JP2015000064A - 造血幹細胞の増殖方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 造血幹細胞の増殖方法を提供する。【解決手段】 造血幹細胞または前駆細胞を増殖させる方法を記述する。本発明はさらに、一次性または二次性骨髄不全症候群の治療方法を含む。【選択図】なし
Description
本開示の技術は、造血幹細胞の増殖方法に関する。
造血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の増殖およびそれらの前駆細胞（たとえば、赤血球前駆細胞）への分化を含む。ＨＳＣは、血液系および免疫系の全系列の成熟細胞を生じさせる。
数十年の間に、複数の系列特異的転写因子、たとえばＧＡＴＡ−１およびＥＫＬＦ等が、造血／赤血球生成において重要な役割を果たすことが証明されている。しかしそれでも、造血および赤血球生成の増大を可能にする細胞固有の因子は、完全に理解されていないままである。幾つかの細胞固有因子、たとえばＷＮＴ３ａ、β−カテニン、およびＨＯＸＢ４等の過剰発現は、マウスにおけるＨＳＣの有意な発現につながることが証明されている。しかし、ヒトＨＳＣの増殖に対するそれらの作用は限られている。
ヒトＨＳＣをエクスビボで増殖させる上での困難は、ヒトＨＳＣベースの治療適用、たとえば、造血系の再構成における大きな課題を代表する。ヒトＨＳＣを効果的に増殖させる方法を開発する必要がある。
本発明は、インビボにおいて、モルホリノオリゴヌクレオチドを使用したＶｅｎｔＸのダウンレギュレーションが、ヒト造血幹細胞または前駆細胞（ＣＤ３４＋である）の増殖をもたらすという予期せぬ結果に基づく。
本発明の一態様は、造血幹細胞または前駆細胞の増殖方法に関する。本方法は、２工程：（１）造血幹細胞または前駆細胞を対象（たとえば、ヒトおよび非ヒト哺乳動物）から単離する工程および、（２）単離された細胞を、ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現または活性を阻害する作用剤と接触させ、それによって細胞の増殖を高める工程、を含む。単離工程は、造血幹細胞または前駆細胞を含有する生体試料（たとえば、骨髄、末梢血、および臍帯血）を対象から得ることおよび該生体試料から細胞を採取することによって実行することができる。
別の態様では、ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現または活性を阻害する作用剤を対象に投与し、それによって対象における造血幹細胞または前駆細胞を増殖させることにより、造血幹細胞または前駆細胞を増殖させる方法を記述する。
作用剤は、干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、または抗体であり得る。ｉＲＮＡ剤は、ＶｅｎｔＸ蛋白質をコードする遺伝子の領域と相同な第１のヌクレオチド配列を有する第１鎖を有する。ｉＲＮＡ剤は、５’非翻訳領域を含む、遺伝子から転写されたｍＲＮＡをターゲットにする。
第１ヌクレオチド配列は、ＲＮＡバージョン、たとえば、
ＵＵＣＡＧＡＡＵＣＧＣＣＧＣＡＵＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＧ（配列番号５）、
ＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＧＵＣＵＵＣＵＧＧＣＣＵＵＧＣＣＡＡＵ（配列番号６）、
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ＣＣＵＧＡＣＵＧＣＧＵＧＣＡＵＧＡＡＡ（配列番号４７）、または
ＧＣＣＵＧＧＡＣＡＧＣＡＣＵＧＡＵＵＵ（配列番号４８）または
その対応するＤＮＡバージョン、すなわち、
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ＴＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＴ（配列番号１３）、
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ＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴ（配列番号５７）、
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ＧＧＡＣＴＣＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴ（配列番号５９）、
ＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＡＴＡＴ（配列番号６０）、
ＣＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＡＴＡＴＴ（配列番号６１）、
ＧＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号６２）、
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ＧＣＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴ（配列番号６４）、
ＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＡＣＡＡ（配列番号４５）、
ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＴＣＴＴ（配列番号６５）、
ＣＣＴＧＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＴＧＡＡＡ（配列番号６６）、または
ＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴ（配列番号６７）
であってよい。
ＵＵＣＡＧＡＡＵＣＧＣＣＧＣＡＵＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＧ（配列番号５）、
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ＣＡＡＡＵＣＵＧＣＣＵＧＣＧＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＵＧ（配列番号７）、
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ＣＣＧＣＡＵＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号１０）、
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ＧＣＵＵＵＣＵＡＣＵＣＡＡＣＧＵＣＵＵ（配列番号３７）、
ＵＣＵＣＵＧＣＣＡＡＧＵＧＧＣＡＣＡＡ（配列番号３８）、
ＧＧＡＣＵＣＡＧＵＵＧＵＵＣＵＧＵＵＵ（配列番号３９）、
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ＣＣＵＧＡＣＵＧＣＧＵＧＣＡＵＧＡＡＡ（配列番号４７）、または
ＧＣＣＵＧＧＡＣＡＧＣＡＣＵＧＡＵＵＵ（配列番号４８）または
その対応するＤＮＡバージョン、すなわち、
ＴＴＣＡＧＡＡＴＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＧ（配列番号１２）、
ＴＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＡＴ（配列番号１３）、
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ＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧＧＣＡＡＡ（配列番号１７）、
ＣＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＡＣＴＣＡＡＣＧＴＣＴ（配列番号１８）、
ＧＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡ（配列番号４９）、
ＧＧＴＴＧＡＧＴＡＡＧＧＡＧＣＣＡＡＡ（配列番号５０）、
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ＧＧＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＧＣＣＧＣＡＴ（配列番号５２）、
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ＴＣＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡ（配列番号５４）、
ＧＣＣＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＧ（配列番号５５）、
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ＧＧＡＣＴＣＡＧＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＴ（配列番号５９）、
ＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＴＡＴＡＴ（配列番号６０）、
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ＧＧＴＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＡＧＴＣＡＡ（配列番号６２）、
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ＧＣＡＧＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＴ（配列番号６４）、
ＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＡＣＡＡ（配列番号４５）、
ＧＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＧＴＴＣＴＴ（配列番号６５）、
ＣＣＴＧＡＣＴＧＣＧＴＧＣＡＴＧＡＡＡ（配列番号６６）、または
ＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＡＴＴＴ（配列番号６７）
であってよい。
ｉＲＮＡ剤は、上記配列の１つを有するモルホリノオリゴヌクレオチドであることができる。
ｉＲＮＡ剤は、第１配列と相補的な第２のヌクレオチド配列を有する第２鎖をさらに含むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、第１配列と相補的な第２のヌクレオチド配列を有する第２鎖をさらに含むことができる。
