ES2319332T3 - Uso terapeutico de oligonucleotidos antisentido tgf-beta 2'. - Google Patents

Abstract

Uso de al menos un oligonucleótido con una longitud de 8 a 30 bloques de construcción nucleotídicos para fabricar una preparación farmacéutica para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades seleccionadas entre el grupo de cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso e inmunosupresión, en el que dicho oligonucleótido hibrida con un ARN mensajero de un TGF-beta 2 y en el que dicha preparación comprende dicho oligonucleótido en una concentración de 1 microM a 25 microM para la administración a un caudal de 2 microl/min. a 10 microl/min. durante 4 a 14 días.

Description

Uso terapéutico de oligonucleótidos antisentido TGF-beta 2.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades que están moduladas por TGF-beta 2.

Introducción

Una característica global de las sustancias farmacéuticas es su eficacia creciente acompañada por un aumento en las cantidades que se administran. Las sustancias particulares usadas en la terapia tumoral muestran una fuerte correlación entre la cantidad total administrada y la inhibición del crecimiento tumoral.

Además, la captación celular es un factor limitante de la eficacia de la administración "in vivo" de oligonucleótidos, en la que se administran convencionalmente concentraciones elevadas y cantidades elevadas de oligonucleótidos para inhibir la producción de la proteína respectiva.

No obstante, el éxito clínico de estas sustancias está limitada ya que un aumento en la concentración y la cantidad total de estas sustancias, que pueden administrarse a un mamífero que padece metástasis tumoral, enfermedad nerviosa e inmunosupresión, está correlacionada con un fuerte aumento en los efectos secundarios graves y la toxicidad.

Hasta ahora, para la terapia del cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso e inmunosupresión no hay resultados de ensayos clínicos que den evidencias de la cantidad de oligonucleótidos que es satisfactoria en terapia tumoral.

Los documentos EP 1008 649 y EP 0695354 muestran que pueden usarse oligonucleótidos que hibridan con el ARNm de TGF-beta 1 y/o TGF-beta 2 para fabricar composiciones farmacéuticas. El documento EP 1 089 764 muestra adicionalmente que pueden usarse inhibidores de sustancias que afectan negativamente al sistema inmune en combinación con oligonucleótidos que hibridan con el ARNm de TGF-beta, VEGF, interleuquina 10, y prostaglandina E2 y sus receptores respectivos para fabricar una composición farmacéutica también. Pero estas patentes ofrecen un amplio intervalo de concentraciones en que pueden administrarse los oligonucleótidos.

Los resultados de estudios toxicológicos en mamíferos mostraron que es posible administrar elevadas cantidades de oligonucleótidos para inhibir la producción de las dianas respectivas sin efectos secundarios toxicológicos (véanse los Ejemplos 1, 2, 3 y Schlingensiepen, R. y col., 2005). Por consiguiente, habría sido obvio administrar elevadas concentraciones y elevadas cantidades de oligonucleótidos para inhibir las dianas implicadas en la terapia del cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso e inmunosupresión.

Sumario de la invención

Sorprendentemente, se reconoció durante ensayos clínicos que, composiciones farmacéuticas que contienen al menos un oligonucleótido en concentración inferior y/o administrado con cantidades diarias inferiores inhibe el crecimiento tumoral más rápido y con menos síntomas durante el progreso de la enfermedad que concentraciones más elevadas y/o cantidades diarias más elevadas.

Además estas concentraciones o cantidades diarias eran de 10 a 50 veces inferiores que la concentración máxima ensayada en estudios toxicológicos sin efectos secundarios graves (véase también la figura 4).

El tema de la solicitud es de acuerdo con la reivindicación 1 y una composición de acuerdo con la reivindicación 1.

Figuras

La Figura 1 muestra la cantidad de pacientes de astrocitoma anaplásico con síntomas debidos al progreso de la enfermedad después del tratamiento con soluciones 10 microM y 80 microM (cloruro sódico al 0,9%) del oligonucleótido hibridado con el ARNm de TGF-beta 2, identificado en la lista de secuencias con la SEC ID Nº 5, administrado de forma intratumoral por suministro potenciado por convección CED a un caudal de 4 microl/min. Como puede observarse en la Figura 1, la cantidad de pacientes de astrocitoma anaplásico con síntomas debidos al progreso del tumor, así como el grado y gravedad de estos efectos después del tratamiento con la solución 10 microM de dicho oligonucleótido se redujo en comparación con los pacientes infundidos con la solución 80 microM de dicho oligonucleótido. Véanse más detalles en el Ejemplo 3. Los grados se definieron de acuerdo con la Escala de Toxicidad de los CTC del NCI Versión 2.0. Los SAE (= acontecimientos adversos graves) se definieron como cualquier suceso médico perjudicial como resultado de dicha dosis que, por ejemplo, provoca efectos amenazantes de la vida, requiere hospitalización del paciente, o prolongación de la hospitalización existente.

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

La Figura 2 muestra la reducción del tamaño del tumor durante un par de meses en cuatro pacientes de astrocitoma anaplásico tratados con una solución 10 microM (figura 2A, 2B, 2C) y 80 microM (figura 2D) (cloruro sódico al 0,9%, DAB7) del oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2, identificado en la lista de secuencias con la SEC ID Nº 5, administrado de forma intratumoral por suministro potenciado por convección. Para más detalles véase el Ejemplo 10. Los tres pacientes tratados con la solución 10 microM (figura 2A, 2B, 2C) mostraron una reducción del tamaño del tumor durante un periodo de aproximadamente 2 a 5 meses observado en el intervalo del 30% al 66%, mientras que el paciente tratado con 80 microM mostró un aumento en el crecimiento tumoral (Figura 2D). Para más detalles véase el ejemplo 10.

La Figura 3 representa oligonucleótidos preferidos, capaces de hibridar con el ARNm de dianas tales como TGF-beta 1 (SEC ID Nº 1 a 4), TGF-beta 2 (SEC ID Nº 5 a 8), TGF-beta 3 (SEC ID Nº 9 a 38), prostaglandina E2 (SEC ID Nº 39 a 49), VEGF (SEC ID Nº 50 a 56), interleuquina 10 (SEC ID Nº 57 a 76), c-jun (SEC ID Nº 78 a 83) y c-fos (SEC ID Nº 85 a 93).

