação Pré-Deferida dos Estados Unidos 20030158403.

Combinações

As composições da invenção podem conter dois ou mais com-postos oligoméricos. Em outra concretização relacionada, as composiçõesda presente invenção podem conter um ou mais compostos de anti-sentido,particularmente oligonucleotídeos, alvejados para um primeiro ácido nucléi-co, e um ou mais compostos de anti-sentido adicionais alvejados para umsegundo ácido nucléico-alvo. Alternativamente, as composições da presenteinvenção podem conter dois ou mais compostos de anti-sentido alvejadospara regiões diferentes do mesmo ácido nucléico-alvo. Dois ou mais com-postos combinados podem ser usados juntos ou seqüencialmente.

Terapia de combinação

Os compostos da invenção podem ser usados em terapias decombinação, no qual um efeito aditivõéálcãnçado por se administrar um oumais compostos da invenção, e um ou mais outros compostos terapêuti-cos/profiláticos adequados para tratar uma condição. Composto(s) terapêuti-co(s)/profilático(s) adequado(s) inclui(em), mas não estão limitados a, agen-tes de abaixamento de glicose, agentes antiobesidade, e agentes de abai-xamento de lipídeo. Os agentes de abaixamento de glicose incluem, masnão estão limitados a, hormônios, hormônios miméticos, ou incretin miméti-cos (por exemplo, insulina, incluindo insulina inalada, GLP-1 ou análogos deGLP-1, tais como liraglutida, ou exenatida), inibidores de DPP(IV), uma sul-foniluréia (por exemplo, acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolaza-mida, glimepirida, uma glipizida, gliburida ou uma gliclazida), uma biguanida(metformina), uma meglitinida (por exemplo, nateglinida ou repaglinida), umatiazolidinediona ou outros agonísticos de PPAR-gama (por exemplo, pioglita-zona ou rosiglitazona), um inibidor de alfa-glucosidase (por exemplo, acar-bose ou miglitol), ou um composto de anti-sentido não-alvejado para GCGR.Também incluídos estão dois agonísticos de PPAR duplos (por exemplo,muraglitazar, sendo desenvolvido por Bristol-Myers Squibb, ou tesaglitazar,sendo desenvolvido por Astra-Zeneca). Também incluídos estão outros tra-tamentos de diabetes em desenvolvimento (por exemplo, LAF237, sendodesenvolvido por Novartis; MK-0431, sendo desenvolvido por Merck; ou ri-monabant, sendo desenvolvido por Sanofi-Aventis). Os agentes antiobesida-de incluem, mas não estão limitados a, supressores de apetite (por exemplo,fentermoina ou Meridia™), inibidores de absorção de gordura, tal como orlis-tat (por exemplo, Xenical™), e formas modificadas de fator neurotrófico ciliarque inibe sinais de fome que estimulam o apetite. Os agentes de abaixamen-to de lipídeo incluem, mas não estão limitados a, resinas de separação desal de bile (por exemplo, cloridrato colestiramina, colestipol, e colesevelam,inibidores de HMGCoA-reductase (por exemplo, lovastatin, pravastatin, ator-vastatin, símvastatin, e fluvastatin), ácido nicotínico, derivados de ácido fíbri-co (por exemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, bezafibrato, e ciprofibra-to), probucol, neomicin, dextrotiroxina, ésteres de estanol de planta, inibido-res de absorção de colesterol (por exemplo, ezetimiba), inibidores de CETP(por exemplo, torceírapib, e JTT-705), inibidores de MTP"(por éxemplo, impli-tapida), inibidores de veículos de ácido de bile (veículos de ácido de bile de-pendentes de sódio), reguladores de CYP7a hepático, inibidores de ACAT(por exemplo, Avasimiba), terapêuticos de substituição de terapêuticos (porexemplo, tamoxigen), HDL sintético (por exemplo, ETC-216), antiinflamató-rios (por exemplo, glucocorticóides), ou um composto de anti-sentido nãoalvejado para GCGR. Um ou mais destes fármacos podem ser combinadoscom um ou mais dos inibidores de anti-sentido de GCGR para alcançar umefeito terapêutico aditivo.Síntese de Oliqômero

A oligomerização de nucleosídeos modificados e não-modifica-dos pode rotineiramente ser realizada de acordo com os procedimentos daliteratura para DNA (Protocolos para Oligonucleotídeos e Análogos, Ed. A-grawal (1993), Humana Press) e/ou RNA (Scaringe, Methods (2001), 23,206-217. Gait et al., Aplicações de RNA Quimicamente sintetizados: Intera-ções de Proteína, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001),57, 5707-5713), e Publicação dos Estados Unidos No. 2005-0014713, que é'aqui incorporada por referência.

Os compostos oligoméricos da presente invenção podem serconvenientemente e rotineiramente produzidos através de uma técnica bem-conhecida de síntese de fase sólida. O equipamento para tal síntese é ven-dido por vários fornecedores incluindo, por exemplo, Apelei Biosystems(Foster City, CA). Qualquer outro meio para tal síntese conhecido na técnicapode adicionalmente ou alternativamente ser empregado. É bem-conhecidousar técnicas similares para preparar oligonucleotídeos, tais como os fosfo-rotioatos e derivados alquilatados.Purificação e Análise de Qliqômero

Os métodos de purificação e análise de oligonucleotídeo sãoconhecidos àqueles técnicos no assunto. Métodos de análise incluem eletro-forese capilar (CE) e pulverização-espectroscopia de massa. Tais métodosde síntese e análise podem ser realizados em placas de cavidades múltiplas.Revelação não-limitativa e incorporação por referência

Enquanto certos compostos, composições e métodos da presen-te invenção foram descritos com especificidade de acordo com certas con-cretizações, os exemplos aqui servem somente para ilustrar os compostosda invenção, e não são pretendidos para limitar a mesma. Cada uma dasreferências, números de acesso no GENBANK®, e similares representadosno presente pedido são incorporados aqui por referência em sua totalidade.Exemplo 1

Ensaio de Modulação de expressão

A modulação de expressão de GCGR pode ser ensaiada emuma variedade de modos conhecidos na técnica. Os níveis de GCGR mRNApodem ser quantificados por, por exemplo, análise Northern blot, reação decadeia de polimerase competitiva (PCR), ou PCR de tempo real. A análisede RNA pode ser realizada em RNA celular total ou poli(A)+ mRNA por mé-todos conhecidas na técnica. Os métodos de isolamento de RNA são ensi-nados em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in MolecularBiology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 e 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc.,1993.

A análise Northern blot é rotina na técnica, e é ensinada em, porexemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volu-me 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996. (PCR) quantitativa totalpode ser convenientemente acompanhada usando-se o Sistema de Detec-ção de Seqüência ABI PRISM™ 7700 comercialmente disponível, disponívelde PE-AppIied Biosystems, Foster City, CA, e usado de acordo com as ins-truções do fabricante.

Os níveis de proteínas codificadas por GCGR podem ser quanti-ficados em uma variedade de modos bem-conhecidos na técnica, tais comoimuno-precipitação, análise Western blot (imunoblot), ELISA ou classificaçãode célula ativada por fluorescência (FACS). Os anticorpos dirigidos a umaproteína codificada por GCGR podem ser identificados e obtidos de umavariedade de fontes, tal como catálogo de MSRS de anticorpos (Aerie Cor-poration, Birmíngham, Ml), ou podem ser preparados via métodos de gera-ção de anticorpo convencionais. Os métodos para preparação de anti-sorosão ensinados em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols inMolecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc.,1997. A preparação de anticorpos monoclonais é ensinada em, por exemplo,Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp.11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997.

Os métodos de imuno-precipitação são padrões na técnica, epodem ser encontrados em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., Current Pro-tocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley &Sons, Inc., 1998. As análises Western blot (imunoblot) são padrões na técni-ca, e podem ser encontradas em, por exemplo, Ausubel, F.M. et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley &Sons, Inc., 1997. Os ensaios imunoabsorventes ligados por enzima (ELISA)são padrões na técnica, e podem ser encontrados em, por exemplo, Ausub-el, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991.

