JP2003527096A - Ｃ−ｍｙｃアンチセンス処理した造血幹細胞組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 濃縮したＨＳＣ集団に対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド処理により調製された、増加した数の造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む組成物について記載する。本発明はさらに、この組成物を産生するための方法およびｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド処理されたＨＳＣの医薬としての使用方法に関する。造血幹細胞組成物を作製するための方法は、被験体からＨＳＣを含む細胞集団を得る工程、ＨＳＣに対して細胞集団を濃縮するのに効果的な様式で、この細胞集団を処置する工程、および、この濃縮されたＨＳＣ集団を、エキソビボでｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーに、このような集団の造血幹細胞の数を少なくとも２倍に増加させるのに十分なオリゴマー濃度および時間の間暴露する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、細胞をｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露すること
によって、インビトロおよびインビボで造血幹細胞（ＨＳＣ）の数を増加させる
ための方法、ならびに系統を方向付けられた（ｌｉｎｅａｇｅ ｃｏｍｍｉｔｔ
ｅｄ）先駆細胞およびその子孫の数を増加させるのに効果的な様式で、そのよう
なＨＳＣを処理するための方法に関連する。本発明はさらに、そのような方法で
産生されたＨＳＣの組成物に関連する。

【０００２】 （参考文献）

【０００３】

【数１】 （発明の背景） 造血幹細胞（ＨＳＣ）は、移植可能な、自己複製し得る、そして多系統の可能
性を有する細胞として特徴づけされた、多能性先駆細胞である。ＨＳＣの分化は
、そのような多系統可能性の喪失および対応する系統の方向付けを引き起こす。
移植研究によって示されたように、ＨＳＣの自己再生がインビボで起こることが
示された。ここで単一のＨＳＣが、免疫不全マウスの骨髄で再増殖した（Ｓｍｉ
ｔｈら、１９９１；Ｏｓａｗａら、１９９６）。造血幹細胞は、組換えレトロウ
イルスに感染し得ること、および遺伝子治療の細胞標的として役立ち得ることも
示された（ＫｅｌｌｅｒおよびＳｎｏｄｇｒａｓｓ、１９９０）。

【０００４】 骨髄増殖性疾患、血球増殖性疾患、および自己免疫疾患を含むがこれに限らな
い、様々な細胞に基づく疾患に罹患した患者は、多くの場合、特定の系統の細胞
数に不均衡を有する。それに加えて、化学療法または照射を受けている患者は、
多くの場合、不完全な造血を有する。

【０００５】 骨髄移植または造血幹細胞を濃縮した細胞集団の移植を伴う、高投与量化学療
法および／または放射線療法は、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、神経
芽種、リンパ腫、乳癌、結腸癌、肺癌、および脊髄形成異常症候群を含むいくつ
かの悪性腫瘍のための、および他の非悪性造血性疾患（例えば血小板減少症）の
ための標準的な治療レジメンである。

【０００６】 卵巣癌、胸腺腫、生殖細胞腫瘍、多発性骨髄腫、黒色腫、精巣癌、肺癌および
脳腫瘍を含む様々な癌の処置に関して、そのようなレジメンを用いて、臨床試験
が行われている。

【０００７】 あらゆる上記の状態に罹患した患者において、造血幹細胞の発達および／また
は複製を調節することは臨床的な有用性を有し、およびそのような細胞は遺伝子
工学に基づく治療の潜在的な標的であるということになる（Ｗｉｌｓｏｎら、１
９９１）。

【０００８】 ＨＳＣは遺伝子治療および自己移植の最適な細胞標的であるようだが、（ａ）
造血幹細胞に独特の抗原性マーカーを同定すること、（ｂ）多数の造血幹細胞を
得ること、および（ｃ）造血幹細胞集団を維持および増殖させることに問題があ
った。

【０００９】 それに加えて、造血幹細胞を濃縮した細胞集団における、長期造血再構築が可
能な細胞の割合は非常に低く、そして従って造血幹細胞を精製および増殖させる
技術の必要性が存在する。同種移植における移植片対宿主性病（ＧＶＨＤ）、お
よび疾患の再発を引き起こし得る自己および同種移植における残存腫瘍細胞のた
めに、ＨＳＣ濃縮した細胞集団を用いた移植の合併症が観察された。現在の治療
レジメンは、Ｔ細胞および残存腫瘍細胞を含む、移植レシピエントにリスクを与
える細胞の除去に向けられる。

【００１０】 ＨＳＣを濃縮した細胞集団の移植を含む、今まで使用された治療レジメンにお
いて、移植細胞の悪性細胞との混入、および／または骨髄機能廃絶（ｍｙｅｌｏ
ａｂｌａｔｉｖｅ）化学療法後の宿主における悪性細胞の残留による、根底にあ
る疾患の再発は、多くの場合そのような治療の失敗を引き起こす。

【００１１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび抗体は、目的の標的タンパク質の合成
に特異的に干渉し得ることが示された。それらの疎水性のために、アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、リン脂質膜とよく相互作用し（Ａｋｈｔａｒ，Ｓ．ら、
１９９１）、そして細胞形質膜との相互作用の後、オリゴヌクレオチドは生きた
細胞内に能動的に輸送されることが示唆された（Ｌｏｋｅ，Ｓ．Ｌ．ら、１９８
９；Ｙａｋｕｂｏｖ，Ｌ．Ａ．ら、１９８９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．ら、
１９９９）。

【００１２】 細胞の発生に関連する遺伝子の阻害が、アンチセンス技術を用いて達成された
が、天然に存在するオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ感受性のホスホジエステ
ル骨格を有する。しかし、天然に存在するオリゴヌクレオチドを、例えばホスホ
ジエステル結合の代わりにメチルホスホネート、ホスホロチオエート、またはホ
スホロジアミデート結合を利用することによって、ヌクレアーゼによる分解に耐
性とした（ＳｐｉｔｚｅｒおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｂａｋｅｒら、
１９９０；Ｈｕｄｚｉａｋ、１９９６）。

【００１３】 ホスホロジアミデートモルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）オリゴヌクレオチ
ド（ＰＭＯ）は、細胞への有利な取り込み、および最低限の非特異的結合相互作
用によって、ＲＮＡ標的に対して高い結合親和性を示すことが示された（例えば
Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎら、１９９７ａを参照のこと）。

【００１４】 アセチルコリンエステラーゼ（ａｃｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ）遺
伝子に特異的な合成ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、（
１）異常な造血の阻害、（２）異常な血小板増殖の阻害、（３）マクロファージ
および造血幹細胞数の増加、（４）同種臓器移植に対する免疫反応の抑制、およ
び（５）悪性腫瘍の治療のための道具として記載された（米国特許第５，８９１
，７２５号） ｃ−ｍｙｃは、細胞増殖、分化、およびアポトーシスを制御する癌原遺伝子で
あり、そしてその異常な発現は、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病およ
び肺癌などを含む多くのヒト癌と関連していた。

【００１５】 いくつかの癌遺伝子ｍＲＮＡのインビトロにおける翻訳は、ｃ−ｍｙｃに対す
るアンチセンス（ＭｃＭａｎａｗａｙら、１９９０；Ｗａｔｓｏｎら、１９９１
；Ｌｉら、１９９５）、およびｂｃｌ−２に対するアンチセンス（Ｒｅｅｄら、
１９９０）によって例示されるように、ホスホジエステルおよび／またはホスホ
ロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによってうまく阻害された。

【００１６】 末梢血および／または骨髄から得た造血幹細胞の移植は、多くの型の癌を含む
様々な疾患の治療のために、化学療法および／または放射線療法と組み合わせて
、ますます使用される。そのような移植するものにおける、長期造血再構築が可
能な細胞の割合は非常に低く、そして従って造血幹細胞の精製および増殖の技術
を開発する必要性が存在する。

【００１７】 よって、多能性であり、広く多様な細胞系統に発達することができ、そしてＧ
ＶＨＤおよび残存疾患の合併症無しに移植することができる、増加した数の造血
幹細胞を得るのに効果的な方法を開発する必要性が依然としてある。本発明はこ
の必要性に取り組む。 （発明の要旨） 本発明は、被験体からＨＳＣを含む細胞集団を得る工程、ＨＳＣを濃縮するの
に効果的な方法で細胞集団を処理する工程、そして濃縮ＨＳＣ集団を、造血幹細
胞の数を少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、そしてより好ましくは少
なくとも８倍以上増加させるのに十分な濃度および期間で、エキソビボでｃ−ｍ
ｙｃアンチセンスオリゴマーに曝露する工程を行うことによって調製した造血幹
細胞（ＨＳＣ）組成物を産生する方法を提供する。ＨＳＣは、系統マーカーの発
現を欠き（ｌｉｎ−）、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現がポジティブ
で、そしてＳｃａ１の細胞表面発現に対してポジティブであるとして特徴付けら
れる。

【００１８】 １つの実施形態では、本方法を行うＨＳＣを含む細胞集団を、ヒト骨髄または
動員されたヒト末梢血から得る。

【００１９】 別の実施形態では、被験体はヒト癌患者であり、そして被験体はリンパ腫また
は白血病を有する。

【００２０】 本発明の実施に使用するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーは、典型的には以
下の１つ以上によって特徴付けられる：（１）約１２から２５塩基長；（２）実
質的に荷電していない骨格；（３）５０℃より高いＴｍで、標的ＲＮＡの相補的
配列と高い親和性でハイブリダイズする能力；（４）ヌクレアーゼ耐性；（５）
細胞内への能動輸送または促進輸送の能力；および（６）図２Ａ−Ａから２Ｅ−
Ｅで示された構造からなる群から選択される構造。

【００２１】 １つの好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、配列番号第１番と
して同定される配列を有する。

【００２２】 本発明はまた、被験体において癌を治療する医薬として使用する、上記で述べ
た方法によって調製した、造血幹細胞（ＨＳＣ）組成物を提供する。

【００２３】 本方法の関連する適用において、上記で述べた方法によって調製した、増殖Ｈ
ＳＣ集団を、系統を方向付けられた先駆細胞およびその子孫の増殖集団を生じる
のに効果的な条件下でさらに培養する。

【００２４】 １つ以上の以下のものを癌患者に伝達する方法が、本発明によってさらに提供
される：（１）ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理造血幹細胞（ＨＳＣ）組
成物；（２）ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー；および（３）系統を方向付け
られた先駆細胞およびその子孫の増殖集団。

【００２５】 造血幹細胞および系統を方向付けられた先駆細胞およびその子孫を濃縮した、
エキソビボで増殖したそのような細胞集団を、様々な悪性腫瘍、非悪性造血異常
、自己免疫疾患を治療する治療レジメンの一部として、およびワクチンを補うた
めに、患者へ再注入し得る。

【００２６】 本発明のこれらおよび他の目的および特徴が、以下の詳細な説明を添付する図
および実施例と併せて読むと、より完全に明らかとなる。

【００２７】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 下記の用語は、本明細書中で使用される場合、他に示さなければ以下の意味を
有する。

【００２８】 本明細書中で使用される場合、用語「造血幹細胞を濃縮した細胞集団」とは、
本明細書中で記載されるポジティブおよびネガティブ選択技術を用いて得られた
細胞集団をいう。ここで造血幹細胞は、ＬＴＲ−ＨＳＣまたはＳＴＲ−ＨＳＣで
あり得る。

【００２９】 本明細書中で使用される場合、用語「長期再増殖造血幹細胞」または「ＬＴＲ
−ＨＳＣ」とは、移植可能であり、そして分化の際、完全に免疫抑制されたレシ
ピエントに移植された場合に、不確定の期間造血細胞の全ての系統に寄与する造
血幹細胞をいう。ＬＴＲ−ＨＳＣはクローン死滅をしない。

【００３０】 本明細書中で使用される場合、用語「短期再増殖造血幹細胞」または「ＳＴＲ
−ＨＳＣ」とは、移植可能であり、そして免疫抑制されたレシピエントに移植さ
れた場合に、約１週間から６ヶ月間造血細胞の全ての系統に寄与し、次いでクロ
ーン死滅をするマウス造血幹細胞をいう。

【００３１】 用語「クローン死滅」とは、本明細書中で使用される場合、単一の造血幹細胞
およびその細胞のクローン増殖によって産生された全ての子孫の最終分化をいい
、その結果、もはや最初のクローンから娘細胞が産生されない。