La Figura 4 representan cualitativamente la eficacia y la toxicidad de oligonucleótidos correlacionadas con la concentración. El eje vertical muestra cualitativamente la toxicidad y la eficacia y el eje horizontal muestra la concentración del oligonucleótido. Puede observarse en la figura, que se alcanza un pico de eficacia a una concentración muy inferior que las concentraciones que muestran efectos tóxicos.

La Figura 5 representa la inhibición de la secreción de TGF-beta 2 por células A-172 tratadas con 5 microM, 10 microM, y 80 microM del oligonucleótido identificado con la SEC ID Nº 5 durante 7 días, mostrada en porcentaje del control no tratado (barra 1). La incubación de células A-172 con tres concentraciones diferentes de este oligonucleótido provocó una media de inhibición del 61,1% (5 microM, barra 2), 68,1% (10 microM, barra 3), y 56,2% (80 microM, barra 4). En conclusión, se descubrió que 10 microM del oligonucleótido identificado por la SEC ID Nº 5 era el mejor inhibidor de la expresión de TGF-beta 2 en comparación con 5 y 80 microM de este oligonucleótido. Se cuantificó TGF-beta 2 secretado por ELISA. Los resultados se toman a partir de cuatro experimentos independientes. Para más detalles véase el Ejemplo 12.

La Figura 6 muestra la proporción de pacientes que sobrevivieron frente al tiempo para tres grupos de tratamiento. En un grupo se administró la SEC ID Nº 5 en una concentración de 10 microM (línea continua) y 80 microM (línea discontinua). Los pacientes del grupo de control (línea de puntos) por otro lado recibieron quimioterapia convencional. Para más detalles véase el ejemplo 11. Los pacientes que aún estaban vivos en el momento de la evaluación, se muestran como valores "censurados" con su tiempo de supervivencia respecto hasta la evaluación (puntos en las curvas). Este tipo de presentación se conoce como "Curva de Supervivencia de Kaplan-Meier". Los datos muestran que los pacientes tratados con 10 microM de la SEC ID Nº 5 tienen una oportunidad mucho mejor de supervivencia que los tratados con 80 microM y los del grupo de control.

Descripción detallada de la invención

La expresión aproximadamente en el contexto de esta invención comprende desviaciones del valor absoluto dado en el texto del 0 al 100%, más preferido del 1 al 80%, incluso más preferido del 2 al 60%, más preferido del 3 al 40%, más preferido del 4 al 20%, e incluso más preferido del 5 al 10% del valor respectivo.

Acontecimiento adverso en el contexto de esta invención se entiende como cualquier suceso médico prejudicial en un paciente o sujeto de investigación clínica después de la administración de una preparación farmacéutica que no tiene relación causal con el tratamiento de la preparación farmacéutica respectiva. Un acontecimiento adverso por lo tanto puede ser cualquier signo desfavorable y no pretendido (incluyendo un hallazgo de laboratorio anormal), síntoma, o enfermedad, por ejemplo, debido al progreso de la enfermedad. Otra expresión para acontecimiento adverso es síntoma.

Tumor cerebral usado de forma sinónima con tumor del cerebro de acuerdo con esta invención es cualquier tumor del cerebro incluyendo metástasis, metástasis derivada de otras partes del cerebro o derivada de cualquier otro tumor en el cuerpo, y metástasis de la médula espinal. Tumor cerebral comprende adicionalmente tumor cerebral primario, astrocitoma, incluyendo glioblastoma y oligoastrocitoma, oligodendroglioma y gliosarcoma.

Cavidad en el contexto de esta invención implica, por ejemplo, colon, duodeno, íleo, yeyuno, cavidad articular, cavidad pleural, espacio intraperitoneal, luz del esófago, laringe, seno maxilar, cavidad nasal, faringe, el recto, el estómago, el tracto intestinal, el conducto urinario, la vejiga urinaria, y el espacio ventricular.

En la presente invención la expresión enfermedad comprende neoplasmas, metástasis, lesiones neuronales, e inmunosupresión.

Hibridación en el contexto de esta invención implica, que dos cadenas nucleotídicas forman al menos parcialmente una doble cadena por enlaces de hidrógeno. La doble cadena se desarrolla completamente cuando las dos cadenas nucleotídicas tienen secuencias antisentido exactas. Pero incluso si cualquier nucleótido de un oligonucleótido, también mencionado como bloque de construcción nucleotídico, está sustituido con otro nucleótido, el nucleótido respectivo está modificado o incluso cuando un espaciador está en el sitio del oligonucleótido respectivo, el oligonucleótido aún puede hibridar con la molécula diana, generalmente el ARNm de una proteína, y con esto inhibir la producción de dicha proteína.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Metástasis en el contexto de esta invención significa que al menos una célula se separa o disocia de un tejido tumoral y se mueve mediante, por ejemplo, el sistema linfático, los vasos sanguíneos, y/o invadiendo el tejido adyacente a otra parte del cuerpo de un mamífero, preferiblemente un ser humano, donde se asienta y forma nuevo tejido tumoral. El término oligonucleótidos de la invención abarca cualquier sal farmacéuticamente aceptable, éster, o cualquier otro compuesto que después de la administración a un mamífero es capaz de proporcionar el metabolito biológicamente activo o resto del mismo. Esto se consigue por hibridación específica de los compuestos con uno o más ácidos nucleicos que codifican TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, VEGF, e interleuquina-10 y/o prostaglandina E2.

Las expresiones ácidos nucleicos y oligonucleótidos se usan de forma sinónima en el contexto de esta invención.

En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos no son ácidos nucleicos antisentido, lo que significa que no funcionan uniéndose parcial o completamente a especies de ADN genómico o ARN complementarias dentro de una célula e inhibiendo de este modo la función de dichas especies de ADN genómico o ARN.

En una realización, los oligonucleótidos de esta invención también comprenden los oligonucleótidos descritos en las patentes EP 069 53 54 y EP 1008649 así como lo de las solicitudes de patente internacional publicadas con el Nº WO 01/68 146, WO 98/33904, WO 99/63975 y WO 99/63975. Los oligonucleótidos que hibridan con TGF-beta en una realización preferida incluyen al menos una secuencia expuesta como las SEC ID Nº 1 a 93.

Los oligonucleótidos o ácidos nucleicos incluyen oligonucleótidos que tienen partes de origen no natural con función similar. Los nucleótidos de origen natural así como los nucleótidos de origen no natural, modificaciones y espaciadores también se mencionan como bloque de construcción nucleotídico. El bloque de construcción nucleotídico más común es un nucleótido. Los nucleótidos modificados o sustituidos así como los espaciadores también están comprendidos por la expresión bloque de construcción nucleotídico.