さらに別の態様で、本発明は一次性または二次性骨髄不全症候群の治療方法を特色とする。本方法は、３工程：（１）造血幹細胞または前駆細胞を、一次性または二次性骨髄不全症候群を有する対象から単離する工程、（２）単離された造血幹細胞または前駆細胞を、ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現または活性を阻害する作用剤と接触させ、それによって造血幹細胞または前駆細胞の増殖を高める工程、および（３）増殖を経た造血幹細胞または前駆細胞の有効量を対象に投与する工程、を含む。単離工程は、造血幹細胞または前駆細胞を含有する生体試料を対象から得ることおよび該生体試料から細胞を採取することによって実行することができる。一次性または二次性骨髄不全症候群は、貧血症、脊髄形成異常症候群、または、化学療法もしくは放射線療法の合併症であり得る。
本発明の１つまたは複数の例の詳細を、以下の解説で説明する。本発明の他の特徴および利点は、以下の、幾つかの実施態様の詳細な説明から、また添付のクレームからも、明白になるであろう。
ＶｅｎｔＸ、ヒトホメオボックス転写因子は、基本的なＷｎｔシグナリングの新規なアンタゴニストである。ＶｅｎｔＸは、それぞれ配列番号１および配列番号４（以下に表示）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を有する。
ＶｅｎｔＸのアミノ酸配列（配列番号１）：
ＶｅｎｔＸのヌクレオチド配列（配列番号４）：
ＶｅｎｔＸは、ＢＭＰ４シグナル経路の脊椎動物アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）・ホメオボックス蛋白質Ｘｏｍのヒト相同体である。ＶｅｎｔＸは、新規なＬＥＦ／ＴＣＦ関連のＷｎｔリプレッサーであり、また想定される腫瘍抑制因子である。さらに、ＶｅｎｔＸは、細胞増殖および分化に関与する重要な遺伝子、たとえば、ｐ５３／ｐ１６およびｃ−ｍｙｃの発現を調節する。
ＶｅｎｔＸは、全系列の造血細胞における制御の下で発現され、その発現は予想外にも、造血幹細胞または前駆細胞のクローン形成能および増殖と逆相関関係を示す。したがって、エクスビボにおいてヒト造血幹細胞または前駆細胞でＶｅｎｔＸを一時的に阻害する工程を含む造血幹細胞または前駆細胞の増殖を高める方法は、本発明の範囲内である。
ＶｅｎｔＸの阻害物質としては、ｉＲＮＡ剤、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）、リボザイムおよび抗体を含む。
ｉＲＮＡ剤、たとえば、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特定のｍＲＮＡの接触（触媒）分解を引き起こす。ｉＲＮＡ剤は、遺伝子発現を低下または阻害するために使用され得る。ｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した標的ＲＮＡの分解を引き起こすように、標的ＲＮＡと十分な配列相補性を有する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、
配列特異的または配列選択的なプロセスであり、これにより標的分子（たとえば、標的遺伝子、標的蛋白質または標的ＲＮＡ）がダウンレギュレートされる。ｉＲＮＡ剤はまた、ＲＮＡに転写できるＤＮＡであってもよい。
ｉＲＮＡ剤、たとえば、二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、または一本鎖マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、特定のｍＲＮＡの接触（触媒）分解を引き起こす。ｉＲＮＡ剤は、遺伝子発現を低下または阻害するために使用され得る。ｉＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した標的ＲＮＡの分解を引き起こすように、標的ＲＮＡと十分な配列相補性を有する。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、
配列特異的または配列選択的なプロセスであり、これにより標的分子（たとえば、標的遺伝子、標的蛋白質または標的ＲＮＡ）がダウンレギュレートされる。ｉＲＮＡ剤はまた、ＲＮＡに転写できるＤＮＡであってもよい。
ＲＮＡｉと関連したメカニズムを介して機能する他の分子も使用することができ、そうした分子としては、化学修飾されたｓｉＲＮＡ（たとえば、モルホリノオリゴヌクレオチドまたはモルホリノアンチセンスオリゴ）、および後にｓｉＲＮＡに開裂するヘアピンＲＮＡの発現駆動性ベクターを含む。
本明細書に記述されている有用な核酸分子または構築物は、１６〜３０ヌクレオチドを各鎖に含むｄｓＲＮＡ（たとえば、ｓｉＲＮＡ）分子を含み、その鎖の一方は、配列番号４の相補的ＤＮＡ配列を有するＶｅｎｔＸのｍＲＮＡにおける標的領域に実質的に同一である。実質的に同一とは、たとえば、少なくとも８０％（または、それより多く、たとえば、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％）同一であり、たとえば、３、２、１、または０個のミスマッチヌクレオチドを有する。他方の鎖は第１鎖と相補的である。ｄｓＲＮＡ分子は、化学的に合成されることができ、インビトロでＤＮＡ鋳型から転写されることができ、あるいはインビボで、たとえば、ｓｈＲＮＡから、転写されることができる。
アンチセンス核酸は、ＶｅｎｔＸを阻害するのに有用である。そのようなアンチセンス核酸分子は、そのヌクレオチド配列が、ＶｅｎｔＸをコードするｍＲＮＡの全部または一部と相補的である核酸分子である。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全部または一部とアンチセンスであってもよい。非コード領域（「５’非翻訳領域および３’非翻訳領域」）は、コード領域に隣接する５’配列および３’配列であり、アミノ酸に翻訳されない。
ＶｅｎｔＸを阻害するための上記作用剤としては、モルホリノオリゴヌクレオチドが含まれる。モルホリノオリゴヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖部分の代わりにモルホリン環が、またＤＮＡおよびＲＮＡの陰イオン性リン酸の代わりに非イオン性ホスホロジアミデート結合が付いた、塩基を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、当技術分野で知られている方法で合成するか、または、たとえば、ジーン・ツールズ社（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ．）から商業的に得ることができる。
用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドのポリマーを指す。用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」またはデオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、自然の力で（たとえば、それぞれ、ＤＮＡ複製またはＤＮＡの転写によって）合成することができる。ＲＮＡは、転写後修飾することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、化学的に合成したり化学的に修飾したりすることもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡおよびｓｓＤＮＡ、）であることもでき、多重鎖（たとえば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であることもできる。
ポリヌクレオチドは、以下の方法によって投与されることができる。すなわち、「裸の」核酸分子（米国特許第５，６７９，６４７号明細書）の直接注入、または、細胞による核酸分子の取り込みを促進するサポニン類（たとえば、米国特許第５，７３９，１１８号明細書参照）もしくは陽イオン性ポリアミン類（たとえば、米国特許第５，８３７，５３３号明細書参照）等の１以上の他剤とともに組成物中に配合された核酸分子の直接注入によって；微小粒子衝撃（たとえば、「遺伝子銃」；バイオリスティック（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）、デュポン社（Ｄｕｐｏｎｔ）の使用）によって；脂質、細胞−表面受容体または遺伝子導入剤で核酸分子をコーティングすることによって；リポソーム、微小粒子、また
はマイクロカプセル中へ核酸分子を封入することによって；核に入ることが知られているペプチドに連結された核酸分子の投与によって；または、受容体を特異的に発現する細胞型をターゲットにするために使用され得る受容体仲介エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結された核酸分子の投与によって、投与されることができる。あるいは、静電力または共有結合力によってポリ−Ｌ−リシンに結合したプラスミドまたは他のベクターから成る分子複合体を調製することができる。ポリ−Ｌ−リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する（クリスチアーノ（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ）ら、１９９５年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディスン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第７３巻、ｐ．４７９）。
はマイクロカプセル中へ核酸分子を封入することによって；核に入ることが知られているペプチドに連結された核酸分子の投与によって；または、受容体を特異的に発現する細胞型をターゲットにするために使用され得る受容体仲介エンドサイトーシスを受けるリガンドに連結された核酸分子の投与によって、投与されることができる。あるいは、静電力または共有結合力によってポリ−Ｌ−リシンに結合したプラスミドまたは他のベクターから成る分子複合体を調製することができる。ポリ−Ｌ−リシンは、標的細胞上の受容体に結合することができるリガンドに結合する（クリスチアーノ（Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ）ら、１９９５年、ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディスン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．）、第７３巻、ｐ．４７９）。
核酸−リガンド複合体を形成することができ、該リガンドは、エンドソームを破壊する融合性ウイルスペプチドを含んでおり、核酸のリソソーム分解の回避を可能にする；または、核酸分子は、特定の受容体をターゲットにすることにより、インビボでの細胞特異的取り込みおよび発現の標的とされ得る。加えて、細胞核におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入、発現および蓄積のための能率的な方法は、米国特許第６，２６５，１６７号明細書に記述されており、核内でアンチセンスオリゴヌクレオチドがセンスｍＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にし、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドが処理されたり細胞質内に輸送されたりするのを防止する。本発明はまた、当技術分野で知られた相同組換えによる発現のため、核酸分子の細胞内導入およびそれに続く宿主細胞ＤＮＡ内への組み込みも意図する。