【００３２】 用語「多能性造血幹細胞」とは、全ての可能性のある細胞系統へ分化し得る造
血幹細胞をいう。

【００３３】 本明細書中で使用される場合、用語「高増殖可能なコロニー形成細胞」または
「ＨＰＰ−ＣＦＣ」とは、造血幹細胞に関して本明細書中で使用される場合、ラ
ットｒＳＣＦ、マウスｒＩＬ−３およびヒトｒＩＬ−６に応答して増殖するマウ
ス細胞をいう。細胞は、寒天またはメチルセルロースのような半固体培地で、あ
るいは単一の細胞として液体培養液中で増殖し、そして１ｍｍより大きな直径を
有し、一般的には密集した多中心とともに１クローンあたり１００，０００細胞
以上を有するマクロクローン（ｍａｃｒｏｃｌｏｎｅｓ）を形成する。この集団
は全てのマウスＨＳＣを含むが、全てのＨＰＰ−ＣＦＣがＨＳＣであるわけでは
なく、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイはＬＴＲ−ＨＳＣの特異的アッセイではない。対
照的に、低増殖可能な（ＬＰＰ）クローンは、１クローンあたり２から１００，
０００の細胞を含む。

【００３４】 本明細書中で使用される場合、「系統を方向付けられた造血幹細胞」は、全て
の細胞系統ではなく、１つ以上の特定の細胞系統に方向付けられるために十分に
分化した造血幹細胞である。

【００３５】 本明細書中で使用される場合、用語「ｌｉｎ−」または「系統枯渇（ｌｉｎｅ
ａｇｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、単球および赤血
球に特異的な細胞表面抗原を発現せず、そして「ＹＷ２５．１２．７」抗体によ
って認識される抗原を発現しない細胞集団をいう（例えばＢｅｒｔｏｎｃｅｌｌ
ｏ Ｉら、１９９１を参照のこと）。

【００３６】 本明細書中で使用される場合、用語「発生」、「分化」および「成熟」とは交
換可能に使用され、そして複数の細胞系統へ分化する可能性を有する段階から、
１つ以上の規定された系統へ方向付けられた、より分化した細胞になる、細胞の
発達をいう。

【００３７】 本明細書中で使用される場合、用語「精製された」とは、造血幹細胞に関して
、それらが天然に特定の組織（例えば骨髄または末梢血）において共に通常見い
出される、いくつかのまたは全ての他の型の細胞と比較して濃縮（単離または精
製）されたＨＳＣをいう。一般的に、ＨＳＣの「精製された」集団は、Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ３３３４２とローダミン１２３の両方を用いた低レベル染色に加えて、濃
度勾配分画、系統枯渇、およびｃ−ｋｉｔおよびＳｃａ−１発現のポジティブ選
択に供された。

【００３８】 本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」およ
び「アンチセンスオリゴマー」とは交換可能に使用され、そしてアンチセンスオ
リゴマーがＲＮＡ中の標的配列とワトソン−クリック塩基対形成によってハイブ
リダイズし、標的配列内でＲＮＡ：オリゴマーへテロ二本鎖を形成することを可
能にする、ヌクレオチド塩基の配列およびサブユニットからサブユニットへの骨
格をいう。オリゴマーは、標的配列と正確な配列相補性または近い相補性を有し
得る。そのようなアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳を
ブロックまたは阻害し得る、あるいは遺伝子の転写を阻害する、二本鎖または一
本鎖配列に結合し得る、およびそれがハイブリダイズする配列に「向けられた」
と言われ得る。

【００３９】 本発明で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な構造は、図１Ａ
〜Ｅで示したβモルホリノサブユニット型を含む。ポリマーは１つ以上の結合型
を含み得ることが認められる。

【００４０】 図１のサブユニットＡは、図２のＡ−Ａで示す５原子反復ユニット骨格を形成
する、１原子のリンの基を含む結合を含む。ここでモルホリノ環は、１原子ホス
ホンアミド結合によって結合する。

【００４１】 図１のサブユニットＢは、図２のＢ−Ｂで示すような、６原子反復ユニット骨
格のために設計される。構造Ｂにおいて、５’モルホリノ炭素をリンの基に結合
している原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり得る。リン
からぶら下がるＸ基は、以下のいずれかであり得る：フッ素；アルキルまたは置
換アルキル；アルコキシまたは置換アルコキシ；チオアルコキシまたは置換チオ
アルコキシ；または環状構造を含む、非置換、モノ置換、またはジ置換窒素。

【００４２】 図１のサブユニットＣ〜Ｅは、図２のＣ−ＣからＥ−Ｅで示すような、７原子
ユニット長骨格のために設計される。構造Ｃにおいて、Ｘ基は構造Ｂと同様であ
り、そして基Ｙは、メチレン、硫黄、または好ましくは酸素であり得る。構造Ｄ
において、ＸおよびＹの基は、構造Ｂと同様である。構造Ｅにおいて、Ｘは構造
Ｂと同様であり、そしてＹはＯ、Ｓ、またはＮＲである。図１Ａ−Ｅで示した全
てのサブユニットにおいて、ＺはＯまたはＳであり、そしてＰ_iまたはＰ_jはアデ
ニン、シトシン、グアニンまたはウラシルである。

【００４３】 本明細書中で使用される場合、「モルホリノオリゴマー」は、典型的なポリヌ
クレオチドと水素結合し得る塩基を支持する骨格を有するポリマー分子を指す。
ここでポリマーは五炭糖骨格基、そしてより具体的にはヌクレオチドおよびヌク
レオシドに典型的なホスホジエステル結合によって結合したリボース骨格を欠く
が、その代わりに環の窒素により結合した環の窒素を含む。好ましい「モルホリ
ノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂで示す形式のモルホリノサブユニット構造か
らなる。ここで（ｉ）構造は、１から３原子長のリンを含む結合によって結合さ
れ、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭
素に結合されていて、そして（ｉｉ）Ｐ_iおよびＰ_jは、塩基特異的水素結合によ
って、ポリヌクレオチドの塩基と結合するのに効果的な、プリンまたはピリミジ
ン塩基対基である。

【００４４】 本発明のこの好ましい局面を、図２Ｂに示す。それはホスホロジアミデート結
合で結合した２つのそのようなサブユニットを示す。モルホリノオリゴヌクレオ
チド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば共同所有の米国特許第５，６
９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第
５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号
、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号において詳述さ
れている。

【００４５】 本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー分子（オリゴ
マー）は、その骨格がホスホジエステル結合のヌクレアーゼ分解に感受性でない
ものである。例示的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチ
オエートおよびリン酸−アミンＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）(両方とも荷電した骨格を
有する）、ならびにメチルホスホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（Ｐ
ＮＡ）オリゴヌクレオチド（これらは全て荷電していない骨格を有し得る）のよ
うな、オリゴヌクレオチドアナログである。

【００４６】 本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴ
マーは、オリゴマーが標的に実質的に３７℃より高い、好ましくは少なくとも５
０℃、そして典型的には６０℃−８０℃またはそれより高いＴｍにおいて、生理
的条件下でハイブリダイズする場合、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブ
リダイズする」。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、規定され
たイオン強度およびｐＨで特異的な配列に関して、熱的融点（Ｔ_[m]）より約１
０℃、そして好ましくは約５℃低く選択される、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨで、Ｔ_[m]は、標的
配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。

【００４７】 ２つの一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行の配置でハイブリダイゼーションが
起こる場合、ポリヌクレオチドは、お互いに「相補的である」と記載される。第
１のポリヌクレオチドの１つの鎖の一本と第２ポリヌクレオチドとの間にハイブ
リダイゼーションが起こる場合、二本鎖ポリヌクレオチドは、別のポリヌクレオ
チドと「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のものと相
補的である度合い）は、一般的に受け入れられた塩基対形成のルールによって、
お互いに水素結合を形成することが期待される、反対の鎖における塩基の割合に
関して定量可能である。

【００４８】 本明細書中で使用される場合、用語「アナログ」とは、オリゴマーに関して、
参照オリゴマーのものと同様の構造的と化学的性質の両方を有する物質をいう。

【００４９】 本明細書中で使用される場合、配列が第１の配列であるポリヌクレオチドが、
生理的条件下で第２のポリヌクレオチド配列に特異的に結合、または特異的にハ
イブリダイズする場合、第１の配列は第２の配列に関して「アンチセンス配列」
である。

【００５０】 本明細書中で使用される場合、「標的ＲＮＡを含む塩基特異的細胞内結合事象
」とは、細胞内におけるオリゴマーの標的ＲＮＡ配列への配列特異的結合をいう
。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列が相補的な一本鎖ポリヌクレオチド
に特異的に結合し得る。

【００５１】 本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二本鎖」とは、偏在
性の細胞内および細胞外ヌクレアーゼによるインビボ分解に耐性である、アンチ
センスオリゴマーのその相補的標的への結合によって形成されたヘテロ二本鎖を
指す。

【００５２】 本明細書中で使用される場合、「ｃ−ｍｙｃ」とは、癌遺伝子または細胞に癌
または腫瘍の発達および増殖に向けて指示を与える遺伝子をいう。「ｃ−ｍｙｃ
」は、下記でさらに詳しく記載されるように、様々な型の癌で遺伝子増幅と関連
していた。

【００５３】 本明細書中で使用される場合、用語「ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー」と
は、相補的またはほとんど相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列に高い親和性を有する（
すなわち、それは「特異的にハイブリダイズする」）、ヌクレアーゼ耐性アンチ
センスオリゴマーをいう。

【００５４】 本明細書中で使用される場合、用語「発現の調節」とは、オリゴヌクレオチド
に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）の、発現またはＲＮ
Ａの翻訳に干渉することよって、所定のタンパク質の発現を増強または抑制する
能力をいう。増強されたタンパク質発現の場合、アンチセンスオリゴマーはサプ
レッサー遺伝子（例えば腫瘍抑制遺伝子）の発現をブロックし得る。抑制された
タンパク質発現の場合、アンチセンスオリゴマーは、所定の遺伝子の発現を直接
ブロックし得る、またはその遺伝子から転写されたＲＮＡの加速された分解に寄
与し得る。

【００５５】 本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」および「癌」とは、増殖制御の喪失
を示し、そして異常に大きな細胞クローンを形成する細胞をいう。腫瘍または癌
細胞は一般的に、接触阻止を喪失し、そして侵襲性である、および／または転移
する能力を有し得る。

【００５６】 本明細書中で使用される場合、アンチセンスオリゴマーに関して「有効な量」
とは、単回投与または一連の投与の一部として哺乳類被験体に投与された、そし
て選択された標的核酸配列の発現を阻害するのに効果的なアンチセンスオリゴマ
ーの量をいう。

【００５７】 本明細書中で使用される場合、個体または細胞の「処置」は、個体または細胞
の天然の経過を変える試みで使用される、あらゆる型の介入である。処置は、例
えば薬学的組成物の投与を含むがこれに限らず、そして予防的に、または病的な
事象の開始または病原体との接触に続いて行われ得る。

【００５８】 本明細書中で使用される場合、用語「改善された治療結果」とは、癌患者に関
して、癌細胞または固形腫瘍の増殖の遅延または縮小、または癌細胞の全細胞数
または全腫瘍負荷量の減少をいう。

【００５９】 （ＩＩ．ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチド） （Ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチドの型） １５−２０塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、通常哺乳類ゲノムにお
いて１つの相補的配列を有するのに十分な長さである。それに加えて、少なくと
も１７ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス化合物が、その標的ｍＲＮＡに
よくハイブリダイズすることが示された（Ｃｏｈｅｎら、１９９１）。

【００６０】 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現の阻害を説明する２つの一般的な
メカニズムが提案された（例えばＡｇｒａｗａｌら、１９９０；Ｂｏｎｈａｍら
、１９９５；およびＢｏｕｄｖｉｌｌａｉｎら、１９９７を参照のこと）。

【００６１】 第１に、オリゴヌクレオチドおよびｍＲＮＡ間に形成されたヘテロ二本鎖は、
ＲＮアーゼＨの基質であり、ｍＲＮＡの切断を導く。この種類に属する、または
属すると提案されたオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホトリエ
ステル、およびホスホジエステル（未修飾「天然」オリゴヌクレオチド）を含む
。そのような化合物は一般的に高い活性を示し、そしてホスホロチオエートは現
在、アンチセンス適用において最も広く採用されているオリゴヌクレオチドであ
る。しかし、これらの化合物は、細胞タンパク質に対する非特異的結合（Ｇｅｅ
ら、１９９８）、および非標的ＲＮＡヘテロ二本鎖の不適当なＲＮアーゼ切断（
Ｇｉｌｅｓら、１９９３）による望ましくない副作用を産生しがちである。