O efeito de compostos oligoméricos da presente invenção naexpressão de ácido nucléico-alvo pode ser testado em qualquer de uma va-riedade de tipos de células provido que o ácido nucléico-alvo esteja presenteem níveis mensuráveis. O efeito dos compostos oligoméricos da presenteinvenção na expressão de ácido nucléico-alvo pode ser rotineiramente de-terminado usando-se, por exemplo, PCR ou análise Northern blot. As linhasde células são derivadas de ambos tecidos normais e tipos de célula, e decélulas associadas com várias enfermidades (por exemplo, enfermidadeshiperproliferativas). As linhagens de células derivadas de tecidos múltiplos eespécies podem ser obtidas de American Type Culture Collection (ATCC,Manassas, VA), o Japanese Câncer Research Resources Bank (Tokyo, Ja-pan), ou o Centre for Applied Microbiology and Research (Wiltshire, UnitedKingdom).

As células primárias, ou aquelas células que são isoladas de umanimal e não submetidas à cultura contínua, podem ser preparadas de acor-do com métodos conhecidos na técnica, ou obtidas de vários fornecedorescomerciais. Adicionalmente, as células primárias incluem aquelas obtidas deindivíduos humanos doadores ern Orrf ambiente clínico (isto é, doadores desangue, pacientes cirúrgicos).Tipos de Célula

O efeito de compostos oligoméricos na expressão de ácido nu-cléico-alvo foi testado em células HepG2.

A linhagem de célula de hepatoblastoma humana HepG2 foi ob-tida a partir de American Type Culture Collection (Manassas, VA). As célulasHepG2 foram rotineiramente cultivadas em suplemento EagIe1S MEM com10% de soro bovino fetal, 1 mM de aminoácidos não-essenciais, e 1 mM depiruvato de sódio (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). As célulasforam rotineiramente passadas por tripsinização e diluição quando elas al-cançaram aproximadamente 90% de confluência. Placas de cultura de ca-madas múltiplas são preparadas para cultura de célula por revestimento comuma diluição de 1:100 de tipo colágeno de calda de rato tipo 1 (BD Bioscien-ces, Bedford, MA) em solução solução salina tamponada por fosfato. As pla-cas contendo colágeno foram incubadas a 37°C por aproximadamente 1 ho-ra, após a qual o colágeno foi removido, e as cavidades foram lavadas duasvezes com solução salina tamponada por fosfato. As células foram espalha-das em placas de 96 cavidades (Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences,Bedford, MA) a uma densidade de aproximadamente 8,000 células/cavidadepara uso nos experimentos de transfecção de composto oligomérico.Tratamento com compostos oligoméricos

Quando as células alcançaram confluência apropriada, elas fo-ram tratadas com oligonucleotídeo usando um método de transfecção con-forme descrito. Outros reagentes de transfecção adequados conhecidos natécnica incluem, mas não estão limitados a, LIPOFECTAMINE™, OLIGO-FECTAMINE™, e FUGENE™. Outros métodos de transfecção adequadosconhecidos na técnica incluem, mas não estão limitados a, eletroporação.LIPOFECTIN™

Quando as células alcançam 65-75% de confluência, elas sãotratadas com oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo é misturado com LIPO-FECTIN™ Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) em meio de soro re-duzido Opti-MEM™-1 (Invitrogen Life TechnõrõglesT Carlsbad, CA), para al-cançar a concentração desejada de oligonucleotídeo, e uma concentraçãode LIPOFECTIN™ de 2,5 ou 3 pg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo. Estamistura de transfecção é incubada à temperatura ambiente por aproximada-mente 0,5 hora. Para crescimento de células em placas de 96 cavidades, ascavidades são lavadas uma vez com 100 μί de OPTI-MEM™-1 e, em segui-da, tratadas com 130 μί da mistura de transfecção. O crescimento das célu-las em placas de 24 cavidades ou em outras placas de cultura de tecido pa-drão é tratado similarmente, usando-se volumes apropriados de meio e oli-gonucleotídeo. As células são tratadas, e os dados são obtidos em duplicataou triplicata. Após aproximadamente 4 -7 horas de tratamento a 37°C, omeio contendo a mistura de transfecção é substituído com meio de culturafresco. As células são colhidas 16-24 horas após tratamento de oligonucleo-tídeo.

CYTOFECTIN™

Quando as células alcançam 65-75% de confluência, elas sãotratadas com oligonucleotídeo. O oligonucleotídeo é misturado com CYTO-FECTIN™ (Gene Therapy Systems, San Diego, CA) em meio de soro redu-zido OPTI-MEM™-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad1 CA), para al-cançar a concentração desejada de oligonucleotídeo, e uma concentraçãode CYTOFECTIN™ de 2 ou 4 pg/mL por 100 nM de oligonucleotídeo. Estamistura de transfecção é incubada à temperatura ambiente por aproximada-mente 0,5 hora. Para crescimento de células em placas de 96 cavidades, ascavidades são lavadas uma vez com 100 μί de OPTI-MEM™-1, e, em se-guida, tratadas com 130 μί da mistura de transfecção. O crescimento decélulas em placas de 24 cavidades ou em outras placas de cultura de tecidopadrão é tratado similarmente, usando-se volumes apropriados de meio eoligonucleotídeo. As células são tratadas, e os dados são obtidos em dupli-cata ou triplicata. Após aproximadamente 4-7 horas de tratamento a 37°C, omeio contendo a mistura de transfecção é substituído com meio de culturafresco. As células são colhidas 16-24 horas após tratamento de oligonucleo-tídeo.

Oligonucleotídeos de controle

Os oligonucleotídeos de controle são usados para determinar aconcentração ótima do composto oligomérico para uma linha de célula parti-cular. Além disso, quando os compostos oligoméricos da invenção são tes-tados em experimentos de classificação de composto oligomérico, ou ensai-os fenotípicos, os oligonucleotídeos de controle são testados em paralelocom compostos da invenção. Em algumas concretizações, os oligonucleotí-deos de controle são usados como oligonucleotídeos de controle negativos,isto é, como uma meio para medir a ausência de um efeito na expressão degene ou fenótipo. Em concretizações alternativas, os oligonucleotídeos decontrole são usados como oligonucleotídeos de controle positivos, isto é,conforme os oligonucleotídeos conhecidos afetam a expressão de gene oufenótipo. Os oligonucleotídeos de controle são mostrados na Tabela 2. O"Nome Alvo" indica o gene ao qual o oligonucleotídeo é alvejado. A "EspécieAlvo" indica espécie na qual o oligonucleotídeo é perfeitamente complemen-tar ao mRNA alvo. O "Motivo" é indicativo de regiões quimicamente distintascompreendendo o oligonucleotídeo. Certos compostos na Tabela 2 são oli-gonucleotídeos quiméricos, compostos de uma região de "folga" central con-sistindo em 2'-desoxinucleotídeos, que é flanqueada em ambos os lados (5'e 3') por "asas". As asas são compostas de 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos,também conhecidos como 2'-MOE nucleotídeos. O "motivo" de cada oligo-nucleotídeo "gapmer" é ilustrado na Tabela 2, e indica o número de nucleotí-deos em cada região de folga e asa, por exemplo, "5-10-5" indica um "gap-mer" tendo uma região de folga de 10 nucleotídeos flanqueada por asas de5-nucleotídeo. ISIS 29848 é uma mistura de composto oligomérico randomi-zado; sua seqüência é mostrada na Tabela 2, onde N pode ser A, T, C ou G.As ligações de internucleosídeo (estrutura principal) são fosforotioato atravésde todos os oligonucleotídeos na Tabela 2. Citosinas não-modificadas sãoindicas por "°C" na seqüência de nucleotídeo; todas as outras citosinas são5-metilcitosinas.<table>table see original document page 35</column></row><table>A concentração de oligonucleotídeo usada varia de linha de cé-lula para linha de célula. Para determinar a concentração ótima de oligonu-cleotídeo para uma linha de célula particular, as células são tratadas com umoligonucleotídeo de controle positivo a uma faixa de concentrações. Os con-troles positivos são mostrados na Tabela 2. Por exemplo, para células prima-tas humanas e não-humanas, o oligonucleotídeo de controle positivo podeser selecionado de ISIS 336806, ou ISIS 18078. Para células de rato ou decamundongo, o oligonucleotídeo de controle positive pode ser, por exemplo,ISIS 15770. A concentração de oligonucleotídeo de controle positivo queresulta em 80% de redução do mRNA alvo, por exemplo, Raf kinase C derato para ISIS 15770, é, em seguida, utilizada como a concentração de clas-sificação para novos oligonucleotídeos em experimentos subseqüentes paraesta linha de célula. Se 80% de redução não é alcançada, a concentraçãomais baixa de oligonucleotídeo de controle positivo que resulta em 60% deredução do mRNA alvo é, em seguida, utilizada como a concentração declassificação de oligonucleotídeo em experimentos subseqüentes para estalinha de célula. Se 60% de redução não é alcançado, esta linha de célulaparticular é considerada como inadequada para experimentos de transfec-ção de oligonucleotídeo. As concentrações de oligonucleotídeos de anti-sentido aqui usadas são de 50 nM a 300 nM quando o oligonucleotídeo deaníi-sentido é transfectado usando-se um reagénte de lipossoma, e 1 DM a40 DM quando o oligonucleotídeo de anti-sentido é transfectado por eletro-poração.

