KR20080074101A - 글루카곤 수용체 발현의 조절 - Google Patents

글루카곤 수용체 발현의 조절 Download PDF

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브레트 피. 모니아
수잔 엠. 프레이어
산자이 비하낫
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존슨 앤드 존슨 파머슈티컬 리서치 앤드 디벨로프먼트 엘엘씨
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Abstract

글루카곤 수용체의 발현을 조절하기 위한 화합물, 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 조성물은 안티센스 화합물, 특유의 생체 내 성질을 갖고, 글루카곤 수용체를 코딩하는 핵산을 표적화하는 안티센스 화합물, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 글루카곤 수용체 발현을 조절하고 질환을 치료하기 위하여 이들 화합물을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

글루카곤 수용체 발현의 조절{MODULATION OF GLUCAGON RECEPTOR EXPRESSIONM}
서열 리스트
29,184 바이트(MS-DOS로 측정함)이고 2006년 9월 19일에 제작된BIOL0066WOSEQ.txt라는 이름의 파일을 포함하는, 디스크 상 서열 목록의 컴퓨터-판독가능한 형태가 본원에서 참조로 인용된다.
본원에서 개시하는 것은 세포, 조직 또는 동물에서 글루카곤 수용체의 발현을 조절하는 화합물, 조성물 및 방법이다.
정상적인 혈당증의 유지는 신중하게 조절된 대사 결과이다. 혈중 글루코오스 수준 유지에 관여하는 글루카곤, 29-아미노산 펩티드는 간에서의 글리코겐분해 및 글루코네오제네시스를 활성화시켜 간으로부터 글루코오스 방출을 증가시키고, 또한 지방성 조직에서 지방분해를 자극한다. 식후 상태에서, 외재성 글루코오스가 소비될 경우 고혈당 수준을 유도하고, 인슐린은 글리코겐분해 및 글루코네오제네시 스의 글루카곤-중재의 증가로 전환시킨다. 당뇨병 환자에서, 인슐린은 이용불가능하거나 완전히 효과적이지 않다. 당뇨병에 대한 치료가 통상적으로 인슐린 수준을 증가시키는데 초점을 맞춘 반면, 글루카곤 작용의 길항작용은 대안적인 요법으로 여겨져 왔다. 글루카곤 수용체(또한 GCGR 또는 GR로 공지된)를 통한 신호에 의한 그의 생리적 효과를 방출하는 글루카곤으로서, 글루카곤 수용체는 당뇨병에 대하여 효능적인 치료적 표적으로서 제안되어 왔다(Madsen et al., Curr . Pharm . Des., 1999, 5, 683-691).
글루카곤 수용체는 7개의 트랜스멤브레인 도메인을 갖는 G-단백질-커플 수용체의 수퍼패밀리에 속한다. 이는 또한 구조적으로 글루카곤과 유사한 펩티드와 결합하는 유사체 수용체의 더 작은 서브-패밀리의 멤버이다. 인간 글루카곤 수용체를 코딩하는 유전자는 1994년에 클론되었고 게놈 서열의 분석은 다중 인트론 및 랫트 글루카곤 수용체 유전자에 대하여 82% 동일성을 밝혔다(Lok et al., Gene, 1994, 140, 203-209.; MacNeil et al., Biochem . Biophys . Res. Commun., 1994, 198, 328-334). 또한 랫트 글루카곤 수용체 유전자의 클로닝은 대안적인 멀티플 스플라이스 변이체에 대한 설명을 할 수 있게 하였다(Maget et al., FEBS Lett, 1994, 351, 271-275). 미국 특허 5,776,725에는 인간 또는 랫트 글루카곤 수용체를 코딩하는 분리된 핵산 서열을 기재하고 있다(Kindsvogel et al., 1998). 인간 글루카곤 수용체 유전자는 염색체 17q25에 위치하고 있다(Menzel et al., Genomics, 1994, 20, 327-328). 글루카곤 수용체 유전자의 코돈 40에서 Gly이 Ser으로의 미스센스 변형은 글루카곤에 대하여 3배 낮은 친화성을 유도하였 고(Fujisawa et al., Diabetologia, 1995, 38, 983-985) 이 변형은 비인슐린 의존 당뇨병(Fujisawa et al., Diabetologia, 1995, 38, 983-985), 고혈압(Chambers and Morris, Nat. Genet, 1996, 12, 122) 및 중추 신경의 지방과다(Siani et al., Obes. Res., 2001, 9, 722-726)를 포함하는 몇몇의 질환 상태와 관련 있다. 마우스에서 표적화된 글루카곤 수용체 유전자의 분열은 총 글루카곤 수용체의 부재 및 상승된 혈장 글루카곤 수준에도 불구하고, 마우스는 정상에 가까운 혈당증 및 지혈증을 유지하였다(Parker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, 290, 839-843).
발명의 요약
본 발명은 GCGR을 코딩하는 핵산분자를 표적으로 하고 혼성화될 수 있는 올리고머 화합물에 관한 것이며, 이는 GCGR의 발현을 조절하고 5' 및 3' 말단에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된(flanked) 10개의 데옥시뉴클레오티드 갭 영역을 포함하는 GCGR을 표적화하는 올리고뉴클레오티드에 비하여 개선된 약물동력을 갖고 있다. 본원에서 "갭머(gapmer)"로서 언급된 올리고뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드 영역 또는 1 내지 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 구성된 "윙"으로 5' 및 3' 각 말단 상에 프랭킹된 "갭"을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 데옥시뉴클레오티드 영역은 10개 초과의 데옥시뉴클레오티드로 구성됨으로써, 본 발명의 갭머는, 이를 테면, 본원에 이의 전체가 참조로서 인용된 미국 공보 2005-0014713에 예시된 바와 같이, 10개의 데옥시뉴클레오티드 갭 영역을 포함하는 키메라 화합물과 비교하여 "확장된 갭(gap-widened)"이다. GCGR을 표적화하는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도는 동일 서열을 갖지만, 두 5' 및 3' 말단 상에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교할 경우 간에서의 올리고뉴클레오티드의 우수한 효능은 유지하면서, 감소하는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 구체예는 GCGR을 표적화하는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드를 포함하고 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도는, 동일 서열을 갖지만, 두 5' 및 3' 말단 상에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교할 경우 감소된다. 본 발명의 또다른 구체예는 GCGR을 표적화하는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드를 포함하고 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도는, 간과 같은 표적 조직에서 효능을 유지 또는 개선하면서, 동일 서열을 갖지만, 두 5' 및 3' 말단 상에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교할 경우 유사하거나 감소된다.
어떤 구체예에서, 동일 서열을 갖지만 두 5' 및 3' 말단 상에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교하여, 확장된 갭 올리고뉴클레오티드는 간에서 올리고뉴클레오티드의 축적 증가 없이 유사하거나 개선된 효능을 갖는다. 따라서, 본 발명의 구체예는 GCGR을 표적화하는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드를 포함하고 여기에서 효능은 표적 조직에서 올리고뉴클레오티드의 축적 증가 없이 동일 서열을 갖지만, 두 5' 및 3' 말단 상에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 유사하거나 우수하다.
또한 세포, 조직 또는 동물을 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포, 조직 또는 동물에서 GCGR의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 세포, 조직 또는 동물에서 GCGR의 발현을 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 인핸서(enhancer)를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 올리고머 화합물을 사용하여 혈중 글루코오스를 저하시키는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 올리고머 화합물을 사용하여 GLP-1 수준을 증가시키는 방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 동물을 본 발명의 유효량의 올리고머 화합물 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 동물에서 다양한 증상을 개선 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명은 동물을 본 발명의 유효량의 올리고머 화합물 또는 약제학적 조성물과 접촉시켜, GCGR의 발현이 감소되고 상기 증상의 하나 이상의 물리적 인디케이터가 상기 다양한 증상이 감소했음을 나타내는 것을 포함하는, 동물에서 다양한 증상을 개선 또는 감소시키는 방법 에 관한 것이다. 어떤 구체예에서, 질환 또는 증상은 대사 질환 또는 증상이다. 어떤 구체예에서, 증상은 한정하는 것은 아니지만, 당뇨병, 비만, 인슐린 저항성 및 인슐린 결핍을 포함한다. 어떤 구체예에서, 당뇨병은 제2형 당뇨병이다. 다른 구체예에서, 증상은 대사 증후군이다. 어떤 구체예에서, 비만은 식이로 유도된다. 또한 동물에 본 발명의 화합물 또는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 글루코오스의 상승 개시를 예방하거나 지연시키는 방법을 제공한다. 또한 베타-세포 작용을 유지하는 방법을 제공한다.
본 출원은 또한 본원에 전체가 참조로 인용된 미국 출원 번호 60/718,685와 관련 있다. 본 출원은 또한 본원에 각각 전체가 참조로 인용된 미국 출원 번호 11/231,243 및 PCT 출원 번호 PCT/US2005/033837과 관련 있다.
개요
GCGR을 코딩하는 핵산 분자의 발현을 조절하는 데 이용하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 다른 안티센스 화합물을 포함하는, 올리고머 화합물이 본원에 개시된다. GCGR을 코딩하는 하나 이상의 표적 핵산 분자와 혼성화하는 올리고머 화합물을 제공하여 이를 달성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 GCGR(글루카곤 수용체 또는 GR로 공지됨)의 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법이다. 표 1에 열거된 것은 GCGR에 표적화된 올리고머 화합물을 설계하기 위하여 이용될 수 있는 서열의 GENBANK® 수탁 번호이다. 본 발명의 올리고머 화합물은 표 1에 나타낸 하나 이상의 표적 핵산 분자와 혼성화하는 올리고머 화합물뿐만 아니라 GCGR을 코딩하는 다른 핵산 분자에 혼성화하는 올리고머 화합물을 포함한다.
올리고머 화합물은 GCGR을 코딩하는 핵산 분자의 임의의 영역, 구획, 또는 부위를 표적화할 수 있다. 적합한 표적 영역, 구획 및 부위는 비제한적으로, 5'UTR, 시작 코돈, 정지 코돈, 코딩 영역, 3'UTR, 5' 캡 영역, 인트론, 엑손, 인트론-엑손 접합점, 엑손-인트론 접합점 및 엑손-엑손 접합점을 포함한다.
종 GENBANK® 수탁 번호 또는 설명 서열 번호
인간 NM＿00160.1 1
랫트 M96674.1 3
인간 AJ245489.1 5
인간 AI261290.1의 상보물 6
인간 NT＿079568.1의 뉴클레오티드 57000 내지 68000 7
활성 올리고머 화합물이 혼성화하는 표적 핵산 상의 위치는 본원에서 하기에 "입증된 표적 구획"으로 언급된다. 본원에서 이용된 용어 "입증된 표적 구획"은 활성 올리고머 화합물이 표적화된 표적 영역의 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분으로 정의된다. 이론에 의한 제한 없이, 이들 표적 구획이 혼성화할 수 있는 표적 핵산의 부분을 나타내는 것으로 사료된다.
본 발명은 키메라 화합물인 올리고머 화합물을 포함한다. 키메라 화합물의 예는 비-데옥시뉴클레오티드 영역 또는 "윙"에 의해 프랭킹된 "갭" 또는 2'-데옥시뉴클레오티드 영역을 갖는 갭머이다. 이론에 의한 제한 없이, 갭머의 갭은 RNA 표적에 결합할 때 RNase H에 의해 인지될 수 있는 기질을 나타내나, 윙은 듀플렉스(duplex) 안정성 또는 유익한 약동학적 효과에 기여하는 것과 같이 다른 특성을 부여할 수 있는 임의의 기질이 아니다. 각 윙은 하나 이상의 비-데옥시올리고뉴클레오티드 모노머일 수 있다. 일 구체예에서, 갭머는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드의 윙에 의해 5' 및 3' 말단 각각에 프랭킹된 16개의 2'-데옥시뉴클레오티드 영역으로 구성된다. 이는 2-16-2 갭머로 언급된다. 이에 따라, 갭머 또는 이러한 키메라 올리고머 화합물의 "모티브"는 2-16-2이다. 또다른 구체예에서, 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 또다른 구체예에서, 갭머의 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명의 구체예는 그의 5' 및 3' 말단 각각에 적어도 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10 초과의 뉴클레오염기 길이의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 13 내지 26 서열 길이의 뉴클레오티드를 함유하는 올리고머 화합물을 포함한다. 바람직한 "확장된 갭" 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 갭 부분에서 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 5' 및 3' 프랭킹 영역은 1, 2, 3, 또는 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드를 포함한다. 바람직한 확장된 갭의 갭머는 1-18-1, 1-17-2, 2-17- 1, 2-16-2, 3-14-3 및 4-12-4를 포함하는 모티브를 갖는다.
바람직한 구체예에서, 올리고머 화합물은 GCGR을 표적화하거나 이에 혼성화한다. 또다른 구체예에서, 올리고머 화합물은 GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 올리고머 화합물은 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%로 GCGR의 발현을 감소시킨다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도가 동일한 서열을 가지나, 각 5' 및 3' 말단에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드로 프랭킹된 10개 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 비교하여 감소되는 것을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 신장에서의 농도가 동일한 서열을 가지나 각 5' 및 3' 말단에서 5개 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드로 프랭킹된 10개 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 그것과 비교하여 유사하거나 감소되는 것을 포함한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 간에서 표적 감소로 간주되는 효능 또는 치료 효과가 동일한 서열을 가지나 조직에서 올리고뉴클레오티드의 축적 증가 없이, 5' 및 3' 말단 둘다에서 5개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 10개의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 그것과 유사하거나 우수한 것을 포함한다.
본 발명은 GCGR을 코딩하는 핵산 분자에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 13 내지 26 길이의 뉴클레오염기를 제공하며, 여기에서, 올리고뉴클레오티드는 제1 영역, 제2 영역 및 제3 영역을 포함하고, 상기 제1 영역은 적어도 11개 데옥시뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제2 및 제3 영역은 1 내지 4개 2'-O-(2-메톡시에틸)뉴클레오티드를 포함하고, 상기 제2 및 제3 영역은 상기 제1 영역의 5' 및 3' 말단에서 제1 영역을 프랭킹한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 GCGR에 혼성화하며, GCGR의 발현을 감소시킨다. 일부 구체예에서, "갭" 영역은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 뉴클레오염기를 포함한다. 일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20 길이의 뉴클레오염기이다.
