KR20030022757A - Ｃ-ｍｙｃ 안티센스-처리된 조혈모세포 조성물 및 방법 - Google Patents

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바르텔메즈스티븐에이치.
이버슨패트릭엘.
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에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드
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Abstract

c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드로 부화된 HSC 집단을 처리함에 의해 제조된 증가된 수의 조혈간세포(HSC)를 포함하는 조성물이 설명된다. 더 이상으로, 본 발명은 그것을 제조하는 방법 및 약제로서c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드-처리된 HSC를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｃ-ＭＹＣ 안티센스-처리된 조혈모세포 조성물 및 방법{C-MYC ANTISENSE-TREATED HEMATOPOIETIC STEM CELL COMPOSITION AND METHOD}
조혈간세포(HSC)는 이식가능하고 자가-복제할 수 있으며 다계통의 잠재력을 가지는 세포로서 특성화되는 다능성 선조세포(pluripotent progenitor)이다. HSC의 분화는 그러한 다계통 잠재력의 상실 및 상응하는 계통 구속을 가져온다. 단일 HSC가 면역결핍 마우스의 골수를 재분포시켰던 이식 연구에 의해 생체내에서 HSC의 자가-재생이 일어난다는 것이 입증되었다(Smith 등, 1991; Osawa 등, 1996). 또한, 조혈간세포가 재조합 레트로바이러스로 감염될 수 있고, 유전자 치료법을 위한 세포 표적으로 사용될 수 있다는 것이 입증되었다(Keller 및 Snodgrass, 1990).
이것들에 제한되는 것은 아니지만, 골수증식성 질환, 혈구증식성 질환 및 자가면역질환을 포함하는 다양한 세포-기초 질환으로 고통받고 있는 환자는 주로 특정 계통의 세포수가 불균형하다. 여기에 더하여, 화학요법 또는 방사선요법을 받고 있는 환자는 주로 조혈작용에 결함이 있다.
골수 이식 또는 조혈간세포로 부화된 세포 집단의 이식과 함께 고용량 화학요법 및/또는 방사선요법은 급성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 신경간세포종, 림프종, 유방암, 결장암, 폐암 및 척수이형성 증후군을 포함하는 어떤 악성종양 뿐만 아니라, 다른 비-악성 조혈성 질환, 예를 들어 혈소판감소증에 대한 표준 치료 섭생이다.
임상적 시도가 난소암, 흉선종, 생식세포 종양, 다발성 골수종, 흑색종, 고환암, 폐암 및 뇌종양을 포함하는 다양한 암의 치료에 대한 그러한 섭생을 사용하여 진행중이다.
상기 상태 중 어느 것으로 고통받고 있는 환자에서는 조혈간세포의 발달 및/또는 복제를 조정하는 것이 임상적으로 유용하며, 그러한 세포가 유전조작-기초 치료법을 위한 잠재적 표적이 된다(Wilson 등, 1991).
HSC가 유전자 치료법 및 자가 이식을 위한 최적의 세포 표적임이 분명하다 해도, (a) 조혈간세포에 유일한 항원 마커를 확인하고, (b) 실질적인 수의 조혈간세포를 얻고, (c) 조혈간세포 집단을 유지 및 확장하는데 있어 문제에 부딪치고 있다.
여기에 더하여, 조혈간세포로 부화된 세포 집단에서 장기적 조혈 복구가 가능한 세포의 퍼센트는 매우 낮으며, 따라서 조혈간세포의 정제 및 확장 기술에 대한 필요성이 있다. HSC로 부화된 세포 집단을 사용한 이식의 합병증이 관찰되었으며, 이것은 동종 이식물에서의 이식편대숙주병(GVHD), 및 질환의 재발을 초래할 수 있는 자가 및 동종 이식물에 잔존하는 종양 세포 때문이다. 현재의 치료 섭생은 T-세포 및 잔존 종양 세포를 포함하여, 이식물 레시피언트를 위태롭게 하는 세포의 제거에 방향을 맞추고 있다.
HSC로 부화된 세포 집단의 이식을 수반하는 지금까지 사용된 치료적 섭생에서는, 악성 세포로 인한 이식 세포의 오염 및/또는 골수제거 화학요법 후 숙주내에 존속하는 악성 세포에 기인하는 잠재적인 질환의 재발이 그러한 치료의 실패를 빈번히 초래한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 항체가 관심의 표적 단백질의 합성을 특이적으로 방해할 수 있다는 것이 입증되었다. 그것들의 소수성으로 인해, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인지질 멤브레인과 잘 상호작용하며(Akhtar S 등, 1991), 세포 플라즈마 멤브레인과의 상호작용 후 올리고뉴클레오티드가 살아있는 세포로 활발히 수송된다고 제안되었다(Loke, S. L. 등 1989; Yakubov, L. A. 등, 1989; And-erson, C. M. 등, 1999).
세포 발달에 관련된 유전자의 저해는 안티센스 기술을 사용하여 달성되지만, 자연발생 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-민감성 포스포디에스테르 백본을 가진다. 그러나, 자연발생 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 포스포디에스테르 결합 대신 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디아미데이트 결합을 이용함으로써, 뉴클레아제에 의한 분해에 내성으로 된다(Spitzer 및 Eckstein, 1988; Baker 등, 1990; Hudziak, 1996).
포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO)가 세포에 호의적으로 업테이크되는 RNA 표적에 대한 높은 결합 친화성 및 최소한의 비-특이적 결합 상호작용을 나타낸다는 것이 입증되었다(예를 들어, Summerton 등 1997a 참조).
아세틸콜린에스테라제 유전자에 특이적인 합성 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드가 (1) 비정상적 조혈작용의 억제, (2) 비정상적 혈소판 증식의 억제, (3) 마크로파지 및 조혈간세포 수의 증가, (4) 동종 기관 이식물에 대한 면역 반응의 감소, 및 (5) 악성 종양의 치료를 위한 도구로서 설명되었다(미국 특허 번호 5,891,725).
c-myc는 세포 성장, 분화, 및 세포자살을 조절하는 프로토-암유전자이며, 그것의 이상 발현은 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병, 폐암 등을 포함하는 많은 사람의 암에 관련된다.
c-myc에 대한 안티센스(McManaway 등, 1990; Watson 등, 1991; Li 등, 1995) 및 bcl-2에 대한 안티센스(Reed 등, 1990)에 의해 예시된 바와 같이, 시험관내에서 몇몇 암유전자 mRNA의 번역이 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 성공적으로 차단되었다.
말초혈 및/또는 골수로부터 유도된 조혈간세포의 이식이 점점 수많은 형태의 암을 포함하는 여러가지 장애의 치료를 위한 화학요법 및/또는 방사선요법과 조합하여 사용되고 있다. 그러한 이식물에서 장기적 조혈 복구가 가능한 세포 퍼센트는 매우 낮으며, 따라서 조혈간세포의 정제 및 확장 기술을 개발할 필요가 있다.
따라서, 다능성이고, 광범위한 세포 계통으로 발달할 수 있으며, GVHD 및 잔존 질환의 합병증 없이 이식할 수 있는, 증가된 수의 조혈간세포를 얻는데 효과적인 방법을 개발할 필요가 여전히 남아있다. 본 발명은 이런 필요성을 다룬다.
발명의 개요
본 발명은 피험자로부터 HSC-함유 세포 집단을 얻는 단계; HSC로 부화시키는데 효과적인 방식으로 세포 집단을 처리하는 단계; 및 조혈간세포의 수를 적어도 2배, 바람직하게 적어도 4배, 더 바람직하게 적어도 8배 이상 증가시키는데 충분한 농도에서 충분한 시간 동안 부화된 HSC 집단을c-myc안티센스 올리고머에 생체외에서 노출하는 단계를 수행함에 의해 제조되는, 조혈간세포(HSC) 조성물의 제조 방법을 제공한다. HSC는 계통 마커의 발현이 결여되고(lin-), c-kit(CD117)의 세포 표면 발현에 대해 양성이며, Sca 1의 세포 표면 발현에 대해 양성으로서 특성화된다.
한 구체예에서, 본 방법을 실행하기 위한 HSC-함유 세포 집단은 사람 골수 또는 가동화된 사람 말초혈로부터 얻어진다.
다른 구체예에서, 피험자는 사람 암환자이고, 이 환자는 림프종 또는 백혈병을 가진다.
본 발명의 실행에 사용되는c-myc안티센스 올리고머는 전형적으로, (1) 약 12 내지 25 염기 길이; (2) 실질적으로 하전되지 않은 백본; (3) 50℃ 이상의 Tm에서 높은 친화성으로 표적 RNA의 상보성 서열과 혼성화하는 능력; (4) 뉴클레아제 내성; (5) 활발한 또는 용이해진 세포로의 수송 능력; 및 (6) 도 2A-A부터 도 2E-E에 나타낸 구조들로 구성되는 군으로부터 선택된 구조 중 하나 이상에 의해 특성화된다.
한 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고머는 SEQ ID NO:1로서 확인된 서열을 가진다.
또한, 본 발명은 피험자의 암을 치료하는데 있어 약제로서 사용되는 상술된 방법에 의해 제조된 조혈간세포(HSC) 조성물을 제공한다.
본 방법의 관련 적용으로, 상술된 방법에 의해 제조된 확장된 HSC 집단은 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 확장된 집단을 가져오는데 효과적인 조건하에서 더 배양된다.
(1)c-myc안티센스 올리고머-처리된 조혈간세포(HSC) 조성물; (2)c-myc안티센스 올리고머; 및 (3) 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 확장된 집단 중 하나 이상을 암환자로 송달하는 방법이 본 발명에 의해 더 제공된다.
그러한 생체외에서 확장된 조혈간세포 및 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손으로 부화된 세포 집단은 다양한 악성종양, 비-악성 조혈성 이상성, 자가면역질환의 치료를 위한, 그리고 백신을 강화시키기 위한 치료적 섭생의 일부로서 환자에게 재주입될 수 있다.
다음의 상세한 설명이 첨부된 도면 및 실시예와 함께 숙독된 때, 본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징이 더 완전히 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1A 내지 1E는 중합체를 형성하는데 적합한 5-원자(A), 6-원자(B) 및 7-원자(C 내지 E) 결합기를 가지는 몇가지 바람직한 모르폴리노 서브유니트를 나타낸다.
도 2A-A부터 2E-E는 각각 도 1의 서브유니트 A 내지 E를 사용하여 구성된, 전형적인 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 반복 서브유니트 세그먼트를 나타낸다.
도 3은 시험관내 분석에서 고증식 잠재성 콜로니 형성 세포(HPP-CFC) 콜로니 형성에 대한 0일 및 3일째의 결과를 묘사하며, 여기에서는 단일 c-kit+, Sca 1+ 세포가 안티센스 올리고머 없이, 스크램블 안티센스 올리고머로, 또는 1, 5, 25 또는 125mMc-myc안티센스 올리고머로 처리되고, IL-6 및 SCF의 존재하에 3일간 배양되었다.
도 4A 내지 4D는 다양한 용량(30, 100, 300 또는 1000㎍/일)의c-myc에 대한 PMO 안티센스로 7일간 매일 복강내적으로 처리된 마우스의 말초혈 분석 결과를 묘사한다. 샘플은 7, 21 및 28일에 수집했다. 그림은 각 시간 지점에서 존재한 적혈구(A), 과립구(B), 림프구(C), 및 백혈구(D)의 수를 나타낸다.
본 발명은 세포를c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출함에 의해 시험관내 및 생체내에서 조혈간세포(HSC)의 수를 증가시키는 방법, 및 계통-구속된 선조세포(lineage-committed progenitor cells) 및 그들 자손의 집단을 증가시키는데 효과적인 방식으로 그러한 HSC를 처리하는 방법에 관한 것이다. 더 이상으로, 본 발명은 그러한 방법에 의해 생성된 HSC 조성물에 관한 것이다.