Exemplo 2

Análise Quantitativa de PCR de Tempo Real de Níveis de GCGR mRNA

A quantificação de níveis de GCGR mRNA foi acompanhada porPCR quantitativa de tempo real usando o ABI PRISM™ 7600, 7700, ou Sis-tema de Detecção de Seqüência 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City,CA), de acordo com as instruções do fabricante.

As quantidades alvos de gene obtidas por RT, PCR de temporeal foram normalizadas usando-se, ou o nível de expressão de GAPDH, umgene cuja expressão é constante, ou pela quantificação de RNA total usan-do-se RiboGreen™ (Molecular Probes1 Inc. Eugene, OR). O RNA total foiquantificado usando-se reagente de quantificação de RNA RiboGreen™(Molecular Probes1 Inc. Eugene, OR). 170 μι. de reagente de operação Ri-boGreen™ (reagente RiboGreen™ diluído 1:350 em 10mM de Tris-HCI, 1mM de EDTA, pH 7.5) foi pipetado em uma placa de 96 cavidades contendo30 μΙ_ de RNA celular purificado. A placa foi lida em um CytoFIuor 4000 (PEApplied Biosystems) com excitação a 485nm e emissão a 530nm.

A expressão de GAPDH foi quantificada por RT, PCR de temporeal, ou simultaneamente com a quantificação do alvo, ou separadamente.

Para medição simultânea com medição de níveis alvos, conjuntos de inicia-dor-sonda específicos ao gene alvo sendo medido foram avaliados para suacapacidade de serem "multiplexados" com uma reação de amplificação deGAPDH antes da análise de PCR quantitativa. A multiplexação se refere adetecção de espécies de DNA múltiplas, neste caso o alvo e controle endó-geno de GAPDH, em um tubo simples, que requer que o conjunto de inicia-dor-sonda para GAPDH não interfira com a amplificação do alvo.

As sondas e iniciadores para uso em PCR de tempo real foramdesignados para hibridizar as seqüências alvos específicas. Os métodos dedelineação de iniciador e sonda são conhecidos na técnica. A delineaçãodos iniciadores e sondas para uso em PCR de tempo real pode ser efetuadausando-se software comercialmente disponível, pofexêmplò, Iniciador Ex-press®, PE Applied Biosystems, Foster City, CA. Os iniciadores e sondas eas seqüências de ácido nucléico-alvo as quais eles hibridizam são apresen-tados na Tabela 4. As sondas PCR alvos-específicas têm FAM covalente-mente ligado ao terminal 5', e a TAMRA ou MGB covalentemente ligado aoterminal 3', onde FAM é um corante fluorescente e TAMRA, ou MGB, é ocorante de esfriamento rápido.

Após isolamento, o RNA é submetido a reação de transcriptasereversa (RT) seqüencial e PCR de tempo real, ambas das quais são realiza-das na mesma cavidade. Os reagentes de RT e PCR foram obtidos de Invi-trogen Life Technologies (Carlsbad, CA). RT, PCR de tempo real foi efetua-do no mesmo pela adição de 20 μΙ_ de coquetel de PCR (2,5x tampão dePCR menos MgCI2, 6,6 mM de MgCI2, 375 μΜ de cada de d ATP, dCTP,dCTP e dGTP, 375 nM de cada "PRIMER FORWARD" e "PRIMER REVER-SE", 125 nM de sonda, 4 Unidades de inibidor de RNAse, 1,25 Unidades dePLATINUM® Taq, 5 Unidades de transcriptase reversa MuLV, e 2,5x de co-rante ROX) em placas de 96 cavidades contendo 30 μΙ_ de solução de RNAtotal (20-200 ng). A reação de RT foi efetuada pela incubação por 30 minu-tos a 48°C. Em seguida a uma incubação por 10 minutos a 95°C para ativaro PLATINUM® Taq, 40 ciclos de um protocolo de PCR de duas etapas foramefetuados: 95°C para 15 segundos (desnaturação), seguido por 60°C por 1,5minutos (recozimento/extensão).

Os compostos da invenção podem ser avaliados para seu efeitoem níveis de mRNA de alvo humano por PCR de tempo real quantitativoconforme aqui descrito, usando-se um conjunto iniciador-sonda para hibridi-zar para GCGR humano. Por exemplo:

Primer de forward: TGCGGTTCCCCGTCTTC (incorporado que como SEQID NO: 21)

Primer reverse: CTTGTAGTCTGTGTGGTGCATCTG (incorporado aqui co-mo SEQ ID NO: 22)E a sonda de PCR:

FAM-CATCTTCGTCCGCATCG-MGB (incorporado aqui como SEQ ID NO:23), onde FAM é o corante fluorescente, e"MGB é um corante de esfriamen-to rápido não-fluorescente.

Os compostos da invenção podem ser avaliados para seu efeitonos níveis de mRNA alvo de rato por PCR de tempo real quantitativo, con-forme descrito em outros exemplos aqui, usando-se um conjunto iniciador-sonda designado para hibridizar para GCGR de rato. Por exemplo:Primer de forward: CAGTGCCACCACAACCTAAGC (incorporado aqui comoSEQ ID NO: 24)

Primer reverse: AGTACTTGTCGAAAGTTCTGTTGCA (incorporado aquicomo SEQ ID NO: 25)E a sonda de PCR:

FAM- TGCTGCCCCCACCTACTGAGCTG-TAMRA (incorporado aqui comoSEQ ID NO: 26), onde FAM é o corante fluorescente, e TAMRA é o corantede esfriamento rápido.

Os compostos da invenção podem ser avaliados para seu efeitonos níveis de mRNA alvo de macaco por PCR de tempo real quantitativo,conforme descrito em outros exemplos aqui, usando-se um conjunto inicia-dor-sonda designado para hibridizar para GCGR de macaco. Por exemplo:

Primer de forward: ACTGCACCCGCAACGC (incorporado aqui como SEQID NO: 27)

Primer reverse: CACGGAGCTGGCCTTCAG (incorporado aqui como SEQID NO: 28)

E a sonda de PCR:

FAM- ATCCACGCGAACCTGTTTGTGTCCTT-TAMRA (incorporado aquicomo SEQ ID NO: 29), onde FAM é o corante fluorescente, e TAMRA é umcorante de esfriamento rápido.

Outro exemplo de um conjunto iniciador-sonda designado parahibridizar para GCGR de macaco é:

Primer de forward: GAACCTTCGACAAGTATTCCTGCT (incorporado aquicomo SEQ ID NO: 30)

Primer reverse: GGGCAGGAGATGTTGGCC (incorporado aqui como SEQID NO: 31)

E a sonda aé PCR:

FAM-CCAGACACCCCCGCCAATAACA-TAMRA (incorporado aqui comoSEQ ID NO: 32), onde FAM é o corante fluorescente, e TAMRA é o corantede esfriamento rápido.

Exemplo 3 Delineacão de oliaonucleotídeos de anti-sentido de "folga amplia-da" que têm como alvo GCGR humano

Uma série de compostos oligoméricos foi designada para GCGRde alvo humano (número de acesso ao Genbank: NM_000160.1, incorpora-do aqui como SEQ ID NO: 1), com tamanhos variados da folga de desoxinu-cleotídeo e asas 2'-MOE. Cada um dos oligonucleotídeos é de 20 nucleoba-ses de comprimento, e tem a mesma seqüência de nucleobases(GCACTTTGTGGTGCCAAGGC, incorporado aqui como SEQ ID NO: 2), e,portanto, têm como alvo o mesmo segmento de SEQ ID NO: 1 (nucleobases532 a 551). Os compostos são mostrados na Tabela 3. O texto plano indicaum desoxinucleotídeo, e nucleotídeos designados com negrito, texto subli-nhado são 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. As ligações de internucleosídeossão fosforotioato, e todas as citosinas são 5-metilcitosinas. Indicado na Ta-bela 3 está o "motivo" de cada composto, indicativo de regiões quimicamen-te distintas compreendendo o oligonucleotídeo.