올리고머 화합물은 약 8 내지 약 80개 뉴클레오염기(예를 들어, 약 8 내지 약 80개의 연결된 뉴클레오시드), 바람직하게 약 13 내지 약 26 뉴클레오염기를 포함할 수 있다. 당업자는 고려되는 바람직한 올리고머 화합물이 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 길이의 뉴클레오염기 화합물을 포함하는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 화합물은 예시적인 안티센스 화합물 중 하나의 5'-말단으로부터 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다(남아있는 뉴클레오염기는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물의 5'-말단의 업스트림에서 바로 시작하는 동일한 올리고뉴클레오티드의 연속 스트레치(stretch)이며, 올리고뉴클레오티드가 약 13 내지 약 26개 뉴클레오염기를 포함할 때까지 계속된다). 다른 화합물은 예시적인 안티센스 화합물 중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 8개의 연속 뉴클레오염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열로 나타낼 수 있다(남아있는 뉴클레오염기는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 화합물의 3'-말단의 다운스트림에서 바로 시작하는 동일한 올리고뉴클레오티드의 연속 스트레치이며, 올리고뉴클레오티드가 약 13 내지 약 26개 뉴클레오염기를 포함할 때까지 계속된다). 화합물은 예시적인 화합물의 서열의 내부 부분에서 적어도 8개 연속적 뉴클레오염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드 서열로 나타낼 수 있으며, 올리고뉴클레오티드가 약 13 내지 약 26개 뉴클레오염기를 함유할 때까지 둘 중 하나 또는 양 방향으로 확대될 수 있음이 이해된다.
본 발명은 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 뉴클레오염기를 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 8-뉴클레오염기 부분을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 GCGR을 코딩하고 적어도 하나의 서열 번호 2 또는 4의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 핵산 분자에 표적화되는 안티센스 올리고뉴클레오티드 20개 길이의 뉴클레오염기를 제공하며, 여기에서, 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 내지 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 데옥시뉴클레오티드 영역 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18 뉴클레오염기 길이를 포함하며, 여기에서 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, 발현을 감소시킨다.
일 구체예에서, 프랭킹 영역은 대칭적이다(3' 프랭킹 영역에서와 같이 5' 프랭킹 영역에서 동일한 수의 뉴클레오티드를 가짐). 또다른 구체예에서, 프랭킹 영역은 비-대칭적이다(5' 프랭킹 영역에서 3' 프랭킹 영역과 다른 수의 뉴클레오티드를 가짐).
다른 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 4 또는 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역, 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역 또는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 인터뉴클레오시드 결합을 함유할 수 있다. 변형된 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오염기도 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다. 다른 구체예에서, 모든 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명의 구체예는 서열 번호 2의 서열을 갖는 20 뉴클레오염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하며, 각 결합은 포스포로티오에이트 결합이고 각 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 3개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 1개 또는 2개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4의 뉴클레오염기 서열을 가지며, 여기에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 및 3' 말단에서 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 가진다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 GCGR에 특이적으로 혼성화하고, GCGR의 발현을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 인핸서 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물도 본원에서 고려된다. 본 발명의 화합물은 GCGR에 의해 매개되는 글루카곤 효과에 관련된 질환 및 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 이용될 수도 있다.
본 발명의 구체예는 세포 또는 조직을 본 발명의 약제학적 조성물 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 포함하여 조직 또는 세포에서 GCGR의 발현을 줄이는 방법, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기 동물에 투여하는 것을 포함하여, 혈중 글루코오스 수준, 혈중 트리글리세리드 수준 또는 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법을 포함한다. 혈중 수준은 혈장 또는 혈청 수준일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 동물에 투여하는 것을 포함하여, 동물에서 인슐린 민감성을 개선시키는 방법, GLP-1 수준을 증가시키는 방법 및 간장의 글루코오스 산출을 억제하는 방법이 또한 고려된다. 개선된 인슐린 민감성은 순환하는 인슐린 수준에서 감소에 의하여 지시될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 동물에 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 약제학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, GCGR을 통한 글루카곤 활성과 관련된 질환 또는 증상을 갖는 동물을 치료하는 방법을 포함한다. 질환 또는 증상은 대사 질환 또는 증상일 수 있다. 일부 구체예에서, 대사 질환 또는 증상은 당뇨병, 고혈당증, 고지혈증, 대사 증후군 X, 비만, 원발성 고혈중 글루코오스증, 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성이다. 일부 구체예에서, 질환은 2형 당뇨병이다. 일부 구체예에서, 비만은 식이-유도된다. 일부 구체예에서, 고지혈증은 증가된 혈중 지질 수준과 연관된다. 지질은 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 포함한다. 일 구체예에서, 증상은 지방간이다. 일부 구체예에서, 지방간은 지방간염 또는 비-알코올성 지방간염이다.
본원에 개시된 올리고머 화합물을 사용하여 동물에서 혈중 글루코오스의 상승 개시를 예방하거나 지연시키는 방법뿐만 아니라 동물에서 베타-세포 작용을 유지하는 방법도 제공된다.
본 발명의 화합물은 이를 필요로 하는 동물, 이를 테면, 인간에서 GCGR의 발현을 조절하는 데 이용될 수 있다. 하나의 비-제한적인 구체예에서, 방법은 GCGR RNA의 발현을 감소시키는 안티센스 화합물의 유효량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 GCGR RNA의 수준 또는 작용을 효율적으로 감소시킨다. GCGR mRNA 수준의 감소가 발현된 GCGR 단백질 산물에서 변형을 유발할 수 있기 때문에, 이렇게 만들어진 변형도 측정될 수 있다. GCGR RNA 또는 발현된 단백질 산물의 수준 또는 작용을 효율적으로 감소시키는 본 발명의 안티센스 화합물은 활성 안티센스 화합물로 고려된다. 일 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 본원에서 예시적인 분석으로 측정된 바, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%로 RNA가 감소되도록 GCGR의 발현을 줄인다.
안티센스 기작
"안티센스 기작"은 화합물과 표적 핵산의 혼성화에 관여하는 모든 것이며, 여기에서, 혼성화의 결과 또는 효과는 표적 분해 또는 예를 들어, 전사 또는 스플라이싱(splicing)에 관여하는 세포 기작에 대하여 시간을 벌 수 있는 표적 점유이다.
표적
본원에서 이용된 용어 "표적 핵산" 및 "GCGR을 코딩하는 핵산 분자"는 GCGR을 코딩하는 DNA, 그러한 DNA에서 전사된 RNA(전-mRNA 및 mRNA 또는 이의 부분을 포함함) 및 그러한 RNA에서 유래된 cDNA도 포함하는 것으로 편의상 이용된다.
영역, 구획 및 부위
표적화 과정은 통상 목적하는 효과, 예를 들어, 발현의 조절이 유발되도록 안티센스 상호작용을 위한, 표적 핵산 내의 적어도 하나의 표적 영역, 구획 또는 부위를 결정하는 것을 포함한다. "영역"은 적어도 하나의 식별가능한 구조, 기능 또는 특성을 갖는 표적 핵산의 부분으로 정의된다. 표적 핵산의 영역 내는 구획이다. "구획"은 표적 핵산 내의 영역의 더 작은 또는 하위-부분으로 정의된다. 본 발명에서 이용되는 "부위"는 표적 핵산에서 독특한 뉴클레오염기 위치로 정의된다.
한번 하나 이상의 표적 영역, 구획 또는 부위가 확인되면, 올리고머 화합물은 목적하는 효과를 제공하기 위하여, 표적에 충분하게 상보적이도록, 예를 들어, 충분히 잘, 충분한 특이성으로 혼성화되도록 설계된다.
변이체
선택적인 RNA 전사체가 DNA의 동일한 게놈 영역에서 생산될 수 있는 것이 본 분야에 또한 알려져 있다. 이러한 선택적인 전사체는 일반적으로 "변이체"로 알려져 있다. 더욱 자세하게, "전-mRNA 변이체"는 그의 시작 또는 정지 위치에서 동일한 게놈 DNA로부터 생산되는 다른 전사체와 다른, 동일한 게놈 DNA로부터 생산되며, 인트론 및 엑손 서열을 둘 다 함유하는 전사체이다.
스플라이싱하는 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역 또는 이의 부분의 절단에 따라, 전-mRNA 변이체는 더 작은 "mRNA 변이체"를 생산한다. 결과적으로, mRNA 변이체는 처리된 전-mRNA 변이체이며, 각각의 독특한 전-mRNA 변이체는 스플라이싱의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 생산해야한다. 이들 mRNA 변이체는 "선택적 스플라이스 변이체"로도 알려져 있다. 전-mRNA 변이체의 스플라이싱이 발생하지 않는다면, 전-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하다.
전사를 시작하거나 정지하는 선택적 신호를 이용하여 변이체가 생산될 수 있으며, 전-mRNA 및 mRNA가 하나 이상의 시작 코돈 또는 정지 코돈을 소유하고 있음이 본 분야에 알려져 있다. 선택적 시작 코돈을 이용하는 전-mRNA 또는 mRNA로부터 유래된 변이체는 전-mRNA 또는 mRNA의 "선택적 시작 변이체"로 알려져 있다. 선택적 정지 코돈을 이용하는 전사체는 전-mRNA 또는 mRNA의 "선택적 정지 변이체"로 알려져 있다. 선택적 정지 변이체의 한 특정 타입은 다중 전사체가 전사의 기작에 의해 "폴리A 정지 신호들" 중 하나의 선택적 선별로부터 유발되어 생성되고, 독특한 폴리A 부위에서 종결되는 전사체가 생성되는 "폴리A 변이체"이다. 결과적으로, 본원에 개시된 변이체의 타입은 또한 적합한 표적 핵산이다.
표적 발현의 조절
"조절"은 기능의 변동, 예를 들어, 발현의 증가(자극 또는 유도) 또는 감소(억제 또는 축소)를 의미한다. 또다른 예로서, 발현의 조절은 전-mRNA 처리에서 스플라이스 부위 선택을 변동시키는 것을 포함할 수 있다. "발현"은 유전자의 코딩된 정보가 세포에서 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 모든 기능을 포함한다. 이들 구조는 전사 및 번역의 산물을 포함한다. "발현의 조절"은 상기 기능의 변동을 의미한다. "조절자"는 GCGR의 발현을 조절하고 입증된 표적 구획에 상보적인 적어도 하나의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 화합물이다.
표적 핵산의 발현 조절은 임의의 수의 핵산(DNA 또는 RNA) 기능의 변경을 통해 성취될 수 있다. 조절될 DNA의 기능은 복제 및 전사를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 내 템플레이트(template), 벡터, 플라스미드 작제물 또는 이외의 것에서 복제 및 전사될 수 있다. 조절될 RNA의 기능은 단백질 번역의 부위로 RNA의 전좌, 세포 내에서 RNA 합성의 부위와 떨어진 부위로 RNA의 전좌 및 RNA에서 단백질의 번역을 포함하나 이에 한정되지 않는 전좌 기능을 포함한다. 조절될 수 있는 RNA 처리 기능은 하나 이상의 RNA 종류를 수득하기 위한 RNA 스플라이싱, RNA의 캡핑(capping), RNA의 3' 성숙 및 RNA가 관여하거나 이에 의해 촉진될 수 있는 RNA를 포함하는 복합체 형성 또는 촉매 활성을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 발현의 조절은 일시적으로 또는 최종 안정 상태 수준로 하나 이상의 핵산 종류의 증가된 수준 또는 하나 이상의 핵산 종류의 감소된 수준을 유발할 수 있다. 표적 핵산 기능과의 이러한 간섭의 한 결과는 GCGR 발현의 조절이다. 이에 따라, 일 구체예에서, 발현의 조절은 표적 RNA 또는 단백질 수준에서 증가 또는 감소를 의미할 수 있다. 또다른 구체예에서, 발현의 조절은 하나 이상의 RNA 스플라이스 산물의 증가 또는 감소 또는 복수의 스플라이스 산물의 비율로의 변화를 의미할 수 있다.
혼성화 및 상보성
"혼성화"는 올리고머 화합물의 상보적 가닥의 접합을 의미한다. 특정 기작으로 한정하지 않으나, 대부분의 접합의 공통의 기작은 수소 결합을 포함하며, 이는 올리고머 화합물의 가닥의 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(뉴클레오염기) 사이에 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴(reversed Hoogsteen) 수소 결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 접합되는 상보적 뉴클레오염기이다. 혼성화는 다양한 환경 하에서 발생할 수 있다. 특정 결합이 바람직한 조건 하에서, 예를 들어, 생체내 분석 또는 치료적 처치의 경우 생리적 조건 하에서 및 실험관내 분석의 경우 분석이 수행되는 조건 하에서, 올리고머 화합물이 비-표적 핵산 서열에 비-특이적으로 결합하는 것을 방지하기에 충분한 정도의 상보성이 있을 때, 올리고머 화합물은 특이적으로 혼성화할 수 있다.
"엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물이 그의 표적 서열에 혼성화하고, 다른 서열에 최소의 수로 혼성화하는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 다른 환경에서 상이할 것이며, 올리고머 화합물이 표적 서열에 혼성화하는 "엄격한 조건"은 그들이 조사되는 분석과 올리고머 화합물의 조성물과 본질에 의하여 결정된다.
본원에서 이용된 "상보성"은 하나 또는 두개의 올리고머 화합물 가닥 상에서 두 뉴클레오염기 사이의 정확한 접합을 위한 능력을 말한다. 예를 들어, 안티센스 화합물의 특정 위치에서 뉴클레오염기가 표적 핵산의 특정 위치의 뉴클레오염기와 수소 결합할 수 있다면, 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보적 위치일 것이라 판단된다. 각 분자에서 충분한 수의 상보적 위치가 서로 수소 결합할 수 있는 뉴클레오염기에 의해 차지될 때, 올리고머 화합물 및 DNA 또는 RNA는 서로 상보적이다. 이에 따라, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 올리고머 화합물과 표적 핵산 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 충분한 수의 뉴클레오염기에 걸친 상보성 또는 충분한 정도의 정확한 접합을 나타내는 데 이용되는 용어이다.
올리고머 화합물의 서열이 특이적으로 혼성화할 그의 표적 핵산의 서열에 100% 상보적일 필요가 없는 것은 본 분야에 알려져 있다. 더욱이, 올리고뉴클레오티드는 사이에 있거나 근접한 구획이 혼성화 사건(예를 들어, 루프(loop) 구조, 미스매치(mismatch) 또는 헤어핀 구조)에 관여하지 않도록 하나 이상의 구획에 걸쳐 혼성화할 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물은 표적화된 표적 핵산 서열 내에서 표적 영역에 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 적어도 92%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 상보성을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 화합물의 20 뉴클레오염기 중 18개가 표적 영역에 상보적이며, 이에 따라 특이적으로 혼성화하는 올리고머 화합물은 90 퍼센트 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 남아있는 비상보적인 뉴클레오염기는 상보적 뉴클레오염기와 함께 무리를 지어 있거나 산재되어 있을 수 있으며, 서로 또는 상보적 뉴클레오염기에 인접할 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전 상보적인 두 영역에 의해 프랭킹된 4개의 비상보적 뉴클레오염기를 지니는 18 뉴클레오염기 길이의 올리고머 화합물은 표적 핵산과 전체 77.8%의 상보성을 지닐 것이며, 이에 따라 본 발명의 범위 내에 있을 것이다. 올리고머 화합물과 표적 핵산의 영역의 퍼센트 상보성은 본 분야에 알려진 BLAST 프로그램(기본 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 루틴하게 결정될 수 있다(Altschul et al., J. MoI. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). 퍼센트 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들어, Smith 및 Waterman(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489) 알고리즘을 이용한 디폴트 세팅을 이용하는 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI)에 의해 결정될 수 있다.