참고문헌
I. 정의
본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는 달리 나타내지 않는다면 다음의 의미를 가진다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조혈간세포로 부화된 세포 집단"은 본원에 설명된 양성 및 음성 선택 기술을 사용하여 얻어진 세포 집단으로 간주하며, 여기에서 조혈간세포는 LTR- 또는 STR-HSC일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "장기적 재분포 조혈간세포" 및 "LTR-HSC"는이식가능하며, 전적으로 면역억제된 레시피언트에게 이식되었을 때 분화시 불확정의 기간 동안 모든 계통의 조혈 세포에 기여하는 조혈간세포로 간주한다. LTR-HSC는 클론 소멸을 겪지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "단기적 재분포 조혈간세포" 또는 "STR-HSC"는 이식가능하며, 면역억제된 레시피언트에게 이식되었을 때 약 1주 내지 6개월의 기간 동안 모든 계통의 조혈 세포에 기여하고, 다음에 클론 소멸을 겪는 뮤린 조혈간세포로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "클론 소멸"은 단일 조혈간세포 및 이 세포의 클론 확장에 의해 생성된 모든 자손의 종결 분화로 간주하며, 이로써 더 이상의 딸세포가 초기 클론으로부터 생성되지 않는다.
용어 "다능성 조혈간세포"는 모든 가능한 세포 계통으로 분화할 수 있는 조혈간세포로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, 조혈간세포에 관한 용어 "고증식 잠재성 콜로니 형성 세포" 또는 "HPP-CFC"는 래트 rSCF, 마우스 rIL-3 및 사람 rIL-6에 반응하여 증식하는 뮤린 세포로 간주한다. 이 세포는 한천 또는 메틸 셀룰로스와 같은 반고체 배지에서 증식하거나, 또는 액체 배양물중에서 단일한 세포로서 증식하고, 일반적으로 조밀한 다중심의 중심들이 있으며 클론 당 100,000 세포 이상을 가지는 직경 1mm 이상의 거대클론을 형성한다. 이 집단은 모든 뮤린 HSC를 포함하지만, 모든 HPP-CFC가 HSC는 아니며, HPP-CFC 분석이 LTR-HSC에 대한 특이적 분석은 아니다. 반대로, 저증식 잠재성(LPP) 클론은 클론 당 2 내지 100,000 세포를 함유한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "계통-구속된 조혈간세포"는 모든 세포 계통은 아니지만 하나 이상의 특정 세포 계통에 구속되도록 충분히 분화된 조혈간세포이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "lin-" 또는 "계통-고갈"은 T-세포, B-세포, 호중구, 단구 및 적혈구에 특이적인 세포 표면 항원의 발현이 결여되고, YW 25.12. 7" 항체에 의해 인식되는 항원을 발현하지 않는 세포 집단으로 간주한다(예를 들어, Bertoncello I 등, 1991).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발달하다", "분화하다" 및 "성숙한"은 상호 교환가능하게 사용되며, 다수의 세포 계통으로 분화하는 잠재력을 가지고 있는 단계에서 하나 이상의 규정된 계통에 구속된 더욱 특수화된 세포로 되는 단계까지의 세포의 진행으로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, 조혈간세포에 관한 용어 "정제된"은 자연 상태의 특정한 조직, 예를 들어 골수 또는 말초혈에서 정상적으로 발견되는 일부 또는 모든 다른 세포 종류에 비하여 부화된(분리된 또는 정제된) HSC로 간주한다. 일반적으로, "정제된" HSC 집단은 Hoechst 33342 및 Rhodamine 123을 사용한 낮은 수준 염색에 더하여, 밀도 구배 분류, 계통 고갈, 및 c-kit 및 Sca-1 발현에 대한 양성 선택이 행해진다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드" 및 "안티센스 올리고머"는 상호 교환가능하게 사용되며, 안티센스 올리고머가 Watson-Crick염기쌍화에 의해 RNA에 있는 표적 서열에 혼성화하는 것을 허용하여 표적 서열내에 RNA:올리고머 이형이중가닥을 형성하는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유니트-대-서브유니트 백본으로 간주한다. 이 올리고머는 표적 서열에 대해 정확한 서열 상보성이거나 또는 거의 상보성일 수 있다. 그러한 안티센스 올리고머는 표적 서열을 함유하는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하거나, 또는 유전자 전사를 저해할 수 있으며, 이중가닥 또는 단일가닥 서열에 결합할 수 있고, 이것과 혼성화하는 서열에 "관련된다"고 말할 수 있다.
본 발명에 사용되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 전형적인 구조는 도 1A 내지 1E에 나타낸 β-모르폴리노 서브유니트 종류를 포함한다. 중합체가 하나 이상의 결합 종류를 함유할 수 있다는 것이 인정될 것이다.
도 1의 서브유니트 A는 도 2의 A-A에 나타낸 5-원자 반복-유니트 백본을 형성하는 1-원자 포스포러스-함유 결합을 함유하며, 이 경우 모르폴리노 고리가 1-원자 포스폰아미드 결합에 의해 연결된다.
도 1의 서브유니트 B는 도 2의 B-B에 나타낸 바와 같은 6-원자 반복-유니트 백본용으로 디자인된다. 구조 B에서, 포스포러스기에 5' 모르폴리노 탄소를 연결하는 원자 Y는 황, 질소, 탄소, 또는 바람직하게 산소일 수 있다. 포스포러스의 X 부분 펜던트는 불소; 알킬 또는 치환 알킬; 알콕시 또는 치환 알콕시; 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시; 또는 고리 구조를 포함하여 비치환, 일치환 또는 이치환 질소 원자 중 어느 것일 수 있다.
도 1의 서브유니트 C 내지 E는 도 2의 C-C부터 E-E에 나타낸 바와 같은 7-원자 유니트-길이 백본용으로 디자인된다. 구조 C에서, X 부분은 구조 B에서와 같고, Y 부분은 메틸렌, 황, 또는 바람직하게 산소일 수 있다. 구조 D에서, X 및 Y 부분은 구조 B에서와 같다. 구조 E에서, X는 구조 B에서와 같고, Y는 O, S 또는 NR이다. 도 1A 내지 1E에 묘사된 모든 서브유니트에서, Z는 O 또는 S이고, Pi 또는 Pj는 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실이다.
본원에 사용된 바와 같은, "모르폴리노 올리고머"는 전형적인 폴리뉴클레오티드에 수소결합할 수 있는 염기를 지지하는 백본을 가지는 중합성 분자로 간주하며, 여기에서 중합체는 펜토스 당 백본 부분, 더 구체적으로 전형적인 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드인 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보스 백본이 결여되어 있지만, 대신 고리 질소를 함유하며 이 고리 질소를 통해 커플링하고 있다. 바람직한 "모르폴리노" 올리고뉴클레오티드는 도 2B에 나타낸 형태의 모르폴리노 서브유니트 구조로 이루어지며, 이 경우 (i) 구조는 한 서브유니트의 모르폴리노 질소와 인접 서브유니트의 5' 외향고리 탄소를 잇는 1- 내지 3-원자 길이의 포스포러스-함유 결합에 의해 함께 연결되고, (ii) Pi 및 Pj는 폴리뉴클레오티드에 있는 염기에 염기-특이적 수소결합에 의해 결합하는데 효과적인 푸린 또는 피리미딘 염기쌍화 부분이다.
본 발명의 이런 바람직한 양태가 도 2B에 예시되며, 이것은 포스포로디아미데이트 결합에 의해 이어진 2개의 그러한 서브유니트를 나타낸다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고머를 포함함)는, 예를 들어 공동 소유인 미국 특허 번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,185,444,5,521,063, 및 5,506,337에 상세히 설명된다.
본원에 설명된 바와 같은, "뉴클레아제 내성" 올리고머 분자(올리고머)는 그것의 백본이 포스포디에스테르 결합의 뉴클레아제 절단에 민감하지 않은 것이다. 전형적인 뉴클레아제 내성 안티센스 올리고머는, 포스포로티오에이트 및 포스페이트-아민 DNA(pnDNA)(모두 하전된 백본을 가진다)와 같은 올리고뉴클레오티드 유사체, 및 메틸-포스포네이트, 모르폴리노 및 펩티드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오티드(모두 하전되지 않은 백본을 가질 수 있다)이다.
본원에 사용된 바와 같은, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고머는, 만일 이 올리고머가 Tm이 실질적으로 37℃ 이상, 바람직하게 적어도 50℃, 전형적으로 60℃ 내지 80℃ 이상인 생리학적 조건하에서 표적에 혼성화한다면, 표적 폴리뉴클레오티드에 "특이적으로 혼성화한다". 그러한 혼성화는 바람직하게 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열용융점(T[m])보다 약 10℃, 바람직하게 약 5℃ 더 낮도록 선택된 긴축 혼성화 조건에 상응한다. 주어진 이온 강도 및 pH에서, T[m]은 표적 서열의 50%가 상보성 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 온도이다.
혼성화가 2개의 단일가닥 폴리뉴클레오티드 사이에서 역평행 입체배치로 일어난 때, 폴리뉴클레오티드는 서로 "상보성"으로 설명된다. 이중가닥 폴리뉴클레오티드는, 만일 혼성화가 제 1 폴리뉴클레오티드와 제 2 폴리뉴클레오티드의 가닥들 중 1개 사이에서 일어날 수 있다면, 다른 1개의 폴리뉴클레오티드에 "상보성"일 수 있다. 상보성(한 폴리뉴클레오티드가 다른 것과 상보하는 정도)은 일반적으로 인정된 염기쌍화 규칙에 따라서 서로 수소결합을 형성할 것으로 기대되는 마주한가닥에 있는 염기의 비율로서 정량할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 올리고머에 관한 용어 "유사체"는 기준 올리고머와 유사한 구조적 및 화학적 특성을 소유하는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 제 1 서열은, 만일 제 1 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드가 생리학적 조건하에서 제 2 폴리뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하거나 또는 특이적으로 혼성화한다면, 제 2 서열에 관하여 "안티센스 서열"이다.
본원에 사용된 바와 같은, "표적 RNA를 수반하는 염기-특이적 세포내 결합 사건"은 세포 내부에서의 올리고머와 표적 RNA의 서열 특이적 결합으로 간주한다. 예를 들어, 단일가닥 폴리뉴클레오티드가 서열에 있는 상보하는 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "뉴클레아제 내성 이형이중가닥"은 안티센스 올리고머와 그것의 상보성 표적의 결합에 의해 형성된 이형이중가닥으로 간주하며, 이것은 도처에 존재하는 세포내 및 세포외 뉴클레아제에 의한 생체내 분해에 대해 내성이다.
본원에 사용된 바와 같은, "c-myc"는 암 또는 종양의 발달 및 성장을 향해 세포가 나아가도록 하는 암유전자 또는 유전자로 간주한다. "c-myc"는 하기 더 상세히 설명된 바와 같이, 다양한 종류의 암에서 유전자 증폭에 관련된다.
본원에 사용된 바와 같은, "c-myc안티센스 올리고머"는 상보성 또는 거의 상보성인c-myc핵산 서열에 대해 높은 친화성을 가지는(즉, "특이적으로 혼성화되는") 뉴클레아제 내성 안티센스 올리고머로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, 올리고뉴클레오티드에 관한 용어 "발현 조정"은 발현 또는 RNA의 번역을 방해함에 의해 주어진 단백질의 발현을 증대시키거나 또는 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드(올리고머)의 능력으로 간주한다. 증대된 단백질 발현의 경우, 안티센스 올리고머는 억제 유전자, 예를 들어 종양 억제 유전자의 발현을 차단할 수 있다. 감소된 단백질 발현의 경우, 안티센스 올리고머는 주어진 유전자의 발현을 직접적으로 차단하거나, 또는 이 유전자로부터 전사된 RNA의 이병화(breakdown)를 가속하는데 기여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "종양" 및 "암"은 성장 제어의 상실을 나타내며, 비정상적으로 큰 세포 클론을 형성하는 세포로 간주한다. 종양 또는 암세포는 일반적으로 접촉저해를 상실하며, 침입성일 수 있고, 및/또는 전이하는 능력을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 안티센스 올리고머에 관한 "유효량"은 단일 용량으로서 또는 일련의 용량의 일부로서 표유류 피험자에게 투여되는 선택된 표적 핵산 서열의 발현을 저해하는데 효과적인 안티센스 올리고머의 양으로 간주한다.
본원에 사용된 바와 같은, 개체 또는 세포의 "치료"는 개체 또는 세포의 자연적 진로를 변경하려는 시도에 사용되는 어떤 종류의 개입이다. 치료는 이것에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 제약학적 조성물의 투여를 포함하며, 예방적으로, 또는 병적 사건의 개시 또는 병인체와의 접촉에 이어서 수행될 수 있다.