ポリヌクレオチドはまた、好適な発現ベクターに組み込まれることもできる。遺伝子療法適用に好適な幾つかのベクターが当技術分野で知られている（たとえば、ウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）：基礎科学および遺伝子療法（Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、イートン・パブリッシング社（Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）（２０００年）参照）。
発現ベクターは、プラスミドベクターであってよい。プラスミドＤＮＡの生成方法および精製方法は、迅速かつ直接的である。加えて、プラスミドＤＮＡは一般に宿主細胞のゲノムに統合されないが、別個の実体としてエピソームの位置に維持され、染色体統合が起こす可能性がある遺伝毒性を排除する。種々のプラスミドが、今や商業的に容易に入手でき、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するものが含まれ、多くは哺乳類系で使用するために個別に設計されている。本発明で使用することが可能なプラスミドの例としては、真核発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン）、ｐＡｄ／ＣＭＶおよびｐＡｄ／ＴＲ５／ＧＦＰｑ（マッシー（Ｍａｓｓｉｅ）ら、１９９８年サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２８巻、ｐ．５３〜６４）などがあるが、その限りではない。代表的な実施態様において、プラスミドはｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶ２（インビトロジェン）、ｐＡｄＣＭＶ５（ＩＲＢ−ＮＲＣ）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＡｄＭＬＰ５（ＩＲＢ−ＮＲＣ）、またはＰＶＡＸ（インビトロジェン）である。
発現ベクターは、ウイルスベースのベクターであってよい。ウイルスベースのベクターの例としては、複製欠損性のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスに由来するものなどがあるが、その限りではない。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、現在、インビボでの、特にヒトへの、外因性オリゴヌクレオチドまたは遺伝子の移入のために選択される組換え遺伝子送達システムである。これらのベクターは、細胞内への遺伝子の能率的な送達を提供し、移入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。レトロウイルス使用の重要な必要条件は、特に細胞集団における野生型ウイルスの広がりの可能性に関して、それらの使用の安
全性を確実にすることである。レトロウイルスベクターが由来するレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどがあるが、その限りではない。具体的なレトロウイルスとしては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭなどがあり、当業者に周知である。
全性を確実にすることである。レトロウイルスベクターが由来するレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳房腫瘍ウイルスなどがあるが、その限りではない。具体的なレトロウイルスとしては、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭなどがあり、当業者に周知である。
ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、およびａｓＲＮＡ分子は、当技術分野で周知の方法でデザインすることができる。ＲＮＡを特異的に分解するために必要な配列特異性を提供するのに十分な相同性を有するこれらのＲＮＡ分子は、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）およびダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ）のウェブサイトで維持されているもの（ｓｉＤＥＳＩＧＮ ＣＥＮＴＥＲ参照）および、インターネット上、ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／１００／１０５／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌで利用できる、「ｓｉＲＮＡユーザーガイド（Ｔｈｅ ｓｉＲＮＡ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ）」を含む、当技術分野で知られているプログラムを使用してデザインすることができる。
モルホリノオリゴはまた、当技術分野で知られている方法、たとえば、ビボ−モルホリノ（ジーン・ツールズ社（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ））を用いて、静脈注射、腹腔内注射、または局所注射により、対象に送達することもできる。
ＶｅｎｔＸ核酸配列に特異性を有するリボザイムはまた、ＶｅｎｔＸ発現を阻害するために使用することもできる。リボザイムは、相補的な領域を有する、ｍＲＮＡ等の一本鎖核酸を開裂することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（たとえば、ハンマーヘッド型リボザイム（ハッセルホフ（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ）ら、１９８８年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３３４巻、ｐ．５８５〜５９１に記述されている）を使用してｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂し、それによって、ｍＲＮＡによりコードされる蛋白質の翻訳を阻害することができる。リボザイムのデザイン方法および生成する方法は、当技術分野で知られている（たとえば、スキャンロン（Ｓｃａｎｌｏｎ）、１９９９年、リボザイムの治療適用（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ、フマーナプレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）参照）。ＶｅｎｔＸ核酸分子またはそのフラグメントに特異性を有するリボザイムは、ＶｅｎｔＸ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいてデザインすることができる。
抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体）は、免疫原としてのＶｅｎｔＸポリペプチドで、適当な対象に免疫性を与えることによって調製することができる。さらに、標準組換えＤＮＡ技術を使用して作ることができる、組換え抗体、たとえば、ヒト部分と非ヒト部分の両者を含む、キメラ抗体やヒト化モノクローナル抗体等が、本明細書で提供される。そのようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術で、たとえば、国際公開第８７／０２６７１号、欧州特許出願第１８４，１８７号明細書；欧州特許出願第１７１，４９６号明細書；欧州特許出願第１７３，４９４号明細書；国際公開第８６／０１５３３号；米国特許第４，８１６，５６７号明細書；欧州特許出願第１２５，０２３号明細書；ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４０巻、ｐ．１０４１〜１０４３、１９８８年；リウ（Ｌｉｕ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８４巻、ｐ．３４３９〜３４４３、１９８７年；リウ（Ｌｉｕ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１３９巻、ｐ．３５２１〜３５２６、１９８７年；サン（Ｓｕｎ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８４巻、ｐ．２１４〜２１８、１９８７年；西村ら、キャンサ
ー・リサーチ（Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．）、第４７巻、ｐ．９９９〜１００５、１９８７年；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１４巻、ｐ．４４６〜４４９、１９８５年；およびショー（Ｓｈａｗ）ら、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．）、第８０巻、ｐ．１５５３〜１５５９、１９８８年）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２９巻、ｐ．１２０２〜１２０７、１９８５年；オイ（Ｏｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第４巻、ｐ．２１４、１９８６年；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２１巻、ｐ．５５２〜５２５、１９８６年；ヴェルホイヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２３９巻、ｐ．１５３４、１９８８年；およびベイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１４１巻、ｐ．４０５３〜４０６０、１９８８年；に記述されている方法を使用して、生成することができる。