Estos oligonucleótidos modificados o sustituidos a menudo se prefieren sobre las formas nativas a causa de las propiedades deseable tales como captación celular potenciada, afinidad potenciada por la diana de ácido nucleico (por ejemplo, proteína), localización intracelular alterada y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas. Las modificaciones de los oligonucleótidos como se usa en este documento comprenden cualquier modificación química del azúcar, el resto básico y/o el enlace internucleosídico.

En una realización, la estructura anular del grupo ribosa de los nucleótidos en el oligonucleótido o polinucleótido modificado tiene oxígeno en la estructura anular sustituido con N-H, N-R (siendo R un alquilo, más preferido alquilo con 1 a 20 carbonos, más preferido los alquilos son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, o R es un sustituyente arilo), S y/o metileno.

Preparación farmacéutica en el contexto de esta invención comprende un oligonucleótido de esta invención dentro de un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización los ácidos nucleicos u oligonucleótidos con una base y/o azúcar modificado covalentemente incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen azúcares estructurales que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes de un grupo hidroxilo en la posición 3' y/o 2' o un grupo fosfato en la posición 5'. Por tanto los ácidos nucleicos modificados pueden incluir adicionalmente al menos un grupo ribosa 2'-O-sustituido. Para propósitos de esta invención, el término "2'-sustituido" significa sustitución del 2'-OH de la molécula de ribosa. El O puede sustituirse con N, S y el sustituyente puede comprender adicionalmente un alquilo con 1 a 20 carbonos por ejemplo O-alquilo, S-alquilo, NH-alquilo, N-dialquilo, O-arilo, S-arilo, NH-arilo, O-aralquilo, S-aralquilo, NH-aralquilo. Las realizaciones preferidas de grupos 2'-O-alquilo son metoxi-, etoxi-, propiloxi-, isopropiloxi-, metoxi-etoxi. También se dan modificaciones adicionales de bloques de construcción nucleotídicos por las patentes US 6.143.881, US 5.591.721, US 5.652.355, US 5.962.425, US 5.969.116 y US 5.914.396.

Otra realización preferida es un bloque de construcción nucleotídico, que comprende al menos una desoxirribosa, con un grupo alquilo unido al carbono 2'. El alquilo puede tener de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 carbonos, de 1 a aproximadamente 20 carbonos, de 1 a aproximadamente 10 carbonos, o de 1 a aproximadamente 5 carbonos. Los grupos alquilo preferidos son los grupos etilo, propilo, isopropilo, butilo, el grupo metilo es altamente preferido.

En otra realización más, los ácidos nucleicos modificados incluyen azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. Por tanto, los ácidos nucleicos pueden ser heterogéneos en la composición estructural conteniendo de este modo cualquier combinación posible de unidades poliméricas unidas juntas tales como ácidos peptidonucleicos (que tienen una estructura de aminoácidos unida a las bases de ácido nucleico). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son homogéneos en la composición estructural.

Las purinas y pirimidinas sustituidas de los ácidos nucleicos incluyen purinas y pirimidinas convencionales tales como citosina así como análogos de bases tales como bases sustituidas (Wagner y col. 1993). Las purinas y pirimidinas incluyen, aunque sin limitación adenina, citosina, guanina, timina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, y otras nucleobases de origen natural y no natural, restos aromáticos sustituidos y no sustituidos.

Los nucleótidos sencillos en cada oligonucleótido pueden contener las mismas modificaciones, pueden contener combinaciones de estas modificaciones, o pueden combinar estas modificaciones con enlaces fosfodiéster. Los procedimientos que vuelven a los oligonucleótido resistentes a nucleasa incluyen, aunque sin limitación, modificación covalente de las bases purina o pirimidina. Por ejemplo, las bases pueden metilarse, hidroximetilarse, o sustituirse de otro modo (por ejemplo, glicosilarse) de modo que los oligonucleótidos o polinucleótidos se vuelvan sustancialmente resistentes a ácido y nucleasa.

En una realización preferida, al menos un extremo del oligonucleótido es una biotina, análogo de biotina, avidina, o análogo de avidina. Estas moléculas tienen la capacidad de bloquear la degradación del oligonucleótido protegido y proporcionar un medio para la unión de elevada afinidad de los ácidos nucleicos modificados al soporte sólido. Los derivados de avidina y biotina, que pueden usarse para preparar los reactivos de esta invención incluyen estreptavidina, avidina succinilada, avidina monomérica, biocitina (biotina-épsilon-N-lisina), hidrazida de biocitina, derivados amina o sulfhidrilo de 2-iminobiotina e hidrazida del ácido biotinil-épsilon-aminocaproico. También pueden usarse derivados de biotina adicionales, tales como éster de biotin-N-hidroxisuccinimida, éster de N-hidroxisuccinimida del ácido biotinil-épsilon-aminocaproico, 6-(biotin amido)hexanoato de sulfosuccinimidilo, N-hidroxisuccinimidaiminobiotina, biotin-bromoacetilhidrazida, p-diazobenzoil biocitina y 3-(N-maleimidopropionil)-biocitina, como grupos de bloque de extremo en los oligonucleótidos de la presente invención.

En otra realización más, las unidades básicas se mantienen para la hibridación con un compuesto diana de ácido nucleico apropiado. Uno de dichos compuestos oligoméricos, un oligonucleótido mimético que ha demostrado tener excelentes propiedades de hibridación, se conoce como ácido peptidonucleico (PNA). En compuestos PNA, la estructura azucarada de un oligonucleótido se remplaza con una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Las nucleobases se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte amida de la estructura. Las Patentes de Estados Unidos Representativas que muestran la preparación de compuestos PNA incluyen, aunque sin limitación, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.539.082, 5.714.331, y 5.719.262. Pueden encontrarse contenidos adicionales de compuestos PNA en Nielsen y col. 1991.

Los oligonucleótidos de estructura modificada adicionales incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosforotriésteres, aminoalquilfosforotriésteres, metil- y otros alquil-fosfonatos incluyendo 3'-alquileno fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos, incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos unidos 2'-5' de éstos, y los que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades nucleosídicas están unidos 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas, y formas ácidas libres. Una realización preferida es la sal sódica del ácido nucleico.