올리고머 화합물
용어 "올리고머 화합물"은 핵산 분자의 영역에 혼성화할 수 있는 폴리머 구조를 말한다. 이러한 용어는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방체 및 이들의 키메라 배합물을 포함한다. 올리고머 화합물은 루틴하게 선형으로 제조되거나, 달리 원형으로 제조되거나 결합될 수도 있다. 또한, 분지 구조가 본 분야에 알려져 있다. "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 올리고머 화합물"은 그것이 혼성화하는 핵산 분자의 영역에 적어도 부분적으로 상보적이며, 그 발현을 조절하는(증가시키거나 감소시키는) 올리고머 화합물을 말한다. 결과적으로, 모든 안티센스 화합물이 올리고머 화합물으로 명명될 수 있으나, 모든 올리고머 화합물이 안티센스 화합물인 것은 아니다. "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 핵산-기초의 올리고머인 안티센스 화합물이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 올리고머 화합물의 비제한적인 예는 프라이머, 프로브, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열(EGS) 올리고뉴클레오티드, 선택적 스플라이서 및 siRNA를 포함한다. 이와 같이, 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형, 분지 또는 헤어핀의 형태로 도입될 수 있으며, 구조적 요소, 이를 테면, 내부 또는 말단 벌지(bulge) 또는 루프를 함유할 수 있다. 올리고머 이중-가닥 화합물은 이중-가닥 화합물을 형성하기 위하여 혼성화된 두 가닥이거나, 혼성화하고 완전하게 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 허용하기에 충분하게 자기 상보적인 단일 가닥일 수 있다.
본 발명의 본문에서 "키메라" 올리고머 화합물 또는 "키메라"는 복수의 화학적으로 상이한 영역을 함유하며, 각각 적어도 하나의 모노머 유니트, 이를 테면, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 뉴클레오티드를 포함하는 단일- 또는 이중-가닥 올리고머 화합물, 이를 테면, 올리고뉴클레오티드이다.
"갭머"는 비-데옥시올리고뉴클레오티드 구획에 의해 프랭킹된 2'-데옥시올리고뉴클레오티드 영역을 지닌 올리고머 화합물, 일반적으로 올리고뉴클레오티드로 정의된다. 중심 영역은 "갭"으로 언급된다. 프랭킹 구획은 "윙"으로 언급된다. 윙 중 하나가 0개의 비-데옥시올리고뉴클레오티드 모노머를 갖는다면, "헤미머"라 칭한다.
NAFLD
"비알콜성 지방간 질환"(NAFLD)은 간세포(간지방증)에서의 단순한 트리글리세리드 축적에서부터 염증(지방간염), 섬유증 및 간경변을 갖는 간지방증 범위의 질환 스펙트럼을 포함한다. 비알콜성 지방간염(NASH)은 트리글리세리드의 침전을 넘어서 NAFLD의 진행으로부터 발생한다. 괴사, 염증 및 섬유증의 포함이 가능한 2차 타격은 NASH의 진행에 요구된다. 2차 타격에 대한 후보는 하기의 넓은 카테고리로 그룹화될 수 있다: 산화적 스트레스에서 증가를 일으키는 인자 및 전염증성 사이토카인의 발현을 개선시키는 인자. 간에서의 증가된 트리글리세리드가 동물 및 인간 간세포에서의 증가된 산화적 스트레스를 유도한다고 제안되어 왔고, 간에서의 트리글리세리드 축적, 산화적 스트레스와 NASH로의 간지방증 진행 사이의 잠정적인 인과관계를 지적한다(Browning 및 Horton, J. Clin . Invest., 2004, 114, 147-152). 고중성지방혈증 및 고지방산혈증은 말초 조직에서의 트리글리세리드 축적을 초래할 수 있다(Shimamura et al., Biochem . Biophys . Res. Commun., 2004, 322, 1080-1085). 본 발명의 일 구체예는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 올리고머 화합물을 투여함으로써 동물의 간에서 지방을 감소시키는 방법이다. 본 발명의 다른 구체예는 치료적 또는 예방적 유효량의 본 발명의 올리고머 화합물을 투여함으로써 동물에서 간지방증을 치료하는 방법이다. 어떤 구체예에서, 지방간은 지방간염이다. 어떤 구체예에서, 지방간은 NASH이다.
화학적 변형
변형되고 선택적인 뉴클레오염기
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 화합물에서 다른 염기가 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 존재하는 변이체를 포함한다. 예를 들어, 제1의 뉴클레오티드가 아데노신이라면 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하는 변이체가 생산될 수 있다. 이는 올리고머 화합물의 임의의 위치에서 수행된다. 이어서 이들 화합물은 본원에 기재되어 있는 방법을 이용하여 테스트하여 GCGR mRNA의 발현을 감소시키는 능력을 결정한다.
올리고머 화합물은 또한 뉴클레오염기(당업계에서 종종 헤테로사이클 염기 또는 단지 "염기"로서 언급됨) 변형 또는 치환을 포함한다. 본원에서, "변형되지 않은" 또는 "자연적인" 뉴클레오염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. "치환"은 변형되지 않은 염기로 대체되거나 다른 변형되지 않은 염기 또는 자연적인 염기를 갖는 자연적인 염기로 대체되는 것을 의미한다. "변형된" 뉴클레오염기는 다른 합성 뉴클레오염기 및 자연적인 뉴클레오염기, 이를 테면, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C=C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 의미한다. 추가의 변형된 뉴클레오염기는 트리사이클 피리미딘, 이를 테면, 페녹사진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 이를 테면, 치환된 페녹사진 시티딘(예: 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 카브아졸 시티딘(2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도(3',2':4,5)피롤로(2,3-d)피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 뉴클레오염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 추가의 뉴클레오염기는 미국 측허 번호 3,687,808에 기재되어 있는 것, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 기재되어 있는 것, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 기재되어 있는 것 및 Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. , ed., CRC Press, 1993에 기재되어 있는 것을 포함한다. 이들 뉴클레오염기의 어떤 것은 본 발명의 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데에 적절한 것으로서 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃에 의해 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 보이고, 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 슈가 변형과 배합시킬 경우, 현재 적절한 염기 치환이다. 당업계에서 염기의 변형이 핵산 서열에서 치환을 제조하기 위하여 이러한 화학적 변형을 수반하는 것은 아니라는 것은 이해된다.
다른 변형된 뉴클레오염기뿐만 아니라 상술한 바과 같이 특정하게 변형된 뉴클레오염기의 제조가 기재된 대표적인 미국 특허는 한정하는 것은 아니지만, 상술한 미국 3,687,808뿐만 아니라, 미국 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 5,681,941; 및 5,750,692를 포함한다.
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 하나 이상의 자연적으로 발생한 헤테로사이클 염기 부분 대신으로 폴리사이클 헤테로사이클 화합물을 포함한다. 트리사이클 헤테로사이클 화합물의 수는 앞서 보고되었다. 이들 화합물은 변형된 가닥의 표적 가닥에 대한 결합 성질을 증가시키기 위하여 안티센스 적용에 일반적으로 사용된다. 가장 많이 연구되는 변형은 구아노신을 표적화화기 때문에 G-클램프 또는 시티딘 유사체라는 용어로 불린다. 제2의 가닥에서 구아노신과 3 수소 결합을 생성하는 대표적인 시토신 유사체는 1,3-디아자페녹사진-2-온(Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846), 1,3-디아자페노티아진-2-온,(Lin, K. -Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874) 및 6,7,8,9-테트라플루오로-1,3-디아자페녹사진-2-온(Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드로 통합된 이들 염기 변형은 상보적인 구아닌으로 혼성화 되는 것으로 나타났고 후자는 또한, 아데닌으로 혼성화되는 것으로 나타났고 적층 상호작용에 의한 나선형 온도 안정성을 개선시키는 것으로 나타났다(또한 미국 특허 공개공보 20030207804 및 20030175906 참조).
추가의 헬릭스-안정성 성질은 시토신 유사체/치환체가 딱딱한 1,3-디아자페녹사진-2-온 스캐폴드(Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532)에 부착되는 아미노에톡시 일부를 가질 경우 발견되었다(Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). 결합 연구는 단일 결합이 5-메틸 시토신(dC5me)에 상대적으로 18℃ 이하의 ΔTm을 갖는 그에 상보적인 표적 DNA 또는 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드 모델의 결합 친화성을 개선시킬 수 있음을 증명하였고, 이는 단일 변형에 대하여 높은 친화성 개선을 보였다. 다른 한편, 나선형 안정성에서 수득한 것은 올리고뉴클레오티드의 특이성을 손상시키지 않았다.
본 발명에서 사용 가능한 추가의 트리사이클 헤테로사이클 화합물 및 이의 사용 방법은 미국 특허 6,028,183, 및 6,007,992에 기재되어 있다.
페녹사진 유도체의 증진된 결합 친화성은 이의 손상되지 않은 서열 특이성과 함께 이들을 더욱 효능 있는 안티센스-염기 약물의 향상에 대하여 가치있는 뉴클레오염기 유사체로 만든다. 실재로, 페녹사진 치환을 포함하는 헵타뉴클레오티드가 RNase H 활성, 세포 흡수 증가 및 증가된 안티센스 활성을 나타내는 것이 가능한 것으로 증명된 시험관 내 실험으로부터 믿을만한 데이터가 도출되었다(Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). 단일 치환이 20 mer 2'-데옥시포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 시험관 내 유효성을 유의하게 개선시키는 것으로 나타났으므로, 활성 증가는 G-클램프의 경우에 더욱 두드러졌다 (Flanagan, W. M.; Wolf, JJ.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518).
헤테로사이클 염기로서 유용한 추가의 변형된 폴리사이클 헤테로사이클 화합물은 한정하는 것은 아니지만, 상술한 미국 특허 3,687,808뿐만 아니라, 미국 특허: 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,434,257; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; 5,645,985; 5,646,269; 5,750,692; 5,830,653; 5,763,588; 6,005,096; 및 5,681,941, 및 미국 특허 공개공보 20030158403에 개시되어 있다.
배합물
본 발명의 조성물은 두개 이상의 올리고머 화합물을 포함할 수 있다. 다른 관계된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 제 1의 핵산 및 제 2의 핵산 표적을 표적화하는 하나 이상의 추가의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 동일한 핵산 표적의 다른 영역을 표적화하는 두개 이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 두개 이상의 배합된 화합물은 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
배합 요법
본 발명의 화합물은 배합 요법으로 사용될 수 있고, 여기에서 추가의 효과는 증상을 치료하기 위하여 본 발명의 하나 이상의 화합물 및 하나 이상의 다른 적절한 치료적/예방적 화합물을 투여함으로써 달성된다. 적절한 치료적/예방적 화합물(들)은 한정하는 것은 아니지만, 당강하제, 항비만제 및 지질강하제를 포함한다. 당강하제는 한정하는 것은 아니지만 호르몬, 호르몬 모방체, 또는 인크레틴 모방체(예: 흡입용 인슐린을 포함하는 인슐린, GLP-1 또는 GLP-1 유사체, 이를 테면, 리라글루티드, 또는 엑세나티드), DPP(IV) 억제제, 술포닐우레아(예: 아세토헥사마이드, 클로로프로파미드, 톨부타미드, 톨아자미드, 글리메피리드, 글리피지드, 글리브리드 또는 글리클라지드), 비구아니드(메트포민), 메글리티니드(예: 나테글리니드 또는 레파글리니드), 티아졸리디네디온 또는 다른 PPAR-감마 작용제(예: 피오글리타존 또는 로지글리타존), 알파-글루코시다아제 억제제(예: 아카보스 또는 미글리톨), 또는 GCGR을 표적으로 하지 않는 안티센스 화합물을 포함한다. 또한 듀얼 PPAR-작용제(예: Bristol-Myers Squibb에 의해 개발된 뮤라글리타자 또는 Astra-Zeneca에 의해 개발된 테사글리타자)를 포함한다. 또한 개발 중인 다른 당뇨병 치료도 포함된다(예: Novartis에서 개발 중인 LAF237; Merck에서 개발 중인 MK-0431; 또는 Sanofi-Aventis에서 개발 중인 리모나반트). 항비만제는 한정하는 것은 아니지만, 식욕 억제제(예: 펜터민 또는 Meridia™), 지방 흡수 억제제, 이를 테면, 올리스타트(예: Xenical™) 및 식욕을 자극하는 공복감 신호를 억제하는 섬모 신경성장인자의 변형된 형태를 포함한다. 지질강하제는 한정하는 것은 아니지만, 담즙산염 씨퀘스터링 레진(예: 콜레스티라민, 콜레스티폴, 및 콜레세벨람 하이드로클로라이드), HMGCoA-환원 효소 억제제(예: 로바스타틴, 프라바스타틴, 아토바스타틴, 심바스타틴 및 플루바스타틴), 니코틴산, 피브린산 유도체(예: 클로피브레이트, 젬피브로질, 페노피브레이트, 벤자피브레이트 및 시프로피브레이트), 프로브콜, 네오마이신, 덱스트로티록신, 식물성 스타놀 에스테르, 콜레스테롤 흡수 억제제(예: 이제티마이브), CETP 억제제(예: 토르세트라피브, 및 JTT-705), MTP 억제제(예: 임플리타피드), 담즙산 수송제의 억제제(혀끝의 나트륨 의존성 담즙산 수송제), 간의 CYP7a 조절제, ACAT 억제제(예: 아바시미베), 에스트로겐 대체 치료제(예: 타목시젠), 합성 HDL(예: ETC-216), 항염증제(예: 글루코코티코이드), 또는 GCGR을 표적으로 하지 않는 안티센스 화합물을 포함한다. 이들 약물의 하나 이상은 하나 이상의 GCGR의 안티센스 억제제와 배합되어 추가의 치료적 효과를 달성할 수 있다.