ー・リサーチ（Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．）、第４７巻、ｐ．９９９〜１００５、１９８７年；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１４巻、ｐ．４４６〜４４９、１９８５年；およびショー（Ｓｈａｗ）ら、ジャーナル・オブ・ザ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．）、第８０巻、ｐ．１５５３〜１５５９、１９８８年）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２９巻、ｐ．１２０２〜１２０７、１９８５年；オイ（Ｏｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第４巻、ｐ．２１４、１９８６年；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３２１巻、ｐ．５５２〜５２５、１９８６年；ヴェルホイヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２３９巻、ｐ．１５３４、１９８８年；およびベイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１４１巻、ｐ．４０５３〜４０６０、１９８８年；に記述されている方法を使用して、生成することができる。
試験試料中のＶｅｎｔＸポリペプチドレベルまたは核酸レベルは、試験試料を試験対象から得るとともに、ＶｅｎｔＸポリペプチドまたは核酸を検出することができる化合物または作用剤（たとえば、ｍＲＮＡプローブまたはゲノムＤＮＡプローブ）と試験試料を接触させることによって評価することができる。「試験試料」は、対象から単離される組織、細胞および体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体を含む。ＶｅｎｔＸ遺伝子の発現レベルは、ＶｅｎｔＸ遺伝子によりコードされるｍＲＮＡを測定すること；ＶｅｎｔＸ遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を測定すること；またはＶｅｎｔＸ遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を測定することを含む、幾つかの方法で測定することができる。
細胞中のＶｅｎｔＸ遺伝子に対応するｍＲＮＡレベルは、インサイチュ方式でもインビトロ方式でも決定することができる。試験試料から単離されるｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン解析、ＰＣＲ解析、およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイで使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出に好ましい一診断方法は、ＶｅｎｔＸ遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸プローブと、単離されたｍＲＮＡとを接触させることを含む。プローブは全長ＶｅｎｔＸ核酸、たとえば配列番号４の核酸等であってよく、またはその一部、たとえば長さが少なくとも１０ヌクレオチドで、ストリンジェントな条件でＶｅｎｔＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド等であってもよい。
一方式では、ｍＲＮＡ（またはそれから調製されるｃＤＮＡ）を表面上に固定するとともにプローブと接触させる。これはたとえば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルで流すとともに、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロース等の膜に移動させることによる。別の方式では、プローブを表面上に固定するとともに、ｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）を、たとえば、遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触させる。当業者は、既知のｍＲＮＡ検出方法を、ＶｅｎｔＸ遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのレベルの検出に使用するために、改変することができる。
ＶｅｎｔＸ遺伝子によりコードされる試料中のｍＲＮＡ（またはそれから調製されるｃＤＮＡ）のレベルは、たとえば、標準ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）、ＲＴ−ＰＣＲ（バスチン（Ｂｕｓｔｉｎ）Ｓ．ジャーナル・オブ・モレキュラー・エンドクリノロジー（Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．）、第２５巻、ｐ．１６９〜９３、２０００年）、定量的ＰＣＲ（オング（Ｏｎｇ）Ｙ．ら、ヘマトロジー（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、第７巻、ｐ．５９〜６７、２００２年）、リアルタイムＰＣＲ（ギンジンガー（Ｇｉｎｚｉｎｇｅｒ）Ｄ．エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．）、第３０巻、ｐ．５０３〜１２、２００２年）、およびインサイチュＰＣＲ（サ
ッカー（Ｔｈａｋｅｒ）Ｖ．、メソッズ・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）、第１１５巻、ｐ．３７９〜４０２、１９９９年）、または幾つかの他の核酸増幅方法による、核酸増幅を用い、続いて、増幅された分子を当技術分野で知られている技術を使用して検出することにより、評価することができる。本明細書で使用されるとき、増幅プライマーは、遺伝子の５’領域または３’領域にアニーリングすることができる一対の核酸分子であり（それぞれ、プラス鎖およびマイナス鎖、または逆も同様）、間に短い領域を含むと定義される。適当な条件下、適当な試薬を用いれば、そのようなプライマーは、プライマーで挟まれたヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
ッカー（Ｔｈａｋｅｒ）Ｖ．、メソッズ・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．）、第１１５巻、ｐ．３７９〜４０２、１９９９年）、または幾つかの他の核酸増幅方法による、核酸増幅を用い、続いて、増幅された分子を当技術分野で知られている技術を使用して検出することにより、評価することができる。本明細書で使用されるとき、増幅プライマーは、遺伝子の５’領域または３’領域にアニーリングすることができる一対の核酸分子であり（それぞれ、プラス鎖およびマイナス鎖、または逆も同様）、間に短い領域を含むと定義される。適当な条件下、適当な試薬を用いれば、そのようなプライマーは、プライマーで挟まれたヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
インサイチュ方法では、細胞試料または組織試料を調製して、スライドグラス等の支持体上に固定し、次いでＶｅｎｔＸポリペプチドをコードする染色体上のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブと接触させることができる。
種々の方法を使用して、ＶｅｎｔＸポリペプチドのレベルを決定することができる。概して、これらの方法は、試料中のポリペプチドのレベルを評価するために、ポリペプチドに選択的に結合する作用剤、たとえば抗体等を接触させることを含む。抗体はポリクローナルであってもよく、より好ましくは、モノクローナルであってもよい。完全な抗体、またはそのフラグメント（たとえば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）も使用することができる。好ましい実施態様で、抗体は検出可能な標識を持つ。用語「標識された」は、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をプローブまたは抗体に物理的に連結することによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を含むことを意図する。たとえば、ウサギＦｃ領域を含む抗体は、ウサギＦｃ領域に対する第二抗体を使用して間接的に標識することができ、ここで第二抗体は、検出可能な物質に結合される。検出可能な物質の例を本明細書に提供する。適当な検出可能な物質または標識としては、放射性同位体（たとえば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、または３２Ｐ）、酵素（たとえば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼ）、蛍光部分または蛍光蛋白質（たとえば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、またはＢＦＰ）、または発光部分（たとえば、クオンタム・ドット社（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、パロ・アルト、カリフォルニアにより供給されるＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）などがある。
本検出方法を使用して、インビトロならびにインビボで、生体試料中のＶｅｎｔＸポリペプチドを検出することができる。ＶｅｎｔＸポリペプチド検出のためのインビトロ技術としては、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫蛍光、ＥＩＡ、ＲＩＡ、およびウェスタンブロッティング解析などがある。ＶｅｎｔＸポリペプチド検出のためのインビボ技術は、標識された抗ＶｅｎｔＸ抗体を対象に導入することを含む。たとえば、抗体を、上述の検出可能な物質で標識することができる。対象における検出可能な物質の存在および位置は、標準的な画像法で検出することができる。
「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。上記ＨＳＣを得ることができる非ヒトの例としては、霊長類、イヌ、齧歯類、モルモット、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびブタなどがあるが、その限りではない。実際には、愛玩動物、家畜、実験動物、および疾患モデル動物が全て意図される。好ましい実施態様で、対象はヒトである。別の実施態様で、対象は実験動物または疾患モデル動物である。
本発明はさらに、造血幹細胞または前駆細胞における異常な高レベルのＶｅｎｔＸポリペプチドと関連した状態を、上述の方法で調製された増殖された造血幹細胞または前駆細胞の有効量で、またはＶｅｎｔＸポリペプチドの発現または活性を阻害する作用剤の有効
量で、治療する方法を特色とする。こうした状態としては、一次性または二次性ＢＭＳＦ、貧血症（たとえば、難治性貧血）、脊髄形成異常症候群（たとえば、低細胞性骨髄異形成症候群）、造血系の悪性腫瘍（たとえば、白血病およびリンパ腫）、および生物学的に（たとえば、ウイルスによる）、物理学的に（たとえば放射線による）、化学的に（たとえば、毒素および抗癌化学療法剤による）、または環境的に（たとえば、汚染による）引き起こされた骨髄損傷などがある。
量で、治療する方法を特色とする。こうした状態としては、一次性または二次性ＢＭＳＦ、貧血症（たとえば、難治性貧血）、脊髄形成異常症候群（たとえば、低細胞性骨髄異形成症候群）、造血系の悪性腫瘍（たとえば、白血病およびリンパ腫）、および生物学的に（たとえば、ウイルスによる）、物理学的に（たとえば放射線による）、化学的に（たとえば、毒素および抗癌化学療法剤による）、または環境的に（たとえば、汚染による）引き起こされた骨髄損傷などがある。