본원에 설명된 바와 같은, 암환자에 관한 용어 "개선된 치료적 성과"는 암세포 또는 고형 종양 성장의 지연 또는 축소, 또는 암세포의 총수 또는 총 종양 부담의 감소로 간주한다.
II. c-myc 안티센스 올리고뉴클레오티드
A. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 종류
15 내지 20 염기의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 보통 포유류 게놈에서 1개의 상보성 서열을 가지기에 충분한 길이이다. 여기에 더하여, 적어도 17 뉴클레오티드 길이의 길이를 가지는 안티센스 화합물은 그것들의 표적 mRNA와 잘 혼성화한다는 것이 입증되었다(Cohen 등, 1991).
두 가지의 일반적인 메카니즘이 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 발현의 저해를 설명하기 위해 제안되었다(예를 들어, Agrawal 등, 1990; Bonham 등, 1995; 및 Boudvillain 등, 1997 참조).
첫번째로, 올리고뉴클레오티드와 mRNA 사이에 형성된 이형이중가닥이 RNaseH에 대한 기질이 되어 mRNA의 절단을 가져온다. 이 부류에 속하는, 또는 속한다고 제안된 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 및 포스포디에스테르(변형되지 않은 "자연적" 올리고뉴클레오티드)를 포함한다. 그러한 화합물은 일반적으로 높은 활성을 나타내며, 포스포로티오에이트가 현재 안티센스 적용에서 가장 광범위하게 사용되는 올리고뉴클레오티드이다. 그러나, 이들 화합물은 세포 단백질과의 비-특이적 결합으로 인한 바람직하지 못한 부작용(Gee 등, 1998) 뿐만 아니라, 비-표적 RNA 이형이중가닥의 부적합한 RNase 절단(Giles 등, 1993)을 생성하려는 경향이 있다.
"입체적 차단인자", 또는 달리 "RNaseH 불활성" 또는 "RNaseH 내성"으로 명명되는 올리고뉴클레오티드 유사체의 제 2 부류는, RNaseH에 대한 기질로서의 작용은 관찰되지 않았으며, 표적 RNA 형성, 핵세포질 수송, 또는 번역을 입체적으로 차단함에 의해 작용한다고 여겨진다. 이 부류는 메틸포스포네이트(Toulme 등 1996), 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬 변형된 올리고뉴클레오티드(Bonham, 1995), 및 N3'P5'포스포라미데이트(Gee, 1998)를 포함한다.
자연발생 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 의한 분해에 민감한 포스포디에스테르 백본을 가지지만, 백본의 어떤 변형은 그러한 분해에 대한 자생 올리고뉴클레오티드의 내성을 증가시킨다(예를 들어, Spitzer 및 Eckstein, 1988 참조).
각각3H-로이신 및3H-티미딘의 결합에 의하여 측정된 단백질 및 DNA 합성에 대한 효과와 같이, 후보 안티센스 올리고머는 급성 및 만성 세포 독성에 대해 잘 공지된 방법에 따라서 평가된다. 여기에 더하여, 후보 안티센스 올리고머의 결합 특이성을 확인하기 위해서, 다양한 대조표준 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 센스, 논센스 또는 스크램블 안티센스 서열, 또는 미스매치 염기를 함유하는 서열과 같은 대조표준 올리고뉴클레오티드가 시험된다. 그러한 시험의 성과는 무차별적인 억제로부터 유전자 발현에 대한 안티센스 저해의 특이적 효과를 식별하는데 중요하다(예를 들어, Bennett 등, 1995). 따라서, 서열은 안티센스 올리고머와 비 -표적 서열의 의 비-특이적 결합을 제한할 필요에 따라 변형될 수 있다.
표적 RNA와 이형이중가닥을 형성하는데 있어 주어진 안티센스 올리고머 분자의 유효성이 본 분야에 공지된 스크리닝 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 올리고머가c-myc를 발현하는 세포 배양물과 인큐베이션되고, (1) 당업자에게 공지된 과정을 사용하여, 표적 서열 및 비-표적 서열과 형성된 이형이중가닥의 존재 또는 부재, (2) RT-PCR 또는 노던 블롯과 같은 표준 기술에 의해 측정된c-mycmRNA의 양, 또는 (3) ELISA 또는 웨스턴 블롯팅과 같은 표준 기술에 의해 측정된c-myc단백질의 양을 모니터링함으로써, 표적 RNA에 대한 효과가 평가된다(예를 들어, Pari 등, 1995: Anderson 등, 1996 참조).
본 발명의 방법에 사용되는 전형적인 안티센스 올리고머는 모르폴리노 올리고머(도 2A 내지 2D), 펩티드 핵산 및 메틸 포스포네이트 올리고머를 포함한다.
1. 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드
바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 하전되지 않은 백본을 갖는 뉴클레아제-내성 올리고머, 특히 선택된 mRNA 표적 서열의 영역에 상보하는 염기 서열에 더하여, 올리고머가 표적 RNA 및 올리고머에 있는 상보성 염기간의 Watson-Crick 염기쌍화에 의해 표적 RNA 서열과 결합할 수 있도록 올리고머의 뉴클레오티드 서브유니트 및 그것들간의 결합에 의해 규정되는 올리고머 백본을 가지는 모르폴리노 올리고머이다.
모르폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특징이, 미국 특허 번호 5,698, 685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337에 상세히 설명된다.
바람직한 올리고머는 상기 인용된 특허에서 나타낸 형태의 모르폴리노 서브유니트로 이루어지며, 이 경우 (i) 모르폴리노기는 한 서브유니트의 모르폴리노 질소와 인접 서브유니트의 5' 외향고리 탄소를 잇는 1- 내지 3-원자 길이의 실질적으로 하전되지 않은 결합에 의해 함께 연결되고, (ii) 모르폴리노기에 부착된 염기는 폴리뉴클레오티드에 있는 염기에 염기-특이적 수소결합에 의해 결합하는데 효과적인 푸린 또는 피리미딘 염기쌍화 부분이다. 푸린 또는 피리미딘 염기쌍화 부분은 전형적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티미딘이다. 그러한 올리고머의 제조는 미국 특허 번호 5,185,444(Summerton 및 Weller, 1993)에 상세히 설명된다. 여러가지 종류의 비이온성 결합이 모르폴리노 백본을 구성하는데 사용될 수 있다. 모르폴리노 올리고머는 비-특이적 안티센스 활성을 거의 나타내지 않으며, 양호한 수용성을 제공하고, 뉴클레아제에 대해 면역성이고, 제조 비용이 저렴하도록 디자인된다(Summerton 및 Weller, 1997b).
2. 펩티드 핵산(PNA)
자연발생 올리고뉴클레오티드에서 발견된 포스포디에스테르 백본이 효능있는 구조적 DNA 의태체에 비본질적이고 나선형 이중가닥 구조에조차 필요하지 않으며, 펩티드 또는 단백질 핵산(PNA)이 효과적인 DNA 의태체로서 기능할 수 있다는 것이 입증되었다(Nielsen, 1995).
PNA는 백본이 디옥시리보스 백본과 구조적으로 동형인 DNA의 유사체이다. 그것은 피리미딘 또는 푸린 염기가 부착된 N-(2-아미노에틸)글리신 유니트로 구성된다. 자연적 피리딘 및 푸린 염기를 함유하는 PNA는 Watson-Crick 염기쌍화 규칙에 따라서 상보성 올리고뉴클레오티드에 혼성화하고, 염기쌍 인식에 관하여 DNA를의태한다(Egholm 등, 199). PNA의 백본은 포스포디에스테르 결합보다는 펩티드 결합에 의해 형성되어 그것들을 안티센스 적용에 적합하게 만든다. 백본은 하전되지 않으며, 이로써 정상적인 열안정성보다 큰 열안정성을 나타내는 PNA/DNA 또는 PNA/ RNA 이중가닥을 가져온다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 인식되지 않는다. 그러나, PNA 안티센스 제제가 세포 배양물에서 느린 멤브레인 침투를 보이는 것이 관찰되는데, 아마 세포로의 불량한 업테이크(수송) 때문인 것 같다(예를 들어, Ardhammar M 등, 1999).
3. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드
메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 하전되지 않으며, 따라서 하전된 올리고뉴클레오티드에 비하여 증대된 세포 업테이크를 나타낼 것으로 예측된다(Blake 등, 1985). 그러나, 메틸포스포네이트 안티센스 올리고머는 시험관내에서 N-ras 발현을 저해할 수 없는 것으로 나타났다(Tidd 등, 1988). 반대로, 시험관내에서 몇가지 암유전자 mRNA의 번역은 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 성공적으로 차단되는 것으로 나타났다(c-myc: McManaway 등, 1990; Watson 등, 1991; bcl-2: Reed 등, 1990; myb: Calabrett 등, 1991; bcr-ab: Szczylik 등, 1991). 메틸포스포네이트 올리고머의 합성은 여러 단계가 필요하며, 이것은 임상적 적용에서 그러한 구조의 사용에 대한 실용성을 제한할 수 있다.
4. 바람직한 안티센스 올리고머
관심의 유전자의 관련 영역으로부터 전사된 mRNA가 일반적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화되지만, 어떤 경우에는 이중가닥 DNA가 이중가닥 DNA에 있는 주홈 부위에 서열 특이적으로 결합하도록 디자인된 비-이온성 프로브를 사용하여 표적화될 수 있다. 그러한 프로브 종류가 미국 특허 번호 5,166,315(Su-mmerton 및 Weller, 1992)에 설명되며, 일반적으로 본원에서 안티센스 올리고머로서 간주되어 표적 유전자의 발현을 차단하는 그것들의 능력이 언급된다.
본 발명의 방법에서, 안티센스 올리고머는 Tm이 실질적으로 37℃ 이상, 예를 들어 적어도 50℃, 바람직하게 60℃ 내지 80℃인 생리학적 조건하에서c-myc핵산 서열의 영역에 혼성화하도록 디자인된다. 올리고머는 이 핵산에 대해 높은 결합 친화성을 가지도록 디자인되며,c-myc표적 서열에 100% 상동성일 수 있거나, 또는 올리고머와c-myc표적 서열간에 형성된 이형이중가닥이 충분히 안정하여 세포에서 체액으로의 그것의 운반 동안 세포 뉴클레아제의 작용 및 다른 방식의 분해를 견디어내는 한, 예를 들어 대립형질 변이체를 수용하기 위한 미스매치를 포함할 수 있다. 만약 존재한다면 미스매치는 중앙에서보다 혼성체 듀플렉스의 말단 영역을 향해 보다 덜 불안정하다. 허용되는 미스매치의 수는 듀플렉스 안정성에 대한 잘 이해된 이론에 따라서, 올리고머의 길이, 듀플렉스의 G:C 염기쌍 퍼센트, 및 듀플렉스에서 미스매치(들) 위치에 의존할 것이다.
그러한 안티센스 올리고머가 필수적으로c-myc표적 서열에 100% 상보성이지는 않지만, 그것은c-myc의 발현이 조정되도록 표적 서열에 안정하게 특이적으로 결합하는데 효과적이다. 양호한 특이성과 조합된 안정하고 효과적인 결합을 허용하는 올리고머의 적합한 길이는 약 8 내지 40 뉴클레오티드 염기 유니트, 바람직하게 약 12 내지 25 뉴클레오티드이다. 표적과의 염기쌍 특이성이 유지된다는 가정하에, 표적 염기와의 축퇴성 염기쌍화를 허용하는 올리고머 염기도 또한 고려된다.