En algunas realizaciones al menos un nucleótido de un oligonucleótido está modificado como se describe en una de las modificaciones anteriores. La modificación puede cubrir el oligonucleótido de forma continua o irregular.

En otra realización más, se combinan al menos dos modificaciones como se ha descrito anteriormente dentro de un oligonucleótido.

En otra realización, se modifican de 1 a aproximadamente 12 o de 1 a aproximadamente 8 o de 1 a aproximadamente 4 o de 1 a aproximadamente 2 oligonucleótidos y/o enlaces nucleotídicos en el extremo 3' y/o 5' del oligonucleótido como se ha descrito anteriormente.

En una realización, los oligonucleótidos de esta invención hibridan con una diana, por ejemplo TGF-beta o sus subtipos más preferido TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, VEGF, IL-10, y bajo PGE_{2}. Estas dianas son bien conocidas para los especialistas en la técnica. La estructura antisentido del ARNm de dichas dianas también se da en el documento PCT/EP2004/053604.

Elongación de cadena significa que los oligonucleótidos de la lista de secuencias y otros oligonucleótidos, que tienen nucleótidos adicionales de la secuencia de la estructura antisentido respectiva del ARNm de dichas dianas, aún están dentro del alcance de esta invención. Los nucleótidos adicionales en una realización están de acuerdo con la región codificante del ARNm, en otra realización más, los nucleótidos adicionales también son de la parte no codificante del ARNm, incluyendo intrones y exones. Los nucleótidos adicionales comprenden de 1 a 10.000 nucleótidos, de 1 a 5.000 nucleótidos, de 1 a 3.000 nucleótidos, de 1 a 1.000 nucleótidos, de 1 a 500 nucleótidos, de 1 a 100 nucleótidos, de 1 a 50 nucleótidos, de 1 a 25 nucleótidos, de 1 a 10 nucleótidos, de 1 a 5 nucleótidos o de 1 a 2 nucleótidos unidos a al menos uno de los extremos 3' y/o 5', en otra realización, a al menos uno de los extremos 2' o 5'. En otra realización más, algunos bloques de construcción nucleotídicos de estos oligonucleótidos o polinucleótidos pueden estar modificados o sustituidos por espaciadores y/o modificaciones como se describe en este documento.

Sales farmacéuticamente aceptables se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos usados en la invención, que significa que las sales retienen las actividades biológicas de los compuestos precursores sin efectos toxicológicos indeseados.

En una realización, el oligonucleótido o su derivado activo es un oligonucleótido monocatenario, en otra realización más, el oligonucleótido es bicatenario, que significa que el oligonucleótido hibrida completa o parcialmente con un segundo oligonucleótido que tiene del 50% al 100% de la estructura antisentido exacta de dicho oligonucleótido. Esto puede provocar una doble cadena en la que ambos oligonucleótidos hibridan con menos fuerza de enlace o una doble cadena con extremos solapantes. Los dos oligonucleótidos pueden tener la misma longitud, en otras palabras pueden tener la misma cantidad de bloques de construcción nucleotídicos o su longitud puede diferir, también provocando extremos solapantes en uno o ambos extremos.

La expresión espaciador en el contexto de esta invención comprende cualquier bloque de construcción nucleotídico que no sea obviamente un derivado o una modificación de un nucleótido, pero conecta dos bloques de construcción nucleotídicos de un modo que el oligonucleótido resultante aún hibrida con su diana, por ejemplo ARNm de TGF-beta 2.

Una realización de la invención es el uso de al menos un oligonucleótido con una longitud de 8 a 30 bloques de construcción nucleotídicos para fabricar una preparación farmacéutica para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades que están moduladas por TGF-beta 2, en el que dicho oligonucleótido hibrida con un ARN mensajero de TGF-beta 2 y en el que dicha preparación comprende dicho oligonucleótido en una concentración de 1 microM a 25 microM.

En otras realizaciones, la preparación farmacéutica de esta invención comprende oligonucleótidos en una concentración de 1 microM a 15 microM, más preferido de 2,5 microM a 14 microM, más preferido de 4 microM a 13 microM, más preferido de 5 microM a 12,5 microM, mucho más preferido la concentración de los oligonucleótidos es 20 microM, 10 microM o 5 microM.

Aunque los oligonucleótidos de esta invención son monocatenarios, en algunas realizaciones al menos partes del ácido nucleico monocatenario son bicatenarias. Las moléculas bicatenarias son más estables in vivo, mientras que las moléculas monocatenarias tienen actividad aumentada.

En una realización, el oligonucleótido tiene una longitud de 8 a 30 nucleótidos y es complementario al ARNm de las dianas, TGF-beta 2. En realizaciones más preferidas, los oligonucleótidos de esta invención tienen longitudes de 8 a 20 nucleótidos, incluso más preferido de 12 a 18 nucleótidos. Se muestran realizaciones preferidas de oligonucleótidos útiles en esta invención en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 1 a 93, realizaciones más preferidas son las SEC ID Nº 1 a 38, son más preferidas las SEC ID Nº 2 y/o 5.

Otros oligonucleótidos útiles en preparaciones farmacéuticas de acuerdo con esta invención son los oligonucleótidos descritos en la lista de secuencias respectivamente de los ejemplos de los documentos EP 1 089 764, EP 0 695 534, PCT/EP98/00497 y PCT/EP2005/002101.

En otras realizaciones, el al menos un oligonucleótido para la fabricación de una preparación farmacéutica comprende al menos un enlace fosforotioato entre dos bloques de construcción nucleotídicos. El enlace fosforotioato puede cubrir el 0%-5%, del 5% al 10%, del 10% al 15%, del 15% al 20%, del 20% al 25%, del 25% al 30%, del 30% al 35%, del 35% al 40%, del 44% al 45%, del 45% al 50%, del 50% al 55%, del 55% al 60%, del 60% al 65%, del 65% al 70%, del 70% al 75%, del 75% al 80%, del 80% al 85%, del 85% al 90%, del 90% al 95% o del 95% al 100% de los enlaces. Los enlaces fosforotioato pueden estar dispersados de forma regular o irregular sobre el oligonucleótido. En algunas realizaciones el fosforotioato se acumula en uno o ambos extremos 3' y/o 5' del oligonucleótido. Otra realización preferida es un oligonucleótido en el que todos los enlaces entre los nucleótidos son fosforotioatos.