【００６２】 「立体ブロッカー」またはあるいは「ＲＮアーゼＨ不活性」または「ＲＮアー
ゼＨ耐性」と呼ばれる、２番目のクラスのオリゴヌクレオチドアナログは、ＲＮ
アーゼＨの基質として作用することが観察されず、そして立体的に標的ＲＮＡの
形成、核細胞質輸送、または翻訳を阻害することによって作用すると考えられる
。この種類は、メチルホスホネート（Ｔｏｕｌｍｅら、１９９６）、モルホリノ
オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’−Ｏ−アリルまたは２’−
Ｏ−アルキル修飾オリゴヌクレオチド（Ｂｏｎｈａｍ、１９９５）、およびＮ３
’Ｐ５’ホスホロアミデート（Ｇｅｅ、１９９８）を含む。

【００６３】 天然に存在するオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼによる消化に感受性のホ
スホジエステル骨格を有するが、骨格の特定の修飾は、天然オリゴヌクレオチド
のそのような分解に対する耐性を増加させる（例えばＳｐｉｔｚｅｒおよびＥｃ
ｋｓｔｅｉｎ、１９８８を参照のこと）。

【００６４】 候補アンチセンスオリゴマーを、それぞれ³Ｈ−ロイシンおよび³Ｈ−チミジン
の組み込みによって測定される、タンパク質およびＤＮＡ合成に対する影響のよ
うな、急性および慢性細胞毒性に関して、周知の方法によって評価する。それに
加えて、様々なコントロールオリゴヌクレオチド、例えばセンス、ナンセンス、
またはスクランブルアンチセンス配列、またはミスマッチ塩基を含む配列を、候
補アンチセンスオリゴマーの結合特異性を確認するために。そのような試験の結
果は、遺伝子発現の特異的なアンチセンス阻害効果を無差別の抑制から見分ける
ために重要である（例えばＢｅｎｎｅｔｔら、１９９５を参照のこと）。よって
、アンチセンスオリゴマーの非標的配列への非特異的結合を制限するために、配
列を必要なだけ修飾し得る。

【００６５】 標的ＲＮＡとのヘテロ二本鎖の形成における、所定のアンチセンスオリゴマー
分子の有効性を、当該分野で公知のスクリーニング法によって決定し得る。例え
ば、オリゴマーを、ｃ−ｍｙｃを発現する細胞培養とインキュベートし、そして
標的ＲＮＡに対する効果を、（１）当業者に公知の手順を用いて、標的配列およ
び非標的配列とのヘテロ二本鎖形成の存在または非存在、（２）ＲＴ−ＰＣＲま
たはノーザンブロットのような標準的な技術によって決定されるｃ−ｍｙｃ ｍ
ＲＮＡの量、または（３）ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングのような
標準的な技術によって決定されるｃ−ｍｙｃタンパク質の量、をモニターするこ
とによって評価する。（例えばＰａｒｉら、１９９５；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１
９９６を参照のこと） 本発明の方法で使用する典型的なアンチセンスオリゴマーは、モルホリノオリ
ゴマー（図２Ａ−Ｄ）、ペプチド核酸およびメチルホスホネートオリゴマーを含
む。

【００６６】 （１．モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド） 好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実質的に荷電していない骨格を
有するヌクレアーゼ耐性オリゴマーであり、そして特に選択されたｍＲＮＡ標的
配列の領域に相補的な塩基配列に加えて、オリゴマーのヌクレオチドサブユニッ
トによって規定されるオリゴマー骨格、および標的ＲＮＡおよびオリゴマーの相
補的塩基間のワトソン−クリック塩基対形成によって、オリゴマーが標的ＲＮＡ
配列に結合し得るような、それらの間の結合を有するモルホリノオリゴマーであ
る。

【００６７】 モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合の特徴は、米国特許第５，６９
８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５
，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号お
よび同第５，５０６，３３７号に詳述されている。

【００６８】 好ましいオリゴマーは、上記で引用した特許で示された形式のモルホリノサブ
ユニットからなり、ここで（ｉ）モルホリノグループは、１から３原子長の、１
つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’環外炭素に連
結している、実質的に荷電していない結合によって結合している、そして（ｉｉ
）モルホリノグループに結合している塩基は、塩基特異的水素結合によってポリ
ヌクレオチドの塩基に結合するのに効果的な、プリンまたはピリミジン塩基対形
成分子である。プリンまたはピリミジン塩基対形成分子は、典型的にはアデニン
、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。そのようなオリゴマーの
調製は、米国特許第５，１８５，４４４号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌ
ｅｒ、１９９３）に詳しく記載されている。様々な型の非イオン性結合を、モル
ホリノ骨格を構築するために使用し得る。モルホリノオリゴマーは、非特異的ア
ンチセンス作用を示さないかまたはほとんど示さず、高い水溶性を与え、ヌクレ
アーゼに反応を示さず、そして低い製造コストを有するように設計される（Ｓｕ
ｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、１９９７ｂ）。

【００６９】 （２．ペプチド核酸（ＰＮＡ）） 天然に存在するオリゴヌクレオチドに見られるホスホジエステル骨格は、強力
な構造ＤＮＡ模倣物に必須ではなく、そして２重らせん構造に必要でさえないこ
と、そしてペプチドまたはタンパク質核酸（ＰＮＡ）が効果的なＤＮＡ模倣物と
して機能し得ることが示された（Ｎｉｅｌｓｅｎ、１９９５）。

【００７０】 ＰＮＡは、骨格が構造的にデオキシリボース骨格と同形のＤＮＡアナログであ
る。それは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットからなり、それにピリ
ミジンまたはプリン塩基が結合する。天然ピリミジンおよびプリン塩基を含むＰ
ＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成ルールに従って、相補的なオリゴヌクレ
オチドにハイブリダイズし、そして塩基対認識に関してＤＮＡを模倣する（Ｅｇ
ｈｏｌｍら、１９９３）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプ
チド結合で形成され、それらをアンチセンス適用にふさわしくする。骨格は荷電
しておらず、通常より高い熱安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ
二本鎖を生じる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識され
ない。しかし、ＰＮＡアンチセンス薬剤は、おそらく低い細胞への取り込み（輸
送）のために、細胞培養において遅い膜通過を示すことが観察された（例えばＡ
ｒｄｈａｍｍａｒ Ｍら、１９９９を参照のこと）。

【００７１】 （３．メチルホスホネートオリゴヌクレオチド） メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、荷電しておらず、そして従って荷
電したオリゴヌクレオチドに比べて増強された細胞取り込みを示すことが予測さ
れる（Ｂｌａｋｅら、１９８５）。しかし、メチルホスホネートアンチセンスオ
リゴマーは、インビトロでＮ−ｒａｓの発現を阻害できないことが示された（Ｔ
ｉｄｄら、１９８８）。対照的に、いくつかの癌遺伝子ｍＲＮＡのインビトロに
おける翻訳は、ホスホジエステルおよび／またはホスホロチオエートアンチセン
スオリゴヌクレオチドによって首尾良くブロックされることが示された（ｃ−ｍ
ｙｃ：ＭｃＭａｎａｗａｙら、１９９０；Ｗａｔｓｏｎら、１９９１；ｂｃｌ−
２：Ｒｅｅｄら、１９９０；ｍｙｂ：Ｃａｌａｂｒｅｔｔら、１９９１；ｂｃｒ
−ａｂ：Ｓｚｃｚｙｌｉｋら、１９９１）。メチルホスホネートオリゴマーの合
成は複数の工程を必要とし、それは臨床適用においてそのような構造を使用する
、実用的な有用性を制限し得る。

【００７２】 （４．好ましいアンチセンスオリゴマー） 目的の遺伝子の関連する領域から転写されるｍＲＮＡが、一般的にアンチセン
スオリゴヌクレオチドの標的となるが、いくつかの場合には、二本鎖ＤＮＡの主
溝部位への配列特異的結合のために設計された非イオン性プローブを用いて、二
本鎖ＤＮＡが標的となり得る。そのような型のプローブは、米国特許第５，１６
６，３１５号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ、１９９２）に記載され
ており、そして一般的に本明細書中で、標的遺伝子の発現を阻害する能力に関し
て、アンチセンスオリゴマーと呼ばれる。

【００７３】 本発明の方法において、アンチセンスオリゴマーは、実質的に３７℃より高い
、例えば少なくとも５０℃および好ましくは６０℃−８０℃のＴｍで、生理的条
件下でｃ−ｍｙｃ核酸配列の領域にハイブリダイズするように設計される。オリ
ゴマーは、核酸に対して高い結合親和性を有するように設計され、そしてｃ−ｍ
ｙｃ標的配列に１００％相補的であり得る、またはオリゴマーおよびｃ−ｍｙｃ
標的配列間に形成されるヘテロ二本鎖が、細胞から体液への移行の間に、細胞ヌ
クレアーゼの作用および他の方式の分解に耐えるのに十分安定である限り、例え
ば対立遺伝子変異体を適応させるにミスマッチを含み得る。ミスマッチは、もし
存在するなら、ハイブリッド二本鎖の中心よりも末端領域に向かってより不安定
化させない。許されるミスマッチの数は、二本鎖安定性のよく理解された原則に
従って、オリゴマーの長さ、二本鎖中でのＧ：Ｃ塩基対の割合、および二本鎖に
おけるミスマッチの位置に依存する。

【００７４】 そのようなアンチセンスオリゴマーは、ｃ−ｍｙｃ標的配列に１００％相補的
である必要はないが、ｃ−ｍｙｃの発現が調節されるように、標的配列に安定に
および特異的に結合することが効果的である。高い特異性とあわせて安定で効果
的な結合を可能にするオリゴマーの適当な長さは、約８−４０ヌクレオチド塩基
ユニット、および好ましくは約１２−２５ヌクレオチドである。標的との塩基対
特異性は維持されると仮定して、標的塩基との縮重塩基対形成を可能にするオリ
ゴマー塩基も企図される。

【００７５】 一般的に、本発明のアンチセンス法を用いた遺伝子発現の調節の標的は、ｃ−
ｍｙｃのｍＲＮＡ翻訳開始コドンにまたがる配列を含む。しかし、いくつかの場
合には、１つ以上のイニシエーターまたはプロモーター部位、イントロンまたは
エキソン連結部位、３’非翻訳領域、および５’非翻訳領域を含む、ｃ−ｍｙｃ
ｍＲＮＡの他の領域が標的となり得る。それに加えて、スプライシングされた
およびされていないＲＮＡがどちらも、本発明の方法で使用するアンチセンスオ
リゴマーを設計する鋳型となり得る。

【００７６】 本発明の方法で使用する好ましいアンチセンスオリゴマーは、好ましくは以下
のものを含む１つ以上の性質を有する：（１）実質的に荷電していない骨格（例
えばＵｈｌｍａｎｎら、１９９０）、（２）標的ＲＮＡの相補的配列と高い親和
性で、すなわち実質的に３７℃より高い、好ましくは少なくとも５０℃、そして
典型的には６０℃−８０℃またはそれより高いＴｍでハイブリダイズする能力、
（３）少なくとも８塩基、一般的には約８−４０塩基、好ましくは１２−２５塩
基のサブユニットの長さ、（４）ヌクレアーゼ耐性（Ｈｕｄｚｉａｋら、１９９
６）および（５）（ｉ）ホスホロチオエートアンチセンスオリゴマーとの競合的
結合、および／または（ｉｉ）検出可能なリポーターを細胞内へ輸送する能力に
よって示されるような、能動輸送または促進輸送の能力。

【００７７】 この実施形態の１つの好ましい局面では、アンチセンスオリゴマーは配列番号
１として示される配列を含む。

【００７８】 （Ｂ．ｃ−ｍｙｃ） ｃ−ｍｙｃは、ニワトリレトロウイルスＭＣ２９の形質転換遺伝子の細胞ホモ
ログである、癌原遺伝子である。ｃ−ｍｙｃは、細胞増殖、分化およびアポトー
シスを調節し、そしてその異常な発現が、多くの場合ヒト癌で観察される。ｃ−
ｍｙｃの異常な、構成的な、または過剰発現は、肺癌、直腸結腸癌、乳癌、膀胱
癌、白血病、肺癌等を含む多くのヒト癌に関連していた。

【００７９】 癌原遺伝子は、以下のものを含む様々なメカニズムによって癌遺伝子へ活性化
される：（１）プロモーターの挿入、（２）エンハンサーの挿入、（３）染色体
の転座、（４）遺伝子増幅、および（５）点突然変異。本明細書中で使用する場
合、癌原遺伝子に関して「活性化」は、例えば発現無しから低レベルの発現へ、
遺伝子の転写が増加することを意味する。メカニズム（１）−（４）は、癌遺伝
子の発現レベルの増加を引き起こし、一方（５）は、変化した遺伝子産物の発現
を引き起こす。証拠は、ある形式の癌遺伝子発現は、腫瘍抑制遺伝子の不活性化
と共に癌の発達に必要であることを示唆する。