Tabela 3

Compostos de anti-sentido que têm como alvo GCGR humano

<table>table see original document page 40</column></row><table>

O 5-10-5 "gapmer", ISIS 310457, foi testado para sua capacida-de de reduzir níveis de mRNA alvo in vitro. As células HepG2 foram tratadascom ISIS 310457 usando-se métodos conforme descritos aqui. ISIS 310457foi analisado para seu efeito no receptor humano de níveis de glucagonmRNA por PCR de tempo real quantitativo, e foi verificado reduzir a expres-são de GCGR por cerca de 96%.

Exemplo 4 Delineacão de oliqonucleotídeos de anti-sentido de "folga amplia-da" que têm como alvo GCGR de rato

Uma série de compostos oligoméricos foi designada para GCGRde alvo dè rato (número de acesso ao Genbank: M96674.1, incorporado aquicomo SEQ ID NO: 3), com tamanhos variados da folga de desoxinucleotídeoe asas 2'-MOE. Cada um dos oligonucleotídeos testado tem a mesma se-qüência de nucleobases (GCACTTTGTGGTACCAAGGT, incorporado aquicomo SEQ ID NO: 4), e, portanto, têm como alvo o mesmo segmento deSEQ ID NO: 3 (nucleobases 402 a 421). O segmento alvejado pelos oligonu-cleotídeos de rato corresponde ao segmento de GCGR alvejado por ISIS310457 (SEQ ID NO:2). Os compostos são mostrados na Tabela 4. O textoplano indica um desoxinucleotídeo, e nucleotídeos designados com negrito,texto sublinhado são 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. As ligações de inter-nucleosídeos são fosforotioato, e todas as citosinas são 5-metilcitosinas.Indicado na Tabela 4 está o "motivo" de cada composto, indicativo de regi-ões quimicamente distintas compreendendo o oligonucleotídeo.

Tabela 4

Compostos de anti-sentido que têm como alvo GCGR derato

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Exemplo 5 Efeitos de oliqonucleotídeos de anti-sentido que têm como alvoestudo de rato de GCGR in vivo

De acordo com a presente invenção, os oligonucleotídéos de-signados para GCGR de rato alvo foram testados in vivo. Ratos Machos S-prague Dawley, de oito semanas de idade, foram injetados com 50, 25, 12,5,ou 6,25 mg/kg de ISIS 356171, ISIS 357368, ISIS 357369, ISIS 357370, ISIS357371, ISIS 357372, ou ISIS 357373 duas vezes por 3 semanas por umtotal de 6 doses. Animais injetados com solução -salina serviram como con-trole. Cada um dos oligonucleotídeos testados tem a mesma seqüência denucleobases (GCACTTTGTGGTACCAAGGT, incorporada aqui como SEQID NO: 4), e a química e motivo de cada composto é descrita acima.

Após o período de tratamento, os ratos foram sacrificados e osníveis de ácido nucléico-alvo foram avaliados no fígado. O isolamento deRNA e quantificação de nível de expressão de mRNA alvo são realizadosconforme descrito por outros exemplos aqui usando-se RIBOGREEN™. ORNA de cada grupo de tratamento foi ensaiado ao longo do RNA a partir dogrupo tratado com ISIS 356171. Os resultados são apresentados nas Tabe-las 5a, 5b, 5c, 5d, 5e, e 5f como um percentagem de níveis de controle tra-tados com solução salina.Tabela 5a

Redução de níveis alvos no fígado de ratos tratados com 2·16-2 oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados para GCGR

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Tabela 5b

Redução de níveis alvos no fígado de ratos tratados com 3'14-3 oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados para GCGR

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Tabela 5c

Redução de níveis alvos no fígado de ratos tratados com 4-12-4 oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados para GCGR

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Redução de níveis alvos no fígado de ratos tratados com 117-2 oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados para GCGR

<table>table see original document page 42</column></row><table>Tabela 5e

Redução de níveis alvos no fígado de ratos tratados com 1-18-1 oligonucleotídeos de anti-sentido alvejados para GCGR

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Tabela 5f

Redução de níveis alvos no fígado de ratos tratados comdesóxi oligonucleotídeos uniformes alvejados para GCGR

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Conforme mostrado nas Tabelas 5a, 5b, 5c, 5d, e 5e, os oligo-nucleotídeos de anti-sentido de folga ampliada foram efetivos na redução deníveis de GCGR in vivo em uma maneira dependente da dose. Desse modo,uma concretização da presente invenção é um método de reduzir a expres-são de níveis de GCGR em um animal compreendendo administrar um oli-gonucleotídeo-de anti-sentido que tem como. alvo J3CGR. Em uma concreti-zação, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreende uma folga de dezes-seis desoxinucleotídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com dois2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

Em adição, a concentração de oligonucleotídeo no rim e fígadofoi determinada. Os métodos para determinar a concentração de oligonucle-otídeo em tecidos são conhecidos na técnica (Geary et al., Anal. Biochem.,1999, 274, 241-248). Mostradas na Tabela 6 estão a concentração total deoligonucleotídeo e a concentração de comprimento total de oligonucleotídeo(em μg/g) no rim ou fígado de animais tratados com 25 mg/kg do oligonucle-otídeo indicado. O oligonucleotídeo total é a soma de todos os metabólitosde oligonucleotídeos detectados no tecido.Tabela 6

Concentração de oligonucleotídeo no fígado e rim

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 6, as concentrações dos oligonu-cleotídeos de folga ampliada no rim foram geralmente reduzidas com relaçãoàquela encontrada para ISIS 356171 nestes tecidos. Tomados com os dadosde redução-alvos mostrados na Tabela 5 no qual a potência foi mantida comISIS 356371, ISIS 356372, e ISIS 356373 com relação a ISIS 356171, estesdados sugerem que oligos de folga ampliada, particularmente ISIS 356371,ISIS 356372, e ISIS 356373 são, na essência, mais efetivos do que ISIS356171 na redução de níveis alvos no fígado.

Exemplo 6 Efeitos fisiológicos de oliaonucleotídeos de anti-sentido aue têmcomo alvo estudo de rato de GCGR in vivo

Para acessar os efeitos fisiológicos de redução de GCGR comos compostos de anti-sentido da invenção, níveis de glicose de plasma fo-ram monitorados através de todo estudo para cada grupo de tratamentodescrito no examplo anterior. Os níveis de glicose foram medidos usando-semétodos clínicos de rotina (por exemplo, o analisador de glicose YSI, YSIScientific1 Yellow Springs, OH) antes do início do tratamento ("Pré-sangria"),e durante cada semana do período de tratamento. Os resultados são apre-sentados na Tabela 7 em mg/dL para cada grupo de tratamento.Tabela 7

Efeito de inibição de anti-sentido de GCGR nos níveis deglicose de plasma

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 7, os animais tratados com oscompostos de anti-sentido que têm como alvo GCGR mostraram tendênciasde glicose reduzida sobre o curso do estudo. Portanto, outra concretizaçãoda presente invenção é um método de abaixamento de níveis de glicose emum animal compreendendo administrar ao referido animal um oligonucleotí-deo de anti-sentido que reduz a expressão de níveis de GCGR. Em concreti-zações preferidas, o oligonucleotídeo de anti-sentido é um oligonucleotídeode folga ampliada. Em uma concretização, o oligonucleotídeo de anti-sentidocompreende um desoxinucleotídeo de dezesseis folgas flanqueadas nosterminais 5' 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em algumas con-cretizações, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreende um desoxinucle-otídeo de quatorze folgas flanqueadas em ambos terminais 5' e 3' com três2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos, ou um desoxinucleotídeo com doze folgasflanqueadas em ambos os terminais 5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil)nucleotídeos.