올리고머 합성
변형된 뉴클레오시드 및 변형되지 않은 뉴클레오시드의 올리고머화는 DNA(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal(1993), Humana Press) 및/또는 RNA(Scaringe, Methods(2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith(1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron(2001), 57, 5707-5713)에 대한 문헌 절차 및 본원에 참조로서 인용된 미국 공개 번호 2005-0014713에 따라 일반적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 올리고머 화합물은 고체상 합성의 공지된 기술로 통상적이고 일반적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성은 위한 장치는 예를 들어 Applied Biosystems(Foster City, CA)를 포함하는, 몇몇의 벤더에 의해 시판되고 있다. 이러한 합성을 위하여 당업계에 공지된 임의의 다른 수단은 부가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 유사한 기술을 이용하는 것이 공지되어 있다.
올리고머 정제 및 분석
올리고뉴클레오티드 정제 및 분석의 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 분석 방법은 모세관 전기영동(CE) 및 전기분무-질량 분석법을 포함한다. 이러한 합성 및 분석 방법은 다중-웰 플레이트에서 수행될 수 있다.
참조에 의한 비한정적인 개시 및 인용
본 발명의 특정한 화합물, 조성물 및 방법이 특정한 구체예에 따라 특정적으로 기술된 반면, 본원의 예시는 단지 본 발명의 화합물만을 제공하지만, 동일한 것으로 한정하려는 것은 아니다. 각 참조, GENBANK® 수탁 번호 및 본 명세서에서 인용된 것은 본원에서 이의 전체가 참조로서 인용된다.
실시예 1
발현 조절의 분석
GCGR 발현의 조절은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. GCGR mRNA 수준은 예를 들어, 노던 블랏 분석, 상대적 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 real-time PCR에 의해 정량화할 수 있다. RNA 분석은 공지된 방법에 의해 총 세포 RNA 또는 poly(A)+ mRNA 상에서 수행될 수 있다. RNA 분리 방법은 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1- 4.2.9 및 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993에 기재되어 있다.
노던 블랏 분석은 당업계에서 기본적인 것이고 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996에 기재되어 있다. Real-time 정량(PCR)은 편리하게 상업적으로 이용가능한 ABI PRISM™ 7700 서열 검출 시스템(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 수행될 수 있고 제조자의 지침에 따라 사용된다.
GCGR에 의해 코딩된 단백질 수준은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대, 면역침전법, 웨스턴 블랏 분석(immunoblotting), ELISA 또는 형광 활성 세포 선별(FACS)로 정량화될 수 있다. GCGR에 의해 코딩된 단백질에 유도된 항체는 다양한 방법, 이를 테면, MSRS의 항체 카탈로그(Aerie Corporation, Birmingham, MI)로부터 확인 및 수득될 수 있거나, 통상의 항체 발생 방법을 통하여 제조될 수 있다.
다클론성 항혈청의 제조에 대한 방법은, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997에 기재되어 있다. 단일클론 항체의 제조는, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1 - 11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997에 기재되어 있다.
면역침전법은 당업계에서 기본적인 것이고, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998에 기재되어 있다. 웨스턴 블랏(immunoblot) 분석은 당업계에서 기본적인 것이고, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997에 기재되어 있다. ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assays)는 당업계에서 기본적인 것이고, 예를 들어, Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991에 기재되어 있다.
표적 핵산 발현 상에서 본 발명의 올리고머 화합물의 효과는 측정가능한 수준에서 존재하는 표적 핵산을 제공하는 다양한 임의의 세포에서 테스트될 수 있다. 표적 핵산 발현 상에서 본 발명의 올리고머 화합물의 효과는 예를 들어, PCR 또는 노던 블랏 분석을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 세포주는 정상적 조직 및 세포 타입 및 다양한 질환과 관련(예: 과대증식 질환)된 세포로부터 유래된다. 다양한 조직 및 종으로부터 유래된 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA), Japanese Cancer Research Resources Bank(Tokyo, Japan), 또는 Centre for Applied Microbiology and Research(Wiltshire, united Kingdom)로부터 입수될 수 있다.
1차 세포 또는 동물로부터 분리된 세포 및 지속 배양이 아닌 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있거나 다양한 상업적 공급자로부터 구입될 수 있다. 부가적으로, 1차 세포는 임상적 상황에서 인간 대상 증여자(예: 혈액 증여자, 외과적 환자)로부터 수득된 것을 포함한다.
세포 타입
표적 핵산 발현 상에서 올리고머 화합물의 효과를 HepG2 세포에서 테스트하였다.
HepG2 세포
인간 간아세포종 세포주 HepG2는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)로부터 구입하였다. HepG2 세포를 10% 우태아혈청, 1 mM 불필수 아미노산, 및 1 mM 피루브산 나트륨(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)이 보충된 Eagle's MEM에서 일반적으로 배양하였다. 세포를 일반적 으로 트립신화 및 약 90% 합류에 도달할 때 희석에 의해 통과시켰다. 멀티웰 배양 플레이트를 세포배양을 위하여 인산 완충 식염수 중 타입 1 랫트 꼬리 콜라겐(BD Biosciences, Bedford, MA)의 1:100 희석액으로 코팅함으로써 제조하였다. 콜라겐-함유 플레이트를 약 1 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 콜라겐을 옮기고 웰을 인산 완충 식염수로 2번 세정하였다. 세포를 올리고머 화합물 트랜스펙션 실험에 사용하기 위하여 약 8,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트(Falcon-Primaria #353872, BD Biosciences, Bedford, MA)로 파종하였다.
올리고머 화합물로 처리
세포가 적절한 합류점에 도달하면, 이들을 기재한 바와 같은 트랜스펙션 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 당업계에 공지된 다른 적절한 트랜스펙션 시약은 한정하는 것은 아니지만, LIPOFECTAMINE™, OLIGOFECTAMINE™, 및 FUGENE™을 포함한다. 당업계에 공지된 다른 적절한 트랜스펙션 방법은 한정하는 것은 아니지만, 일렉트로포레이션을 포함한다.
LIPOFECTIN ™
세포가 65-75% 합류점에 도달하면, 이들을 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드를 Opti-MEM™-1 환원 혈청 배지(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 중의 LIPOFECTIN™(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)과 혼합하여 원하는 올리고뉴클레오티드 농도 및 100 nM 올리고뉴클 레오티드 당 2.5 또는 3 ㎍/mL의 LIPOFECTIN ™이 되도록 하였다. 이 트랜스펙션 혼합물을 상온에서 약 0.5 시간 동안 배양하였다. 96-웰 플레이트에서 성장한 세포를 위하여, 웰을 100 ㎕의 OPTI-MEM™-1로 한번 세정한 다음 130 ㎕의 트랜스펙션 혼합물로 처리하였다. 24-웰 플레이트에서 성장한 세포 또는 다른 기준 조직 배양 플레이트를 적절한 용적의 배지 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 유사하게 처리하였다. 세포를 처리하고 2회 또는 3회 반복하여 데이터를 수득하였다. 37℃에서 약 4-7 시간의 처리 후, 트랜스펙션 혼합물을 포함하는 배지을 신선한 배양 배지로 교환하였다. 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 16-24 시간 배양하였다.
CYTOFECTIN ™
세포가 65-75% 합류점에 도달하면, 이들을 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM™-1 환원 혈청 배지(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) 중의 CYTOFECTIN™(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)과 혼합하여 원하는 올리고뉴클레오티드 농도 및 100 nM 올리고뉴클레오티드 당 2 또는 4 ㎍/mL의 CYTOFECTIN™이 되도록 하였다. 이 트랜스펙션 혼합물을 상온에서 약 0.5 시간 동안 배양하였다. 96-웰 플레이트에서 성장한 세포를 위하여, 웰을 100 ㎕의 OPTI-MEM™-1으로 한번 세정한 다음 130 ㎕의 트랜스펙션 혼합물로 처리하였다. 24-웰 플레이트에서 성장한 세포 또는 다른 기준 조직 배양 플레이트를 적절한 용적의 배지 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 유사하게 처리 하였다. 세포를 처리하고 2회 또는 3회 반복하여 데이터를 수득하였다. 37℃에서 약 4-7 시간의 처리 후, 트랜스펙션 혼합물을 포함하는 배지을 신선한 배양 배지로 교환하였다. 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리한 후 16-24 시간 배양하였다.
대조 올리고뉴클레오티드
대조 올리고뉴클레오티드를 특정한 세포주에 대한 최상의 올리고머 화합물 농도를 결정하기 위하여 사용하였다. 또한, 본 발명의 올리고머 화합물을 올리고머 화합물 스크리닝 실험 또는 표현형 어세이에서 테스트하고, 동시에 대조 올리고뉴클레오티드를 본 발명의 화합물로 테스트하였다. 어떤 구체예에서, 대조 올리고뉴클레오티드를 네가티브 대조 올리고뉴클레오티드, 즉 유전자 발현 또는 표현형 상에서 효과의 부재를 측정하기 위한 수단으로서 사용하였다. 대안적인 구체예에서, 대조 올리고뉴클레오티드를 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드, 즉 유전자 발현 또는 표현에 영향을 미치는 공지된 올리고뉴클레오티드로서 사용하였다. 대조 올리고뉴클레오티드를 표 2에 나타내었다. "표적 명칭"은 표적화하는 올리고뉴클레오티드에 대한 유전자를 의미한다. "표적의 종"은 올리고뉴클레오티드가 표적 mRNA에 대하여 완전하게 상보적인 종을 의미한다. "모티브"는 화학적으로 올리고뉴클레오티드를 포함하는 분명한 영역을 의미한다. 표 2에서 특정한 화합물은 키메릭 올리고뉴클레오티드이고, 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된 중심의 "갭" 영역으로 구성되고, 이는 "윙"에 의해서 양쪽 측면(5' 및 3')에서 프랭킹된다. 윙은 2'-MOE 뉴클레오티드로 공지된 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 구성된다. 각 갭머(gapmer) 올리고뉴클레오티드의 "모티브"는 표 2에 기재되고 각 갭 영역 및 윙에서 뉴클레오티드의 수를 의미하는데, 예를 들어, "5-10-5"는 5-뉴클레오티드 윙에 의해 프랭킹된 10-뉴클레오티드 갭영역을 갖는 갭머를 의미한다. ISIS 29848은 랜덤한 올리고머 화합물의 혼합물이다; 이의 서열은 표 2에 나타내었고, 여기에서 N은 A, T, C 또는 G일 수 있다. 인터뉴클레오시드(백본) 결합은 표 2의 올리고뉴클레오티드를 통한 포스포로티오에이트이다. 변형되지 않은 시토신은 뉴클레오티드 서열에서 "UC"로 나타내어진다; 모든 다른 시토신은 5-메틸시토신이다.
세포주 테스트, 올리고머 화합물 스크리닝 및 표현형 어세이를 위한 대조 올리고뉴클레오티드
ISIS # 표적 명칭 표적의 종 서열(5' 에서3 ') 모티브 서열 번호
113131 CD86 인간
Figure 112008027592940-PCT00001
 5-10-5 8
289865 forkhead box 01A (횡문근육종) 인간
Figure 112008027592940-PCT00002
 5-10-5 9
25237 인테그린 베타 3 인간
Figure 112008027592940-PCT00003
 4-10-4 10
196103 인테그린 베타 3 인간
Figure 112008027592940-PCT00004
 5-10-5 11
148715 Jagged 2 인간; 마우스; 랫트
Figure 112008027592940-PCT00005
 5-10-5 12
18076 Jun N-말단 키나아제-1 인간
Figure 112008027592940-PCT00006
 5-9-6 13
18078 Jun N-말단 키나아제-2 인간
Figure 112008027592940-PCT00007
 5-9-6 14
183881 키네신 유사-1 인간
Figure 112008027592940-PCT00008
 5-10-5 15
29848 없음 없음
Figure 112008027592940-PCT00009
 5-10-5 16
226844 Notch(초파리) 유사체 1 인간; 마우스
Figure 112008027592940-PCT00010
 5-10-5 17
105990 페록시좀 증식제-활성 수용체 감마 인간
Figure 112008027592940-PCT00011
 5-10-5 18
336806 Raf 키나아제 C 인간
Figure 112008027592940-PCT00012
 5-10-5 19
15770 Raf 키나아제 C 인간; 뮤린; 사크로마 바이러스; 랫트
Figure 112008027592940-PCT00013
 5-10-5 20
사용된 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주에 따라 변화된다. 특정한 세포주에 대하여 최상의 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하기 위하여, 세포를 파지티브 대조 336806 또는 ISIS 18078로 처리하였다. 마우스 또는 랫트 세포에 대한 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, ISIS 15770일 수 있다. 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드의 농도는 표적 mRNA, 예를 들어, ISIS 15770에 대한 랫트 키나아제 C의 80% 감소를 유도하였고, 이어서 그 세포주에 대한 연속적인 실험에서 새로운 올리고뉴클레오티드에 대한 농도를 스크리닝하기 위하여 사용되었다. 80%의 감소가 일어나지 않았다면, 파지티브 대조 올리고뉴클레오티드의 가장 낮은 농도는 표적 mRNA의 60% 감소를 유도하였고, 이어서 그 세포주에 대한 연속적인 실험에서 새로운 올리고뉴클레오티드에 대한 농도를 스크리닝하기 위하여 사용되었다. 60%의 감소가 일어나지 않았다면, 특정한 세포주는 올리고뉴클레오티드 트랜스펙션 실험에 적절하지 않은 것으로 간주하였다. 본원에서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 리포좀제를 이용하여 트랜스펙션 될 경우에는 50 nM 내지 300 nM이고 안티센스 올리고뉴클레오티드가 일렉트로포레이션으로 트랜스펙션 될 경우에는 1 μM 내지 40 μM이다.
실시예 2
GCGR mRNA 수준의 Real-time 정량 PCR 분석
GCGR mRNA 수준의 Real-time 정량 PCR 분석은 제조자의 지시에 따라 ABI PRISM™ 7600, 7700, 또는 7900 Sequence Detection System(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 real-time 정량 PCR로 수행하였다.
RT, real-time PCR로 수득된 유전자 표적 정량은 유전자 발현이 지속적인 GAPDH의 발현 수준을 이용하여 표준화하거나, RiboGreen™(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)을 이용하여 총 RNA를 정량함으로써 표준화하였다. 총 RNA는 RiboGreen™ RNA 정량제(Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)를 이용하여 정량하였다. 170 ㎕의 RiboGreen™ 워킹 시약(1O mM Tris-HCl 중 1:350으로 희석된 RiboGreen™시약, 1 mM EDTA, pH 7.5)를 정제된 세포 RNA 30 ㎕를 포함하는 96-웰 플레이트로 피펫팅하였다. 플레이트를 485 nm의 여기 및 530 nm의 방출을 갖는 CytoFluor 4000(PE Applied Biosystems)에서 리딩하였다.