【００８０】 ｍｙｃ癌原遺伝子は、他の遺伝子の発現を直接調節する転写因子として記載さ
れた。その例はＥＣＡ３９、ｐ５３、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）
、アルファプロチモシン（ｐｒｏｔｈｙｍｏｓｉｎ）およびＣｄｃ２５Ａを含む
（Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｆら、１９９８）。

【００８１】 ニワトリにおいて、特定の鳥類白血病ウイルスによるニワトリＢ細胞の感染後
、プロウイルスがｍｙｃ遺伝子の近くに組み込まれ、それがプロモーターまたは
エンハンサーのいずれかとして作用するウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）によ
って活性化され、ｍｙｃの発現およびＢ細胞腫瘍の形成を引き起こす（Ｍｕｒｒ
ａｙら、１９９６）。同様に、バーキットリンパ腫では、エンハンサー配列が転
座し、ｍｙｃの発現を引き起こす。

【００８２】 ｃ−ｍｙｃは正常造血幹細胞に発現し、そしてヒト表皮幹細胞の分化を促進す
ることが示された（Ｇａｎｄａｒｉｌｌａｓ ＡおよびＷａｔｔ ＦＭ、Ｇｅｎ
ｅｓ Ｄｅｖ １１（２１）：２８６９−２８８２、１９９７）。それに加えて
、ｃ−ｍｙｃは多くの癌で過剰発現または異常に発現していることが示された（
例えばＢｉｅｃｈｅ Ｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９（１２）：２７５９−
６５、１９９９を参照のこと）。休止細胞が細胞周期に再び入る時、ｃ−ｍｙｃ
の発現がアップレギュレートされること、そして異所性のｃ−ｍｙｃの発現が増
殖阻害シグナル、分化刺激、または分裂促進物質の中止に反応する細胞周期の停
止を阻害することが観察された（例えばＡｍａｔｉ Ｂら、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏ
ｓｃｉ ３：Ｄ２５０−６８、１９９８を参照のこと）。さらに、アポトーシス
阻害剤ｂｃｌ−２の発現が、結腸直腸癌細胞においてｃ−ｍｙｃの発現と逆比例
していた（例えばＰｏｐｅｓｃｕ ＲＡら、１９９８；Ｐｅｔｅｒｓ Ｒら、１
９９８を参照のこと）。

【００８３】 ｃ−ｍｙｃ過剰発現白血病および結腸癌細胞株を治療するためにｃ−ｍｙｃア
ンチセンスホスホロチオエートオリゴマーを使用した場合、細胞増殖の阻害に加
えて、競合的逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、結腸癌
細胞株および白血病細胞株においてそれぞれ、ｃ−ｍｙｃ ｍＲＮＡの２０から
１００分の１の減少が検出された（Ｌｉら、１９９５）。

【００８４】 ｃ−ｍｙｃに対するホスホロジアミデートオリゴマーアンチセンスは、ＲＮＡ
レベルで作用して正常なプレｍＲＮＡスプライシングを阻害し、そして配列特異
的な方式で異常にスプライシングされたｍＲＮＡを産生することが示された（Ｈ
ｕｄｚｉａｋ ＲＭら、２０００）。

【００８５】 驚くべきことに、造血幹細胞の濃縮集団を処理するためにｃ−ｍｙｃに対する
アンチセンスオリゴマーを使用した場合、発明者らは、造血幹細胞集団の発達が
調節されることを発見した。まとめると、多能性造血幹細胞の集団を、ｃ−ｍｙ
ｃをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの開始コドンにまたがる領域に向
けられた、アンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露することによって維持および
増殖させ得る。そのような増殖した造血幹細胞の集団を、方向付けられた前駆細
胞系統およびその子孫の集団の増殖を生じるのに効果的な条件下でさらに処理し
得ることも発見された。

【００８６】 （ＩＩＩ．造血幹細胞組成） （Ａ．造血幹細胞を得る方法） 成体において、多分化能性造血幹細胞の大多数が骨髄中で見られる。しかしな
がら、少数だが、かなりの数の多分化能性造血幹細胞が末梢循環、肝臓、および
脾臓において見出され得る。

【００８７】 本発明方法に使用する造血幹細胞はヒト骨髄、ヒト新生児臍帯血、胎児肝臓、
または適切な動員後の成人ヒト末梢血由来でありうる。

【００８８】 サイトカインを含む特定の化合物で被験体を処理することにより、造血幹細胞
の割合が劇的に増加する。まず、移植がより迅速に行うことができるため、その
ような動員化処理末梢血造血幹細胞は、移植手順において骨髄由来造血幹細胞に
対する重要な代替物となっている。（Ｔａｎａｋａ，ら、１９９９を参照するこ
と。）例えば、一つ以上の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子
（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）および化学療法薬剤（つまり、シクロ
ホスファミド）を使用してそのような動員化を達成し得る。

【００８９】 造血幹細胞単離に関する多くの方法が当該分野で既知であり、これには、通常
、骨髄、新生児臍帯血、胎児肝臓または成人ヒト末梢血からの造血幹細胞獲得が
含まれる。一旦獲得したら、一つ以上の密度勾配分離、または、パンニング法、
ＦＡＣＳおよび磁気ビーズ分離などのような技術によるポジティブまたはネガテ
ィブ選択を用いた免疫アフィニティー精製を行い、造血幹細胞集団を濃縮する。
そのような濃縮するステップに続いて、細胞集団をさらに表現型に関して、およ
び機能面に関して特徴付ける。

【００９０】 密度勾配で濃縮した、系統の枯渇した骨髄細胞の画分を選択すること、および
更に、ＤＮＡ結合色素、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２に低レベルで結合し、ミトコ
ンドリア結合色素、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（Ｗｏｌｆら、１９９３）に低レ
ベルで結合する細胞に対する１ステップ蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分画
化に基づいた細胞集団を選択することにより、高い増殖能力を持つコロニー形成
細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ，インビトロ）の特徴を持つ始原的造血幹細胞を単離し得
るということが先行研究により示されている。最近、ＨＰＰ−ＣＦＣの確定され
た部分集団が移植可能であり、ＨＰＰ−ＣＦＣを生じる細胞の部分集団が、エキ
ソビボで複製しうるＬＴＲ−ＨＳＣｓであることが示されている（例えば、Ｙａ
ｇｉら、１９９９を参照のこと）。

【００９１】 （Ｂ．造血幹細胞組成の特性化） 造血幹細胞は、歴史的に、自己再生可能なだけでなく、任意の造血幹細胞系統
が娘細胞を生じる能力を保持し得る、移植可能細胞として定義されてきた。方向
付けられた前駆細胞は、造血幹細胞由来のより分化した細胞として定義される。

【００９２】 造血幹細胞を特徴付ける表現型マーカーが、広範なデータベースおよび多くの
刊行物で用いられている。今までのところ、マーカーがマウスまたはヒト造血幹
細胞に対して決定的なものであるということに関して意見の一致がみられていな
い。

【００９３】 本明細書中で、密度勾配により濃縮し、ＣＤ３４抗原発現がネガティブ、ＣＤ
１１７（ｃ−ｋｉｔ）抗原発現がポジティブでＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３
３３４２（Ｈｏ−３３３４２）およびミトコンドリア結合色素であるＲｈｏｄａ
ｍｉｎｅ１２３（Ｒｈ−１２３）（Ｗｏｌｆら、１９９３）との低レベル結合性
を示す、系統の枯渇骨髄細胞の蛍光表示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）による選択を
行い、ＬＴＲ−ＨＳＣをマウスから単離し、特徴付けしている。この単離細胞集
団が移植可能であり、未分画化骨髄細胞と共に移植した場合、致死的放射線照射
したレシピエントでの再構築が可能であることが示されている。

【００９４】 ＳＴＲ−ＨＳＣ集団を、ＦＡＣＳ分取により選択可能であり、本明細書中で、
表現型の面で系統マーカー（ｌｉｎ−）の発現を欠き、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７
）、Ｓｃａ１およびＣＤ３４に関してポジティブで、ＤＮＡ結合色素Ｈｏｅｃｈ
ｓｔ３３３４２（Ｈｏ−３３３４２）に対して低レベル結合性を示し、ミトコン
ドリア結合色素であるＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（Ｒｈ−１２３）に対して高レ
ベル結合性を示す、密度勾配で軽い分画に来る骨髄細胞として定義する。

【００９５】 造血幹細胞を検出および特性化するために使用する機能的読み出しには、細胞
培養における（インビトロ）特定の解析条件下でコロニーを形成する能力が含ま
れる。典型的な解析には、長期間培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）分析（Ｐｅｔｔｅ
ｎｇｅｌｌ Ｒら、１９９４）および、高増殖能力−コロニー形成細胞（ＨＰＰ
−ＣＦＣ）分析が含まれる。（例えば、Ｙａｇｉら、１９９９を参照すること。
）上記のように、さらなる機能的特性化には、長期再構築性造血幹細胞（ＬＴＲ
−ＨＳＣ）および短期再構築性造血幹細胞（ＳＴＲ−ＨＳＣ）に対するインビボ
解析が含まれる。

【００９６】 造血幹細胞は、しばしば、上記で定義したように、高増殖能コロニー形成細胞
（ＨＰＰ−ＣＦＣ）解析における活性により機能的に特徴付けられる。

【００９７】 ＨＰＰ−ＣＦＣは次のように特性化される。すなわち、（１）インビボでの、
細胞毒性を持つ薬剤である５−フルオロウラシル処理に対する相対的耐性、（２
）致死的放射線照射されたマウスの骨髄再構築可能な細胞との高い相関性、（３
）適切な条件下でマクロファージ、顆粒球、巨核球および赤血球系統の細胞を生
じる能力、および（４）多因子反応性、である（例えば、ＭｃＮｉｅｃｅ，１９
９０を参照すること）。

【００９８】 本発明方法に使用する造血幹細胞は、実施例１で記述するように、濃縮してい
る。実施例２でさらに記述するように、それらの細胞は、また、ＨＰＰ−ＣＦＣ
解析（インビトロ）およびＬＴＲ−ＨＳＣｓ（インビボ）に対する解析において
も機能的に特徴付けされた。

【００９９】 造血幹細胞培養に対する好適なサイトカインには、一つ以上のインターロイキ
ン３（ＩＬ−３）、インターロイキン（ＩＬ−６）、インターロイキンー１１（
ＩＬ−１１）、インターロイキンー１２（ＩＬ−１２）、幹細胞因子（ＳＦＣ）
、例えばＷＯ９１／０５７９５で記述されている初期活性化赤血球因子、および
トロンボポエチン（ＴＰＯ）が含まれる。

【０１００】 完全な免疫抑制後のマウスＬＴＲ−ＨＳＣｓを用いた長期再構築には、持続的
ではない移植ではあるが、再構築する契機を与えるために、あまり分化していな
い長期再構築細胞とともに非分画化骨髄細胞を移植し、これにより長期再構築細
胞がホストを再構築するのに十分に分化するまで完全に免疫抑制されたホストを
生存させることを可能にする、ことが必要であることが示された（例えば、Ｊｏ
ｎｅｓら、１９９０を参照すること）。ＬＴＲ−ＨＳＣｓは効果的に完全免疫抑
制後のホストの造血系を再構築するために数ヶ月を要し得る。

【０１０１】 モノクローナル抗体をドナーおよびレシピエント細胞との区別を行うために使
用し得るような、つまりＦＡＣＳ解析および／または細胞分取によって区別し得
るようなＣＤ４５遺伝子座での類似遺伝子的なＣＤ４５．１として定義されるド
ナー造血幹細胞およびＣＤ４５．２として定義されるレシピエント造血幹細胞を
用いることにより、マウス造血再構築研究においてドナーおよびレシピエントの
細胞を区別するためにいくつかの方法を開発してきた。そのような検出方法にお
いて、ＣＤ４５．１ドナー細胞分化が受容側造血系再構築に十分であるようにな
るまで受容側マウスを生存させるために、受容側マウスに十分なＣＤ４５．２ポ
ジティブ骨髄細胞を注入する。ＳＴＲ−ＨＳＣｓ由来のＬＴＲ−ＨＳＣｓ、およ
び受容マウス細胞由来のドナー細胞を分化させるために、そのような方法を使用
し得る（実施例２）。