Para examinar os efeitos de redução de GCGR nos outros ele-mentos na trajetória de glucagon, os animais tratados com os compostos deanti-sentido foram também acessados para níveis de glucagon e níveis depeptídeo-1 similares a glucagon (GLP-1) no final do período de tratamento.Os níveis de plasma de glucagon e GLP-1 ativo foram determinados usando-se kits comercialmente disponíveis, instrumentos, ou serviços (por exemplo,por radioimunoensaio, ELISA, e/ou imunoensaio Luminex, e/ou Linco Rese-arch Inc. Bioanalytical Services, St. Louis, MO). Os níveis de glucagon mé-dios (em ng/mL), e níveis de GLP-1 (pM) para cada grupo de tratamento,são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8

Efeitos de inibição de anti-sentido de GCGR em níveis deglucagon e GLP-1

<table>table see original document page 46</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 8, a redução de anti-sentido deGCGR causa aumento na circulação de níveis de glucagon, bem como nacirculação de níveis de GLP-1. Embora as tendências de reduções nos ní-veis de glicose de plasma sejam notados como na Tabela 7, nenhuma hipo-glicemia foi observada. Portanto, outra concretização da presente invenção éum método de aumentar os níveis de GLP-1 em um animal por administrar-se um oligonucleotídeo de anti-sentido que tem como alvo GCGR. Em umaconcretização, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreende uma folga dedezesseis desoxinucleotídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' comdois 2'-0-(2-metoxietil)Tiü"òleotídeos>;Em algumas concretizações, o oügonu-cleotídeo de anti-sentido compreende uma folga de quatorze desoxinucleotí-deos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com três 2'-0-(2-metoxietil)nucleotídeos, ou uma folga de doze desoxinucleotídeos flanqueada em am-bos os terminais 5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em con-cretizações preferidas, o oligonucleotídeo de anti-sentido é um oligonucleotí-deo de folga ampliada. Em concretizações preferidas, o oligonucleotídeo deanti-sentido compreende ISIS 357371, ISIS 357372, ou ISIS 357373.

Examplo 7 Efeitos de oliqonucleotídeos de anti-sentido que têm como alvoestudo de GCGR in vivo em macacos cinomóloqos

Para avaliar as alterações na distribuição do tecido, a potência,ou índice terapêutico causado pela modificação do motivo de oligonucleotí-deo de anti-sentido em um primata, macacos cinomólogos foram injetadoscom ISIS 310457 (motivo 5-10-5) ou ISIS 325568 (motivo 2-16-2) em dosesde 3, 10, ou 20 mg/kg por semana. Estes compostos de anti-sentido mos-tram 100% de complementaridade para a seqüência-alvo de GCGR de ma-caco. Os animais injetados com solução salina apenas serviram como con-troles. A duração do estudo foi 7 semanas, e os animais foram dosados trêsvezes durante a primeira semana, seguido por dosagem uma vez por sema-na por 6 semanas. Cada grupo de tratamento foi compreendido de 5 ani-mais. Um grupo tratado com 20 mg/kg de ISIS 310457 e um grupo tratadocom 20 mg/kg de ISIS 325568 recuperados por três semanas após cessa-mento de dosagem antes de sacrifício ("recuperação de 20 mg/kg"). Outrosgrupos de tratamento foram sacrificados no final do estudo. Os tecidos dofígado foram coletados para acessar a redução-alvo.

O isolamento de RNA e quantificação de nível de expressão demRNA alvo foram realizados conforme descrito por outros exemplos aquiusando-se RIBOGREEN™. Os resultados são apresentados na Tabela 9como uma percentagem de níveis de controle tratados com solução salina.

Tabela 9

Redução de níveis alvos no fígado de macacos tratadoscom oligonucleotídeos de anti-sentido que têm como alvo GCGR

<table>table see original document page 48</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 9, o tratamento com ISIS 310457e 325568 causou diminuição nos níveis de GCGR em todas as doses testa-das, e redução nos níveis alvos foi ainda observada nos grupos de recupe-ração de 20 mg/kg. O ISIS 325568 causou maior redução do que ISIS310457 na dose de 3 mg/kg. Desse modo, uma concretização da presenteinvenção é um método de reduzir expressão de níveis de GCGR em um a-nimal compreendendo administrar-se um oligonucleotídeo de anti-sentidoque tem como alvo GCGR. Em concretizações preferidas, o oligonucleotídeode anti-sentido é um oligonucleotídeo de folga ampliada. Em uma concreti-zação, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreende uma folga de dezes-seis desoxinucleotídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com dois2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em algumas concretizações, o oligonucleo-tídeo de anti-sentido compreende uma folga de quatorze desoxinucleotídeosflanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucle-otídeos, ou uma folga de doze desoxinucleotídeos flanqueada em ambos osterminais 5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em uma con-cretização, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreende ISIS 325568.

Em adição, a concentração de oligonucleotídeo no rim e no fíga-do foram determinadas. Os métodos para determinar a concentração de oli-gonucleotídeo em tecidos são conhecidos na técnica (Geary et al., Anal Bio-chem, 1999, 274, 241-248). São mostradas na Tabela 10 a concentraçãototal e a concentração de oligonucleotídeo de comprimento total (em μg/g)no rim ou fígado de animais tratados com o oligonucleotídeo indicado.

TabeIa 10

Concentração de oligonucleotídeo em fígado e rimTabela6

Concentração de oligonucleotídeo no fígado e rim

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Conforme mostrado na Tabela 10, a concentração do rim do oli-gonucleotídeo ISIS 310457 de motivo 5-10-5 é mais alta do que medida parao oligonucleotídeo ISIS 325568 de motivo 2-16-2 em todas as concentraçõestestadas. Tomados com os dados de redução-alvos mostrados na Tabela 9para o nucleotídeo de motivo 2-16-2, estes dados sugerem que o oligonu-cleotídeo de folga ampliada é Mais potente do que o oligonucleotídeo de mo-tivo 5-10-5, proporcionando um abaixamento mais robusto de níveis de mR-NA alvo no fígado sem acúmulo aumentado de oligonucleotídeo.Exemplo 8 Efeitos fisiológicos de oliqonucleotídeos de anti-sentido que têmcomo alvo estudo de GCGR in vivo em macacos cinomólogos,

Para examinar os efeitos de redução de GCGR em outros ele-mentos na trajetória de glucagon, os animais tratados com os compostos deanti-sentido conforme descritos no Exemplo 7 foram também acessados pa-ra níveis de glucagon e níveos de peptídeo-1 similares a glucagon (GLP-1)durante cada semana de tratamento. Os grupos de recuperação foram tes-tados para um adicional de três semanas após cessamento da dosagem. Osmacacos foram anestesiados antes da coleta de sangue para evitar artefatosdevido a estresse. Os níveis de plasma de glucagon e GLP-1 ativo foramdeterminados usando-se kits comercialmente disponíveis, instrumentos, ouserviços (por exemplo, por radioimunoensaio, ELISA, e/ou imunoensaio Lu-minex, e/ou Linco Research Inc. Bioanalytical Services, St. Louis, MO). Osníveis de glucagon médios (em ng/mL) e níveis de GLP-1 (pM) para cadagrupo de tratamento são mostrados na Tabela 11.<table>table see original document page 51</column></row><table>Outra concretização da presente invenção é um método de au-mentar níveis de GLP-1 em um animal por administrar-se um oligonucleotí-deo de anti-sentido que tem como alvo GCGR. Em concretizações preferi-das, o oligonucleotídeo de anti-sentido é um oligonucleotídeo de folga ampli-ada. Em uma concretização, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreendeuma folga de 16 desoxinucleotídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em algumas concretizações, ooligonucleotídeo de anti-sentido compreende uma folga de 14 desoxinucleo-tídeos flanqueada em ambos os terminais 5' e 3' com três 2'-0-(2-metoxietil)nucleotídeos, ou uma folga de 12 desoxinucleotídeos flanqueada em ambosos terminais 5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos. Em concreti-zações preferidas, o oligonucleotídeo de anti-sentido é ISIS 325568. Em ou-tra concretização, o oligonucleotídeo de anti-sentido compreende ISIS325568.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.Monia, Brett P.Freier, Susan M.Bhanot, Sanj ay