GAPDH 발현을 표적의 정량과 동시에 또는 개별적으로, RT, real-time PCR로 정량하였다. 표적 수준의 측정과 동시 측정을 위하여, 측정하기 위한 표적 유전자에 특이적인 프라이머-프로브 세트를 정량적 PCR 분석에 앞서 GAPDH 증폭을 갖는 "멀티플렉스"에 대한 이들의 능력에 대하여 측정하였다. 멀티플렉스는 다양한 DNA 종의 검출을 의미하고, 단일 튜브에서 표적 및 내생적 GAPDH 대조의 경우에, GAPDH에 대한 프라이머-프로브 세트는 표적의 증폭을 방해하지 않는 것이 요구된다.
real-time PCR에 사용하기 위한 프로브 및 프라이머는 표적-특정 서열에 대하여 혼성화되도록 디자인하였다. 프라이머 및 프로브 디자인의 방법은 당업계에 공지되어 있다. real-time PCR에서 사용하기 위한 프라이머 및 프로브 디자인은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어, 예를 들어, Primer Express®(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 수행할 수 있다. 혼성화를 위한 프라이머 및 프로브 및 표적 핵산 서열을 표 4에 나타내었다. 표적-특이 PCR 프로브는 5' 말단에 공유결합된 FAM 및 3' 말단에 공유결합된 TAMRA 또는 MGB를 갖고, 여기에서 FAM은 형광성 염료이며 TAMRA 또는 MGB는 형광 소멸(quencher) 염료이다.
분리 후, RNA를 순차적으로 역전사효소(RT) 반응 및 real-time PCR에 적용하였으며, 둘 모두 같은 웰에서 수행된다. RT 및 PCR 시약은 Invitrogen Life Technologies(Carlsbad, CA)에서 구입하였다. RT, real-time PCR은 20 ㎕ PCR 칵테일(MgCl2 무함유 2.5 x PCR 버퍼, 6.6 mM MgCl2, dATP, dCTP, dCTP 및 dGTP 각각 375 μM, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 각각 375 nM, 프로브 125 nM, 4 유닛의 RNAse 억제제, 1.25 유닛의 PLATINUM® Taq, 5 유닛의 MuLV 역전사효소 및 2.5 x ROX 염료)을, 총 RNA 용액 30 ㎕(20-200 ng)를 포함하는 96-웰 플레이트에 첨가하는 것과 같은 방법으로 수행하였다. RT 반응은 48℃에서 30분 동안 배양함으로써 수행하였다. 이어서 PLATINUM® Taq을 활성화시키기 위하여 95℃에서 10분 배양 한 후 두 단계의 PCR 프로토콜의 40 사이클을 수행하였다: 95℃에서 15초(변성) 후 60℃에서 1.5분(어닐링/연장).
본 발명의 화합물은 본원에서 상술한 바와 같이, 인간 GCGR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하여, 정량 real-time PCR로 인간 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 측정될 수 있다. 예를 들어:
정방향 프라이머: TGCGGTTCCCCGTCTTC(본원에서 서열 번호 21로 나타내어짐)
역방향 프라이머: CTTGTAGTCTGTGTGGTGCATCTG(본원에서 서열 번호 22로 나타내어짐)
및 PCR 프로브: FAM-CATCTTCGTCCGCATCG-MGB(본원에서 서열 번호 23으로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 MGB는 비-형광성 형광 소멸 염료이다.
본 발명의 화합물은 본원에서 다른 실시예에서 기재한 바와 같이, 랫트 GCGR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하여, 정량 real-time PCR로 랫트 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 측정될 수 있다. 예를 들어:
정방향 프라이머: CAGTGCCACCACAACCTAAGC(본원에서 서열 번호 24로 나타내어짐)
역방향 프라이머: AGTACTTGTCGAAAGTTCTGTTGCA(본원에서 서열 번호 25로 나타내어짐)
및 PCR 프로브: FAM-TGCTGCCCCCACCTACTGAGCTG-TAMRA(본원에서 서열 번호 26으로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 TAMRA는 형광 소멸 염료이다.
본 발명의 화합물은 본원에서 다른 실시예에서 기재한 바와 같이, 원숭이 GCGR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트를 이용하여, 정량 real-time PCR로 원숭이 표적 mRNA 수준 상에서 이들의 효과에 대하여 측정될 수 있다. 예를 들어:
정방향 프라이머: ACTGCACCCGCAACGC(본원에서 서열 번호 27로 나타내어짐)
역방향 프라이머: CACGGAGCTGGCCTTCAG(본원에서 서열 번호 28로 나타내어짐)
및 PCR 프로브: FAM-ATCCACGCGAACCTGTTTGTGTCCTT-TAMRA(본원에서 서열 번호 29로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 TAMRA는 형광 소멸 염료이다.
원숭이 GCGR에 대하여 혼성화되도록 디자인된 프라이머-프로브 세트의 다른 실시예는 하기와 같다:
정방향 프라이머: GAACCTTCGACAAGTATTCCTGCT(본원에서 서열 번호 30으로 나타내어짐)
역방향 프라이머: GGGCAGGAGATGTTGGCC(본원에서 서열 번호 31로 나타내어짐)
및 PCR 프로브: FAM-CCAGACACCCCCGCCAATAACA-TAMRA(본원에서 서열 번호 32로 나타내어짐), 여기에서 FAM은 형광성 염료이고 TAMRA는 형광 소멸 염료이다.
실시예 3 인간 GCGR 을 표적화하는 "확장된 갭" 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인
일련의 올리고머 화합물을 다양한 사이즈의 데옥시뉴클레오티드 갭 및 2'-MOE 윙을 갖고, 인간 GCGR(Genbank 수탁 번호: NM_000160.1, 본원에서 서열 번호 1로 나타내어짐)을 표적하도록 디자인하였다. 각 올리고뉴클레오티드는 20 뉴클레오염기 길이이고 동일한 뉴클레오염기 서열(GCACTTTGTGGTGCCAAGGC, 본원에서 서열 번호 2로 나타내어짐)을 가지므로, 서열 번호 1의 동일한 구획(뉴클레오염기 532 내지 551)을 표적으로 한다. 화합물은 표 3에 나타내었다. 평문은 데옥시뉴클레오티드를 나타내고, 뉴클레오티드는 진하게 표현하였으며, 밑줄은 2'-0-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드를 나타낸다. 인터뉴클레오시드 결합은 모두 포스포로티오에이트이고, 모든 시토신은 5-메틸시토신이다. 표 3에서 각 화합물의 "모티브"는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 독특한 영역을 나타낸다.
표 3
인간 GCGR 을 표적화하는 안티센스 화합물
Figure 112008027592940-PCT00014
5-10-5 갭머, ISIS 310457를 시험관 내에서 표적 mRNA 수준을 감소시키는 능력에 대하여 테스트하였다. HepG2 세포를 상술한 바와 같은 방법을 이용하여 ISIS 310457로 처리하였다. ISIS 310457을 인간 글루카곤 수용체 mRNA 수준 상에서 이의 효과에 대하여 정량 real-time PCR로 분석하였고 약 96% 까지 GCGR의 발현을 감소시키는 것이 발견되었다.
실시예 4 랫트 GCGR 을 표적화하는 "확장된 갭" 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인
일련의 올리고머 화합물을 다양한 사이즈의 데옥시뉴클레오티드 갭 및 2'-MOE 윙을 갖고, 랫트 GCGR(Genbank 수탁 번호: M96674.1, 본원에서 서열 번호 3으로 나타내어짐)을 표적하도록 디자인하였다. 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오염기 서열(GCACTTTGTGGTACCAAGGT, 본원에서 서열 번호 4로 나타내어짐)을 가지므로, 서열 번호 3의 동일한 구획(뉴클레오염기 402 내지 421)을 표적으로 한다. 랫트 올리고뉴클레오티드가 표적화하는 구획은 ISIS 310457(서열 번호 2)이 표적화하는 인간 GCGR의 구획에 상응한다. 화합물은 표 4에 나타내었다. 평문은 데옥시뉴클레오티드를 나타내고, 뉴클레오티드는 진하게 표현하였으며, 밑줄은 2'-0-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드를 나타낸다. 인터뉴클레오시드 결합은 모두 포스포로티오에이트이고, 모든 시토신은 5-메틸시토신이다. 표 4에서 각 화합물의 "모티브"는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 독특한 영역을 나타낸다.
표 4
랫트 GCGR 을 표적화하는 안티센스 화합물
Figure 112008027592940-PCT00015
실시예 5 GCGR 을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과-생체 내 랫트 연구
본 발명에 따른, 랫트 GCGR을 표적하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드를 생체 내에서 테스트하였다. 8주령의 수컷 스프라그-도올리(Sprague Dawley) 랫트에 ISIS 356171, ISIS 357368, ISIS 357369, ISIS 357370, ISIS 357371, ISIS 357372, 또는 ISIS 357373의 50, 25, 12.5, 또는 6.25 mg/kg을 3주 동안 주마다 2회씩 총 6회 주사하였다. 대조로서 살린을 주사한 동물을 사용하였다. 테스트된 각 올리고뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오염기 서열(GCACTTTGTGGTACCAAGGT, 본원에서 서열 번호 4로 타나내어짐)을 갖고, 각 화합물의 화학적 성질 및 모티브는 상술한 바와 같다.
처리 기간 후, 랫트를 희생시키고 간에서 표적 핵산 수준을 측정하였다. RNA 분리 및 표적 mRNA 발현 수준 정량은 본원의 다른 실시예에서 기재한 바와 같이 RIBOGREEN™을 이용하여 수행하였다. 각 처리 그룹의 RNA는 ISIS 356171로 처리한 그룹의 RNA와 함께 분석하였다. 결과는 살린-처리 대조 수준의 퍼센트로서 표 5a, 5b, 5c, 5d, 5e 및 5f에 나타내었다.
표 5a
GCGR 을 표적화하는 2-16-2 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 랫트 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조 %
올리고뉴클레오티드 농도(mg/kg)
50 25 12.5 6.25
ISIS 356171 5-10-5 7 20 26 36
ISIS 357371 2-16-2 11 22 35 39
표 5b
GCGR 을 표적화하는 3-14-3 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 랫트 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조 %
올리고뉴클레오티드 농도(mg/kg)
50 25 12.5 6.25
ISIS 356171 5-10-5 10 24 28 50
ISIS 357372 3-14-3 12 23 37 56
표 5c
GCGR 을 표적화하는 4-12-4 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 랫트 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조 %
올리고뉴클레오티드 농도(mg/kg)
50 25 12.5 6.25
ISIS 356171 5-10-5 10 25 36 47
ISIS 357373 4-12-4 13 22 48 47
표 5d
GCGR 을 표적화하는 1-17-2 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 랫트 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조 %
올리고뉴클레오티드 농도(mg/kg)
50 25 12.5 6.25
ISIS 356171 5-10-5 8 24 32 43
ISIS 357370 1-17-2 20 41 62 68
표 5e
GCGR 을 표적화하는 1-18-1 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 랫트 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조 %
올리고뉴클레오티드 농도(mg/kg)
50 25 12.5 6.25
ISIS 356171 5-10-5 9 27 34 46
ISIS 357369 1-18-1 33 35 58 70
표 5f
GCGR 을 표적화하는 동형의 데옥시 올리고뉴클레오티드로 처리된 랫트 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조 %
올리고뉴클레오티드 농도(mg/kg)
50 25 12.5 6.25
ISIS 356171 5-10-5 8 23 30 45
ISIS 357368 동형의 데옥시 31 43 77 73
표 5a, 5b, 5c, 5d 및 5e에 나타낸 바와 같이, 확장된 갭 안티센스 올리고뉴클레오티드는 농도 의존적인 방식으로 생체 내에서 GCGR 수준을 감소시키는데 효과적이었다. 따라서, 본 발명의 일 구체예는 GCGR을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 동물에서 GCGR의 발현 수준을 감소시키는 방법이다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다.
또한, 신장 및 간에서의 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하였다. 조직에서 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Geary et al., Anal. Biochem., 1999, 274, 241-248). 표 6은 지정된 올리고뉴클레오티드 25 mg/kg으로 처리된 동물의 신장 또는 간에서의 총 올리고뉴클레오티드 농도 및 전장 올리고뉴클레오티드의 농도(㎍/g으로 나타냄)를 나타낸다. 총 올리고뉴클레오티드는 조직에서 검출된 모든 올리고뉴클레오티드 대사 산물의 합이다.
표 6
간 및 신장에서의 올리고뉴클레오티드의 농도
Figure 112008027592940-PCT00016
표 6에 나타낸 바와 같이, 신장에서의 확장된 갭 올리고뉴클레오티드의 농도는 통상 이들 조직에서 ISIS 356171에 대하여 발견되는 것에 비하여 감소하였다. 표 5의 표적 감소 데이터는 ISIS 356171에 비하여 ISIS 356371, ISIS 356372 및 ISIS 356373으로 효과가 유지되었고, 이들 데이터는 확장된 갭 올리고, 특히 ISIS 356371, ISIS 356372 및 ISIS 356373가 본질적으로 간에서 표적 수준을 감소시키는데 ISIS 356171보다 더욱 효과적임을 시사한다.
실시예 6 GCGR 을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 물리적 효과-생체 내 랫트 연구
본 발명의 안티센스 화합물에 의한 GCGR 감소의 물리적 효과를 측정하기 위하여, 혈장 글루코오스 수준을 앞선 실시예에서 기재한 바와 같은 각 처리 그룹에 대한 연구를 통하여 모니터링하였다. 글루코오스 수준을 처리 전 시작("Pre-bleed") 및 처리 기간의 각 주 동안, 통상의 임상적 방법을 이용하여 측정하였다. 결과는 표 7에 각 처리 그룹에 대하여 mg/dL로 나타내었다.
표 7
혈장 글루코오스 수준 상에서 GCGR 의 안티센스 억제의 효과
Figure 112008027592940-PCT00017
표 7에 나타낸 바와 같이, GCGR을 표적화하는 안티센스 화합물로 처리된 동물이 연구 기간 동안 글루코오스를 감소시키는 경향을 보였다. 그러므로, 본 발명의 다른 구체예는 동물에서 GCGR의 발현 수준을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물에서 글루코오스 수준을 저하시키는 방법이다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 확장된 갭 올리고뉴클레오티이다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 어떤 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 세개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14개의 데옥시뉴클레오티드 갭 또는 두 5' 및 3' 말단 상에서 네개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다.