En una realización, el oligonucleótido es un oligonucleótido monocatenario. Monocatenario significa que todos los bloques de construcción del oligonucleótido están en una línea y no hibridan con un segundo oligonucleótido u oligonucleótido antisentido y no están unidos de otro modo.

En otras realizaciones más, los oligonucleótidos de esta invención se usan para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo de cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso, e inmunosupresión.

En otras realizaciones se administran preparaciones farmacéuticas de los oligonucleótidos por infusión en un tejido, un tumor o una cavidad corporal. En realizaciones más preferidas el tejido se selecciona entre el grupo del conducto biliar, vejiga, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, endometrio, epitelio, vesícula biliar, cabeza, cabeza y cuello, corazón, intestino, articulaciones, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, vasos linfáticos, músculo, esófago, ovario, páncreas, próstata, recto, conducto urinario, piel y sus capas, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, amígdala, o útero y/o se administra al tumor respectivo de este tejido.

En una realización más preferida la preparación farmacéutica se administra al tumor en el cerebro, preferiblemente el tumor cerebral se selecciona entre el grupo de astrocitoma incluyendo glioblastoma y oligoastrocitoma.

En otra realización, la preparación farmacéutica de oligonucleótidos se administra en una cavidad corporal, seleccionada entre el grupo de conducto biliar, vejiga, colon, vesícula biliar, cavidad articular, cavidad pleural, espacio intraperitoneal, el recto, el tracto intestinal, el conducto urinario, la vejiga urinaria, y el espacio ventricular.

Las preparaciones farmacéuticas que comprenden al menos un oligonucleótido de esta invención se administran a un tumor o un tejido, la cavidad articular o el espacio ventricular con un flujo de 2 microl/min. a 10 microl/min., es más preferido 4 microl/min. En una realización muy preferida, la preparación farmacéutica se administra a estos caudales en un tumor del cerebro, más preferido en astrocitoma, incluyendo glioblastoma y oligoastrocitoma.

En otra realización, la preparación farmacéutica se administra en cavidades corporales que no son el espacio ventricular o la cavidad articular, por ejemplo, el colon, cavidad pleural, espacio intraperitoneal, el recto, el estómago, el tracto intestinal, el conducto urinario, o la vejiga urinaria.

En otras realizaciones más, los oligonucleótidos de esta invención se usan para la profilaxis y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo de cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso, e inmunosupresión.

En realizaciones preferidas, se tratan el cáncer, la metástasis, el sistema nervioso, y/o la inmunosupresión con los oligonucleótidos respectivos que hibridan con ARNm de las dianas TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, VEGF, interleuquina-10, c-jun, c-fos y/o prostaglandina E2, incluso más preferido son secuencias identificadas en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 1-93. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de TGF-beta 1 se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 1-4, es más preferida la SEC ID Nº 2. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de TGF-beta 2 se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 5-8, es más preferida la SEC ID Nº 5. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de TGF-beta 3 se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 9-38. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de prostaglandina E2 se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 39-49. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de interleuquina 10 se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 57-76. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de c-jun se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 78-83. Las secuencias preferidas que hibridan con el ARNm de c-jun se identifican en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 85-93.

Otra realización de una enfermedad del sistema nervioso es la esclerosis lateral amiotrófica. En una realización preferida las lesiones neuronales se tratan con los oligonucleótidos respectivos que hibridan con ARNm de las dianas c-jun o j-fos, incluso más preferido son secuencias de c-jun identificadas en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 78-83 respectivamente, secuencias de c-fos identificadas en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 85-93.

En una realización la preparación farmacéutica se administra con un sistema de aplicación. Un sistema de aplicación preferido comprende una bomba portátil, conectada con tubos flexibles a un sistema de entrada. El sistema de entrada está conectado a un catéter de infusión implantado quirúrgicamente en el centro de un tumor, un tejido o acaba en una cavidad corporal. En otra realización, se usan varios catéteres de infusión para infundir la preparación farmacéutica. En otras realizaciones más, los catéteres de infusión están posicionados no en el centro del tumor o tejido, sino que están posicionados en el margen del tejido y/o tumor infundido con la preparación farmacéutica. Los sistemas de aplicación útiles para esta invención también se describen en la solicitud de patente internacional PCT/EP 2004/ 004211.

El volumen total por día de la preparación farmacéutica preferiblemente infundida en tumores, tejidos o las cavidades corporales seleccionadas entre la cavidad articular o el espacio ventricular varía de aproximadamente 0,15 ml/d a aproximadamente 0,15 l/d, más preferido de 0,7 ml/d a 0,07 l/d, incluso más preferido de 1,2 ml/d a 0,06 l/d, incluso más preferido de 2 ml/d a 0,03 l/d, incluso más preferido de 3 ml/d a 15 ml/d, y mucho más preferido son 5,6 ml/d o 11 ml/d.

En otra realización el volumen total de preparación farmacéutica preferiblemente infundida en cavidades corporales grandes tales como el espacio intraperitoneal o el espacio pleural es de aproximadamente 5 ml/d a aproximadamente 3 l/d, más preferido de 0,05 l/d a 1,5 l/d, incluso más preferido de 0,15 l/d a 1 l/d, incluso más preferido de 0,4 l/d a 0,6 l/d, es mucho más preferido 0,5 l/d.

En otra realización la cantidad total de oligonucleótido aplicada en tumores, tejidos o las cavidades corporales seleccionadas entre la cavidad articular o el espacio ventricular mediante esta invención es de aproximadamente 0,15 nmoles a aproximadamente 3 micromoles, más preferido de 1 nmol a 2 micromoles, incluso más preferido de 0,01 micromoles a 1 micromol, incluso más preferido de 0,02 micromoles a 0,1 micromoles, y mucho más preferido de 0,224 micromoles, 0,112 micromoles, 0,056 micromoles, o 0,028 micromoles.

En la realización más preferida estas cantidades se administran en un tumor cerebral, en una realización preferida el tumor cerebral es un astrocitoma, incluyendo glioblastoma o es un oligoastrocitoma.

Para el tratamiento de tumores cerebrales, se prefieren los oligonucleótidos que pueden hibridar con ARNm de TGF-beta, son más preferidas las secuencias identificadas en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 1 a 38. Son más preferidos oligonucleótidos que hibridan con TGF-beta 2, son incluso más preferidas secuencias identificadas en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 5 a 8. En una realización muy preferida, el oligonucleótido se identifica en el protocolo de secuencias por la SEC ID Nº 5. En una realización preferida la SEC ID Nº 5 se administra en forma de su sal sódica que tiene un peso molecular de 6142,4 g, respectivamente 7115,3 g como hidrato, que comprende aproximadamente 54 moléculas de agua cristalina por oligonucleótido.