<120> MODULAÇÃO DE EXPRESSÃO .DE RECEPTOR DE GLUCAGON

<130> BIOLOO66WO

<150> 60/718,684<151> 2005-09-19

<160> 32

<170> FastSEQ para versão Windows 4.0

<21ü> 1

<211> 2034

<212> DNA

<213> H. sapiens

<400> 1

ggatctggca gcgccgcgaa gacgagcggt caccggcgcc cgacccgagc gcgcccagag 60gacggcgggg agccaagccg acccccgagc agcgccgcgc gggccctgag gctcaaaggg 120gcagcttcag gggaggacac cccactggcc aggacgcccc aggctctgct gctctgccac 180tcagctgccc tcggaggagc gtacacacac accaggactg cattgcccca gtgtgcagcc 240cctgccagat gtgggaggca gctagctgcc cagaggcatg cccccctgcc agccacagcg 300acccctgctg ctgttgctgc tgctgctggc ctgccagcca caggtcccct ccgctcaggt 360gatggacttc ctgtttgaga agtggaagct ctacggtgac cagtgtcacc acaacctgag 420cctgctgccc cctcccacgg agctggtgtg caacagaacc ttcgacaagt attcctgctg 480gccggacacc cccgccaata ccacggccaa catctcctgc ccctggtacc tgccttggca 540ccacaaagtg caacaccgct tcgtgttcaa gagatgcggg cccgacggtc agtgggtgcg 600tggaccccgg gggcagcctt ggcgtgatgc ctcccagtgc cagatggatg gcgaggagat 660tgaggtccag aaggaggtgg ccaagatgta cagcagcttc caggtgatgt acacagtggg 720ctacagcctg tccctggggg ccctgctcct cgccttggcc atcctggggg gcctcagcaa 780gctgcactgc acccgcaatg ccatccacgc gaatctgttt gcgtccttcg tgctgaaagc 840cagctccgtg ctggtcattg atgggctgct caggacccgc tacagccaga aaattggcga 900cgacctcagt gtcagcacct ggctcagtga tggagcggtg gctggctgcc gtgtggccgc 960ggtgttcatg caatatggca tcgtggccaa ctactgctgg ctgctggtgg agggcctgfca 1020cctgcacaac ctgctgggcc tggccaccct ccccgagagg agcttcttca gcctctacct 1080gggcatcggc tggggtgccc ccatgctgtt cgtcgtcccc tgggcagtgg tcaagtgtct 1140gttcgagaac gtccagtgct ggaccagcaa tgacaacatg ggcttctggt ggatcctgcg 1200gttccccgtc ttcctggcca tcctgatcaa cttcttcatc ttcgtccgca tcgttcagct 1260gctcgtggcc aagctgcggg cacggcagat gcaccacaca gactacaagt tccggctggc 1320caagtccacg ctgaccctca tccctctgct gggcgtccac gaagtggtct ttgccttcgt 1380gacggacgag cacgcccagg gcaccctgcg ctccgccaag ctcttcttcg acctcttcct 1440cagctccttc cagggcctgc tggtggctgt cctctactgc ttcctcaaca aggaggtgca 1500gtcggagctg cggcggcgtt ggcaccgctg gcgcctgggc aaagtgctat gggaggagcg 1560gaacaccagc aaccacaggg cctcatcttc gcccggecac ggccctccca gçaaggagct 1620gcagtttggg aggggtggtg gcagccagga ttcatctgcg gagaccccct tggctggtgg 1680cctçcctaga ttggctgaga gccccttctg aaccctgctg ggaccccagc tagggctgga 1740ctctggcacc cagaggcgtc gctggacaac ccagaactgg acgcccagct gaggctgggg 1800gcgggggagc caacagcagc ccccacctac cccccacccc cagtgtggct gtctgcgaga 1860ttgggcctcc tctccctgca cctgccttgt ccctggtgca gaggtgagca gaggagtcca 1920gggcgggagt gggggctgtg ccgtgaactg cgtgccagtg tccccacgta tgtcggcacg 1980tcccatgtgc atggaaatgt cctccaacaa taaagagctc aagtggtcac cgtg 2034

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223> Composto oligomérico<400> 2

gcactttgtg gtgccaaggc 20

<210> 3

<211> 1875

<212> DNA

<213> R. norvegicus

<400> 3

gaattcgcgg ccgccgccgg gccccagatc ccagtgcgcg aggagcccag tcctagaccc 60agcaacctga ggagaggtgc acacaccccc aaggacccag gcacccaacc tctgccagat 120gtgggggggt ggctacccag aggcatgctc ctcacccagc tccactgtcc ctacctgctg 180ctgctgctgg tggtgctgtc atgtctgcca aaggcaccct ctgcccaggt aatggacttt 240ttgtttgaga agtggaagct ctatagtgac cagtgccacc acaacctaag cctgctgccc 300ccacctactg agctggtctg caacagaact ttcgacaagt actcctgctg gcctgacacc 360cctcccaaca ccactgccaa catttcctgc ccctggtacc taccttggta ccacaaagtg 420cagcaccgcc tagtgttcaa gaggtgtggg cctgatgggc agtggg.ttcg agggccacgg 480gggcagtcat ggcgcgacgc ctcccaatgt cagatggatg atgacgagat cgaggtccag 540aagggggtag ccaagatgta tagcagctac caggtgatgt acactgtggg ctacagtctg 600tccctggggg ccttgctcct ggcgctggtc atcctgctgg gcctcaggaa gctgcactgc 660acccggaact acatccacgg gâacctgttc gcgtccttcg tgctcaaggc tggctctgtg 720ctggtçattg attggctgct caagacacgc tatagccaga agattggaga tgacctcagt 780gtgagcgtct ggctcagtga tggggcggtg gctggctgca gagtggccac agtgatcatg 840cagtacggca tcatagccaa ctactgctgg ttgctggtgg agggtgtgta cctgtacagc 900ctgctgagca tcaccacctt ctcggagaag agcttcttct ccctctatct gtgcatcggc 960tggggatctc ccctgctgtt tgtcatcccc tgggtggtgg tcaagtgtct gtttgagaat 1020gtccagtgct ggaccagcaa tgacaatatg ggattctggt ggatcctgcg tatccctgta 1080ctcctggcca tactgatcaa ttttttcatc tttgtccgca tcattcatct tcttgtggcc 1140aagctgcgtg cccatcagat gcactatgct gattacaagt tccggctagc caggtccacg 1200ctgaccctca ttcctctgct gggagtccac gaagtggtct ttgcctttgt gactgatgag 1260catgcccagg gcaccctgcg ctccaccaag ctcttttttg acctgttctt cagctccttt 1320cagggtctgc tggtggctgt tctctactgt ttcctcaaca aggaggtgca ggcagagcta 1380ctgcggcgtt ggaggcgatg gcaagaaggc aaagctcttc aggaggaaag gatggccagc 1440agccatggca gccacatggc cccagcaggg acttgtcatg.gtgatccctg tgagaaactt 1500cagcttatga gtgcaggcag cagcagtggg actggctgtg agccctctgc gaagacctca 1560ttggccagta gtctcccaag gctggctgac agccccacct gaatctccac tggactccag 1620ccaagttgga ttcagaaagg gcctcacaag acaacccaga aacagatgcc tggccaaggc 1680tgaagaggca aagcagcaag acagcagctt gtactatcca cactccccta acctgtcctg 1740gccgggtaca ggecacattg atggagtagg ggctggatat gatggagtag ccatgctitg_1800!7ãactatgggt gttcccatga gtgttgccat gttccatgca cacagatatg accttcagta 1860aagagctccc gtagg 1875

<210> 4<211> 20<212> DNA

<213> . Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico<400> 4 ·

gcactttgtg gtaccaaggt 20

<210> 5

<211> 2378

<212> DNA

<213> H. sapiens

<400> 5

cctctagagt caacatgaca ggcatcgaat ggctcctgtt tctctggcag agttgggggc 60

agagccaggc ttggccacgc tgggctctaa ggggctgtca ttttgcccag ggagctcctg 120

gctgggtggt cctcccccca gggtgagcac gcgtcccccc cacccccact tcgaggcgcc 180

caggcaggga acagctcatt ggccagtgtc cttçatcctt gtccccgcct gcatctccac 240catccacccttctcccctgcgttgggggtggtggccggaggataaggcccccgcctgccgccaagcctgcgcctcccatccagtctgtgaaggccccgtttacctggagggaaaccctctcctggcactgtattccatttcactcgcgggcagaattcaggttgccacccctcccacagcggccagctcccctgtggcgtacctaggcacccccacacacctggggccaaggtcagcctgagcacgccggcaagagcattgcgaccctcactcctccctcgcacagctgatctcactgccattttttgtaagacctccgtgcgcccggccaggggaggacctcggaggagatgtgggagg

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ccccttgtccctgcccacctggagaggcggcagtggcagtcccagagctgcagggagaggacctggctcatgagcccaggtgtccctgtcccctgggtggccaggctgtccagccttcgcggctggccctcaaagaagagtgcacgtggaaactgggctcgctcagatgcaccacgggggcgacgcccgcccaggaagccggcagggggcacagctgcaagtccaggcattttcccagggactgagggagcaggaaggtgccagccagccctttttttttgatctcgctcgagtagctgggagacggggtccctcggccttctttatcccccagacgccccaccaggactcccagaggca