「治療すること」または「治療」は、障害、障害の症状、障害に続発する疾病状態、または障害傾向を、治癒、軽減、緩和、治療、発症遅延、改善する目的で、（ＶｅｎｔＸの発現または活性を阻害する）作用剤を含有する組成物、またはそうした作用剤で前処理した造血幹細胞または前駆細胞を含有する組成物の、状態（たとえば、貧血症および脊髄形成異常症候群）を有する対象への投与を指す。
「有効量」は、治療した対象において、たとえば、上述の、医学的に望ましい結果をもたらすことができる組成物の量を指す。治療方法は、インビボまたはエクスビボで、単独で、または他剤もしくは他の治療方法と併せて、実行され得る。薬の実際の有効量は、利用する具体的な薬またはその組合せ、配合される特定の組成物、投与方法、および患者の年齢、体重、状態、および治療する症状または状態の重症度によって異なり得る。特定の患者の適用量は、従来の考慮すべき要件を使用して、（たとえば、適当な、従来の薬理学的プロトコールを用いて）、当業者により決定されることができる。
上記組成物の１つまたは複数を動物（たとえば、ヒト）に投与して、ＶｅｎｔＸまたはその相同体の発現または活性を調整することができる。医師は、たとえば、最初は比較的低用量を処方し、その後適当な応答が得られるまで用量を増やすことが可能である。加えて、特定の対象のための具体的な用量は、使用される具体的な作用剤の活性、対象の年齢、体重、全体的健康、性別、および食事、投与時期、投与経路、排泄速度、複合薬、および調整される発現または活性の程度を含む、種々の要因に依存することが理解される。
治療効果は、標的遺伝子ｍＲＮＡの量を測定する（たとえばリアルタイムＰＣＲを使用する）か、または標的遺伝子ｍＲＮＡによりコードされるポリペプチドの量を測定する（ウェスタンブロット解析）かのいずれによっても監視することができる。当技術分野で周知の通り、患者への適用量は、上述のような様々な要因に依存する。適用量は異なるであろうが、ポリヌクレオチド投与の好ましい適用量は、約１０６〜１０１２コピーのポリヌクレオチド分子である。この用量を必要に応じて繰り返し投与することができる。
ポリヌクレオチドは、薬学的にインビボ投与に適した組成物を提供するために、水性の担体、媒体、または溶液で調製することができる。水溶液を調製する方法は、当業者に周知である。好ましくは、水溶液は、水、塩類を含有する生理学的に容認できる水溶液および／またはバッファー、たとえばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）等、または動物またはヒトへの投与に容認できる他の水溶液／界面活性剤である。そのような溶液は、当業者に周知であり、蒸留水、脱イオン水、純水または超純水、生理食塩水、ＰＢＳ、および核酸と相性が良い通常のバッファーを含有する溶液等が挙げられるが、その限りではない。組成物はまた、溶液を等張にするために塩化ナトリウムおよびグルコースまたはマンニトールも含有してもよい。本組成物は、適当な助剤成分、たとえばｐＨ調整剤、モル浸透圧濃度調整剤、および張度調整剤等を含有してもよい。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている高分子の、生分解性微小粒子、またはマイクロカプセル送達デバイスを使用して、送達することができる。ポリヌクレオチドの取り込みを達成する別の方法は、標準方法で調製されるリポソームを使用することである
。ポリヌクレオチドは、単独でこれらの送達媒体に組み込まれたり、組織特異的固体と一緒に共に組み込まれたりすることができる。さらに、当技術分野で知られている組織特異的転写制御エレメント使用によって、組織特異的ターゲティングを達成することができる。
。ポリヌクレオチドは、単独でこれらの送達媒体に組み込まれたり、組織特異的固体と一緒に共に組み込まれたりすることができる。さらに、当技術分野で知られている組織特異的転写制御エレメント使用によって、組織特異的ターゲティングを達成することができる。
ポリヌクレオチドは、非経口的に投与できる。用語「非経口的」は、本明細書で使用されるとき、注射、たとえば静脈内注射、動脈内注射、髄内注射、骨内注射、および髄腔内注射、ならびに任意の適当な注入技術を指す。
増殖した造血幹細胞または前駆細胞は、たとえば、細胞を分離し（たとえば、機械的分離による）、細胞を薬学的に許容できる担体（たとえば、リン酸緩衝生理食塩溶液）と完全に混合することによって、患者への投与のために配合することが可能である。それらは、注射または注入によって各個体に投与することができる。
異種および自家両方の造血幹細胞または前駆細胞を使用することができる。前者の場合、宿主反応を回避するか最小限に抑えるために、ＨＬＡ−適合を実施すべきである。後者の場合、対象から自家細胞を濃縮して精製し、後で使用するために保存する。細胞は、宿主細胞またはグラフトＴ細胞の存在下、エクスビボで培養して、宿主に再導入することが可能である。これには、本細胞を自己として認識し、Ｔ細胞活性の低下をよりよく提供する宿主の利点があるかもしれない。
本発明は、作用剤（ＶｅｎｔＸの発現または活性を阻害する）を含有する医薬組成物あるいは本作用剤で前処理した造血幹細胞または前駆細胞を含有する組成物を提供する。医薬組成物は、治療有効量の活性作用剤または造血幹／前駆細胞および任意選択的に他の活性作用剤を、薬学的に許容できる担体と混合することにより調製できる。担体は、投与経路に応じて、種々の形をとることができる。
上記医薬組成物は、従来の医薬品賦形剤および調製方法を使用することによって調製することができる。すべての賦形剤を崩壊剤、溶媒、造粒剤、保湿剤、およびバインダーと混合することができる。
成句「薬学的に許容できる」は、ヒトに投与されるとき、生理学的に耐容でき、望まれない反応を一般に招来しない、分子実体およびそのような組成物の他成分を指す。好ましくは、用語「薬学的に許容できる」は、哺乳動物、より詳細にはヒト使用のために、連邦政府または州政府の監督官庁により承認された、あるいは米国薬局方または一般に認められた薬局方に収載されたこと、を意味する。薬学的に許容できる塩類、エステル類、アミド類、およびプロドラッグ類は、妥当な医学的判断の範囲内であり、不当な毒性、刺激、アレルギー反応等無く患者の組織と接触した使用に適しており、合理的な利益／リスク比に相応し、かつそれらの所期の使用に有効な、塩類（たとえば、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩類）、エステル類、アミド類、およびプロドラッグ類を指す。
上述の医薬組成物に適用される担体は、化合物と共に投与される希釈剤、賦形剤、または媒体を指す。そのような医薬担体は、無菌液体、たとえば水および油等であってよい。水または水溶液、生理食塩水、およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液は、好ましくは、特に注射液用の、担体として使用される。適当な医薬担体はＥ．Ｗ．マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）による、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版に記述されている。
用量および投与頻度は、当業者に知られている急性期の臨床徴候の少なくとも１つまたは複数、好ましくは複数が、減少するかまたは存在しない、寛解期の持続を確証する臨床
徴候に依存するであろう。より一般的には、用量および頻度は、上記組成物による治療のために意図される、病態または障害の病理学的徴候および臨床症状ならびに不顕性症状の後退にある程度依存するであろう。適用量および投与計画は、当業者に認識されている通り、投与される年齢、性別、体調、ならびに複合体の利益および治療される患者または哺乳動物対象における副作用、および医師の判断によって、調節することができる。
徴候に依存するであろう。より一般的には、用量および頻度は、上記組成物による治療のために意図される、病態または障害の病理学的徴候および臨床症状ならびに不顕性症状の後退にある程度依存するであろう。適用量および投与計画は、当業者に認識されている通り、投与される年齢、性別、体調、ならびに複合体の利益および治療される患者または哺乳動物対象における副作用、および医師の判断によって、調節することができる。
最後に、本発明は、遺伝子療法によって免疫疾患または代謝疾患を治療するための遺伝子を送達する方法を特色とする。本明細書に記載の造血幹細胞または前駆細胞を使用して、外因性の、組換えポリペプチドを発現させることができる。したがって、組換え核酸を含有するそのような造血幹細胞または前駆細胞は、本発明の範囲内である。組換え核酸は、ポリペプチドをコードすることができ、また造血幹細胞または前駆細胞は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むことができる。
したがって、本発明は、異種核酸を対象に導入する方法を特色とする。本方法は、造血幹細胞または前駆細胞を増殖および遺伝子導入をする工程（ここで造血幹細胞または前駆細胞の少なくとも１つは異種核酸を含む）、およびその細胞を、必要としている対象に投与する工程を含む。異種核酸は、目的のポリペプチドをコードする。
用語「異種」は相対語であり、核酸の部分に関して使用されるとき、その核酸が、自然には互いに同じ関係で存在しない２つ以上の部分配列を含むことを示す。たとえば、組換えで生成される核酸は一般に、新しい機能的核酸を作るために合成的に配置された無関係の遺伝子に由来する２つ以上の配列、たとえば、１つのソースに由来するプロモータと別のソースに由来するコード領域とを有する。したがって２つの核酸は、ここでの意味合いにおいて互いに異種である。細胞に添加するとき、組換え核酸は、細胞の内在遺伝子とも異種になるであろう。したがって、染色体において、異種な核酸は、染色体に組み込まれている非ネイティブの（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブの（天然に存在しない）染色体外核酸を含むであろう。これに対し、染色体の自然に転座した部分は、突然変異細胞特有の内在核酸配列を含むため、この特許出願の意味合いにおいて異種とはみなされない。同様に、異種蛋白質は、その蛋白質が、自然には互いに同じ関係で存在しない２つ以上の部分配列を含むことを示す（たとえば、１つの核酸配列によって２つの部分配列がコードされる、「融合蛋白質」）。そのような蛋白質は、組換え技術で生成することができる。
用語「組換え」は、たとえば細胞、核酸、蛋白質、またはベクターと関連して使用されるとき、細胞、核酸、蛋白質、またはベクターが、異種核酸または蛋白質の導入あるいはネイティブの核酸または蛋白質の変化によって修飾されていること、あるいは細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（天然に存在する）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、あるいは、別の状況では正常にまたは異常に発現されるか、低発現であるか、または全く発現されないネイティブ遺伝子の第２のコピーを発現する。