글루카곤 경로에서 다른 요소 상에서 GCGR의 감소 효과를 측정하기 위하여, 안티센스 화합물로 처리한 동물을 또한 처리 기간 말에 글루카곤 수준 및 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1)에 대하여 측정하였다. 글루카곤 및 활성 GLP-1의 혈장 수준은 상업적으로 이용가능한 키트, 기구 또는 서비스를 이용하여 결정할 수 있다(예를 들어, 방사면역측정법, ELISA, 및/또는 루미넥스 면역화학적 분석, 및/또는 Linco Research Inc. Bioanalytical Services, St. Louis, MO). 각 처리 그룹에 대한 평균 글루카곤 수준(ng/mL로 나타냄) 및 GLP-1 수준(pM)을 표 8에 나타내었다.
표 8
글루카곤 및 GLP-1 수준 상에서 GCGR 의 안티센스 억제 효과
Figure 112008027592940-PCT00018
Figure 112008027592940-PCT00019
표 8에 나타낸 바와 같이, GCGR의 안티센스 감소는 순환하는 글루카곤 수준뿐만 아니라 순환하는 GLP-1 수준의 증가를 유도한다. 표 7에서 나타난 바와 같이 혈장 글루코오스 수준이 감소하는 경향이 있을지라도, 저혈당은 관찰되지 않았다. 그러므로, 본 발명의 다른 구체예는 GCGR을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 동물에서 GLP-1 수준을 증가시키는 방법이다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 어떤 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 세개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14개의 데옥시뉴클레오티드 갭 또는 두 5' 및 3' 말단 상에서 네개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ISIS 357371, ISIS 357372 또는 ISIS 357373을 포함한다.
실시예 7 GCGR 을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과-생체 내 시아노몰구스 원숭이 연구
영장류에서 안티센스 올리고뉴클레오티드 모티브의 변형에 의한 조직 분배, 효능 또는 치료적 인덱스에서 변화를 측정하기 위하여, 시아노몰구스 원숭이에 ISIS 310457(5-10-5 모티브) 또는 ISIS 325568(2-16-2 모티브)을 주 마다 3, 10, 또는 20 mg/kg의 농도로 주사하였다. 이 안티센스 화합물은 원숭이 GCGR 표적 서열에 100% 상보성을 나타내었다. 살린 단독으로 주사한 동물을 대조로서 제공하였다. 연구 기간은 7주였고, 첫 주 동안은 동물에 3회 투여하였고, 다음 6주 동안은 주마다 1회 투여하였다. 각 처리 그룹을 5개의 동물로 구성하였다. ISIS 310457 20 mg/kg으로 처리한 하나의 그룹과 ISIS 325568 20 mg/kg으로 처리한 하나의 그룹을 희생에 앞서 투여 중단 후 3주 동안 회복시켰다("20 mg/kg 회복"). 다른 처리 그룹은 연구의 마지막에 희생시켰다. 간 조직을 표적 감소를 측정하기 위하여 회수하였다.
RNA 분리 및 표적 mRNA 발현 수준 정량을 본원의 다른 실시예에서 기재한 바와 같이 RIBOGREEN™을 이용하여 수행하였다. 결과는 살린-처리 대조 수준의 퍼센트로서 표 9에 나타내었다.
GCGR 을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 원숭이 간에서의 표적 수준의 감소
처리 모티브 대조%
올리고뉴클레오티드의 농도
20 mg/kg, 회복 20 mg/kg 10 mg/kg 3 mg/kg
ISIS 310457 5-10-5 27 34 43 71
ISIS 325568 2-16-2 43 45 54 49
표 9에 나타낸 바와 같이, ISIS 310457 및 325568의 처리는 테스트된 모든 농도에서 GCGR 수준의 감소를 유도하였고, 표적 수준의 감소는 20 mg/kg 회복 그룹에서 여전히 발견되었다. 3 mg/kg 농도에서 ISIS 325568이 ISIS 310457보다 큰 감소를 유도하였다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에서, GCGR을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 GCGR의 발현 수준을 감소시키는 방법이다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 어떤 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 세개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14개의 데옥시뉴클레오티드 갭 또는 두 5' 및 3' 말단 상에서 네개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ISIS 325568을 포함한다.
또한, 신장 및 간에서의 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하였다. 조직에서 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Geary et al., Anal Biochem, 1999, 274, 241-248). 표 10에 지정된 올리고뉴클레오티드로 처리된 동물의 신장 및 간에서의 전장 올리고뉴클레오티드의 농도 및 총 농도(㎍/g으로 나타냄)를 나타내었다.
표 10
간 및 신장에서의 올리고뉴클레오티드의 농도
Figure 112008027592940-PCT00020
Figure 112008027592940-PCT00021
표 10에 나타낸 바와 같이, 5-10-5 모티브 올리고뉴클레오티드 ISIS 310457의 신장에서의 농도는 테스트된 모든 농도에서 2-16-2 모티브 올리고뉴클레오티드 ISIS 325568에 대하여 측정된 것보다 더 높았다. 2-16-2 모티브 올리고뉴클레오티드에 대한 표 9의 표적 감소 데이터는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드가 상응하는 5-10-5 모티브 올리고뉴클레오티드보다 더욱 효능적임을 시사하고, 올리고뉴클레오티드의 축적 증가없이 간에서 표적 mRNA 수준을 더욱 강하게 저하시켰다.
실시예 8 GCGR 을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 물리적 효과-생체 내 시아노몰구스 원숭이 연구
글루카곤 경로의 다른 요소 상에서 GCGR의 감소 효과를 측정하기 위하여, 실시예 7에서 기재한 바와 같이 안티센스 화합물로 처리한 동물을 또한 처리 기간 매 주마다 글루카곤 수준 및 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 수준에 대하여 평가하였다. 회복 그룹을 투여 중지 후 추가의 3주 동안 테스트하였다. 원숭이를 스트레스로 인한 인공산물을 피하기 위하여 혈액 회수 전에 마취시켰다. 글루카곤 및 활성 GLP-1의 혈장 수준은 상업적으로 이용가능한 키트, 기구 또는 서비스(예를 들어, 방사면역측정법, ELISA, 및/또는 루미넥스 면역화학적 분석 및/또는 Linco Research Inc. Bioanalytical Services, St. Louis, MO)를 이용하여 결정하였다. 각 처리 그룹에 대한 평균 글루카곤 수준(ng/mL) 및 GLP-1 수준(pM)을 표 11에 나타낸다.
표 11
시아노몰구스 원숭이의 글루카곤 및 GLP-1 수준 상에서 GCGR 의 안티센스 억제 효과
Figure 112008027592940-PCT00022
Figure 112008027592940-PCT00023
본 발명의 다른 구체예는 GCGR을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 동물에서 GLP-1 수준을 증가시키는 방법이다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 확장된 갭 올리고뉴클레오티드이다. 일 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 16개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 어떤 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 두 5' 및 3' 말단 상에서 세개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 14개의 데옥시뉴클레오티드 갭 또는 두 5' 및 3' 말단 상에서 네개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 프랭킹된 12개의 데옥시뉴클레오티드 갭을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ISIS 325568이다. 다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ISIS 325568을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Monia, Brett P. Freier, Susan M. Bhanot, Sanjay <120> MODULATION OF GLUCAGON RECEPTOR EXPRESSION <130> BIOL0066WO <150> 60/718,684 <151> 2005-09-19 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2034 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 ggatctggca gcgccgcgaa gacgagcggt caccggcgcc cgacccgagc gcgcccagag 60 gacggcgggg agccaagccg acccccgagc agcgccgcgc gggccctgag gctcaaaggg 120 gcagcttcag gggaggacac cccactggcc aggacgcccc aggctctgct gctctgccac 180 tcagctgccc tcggaggagc gtacacacac accaggactg cattgcccca gtgtgcagcc 240 cctgccagat gtgggaggca gctagctgcc cagaggcatg cccccctgcc agccacagcg 300 acccctgctg ctgttgctgc tgctgctggc ctgccagcca caggtcccct ccgctcaggt 360 gatggacttc ctgtttgaga agtggaagct ctacggtgac cagtgtcacc acaacctgag 420 cctgctgccc cctcccacgg agctggtgtg caacagaacc ttcgacaagt attcctgctg 480 gccggacacc cccgccaata ccacggccaa catctcctgc ccctggtacc tgccttggca 540 ccacaaagtg caacaccgct tcgtgttcaa gagatgcggg cccgacggtc agtgggtgcg 600 tggaccccgg gggcagcctt ggcgtgatgc ctcccagtgc cagatggatg gcgaggagat 660 tgaggtccag aaggaggtgg ccaagatgta cagcagcttc caggtgatgt acacagtggg 720 ctacagcctg tccctggggg ccctgctcct cgccttggcc atcctggggg gcctcagcaa 780 gctgcactgc acccgcaatg ccatccacgc gaatctgttt gcgtccttcg tgctgaaagc 840 cagctccgtg ctggtcattg atgggctgct caggacccgc tacagccaga aaattggcga 900 cgacctcagt gtcagcacct ggctcagtga tggagcggtg gctggctgcc gtgtggccgc 960 ggtgttcatg caatatggca tcgtggccaa ctactgctgg ctgctggtgg agggcctgta 1020 cctgcacaac ctgctgggcc tggccaccct ccccgagagg agcttcttca gcctctacct 1080 gggcatcggc tggggtgccc ccatgctgtt cgtcgtcccc tgggcagtgg tcaagtgtct 1140 gttcgagaac gtccagtgct ggaccagcaa tgacaacatg ggcttctggt ggatcctgcg 1200 gttccccgtc ttcctggcca tcctgatcaa cttcttcatc ttcgtccgca tcgttcagct 1260 gctcgtggcc aagctgcggg cacggcagat gcaccacaca gactacaagt tccggctggc 1320 caagtccacg ctgaccctca tccctctgct gggcgtccac gaagtggtct ttgccttcgt 1380 gacggacgag cacgcccagg gcaccctgcg ctccgccaag ctcttcttcg acctcttcct 1440 cagctccttc cagggcctgc tggtggctgt cctctactgc ttcctcaaca aggaggtgca 1500 gtcggagctg cggcggcgtt ggcaccgctg gcgcctgggc aaagtgctat gggaggagcg 1560 gaacaccagc aaccacaggg cctcatcttc gcccggccac ggccctccca gcaaggagct 1620 gcagtttggg aggggtggtg gcagccagga ttcatctgcg gagaccccct tggctggtgg 1680 cctccctaga ttggctgaga gccccttctg aaccctgctg ggaccccagc tagggctgga 1740 ctctggcacc cagaggcgtc gctggacaac ccagaactgg acgcccagct gaggctgggg 1800 gcgggggagc caacagcagc ccccacctac cccccacccc cagtgtggct gtctgcgaga 1860 ttgggcctcc tctccctgca cctgccttgt ccctggtgca gaggtgagca gaggagtcca 1920 gggcgggagt gggggctgtg ccgtgaactg cgtgccagtg tccccacgta tgtcggcacg 1980 tcccatgtgc atggaaatgt cctccaacaa taaagagctc aagtggtcac cgtg 2034 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 2 gcactttgtg gtgccaaggc 20 <210> 3 <211> 1875 <212> DNA <213> R. norvegicus <400> 3 gaattcgcgg ccgccgccgg gccccagatc ccagtgcgcg aggagcccag tcctagaccc 60 agcaacctga ggagaggtgc acacaccccc aaggacccag gcacccaacc tctgccagat 120 gtgggggggt ggctacccag aggcatgctc ctcacccagc tccactgtcc ctacctgctg 180 ctgctgctgg tggtgctgtc atgtctgcca aaggcaccct ctgcccaggt aatggacttt 240 ttgtttgaga agtggaagct ctatagtgac cagtgccacc acaacctaag cctgctgccc 300 ccacctactg agctggtctg caacagaact ttcgacaagt actcctgctg gcctgacacc 360 cctcccaaca ccactgccaa catttcctgc ccctggtacc taccttggta ccacaaagtg 420 cagcaccgcc tagtgttcaa gaggtgtggg cctgatgggc agtgggttcg agggccacgg 480 gggcagtcat ggcgcgacgc ctcccaatgt cagatggatg atgacgagat cgaggtccag 540 aagggggtag ccaagatgta tagcagctac caggtgatgt acactgtggg ctacagtctg 600 tccctggggg ccttgctcct ggcgctggtc atcctgctgg gcctcaggaa gctgcactgc 660 acccggaact acatccacgg gaacctgttc gcgtccttcg tgctcaaggc tggctctgtg 720 ctggtcattg attggctgct caagacacgc tatagccaga agattggaga tgacctcagt 780 gtgagcgtct ggctcagtga tggggcggtg gctggctgca gagtggccac agtgatcatg 840 cagtacggca tcatagccaa ctactgctgg ttgctggtgg agggtgtgta cctgtacagc 900 ctgctgagca tcaccacctt ctcggagaag agcttcttct ccctctatct gtgcatcggc 960 tggggatctc ccctgctgtt tgtcatcccc tgggtggtgg tcaagtgtct gtttgagaat 1020 gtccagtgct ggaccagcaa tgacaatatg ggattctggt ggatcctgcg tatccctgta 1080 ctcctggcca tactgatcaa ttttttcatc tttgtccgca tcattcatct tcttgtggcc 1140 aagctgcgtg cccatcagat gcactatgct gattacaagt tccggctagc caggtccacg 1200 ctgaccctca ttcctctgct gggagtccac gaagtggtct ttgcctttgt gactgatgag 1260 catgcccagg gcaccctgcg ctccaccaag ctcttttttg acctgttctt cagctccttt 1320 cagggtctgc tggtggctgt tctctactgt ttcctcaaca aggaggtgca ggcagagcta 1380 ctgcggcgtt ggaggcgatg gcaagaaggc aaagctcttc aggaggaaag gatggccagc 1440 agccatggca gccacatggc cccagcaggg acttgtcatg gtgatccctg tgagaaactt 1500 cagcttatga gtgcaggcag cagcagtggg actggctgtg agccctctgc gaagacctca 1560 ttggccagta gtctcccaag gctggctgac agccccacct gaatctccac tggactccag 1620 ccaagttgga ttcagaaagg gcctcacaag acaacccaga aacagatgcc tggccaaggc 1680 tgaagaggca aagcagcaag acagcagctt gtactatcca cactccccta acctgtcctg 1740 gccgggtaca ggccacattg atggagtagg ggctggatat gatggagtag ccatgctatg 1800 aactatgggt gttcccatga gtgttgccat gttccatgca cacagatatg accttcagta 1860 aagagctccc gtagg 1875 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 4 gcactttgtg gtaccaaggt 20 <210> 5 <211> 2378 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 5 cctctagagt caacatgaca ggcatcgaat ggctcctgtt tctctggcag agttgggggc 60 agagccaggc ttggccacgc tgggctctaa ggggctgtca ttttgcccag ggagctcctg 120 gctgggtggt cctcccccca gggtgagcac gcgtcccccc cacccccact tcgaggcgcc 180 caggcaggga acagctcatt ggccagtgtc cttcctcctt gtccccgcct gcatctccac 240 catccaccct gctccagctg ccccttgtcc ctctccccgt cccctgccca gagccccagg 300 tctcccctgc acccctgagc ctgcccacct agcagtgccc ctcgtccagg gcccctctgg 360 gttgggggtg cacacagcgg ggagaggcgg ctcctgctgc tcctcaccca gcccggctca 420 gtggccggag ccgcccagga cagtggcagt agatggggct gtttgatcag gatcagggaa 480 gataaggccc cttgcgtgac cccagagctg gggacgccaa aactgcccct cttccccyac 540 ccgcctgccg ctgtctctgc cagggagagg cccctactct gtgggtcctt cgccccagca 600 ccaagcctgc atggctgctc acctggctca ggaactgggg atcagcgaca cacgggtcct 660 gcctcccatc ggcccctaca tgagcccagg gtccaagggc tgaggttggg agctctttag 720 cagtctgtga cgcaggtgcc tgtccctgtc attcagctgt cacactgctt ggggcatctc 780 aggccccgtt agcggggcag ccctgggtgg agctggcccc acgcgggctc acccagccgc 840 tacctggagg aggctaaaat ccaggctgtc ccgtggcagc cagcagtcca ggcctgcccg 900 gaaaccctct gctccagctg cagccttcgc ccatctcctt gcccctctcc ctggcttccc 960 cctggcactg ccttccagct ggctggccct ccatctgccc agccatccat ccacacctct 1020 tattccattt