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cccctgcccactcgtccaggtcctcacccagtttgatcagaactgcccctgtgggtccttatcagcgacatgaggttgggcacactgcttacgcgggctccagcagtccagcccctctccagccatccatcccgggggctgaccctccctaaaggccgatatggggaccacaccctgtgctcaaaggactttgcacggcacacagaccccccactttgctacgcttggcaggtgaggaggtctggggagggcaatgagacagagtgactcttgagacggactgccccgggcccgccaccaagcggatggtgggaaacaggaggctcagagtgctctgccaagctgtgcag

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30036042048054060066072.0780840900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220228023402378

<210><211><212><213>

6

735DNA

H. sapiens

<220><221><222><223>

misc_feature42, 346

η = A,Τ,C ou G

<400> 6cagccacagccaggtgatggctgagcctgctggcctcagctgaggaccccgtgtgcaacagccaacatctttcaagagatgatgcctcccgcaggcgcggcactgtaactgtgggctacaaggtaggatt

gacccctgctacttcctgtttgccccctccacttcctgaggccaaggggcgaaccttcgacctgcccctggcgggcccgaagtgccagattggggctggacgcagaaggagcctgtccctccgcc

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<210><211><212>

7

11001DNA<213> H. sapiens <220> <221> misc_feature <222> 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 <223> η = A, T, C ou G <220> <221> misc_feature <222> 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356·, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386

<223>

η = Α,Τ,C ou G

<22 0><221><222>

<223>

misc_feature

387, 388, 389, 390, 391, 392, 476, 480, 487, 535, 546, 553,

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<220><221><222>

<223>

misc_feature

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7001, 7002, 7003, 7004, 7005, 7006, 7007, 7008, 7010η = Α,Τ,C ou G

<220><221><222>

<223>

misc_feature

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<220><221><222>

<223>

misc_feature

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tccgtctgcc tgcctgtctg tctgcctgtc 6120tgcctgtctg tctgcctgtc tgtccatctg cctatccatc tacctgcctg cctgtctgcc 6180tgtctgtctg cctgtctgtc tgcctgcctg tctgtctgtc tgtctggttg cttgntgcat 6240gtgtccccca gccacaggtc ccctccgctc aggtgatgga cttcctgttt gagaagtgga 6300agctctacgg tgaccagtgt caccacaacc tgagcctgct gccccctccc acgggtgagc 6360cccccaccca gagcctttca gcctgtgcct ggcctcagca cttcctgagt tctcttncat 6420gggaaggttc ctgggtgctt atgcagcctt tgaggacccc gccaaggggc cctgtcattc 6480ctcaggcccc caccaccgtg ggcaggtgag gtaacgaggt aactgagcca cagagctggg 6540gacttgcctc aggccgcaga gccaggaaat aacagaacgg tggcattgcc ccagaaccgg 6600ctgctgctgc tgcccccagg cccagatggg taataccacc tacagccccg tggagttttc 6660agtgggcaga cagtgccagg gcgtggaagc tgggacccag gggcctggga gggctcgggt 6720ggagagtgta tatcatggcc tggacacttg gggtgcaggg agaggatagg gctggaggac 6780tcacccggga ggcagtgcct gggttcggat gagggaggca gccaccanct gggcagaggg 6840gggcaggtgt ggcagcctcc attggngcag agggagcagn atgtggcagc cacaggtttg 6900gcgatgcacc tgggaangga tgaaaatggc attngggttc 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gggtgggggc

cctcatccct

ccagggcacc

tgnccgcncg

tctctccagg

agtgggggca

gggatgccag

cccctgctct

ggcctcagcc.

tttccgtggc

cccctcagag

gangnangga

cggagctgcg

acaccagcaa

agtttgggag

tccctagatt

ctggcaccca

gcgggggagc

agattgggcc

ccagggcggg

acgtcccatg

atgtcntgga

cggtgggtgg

cagagttggc

aggtcctggc

ccagagggtc

gcatcacagt

tggaggccgt

gcctccgttt

a

cangntgctg

tcctggccat

tggcgtcctg

ccggcaccca

tcctccctgg

ccaggcccac

ggctcgggat

cgcatcgttc

aagttccggt

gggcagctgg

ggtgggtgac

ctgctgggcg

ctgcgcntcc

cccgccggct

gcctgctggt

tctgagacca

ccccacccct

tattgggtgc

ccatcgctac

gatgctgggt

cggagactgg

cagngcaggc

gcggcgttgg

ccacagggcc

gggtggtggc

ggctgagagc

gnagggcgtc

caacagcagc

tcctctccct

agtgggggct

tgcatggaaa

aagcagggct

tcagcgccag

actggaaccc

caccttccca

accattcacc

cccctgaccg

gaggacactg

catctcagct

gaccagcaat

cctggtgagg

aggctgcccc

gacaggacac

ctgtgtgccc

ctgcaggagg

gcccctgact

agctgctcgt

gggtgccgcg

gggtggggac

tcaggcgctg

tccacgaagt

gccaagctct

cccccgcccg

ggctgtcctc

tcagcactgg

gcccgggggt

agttgccatg

ggtgtccacc

ggcatagctg

gcatctccga

cctaggactg

caccgctggc

tcatcttcgc

agccaggatt

cccttctgaa

gctggacaac

nccccaccta

gcacctgcnt

gtgccgtgaa

tgtcctccaa

gganaatgct

tgcgggctgt

cggaggatcc

tcntggttct

agcagagacn

accccatcag

gcacctggct

ccagccccct

gacaacatgg

aaatgaagag

aggagacagc

caggacactg

accagcccca

gtcaggtggg

cgcaccctnt

ggccaagctg

gcagctggcg

tccaagctcc

cctctgcagg

ggtcttcgcc

tcttcgacct

gggcgcagtg

tactgcttcc

ccgtcggggt

tggaacacgt

gcgctgggtg

gtngggggtc

tgcccagcag

tgaggcccac

gcctgccccg

gcctgggcaa

ccggccacgg

catctgcgga

ccctgctggg

ccagaactgg

nccccccnac

tgtccctggt

ctgcgtgcca

caataaagag

ggggccgaag

tgaagggtcc

ngaaggcagc

ggcgggcagt

tgaggggcac

cactggattc

catcggcccg

cgggcaattt

8700876088208880894090009060912091809240930093609420948095409600966097209780984099009960100201008010140102001026010320103801044010500105601062010680107401080010860109201098011001

<210> .. 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 8

cgtgtgtctg tgctagtccc

20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 9

ggcaacgtga acaggtccaa

20

<210> 10<211> 18<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 10gcccattgct ggacatgc

18

<210> 11<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 11agççcattgc tggacatgca

20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 12

ttgtcccagt cccaggcctc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto òligomérico

<400> 13

ctttccgttg gacccctggg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<210> 15

<211>. 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 15

atccaagtgc tactgtagta 20

<210> 16

<211> 20

<220>

<223> Composto oligomérico

<400> 14gtgcgcgcga gcccgaaatc

20<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Composto oligomérico

<220><221><222>

<223>

misc_feature1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,18, 19, 20η = A,T,C ou G

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,

<400> 16ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη

20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<22 0><223>

Composto oligomérico

<400> 17gccctccatg ctggcacagg

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

20

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 18agcaaaagat caatccgtta

20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência ..artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 19tacagaaggc tgggccttga

20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA.