일반적으로, 본 발명의 안티센스 방법을 사용하여 유전자 발현이 조정되는 표적은c-myc의 mRNA 번역 시작 코돈을 포함하는 서열을 포함한다. 그러나, 어떤 경우에는, 개시인자 또는 프로모터 부위, 인트론 또는 엑손 정션 부위, 3'-미번역 영역, 및 5'-미번역 영역 중 하나 이상을 포함하여c-mycmRNA의 다른 영역이 표적화될 수 있다. 여기에 더하여, 스플라이스된 RNA 및 스플라이스 되지 않은 RNA 모두 본 발명의 방법에 사용되는 안티센스 올리고머의 디자인을 위한 주형으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 바람직한 안티센스 올리고머는 바람직하게, (1) 실질적으로 하전되지 않은 백본(예를 들어, Uhlmann 등, 1990), (2) 높은 친화성으로 표적 RNA의 상보성 서열과 혼성화하는 능력, 즉 실질적으로 37℃ 이상, 바람직하게 적어도 50℃, 전형적으로 60℃ 내지 80℃ 이상의 Tm, (3) 적어도 8 염기, 일반적으로 약 8 내지 40 염기, 바람직하게 12 내지 25 염기의 서브유니트 길이, (4) 뉴클레아제 내성(Hudziak 등, 1996), 및 (5) (i) 포스포로티오에이트 안티센스 올리고머와의 경쟁적 결합, 및/또는 (ii) 세포로 검출가능한 리포터를 수송하는 능력에 의해 증명된, 활발한 또는 용이해진 수송 능력을 포함하는 하나 이상의 특성을 가진다.
이 구체예의 한 바람직한 양태로서, 안티센스 올리고머는 SEQ ID NO:1로서 나타낸 서열을 포함한다.
B. c-myc
c-myc는 닭 레트로바이러스 MC29의 형질전환 유전자의 세포 상동물인 프로토 -암유전자이다.c-myc는 세포 성장, 분화, 및 세포자살을 조절하며, 그것의 이상 발현이 주로 사람 암에서 관찰된다.c-myc의 이상, 구성적 또는 과발현이 폐암, 결직장암, 유방암, 방광암, 백혈병, 폐암 등을 포함하는 많은 사람 암에 관련된다.
프로토-암유전자는 (1) 프로모터 삽입; (2) 인핸서 삽입, (3) 염색체 전위, (4) 유전자 증폭, 및 (5) 점돌연변이를 포함하는, 여러가지 메카니즘에 의해 암유전자로 활성화된다. 본원에 사용된 바와 같은, 프로토-암유전자에 관한 "활성화"는, 유전자의 전사가, 예를 들어 무발현에서 낮은 수준의 발현까지 증가된다는 것을 의미한다. (1) 내지 (4)의 메카니즘은 암유전자의 발현 수준의 증가를 가져오며, (5)는 변경된 유전자 생성물의 발현을 가져온다. 증거는 종양 억제 유전자의 불활성화와 함께 어떤 형태의 암유전자 발현이 암의 발달에 필요하다는 것을 암시한다.
myc프로토-암유전자는 다른 유전자들의 발현을 직접적으로 조절하는 전사 인자로서 설명되며, 이것의 예는 ECA39, p53, 오르티닌 디카르복실라제(ODC), 알파-프로티모신 및 Cdc25A를 포함한다(Ben-Yosef 등, 1998).
닭에서, 어떤 조류 백혈병 바이러스로 닭 B-세포를 감염시키면, 프로바이러스는 가까운myc유전자에 통합되고, 이것은 프로모터 또는 인핸서로 작용하는 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR)에 의해 활성화되어myc의 발현 및 B-세포 종양의 형성을 가져온다(Murray 등, 1996). 유사하게, 버킷 림프종에서는 인핸서 서열이 전위되어myc의 발현을 가져온다.
c-myc는 정상 조혈간세포에서 발현되고, 사람 상피간세포의 분화를 촉진한다고 알려져 있다(Gandarillas A. 및 Watt F.M. Genes Dev 11(21):2869-2882,1997). 여기에 더하여,c-myc는 수많은 암에서 과발현되거나 또는 이상 발현되는 것으로 나타났다(예를 들어, Bieche I. 등, Cancer Res 59(12):2759-65, 1999). 휴지 세포가 세포 사이클에 재진입하는 때c-myc발현이 상향조절되며,c-myc의 이소성 발현이 성장-억제 신호, 분화 자극, 또는 미토겐 금단에 반응하는 세포 사이클 정지를 방지한다는 것이 관찰되었다(예를 들어, Amati B. 등, Front Biosci 3:D250-68, 1998). 더 이상으로, 세포자살 저해인자인bcl-2의 발현은 직결장 암세포에서의c-myc발현과 역으로 서로 관련된다(예를 들어, Popescu R. A. 등, 1998; Peters R 등, 1998).
c-myc안티센스 포스포로티오에이트 올리고머를 사용하여c-myc과발현 백혈병 및 결장암 셀라인을 처리했을 때, 세포 증식의 저해에 더하여, 20 내지 100배 감소된c-mycmRNA가 경쟁적 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 사용하여 결장암 셀라인 및 백혈병 셀라인에서 각각 검출되었다(Li 등, 1995).
c-myc에 대한 포스포르디아미데이트 올리고머 안티센스가 RNA 수준에서 작용하여, 정상 pre-mRNA 스플라이싱을 저해하고 서열 특이적 방식으로 이상 스플라이싱된 mRNA를 생성한다는 것이 입증되었다(Hudziak R. M. 등, 2000).
놀랍게도,c-myc의 안티센스 올리고머를 사용하여 부화된 조혈간세포 집단을 처리했을 때, 본 발명자들은 조혈간세포 집단의 발달이 조정되었다는 것을 발견했다. 요약해서, 다능성 조혈간세포의 집단은c-myc를 코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 시작 코돈을 포함하는 영역에 관련된 안티센스 올리고뉴클레오티드에의 노출에 의해 유지 및 확장될 수 있다. 또한, 그러한 확장된 조혈간세포 집단은 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 확장된 집단을 가져오는데 효과적인 조건하에서 더 처리될 수 있다는 것이 발견되었다.
III. 조혈간세포 조성물
A. 조혈간세포를 얻는 방법
성인에서, 다능성 조혈간세포의 대부분은 골수에서 발견된다. 그러나, 작지만 의미 있는 수의 그러한 세포가 말초 순환, 간 및 비장에서 발견될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 조혈간세포는 사람 골수, 사람 신생아 제대혈, 태아의 간, 또는 적합한 가동화 후의 성인 사람 말초혈로부터 유도될 수 있다.
조혈간세포의 빈도는 피험자를 사이토카인을 포함하는 어떤 화합물로 치료함에 의해 극적으로 증가될 수 있다. 그러한 "가동화된" 말초혈 조혈간세포는 생착이 더 빠르기 때문에 주로 이식 과정에서 골수-유도 조혈간세포의 중요한 대안이 된다(예를 들어, Tanaka 등, 1999 참조). 그러한 가동화는, 예를 들어 과립구 콜로니-자극인자(G-CSF), 간세포인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 화학요법제(즉, 시클로포스파미드) 중 하나 이상을 사용하여 달성될 수 있다.
조혈간세포 분리를 위한 수많은 방법이 본 분야에 공지되어 있으며, 이것은 일반적으로 골수, 신생아 제대혈, 태아의 간 또는 성인 사람 말초혈로부터 조혈간세포를 얻는 것을 포함한다. 일단 얻어지면, 조혈간세포 집단은 밀도 구배 분리,패닝과 같은 기술에 의한 양성 및/또는 음성 선택을 사용한 면역친화성 정제, FACS 및 자기비드 분리 중 하나 이상을 수행함에 의해 부화된다. 그러한 부화 단계 후, 세포 집단은 표현형적으로 및 기능적으로 더 특성화된다.
이전의 연구는, 고증식 잠재성 콜로니 형성 세포(HPP-CFC, 시험관내)로서 특성화된 원시 조혈 세포가 밀도 구배-부화된 계통-고갈 골수 부분을 선택하고; DNA 결합 염료 Hoechst 33342 및 미토콘드리아 결합 염료 Rhodamine 123에 낮은 수준으로 결합하는 세포에 대한 단일 단계 형광-활성화 세포 선별기(FACS) 분류에 근거하여 세포 집단을 더 선택함에 의해 분리될 수 있다는 것을 입증했다(Wolf 등 1993). 최근에, HPP-CFC의 규정된 아집단이 이식가능하며, HPP-CFC를 발생시키는 세포의 아집단은 생체외에서 복제할 수 있는 LTR-HSC이라는 것이 알려졌다(Yagi 등 1999).
B. 조혈간세포 조성물의 특성화
조혈간세포는 자가-재생할 수 있을 뿐만 아니라, 어떤 조혈 계통의 딸세포를 생성하는 능력을 소유할 수 있는, 이식가능한 세포로서 역사상 정의되어 왔다. 계통-구속된 선조세포는 조혈간세포로부터 유도된 더 분화된 세포로서 정의된다.
조혈간세포를 특징짓는 표현형적 마커는 광범한 논쟁 및 수많은 간행물의 주제이다. 아직까지는, 마커들이 뮤린 또는 사람 조혈간세포에 대해 한정적이라는데 관해 일치하지 않고 있다.
본원에서 LTR-HSC는 CD34 항원의 발현에 대해 음성이고, CD117 항원의 발현에 대해 양성이며, DNA 결합 염료 Hoechst 33342(Ho-33342) 및 미토콘드리아 결합 염료 Rhodamine 123(Rh-123)의 낮은 수준 결합을 나타내는, 밀도 구배-부화된 계통-고갈 골수 세포에 대한 형광-활성화 세포 선별기(FACS) 선택을 사용하여 마우스에서 분리되어 특성화되었다(Wolf 등, 1993). 이 분리된 세포 집단은 이식가능하고, 미분류 골수 세포와 함께 이식되었을 때 치명적 방사선 조사된 레시피언트를 재분포시킬 수 있다는 것이 입증되었다.
STR-HSC 집단은 FACS 선별에 의해 선택될 수 있으며, 본원에서는 계통 마커의 발현이 결여되고(lin-), c-kit(CD117), Sca 1 및 CD34에 대해 양성이며, DNA 결합 염료 Hoechst 33342(Ho-33342)의 낮은 수준 결합 및 미토콘드리아 결합 염료 Rhodamine 123(Rh-123)의 높은 수준 결합을 나타내는, 저밀도 구배-부화된 골수 세포로서 표현형적으로 정의된다.
조혈간세포를 검출하고 특성화하는데 사용되는 기능적 해독은 세포 배양물(시험관내)에서 특정한 분석 조건하에 콜로니를 형성하는 능력을 포함한다. 전형적인 분석법은 장기적 배양 개시 세포(LTCIC) 분석(Pettengell R. 등, 1994) 및 고증식 잠재성 콜로니 형성 세포(HPP-CFC) 분석(Yagi 등, 1999)을 포함한다. 더 이상의 기능적 특성화는 상술된 바와 같은 장기적 재분포 조혈간세포(LTR-HSC) 및 단기적 재분포 조혈간세포(STR-HSC)에 대한 생체내 분석을 포함한다.
조혈간세포는 주로 상기 정의된 바와 같은 고증식 잠재성 콜로니 형성 세포 (HPP-CFC) 분석에서의 활성에 의해 기능적으로 특성화된다.
HPP-CFC는 (1) 세포독성 약물인 5-플루오로우라실을 사용한 생체내 처리에 대한 상대적 내성; (2) 치명적으로 방사선 조사된 마우스의 골수를 재분포시킬 수 있는 세포와의 높은 상관성; (3) 적합한 조건하에서 마크로파지, 과립구, 거핵세포및 적혈구 계통의 세포를 생성하는 능력; 및 (4) 다중인자 반응성에 의해 특성화된다(예를 들어, McNiece, 1990 참조).
본 발명의 방법에 사용되는 조혈간세포는 실시예 1에 설명된 바와 같이 부화된다. 또한, 세포는 실시예 2에 더 설명된 바와 같이 HPP-CFC 분석(시험관내) 및 LTR-HSC에 대한 분석(생체내)에서 기능적으로 특성화되었다.
조혈간세포의 배양을 위한 바람직한 사이토카인은 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-11(IL-11), 인터류킨-12(IL-12), 간세포인자(SCF), 예를 들어 WO 91/05795에 설명된 초기 작용 조혈 인자, 및 트롬보포이에틴(TPO) 중 하나 이상을 포함한다.
완전한 면역억제 후 뮤린 LTR-HSC를 사용한 장기적 복구는 덜 분화된 장기적 재분포 세포와 함께 미분류 골수 세포의 이식이 필요하다고 알려졌으며, 이로써 지속적이지는 않으나 초기 생착을 제공할 수 있고, 이것은 완전히 면역억제된 숙주가 장기적 재분포 세포가 충분히 분화하여 숙주를 재분포시킬 때까지 생존하도록 한다 (예를 들어, Jones 등, 1990 참조). LTR-HSC는 완전한 면역억제 후 숙주의 조혈 시스템을 효과적으로 재분포시키는데 수개월이 필요할 수 있다.