【０１０２】 一旦、造血幹細胞集団を得たら、その細胞をすぐに使用する、または、その細
胞を後に凍結融解し例えば患者への投与に使用するように、標準的な条件下で液
体窒素により凍結し長期間保存し得る。細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ウ
シ胎仔血清（ＦＣＳ）、および４０％細胞培養液中で保存する。

【０１０３】 （ＩＶ．本発明の方法および組成） ある好適な局面において、本発明は、濃縮したＨＳＣ集団を、ｃ−ｍｙｃをコ
ードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの開始コドンに渡る領域に向けられたア
ンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露して多分化能幹細胞（ＨＳＣ）集団を維持
し発展させるための方法および組成を提供する。

【０１０４】 ある好適な実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＳＥＱ：Ｉ
Ｄ：ＮＯ．１で示される配列を持つ。さらに好適な実施形態において、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは物質的に電荷をもたず、さらに、安定で、高いＴｍを
持ち、および、（ｉ）ホスホロチオエートアンチセンスオリゴマーとの競合的結
合および／または、（ｉｉ）細胞への検出可能なレポーターの輸送能力によって
明らかなように能動輸送または促進輸送が可能であるという特徴を持つ。

【０１０５】 造血幹細胞に対してエキソビボ（インビトロ）でｃ−ｍｙｃアンチセンスオリ
ゴマーに曝露し得、および／またはインビボで造血幹細胞集団の拡大を引き起こ
すのに有効な量のｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを対象者に投与し得る。

【０１０６】 関連局面において、造血幹細胞を、造血幹細胞集団の拡大を引き起こすのに有
効な量のｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーに曝露し得、さらに、系統の方向付
けられた前駆細胞およびその子孫細胞の増殖を引き起こすのに効果的な条件下で
処理し得る。

【０１０７】 （Ａ．アンチセンスオリゴマーへの細胞の曝露） 本発明は、安定で、高いＴｍ、細胞へ能動輸送または促進輸送され、高アフィ
ニティーで相補的または相補的に近いｃ−ｍｙｃ核酸配列と結合可能であるとい
う特徴を持つ、実質的に電荷を持たないアンチセンスオリゴマーを造血幹細胞へ
適用可能であり、また、インビトロまたはインビボのいずれかで被験者において
、その細胞でのｃ−ｍｙｃ発現が抑制され、その結果細胞分化が調節されるとい
う発見に基づいたものである。

【０１０８】 多くの癌治療レジメンにより、患者の免疫不全が引き起こされ、患者は感染に
対して防御不可能な状態である。免疫不全に対する補助的な治療には、患者が感
染因子にさらされないように患者を保護的に隔離すること、例えば抗ウイルス剤
および抗真菌剤などの抗生物質投与、および／または貧血、血小板減少症（低血
小板数）、または好中球減少症（低好中球数）を治療するための断続的な輸血が
含まれ得る。

【０１０９】 多数の形の癌を含む様々な疾患の処置に対して、化学療法および／または放射
線療法と組み合わせて、末梢血および／または骨髄由来の造血幹細胞移植が益々
使用される。そのような長期造血系再構築が可能である移植物中の造血幹細胞の
割合は非常に低く、従って、造血幹細胞の精製および増加技術を発展させる必要
性がある。

【０１１０】 造血幹細胞を濃縮した細胞集団を用いた移植合併症治療には、同種移植片にお
ける移植片対宿主疾患（ＧＶＤＨ）の原因であるＴ−細胞、および疾患の再発を
引き起こしうる自己移植における腫瘍細胞など、移植レシピエント側に対する危
険性をもたらす移植組織中の細胞除去が含まれる。

【０１１１】 造血幹細胞を濃縮した細胞集団を用いる現在の移植手順および／または骨髄移
植は、特に好中球および血小板不足を起こす患者において、患者の造血系が、移
植した後、再構築されるまでに過剰な時間を要するという問題を抱えている。

【０１１２】 好中球は、感染に対するホストの保護に関連するものである。しばしば、化学
療法または放射線治療後に、およそ３−４週間の間、またはそれ以上の期間にわ
たって患者は好中球数が不足し、その結果、易感染状態になる。

【０１１３】 傷害を受けた部位での効果的な血液凝固のために血小板が必要である。しばし
ば、化学療法、放射線療法、造血幹細胞含有率を高めた細胞集団の移植、または
骨髄移植の後、およそ４−６週間の間、またはそれ以上の期間にわたって患者の
血小板数が不十分になり、その結果、患者は打撲傷が残りやすく、過剰な出血が
起こりやすくなる。

【０１１４】 （Ｂ．エキソビボでの、細胞に対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理
） 本発明には、インビトロ（エキソビボ）での、高アフィニティーで相補的また
は相補的に近いｃ−ｍｙｃ配列に対して結合可能なヌクレアーゼ耐性アンチセン
スオリゴマーの、造血幹細胞への曝露および、それに続くインビトロでの造血幹
細胞の発生分化調節が含まれる。そのような処理により、効果的に造血幹細胞培
養の組成に影響を与え得る。

【０１１５】 造血幹細胞をインビトロ（エキソビボ）で、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌ
クレオチドにて処理し、その後、対象者に対して投与し得る。この被験体は、造
血幹細胞を採取した同じ個人（自己移植）または、異なる個人（同種移植）であ
り得る。他者に対するドナーおよびレシピエント両方の免疫反応を最小限にする
ために、同種移植においては、ドナーおよびレシピエントは、ＨＬＡ抗原の類似
性に基づいて適合させられる。

【０１１６】 ある局面において、本発明は、ＨＳＣｓ集団を得て、それらをエキソビボにお
いて相補的または相補的に近いｃ−ｍｙｃ配列に対して高親和性を有するヌクレ
アーゼ耐性アンチセンスオリゴマーに曝露し、その後、増加させたＨＳＣ集団を
被験体に再注入することによって、造血幹細胞の発生を調節する方法に関する。

【０１１７】 本発明方法で使用する造血幹細胞集団を被験体から抽出し精製して、一つ以上
のサイトカイン存在下においてエキソビボで培養する。好適なサイトカインには
、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦおよびＴＰＯが含まれる。本発明方法で使用する
造血幹細胞集団は、好適にヒトおよび同種であり、または自己であり得る。

【０１１８】 造血幹細胞移植が必要な患者または同種ドナーから造血幹細胞を得うる。培養
において、インビトロで生存造血幹細胞数が増加する結果を得るために効果的な
条件下で、濃縮した造血幹細胞集団をｃ−ｍｙｃに対するオリゴマーアンチセン
スに曝露する。

【０１１９】 あるアプローチにおいて、本発明方法により、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴ
マーに曝露する前に存在する造血幹細胞数よりも少なくとも２倍にとなる造血幹
細胞集団増加が引き起こされる。好適には、本明細書中で記述している方法を用
いたｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーによる造血幹細胞の処理により、ｃ−ｍ
ｙｃアンチセンスオリゴマーに曝露する前に存在する造血幹細胞数と比較して、
造血幹細胞集団が最低４倍から８倍に増加する。より好適には、本明細書中で記
述している方法を用いたｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーによる造血幹細胞の
処理により、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーに曝露する前に存在する造血幹
細胞数と比較して、造血幹細胞集団が８倍以上に増加する。

【０１２０】 一般的に、分化することなく、造血幹細胞集団増加を引き起こすのに十分な時
間、造血幹細胞複製促進に効果的なサイトカインまたは増殖因子とともにｃ−ｍ
ｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養液中で造血幹細胞を培養する。

【０１２１】 造血幹細胞複製促進効果があるサイトカインまたは増殖因子とともにｃ−ｍｙ
ｃアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む培養液に曝露後、ＨＳＣ数が最低２倍
、４倍、８倍、またはそれ以上に増加するために必要な培養時間は、細胞の供給
源（組織供給源および細胞を取り出す被験者の健康を含む）、培養条件、濃縮し
た細胞集団中のＨＳＣの割合等に依存して変化する。

【０１２２】 本発明が二つの関連局面を意味することが理解されるであろう。即ち、（１）
ＨＳＣ数が増加した細胞集団、および（２）増加ＨＳＣ集団が特定の系統の方向
付けられた前駆細胞に分化する細胞集団、である。より長時間培養を行うと、Ｈ
ＳＣを濃縮した細胞集団に対するｃ−ｍｙｃアンチセンス処理で元来生じたＨＳ
Ｃの分化により、細胞集団の特定系統の方向付けられた前駆細胞数の増加が引き
起こされ得る。この局面において、本発明ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、インビトロでの増加させた造血幹細胞集団分化により得た様々な系統
の分化および方向付けられた前駆細胞数を増加させる方法での利用が考えられる
。次に、そのような増加し分化した、方向付けられた前駆細胞の集団を患者に再
注入し得る。

【０１２３】 そのような場合、例えば、好中球、血小板、リンパ球、赤血球系細胞または単
球など、特定タイプの細胞の移植が必要な患者から造血幹細胞を得る。

【０１２４】 再注入したエキソビボ ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理造血幹細胞に
より、化学療法または放射線療法後の患者の循環系での好中球および血小板の両
細胞数を迅速に増加させる手段が提供される。

【０１２５】 この局面において、濃縮したＨＳＣ集団を得て、次に、分化することなく造血
幹細胞複製を促進する効果を持つ一つ以上の増殖因子と共にｃ−ｍｙｃアンチセ
ンスオリゴマーを含む培養液中で培養を行う。この細胞を、造血幹細胞集団の増
加を引き起こすのに十分な時間培養し、次に、アンチセンスオリゴマーを培養液
から除去して、造血幹細胞分化を引き起こす効果のある条件下で続いて培養を行
う。評価されるであろうように、培養培地からアンチセンスオリゴマー除去後に
、造血幹細胞分化で生じた様々な細胞系統での増加が増加した造血幹細胞集団か
ら起こる。詳細には、この方法を使用して多くの好中球および血小板を得得る。

【０１２６】 （Ｃ．アンチセンスオリゴマーのインビボ投与） ある局面において、本発明は、造血幹細胞を、インビボで相補的または相補的
に近いｃ−ｍｙｃ配列に対して高い親和性を有するアンチセンスオリゴマーへの
曝露による造血幹細胞発生分化の調節方法に関している。

【０１２７】 ある場合では、被験体は、例えば、化学療法または放射線療法後で造血幹細胞
数を増加させる必要がある。

【０１２８】 ある典型的な本方法の適用において、被験体に対するｃ−ｍｙｃアンチセンス
オリゴマー投与により、例えば化学療法または放射線療法後での被験体の造血幹
細胞数増加が引き起こされる。

【０１２９】 この実施形態において、被験体体内で造血幹細胞数増加を引き起こすのに効果
的な手法でｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する。

【０１３０】 他の場合において、被験体は、例えば化学療法または放射線療法後で、好中球
および／または血小板などの造血幹細胞分化により生じる方向付けられた前駆細
胞数を増加させる必要がある者である。

【０１３１】 この実施形態において、被験体体内でのＨＳＣの分化および、好中球および血
小板数の対応する増加を引き起こすのに効果的な手法でｃ−ｍｙｃアンチセンス
オリゴマーを被験体に投与する。 被験体に対する、本明細書中で記述した方法を用いたｃ−ｍｙｃアンチセンスオ
リゴマーのインビボ投与により、造血幹細胞集団および／または方向付けられた
前駆細胞およびそれらの子孫系統細胞集団の増加がもたらされ得るということ、
そしてそれが、（１）ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与の持続時間、用量
および頻度、および（２）被験体の全身状態を含む多数の要因に依存してもたら
されうることが理解されるであろう。

【０１３２】 （１．患者の処置） 標的ｃ−ｍｙｃ核酸配列への効果的なアンチセンスオリゴマーの効果的な送達
は、本発明方法の重要な局面である。本発明に従って、ｃ−ｍｙｃへのオリゴマ
ーアンチセンスの効果的送達には、経口および、静脈内、皮下、腹腔内および筋
肉内などならびに吸入および経皮輸送の非経口経路を含む様々な全身的経路が含
まれうるがこれに限らない。

【０１３３】 ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを造血幹細胞へ輸送または薬物を被験体の
血流へと誘導するのに効果的な任意の方法もまた予想されることは理解される。

【０１３４】 例えば、局所投与に適合した薬学的に許容可能な担体の使用によって、アンチ
センスオリゴマーの経皮輸送を遂行しうる。ＰＣＴ特許出願ＷＯ／９７／４０８
５４においてモルホリノオリゴマー送達の一例が記述されている。