上記造血幹細胞または前駆細胞および方法は、当技術分野で知られる様々な遺伝子治療方法で使用することができる。遺伝子療法は、エクスビボ技術もインビボ技術も含む。具体的には、上述の造血幹細胞または前駆細胞は、オリゴヌクレオチド調節因子またはその調節因子をコードする核酸分子を用いてエクスビボで遺伝子操作され、操作された細胞はその後、治療を受ける患者に提供される。細胞培養は、たとえば、細胞を分離し（たとえば、機械的分離による）、細胞を薬学的に許容できる担体（たとえば、リン酸緩衝食塩溶液）と完全に混合することにより、患者に投与するために配合することができる。異種間拒絶またはアロタイプ拒絶を回避するために、操作される細胞は一般に自家である。そのようなエクスビボ方法は当技術分野で周知である。
細胞は、上述の技術を使用したポリヌクレオチドの投与によって操作されることができる。
さらなる詳述なく、当業者は、上述に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の具体的な実施態様は、単に実例にすぎず、どのような形であれ、残りの開示内容を制限するものではないと解釈されるべきである。
さらなる詳述なく、当業者は、上述に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の具体的な実施態様は、単に実例にすぎず、どのような形であれ、残りの開示内容を制限するものではないと解釈されるべきである。
本明細書に引用されている全ての刊行物を参照により援用する。
（実施例）
実施例１：ＶｅｎｔＸ発現は、造血中および赤血球生成中に制御される
骨髄（ＢＷ：Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）試料を、施設のＩＲＢ承認を得て、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から、人工股関節置換術後に廃棄された大腿骨骨頭組織から入手した。単核細胞のフィコール分離後、磁気活性化細胞選別ＣＤ３４＋前駆細胞キット（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使用してＣＤ３４＋細胞を濃縮した。ＢＷ ＣＤ３４＋細胞の純度は、リゾ（Ｒｉｚｏ）ら、２００８年に記述されているフローサイトメトリーで評価したとき、９５％以上であった。
（実施例）
実施例１：ＶｅｎｔＸ発現は、造血中および赤血球生成中に制御される
骨髄（ＢＷ：Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ）試料を、施設のＩＲＢ承認を得て、ブリガム・アンド・ウィメンズ病院（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）から、人工股関節置換術後に廃棄された大腿骨骨頭組織から入手した。単核細胞のフィコール分離後、磁気活性化細胞選別ＣＤ３４＋前駆細胞キット（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使用してＣＤ３４＋細胞を濃縮した。ＢＷ ＣＤ３４＋細胞の純度は、リゾ（Ｒｉｚｏ）ら、２００８年に記述されているフローサイトメトリーで評価したとき、９５％以上であった。
全ＲＮＡを、トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）法で単離し、製造業者のプロトコールに従って、スーパースクリプト第１鎖合成システム（ＳｕｐｅｒＳｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成に同量のＲＮＡを使用した。その後、ＶｅｎｔＸ ｍＲＮＡレベルを測定するために、ｃＤＮＡを、下記のプライマーとともにＶｅｎｔＸのリアルタイムＰＣＲのために使用した：
５’−ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１９）および
５’−ＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２０）。リアルタイムＰＣＲはまた、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム（４８０ リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））でＳＹＢＲ グリーン（Ｇｒｅｅｎ）を用いて実施された。
５’−ＣＣＧＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１９）および
５’−ＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＴＧＣ−３’（配列番号２０）。リアルタイムＰＣＲはまた、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム（４８０ リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）；ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））でＳＹＢＲ グリーン（Ｇｒｅｅｎ）を用いて実施された。
結果は、ＶｅｎｔＸ発現が、赤血球の成熟中に上昇したことを示している。より具体的には、ＶｅｎｔＸ発現は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞では無視でき、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞では有意にアップレギュレートされ、骨髄系列の前駆細胞、たとえば、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ：ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭｓ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）、および骨髄球系共通前駆細胞（ＣＭＰ：ｃｏｍｍｏｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）ではさらに上昇した。赤血球生成中のＶｅｎｔＸの発現上昇パターンは、リンパ球生成中などの他の造血プロセス中のものと同じであった。上記３つの異なるサブグループの骨髄細胞系列、すなわち、ＭＥＰ、ＧＭ、およびＣＭＰの間では、ＶｅｎｔＸ発現の有意差は無かった。
実施例２：ＶｅｎｔＸはエクスビボでヒトＣＤ３４＋細胞の増殖を制御する
ヒトＢＷＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載の通りに入手した。これらの細胞におけるＶｅｎｔＸ発現を、レンチウイルスベースのｓｈＲＮＡ手法でノックダウンさせた。
ヒトＢＷＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載の通りに入手した。これらの細胞におけるＶｅｎｔＸ発現を、レンチウイルスベースのｓｈＲＮＡ手法でノックダウンさせた。
簡単に記載すると、ＶｅｎｔＸをターゲットにするｓｈＲＮＡ（ｐＨＡＧＥ−ｓｈＶｅｎｔＸ）を発現するレンチウイルスベクターｐＨＡＧＥ−ＣＭＶ−ｅＧＦＰＷを、骨髄ＣＤ３４＋細胞の形質導入のために使用した。このレンチウイルスベクターは、形質導入率を監視するためまたは細胞選別のための、ＧＦＰの同時発現を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を
含む。ＶｅｎｔＸ ｓｈＲＮＡの対応するＤＮＡ配列は、配列番号１２または１４である。
含む。ＶｅｎｔＸ ｓｈＲＮＡの対応するＤＮＡ配列は、配列番号１２または１４である。
ＧＦＰをターゲットにする無効配列（ｐＨＡＧＥ−ｓｈＧＦＰ）を、コントロールとして使用した。レンチウイルスパッケージングを、ダナファーバ（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ）／ハーバードがんセンターベクターコア施設（Ｈａｒｖａｒｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施し、ウイルス上澄を使用までアリコートで−７０℃で保存した。ＣＤ３４＋細胞を、先ず、１０％ＦＢＳ、幹細胞因子（ＳＣＦ：ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ、１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３リガンド（１００ｎｇ／ｍＬ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３、１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍＬ）（ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））を含有するＩＭＤＭ培地で２日間培養し、次いで４μｇ／ｍｌポリブレンの存在下、感染多重度（ＭＯＩ：Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）５で形質導入した。ＧＦＰ陽性細胞を、形質導入後２４時間に、ＦＡＣＳＡｒｉａ高速ソーター（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））で選別した（ダナ・ファーバセンター研究所フローサイトメトリコア施設（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ））。
選別されたＧＦＰ陽性ＣＤ３４＋細胞（皿当たり１×１０４個）を、組換えヒトサイトカイン類（ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびエリスロポイエチン）の混合物を含有する完全メチルセルロース培地（メソカルト（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ）ＧＦ、Ｈ４４３４；ステムセル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））に、三重にプレーティングすることによって、インビトロコロニー形成細胞（ＣＦＣ：ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）のアッセイを実施した。３７℃で１４日間インキュベートした後、コロニーを計数し、標準基準に従って分類した。
長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイ用に、９６ウェルプレートでウェル当たり３０〜９００細胞の限界希釈でＭ２−１０Ｂ４ネズミ線維芽細胞を用いて、形質導入されたＧＦＰ陽性細胞を選別した。週１回、培養に新たな培地を供給した。５週間培養した後、ウェルから、全細胞を、３５ｍｍペトリ皿の、上述した完全メチルセルロース培地に移した。さらに２週間培養した後、ウェルを陽性または陰性として採点して、ＬＴＣ−ＩＣ頻度を得た。