CD45.1로 정의된 CD45 유전자좌에 있는 유사 유전자형인 도너 조혈간세포 및 CD45.2로 정의된 레시피언트 조혈간세포를 사용하여, 뮤린 조혈 복구 연구에서 도너와 레시피언트의 세포를 구별하기 위한 방법이 개발되고 있으며, 이로써 단일클론 항체를 사용하여, 즉 FACS 분석 및/또는 선별에 의해 도너와 레시피언트 세포를 구별할 수 있다.
그러한 검출 방법에서, 레시피언트의 조혈 시스템을 재분포시키기에 충분한 정도로 CD45.1 도너 세포의 분화가 일어날 때까지 마우스를 살아있게 하기 위해 레시피언트에게 충분한 CD45.2 양성 골수 세포가 주입된다. 그러한 방법을 사용하여 LTR-HSC와 STR-HSC, 그리고 도너 세포와 레시피언트 세포를 구별할 수 있다(실시예 2).
일단 조혈간세포 집단이 얻어지면, 세포는 바로 사용되거나, 또는 액체 질소중에 냉동되어 표준 조건하에서 장기간 동안 저장될 수 있으며 그것들은 나중에 해동되어, 예를 들어 환자에게 투여하는데 사용될 수 있다. 세포는 보통 10% DMSO, 50% 태아소혈청(FCS), 및 40% 세포 배양 배지에 저장될 것이다.
IV. 본 발명의 방법 및 조성물
한 바람직한 양태로서, 본 발명은 부화된 HSC 집단을c-myc를 코드하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 시작 코돈을 포함하는 영역에 대하여 관련된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출함에 의해 다능성 조혈간세포(HSC) 집단을 유지 및 확장하는 방법 및 조성물을 제공한다.
한 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1로서 나타낸 서열을 가진다. 더 이상의 바람직한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 하전되지 않으며, 안정성, 높은 Tm, 및 (i) 포스포로티오에이트 안티센스 올리고머와의 경쟁적 결합 및/또는 (ii) 세포로 검출가능한 리포터를 수송하는 능력에 의해 증명된, 활발한 또는 용이해진 수송 능력에 의해 더 특성화된다.
조혈간세포는 생체외에서(시험관내에서)c-myc안티센스 올리고머에 노출될 수 있고, 및/또는c-myc안티센스 올리고머가 생체내에서 확장된 조혈간세포 집단을 가져오는데 효과적인 양으로 피험자에게 투여될 수 있다.
관련 양태로서, 조혈간세포는 확장된 조혈간세포 집단을 가져오는데 효과적인 양의c-myc안티센스 올리고머에 노출되고, 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 확장된 집단을 가져오는데 효과적인 조건하에서 더 처리된다.
A. 안티센스 올리고머에 세포 노출
본 발명은 높은 Tm, 활발한 또는 용이해진 세포로의 수송 능력, 및 상보성 또는 거의 상보성인c-myc핵산 서열에 높은 친화성으로 결합하는 능력에 의해 특성화된, 안정한 실질적으로 하전되지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드가 조혈간세포에 투여될 수 있으며, 시험관내에서 또는 피험자의 생체내에서 세포에서의c-myc발현을 저해하여, 그 결과 세포 발달을 조정한다는 발견을 토대로 한다.
많은 암 치료 섭생은 환자의 면역억제를 가져오며, 환자는 감염을 방어할 수 없게 된다. 면역억제에 대한 보조적 관리는, 환자가 감염성 제제에 노출되지 않도록 환자를 격리보호하는 것; 항체, 예를 들어 항바이러스제 및 항진균제의 투여; 및/또는 빈혈, 혈소판감소증(낮은 혈소판수), 또는 호중구감소증(낮은 호중구수)을 치료하기 위한 주기적 수혈을 포함할 수 있다.
말초혈 및/또는 골수로부터 유도된 조혈간세포의 이식이 점점 수많은 형태의 암을 포함하는 여러가지 장애의 치료를 위한 화학요법 및/또는 방사선요법과 조합하여 사용되고 있다. 그러한 이식물에서, 장기적 조혈 복구가 가능한 세포 퍼센트는 매우 낮으며, 따라서 조혈간세포의 정제 및 확장 기술을 개발할 필요가 있다.
조혈간세포로 부화된 세포 집단을 사용한 이식 치료법의 합병증은, 동종 이식편에서 이식편대숙주병(GVHD)을 초래하는 T-세포 및 질환의 재발을 일으킬 수 있는 자가 이식물에 있는 종양 세포를 포함하여, 이식물 레시피언트를 위태롭게 하는 이식물에 있는 세포의 제거를 포함한다.
또한, 현재의 조혈간세포로 부화된 세포 집단을 사용하는 이식 섭생 및/또는 골수 이식은 이식과 환자의 조혈 시스템의 재분포 사이의 과도한 경과 시간으로 고통받으며, 특히 환자는 주로 호중구 및 혈소판 결핍으로 고통받는다.
호중구는 감염에 대해 숙주를 방어하는데 연루된다. 화학요법 또는 방사선요법 후 빈번히 환자는 약 3 내지 4주 또는 더 긴 시간 동안 불충분한 호중구수로 고통받을 것이며, 그 결과 감염에 대한 감수성이 증가한다.
혈소판은 상처 부위에서 효과적인 혈액 응고에 필수적이다. 화학요법, 방사선요법, 조혈간세포로 부화된 세포 집단의 이식 또는 골수 이식 후 빈번히 환자는 약 4 내지 6주 또는 더 긴 시간 동안 불충분한 혈소판수로 고통받을 것이며, 그 결과 쉽게 멍이들고 과도한 출혈이 있게 된다.
B. 생체외에서 c-myc 안티센스 올리고머를 사용한 세포의 처리
본 발명은 조혈간세포를 상보성 또는 거의 상보성인c-myc서열에 높은 친화성으로 결합할 수 있는 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고머에 시험관내에서(생체외에서) 노출하고, 이어서 시험관내에서 조혈간세포의 발달을 조정하는 것을 포함한다. 그러한 처리는 조혈간세포 배양 조성물에 효과적으로 영향을 미칠 수 있다.
조혈간세포는c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드로 시험관내에서(생체외에서) 처리된 후, 피험자에게 투여될 수 있다. 피험자는 조혈간세포를 얻었던 개체와 동일(자가 이식)하거나 또는 다른 개체(동종 이식)일 수 있다. 동종 이식에서, 도너 및 레시피언트는 다른 한쪽에 대한 도너 및 레시피언트 세포의 면역 반응을 최소화하기 위해서 HLA 항원의 유사성을 근거로 매치된다.
한 양태로서, 본 발명은, HSC의 집단을 얻는 단계, 그것들을 상보성 또는 거의 상보성인c-myc서열에 대해 높은 친화성을 가지는 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고머에 생체외에서 노출하는 단계, 및 이어서 확장된 HSC 집단을 피험자에게 재주입하는 단계에 의해 조혈간세포의 발달을 변형시키는 방법을 지도한다.
본 발명의 방법에 사용되는 조혈간세포 집단은 피험자로부터 추출되어, 하나 이상의 사이토카인의 존재하에 생체외에서 정제 및 배양된다. 바람직한 사이토카인은 IL-3, IL-6, SCF 및 TPO를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 조혈간세포 집단은 사람 및 동종성, 또는 자가성 모두 바람직하다.
조혈간세포는 조혈간세포 이식이 필요한 환자로부터, 또는 동종의 도너로부터 얻어질 수 있다. 부화된 조혈간세포 집단은 시험관내에서 배양물중의 생존가능한 조혈간세포의 수를 증가시키는데 효과적인 조건하에서c-myc의 올리고머 안티센스에 노출된다.
한 접근법에서, 본 발명의 방법은c-myc안티센스 올리고머에 노출하기 전에 존재한 조혈간세포의 수보다 적어도 2배 이상인 조혈간세포 집단의 증가를 가져온다. 바람직하게, 본원에 설명된 방법을 사용하여c-myc안티센스 올리고머로 조혈간세포를 처리하는 것은c-myc안티센스 올리고머에 노출하기 전에 존재한 조혈간세포의 수에 비하여 적어도 4배 내지 8배 증가된 조혈간세포 집단을 가져온다. 더 바람직하게, 본원에 설명된 방법을 사용하여c-myc안티센스 올리고머로 조혈간세포를 처리하는 것은c-myc안티센스 올리고머에 노출하기 전에 존재한 조혈간세포의 수에 비하여 8배 이상 증가된 조혈간세포 집단을 가져온다.
일반적으로, 조혈간세포는, 조혈간세포 복제를 촉진하는데 효과적인 사이토카인 또는 성장인자와 함께c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배지에서, 조혈간세포의 분화 없이 조혈간세포 집단의 증가를 가져오기에 충분한 시간 동안 배양된다.
조혈간세포 복제를 촉진하는데 효과적인 사이토카인 또는 성장인자와 함께c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배지에 노출된 후, HSC의 수가 적어도 2배, 4배, 8배, 또는 8배 이상 증가하는데 필요한 배양 시간은 세포 공급원(조직 공급원 및 세포가 취해진 피험자의 건강을 포함함), 배양 조건, 부화된 집단의 HSC 퍼센트에 따라 변할 것이다.
본 발명이 2가지 관련 양태로서 (1) HSC 수가 증가한 세포 집단; 및 (2) 증가된 HSC 집단이 특정 계통에 구속된 선조세포로 분화된 세포 집단을 나타낸다는 것이 이해될 것이다. 더 긴 배양 시간은 특정 계통에 구속된 선조세포의 수가 증가한 세포 집단을 가져올 수 있으며, 이것은 HSC의 분화가 원래 HSC로 부화된 세포 집단의c-myc안티센스 처리에 의해 생성되기 때문이다. 이런 양태로서, 본 발명의c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드는 시험관내에서 증가된 조혈간세포 집단의분화에 의해 얻어진 다양한 계통으로 분화 및 구속된 선조세포의 수를 증가시키기 위한 방법에 유용하다. 다음에, 그러한 증가된 분화 및 구속된 선조세포 집단이 환자에게 재주입될 수 있다.
그러한 경우에, 조혈간세포는 특정한 종류의 세포 이식, 예를 들어 호중구, 혈소판, 림프구, 적혈구, 또는 단구의 이식이 필요한 환자로부터 얻어진다.
생체외에서 재주입된c-myc안티센스 올리고머-처리된 조혈간세포는, 화학요법 또는 방사선요법 후 환자의 순환에 있는 호중구 및 혈소판의 수를 빠르게 증가시키는 수단을 제공한다.
이런 양태로서, 부화된 HSC 집단이 얻어지고, 다음에 분화 없이 조혈간세포 복제를 촉진하는데 효과적인 하나 이상의 성장인자와 함께c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 배지에서 배양된다. 세포는 조혈간세포 집단의 증가를 가져오기에 충분한 시간 동안 배양된 후, 배양 배지로부터 안티센스 올리고머가 제거되고, 이어서 조혈간세포의 분화를 가져오는데 효과적인 조건하에서 배양된다. 인정되는 바와 같이, 조혈간세포의 분화에 의해 생성된 다양한 세포 계통의 증가는 배양 배지로부터 안티센스 올리고머의 제거 후 증가된 조혈간세포 집단으로부터 얻어진다. 특히, 다수의 호중구 및 혈소판이 이 과정을 사용하여 얻어질 수 있다.
C. 안티센스 올리고머의 생체내 투여
한 양태로서, 본 발명은 조혈간세포를 상보성 또는 거의 상보성인c-myc서열에 대해 높은 친화성을 가지는 안티센스 올리고머에 생체내에서 노출함에 의해 조혈간세포의 발달을 변형시키는 방법을 지도한다.
어떤 경우에, 피험자는, 예를 들어 화학요법 또는 방사선요법 후 조혈간세포 수의 증가가 필요하다.