En otra realización la cantidad total de oligonucleótido aplicada en cavidades corporales grandes tales como la cavidad intraperitoneal o la cavidad pleural por una preparación farmacéutica de esta invención es de aproximadamente 0,005 micromoles a aproximadamente 0,05 mmoles, más preferido de 0,05 micromoles a 0,025 mmoles, más preferido de 0,1 micromoles a 0,01 mmoles, y mucho más preferido de 10 micromoles, 5 micromoles o 2,5 micromoles.

En otra realización la cantidad total de oligonucleótido aplicada en tumores, tejidos o las cavidades corporales seleccionadas entre la cavidad articular o el espacio ventricular mediante esta invención es de aproximadamente 7,5 nmoles a aproximadamente 22,5 micromoles, más preferido de 50 nmoles a 10 micromoles, incluso más preferido de 0,1 micromoles a 5 micromoles, incluso más preferido de 0,4 micromoles a 1 micromol, y mucho más preferido de 0,21 micromoles, 0,28 micromoles o 0,35 micromoles.

En una realización más preferida la cantidad respectiva se administra en un tumor cerebral, la realización más preferida del tumor cerebral es astrocitoma, incluyendo glioblastoma u oligoastrocitoma.

En otra realización la cantidad total de oligonucleótido aplicada en cavidades corporales grandes tales como la cavidad intraperitoneal o la cavidad pleural por una preparación farmacéutica de esta invención es de aproximadamente 0,25 micromoles a aproximadamente 0,45 mmoles, más preferido de 1 micromol a 0,5 mmoles, más preferido de 0,01 mmoles a 0,1 mmoles, y mucho más preferido de 50 micromoles, 40 micromoles o 30 micromoles.

La preparación farmacéutica de esta invención se administra en un tumor, un tejido o una cavidad corporal durante días hasta aproximadamente 14 días. Este periodo de tiempo también se conoce como transcurso. Se prefiere el periodo de 4 días y 7 días para el tratamiento de tumor cerebral, donde la realización más preferida del tumor cerebral es astrocitoma, incluyendo glioblastoma, u oligoastrocitoma.

En otras realizaciones los oligonucleótidos en una preparación farmacéutica se administran en una pluralidad de veces, en otras palabras un transcurso como se ha definido anteriormente se repite una pluralidad de veces, prefiriendo de 2 a 20 veces. En realizaciones preferidas el procedimiento se repite de una a veinte veces, por ejemplo de dos veces a tres veces, de cuatro times a cinco veces, de seis veces a siete veces, de ocho veces a nueve veces, de diez veces a once veces, de doce veces a trece veces, de catorce veces a quince veces, de dieciséis veces a diecisiete veces, de dieciocho veces a diecinueve veces, o veinte veces.

Todos los transcursos pueden tener la misma duración o pueden variar. En algunas realizaciones el tiempo entre dos transcursos es de aproximadamente 1 día a aproximadamente 2 días, de aproximadamente 2 días a aproximadamente 3 días, de aproximadamente 4 días a aproximadamente 5 días, de aproximadamente 5 días a aproximadamente 7 días, de aproximadamente 8 días a aproximadamente 10 días, de aproximadamente 10 días a aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 3 semanas, de aproximadamente 3 semanas a aproximadamente 4 semanas, de aproximadamente 4 semanas a aproximadamente 6 semanas, y de aproximadamente 6 semanas a aproximadamente 12 semanas. En una realización preferida el tiempo entre dos transcursos varía entre aproximadamente 2 días y 8 semanas, más preferido de aproximadamente 4 días a aproximadamente 4 semanas, incluso más preferido de aproximadamente 6 días a aproximadamente 12 días.

En una realización preferida el oligonucleótido disuelto en una solución fisiológica (= isotónica) se administra en 7 días y después durante los siguientes 7 días no se administra oligonucleótido. Este transcurso se repitió varias veces.

En otra realización la preparación farmacéutica comprende al menos un oligonucleótido y además al menos un adyuvante adicional. Para más detalles acerca de los adyuvantes, también se conocen como inmunoestimulantes, véase también el documento EP 1 089 764. En una realización preferida el adyuvante es un oligonucleótido que comprende un resto CpG. Para detalles adicionales acerca de los restos CpG véase también Krieg 2002.

Se usan realizaciones preferidas de las preparaciones farmacéuticas de esta invención en mamíferos, donde la realización preferida de un mamífero es un ser humano. Además de ser útil en tratamiento en seres humanos, la presente invención también es útil para otros sujetos incluyendo animales de veterinaria, animales exóticos y animales de granja, incluyendo mamíferos, roedores, y similares. Los mamíferos incluyen seres humanos, caballos, perros, cerdos, gatos, o primates (por ejemplo, un mono, un chimpancé, o un lémur). Los roedores incluyen ratas, ratones, ardillas, o cobayas.

En una realización, la preparación farmacéutica con al menos un oligonucleótido de esta invención para el tratamiento de tumores y/o metástasis se administra a un mamífero a una cantidad que produce una concentración de este oligonucleótido en el intervalo de 1 a 50 microgramos por 1 cm^{3} del tumor respectivo. En otra realización, la preparación farmacéutica se administra de un modo que la concentración del oligonucleótido es de 2 a 20 microgramos por 1 cm^{3} de tejido tumoral por día, son más preferidos de 3 a 10 microgramos por 1 cm^{3} de tejido tumoral por día.

La preparación farmacéutica de la presente invención puede administrarse de varios modos dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por infusión directamente en un tejido, tumor y/o una cavidad corporal. La administración de las preparaciones farmacéuticas de la presente invención puede conseguirse por cualquier medio conocido para los especialistas en la técnica. Las vías de administración incluyen, aunque sin limitación, infusión parenteral (por ejemplo, intramuscular), intraperitoneal, intraventricular, intracerebral, intratumoral, intracerebroventricular, intratecal, intrauterina, e inyección en la vejiga, y la pleura.

Las preparaciones farmacéuticas incluyen preparaciones farmacéuticas fluidas que contienen el oligonucleótido en una concentración de 1 microM a 25 microM.