結果は、ｐＨＡＧＥ−ｓｈＶｅｎｔＸおよびｐＨＡＧＥ−ｓｈＧＦＰの形質導入率が約２０％であったことを示している。定量的ＰＣＲ手法を使用して、ｐＨＡＧＥ−ｓｈＶｅｎｔＸ−形質導入ＣＤ３４＋細胞におけるＶｅｎｔＸノックダウンの効率が約３０％であると決定された。陽性形質導入細胞を、サイトカイン添加ストローマ・フリー液体培地にプレーティングし、細胞数を週１回、４週まで計数した。半減培養（ｄｅｍｉ−ｄｅｐｏｐｕｌａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）の週１回の細胞計数のプロットは、ＣＤ３４＋細胞におけるＶｅｎｔＸ発現のノックダウンが、細胞を４週間培養した後の独立した３実験のコントロール細胞と比較して、全細胞数で約５倍の増加を招いたことを示している。
コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイで決定されるように、ＶｅｎｔＸのノックダウンは、ＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−Ｇ／ＣＦＵ−Ｍコロニー形成において約２倍の増加をもたらした。子孫細胞総数は、ＣＦＣアッセイに基づき約３倍増加した。このノックダウンは、全系列の造血細胞の増殖、特に赤血球系列コロニー形成を促進した。一貫して、ＬＴＣ−ＩＣ頻度は、ｓｈＶｅｎｔＸ形質導入ＣＤ３４＋細胞において約３倍増加した。加えて、このノックダウンは、エクスビボ液体培養におけるＣＤ３４＋細胞のパーセンテージが３０％増加するという結果をもたらした。
時間経過ＦＡＣＳ解析は、ＶｅｎｔＸのノックダウンがＣＤ３４＋細胞集団を４週まで維持するのに役立つことを示した。ＶｅｎｔＸのノックダウンはまた、最も原始的なＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団も増加させた。要するに、ＶｅｎｔＸノックダウンは、ＣＤ３４＋細胞プールの維持およびＣＤ３４＋細胞増殖の促進を助けた。
実施例３：低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＶｅｎｔＸの一時的ノックダウンは、ＣＤ３４＋細胞の増殖を促進する
ヒトＢＷＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載の通りに入手した。これらの細胞におけるＶｅｎｔＸ発現を、ｓｉＲＮＡ手法を使用してノックダウンした。より具体的には、製造業者の取扱説明書に従って、ヒトＣＤ３４＋細胞ヌクレオフェクターキット（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ）（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を使用したエレクトロポレーションにより、ＶｅｎｔＸをターゲットにする低分子オリゴヌクレオチド、ｓｉＶｅｎｔＸを、上記ＢＷ ＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトした。
ヒトＢＷＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載の通りに入手した。これらの細胞におけるＶｅｎｔＸ発現を、ｓｉＲＮＡ手法を使用してノックダウンした。より具体的には、製造業者の取扱説明書に従って、ヒトＣＤ３４＋細胞ヌクレオフェクターキット（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ）（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を使用したエレクトロポレーションにより、ＶｅｎｔＸをターゲットにする低分子オリゴヌクレオチド、ｓｉＶｅｎｔＸを、上記ＢＷ ＣＤ３４＋細胞にトランスフェクトした。
簡単に記載すると、１×１０６個のＣＤ３４＋細胞を、ＶｅｎｔＸ ｓｉＲＮＡ（配列番号５）または無効ＧＦＰ ｓｉＲＮＡの何れか０．５ｎｍｏｌを含むヌクレオフェクター溶液１００μｌに分散させた。これらの細胞のエレクトロポレーションを、ヌクレオフェクターＩＩデバイス（ｎｕｃｌｅｒｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ Ｄｅｖｉｃｅ）（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を使用して実施した。エレクトロポレーションされた細胞を、１０％ＦＢＳおよび上記サイトカイン類を含有する予め加温したＩＭＤＭ培地１ｍｌと共に、一晩インキュベートした。
結果は、定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づいて、ＣＤ３４＋細胞におけるＶｅｎｔＸの約７０％がｓｉＲＮＡトランスフェクションによってノックダウンされたことを示している。上記レンチウイルス−仲介手法のものと一致して、ＣＤ３４＋細胞におけるＶｅｎｔＸの一時的ノックダウンはまた、２週間培養中に、ｓｉＧＦＰ−トランスフェクト細胞と比較して、約２倍のＨＳＣ増殖を招いた。同様に、ｓｉＶｅｎｔＸ−トランスフェクト細胞は、ＣＤ３４＋細胞のパーセンテージの増加を示した。ＣＦＣアッセイはまた、ＶｅｎｔＸの一時的ノックダウンが、ＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−ＥコロニーおよびＣＦＵ−ＧＭコロニーの形成および子孫細胞総数で約２倍の増加という結果をもたらしたことも示す。要するに、このｓｉＲＮＡ手法は、上記レンチウイルスベースのｓｈＲＮＡ手法と同程度有効であった。
実施例４：ＶｅｎｔＸの過剰発現は、ＣＤ３４＋細胞増殖をブロックする。
ヒトＢＷＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載の通りに入手した。上述のヒトＣＤ３４＋細胞ヌクレオフェクターキット（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ）（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を使用して、これらの細胞をｐＣＳ２−ＧＦＰまたはｐＣＳ２−ＧＦＰＶｅｎｔＸプラスミドでトランスフェクトした。２４時間トランスフェクトした後、ＧＦＰ−陽性細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ高速ソーターで選別した。
ヒトＢＷＣＤ３４＋細胞を、実施例１に記載の通りに入手した。上述のヒトＣＤ３４＋細胞ヌクレオフェクターキット（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ）（ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を使用して、これらの細胞をｐＣＳ２−ＧＦＰまたはｐＣＳ２−ＧＦＰＶｅｎｔＸプラスミドでトランスフェクトした。２４時間トランスフェクトした後、ＧＦＰ−陽性細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ高速ソーターで選別した。
結果は、ＶｅｎｔＸの強制的な発現によってＣＤ３４＋細胞のコロニー形成が大幅に抑止されたことを示している。さらに、ＶｅｎｔＸの過剰発現によって、ヒトＣＤ３４＋細胞のＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １（ＳＲ１）−仲介増殖がブロックされる。
ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ １（ＳＲ１）はアリール炭化水素受容体アンタゴニストであることに留意されたい。結果は、ＳＲ１がＣＤ３４＋細胞におけるＶｅｎｔＸの発現を阻害し、これらのＣＤ３４＋細胞の増殖を高めたことも示している。このように、ＣＤ３４＋細胞の増殖にはＶｅｎｔＸのダウンレギュレーションが必要である。
実施例５：ＶｅｎｔＸはインビボでＣＤ３４＋細胞の増殖を制御する。
ＶｅｎｔＸがインビボでＣＤ３４＋細胞の増殖を促進するかどうかを決定するために、８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ；ＮＳＧとして一般に知られている）をジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入し、特定病原体除去条件で維持した。移植前に、マウスに１００ラド（Ｒａｄ）を亜致死的に照射した。約１×１０６個のＣＤ３４＋細胞を、ＶｅｎｔＸまたはＧＦＰｓｈＲＮＡレンチウイルスで形質導入した。形質導入後２４時間に、全細胞（１×１０６個、約２０％がＧＦＰ陽性細胞）または陽性に形質導入された細胞（２×１０４個、全てＧＦＰ陽性）をレシピエントマウスに注射した。ヒトＣＤ４５＋細胞を、レシピエントマウスの骨髄からＦＡＣＳで解析した。二次移植では、ヒト細胞をさらに精製せずに、キメラ一次レシピエントマウスの骨髄を二次レシピエントＮＳＧマウスに注射した。
ＶｅｎｔＸがインビボでＣＤ３４＋細胞の増殖を促進するかどうかを決定するために、８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ガンマ；ＮＳＧとして一般に知られている）をジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入し、特定病原体除去条件で維持した。移植前に、マウスに１００ラド（Ｒａｄ）を亜致死的に照射した。約１×１０６個のＣＤ３４＋細胞を、ＶｅｎｔＸまたはＧＦＰｓｈＲＮＡレンチウイルスで形質導入した。形質導入後２４時間に、全細胞（１×１０６個、約２０％がＧＦＰ陽性細胞）または陽性に形質導入された細胞（２×１０４個、全てＧＦＰ陽性）をレシピエントマウスに注射した。ヒトＣＤ４５＋細胞を、レシピエントマウスの骨髄からＦＡＣＳで解析した。二次移植では、ヒト細胞をさらに精製せずに、キメラ一次レシピエントマウスの骨髄を二次レシピエントＮＳＧマウスに注射した。
結果は、ｓｈＧＦＰ形質導入ＣＤ３４＋細胞と比較して、ｓｈＶｅｎｔＸ形質導入ＣＤ３４＋細胞では、ヒト細胞生着率が約１．５〜２倍上昇したことを示している。明らかに、ＶｅｎｔＸのノックダウンは全系列の造血細胞の発生を可能にした。骨髄細胞系列（ＣＤ１４＋細胞）の発生は他の系列と比較して僅かに損なわれているようであった。
ＣＤ３４＋細胞のレンチウイルス形質導入率が僅か約２０％であったことから、ＨＳＣの増殖に対するＶｅｎｔＸノックダウンの効果をさらに調査するために、陽性に形質導入されたＣＤ３４＋細胞を精製し、次いでＮＳＧマウスに移植した。移植の１３週後に、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージをＦＡＣＳ解析で決定した。驚くほどに、ｓｈＶｅｎｔＸ形質導入ＣＤ３４＋細胞では、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージが、ｓｈＧＦＰ形質導入ＣＤ３４＋細胞と比較して２０倍まで増加した。