본 방법의 한 전형적인 적용에서, 피험자에게c-myc안티센스 올리고머를 투여하는 것은, 예를 들어 화학요법 또는 방사선요법 후 피험자에서 조혈간세포 수의 증가를 가져온다.
이 구체예에서,c-myc안티센스 올리고머는 피험자에서 조혈간세포 수의 증가를 가져오는데 효과적인 방식으로 피험자에게 투여된다.
다른 경우에, 피험자는, 예를 들어 화학요법 또는 방사선요법 후 호중구 및/또는 혈소판과 같은 조혈간세포의 분화에 의해 생성된 구속된 선조세포 수의 증가가 필요하다.
이 구체예에서,c-myc안티센스 올리고머는 HSC의 분화 및 환자에서 호중구 및 혈소판 수의 상응하는 증가를 가져오는데 효과적인 방식으로 피험자에게 투여된다.
본원에 설명된 방법을 사용하여 피험자에게c-myc안티센스 올리고머를 생체내 투여하는 것은 조혈간세포 집단, 및/또는 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손 집단의 증가를 가져올 수 있으며, 이것은 (1)c-myc안티센스 투여 기간, 용량 및 빈도, 및 (2) 피험자의 일반적 상태를 포함하는 많은 인자들에 의존한다는 것이 이해될 것이다.
1. 환자의 치료
표적c-myc핵산 서열에 안티센스 올리고머의 효과적인 송달은 본 발명 방법의 중요한 양태이다. 본 발명에 따라서,c-myc에 올리고머 안티센스의 효과적인 송달은, 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 경구 및 비경구 경로, 예를 들어 정맥내, 피하, 복강내 및 근육내를 포함하는 다양한 전신적 경로 뿐만 아니라, 흡입 및 경피적 송달을 포함할 수 있다.
조혈간세포에c-myc안티센스 올리고머를 송달하거나, 또는 피험자의 혈류에 약물을 도입하는데 효과적인 어떤 방법이 또한 고려된다.
안티센스 올리고머의 경피적 송달은, 예를 들어 국부 투여에 적합하게 된 제약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 달성될 수 있다. 모르폴리노 올리고머 송달의 한 예가 PCT 특허 출원 WO 97/40854에 설명된다.
한 바람직한 구체예에서, 올리고머는 제약학적으로 허용되는 담체중에 함유된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)이며 경구적으로 송달된다. 이 구체예의 더 이상의 양태로서, 모르폴리노c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드는 단기간 동안 규칙적인 간격으로, 예를 들어 2주 이하 동안 매일 투여된다. 그러나, 어떤 경우에 안티센스 올리고머는 더 긴 기간에 걸쳐 간헐적으로 투여된다.
전형적으로, 1회 이상의 안티센스 올리고머 용량이, 일반적으로 약 1 내지 2주의 기간 동안 규칙적으로 투여된다. 경구 투여에 바람직한 용량은 약 1mg 올리고머/환자 내지 약 25mg 올리고머/환자이다(70kg의 성인 체중을 기준으로). 어떤 경우에, 25mg 올리고머/환자 이상의 용량이 필요할 수도 있다. 정맥내 투여에서, 바람직한 용량은 약 0.5mg 올리고머/환자 내지 약 10mg 올리고머/환자이다(70kg의 성인 체중을 기준으로).
안티센스 화합물은 일반적으로, 적어도 200 내지 400nMc-myc안티센스 올리고머의 최고 혈중농도를 가져오기에 충분한 양으로 투여된다.
일반적으로, 본 방법은c-myc핵산 표적 서열의 발현을 저해하는데 효과적인 양의 안티센스 제제를 적합한 제약학적 담체의 상태로 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 조성물은 생리적으로 허용되는 어떤 편리한 부형제의 상태로 투여될 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드 조성물은 당업자에 의해 사용되는 여러가지 생리적으로 허용되는 표준 담체 중 어느 것을 포함할 수 있다. 그러한 제약학적 담체의 예는, 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 식염수, 포스페이트 완충 식염수(PBS), 물, 수성 에탄올, 기름/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 트리글리세리드 에멀젼, 습윤제, 정제 및 캡슐을 포함한다. 적합한 생리적으로 허용되는 담체의 선택이 선택된 투여 방식에 따라 변할 것이라는게 이해될 것이다.
어떤 경우에, 리포솜이 세포로의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 업테이크를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Williams, 1996; Lappalainen 등, 1994; Uhlmann 등, 1990; Gregoriadis, 1979 참조). 또한, 예를 들어 WO 93/01286에 설명된 바와 같이, 히드로겔이 안티센스 올리고머 투여용 부형제로서 사용될 수 있다. 또는 달리, 올리고뉴클레오티드는 미소구 또는 미립자의 상태로 투여될 수 있다(예를 들어, Wu 및 Wu, 1987 참조).
또한, 지속적 방출 조성물이 본 출원의 범위내에서 고려된다. 이것들은 필름 또는 미세캡슐과 같은 모양을 한 물체의 형태로 반투과성 중합체 매트릭스를 포함할 수 있다.
본 방법의 바람직한 적용에서, 피험자는 사람 피험자이다. 또한, 피험자는 암환자, 특히 백혈병, 림프종, 신경간세포종, 유방암, 결장암, 폐암, 또는 다른 종류의 암으로 진단된 환자일 수 있고, 화학요법 또는 방사선요법으로 치료받는 중이거나 또는 치료받았던 환자이다. 또한, 본 방법은, 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 재생불량성 빈혈, 심한 복합 면역결핍, 겸상혈구성 빈혈, 지중해 빈혈 및 척수이형성 증후군을 포함하는 비-암성 조혈성 장애의 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드의 생체내에서 효과적인 용량은 투여 빈도 및 경로, 그리고 치료중인 피험자의 상태에 따라서 변할 것이라는게 이해될 것이다. 따라서, 그러한 생체내 치료법은 일반적으로, 치료될 상태를 적합한 시험에 의해 모니터링 하고, 최적의 치료적 성과를 달성하기 위해서 용량 또는 치료 섭생을 상응하게 맞추는 것이 필요할 것이다.
한 양태로서, 본 발명은 조혈간세포 집단을 증가시키는데 효과적인 조건하에서 조혈간세포를 본원에 설명된 안티센스 올리고머에 노출하고, 다음에 더 성숙한 표현형을 가지는 세포로 조혈간세포의 분화를 촉진하는데 효과적인 방식으로 증가된 조혈간세포 집단을 더 처리함에 의해, 단구, 과립구, 혈소판, 림프구 및 적혈구와 같은 증가된 조혈간세포 집단으로부터 유도된 더 분화된 세포의 증가된 집단을 생성하는 방법을 제공한다.
치료적 섭생은 피험자에게c-myc안티센스-처리된 HSC의 투여, 및/또는c-myc안티센스 올리고머의 직접 투여를 포함할 수 있다. 그러한 투여는 동시적 또는 연속적일 수 있다. 어떤 경우에, 환자는 화학요법, 방사선요법, 및 동일한 또는 유사한 상태로 진단된 개체를 치료하기 위해 당업자에 의해 전형적으로 사용되는 다른 제제 중 하나 이상으로 더 치료될 수 있다. 그러한 더 이상의 치료는, 환자에게c-myc안티센스-처리된 HSC의 투여 및/또는c-myc안티센스 올리고머의 직접 투여와 동시에, 이어서 또는 교대로 수행될 수 있다.
2. 치료 모니터링
본원에 설명된 방법을 수반하는 주어진 치료적 섭생의 효능은, 예를 들어 치료중인 피험자의 순환에 있는 세포의 표현형에 대한 종래의 FACS 분석에 의해 모니터될 수 있으며, 이로써 안티센스 치료에 반응하는 다양한 계통의 세포수의 변화가 모니터된다.
표현형적 분석은 일반적으로 분석될 세포 종류에 특이적인 단일클론 항체를 사용하여 수행된다. 그러한 표현형적 분석에서 단일클론 항체의 사용은 세포 분석을 위해 당업자에 의해 일상적으로 사용된다. 특정 세포 종류에 특이적인 단일클론 항제는 상업적으로 입수가능하다.
조혈간세포는 상기 상세히 설명된 바와 같이 표현형적으로 특성화된다. 그러한 표현형적 분석은 일반적으로, 관심의 각 특정 세포 종류, 예를 들어 (1) 조혈간세포(LTCIC, 조약돌 형성 분석, HPP-CFC 분석), (2) 과립구 또는 호중구(클론성 한천 또는 메틸 셀룰로스 분석, 여기에서 배지는 G-CSF 또는 GM-CSF를 함유한다), (3) 거핵세포(클론성 한천 또는 메틸 셀룰로스 분석, 여기에서 배지는 TPO, IL-3, IL-6 및 IL-11을 함유한다), 및 (4) 적혈구(클론성 한천 또는 메틸 셀룰로스 분석,여기에서 배지는 EPO 및 SCF 또는 EPO, SCF 및 IL-3를 함유한다)에 대한 생물학적 분석과 함께 수행된다.
그러한 표현형적 및 생물학적 분석의 정확한 성질은, 치료될 상태, 및 치료가 조혈간세포 집단 또는 특정 계통 또는 계통들의 세포 집단을 증대시키는 방향으로 나아가는지의 여부에 따라 변할 것이라는게 이해될 것이다.
피험자가 특정한 종류의 암으로 진단된 경우, 암의 상태가 또한 치료중인 암의 종류에 적합한 진단 기술을 사용하여 모니터된다.
안티센스 올리고머 치료 섭생은 상술된 표현형적 및 생물학적 분석 결과를 토대로 나타낸 바와 같이 적합하게(용량, 빈도, 경로 등) 될 수 있다.
V. 본 발명의 적용/유용성
본원에 설명된 바와 같이,c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 조혈간세포는 여러가지 적용에 유용하다. 예를 들어,c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드로 HSC를 처리하는 것은 시험관내에서 확장된 조혈간세포를 제공하며, 이것은 여러 목적을 위해 사용될 수 있다. 여기에 더하여, 적합한 조건하에서, 그러한 시험관내 확장된 조혈간세포 집단은 구속된 선조세포 및 그들의 자손, 예를 들어 호중구 및 혈소판의 생성을 위한 공급원으로서 사용된다.
생체외에서 확장된 세포 HSC 및 구속된 선조세포 집단은 환자에 투여되었을 때 자가 및 동종 조혈성 생착 모두에 유용하며, 이 경우 세포는 이상형성 세포를 가지지 않고, 이식편대숙주병을 피할 수 있다.
한 양태로서, 일단 추출되어 부화되면, 조혈간세포는 하나 이상의 사이토카인 및c-myc안티센스 올리고머의 존재하에 생체외에서 배양될 수 있다. 그러한 안티센스 올리고머-처리된 조혈간세포 배양물은, 이것들에 제한되는 것은 아니지만, (1) (a) 조혈간세포 보상 요법, (b) 자가면역질환 치료, (c) 동종 이식물에 대한 면역 반응 감소, 또는 (d) 환자의 HIV-감염 치료를 목적으로 피험자에게 생체내 투여하기 위한 조혈간세포 집단의 생체외 확장 또는 증식, 및 (2)c-myc발현에 관련된 암의 암세포 성장의 저해 또는 정지를 포함하여 여러가지 적용에 유용하다.
다른 양태로서, 일단 추출되어 부화되면, 조혈간세포는 특정 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 집단을 증가시키는데 충분한 시간 동안 하나 이상의 사이토카인 및c-myc안티센스 올리고머의 존재하에 생체외에서 배양될 수 있다. 이 과정이 생체외에서 수행된 후, (a) 세포 보상 요법, 및 (b) 백신접종 강화를 위해 피험자에게 생체내 투여될 수 있다.
자가 조혈간세포 이식은, 이것들에 제한되는 것은 아니지만, 유방암 및 난소암을 포함하는 많은 고형 종양을 치료하는데 사용된다. 조혈간세포 이식 전에, 환자는 존재하는 종양의 양을 감소시키기 위한 화학요법 섭생을 받을 수 있거나 또는 받지 않을 수 있으며, 일반적으로 (1) 골수 또는 말초혈로부터 환자의 조혈간세포의 수집; (2) 사이토카인의 존재하에 조혈간세포의 배양 또는 액체 질소중에 동결보존; (3) 정맥내로 고용량 화학요법제의 투여(대부분의 경우에); 및 (4) 화학요법제 투여가 완료된 후 환자의 조혈간세포의 재주입(정맥내); 및 (5) 조혈간세포의 분화 및 환자 조혈 시스템의 재분포를 촉진하기 위한 성장인자를 사용한 더 이상의 환자 치료가 이어진다. 일반적으로, 이 시간 동안 환자는 면역손상되며 격리보호가 필요하다.