Anteriormente se han dado las concentraciones más preferidas. Dichas preparaciones pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, tal como, aunque sin limitación, un potenciador de la penetración, vehículos o excipientes aceptables. El término preparación farmacéutica implica que los líquidos o sustancias de esta composición son puros y/o están combinados con vehículos farmacéuticamente aceptables.

El término vehículo farmacéuticamente aceptable significa una o más cargas líquidas compatibles, diluyentes o sustancias de encapsulación que son adecuadas para la administración a un ser humano u otro mamífero. El término "vehículo" se refiere a un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con que se combina el ingrediente activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las preparaciones farmacéuticas también son capaces de combinarse con los compuestos de la presente invención, y entre sí, de tal modo que no hay interacción que alterara la eficacia farmacéutica deseada. Dichos vehículos posibilitan que los oligonucleótidos de la invención se formulen en forma de líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, emulsiones.

Como se ha descrito anteriormente las composiciones farmacéuticas también pueden incluir microcápsulas, nanocápsulas, micro y nanoesferas, emulsiones y suspensiones, oligonucleótidos revestidos sobre partículas de oro microscópicas o preparaciones de oligonucleótidos de liberación prolongada, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, o solubilizantes.

Para infusión en el estómago, intestino, colon, o recto se útil un enema.

Para una breve revisión de los presentes procedimientos de suministro de fármacos, véase Langer (1990).

En otra realización más, los oligonucleótidos están presentes en vehículos farmacéuticos para administración parenteral por infusión. Las formulaciones para infusión pueden presentarse en forma de dosificación unitaria con un conservante añadido. Las composiciones farmacéuticas toman formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

En una realización, los vehículos farmacéuticos para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los oligonucleótidos en forma soluble en agua. En una realización preferida el oligonucleótido se disuelve en una solución fisiológica (isotónica), más preferido solución de cloruro sódico al 0,9%.

En otra realización se prepara una suspensión de los compuestos en forma de una infusión oleosa apropiada. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de infusión acuosas comprenden sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

En otra realización más, los oligonucleótidos pueden estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de su uso. En otras realizaciones, el oligonucleótido se reconstituye con una solución isotónica. La solución isotónica es cualquier solución acuosa con una presión osmótica tan elevada como la presión osmótica del cuerpo. Habitualmente se usan soluciones de sales, azúcares y etc. En realizaciones preferidas la solución isotónica es una solución de cloruro sódico al 0,9% o una solución de Ringer-lactato (por ejemplo, DAB7).

En otra realización más, los compuestos activos pueden estar en forma de un concentrado para dilución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de su uso.

En otra realización más, los compuestos se formulan en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención o comprimidos, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

En otra realización más, los compuestos se formulan en forma de una preparación de depósito. En una realización dichas preparaciones de acción prolongada se formulan con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados de solubilidad moderadamente lenta, por ejemplo en forma de una sal de solubilidad moderadamente lenta.

En otras realizaciones, los sistemas de suministro incluyen sistemas de suministro de liberación temporalizada, de liberación retardada, o de liberación sostenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la conveniencia para el sujeto y el medico. Están disponibles muchos tipos de sistemas de suministro y son conocidos para los especialistas en la técnica.

En una realización, los sistemas de suministro incluyen sistemas basados en polímeros tales como poli(lactida-glicolida), co-polioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico, y polianhídridos, más preferido polianhídridos con peso molecular de más de 20.000 Da. En una realización preferida el polianhídrido es una policondensación de ácidos dicarbónicos con elevado peso molecular. Para más detalles obsérvese también el documento EP 0260415. Se describen microcápsulas de los anteriores fármacos que contienen polímeros en, por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.075.109.

En otra realización, se ha conseguido la mejora de la captación del oligonucleótido con diferentes sistemas de vectorización incluyendo liposomas (neutros, catiónicos, inmunoliposomas), micro y nanopartículas, polímeros, o unión covalente a un vehículo (C. Lefebure y col. 1995). También se ha usado la transfección mediada por lípidos para suministrar oligonucleótidos (Wang y Martini 1996). En otra realización los sistemas de suministro incluyen sistemas no poliméricos que son, por ejemplo, lípidos incluyendo esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono, di y triglicéridos, sistemas de liberación de hidrogel, sistemas silásticos, sistemas basados en péptidos, y similares.

Los ejemplos específicos incluyen, aunque sin limitación: (a) sistemas de erosión en los que un agente de la invención está contenido en una forma dentro de una matriz tal como las descritas en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.452.775, 4.675.189, y 5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo filtra a una velocidad controlada desde un polímero tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686.

En otras realizaciones más, los oligonucleótidos se formulan con GELFOAM®, un producto comercial que consiste en fibras de colágeno modificadas que se degradan lentamente.

En una realización, las composiciones farmacéuticas también comprenden vehículos o excipientes en fase sólida o de gel adecuados. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, aunque sin limitación, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.

En una realización, los oligodesoxinucleótidos se administran netos o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales tienen que ser farmacéuticamente aceptables, pero pueden usarse convenientemente sales farmacéuticamente no aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Dichas sales incluyen, aunque sin limitación, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico, y bencenosulfónico. Además, dichas sales pueden preparare como sales de metales alcalinos o alcalino-térreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende adicionalmente al menos un tampón y/o al menos un conservante.

En una realización adecuada los agentes tamponantes incluyen, aunque sin limitación, ácido acético y una sal (1-2% p/v), ácido cítrico y una sal (1-3% p/v), ácido bórico y una sal (0,5-2,5% p/v), y ácido fosfórico y una sal (0,8-2% p/v).

Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (por ejemplo, 0,003-0,03% p/v), clorobutanol (por ejemplo, 0,3-0,9% p/v), parabenos (por ejemplo, 0,01-0,25% p/v), y tiomersal (por ejemplo, 0,004-0,02% p/v).

En otra realización, las composiciones farmacéuticas también incluyen potenciadores de la penetración para potenciar el suministro alimentario. Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes, tensioactivos, y no tensioactivos (Lee y col. 1991, Muranishi 1990). Pueden incluirse uno o más potenciadores de la penetración de una o más de estas amplias categorías.

Diversos ácidos grasos y sus derivados que funcionan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, recinleato, monooleina (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilaza-cicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, mono y diglicéridos y sales fisiológicamente aceptables (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee y col. 1991, Muranishi 1990, El-Hariri y col. 1992). Ejemplos de algunos ácidos grasos actualmente preferidos son caprato sódico y laurato sódico, usados individualmente o en combinación a concentraciones del 0,5 al 5%.