gagggtgccc caaagaagag cccgtaacag cccgggggct catagccagc 1080 cactcgcggg accccgcaca tgcacgtgga cccacaggaa gaccctccct gcttctccca 1140 cagaattcag ttggtgcaga aactgggctc tgtagcaacg aaaggccgat ttgtgtagct 1200 gttgccaccc cgaactccca gctcagatgc tggctgtggc atggggacca ggggctgtga 1260 ctcccacagc cctggcaggc accacggggg atgtcctccc caccctgtgc ccccacccta 1320 ggccagctcc tcctccaagt cgacgcccgc agtgctaacc tcaaaggact gtgcagccag 1380 cctgtggcgt cccatgggat ccaggaagcc caaccgagcc ttgcacggca cccacgaggc 1440 acctaggcac cccggtgctg ggcagggggc acacatgtga cacagacccc tgagtgtggg 1500 ccccacacac ttggcctggc acagctgcaa gccagcccag ccactttgct cgctgtggca 1560 ctggggccaa gtgatggaag gtccaggcat cgccaccctc acgcttggca cattggctca 1620 ggtcagcctg gcaagccagc tttcccaggg gctaagaata ggtgaggagg atggtgagga 1680 agcacgccgg ggggctgtca actgagggag gaggtcacca tctggggagg ctggtcgccc 1740 caagagcatt gggtcacctg caggaaggtg gctgccacca gcaatgagac gaggggctct 1800 gcgaccctca gagctgccag ccagccagcc ctgggtggca agagtgactc ctcctggggt 1860 ctcctccctc ctatcgccct cttttttttt tttttttttt ttgagacgga gtctcgctct 1920 gcacagctga ctgcaatgct gatctcgctc actgcaaggt ctgccccggg ttcacgccat 1980 tctcactgcc acaagctccc gagtagctgg actacagacg cccgccacca cgcctggcta 2040 attttttgta tttttagtta gagacggggt ttcactgtgt agcggatggt ctcgatctcc 2100 agacctccgt tgatccaccc ccctcggcct cccaagttct gggaaacagg cgtgagcgcc 2160 gcgcccggcc cccagctccc tctttatccc taggaccctg aggctcagag gggcagcttc 2220 aggggaggac accccactgg ccagacgccc caggctctgc tgctctgcca ctcagctgcc 2280 ctcggaggag cgtacacaca caccaggact gcattgcccc agctgtgcag cccctgccag 2340 atgtgggagg cagctagctg cccagaggca tgcccccc 2378 <210> 6 <211> 735 <212> 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<220> <221> misc_feature <222> 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 387, 388, 389, 390, 391, 392, 476, 480, 487, 535, 546, 553, 574, 596, 615, 635, 639, 780, 786, 1568, 1645, 2097, 2555, 2559, 2564, 2653, 2752, 2788, 2797, 2880, 2883, 2886, 2923, 3135, 3178, 3209, 3468, 3750, 3859, 3915, 4023, 4226 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 4235, 4242, 4352, 4387, 4390, 4418, 4619, 4717, 4883, 5060, 5106, 5148, 5587, 6235, 6417, 6828, 6866, 6880, 6917, 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gaggcgcggg gtctcaccag cgctgtctcc cctcggtggg ctcctgcccc 1140 gaggactgcc cggtggcacc ggcgcggccc aggatggggt gaggggtgtc tgcgccccgc 1200 ctggccgctc ctcttccgcg gcccacactg gcgactttga ccccggcaag cgggtcactg 1260 ccctgcccgg ctccggcccc cccggcgccc caccacccgg ccgactcggc caccgggctt 1320 atgctccgac tctgaaccga ctgaccccgg ccccctcggc gcccgcatcc tccaaggacc 1380 ggccagggct gctctctgcc cttggtattg gggacatcag ggttgggggg tctgggtgca 1440 cccacgcctg ccccgccccc acggggtgag ggcgcaggga tagggctttg tcaacagcct 1500 gtggcccctg atcccgcccc ggtgccctga ccttccacta ccttctctgg tttcacaaaa 1560 acatcccngg ctcccatccc ggagctcctc aaagcgtctg agaggcccct tgcggacgcc 1620 ctgggagccc cgctgccttc ctggnaccag tggccgctcc acccatcctg ggggcccagc 1680 tccaggtctg cgggtccctc agccgccccc agtgggaatc ggtggagcct gacgcagcca 1740 ggagcgccca agagtcacgt gttctgccag ggaggacatg ggacaggaca cggggtgcca 1800 gccctgcaaa gcggccgggg cagtggagct caggtggccc taagccctgg tggtggctgg 1860 tgtggcccgg caggcagctg tgggagggag gaagggggtg gcatgcggtg ggggtctaga 1920 gaaggcgggc agggcacctc gggagccccc ccattgggca cctcgggaac cccccacatt 1980 gggcacctcg ggaaccctcc cattgggcac ctcgggaacc ccccacattg ggcacctcgg 2040 gaacccccgc attgggcacc tcgggaaccc tcccattggg cacctcggga acccccntat 2100 tgggcacctc gggaaccccc acattgggca cctcgggaac cccccctatt gggcaccttg 2160 ggaacccctc ccctaattct cagctgactc caaggcctga gaaggagctt ggtcacctgg 2220 actgtgaagg tggagggtgg ggtccctggt gggtcgtccc acctaccagc tgtgtcgccg 2280 gaagggtaat acggagcact gtggccccgg ggagccccga gtggcagctc cacagctggg 2340 agtttctgtc cactccttca gtcaacaaac attgatcctg ggctgaccgg ggcccggggg 2400 tgtcagtgtc tcctctcggg ggagagggct gggtgagatc aacagaggag cctcccttct 2460 tcccttcagg ctggtgtcac cttcagtgat ggggcagggt ccccacttgg gaagttaaat 2520 cgtcgtcccc gtcccaggac cacagcagcc tcagncctnc tctncaggcc aggctctctc 2580 atgggtgctc agctggaaat tggtcccccc ccggctccac ccacccctgt tggggtgagg 2640 agctggagtc tcncctaccc atatgggacc caccacccgc agggaacgga ggacgctcac 2700 acttctgcac ctcctgcctc actatcagag acccagtgga gaattgcctc cncacctcac 2760 ctcttgtatt cagaggccct gacccctnag ggatccngga ctaggggtgc cctatgggga 2820 gcccacctgt ggcctgtgga tgctgagctg tcgggggaat cctccaggat ccccagcccn 2880 acnttnccaa ccttctgttg aggctgaggg gacacagagc ccncactcct gggtcctgac 2940 tgtttcaaag aaaggcctgg gggactgggc agccaacccc tccctcggct cgctggggtc 3000 tccagactgg ctgcccggct ggaaggtggg gccctggcac gcgaggacct catgtgtgga 3060 ggcactggct tggggggtgc tcccagtggc tctagagtca acatgacagg catcgaatgg 3120 ctcctgtttc tctgncagag ttggggcaga gccaggcttg gccacgctgg gctctaangg 3180 gctgtcattt tgcccaggga gctcctggnc tgggtggtcc tccccccagg gtgagcacgc 3240 gtccccccca cccccacttc gaggcgccca ggcagggaac agctcattgg ccagtgtcct 3300 tcctccttgt cccccgcctg catctccacc atccaccctg ctccagctgc cccttgtccc 3360 tctccccgtc ccctgcccag agccccaggt ctcccctgca cccctgagcc tgcccaccta 3420 gcagtgcccc tcgtccaggg cccctctggg ttgggggtgc acacagtngg ggagaggcgg 3480 ctcctgctgc tcctcaccca gcccggctca gtggccggag ccgcccagga cagtggcagt 3540 agatggggct gtttgatcag gatcagggaa gataaggccc cttgcgtgac cccagagctg 3600 gggacgccaa aactgcccct cctcccccac ccgcctgccg ctgtctccgc cagggagagg 3660 cccctactct gtgggtcctt cgccccagca ccaagcctgc atggctgctc acctggctca 3720 ggaactgggg atcagcgaca cacgggtccn tgcctcccat cggcccctac atgagcccag 3780 ggtccaaggg ctgcggttgg gagctcttta gcagtctgtg acgcaggtgc ctgtccctgt 3840 cattcagctg tcacactgnc ttggggcatc tcaggccccg ttagcggggc agccctgggt 3900 ggagctggcc ccacngcggg ctcacccagc cgctacctgg aggaggctaa aatccaggct 3960 gtcccgtggc agccagcagt ccaggcctgc ccggaaaccc tctgctccag ctgcagcctt 4020 cgncccatct ccttgcccct ctccccggct tccccctggc actgccttcc agctggctgg 4080 ccctccatct gcccagccat ccatccacac ctcttattcc atttgagggt gccccaaaga 4140 agagcccgta acagcccggg ggctcatagc cagccactcg cgggaccccg cacatgcacg 4200 tggacccaca ggaagaccct ccctgncttc tcccnacaga anttcagttg gtgcagaaac 4260 tgggctctgt agcaacgaaa ggccgatttg tgtagctgtt gccaccccga actcccagct 4320 cagatgctgg ctgtggcatg gggaccaggg gnctgtgact cccacagccc tggcaggcac 4380 cacgggnggn atgtcctccc caccctgtgc ccccaccnct aggccagctc ctcctccaag 4440 tcgacgcccg cagtgctaac ctcaaaggac tgtgcagcca gcctgtggcg tcccatggga 4500 tccaggaagc ccaaccgagc cttgcacggc acccacgagg cacctaggca ccccggtgct 4560 gggcaggggg cacacatgtg acacagaccc ctgagtgtgg gccccacaca cttggcctng 4620 gcacagctgc aagccagccc agccactttg ctcgctgtgg cactggggcc aagtgatgga 4680 aggtccaggc accgccaccc tcacgcttgg cacattnggc tcaggtcagc ctggcaagcc 4740 agctttccca ggggctaaga ataggtgagg aggatggtga ggaagcagcc gggggctgtc 4800 aactgaggga ggaggtcacc atctggggag gctggtcccc cacccaagag cattgggtca 4860 ccctgcagga aggtggctgc canccagcaa tgagacgagg ggctctgcga ccctcagagc 4920 tgccagccag ccagccctgg gtggcaagag tgactcctcc tggggtctcc tccctcctat 4980 cgccctcttt tttttttttt ttttttttga gacggagtct cgctctgtca cccaggctgg 5040 actgcaatgg cttgatctcn gctcactgca agctctgcct cccgggttca cgccattctc 5100 ctgccntcaa gctcccgagt agctgggact acagacgccc gccaccancg cctggctaat 5160 tttttgtatt tttagtagag acggggtttc actgtgttag ccaggatggt ctcgatctcc 5220 agacctcgtg atccaccccc ctcggcctcc caaagttctg ggattacagg cgtgagccgc 5280 cgcgcccggc ccccagctcc ctctttatcc ctaggaccct gaggctcaga ggggcagctt 5340 caggggagga caccccactg gccaggacgc cccaggctct gctgctctgc cactcagctg 5400 ccctcggagg agcgtacaca cccaccagga ctgcattgcc ccagctgtgc agcccctgcc 5460 agatgtggga ggcagctagc tgcccagagg catgcccccc tgccagccac agcgacccct 5520 gctgctgttg ctgctgctgc tggcctgcca ggtgaggact cacagcaccc tcagcaccca 5580 ggggccntcc tgtgaggact gcacactgat ggctctctgt ctgcctgcct gcctgcctgc 5640 ctgcctgcct gtctgtctgt ctgcccgtct gcctgcccat ctgcctgtct gtctgcctgt 5700 ccgtctgtct gtccatctgt ccatctgcct atccatctgc ctgcctgtct gcctgtccgt 5760 ctgcctgtct gtctgcctgt ccatctgtcc atctgcctat ccatctgcct gcctgtctgt 5820 cggcctgcct gcctgcctgt ctgtctgctg cctgtctgtc cgtctgcctg tctgcctgtc 5880 cgtctgcctg cctgtccgtc tgcctgtccg tctgcctgcc tgcctgtctg tctgcctgcc 5940 tgtctgcctg cctgtccgtc tgcctgtccg tctgcctgcc tgtctgcctg cctgtctgcc 6000 tgtctgcccg tctgcctgtc tgtctgcctg tccgtctgcc tgtctgtccg tctgtccatc 6060 tgcctatcca tctgcctgcc tatctgtctg tccgtctgcc tgcctgtctg tctgcctgtc 6120 tgcctgtctg tctgcctgtc tgtccatctg cctatccatc tacctgcctg cctgtctgcc 6180 tgtctgtctg cctgtctgtc tgcctgcctg tctgtctgtc tgtctggttg cttgntgcat 6240 gtgtccccca gccacaggtc ccctccgctc aggtgatgga cttcctgttt gagaagtgga 6300 agctctacgg tgaccagtgt caccacaacc tgagcctgct gccccctccc acgggtgagc 6360 cccccaccca gagcctttca gcctgtgcct ggcctcagca cttcctgagt tctcttncat 6420 gggaaggttc ctgggtgctt atgcagcctt tgaggacccc gccaaggggc cctgtcattc 6480 ctcaggcccc caccaccgtg ggcaggtgag gtaacgaggt aactgagcca cagagctggg 6540 gacttgcctc aggccgcaga gccaggaaat aacagaacgg tggcattgcc ccagaaccgg 6600 ctgctgctgc tgcccccagg cccagatggg taataccacc tacagccccg tggagttttc 6660 agtgggcaga cagtgccagg gcgtggaagc tgggacccag gggcctggga gggctcgggt 6720 ggagagtgta tatcatggcc tggacacttg gggtgcaggg agaggatagg gctggaggac 6780 tcacccggga ggcagtgcct gggttcggat gagggaggca gccaccanct gggcagaggg 6840 gggcaggtgt ggcagcctcc attggngcag agggagcagn atgtggcagc cacaggtttg 6900 gcgatgcacc tgggaangga tgaaaatggc attngggttc agcccccaga gagggaggtg 6960 ctgagagaag gtcacngaga atggggnanc cnnntgnnnn nnnnnnnnan nntnnnnnnn 7020 nggggtctnc caagggaagg tgtcctncag agntgnantt cagggctggn ctgggcgtgc 7080 tagcggagnc tngtccagng gaggnggatn ntcaggtgag gaaggtggag gtcagatggg 7140 ngaggtggag gtcaagtggg ggagggagca gcccaggcca tgtcctgggc gaggtgacgg 7200 ccgagctcag gcttccagag agaggagaga ggcnnncnna nnnannncnn nnnnnnnnnn 7260 tnccctgccc tgctctgccc tgccctaccn taccctgcag agctggtgtg naacagaacn 7320 ttcgacaagt attcctgctg gccggacacc cccgccaata ccacggccaa catctcctgc 7380 ccctggtacc tgccttggca ccacaaaggt acccatagag gggaggaact gtgggggggg 7440 cgggcccagg gtggggctga cncccangcc tcccccncna cnacncnccc agtgcaacac 7500 cgcnttcgtg ttcaagagat gcgggcccga cggtcagtgg gtgcgtggac cccgggggca 7560 gccttggcgt gatgcctccc agtgccagat ggatggcgag gagattgagg tccaggtcag 7620 tgggcggcag gcaggcgcgg tggggctgga tgggaacggg catgggggcc cctgcctggc 7680 cctcacaggc cactgtaact cgcagaagga ggtggccaag atgtacagca gcttccaggt 7740 gatgtacaca gtgggctaca gcctgtccct gggggccctg ctcctcgcct tggccatcct 7800 ggggggcctc aggtaggatt ccgccagcgc ccggggcggc cgcagaggac agggaggagg 7860 acgggcgctg actggctgtg cccacagcaa gctgcactgc acccgcaatg ccatccacgc 7920 gaatctgttt gcgtccnttc gtgctgaaag ccagctccgt gctggtcatt gatgggctgc 7980 tcaggacccg ctacagccag aaaattggcg acgacctcag tgtcagcacc tggctcagtg 8040 atggagtgag cccccctcgg cggccccagg caggtgggtg nggtgggcag ccaggcaggt 8100 ggccangtag ccgcgctcac actgcacctg taccaggcgg tggctggctg ccgtgtggcc 8160 gcggtgttca tgcaatatgg catcgtggcc aactactgct ggctgctggt ggagggcctg 8220 tacctgcaca acntgctggg cctggccacc ctccccgaga ggagcttctt cagcctctac 8280 ctgggcatcg gctggggtga gtgggctggc atgagagggg gttaaggcag gctgaccaag 8340 cctttgggac cancagctgc tgccccccac aggtgccccc atgctgttcg tcgtcccctg 8400 ggcagtggtc aagtgtctgt tcgagaacgt ccagtgagta tgagcggctg gacagcctgg 8460 ggagggaccg