【０１３５】 ある好適な実施形態において、オリゴマーはホスホロジアミデートモルフォリ
ノオリゴマー（ＰＭＯ）であり、これは薬学的に許容可能な担体に含まれ、経口
的に送達される。この実施形態のさらなる局面において、例えば二週間以下の期
間に毎日など、短期間一定間隔でモルホリノｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌク
レオチドを投与する。しかしながら、より長期間に渡って断続的にアンチセンス
オリゴマーを投与する場合がある。

【０１３６】 典型的に、およそ１週間から２週間の間、通常一定間隔でアンチセンスオリゴ
マーの一つ以上の用量を投与する。経口投与の好適な用量は、およそ１ｍｇオリ
ゴマー／患者からおよそ２５ｍｇオリゴマー／患者（体重７０ｋｇの成人を基に
している）である。２５ｍｇオリゴマー／患者より多くの用量が必要でありうる
場合もある。ＩＶ投与の場合、好適な用量は、およそ０．５ｍｇオリゴマー／患
者からおよそ１０ｍｇオリゴマー／患者（体重７０ｋｇの成人を基にしている）
である。

【０１３７】 少なくとも２００−４００ｎＭのｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーのピーク
血中濃度を引き起こすのに十分な量のアンチセンス化合物を通常投与する。

【０１３８】 通常、本方法には、適切な薬学的担体、ｃ−ｍｙｃ核酸標的配列の発現抑制に
効果的なアンチセンス薬剤量での被験者への投与が含まれる。

【０１３９】 続いて、生理学的に許容可能な任意の便宜的なビヒクルにおいてアンチセンス
オリゴヌクレオチド組成を投与しうる。そのようなオリゴヌクレオチド組成には
、当業者により採用される任意の様々な標準的で生理学的に許容可能な担体が含
まれうる。そのような薬学的担体の例には、生理食塩水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）、水、エタノール水溶液、油／水乳濁液のような乳濁液、トリグリセリド乳濁
剤、加湿剤、錠剤およびカプセルが含まれるがこれに限らない。適切な生理学的
許容可能な担体の選択が、選択した投与形態に依存して様々であるということが
理解される。

【０１４０】 ある例において、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド取り込みを促進す
るためにリポソームを使用しうる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，１９９６；Ｌａ
ｐｐａｌａｉｎｅｎら、１９９４；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０；Ｇｒｅｇｏｒ
ｉａｄｉｓ，１９７９）を参照のこと）。例えば、ＷＯ／９３／０１２８６で記
述されているように、アンチセンスオリゴマー投与に対するビヒクルとしてヒド
ロゲルをも使用しうる。あるいは、ミクロスフェアまたは微粒子にてオリゴヌク
レオチドを投与しうる。（例えば、ＷｕおよびＷｕ、（１９８７）を参照するこ
と）。

【０１４１】 この適用の範囲内で、持続的放出組成もまた考慮される。これらには、フィル
ムまたはマイクロカプセルなどのような成形加工品の形を取る半浸透可能なポリ
マー性マトリックスが含まれうる。

【０１４２】 好適な本方法適用において、被験体はヒト被験体である。被験体はまた、癌患
者、特に、白血病、リンパ腫、神経芽細胞種、乳癌、結腸癌、肺癌、または、化
学療法または放射線療法により患者を処置されるかまたは処置されている任意型
の癌であると診断された患者でもありうる。本方法はまた、形成不全貧血（再生
不良性貧血）、重症複合型免疫不全、鎌状赤血球性貧血、サラセミアおよび骨髄
異形成症候群を含むがこれに限らない非癌性造血系障害の処置にも適用可能であ
る。

【０１４３】 本発明の方法で使用するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果的
なインビボ用量が、処置下の被験体の状態ならびに投与頻度および経路に従って
様々であるということが理解される。従って、そのようなインビボ治療は通常、
治療成果を最善にするために、処置する状態に適切な試験によってモニターする
ことおよび用量または治療レジメンにおける対応する調節が必要である。

【０１４４】 ある局面において、本発明は、造血幹細胞の集団を増殖させるのに効果的な条
件下で造血幹細胞を本明細書中で記述したアンチセンスオリゴマーに曝露し、さ
らに増加した造血幹細胞の集団を、より成熟した表現型をもつ細胞への造血幹細
胞分化促進に効果的な方法で処理することにより、増加した造血幹細胞の集団由
来の、単球、顆粒球、血小板、リンパ球および赤血球のような、より分化した細
胞の集団を増殖させる方法を提供する。

【０１４５】 治療レジメンには、被験体へのｃ−ｍｙｃアンチセンス処理ＨＳＣの投与およ
び／またはｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの直接投与が含まれうる。そのよ
うな投与を同時または連続的に行いうる。ある場合において、同じまたは類似し
た状態によって診断された個人を処置するために、一つ以上の化学療法、放射線
療法または当業者が使用する他の薬剤で患者をさらに処置しうる。そのようなさ
らなる処置は、被験体へのｃ−ｍｙｃアンチセンス処理ＨＳＣ投与および／また
はｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーの直接投与に関して同時、連続的または交
互でありうる。

【０１４６】 （２．処置のモニタリング） 例えば、アンチセンス処置に反応して起こる様々な系統の細胞数変化をモニタ
ーするために、処置下の被験体の循環系における細胞表現型に対する通常用いる
ＦＡＣＳアッセイによって、本明細書中で記述した方法に関連した所与の治療レ
ジメンの効力をモニターしうる。

【０１４７】 通常、分析されるべき細胞型に特異的なモノクローナル抗体を用いて表現型分
析を行う。そのような表現型分析において、モノクローナル抗体を、細胞分析を
目的として慣用的に当業者は使用している。特定の細胞型に特異的なモノクロー
ナル抗体を商業的に入手可能である。

【０１４８】 造血幹細胞は、上記で詳述したような表現型における特徴を持つ。そのような
表現型分析は通常、例えば、（１）造血幹細胞（ＬＴＣＩＣ，敷石（ｃｏｂｂｌ
ｅｓｔｏｎｅ）形成アッセイおよびＨＰＰ−ＣＦＣｓに対するアッセイ）、（２
）顆粒球または好中球（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦを含む培養液中でのクロ
ーンアガーまたはメチルセルロースアッセイ）、（３）巨核球（ＴＰＯ、ＩＬ−
３、ＩＬ−６およびＩＬ−１１を含む培養液中でのクローナルアガーまたはメチ
ルセルロースアッセイ）、および（４）赤血球系細胞（ＥＰＯおよびＳＣＦまた
は、ＥＰＯ，ＳＣＦおよびＩＬ−３）を含む培養液中でのクローンアガーまたは
メチルセルロースアッセイ）など、それぞれ特定の関心ある細胞型に対して生物
学的アッセイと組み合わせて行われる。

【０１４９】 そのような表現型および生物学的アッセイの正確な性質が、処置を行う状態お
よびその処置が造血幹細胞の集団またはあるいくつかの特定系統の細胞の集団を
促進するように向けられるかどうかに依存して様々であることが理解される。

【０１５０】 被験体が特定タイプの癌であることが診断されている場合、処置下の癌の型に
適切な診断技術を用いて癌の状態をもモニターする。

【０１５１】 示されているように、上記の表現型および生物学的アッセイの結果に基づいて
アンチセンスオリゴマー処置レジメンを調整しうる。

【０１５２】 （Ｖ．本発明の適用／有用性） 本明細書中で記述しているように、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドで処理した造血幹細胞は様々な適用において有用性が認められる。例えば、ｃ
−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＨＳＣ処理により、様々な目
的に使用しうるインビトロでの造血幹細胞増加がもたらされる。さらに、適切な
条件下で、そのようなインビトロで増加した造血幹細胞の集団は、方向付けられ
た前駆細胞および例えば好中球または血小板などのようなその子孫細胞の産生源
として働く。

【０１５３】 エキソビボでの増加した細胞ＨＳＣおよび方向付けられた前駆細胞の集団は、
患者に投与した場合、その細胞に腫瘍細胞が含まれておらず、移植片対宿主疾患
を回避し得、自己および同種造血系細胞移植における有用性が認められる。

【０１５４】 ある局面において、一旦抽出し濃縮した造血幹細胞を、一つ以上のサイトカイ
ンおよびｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー存在下で、エキソビボで培養しうる
。そのようなアンチセンスオリゴマー処理造血幹細胞培養は、（１）（ａ）造血
幹細胞交換治療、（ｂ）自己免疫疾患の処置、（ｃ）同種移植片に対する免疫反
応の減少、または（ｄ）被験体におけるＨＩＶ−感染の処置、を目的として被験
者に対する後のインビボ投与を行うためのエキソビボでの造血幹細胞の集団の拡
大または増殖、および（２）癌がｃ−ｍｙｃ発現と関連している場合の癌細胞増
殖の阻害または阻止、を含むがそれに限らない様々な適用において有用性が認め
られる。

【０１５５】 別の局面において、一旦抽出し濃縮した造血幹細胞を、一つ以上のサイトカイ
ンおよびｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー存在下で、特定の系統を方向付けら
れた前駆細胞およびその子孫細胞の集団を増加させるために十分な時間、エキソ
ビボで培養しうる。エキソビボでこの過程を行い、その後、（ａ）細胞交換治療
、および（ｂ）ワクチン接種効果を増大させるためにインビボで被験体に対して
投与を行いうる。

【０１５６】 乳癌および卵巣癌を含むがこれに限らない多くの固形癌を処置するために自己
造血幹細胞移植が行われてきている。造血幹細胞移植前に、存在する癌の量を減
少させるために患者は化学療法を受けてもよく、受けなくてもよく、通常その後
（１）骨髄または末梢血のどちらか由来の患者の造血幹細胞を回収、（２）サイ
トカイン存在下での造血幹細胞培養または液体窒素中での凍結保存、（３）静脈
内投与による高用量化学療法投与（殆どの場合）および（４）化学療法投与終了
後、患者の造血幹細胞再注入（ＩＶ）、および（５）造血幹細胞の分化および患
者の造血幹細胞再増殖促進のために増殖因子を用いた、患者に対するさらなる処
置、が行われる。通常、この期間中、患者は免疫無防備状態であり、保護隔離が
必要である。

【０１５７】 白血病、形成不全貧血、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキンリンパ腫）お
よび免疫不全症の患者を処置するために同種造血幹細胞移植が行われてきた。ド
ナーおよびレシピエントの細胞の両方の免疫反応を最小限にするために同種移植
においてはドナーおよびレシピエントがＨＬＡ細胞表面抗原の類似性に基づいて
適合していなければならないということを除き、同種造血幹細胞移植プロトコー
ルは自己移植に対して使用するものと同様である。

【０１５８】 移植前に、方向付けられた前駆細胞およびその子孫細胞とともに造血幹細胞の
集団を増加させることにより、移植された細胞が、レシピエントの造血系を再構
築させるのに十分に増殖するまでの遅延時間を短くしうる。

【０１５９】 骨髄除去前に組織中の造血幹細胞の集団を増加させるために、骨髄を除去する
前に本発明ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを潜在能力のある骨髄造血幹細胞
処理に使用しうる。

【０１６０】 関連アプローチにおいて、組織適合性抗原を欠失した形で細胞を維持するため
に細胞バンクに保存する前に、骨髄または精製造血幹細胞の集団に対する本発明
ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーでの曝露に本発明方法を使用しうる。

【０１６１】 ある例示的な本方法適用において、被験体は癌患者であり、その癌がｃ−ｍｙ
ｃ発現と関連するものである場合、癌細胞増殖を阻害または停止するためにｃ−
ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを用いた患者の造血幹細胞処理を使用する。一旦
細胞をｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーで処理しておいた後、細胞を（１）直
接患者に注入する、および／または（２）系統を方向付けられた前駆細胞および
その子孫細胞の集団を増加させるために造血幹細胞を分化させるのに効果的な条
件下で培養し、その後患者に注入する、のどちらかであり得る。

【０１６２】 異なる割合の造血幹細胞および系統を方向付けられた前駆細胞およびその子孫
細胞をもたらすために、被験体に再注入する前にインビトロにて培養する時間お
よびｃ−ｍｙｃアンチセンスに曝露する時間が様々であり得ることが理解される
。

【０１６３】 ある場合において、そのような癌治療を目的とした造血幹細胞のエキソビボで
のｃ−ｍｙｃアンチセンス処理に関連した治療レジメンには、放射線療法および
／または化学療法などのようなさらなる介在が含まれる。ｃ−ｍｙｃアンチセン
ス処理細胞の再注入前に、最中に、または後に本処置を行い得る。