동종 조혈간세포 이식은 백혈병, 재생불량성 빈혈, 림프종(호즈킨병 및 비-호즈킨 림프종), 및 면역결핍질환을 갖는 환자를 치료하는데 사용된다. 동종 조혈간세포 이식 프로토콜은 자가 이식에 사용된 것과 유사하지만, 동종 이식에서는 도너 및 레시피언트가 다른 한쪽에 대한 도너 및 레시피언트 세포의 면역 반응을 최소화하기 위해서 HLA 세포 표면 항원의 유사성을 근거로 매치되어야 한다.
이식 전에, 구속된 선조세포 및 그들의 자손과 함께 조혈간세포 집단을 증가시키는 것은 이식된 세포가 충분히 증식하여 레시피언트의 조혈 시스템을 재분포키는 동안의 경과 기간을 단축시킬 수 있다.
본 발명의c-myc안티센스 올리고머는, 골수 제거 전 조직에 있는 조혈간세포 집단을 증가시키기 위해서, 골수를 제거하기 전에 잠재적 골수 조혈간세포 도너를 처리하는데 사용될 수 있다.
관련 접근법으로, 본 발명의 방법은, 조직 조직적합성 항원이 없는 형태로 세포를 보유하기 위해서 세포 은행에 그것들을 보관하기 전에, 골수 또는 정제된 조혈간세포 집단을 본 발명의c-myc안티센스 올리고머에 노출하는데 사용될 수 있다.
본 방법의 한 전형적인 적용에서, 피험자는 암환자이고,c-myc안티센스 올리고머를 사용한 환자의 조혈간세포의 처리는 암세포의 성장을 저해 또는 정지시키기 위해 사용되며, 여기에서 암은c-myc발현에 관련된다. 일단 세포가c-myc안티센스 올리고머로 처리되면, 세포는 (1) 환자에게 직접 주입될 수 있고, 및/또는(2) 조혈간세포의 분화를 가져오는데 효과적인 조건하에서 배양되어 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 확장된 집단을 생성하고, 다음에 이것이 환자에게 주입될 수 있다.
환자에게 재주입하기 전에, 시험관내 배양 기간 및c-myc안티센스에 노출하는 시간은 변화될 수 있으며, 그 결과 조혈간세포와 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 비율이 달라진다는 것이 이해될 것이다.
어떤 경우에, 암의 치료를 위한 조혈간세포의 그러한 생체외c-myc안티센스 올리고머 처리를 수반하는 치료적 섭생은 방사선요법 및/또는 화학요법과 같은 추가적 개입을 더 포함할 수 있다. 이 치료는c-myc안티센스-처리된 세포의 재주입 전에, 동안에, 또는 이어서 일어날 수 있다.
1. 이식편대숙주병(GVHD)
c-myc안티센스 올리고머를 사용한 이식물 레시피언트 자신의 골수 또는 조혈간세포(예를 들어, 화학요법 또는 방사선요법을 시작하기 전에 환자로부터 추출된 골수)의 처리는, 이식 후 GVHD에 대한 잠재성을 최소화함으로써 현행 방법의 전형인 면역 억제에 대한 필요성을 피하기 위해 사용될 수 있다.
또한,c-myc안티센스 올리고머는 GVHD를 최소화하기 위해 조직 및 기관 도너 뿐만 아니라 이식물 레시피언트를 치료하는데 사용될 수 있다.
GVHD는 빈번한 동종 이식 합병증이다. 동종 골수 이식물을 받은 환자 중 약 반에서 어떤 GVHD가 발생하고, 이것은 일반적으로 경미하지만, 그 상태는 생명을 위협할 수도 있다. GVHD에서, 도너의 세포는 레시피언트의 기관 및 조직을 공격한다. GVHD를 갖는 환자는 감염에 대한 감수성이 증가되며, 피부, 간, 및 위장관이 GVHD의 공격을 받을 수 있다.
GVHD는 사람 백혈구 항원(HLA)의 차이를 근거로 환자의 세포를 이질적인 것으로 인식하는 T-세포에 기인한다. 도너 및 레시피언트가 유사한 HLA 종류를 가질때 조차도, 많은 부차적인 마커는 도너 및 레시피언트가 동일한 쌍동이일때를 제외하고는 그들 사이에서 상이하다. 따라서, 이식편대숙주병(GVHD)은 잠재적인 문제이며, GVH 반응을 최소화하기 위한 치료가 대부분의 이식에서 치료적 섭생의 일부이다.
조혈간세포 이식의 경우에, 그러한 치료는 일반적으로, 조혈간세포 부화와 조합된 또는 단독 T-세포 고갈, 및 GVHD의 예방을 위한 약물 치료법을 포함한다. GVHD을 위한 전형적인 약물 치료법은 시클로스포린(면역억제성 약물)을 단독으로 투여하거나, 또는 메토트렉세이트와 함께 투여하는 것이다.
한 양태로서, 본 발명은c-myc안티센스-처리된 조혈간세포 집단을 제공하며, 이로써 동종 숙주로의 조혈간세포의 이식은 GVHD를 초래하지 않을 것 같다.
관련 양태로서, 본 발명은c-myc안티센스-처리된 조혈간세포 집단으로부터 유도된 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 집단을 제공하며, 이로써 동종 숙주로의 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 이식은 GVHD를 초래하지 않을 것 같다. 메카니즘은 본 발명의 일부는 아니지만, 그러한c-myc안티센스-처리된 조혈간세포는 자기 및 비-자기 항원에 대한 면역학적 기억이 결여될 것으로 기대되며, 이로써 GVHD의 가능성을 최소화한다. 그러한c-myc안티센스 올리고머-처리된 세포는 동종 이식에 사용되어 이식편대숙주병(GVHD)를 최소화하거나 또는 제거할 수 있다.
본 발명의 방법은, 배양 기간 및c-myc안티센스 올리고머에 조혈간세포의 노출 기간을 토대로, 증가된 수의 조혈간세포를 단독으로 또는 증가된 수의 계통-구속된 선조세포 및 그들의 자손과 함께 생성하는데 사용될 수 있다.
조혈간세포, 계통-구속된 선조세포 및 그들의 자손, 조직, 또는 기관이 이식되는 경우에,c-myc안티센스 올리고머는 또한 레시피언트에게 투여되어, 이식된 조혈간세포, 계통 구속적 선조세포 및 그들의 자손, 조직, 및 기관에 대한 면역 반응을 더 최소화할 수 있다.
본 발명은, 예를 들어 자가 조혈간세포 이식에 사용하기 위해 계통 오염 없이 그러한 세포의 다계통 잠재력을 보존하고 있는 레시피언트 자신의 조혈간세포 집단을 시험관내에서(생체외에서) 확장하는데 사용될 수 있다.
2. 자가면역질환
조혈간세포가 분화함에 따라, 그것들은 숙주의 세포 및 조직에 존재하는 다양한 항원에 노출되고, 면역학적 내성이 흉선내에서 T-세포가 발생하는 동안 수립된다. 일반적으로, 숙주 단백질과 반응하는 T-세포는 생존하지 못한다. 그러나, 어떤 경우에, 면역 시스템은 자기 항원을 이질적인 것으로 인식할 수 있으며, 그 결과 하나 이상의 내인성 항원에 대한 면역 반응을 초래하여 자가면역상태 또는 질환을 가져온다.
자가면역상태의 예는 기관 특이적 형태, 및 비-특이적 형태를 포함하며, 기관 특이적 형태에서 면역 반응은, 예를 들어 부신 세포에 대해 관련되어 에디슨병을 일으키거나, 갑상선에 대해 관련되어 자가면역 갑상선염(하시모토병)을 일으키거나, 또는 췌장의 랑게르한스섬 베타 세포에 대해 관련되어 인슐린-의존성 당뇨병을 초래하고; 비-특이적 형태에서 면역 반응은, 도처에 존재하는 항원에 대해 관련되어(예를 들어, DNA에 대한 면역 반응), 전신성 질환인 홍반성 루프스를 초래한다. 더 이상의 예는, 타액관에 대한 자가-항체의 생성에 기인하는 쇼그렌 증후군, 류마티스성 관절염을 포함한다. 자가면역은 항체, T-세포, 또는 두가지 모두에 의한 공격의 결과일 수 있다.
본 발명은 자가면역질환의 치료를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 그러한 방법에서, 조혈간세포가 환자로부터 얻어지고, 이어서 화학요법, 방사선요법 또는 환자에게서 잔존 T-세포를 고갈시키는 다른 수단으로 환자를 치료할 수 있다. 다음에, 환자의 조혈간세포 또는 동종 도너로부터의 조혈간세포가 시험관내에서 생존가능한 조혈간세포 수를 증가시키는데 효과적인 조건하에서c-myc안티센스 올리고머에 생체외에서 노출되고, 다음에 이것이 환자에게 주입된다. 확장된 조혈간세포 집단은 숙주 항원 레퍼터리의 존재하에 발생하기 때문에, 새롭게 발생된 T-세포는 숙주 항원을 이질적인 것으로서 인식해서는 않되며 자가면역 반응이 일어나서도 않된다.
시험관내에서c-myc안티센스-처리된 조혈간세포는 자기 항원에 대한 면역학적 기억이 결여되며, 이로써c-myc처리된 조혈간세포 또는 그것으로부터 유도된 계통-구속된 선조 및 자손 세포의 이식이 자가면역질환을 갖는 환자의 치료를 위한 이식 섭생에 사용되어 자가면역상태를 최소화 또는 제거할 수 있다.
본 발명의 방법은, 배양 기간 및c-myc안티센스 올리고머에 조혈간세포의 노출 기간을 토대로, 증가된 수의 조혈간세포를 단독으로 또는 증가된 수의 계통-구속적 선조세포 및 그들의 자손과 함께 생성하는데 사용될 수 있다.
이 구체예의 관련 양태로서, 자가면역질환을 가지는 환자는c-myc안티센스 올리고뉴클레오티드의 생체내 투여에 의해 치료될 수 있다. 그러한 생체내 투여는 단독으로, 또는c-myc안티센스 올리고머-처리된 HSC 및/또는 계통-구속된 선조세포 및 그들 자손의 생체외 투여와 함께 수행될 수 있다.
그러한 자가면역질환 치료 섭생이 환자의 치료적 성과를 최적화할 필요에 따라 추가의 치료 구성요소를 더 포함할 것이라는게 이해될 것이다. 그러한 추가의 치료 구성요소는 자가면역질환의 치료에 대해 본 분야에 공지된 조성물 및 과정을 포함한다.
3. 조직 및 기관 이식
관련 접근법에서, 본 발명의c-myc안티센스 올리고머-처리된 HSC 조성물은 기관 또는 조직 이식물에 대한 레시피언트의 반응을 조정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 이 양태로서, 본 발명의c-myc안티센스 올리고머가 도네이션 과정 전에 기관 및/또는 조직 이식물 레시피언트에게 투여되어, 이식 후 면역 반응 및 결과의 조직 거부를 감소시킨다.
이것은 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 바와 같이, 이식 과정에 적합한 조건하에서 시험관내에서 T-세포를 고갈시키는데 효과적인 방식으로 이식되는 조직 또는 기관을 처리함으로써 달성될 수 있다. 그러한 시험관내 처리는, GVHD를 최소화 또는 제거하는데 효과적인 방식으로, 그러한 이식 전에, 이식 동안, 및 이식 후 제한된 시간 동안 환자에게c-myc안티센스 올리고머를 투여하는 것과 함께 수행될 수 있다.
4. 백신에 대한 면역 반응의 강화
더 이상의 구체예에서, 본 발명은 백신에 대한 반응을 강화하는 방법 및 조성물을 제공한다. 그러한 방법에서,c-myc안티센스 올리고머가 백신 투여 전에 또는 백신 투여와 동시에 피험자에게 투여되고, 이로써 백신에 존재하는 면역원에 대한 더 큰 면역 반응을 가져온다.