gggggctggg gtgcggcgct ctggcctgag gcagggaggg gccggggatg 8520 agcctggtgc ctggggaggg ggtcatttgt gaccttctcc cttccttttc tgagaccncg 8580 aattagatcc tggcaaaatc gggacggggg tgctgagggg cggagggngc tgggggctgt 8640 gccccnagta tgtgagtggc ctggcctcgn cangntgctg gaccagcaat gacaacatgg 8700 gcttctggtg gatcctgcgg ttccccgtct tcctggccat cctggtgagg aaatgaagag 8760 ccaggaacgc accccaggcc cctcctccct tggcgtcctg aggctgcccc aggagacagc 8820 agcatcctgt ctgagagcgc tgggagggag ccggcaccca gacaggacac caggacactg 8880 gccagcaccc tggacactga gccaggctgt tcctccctgg ctgtgtgccc accagcccca 8940 gggctatgtg gcccagggcc tatcttgctg ccaggcccac ctgcaggagg gtcaggtggg 9000 gccttccaag ggcacagagc tgttccctgg ggctcgggat gcccctgact cgcaccctnt 9060 ctcacacaga tcaacttctt catcttcgtc cgcatcgttc agctgctcgt ggccaagctg 9120 cgggcacggc agatgcacca cacagactac aagttccggt gggtgccgcg gcagctggcg 9180 tctcgagacc tggagaccct cagggccaga gggcagctgg gggtggggac tccaagctcc 9240 acgtggatgg tgcgggccga gggtgggggc ggtgggtgac tcaggcgctg cctctgcagg 9300 ctggccaagt ccacgctgac cctcatccct ctgctgggcg tccacgaagt ggtcttcgcc 9360 ttcgtgacgg acgagcacgc ccagggcacc ctgcgcntcc gccaagctct tcttcgacct 9420 cttcctcagc tccttccagg tgnccgcncg cccgccggct cccccgcccg gggcgcagtg 9480 tgccacccct gaccaccctg tctctccagg gcctgctggt ggctgtcctc tactgcttcc 9540 tcaacaagga ggtaggtggg agtgggggca tctgagacca tcagcactgg ccgtcggggt 9600 caggggcaga gagaggcaca gggatgccag ccccacccct gcccgggggt tggaacacgt 9660 ggggcccaag cctttccctc cccctgctct tattgggtgc agttgccatg gcgctgggtg 9720 tcaggccccc aggacaggtt ggcctcagcc ccatcgctac ggtgtccacc gtngggggtc 9780 cccaggtgtc tgcagactgc tttccgtggc gatgctgggt ggcatagctg tgcccagcag 9840 ggagcttgtg tcgctctgca cccctcagag cggagactgg gcatctccga tgaggcccac 9900 agcaggtccc ggntggggtg gangnangga cagngcaggc cctaggactg gcctgccccg 9960 tccccctccc caggtgcagt cggagctgcg gcggcgttgg caccgctggc gcctgggcaa 10020 agtgctatgg gaggagcgga acaccagcaa ccacagggcc tcatcttcgc ccggccacgg 10080 ccctcccagc aaggagctgc agtttgggag gggtggtggc agccaggatt catctgcgga 10140 gacccccttg gctggtggcc tccctagatt ggctgagagc cccttctgaa ccctgctggg 10200 accccagcta gggctggact ctggcaccca gnagggcgtc gctggacaac ccagaactgg 10260 acgcccagct gaggctgggg gcgggggagc caacagcagc nccccaccta nccccccnac 10320 ccccagtgtg gctgtctgcg agattgggcc tcctctccct gcacctgcnt tgtccctggt 10380 gcagaggtga gcagaggagt ccagggcggg agtgggggct gtgccgtgaa ctgcgtgcca 10440 gtgtccccac gtatgtcggc acgtcccatg tgcatggaaa tgtcctccaa caataaagag 10500 ctcaangtgg tcacncgtgc atgtcntgga aagcagggct gganaatgct ggggccgaag 10560 cnagtggggg atggaacagn cggtgggtgg tcagcgccag tgcgggctgt tgaagggtcc 10620 ccntgctgtc ccagttcact cagagttggc actggaaccc cggaggatcc ngaaggcagc 10680 cagcctgtgc ccatctgagc aggtcctggc caccttccca tcntggttct ggcgggcagt 10740 ccccctggac gctttggcca ccagagggtc accattcacc agcagagacn tgaggggcac 10800 agtggctaag gcggcatgag gcatcacagt cccctgaccg accccatcag cactggattc 10860 acccgagggc gtcttctccc tggaggccgt gaggacactg gcacctggct catcggcccg 10920 cccttcctct gagcctcctg gcctccgttt catctcagct ccagccccct cgggcaattt 10980 acaggccacg tagcagattg a 11001 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 8 cgtgtgtctg tgctagtccc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 9 ggcaacgtga acaggtccaa 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 10 gcccattgct ggacatgc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 11 agcccattgc tggacatgca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 12 ttgtcccagt cccaggcctc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 13 ctttccgttg gacccctggg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 14 gtgcgcgcga gcccgaaatc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 15 atccaagtgc tactgtagta 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <220> <221> misc_feature <222> 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 <223> n = A,T,C or G <400> 16 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 17 gccctccatg ctggcacagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 18 agcaaaagat caatccgtta 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 19 tacagaaggc tgggccttga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligomeric compound <400> 20 atgcattctg cccccaagga 20 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 21 tgcggttccc cgtcttc 17 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 cttgtagtct gtgtggtgca tctg 24 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 23 catcttcgtc cgcatcg 17 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 cagtgccacc acaacctaag c 21 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 agtacttgtc gaaagttctg ttgca 25 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 26 tgctgccccc acctactgag ctg 23 <210> 27 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 27 actgcacccg caacgc 16 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 cacggagctg gccttcag 18 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 29 atccacgcga acctgtttgt gtcctt 26 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 30 gaaccttcga caagtattcc tgct 24 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 gggcaggaga tgttggcc 18 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR probe <400> 32 ccagacaccc ccgccaataa ca 22

Claims (63)

  1. GCGR을 코딩하는 핵산 분자를 표적으로 하고 적어도 서열 번호 2 또는 4의 8-뉴클레오염기 부분을 포함하는 20 뉴클레오염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 올리고뉴클레오티드는 1 내지 4개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단에서 프랭킹되는 12, 13, 15, 16, 17, 또는 18 뉴클레오염기 길이의 데옥시뉴클레오티드 영역을 포함하고 GCGR에 특이적으로 혼성화하며 그의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 제 1항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 제 1항에 있어서, 서열 번호 4의 뉴클레오염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제 4항에 있어서, 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드.
  6. 제 5항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 제 5항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 제 4항에 있어서, 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 제 8항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  11. 제 4항에 있어서, 하나 또는 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센 스 올리고뉴클레오티드.
  12. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  13. 제 11항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  14. 제 4항에 있어서, 네개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  15. 제 14항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  16. 제 14항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  17. 제 4항에 있어서, 세개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드.
  18. 제 17항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  19. 제 17항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  20. 제 1항에 있어서, 서열 번호 2의 뉴클레오염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  21. 제 20항에 있어서, 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  22. 제 21항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  23. 제 21항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  24. 제 20항에 있어서, 하나의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 18-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  25. 제 24항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  26. 제 24항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  27. 제 20항에 있어서, 하나 또는 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 17-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  28. 제 27항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  29. 제 27항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  30. 제 20항에 있어서, 네개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 12-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  31. 제 30항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  32. 제 30항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  33. 제 20항에 있어서, 세개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 14-데옥시뉴클레오티드 영역을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  34. 제 33항에 있어서, 적어도 하나의 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  35. 제 33항에 있어서, 적어도 하나의 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  36. 제 1항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 인핸서(enhancer) 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  37. 세포 또는 조직을 제 36항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 조직 또는 세포에서 GCGR의 발현을 감소시키는 방법.
  38. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 글루코오스 수준을 감소시키는 방법.
  39. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 GLP-1 수준을 증가시키는 방법.
  40. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 인슐린 민감성을 개선시키는 방법.
  41. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 트리글리세리드를 감소시키는 방법.
  42. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법.
  43. 동물에게 치료적 또는 예방적 유효량의 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 글루카곤 수용체 발현과 관련된 질환 또는 증상을 갖는 동물을 치료하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 질환 또는 증상이 대사 질환 또는 증상인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 질환 또는 증상이 당뇨병, 고혈당증, 비만, 원발성 고글루카곤혈증, 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 43항에 있어서, 질환 또는 증상이 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 글루코오스 수준의 상승 개시를 예방하거나 지연시키는 방법.
  48. 동물에게 제 36항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 베타-세포 기능을 보존하는 방법.
  49. 서열 번호 2의 서열을 갖고, 두개의 2'-O-(2-메톡시에틸) 뉴클레오티드로 5' 및 3' 말단 상에서 프랭킹된 16-데옥시뉴클레오티드 영역에 의해 특정지어지는 20 뉴클레오염기 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 각 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 결합이며 각 시토신은 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  50. 제 49항의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 인핸서(enhancer) 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  51. 세포 또는 조직을 제 50항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 조직 또는 세포에서 GCGR의 발현을 감소시키는 방법.
  52. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 글루코오스 수준을 감소시키는 방법.
  53. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 GLP-1 수준을 증가시키는 방법.
  54. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 인슐린 민감성을 개선시키는 방법.
  55. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 트리글리세리드를 감소시키는 방법.
  56. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 콜레스테롤 수준을 감소시키는 방법
  57. 동물에게 치료적 또는 예방적 유효량의 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 글루카곤 수용체 발현과 관련된 질환 또는 증상을 갖는 동물을 치료하는 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 질환 또는 증상이 대사 질환 또는 증상인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 57항에 있어서, 질환 또는 증상이 당뇨병, 고혈당증, 비만, 원발성 고글루카곤혈증, 인슐린 결핍 또는 인슐린 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 57항에 있어서, 질환 또는 증상이 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 혈중 글루코오스 수준의 상승 개시를 예방하거나 지연시키는 방법
  62. 동물에게 제 50항의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 동물에서 베타-세포 기능을 보존하는 방법.
  63. 부차적 치료 효과를 달성하기 위하여, PPAR-감마, 듀얼-PPAR 또는 팬-PPAR 작용제를 포함하는 PPAR 작용제, 디펩티딜 펩티다아제(IV) 억제제, GLP-1 유사체, 인슐린 및 인슐린 유사체, 인슐린 분비촉진제, SGLT2 억제제, 프람린타이드를 포함하는 인간 아밀린 유사체, 글루코키나아제 활성제, 비구아니드 및 알파-글루코시다아제 억제제로 구성된 그룹으로부터 선택된 항당뇨제와 배합된 제 1항의 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 질환 또는 증상을 갖는 동물의 치료 방법.
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