【０１６４】 （１．移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）） 移植後のＧＶＨＤの可能性を最小限にすることで最近の方法論の代表である免
疫抑制の必要を避けるために、移植レシピエント自身の骨髄または造血幹細胞（
例えば、化学療法または放射線療法を開始する前に患者から抽出した骨髄）に対
するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを用いた処理を行いうる。

【０１６５】 ＧＶＨＤを最小限にするために、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを、組織
および器官ドナーならびに移植レシピエントの処置にも使用しうる。

【０１６６】 ＧＶＨＤは、同種移植でしばしば見られる合併症である。同種骨髄移植を受け
たおよそ半分の患者が、通常穏やかではあるが、生命の危機となりうる状態であ
る、ある程度のＧＶＨＤを発症する。ＧＶＨＤにおいて、ドナー細胞がレシピエ
ントの器官および組織を攻撃する。ＧＶＨＤを発症している患者は感染症に罹患
しやすくなり、皮膚、肝臓および消化管がＧＶＨＤによって攻撃されうる。

【０１６７】 ＧＶＨＤは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の違いを基にして患者の細胞を外来物
として認識するＴ細胞により引き起こされる。ドナーおよびレシピエントが一卵
性双生児である場合を除いて、同様なＨＬＡ型を持っている場合でさえ、多くの
マイナーなマーカーが異なっている。従って、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）は
可能性のある問題であり、殆どの移植においてＧＶＨ反応を最小限に抑制するた
めの処置は治療レジメンの一部である。

【０１６８】 造血幹細胞移植の場合、そのような処置には通常、Ｔ細胞欠損のみ（つまり、
密度勾配遠心に基づいてＴ細胞を除去するエルトリエーションによる）または、
それに造血幹細胞濃縮を組み合わせたもの、およびＧＶＨＤを防ぐための薬物療
法が含まれる。ＧＶＨＤに対する代表的な薬物療法は、シクロスポリン（免疫抑
制剤）の、単独またはメトトレキセートとの投与である。

【０１６９】 ある局面において、本発明は、同種ホストへの造血幹細胞移植がＧＶＨＤを引
き起こさないような、ｃ−ｍｙｃアンチセンス処理した造血幹細胞の集団を提供
する。

【０１７０】 関連局面において、本発明は、系統を方向付けられた前駆細胞およびその子孫
細胞の同種ホストへの移植によりＧＶＨＤが引き起こされないようにｃ−ｍｙｃ
アンチセンス処理した造血幹細胞の集団由来の系統を方向付けられた前駆細胞お
よびその子孫細胞の集団を提供する。その機構は、本発明の部分ではないが、そ
のようなｃ−ｍｙｃアンチセンス処理した造血幹細胞の集団が自己および非自己
抗原の免疫記憶を失っており、それによってＧＶＨＤの可能性が最小限に抑えら
れることが期待される。移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を最小限に抑えるかまた
は除去するために、同種移植に対してそのようなｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴ
マー処理細胞を使用しうる。

【０１７１】 培養時間および造血幹細胞のｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーへの曝露時間
に基づいて、造血幹細胞数増加のみ、または系統を方向付けられた前駆細胞およ
びその子孫細胞とともに造血幹細胞数の増加を引き起こすために本発明方法を使
用しうる。

【０１７２】 造血幹細胞、系統を方向付けられた前駆細胞およびその子孫細胞、組織、また
は器官を移植する場合、移植された造血幹細胞、系統を方向付けられた前駆細胞
およびその子孫細胞、組織、および器官に対する免疫反応をさらに最小限に抑制
するために、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーをレシピエントにも投与しうる
。

【０１７３】 例えば、自己造血幹細胞移植における使用の場合、インビトロ（エキソビボ）
で、系統を方向付けられていない、造血幹細胞多系統分化能を維持するレシピエ
ント自身の造血幹細胞の集団を増加させるために、本方法を使用しうる。

【０１７４】 （２．自己免疫疾患） 造血幹細胞分化時に、ホスト細胞および組織に存在する様々な抗原に対してそ
れらを曝露し、胸腺中でのＴ細胞発生分化の間、免疫寛容性を確立する。一般的
に、ホスト蛋白質との反応性を持つであろうＴ細胞は生き残らない。しかしなが
ら、ある場合において、免疫系が自己抗原を外来物として認識しうる。その結果
、一つ以上の内在抗原に対して免疫反応が引き起こされ、自己免疫状態または疾
患を導く。

【０１７５】 例示的な自己免疫状態には、免疫反応が、例えば副腎の細胞に向けられている
場合、アジソン病が引き起こされ、甲状腺に向けられた場合は、自己免疫甲状腺
炎（橋本病）、またはランゲルハンス島β細胞に向けられた場合はインスリン依
存性糖尿病といった器官特異的な形態および、例えば、ＤＮＡに免疫反応が向け
られた場合は、全身性エリテマトーデスが引き起こされるなど免疫反応が広く分
布する抗原に向けられるといった非特異的な形態が含まれる。さらなる例には、
唾液管に対する自己抗体産生により引き起こされるシェーグレン症候群、慢性関
節リウマチが含まれる。自己免疫は抗体、Ｔ細胞、またはその両方による攻撃の
結果でありうる。

【０１７６】 本発明は、自己免疫疾患の処置に対する方法および組成を提供する。そのよう
な方法において、患者から造血幹細胞を得うる。その後、患者から残存Ｔ細胞を
除去するために化学療法、放射線療法または他の方法で患者の処置を行う。次に
、患者の造血幹細胞または同種ドナー由来の造血幹細胞を、インビトロで生存可
能な造血幹細胞数を増加させるために効果的な条件下でエキソビボでｃ−ｍｙｃ
アンチセンスオリゴマーに曝露し、その後患者に注入する。増加した造血幹細胞
の集団はホストの抗原性レパートリー存在下で発生分化するため、新しく発生分
化したＴ細胞は、ホスト抗原を外来物として認識しないはずであり、自己免疫反
応は起こらないはずである。

【０１７７】 自己免疫状態を最小限に抑えるかまたは除去するために、ｃ−ｍｙｃ（アンチ
センスオリゴマー）処理した造血幹細胞または系統を方向付けられた前駆細胞お
よびそれ由来の子孫細胞移植を自己免疫疾患患者の処置に対する移植レジメンに
おいて使用しうるように、インビトロでｃ−ｍｙｃアンチセンス処理された造血
幹細胞は自己抗原の免疫記憶を欠く。

【０１７８】 培養時間および造血幹細胞をｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーに曝露する時
間に基づいて、造血幹細胞数増加のみ、または系統を方向付けられた前駆細胞お
よびその子孫細胞数の増加を伴う造血幹細胞数増加を引き起こすために本発明方
法を使用しうる。

【０１７９】 この実施形態の関連局面において、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドのインビボ投与により自己免疫疾患患者を処置しうる。そのようなインビボ投
与を、単独で、またはエキソビボのｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理ＨＳ
Ｃおよび／または系統を方向付けられた前駆細胞およびその子孫細胞投与と組み
合わせて行いうる。

【０１８０】 患者の治療効果を最大にすることが必要であるので、そのような自己免疫疾患
処置レジメンにはさらに追加的な処置化合物が含まれることが理解される。その
ような追加的処置組成には、自己免疫疾患処置に対して当該分野で公知の組成お
よび手段が含まれる。

【０１８１】 （３．組織および器官移植） 関連アプローチにおいて、移植器官および組織に対するレシピエントの反応を
調節するために、本発明のｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理ＨＳＣ組成物
を使用しうる。本発明のこの局面において、免疫反応および移植後の組織拒絶を
抑制するために、供与手順の前に、器官および／または組織移植レシピエントに
対してｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを投与する。

【０１８２】 当業者が通常行うように、移植手順に適切な条件下において、インビトロでＴ
細胞を消耗するのに効果的な方法で移植するために組織または器官を処置するこ
とによりこれを遂行しうる。ＧＶＨＤを最小限に抑制または除去するのに効果的
な方法で、そのような移植前、最中、または後の限られた時間の間、患者へのｃ
−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー投与と組み合わせてそのようなインビトロ処置
を行いうる。

【０１８３】 （４．ワクチンに対する免疫反応の増大） さらなる実施形態において、本発明は、ワクチンに対する反応増大に関する方
法および組成を提供する。そのような方法において、ワクチン投与前または同時
に、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを被験体に対して投与し、それによりワ
クチン中に存在する免疫原に対する免疫反応を増大させる。

【０１８４】 次の実施例は説明するものであるが、どのようにも本発明を限定するものでは
ない。

【０１８５】 （実施例１） （インビボでのＬＴＲ−ＨＳＣにおけるｃ−ｍｙｃアンチセンスの効果） マウス造血幹細胞を骨髄から得た。まず、未分画骨髄に対して、１．０８０ｇ
／ｍｌ Ｎｙｃｏｄｅｎｚ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｙｃｏｍ
ｅｄ Ｐｈａｒｍａ ＡＳ ＯＳＬＯ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて密度分離を行い
、次に、系統特異的モノクローナル抗体を使用したＤｙｎａｌ Ｂｅａｄ消耗に
よりｌｉｎ−細胞集団を単離し、（１）ｃ−ｋｉｔおよびＳｃａ１に対する抗体
、（２）ヨウ化プロピジウム、および（３）色素、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３３４２、
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した後、（
Ａ）Ｓｃａ１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３３４２低染色（
Ｈｏ^low）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３低染色（Ｒｈ^low）およびＰＩネガティブ
細胞（ＬＴＲ−ＨＳＣ）、または（Ｂ）Ｓｃａ１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−細
胞、（ＳＴＲ−ＨＳＣ）のどちらかを選択することによりＦＡＣＳを用いて細胞
を選別した。

【０１８６】 （Ａ．ＩＬ−６およびＳＣＦ＋／−アンチセンスオリゴマーを含む培養液中で
のＨＳＣの培養） Ｓｃａ１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、ｌｉｎ−という性質を持つ、ＳＴＲ−ＨＳＣの濃
度を高めた２５細胞を培養液中に直接的に分類して入れ、３日間、（１）アンチ
センスオリゴマーなしで、（２）配列番号２として示す配列を持つ２５μＭ ス
クランブルｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーとともに、または（３）配列番号
１で示す配列を持つ、１、５、２５、または１２５μＭのモルホリノホスホロア
ミデート ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーとともに、のいずれかで、ＩＬ−
６およびＳＣＦ存在下で培養を行った。３日後、細胞数を数え、寒天上に播種し
、標準的ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイによりｄａｙ０（０日目）およびｄａｙ３（３
日目）にＨＰＰを測定した。（表１および図３を参照すること。） その結果、３日後、ＩＬ−６＋ＳＣＦ＋１２５μＭ ｃ−ｍｙｃアンチセンス
存在下の培養では、総細胞産生（新しく生まれた細胞から死んだ細胞を差し引く
）は抑制され、その一方、ＨＰＰ−ＣＦＣが「保たれる」かまたは増加している
（ＩＬ−６＋ＳＣＦ＋１２５μＭ ｃ−ｍｙｃアンチセンス存在下で培養した細
胞の場合およそ３３ＨＰＰ、それに対して、ＩＬ−６＋ＳＣＦのみ存在下で培養
した細胞の場合はおよそ３ＨＰＰ）ということが示される。

【０１８７】 表１．ＩＬ−６およびＳＣＦ＋／−アンチセンスオリゴマーを含む培養液中で
のＨＳＣの培養

【０１８８】

【表１】 （Ｂ．１個のＨＳＣは、２５μＭ ｃ−ｍｙｃアンチセンスにより誘導される
増殖抑制から逃れる） １個の高度精製ＳＴＲ−またはＬＴＲ−ＨＳＣを、ＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣ
Ｆのみ、またはＩＬ−３＋ＩＬ−６＋ＳＣＦおよび配列番号１で示す配列を持つ
２５μＭ モルホリノホスホロアミデート ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー
、または配列番号２で示す配列を持つスクランブルｃ−ｍｙｃアンチセンスオリ
ゴマーを含む培養液が入った９６ウェルプレートに、直接分類して入れた。