다음의 실시예들은 본 발명을 예시하며, 어떤 식으로도 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
시험관내에서 LTR-HSC에 대한 c-myc 안티센스의 효과
뮤린 조혈간세포를 미분류 골수에서 시작하는 골수로부터 얻어서 1.080g/ml Nycodenz 분리 배지(Nycomed Pharma AS OSLO, 노르웨이)를 사용하여 밀도 분리를 수행하고, 이어서 계통-특이적 단일클론 항체를 사용하는 Dynal Bead 고갈을 사용하여 lin- 세포 집단을 분리한 후, (1) c-kit 및 Sca 1에 대한 항체; (2) 프로피듐 요디드; 및 (3) 염료들인 Hoescht 33342, Rhodamine 123 및 프로피디늄 요디드(PI)로 염색하고, 다음에 (A) Sca 1+, c-kit+, lin-, Hoescht 33342 low(Holow), Rhoda-mine 123 low(Rhlow) 및 PI 음성 세포(LTR-HSC), 또는 (B) Sca 1+, c-kit+, lin- 세포(STR-HSC)에 대해 선택함으로써, FACS를 사용하여 세포를 선별했다.
A. IL-6 및 SCF +/- 안티센스 올리고머를 함유하는 배지에서 HSC의 배양
Sca 1+, c-kit+ 및 lin-로서 특성화된 STR-HSC로 부화된 25 세포를 배지에서 직접 선별하고, (1) 안티센스 올리고머 없이, (2) SEQ ID NO:2로서 나타낸 서열을 가지는 스크램블c-myc안티센스 올리고머 25μM과 함께, 또는 (3) SEQ ID NO:1로서 나타낸 서열을 가지는 모르폴리노 포스포로아미데이트c-myc안티센스 올리고머 1, 5, 25, 또는 125μM과 함께, IL-6 및 SCF의 존재하에 3일간 배양했다. 3일 후, 세포를 계수하고, 한천에 평판하고, 다음에 표준 HPP-CFC 분석법으로 0일 및 3일째에 HPP에 대해 평가했다(표 1 및 도 3 참조).
결과는 IL-6 + SCF + 125μMc-myc안티센스 존재하에서 배양한지 3일 후, 전체 세포 생성(세포탄생-세포사)은 정지되고, HPP-CFC는 "보존되거나" 또는 확장된다는 것을 나타낸다(IL-6 + SCF + 125μMc-myc안티센스의 존재하에 배양된 세포에 대해 대략 33 HPP 대 IL-6 + SCF 만의 존재하에 배양된 세포에 대해 대략 3 HPP).
B. 단일 HSC는 25μM c-myc 안티센스에 의해 유도된 증식 저해를 벗어난다
단일 고도 정제된 STR- 또는 LTR-HSC를 IL-3 + IL-6 + SCF 만을, 또는 IL-3 + IL-6 + SCF 및 25μM의 SEQ ID NO:1로서 나타낸 서열을 가지는 모르폴리노 포스포로아미데이트c-myc안티센스 올리고머 또는 SEQ ID NO:2로서 나타낸 서열을 가지는 스크램블c-myc안티센스 올리고머가 있는 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에서 직접 선별했다.
결과는 단일 세포로서 배양되었을 때, STR- 및 LTR-HSC 모두 그것들의 클론 크기가 계속 증가한다는 것을 나타낸다.
C. 안티센스 c-myc 는 생체외에서 2차 - 4차 세포분열 동안 LTR-HSC 딸세포의 자가-복제를 매개한다
더 이상의 실험에서, 단일 정제된 LTR-HSC(lin-, c-kit+, Hoescht low(Holow) 및 Rhodamine low(Rhlow)를 특징으로 함)를 25μM 안티센스 올리고머가 있거나 또는 없는 IL-3, IL-6 및 간세포인자(SCF)가 있는 배지를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에서 직접 선별하고 6일간 배양했다. 6일째에 웰(클론) 당 세포수를 측정하고 한천으로 옮겨서 HPP-CFC에 대해 분석했다(즉, 다음에 개개의 딸세포의 증식 잠재성을 측정할 수 있다).
결과는 4-세포 단계에서 8-세포 단계 동안, 처리된 배양물과 처리되지 않은 배양물 사이에서 HPP-CFC의 차이가 검출되지 않았음을 나타낸다. 그러나, 4-세포 단계에서 대략 32-세포 단계 동안은, 배양 배지에 있는 25μMc-myc안티센스 올리고머의 존재가c-myc안티센스 스크램블 또는 성장 인자만으로 처리된 배양물과 비교하여 클론 당 HPP-CFC의 수를 두배로 만들었으며, 이것은c-myc발현의 감소가 HSC의 자가-복제를 매개한다는 것을 암시한다.
실시예 2
조혈작용에 대한 생체내 투여된 c-myc 안티센스(AS)의 효과
A. c-myc 안티센스 올리고머로 7일간 처리된 마우스
SEQ ID NO:1로서 나타낸 서열을 가지는 모르폴리노 포스포로아미데이트c-myc안티센스 올리고머를 다양한 양으로 7일간 매일 마우스에게 복강내(IP) 주사했다. 말초혈 샘플을 마우스로부터 취하고, 7, 21 및 28일에 분석했다. 도 4A 내지4D는 마우스의 말초혈에서 검출된 적혈구(A), 과립구(B), 림프구(C), 및 백혈구(D)의 수를 나타낸다.
결과는 21 내지 28일간 마우스에게 100㎍c-myc안티센스의 투여가 7일째에 말초혈에 있는 과립구(B) 및 백혈구(D)의 분명한 감소에 이어서 21 및 28일째에는 증가를 행했고, 한편 효과의 크기는 100 내지 300㎍ 모르폴리노 포스포로아미데이트c-myc안티센스 올리고머에서 최대였다는 것을 나타낸다. 말초혈에 있는 적혈구(A) 또는 림프구(B) 수에 대한 최소한의 효과가 처리 후 관찰되었다.
B. c-myc 안티센스 올리고머로 2 또는 9일 처리된 마우스
SEQ ID NO:1으로 나타낸 서열을 가지는 모르폴리노 포스포로아미데이트 100㎍을 2일 또는 11일간 매일 복강내(IP) 주사했다. 마우스의 골수 구획을 11일째에 평가했다. 그 결과는 골수의 c-kit+(CD117 또는 조혈간세포) 성분이 100㎍c-myc안티센스 올리고머로 처리된 동물에서 증가했고, 2일간 처리도 11일간 처리와 동일하게 효과적이었음을 나타낸다.

Claims (23)

  1. 조혈간세포(HSC) 조성물의 제조 방법으로서, 이 방법이
    (a) 피험자로부터 HSC-함유 세포 집단을 얻는 단계;
    (b) 세포 집단을 HSC로 부화시키는데 효과적인 방식으로 세포 집단을 처리하는 단계; 및
    (c) 그러한 집단의 조혈간세포 수를 적어도 2배 증가시키는데 충분한 올리고머 농도에서 충분한 시간 동안 부화된 HSC 집단을c-myc안티센스 올리고머에 생체외에서 노출하는 단계
    를 포함하며, 여기에서 상기 HSC가 계통 마커의 발현이 결여되고(lin-), c-kit(CD117)의 세포 표면 발현에 대해 양성이며, Sca 1의 세포 표면 발현에 대해 양성으로서 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 노출이 상기c-myc안티센스 올리고머로 처리하기 전에 상기 세포 집단에 존재한 HSC의 수에 비하여 그러한 집단의 조혈간세포 수를 적어도 4배 증가시키는데 충분한 안티센스 올리고머 농도에서 충분한 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, HSC-함유 세포 집단이 사람 골수로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, HSC-함유 세포 집단이 가동화된 사람 말초혈로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, HSC-함유 세포 집단이 사람 암환자로부터 얻어지고, 상기 노출이 상기c-myc안티센스 올리고머로 처리하기 전에 상기 부화된 HSC 집단에 존재한 암세포의 수에 비하여 상기 확장된 HSC 집단의 생존가능한 암세포 수를 감소시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, HSC-함유 세포 집단이 림프종 또는 백혈병을 갖는 환자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가 약 12 내지 25 염기 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가
    (a) 실질적으로 하전되지 않은 백본;
    (b) 50℃ 이상의 Tm에서 높은 친화성으로 표적 RNA의 상보성 서열과 혼성화하는 능력;
    (c) 뉴클레아제 내성; 및
    (d) 활발한 또는 용이해진 세포로의 수송 능력
    에 의해 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머 백본이 도 2A-A에서 도 2E-E에 나타낸 구조로 구성되는 군으로부터 선택된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가 SEQ ID NO:1로 확인된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. (a) 피험자로부터 HSC-함유 세포 집단을 얻는 과정;
    (b) 세포 집단을 HSC로 부화시키는데 효과적인 방식으로 세포 집단을 처리하는 과정; 및
    (c) 상기c-myc안티센스 올리고머로 처리하기 전에 존재한 HSC의 수에 비하여 그러한 집단의 조혈간세포 수를 적어도 2배 증가시키는데 충분한 올리고머 농도에서 충분한 시간 동안 부화된 HSC 집단을c-myc안티센스 올리고머에 생체외에서 노출하는 과정
    에 의해 제조된 조혈간세포(HSC) 조성물로서, 여기에서 상기 HSC가 계통 마커의 발현이 결여되고(lin-), c-kit(CD117)의 세포 표면 발현에 대해 양성이며, Sca 1의 세포 표면 발현에 대해 양성으로서 특성화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가 약 12 내지 25개의 염기의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가
    (a) 실질적으로 하전되지 않은 백본;
    (b) 50℃ 이상의 Tm에서 높은 친화성으로 표적 RNA의 상보성 서열과 혼성화하는 능력;
    (c) 뉴클레아제 내성; 및
    (d) 활발한 또는 용이해진 세포로의 수송 능력
    에 의해 특성화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머 백본이 도 2A-A에서 도 2E-E에 나타낸 구조로 구성되는 군으로부터 선택된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 11 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가 SEQ ID NO:1로 확인된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 피험자의 암을 치료하는데 있어 약제로서 사용되는 제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따르는 조성물.
  17. 암환자에c-myc안티센스 올리고머-처리된 조혈간세포(HSC) 조성물을 송달하는 방법으로서, 이 방법이
    (a) 상기 환자로부터 HSC-함유 세포 집단을 얻는 단계;
    (b) 세포 집단을 HSC로 부화시키는데 효과적인 방식으로 세포 집단을 처리하는 단계;
    (c) 상기c-myc안티센스 올리고머로 처리하기 전에 존재한 HSC의 수에 비하여 그러한 집단의 조혈간세포 수를 적어도 2배 증가시키는데 충분한 올리고머 농도에서 충분한 시간 동안 부화된 HSC 집단을c-myc안티센스 올리고머에 생체외에서 노출하는 단계; 및
    (d) 상기c-myc안티센스 올리고머-처리된 조혈간세포 조성물을 환자에게 도입하는 단계
    를 포함하고, 여기에서 상기 HSC가 계통 마커의 발현이 결여되고(lin-), c-kit(CD 117)의 세포 표면 발현에 대해 양성이며, Sca 1의 세포 표면 발현에 대해 양성으로서 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 노출이 상기c-myc안티센스 올리고머로 처리하기 전에 상기 세포 집단에 존재한 HSC의 수에 비하여 그러한 집단의 조혈간세포 수를적어도 4배 증가시키는데 충분한 안티센스 올리고머 농도에서 충분한 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 노출이 상기c-myc안티센스 올리고머로 처리하기 전에 존재한 생존가능한 암세포의 수에 비하여 그러한 집단의 생존가능한 암세포 수를 감소시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가 약 12 내지 25개의 염기의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가
    (a) 실질적으로 하전되지 않은 백본;
    (b) 50℃ 이상의 Tm에서 높은 친화성으로 표적 RNA의 상보성 서열과 혼성화하는 능력;
    (c) 뉴클레아제 내성; 및
    (d) 활발한 또는 용이해진 세포로의 수송 능력
    에 의해 특성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 17 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머 백본이 도 2A-A에서 도 2E-E에 나타낸 구조로 구성되는 군으로부터 선택된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 17 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머가 SEQ ID NO:1로 확인된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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