ヒトＣＤ３４＋細胞の長期生着に対するＶｅｎｔＸの効果を試験するために、二次移植実験を実施した。コントロールｓｈＧＦＰ形質導入ＣＤ３４＋細胞を有するマウスはどれも検出可能な二次生着を示さなかったが、ｓｈＶｅｎｔＸ形質導入ＣＤ３４＋細胞を有するマウス２匹は、陽性のヒト細胞生着を示した（それぞれ、０．２５％および０．２８％）。
抗ＶｅｎｔＸモルホリノオリゴヌクレオチド、すなわち、
５’−ＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＧＡＧＧＧＴＡＡ−３’（ＶｅｎｔＸ ＭＯ；配列番号６８）または
５’−ＧＡＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＣＧＧＣＴＡＡ−３’（ＶｅｎｔＸ ＭＯ−２；配列番号６９）、および
コントロールモルホリノオリゴヌクレオチドが、上述の通りにヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレーションされた。次いで、やはり上述の通りに、細胞をＮＳＧマウスに注射した。注射後８週にマウスを屠殺し、上述の通りに、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージをＦＡＣＳで解析した。驚いたことには、抗ＶｅｎｔＸモルホリノオリゴヌクレオチドは、コントロールオリゴヌクレオチドと比較して、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを５０％増加するという結果をもたらした。
５’−ＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＧＡＧＧＧＴＡＡ−３’（ＶｅｎｔＸ ＭＯ；配列番号６８）または
５’−ＧＡＧＣＣＣＧＧＴＴＴＧＣＡＴＡＣＡＣＧＧＣＴＡＡ−３’（ＶｅｎｔＸ ＭＯ−２；配列番号６９）、および
コントロールモルホリノオリゴヌクレオチドが、上述の通りにヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレーションされた。次いで、やはり上述の通りに、細胞をＮＳＧマウスに注射した。注射後８週にマウスを屠殺し、上述の通りに、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージをＦＡＣＳで解析した。驚いたことには、抗ＶｅｎｔＸモルホリノオリゴヌクレオチドは、コントロールオリゴヌクレオチドと比較して、ヒトＣＤ４５＋細胞のパーセンテージを５０％増加するという結果をもたらした。
実施例６：ＶｅｎｔＸは、ＣＤ３４＋細胞における細胞周期調節因子をターゲットにする
ＶｅｎｔＸは、Ｗｎｔシグナル経路および細胞周期機構の幾つかの成分、たとえばＣｙｃｌｉｎ Ｄ１，ｐ２１およびｐ１６ｉｎｋ４ａ等の、調節因子である。ｐ２１，ｐ１６ｉｎｋ４，Ｃ−ｍｙｃ、およびＣｙｃｌｉｎ Ｄ１のレベルを、下記のプライマーとともに定量的ＰＣＲを使用して決定した：
ｐ２１：５’−ＡＡＡＣＴＴＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号２１）およ
び
５’−ＡＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＧ−３’（配列番号２２）；
ｐ１６：５’−ＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＴＡＡＡＴ−３’（配列番号２３）および
５’−ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号２４）；
Ｃ−ｍｙｃ：５’−ＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴ−３’（配列番号２５）および
５’−ＧＴＡＧＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡ−３’；（配列番号２６）および
Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１：５’−ＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＣＴＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２７）および５’−ＴＴＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２８）。
ＶｅｎｔＸは、Ｗｎｔシグナル経路および細胞周期機構の幾つかの成分、たとえばＣｙｃｌｉｎ Ｄ１，ｐ２１およびｐ１６ｉｎｋ４ａ等の、調節因子である。ｐ２１，ｐ１６ｉｎｋ４，Ｃ−ｍｙｃ、およびＣｙｃｌｉｎ Ｄ１のレベルを、下記のプライマーとともに定量的ＰＣＲを使用して決定した：
ｐ２１：５’−ＡＡＡＣＴＴＴＧＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号２１）およ
び
５’−ＡＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＴＧＡＧＡＣＧ−３’（配列番号２２）；
ｐ１６：５’−ＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡＣＣＧＴＡＡＡＴ−３’（配列番号２３）および
５’−ＴＧＣＴＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号２４）；
Ｃ−ｍｙｃ：５’−ＣＡＧＣＴＧＣＴＴＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＴＴ−３’（配列番号２５）および
５’−ＧＴＡＧＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＧＣＡＣＣＧＡ−３’；（配列番号２６）および
Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１：５’−ＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴＣＴＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号２７）および５’−ＴＴＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号２８）。
結果は、ＶｅｎｔＸの過剰発現は、ＣＤ３４＋細胞において、ｐ２１およびｐ１６ｉｎｋ４ａの発現を増加させたが、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１およびＣ−ｍｙｃの発現をダウンレギュレートしたことを示している。ＶｅｎｔＸのノックダウンはｐ２１発現を減少させたが、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１およびＣ−ｍｙｃの発現を増加させた、結果を機能喪失手法でさらに確認した。やはりＦＡＣＳ解析に基づき、ＶｅｎｔＸのノックダウンは、Ｃｙｃｌｉｎ
Ｄ１蛋白質のレベルを上昇させた。
Ｄ１蛋白質のレベルを上昇させた。
他の実施態様
この明細書に開示されている特徴は全て、任意の組合せで組み合わせることが可能である。この明細書に開示されている各特徴は、同一の、同等の、または類似した、目的にかなう代わりの特徴に置き換えられてもよい。したがって、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示されている各特徴は、一般的な一連の同等または類似した特徴の例にすぎない。
この明細書に開示されている特徴は全て、任意の組合せで組み合わせることが可能である。この明細書に開示されている各特徴は、同一の、同等の、または類似した、目的にかなう代わりの特徴に置き換えられてもよい。したがって、明示的に別段の定めをした場合を除き、開示されている各特徴は、一般的な一連の同等または類似した特徴の例にすぎない。
上述から、当業者は本発明の本質的な特性を容易に確認することができ、その精神および範囲から離れることなく、本発明を様々な使用および条件に適合させるために、様々な変更および修正を行うことができる。したがって、他の実施態様もまたクレームの範囲内である。
Claims (12)
- 造血幹細胞または前駆細胞を増殖させる方法であって、
造血幹細胞または前駆細胞を対象から単離する工程、および
前記造血幹細胞を、ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現を阻害するモルホリノオリゴヌクレオチドと接触させ、それによって前記造血幹細胞または前駆細胞の増殖を高める工程、
を含む、方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５〜１８および配列番号２９〜６９からなる群から選択される配列を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記対象の骨髄、末梢血、または臍帯血から得ることによって前記単離工程が実行される、請求項１に記載の方法。
- 対象における一次性または二次性骨髄不全症候群を治療する方法であって、
造血幹細胞または前駆細胞を、一次性または二次性骨髄不全症候群を有する対象から単離する工程、
前記造血幹細胞または前駆細胞を、ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現を阻害するモルホリノオリゴヌクレオチドと接触させ、それによって前記造血幹細胞または前駆細胞の増殖を高める工程、および
前記対象に、増殖を経た前記造血幹細胞または前駆細胞の有効量を投与する工程、
を含む、方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５〜１８および配列番号２９〜６９からなる群から選択される配列を有する、請求項４に記載の方法。
- 前記造血幹細胞または前駆細胞を、前記対象の骨髄、末梢血、または臍帯血から得ることによって前記単離工程が実行される、請求項４に記載の方法。
- 一次性または二次性骨髄不全症候群が、貧血症、脊髄形成異常症候群、または、化学療法もしくは放射線療法の合併症である、請求項４に記載の方法。
- 一次性または二次性骨髄不全症候群が貧血症である、請求項７に記載の方法。
- 一次性または二次性骨髄不全症候群が脊髄形成異常症候群である、請求項７に記載の方法。
- 一次性または二次性骨髄不全症候群が化学療法の合併症である、請求項７に記載の方法。
- 対象における造血幹細胞または前駆細胞を増殖させる方法であって、
ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現を阻害するモルホリノオリゴヌクレオチドを、必要としている対象に投与し、それによって前記対象における前記造血幹細胞または前駆細胞の増殖を高めること、
を含む、方法。 - 対象における一次性または二次性骨髄不全症候群を治療する方法であって、
ＶｅｎｔＸポリペプチドの発現を阻害するモルホリノオリゴヌクレオチドを、必要としている前記対象に投与し、それによって前記対象における造血幹細胞または前駆細胞の増殖を高めること、
を含む、方法。
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