【０１８９】 （表２．＋／−アンチセンスオリゴマーでのシングルＨＳＣ培養）

【０１９０】

【表２】 この結果、１個の細胞として培養した場合、ＳＴＲ−およびＬＴＲ−ＨＳＣの
両方がそのクローン数を増大し続けるということが示される。

【０１９１】 （Ｃ．アンチセンスｃ−ｍｙｃは、エキソビボでの２回目から４回目の細胞分
裂の間、ＬＴＲ−ＨＳＣ娘細胞の自己複製を仲介する） さらなる実験において、１個の精製ＬＴＲ−ＨＳＣ（ｌｉｎ−、ｃ−ｋｉｔ、
Ｈｏｅｓｃｈｔ 低レベル（Ｈｏ^low）およびＲｈｏｄａｍｉｎｅ 低レベル（
Ｒｈ^low）という性質を持つ）を直接、２５μＭアンチセンスオリゴマーが入っ
ている、または入っていない状態でＩＬ−３，ＩＬ−６および幹細胞因子（ＳＣ
Ｆ）を含む培養液が入った９６ウェル培養プレートに分類して入れ、６日間培養
を行った。第６日に、ウェル（クローン）ごとの細胞数を測定し寒天に移し、Ｈ
ＰＰ−ＣＦＣに関してアッセイした（つまり、個々の娘細胞の増殖能力を測定し
得た）。

【０１９２】 （表３．アンチセンスｃ−ｍｙｃの、エキソビボでの２回目から４回目の細胞
分裂間のＬＴＲ−ＨＳＣ娘細胞の自己複製に対する効果）

【０１９３】

【表３】 その結果、４−８細胞ステージの間、ＨＰＰ−ＣＦＣにおいて処理および未処
理培養の間での違いが全く検出されなかったことが示される。しかしながら、４
からおよそ３２細胞ステージの間、培養液中に２５μＭのｃ−ｍｙｃアンチセン
スオリゴマーが存在する場合、ｃ−ｍｙｃアンチセンススクランブルオリゴマー
または増殖因子単独で処理した培養と比較して、ＨＰＰ−ＣＦＣ／クローン数が
倍になった。このことから、ｃ−ｍｙｃ発現の減少によりＨＳＣｓの自己複製が
仲介されることが示唆される。

【０１９４】 （実施例２） （造血に対するｃ−ｍｙｃアンチセンス（ＡＳ）インビボ投与の効果） （Ａ．ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーで７日間処置したマウス） 配列番号１で示す配列を持つ、様々な量のモルホリノホスホロアミデート ｃ
−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーを、７日間、毎日マウスに腹腔内注射（ＩＰ）
した。第７、２１および２８日に、末梢血試料をマウスから採取し分析を行った
。図４Ａ−Ｄで、マウス末梢血中で検出した赤血球（Ａ）、顆粒球（Ｂ）、リン
パ球（Ｃ）および白血球（Ｄ）数を示す。

【０１９５】 その結果、２１−２８日間のマウスに対する１００μｇ ｃ−ｍｙｃアンチセ
ンス投与により、第７日の末梢血中での顆粒球（Ｂ）および白血球（Ｄ）数が明
らかに減少し、その後、第２１日、２８日で、増加効果がもたらされ、その効果
は１００から３００μｇのモルホリノホスホロアミデートｃ−ｍｙｃアンチセン
スオリゴマーで最大であったということが示される。末梢血中の赤血球（Ａ）ま
たはリンパ球（Ｂ）数における最小効果が次の処置で観察された。

【０１９６】 （Ｂ．ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーで２−９日間処置されたマウス） 配列番号１で示す配列を持つ１００μｇモルホリノホスホロアミデートｃ−ｍ
ｙｃアンチセンスオリゴマーを、２−１１日間毎日、マウスに腹腔内注射（ＩＰ
）した。マウスの骨髄区画を第１１日に測定し、その結果、骨髄のｃｋｉｔ＋（
ＣＤ１１７または造血幹細胞）成分が１００μｇのｃ−ｍｙｃアンチセンスオリ
ゴマーで処理した動物で増加したこと、および、２日間処理で１１日処理と同等
の効果が見られたということが示される（表４）。

【０１９７】 （表４．マウス骨髄に対するｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーでの２−９日
間処置による効果）

【０１９８】

【表４】 （表５．本発明を補助するために提供される配列）

【０１９９】

【表５】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１Ａ−Ｅは、ポリマーを形成するのに適切な５原子（Ａ）、６原子（Ｂ）、
および７原子（Ｃ〜Ｅ）結合基を有する、いくつかの好ましいモルホリノサブユ
ニットを示す。

【図２】 図２Ａ−Ａから２Ｅ−Ｅは、それぞれ図１のサブユニットＡ−Ｅを用いて構築
した、例示的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニット部分を示す。

【図３】 図３は、インビトロアッセイにおける高増殖可能なコロニー形成細胞（ＨＰＰ
−ＣＦＣ）のコロニー形成の、０日および３日の結果を示す。ここで、単一のｃ
−ｋｉｔ＋、Ｓｃａ１＋細胞を、アンチセンスオリゴマーなし、スクランブルさ
れた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）アンチセンスオリゴマー、または１、５、２５、ま
たは１２５ｍＭのｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーで処理して、そしてＩＬ−
６およびＳＣＦの存在下で３日間培養した。結果を、（Ａ）ＨＰＰ−ＣＦＣの全
数；（Ｂ）ＨＰＰ−ＣＦＣの頻度；および（Ｃ）細胞数／ＨＰＰ−ＣＦＣの頻度
として示す。

【図４】 図４Ａ〜Ｄは、様々な投与量（３０、１００、３００または１０００μｇ／日
）のｃ−ｍｙｃに対するＰＭＯアンチセンスで７日間毎日腹腔内に処理し、試料
を７、２１、および２８日目に採取したマウスの末梢血の分析結果を示す。図は
、各時点で存在した赤血球（Ａ）、顆粒球（Ｂ）、リンパ球（Ｃ）および白血球
（Ｄ）の数を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (72)発明者 イバーセン， パトリック エル． アメリカ合衆国 オレゴン 97330， コ ーバリス， エヌ．ダブリュー． フェア オークス プレイス 5902 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA11 CA20 DA02 GA11 HA17 4B065 AA91X AB01 AC20 BA01 BA25 BB34 BC01 BD50 CA44 CA46 4C057 AA17 DD01 MM09 4C087 BB34 BB46 CA04 MA01 NA14 ZB07 ZB21 ZB26

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 造血幹細胞（ＨＳＣ）組成物を作製するための方法であって
   、該方法は、以下； （ａ）被験体からＨＳＣを含む細胞集団を得る工程； （ｂ）ＨＳＣに対して該細胞集団を濃縮するのに効果的な様式で、該細胞集団
   を処置する工程；および （ｃ）該濃縮されたＨＳＣ集団を、エキソビボでｃ−ｍｙｃアンチセンスオリ
   ゴマーに、このような集団の造血幹細胞の数を少なくとも２倍に増加させるのに
   十分なオリゴマー濃度および時間の間暴露する工程であって、ここで、該ＨＳＣ
   は、系統マーカーの発現を欠き（ｌｉｎ−）、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞
   表面発現に対してポジティブであり、かつＳｃａ１の細胞表面発現に対してポジ
   ティブであるとして特徴付けられる、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記暴露を、前記ｃ−ｍｙ
   ｃアンチセンスオリゴマーでの処理の前に、前記細胞集団に存在しているＨＳＣ
   の数と比較して、このような集団の造血幹細胞の数を少なくとも４倍増加させる
   のに十分なアンチセンスオリゴマー濃度および期間の間行う、方法。
3. 【請求項３】 前記ＨＳＣを含む細胞集団がヒト骨髄から得られる、請求項
   １に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ＨＳＣを含む細胞集団が動員されたヒト末梢血から得ら
   れる、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、前記ＨＳＣを含む細胞集団
   がヒト癌患者から得られ、かつ前記暴露が、前記ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴ
   マーでの処理の前に前記濃縮されたＨＳＣ集団に存在する癌細胞の数と比較して
   、前記増殖されたＨＳＣ集団の生存可能な癌細胞の数を減少させるのに効果的で
   ある、方法。
6. 【請求項６】 前記ＨＳＣを含む細胞集団がリンパ腫または白血病を患う患
   者から得られる、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記アンチセンスオリゴマーが約１２〜２５塩基長を有する
   、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、前記アンチセンスオリゴマ
   ーが、以下； （ａ）実質的に荷電していない骨格； （ｂ）５０℃より大きなＴｍで、高い親和性で標的ＲＮＡの相補的配列とハイ
   ブリダイスする能力； （ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および （ｄ）細胞への能動輸送または促進輸送のための能力、 によって特徴付けられる、方法。
9. 【請求項９】 前記アンチセンスオリゴマー骨格が、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−Ｅ
   に示される構造からなる群から選択される構造を有する、請求項１に記載の方法
   。
10. 【請求項１０】 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号１として同定さ
    れた配列を有する、請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 造血幹細胞（ＨＳＣ）組成物であって、以下： （ａ）被験体からＨＳＣを含む細胞集団を得る工程； （ｂ）ＨＳＣに対して該細胞集団を濃縮するのに効果的な様式で、該細胞集団
    を処理する工程；および （ｃ）該濃縮されたＨＳＣ集団を、エキソビボで、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオ
    リゴマーに、該ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーでの処理の前に存在するＨＳ
    Ｃの数と比較して、このような集団の造血幹細胞の数を少なくとも２倍増加させ
    るのに十分なオリゴマー濃度および時間の間暴露する工程、 を包含し、ここで、該ＨＳＣは、系統マーカーの発現を欠き（ｌｉｎ−）、ｃ−
    ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現に対してポジティブであり、かつＳｃａ１
    の細胞表面発現に対してポジティブであるとして特徴付けられる、工程、 のプロセスによって調製される、造血幹細胞（ＨＳＣ）組成物。
12. 【請求項１２】 前記アンチセンスオリゴマーが約１２〜２５塩基長を有す
    る、請求項１１に記載の組成物。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の組成物であって、前記アンチセンスオ
    リゴマーが、以下； （ａ）実質的に荷電していない骨格； （ｂ）５０℃より大きなＴｍで、高い親和性で標的ＲＮＡの相補的配列とハイ
    ブリダイスする能力； （ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および （ｄ）細胞への能動輸送または促進輸送のための能力、 によって特徴付けられる、組成物。
14. 【請求項１４】 前記アンチセンスオリゴマー骨格が、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−
    Ｅに示される構造からなる群から選択される構造を有する、請求項１１に記載の
    組成物。
15. 【請求項１５】 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号１として同定さ
    れた配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
16. 【請求項１６】 被験体において癌を処置する際の医薬としての使用のため
    の、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. 【請求項１７】 がん患者に対してｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理
    された造血幹細胞（ＨＳＣ）組成物を送達するための方法であって、該方法は、
    以下： （ａ）該患者からＨＳＣを含む細胞集団を得る工程； （ｂ）ＨＳＣに対して細胞集団を濃縮するのに効果的な様式で、該細胞集団を
    処理する工程； （ｃ）該濃縮されたＨＳＣ集団を、エキソビボで、ｃ−ｍｙｃアンチセンスオ
    リゴマーに、該ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーでの処理の前に存在するＨＳ
    Ｃの数と比較して、このような集団の造血幹細胞の数を少なくとも２倍増加させ
    るのに十分なオリゴマー濃度および時間の間暴露する工程；および （ｄ）該患者に、該ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー処理された造血幹細胞
    組成物を導入する工程であって、ここで、該ＨＳＣは、系統マーカーの発現を欠
    き（ｌｉｎ−）、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）の細胞表面発現に対してポジティブ
    であり、かつＳｃａ１の細胞表面発現に対してポジティブであるとして特徴付け
    られる、工程、 を包含する、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、前記暴露を、前記ｃ−
    ｍｙｃアンチセンスオリゴマーでの処理の前に、前記細胞集団に存在しているＨ
    ＳＣの数と比較して、このような集団の造血幹細胞の数を少なくとも４倍増加さ
    せるのに十分なアンチセンスオリゴマー濃度および時間の間行う方法。
19. 【請求項１９】 前記暴露が、前記ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマーでの
    処理の前に存在する生存可能な癌細胞の数と比較して、このような集団で生存可
    能ながん細胞の数を減少させるのに効果的である、請求項１７に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記アンチセンスオリゴマーが約１２〜２５塩基長を有す
    る、請求項１７に記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の方法であって、前記アンチセンスオリ
    ゴマーが、以下； （ａ）実質的に荷電していない骨格； （ｂ）５０℃より大きなＴｍで、高い親和性で標的ＲＮＡの相補的配列とハイ
    ブリダイスする能力； （ｃ）ヌクレアーゼ耐性；および （ｄ）細胞への能動輸送または促進輸送のための能力、 によって特徴付けられる、方法。
22. 【請求項２２】 前記アンチセンスオリゴマー骨格が、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−
    Ｅに示される構造からなる群から選択される構造を有する、請求項１７に記載の
    方法。
23. 【請求項２３】 前記アンチセンスオリゴマーが、配列番号１として同定さ
    れた配列を有する、請求項１７に記載の方法。