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Composto oligomérico

<400> 20

atgcattctg cccccaagga

20

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>-<223>

Iniciador PCR

<400> 21tgcggttccc cgtcttc

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 22

cttgtagtct gtgtggtgca tctg

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Sonda PCR

<400> 23catcttcgtc cgcatcg

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 24

cagtgccacc acaacctaag c

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213>--~ -Seqüência artificial<220>

<223> Iniciador PCR

<400> 25

agtacttgtc gaaagttctg ttgca

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Sonda PCR

<400> 26

tgctgccçcc acctactgag ctg

<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223>

Iniciador PCR

<400> 27actgcacccg caacgc

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Iniciador PCR

<400> 28cacggagctg gccttcag

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Sonda PCR

<400> 29

atccacgcga acctgtttgt gtcctt

<210><211><212><213>

<220><223>

3024DNA

Seqüência artificial

Iniciador PCR

<400> 30

gaaccttcga caagtattcc tgct

<210><211><212><213>

<220><223>

3118DNA

Seqüência artificial

Iniciador PCR

<400> 31gggcaggaga tgttggcc

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220><223>

Sonda PCR

<400> . 32

ccagacaccc ccgccaataa ca

Claims (63)

1. Oligonucleotídeo de anti-sentido de 20 nucleobases de com-primento objetivado para uma molécula de ácido nucléico que codifica GC-GR, e compreendendo pelo menos uma porção de 8-nucleobases de SEQID NO: 2 ou 4, em que o oligonucleotídeo compreende uma região de deso-xinucleotídeo de 12, 13, 15, 16, 17, ou 18 nucleobases de comprimento naqual é flanqueada em seus terminais 5' e 3' com 1 a 4 2'-0-(2-metoxietil) nu-cleotídeos, e em que o oligonucleotídeo se hibridiza especificamente para ereduz expressão de GCGR.

2. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 1, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligaçãode fosforotioato.

3. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 1, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

4. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 1, tendo a seqüência de nucleobases de SEQ ID NO: 4.

5. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 4, caracterizado por uma região de 16-desoxinucleotídeos flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

6. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 5, ern que pelo menos uma ligação de intérnucleosídeo é uma ligaçãode fosforotioato.

7. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 5, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

8. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 4, caracterizado por uma região de 18-desoxinucleotídeos flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

9. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindica-ção 8, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma ligaçãode fosforotioato.

10. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 8, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

11. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 4, caracterizado por uma região de 17-desoxinucleotídeos flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

12. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 11, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma liga-'ção de fosforotioato.

13. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 11, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

14. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 4, caracterizado por uma região de 12-desoxinucleotídeos flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

15. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 14, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma liga-ção de fosforotioato.

16. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 14, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

17. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 4, caracterizado por uma região de 14-desoxinucleotídeos flanqueadaem seus terminais 5' e 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

18. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 17, em que pelo menos tima ligação de internucleósídéB éuma liga-ção de fosforotioato.

19. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 17, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

20. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 1, tendo a seqüência de nucleobases de SEQ ID NO: 2.

21. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 20, caracterizado por uma região de 16-desoxinucleotídeos flanquea-da em seus terminais 5' e 3' com dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

22. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 21, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma liga-ção de fosforotioato.

23. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 21, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

24. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 20, caracterizado por uma região de 18-desoxinucleotídeos flanquea-da em seus terminais 5' e 3' com um 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeo.

25. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 24, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma liga-ção de fosforotioato.

26. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 24, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

27. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 20, caracterizado por uma região de 17-desoxinucleotídeos flanquea-da em seus terminais 5' e 3' com um ou dois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

28. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 27, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma liga-ção de fosforotioato.

29. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 27, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

30. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 20, caracterizado por uma região de 12-desoxinucleotídeos em seústerminais 5' e 3' com quatro 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

31. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 30, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma Iiga-ção de fosforotioato.

32. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 30, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

33. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 20, caracterizado por uma região de 14-desoxinucleotídeos flanquea-da em seus terminais 5' e 3' com três 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos.

34. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 33, em que pelo menos uma ligação de internucleosídeo é uma liga-ção de fosforotioato.

35. Oligonucleotídeo de anti-sentido, de acordo com a reivindi-cação 33, em que pelo menos uma citosina é uma 5-metilcitosina.

36. Composição farmacêutica compreendendo o oligonucleotí-deo de anti-sentido de acordo com a reivindicação 1, e, opcionalmente, um1veículo farmaceuticamente aceitável, diluente, intensificador ou excipiente.

37. Método de reduzir a expressão de GCGR em tecidos ou cé-lulas compreendendo contactar referidas células ou tecidos com a composi-ção farmacêutica como definida na reivindicação 36.

38. Método de diminuir os níveis de glicose no sangue em umanimal compreendendo administrar ao referido animal a composição farma-cêutica como definida na reivindicação 36.

39. Método de aumentar os níveis de GLP-1 em um animalcompreendendo administrar ao referido animal a composição farmacêuticade acordo com a reivindicação 36.

40. Método de aperfeiçoar a sensibilidade de insulina em umanimal compreendendo administrar ao referido animal a composição farma-cêutica como definida na reivindicação 36.

41. Método de diminuir triglicerídeos no sangue em um animalcompreendendo administrar ao referido animal a composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 36.

42. Método de diminuir os níveis de colesterol no sangue em umanimal compreendendo administrar ao referido animal a composição farma-cêutica como definida na reivindicação 36.

43. Método de tratar um animal tendo uma doença ou condiçãoassociada com expressão de receptor de glucagon compreendendo adminis-trar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamenteefetiva da composição farmacêutica como definida na reivindicação 36.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a doençaou condição é uma doença ou condição metabólica.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a doençaou condição é diabetes, hiperglicemia, obesidade, hiperglucagonemia primá-ria, deficiência de insulina, ou resistência à insulina.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, em que a doençaou condição é diabetes Tipo 2.

47. Método de prevenir ou retardar o começo de níveis elevadosde glicose no sangue em um animal compreendendo administrar ao referidoanimal a composição farmacêutica como definida na reivindicação 36.

48. Método de preservar a função de célula-beta em um animalcompreendendo administrar ao referido animal a composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 36.

49. Oligonucleotídeo de anti-sentido de 20 nucleobases de com-primento, tendo a seqüência de SEQ ID NO: 2, e caracterizado por uma re-gião de 16-desoxinucleotídeos fIanqueada em seus terminais 5' e 3' comdois 2'-0-(2-metoxietil) nucleotídeos em que cada ligação de internucleosí-deo é uma ligação de fosforotioato, e cada citosina é uma 5-metilcitosina.

50. Composição farmacêutica compreendendo o oligonucleotí-deo de anti-sentido como definida na reivindicação 49, e, opcionalmente, umveículo farmaceuticamente aceitável, diluente, intensificador ou excipiente.

51. Método de reduzir a expressão de GCGR em tecidos ou cé-lulas, compreendendo contactar referidas células ou tecidos com a composi-ção farmacêutica como definida na reivindicação 50.

52. Método de dimfnoircfs nívêis de glicose no sangue em umanimal compreendendo administrar ao referido animal a composição farma-cêutica como definida na reivindicação 50.

53. Método de aumentar os níveis de GLP-1 em um animalcompreendendo administrar ao referido animal a composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 50.

54. Método de aperfeiçoar a sensibilidade de insulina em umanimal compreendendo administrar ao referido animal a composição farma-cêutica como definida na reivindicação 50.

55. Método de diminuir triglicerídeos no sangue em um animalcompreendendo administrar aõ referido animal a composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 50.

56. Método de diminuir os níveis de colesterol no sangue em umanimal compreendendo administrar ao referido animal a composição farma-cêutica como definida na reivindicação 50.

57. Método de tratar um animal tendo uma doença ou condiçãoassociada com expressão de receptor de glucagon compreendendo adminis-trar ao referido animal uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamenteefetiva da composição farmacêutica como definida na reivindicação 50.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, em que a doençaou condição é uma doença ou condição metabólica.

59. Método, de acordo com a reivindicação 57, em que a doençaou condição é diabetes, hiperglicemia, obesidade, hiperglucagonemia primá-ria, deficiência de insulina, ou resistência à insulina.

60. Método, de acordo com a reivindicação 57, em que a doençaou condição é diabetes Tipo 2.

61. Método de prevenir ou retardar o começo de níveis elevadosde glicose no sangue em um animal compreendendo administrar ao referidoanimal a composição farmacêutica como definida na reivindicação 50.

62. Método de preservar a função de célula-beta em um animalcompreendendo administrar ao referido animal a composição farmacêuticacomo definida na reivindicação 50.

63. Método de tratar um animal tendo^umã doença ou condiçãometabólica compreendendo administrar ao referido animal um compostocomo definido na reivindicação 1, em combinação com um agente antidiabé-tico selecionado a partir do grupo compreendendo agonísticos de PPAR in-cluindo agonisticos de PPAR-gama, duplo-PPAR ou pan-PPAR, inibidoresde dipeptidil peptidase (IV), análogos de .GLP-1, insulina e análogos, insulinasecretogogos, inibidores de SGLT2, análogos de amilin humano incluindopramlintida, ativadores de glucocinase, biguanidas e inibidores de alfa -glucosidase, para alcançar um efeito terapêutico aditivo.