Las tareas fisiológicas de la bilis incluyen la facilitación de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (Brunton 1996). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, funcionan como potenciadores de la penetración. Por tanto, el término "sal biliar" incluye cualquiera de los componentes de origen natural de la bilis así como cualquier otro derivado sintético. Una sal biliar actualmente preferida es el ácido quenodesoxicólico (CDCA) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.), generalmente usado en concentraciones del 0,5 al 2%. Pueden usarse formulaciones complejas que comprenden uno o más potenciadores de la penetración. Por ejemplo, pueden usarse sales biliares en combinación con ácidos grasos para preparar formulaciones complejas. Las combinaciones preferidas incluyen CDCA combinado con caprato sódico o laurato sódico (generalmente del 0,5 al 5%).

En una realización se usan adicionalmente agentes quelantes que incluyen, aunque sin limitación, etilendiaminatetraacetato disódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato sódico, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acilo de colágeno, laureth-9 y derivados N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee y col. 1991, Muranishi 1990, Buur y col. 1990). Los agentes quelantes tienen la ventaja añadida de servir también como inhibidores de DNasa.

En otra realización se usan adicionalmente tensioactivos. Los tensioactivos incluyen, por ejemplo, lauril sulfato sódico, polioxietilen-9-lauril éter y polioxietilen-20-cetil éter (Lee y col. 1991), y emulsiones perfluoroquímicas tales como FC-43 (Takahashi y col. 1988).

Los no tensioactivos incluyen, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee y col. 1991), y agentes anti-inflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina, y fenilbutazona (Yamashita y col. 1987).

En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen adicionalmente otros componentes accesorios encontrados convencionalmente en composiciones farmacéuticas, a sus niveles de uso establecidos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales o agentes anti-inflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas de dosificación de la composición de la presente invención, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes, y estabilizantes. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deben impedir excesivamente las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la
invención.

La presente invención puede usarse para la aplicación de fármacos descrita en cualquier tejido del sujeto en que está indicado este procedimiento. Dichos tejidos incluyen, por ejemplo, conducto biliar, vejiga, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, endometrio, epitelio, vesícula, vesícula biliar, cabeza, cabeza y cuello, corazón, intestino, articulaciones, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, vasos linfáticos, músculo, esófago, ovario, páncreas, próstata, recto, conducto urinario, piel y sus capas, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, amígdala, o
útero.

El tumor respectivo de un tejido también mencionado como tumor o neoplasma comprende adamantinoma de huesos largos, adenoma, ameloblastoma, astrocitoma, carcinoma del conducto biliar, carcinoma de vejiga, carcinoma de los huesos, carcinoma de médula ósea, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer cervical, cáncer cervical del útero, condroma, coriocarcinoma, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cistadenocarcinoma, carcinoma embrional, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, fibroma, timoma folicular, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, glioblastoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del corazón, cáncer hepatocelular, cáncer en la cavidad intraperitoneal, cáncer del intestino, carcinoma del riñón, cáncer de laringe, lipoma, carcinoma hepático, carcinoma pulmonar, cáncer del ganglio linfático, cáncer de los vasos linfáticos, glioma maligno, mesentelioma, meningioma, carcinoma medular, mioma, neuroblastoma, carcinoma broncogénico/pulmonar macrocítico, cáncer de esófago, osteosarcoma, cáncer de ovario, carcinoma del páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, timoma papilar, feocromocitoma, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, carcinoma de las células renales, carcinoma del conducto urinario, carcinoma de glándulas sebáceas, seminoma, cáncer cutáneo, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma del intestino delgado, cáncer de tejido blando, carcinoma del bazo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de estómago, teratoma, carcinoma testicular, carcinoma de testículos, timoma, cáncer de la tiroides, tumores de la glándula tiroides, y cáncer del cuerpo uterino.

Las expresiones tumor, cáncer, y neoplasma se usan de forma sinónima en el contexto de esta invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

En esta solicitud se presentan los resultados de estudios locales en animales así como estudios clínicos en pacientes. Todos estos estudios se han realizado de acuerdo con las directrices actuales de la Buena Práctica Clínica (GCP) y se han aprobado por comités de ética locales. Además los estudios en pacientes siguieron la declaración actual internacional de Helsinki para experimentación en seres humanos.

Ejemplo 1 Estudios de toxicidad local después de inyección en embolada intratecal en conejos

La seguridad y tolerabilidad local de una preparación farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 se demostró en estudios de toxicidad local aplicando dicho oligonucleótido por vía intratecal en conejos en forma de un bolo.

Se realizaron dos estudios cada uno con ocho conejos (2/género/grupo de tratamiento) administrando 0,1 ml de una solución 14 microM o 500 microM de dicho oligonucleótido en solución salina normal, respectivamente, por inyección en embolada intratecal sencilla en el espacio subaracnoideo de la región lumbar. Los grupos de control recibieron solución de NaCl al 0,9% del mismo modo. Se inspeccionaron las reacciones locales de forma macroscópica 2, 6, y 30 horas después de la administración. Seis y 30 horas después de la administración se sacrificó 1 animal/género/grupo. Se examinaron histológicamente muestras de tejido cerebral (grosor aprox. 5 micrómetros).

En ninguno de los conejos se observaron signos clínicos de toxicidad o cambios macroscópicamente visibles para ambas concentraciones. En ambos estudios el examen histopatológico no reveló lesiones histomorfológicas relacionadas con la sustancia en el espacio subaracnoideo de la región lumbar. No se observaron cambios relacionados con la sustancia en la materia gris y blanca de la médula espinal. El tronco nervioso y las células nerviosas no mostraron ninguna anormalidad.

Un conejo de control (cloruro sódico al 0,9%) mostró hemorragia de moderada a marcada en la leptomeninge y en el tronco nervioso, una malacia leve e infiltración de granulocitos neutrófilos y depósitos fibrinosos moderados.

Todos los animales excepto un conejo de control (cloruro sódico al 0,9%) revelaron hemorragias de leves a moderadas en la materia blanca, la luz del canal central, la materia gris y/o el espacio subaracnoideo. Todos estos cambios se considera que se deben al daño mecánico causado por la inyección intratecal y, por tanto, no están relacionados con la sustancia.

En conclusión, el oligonucleótido identificado con la secuencia ID Nº 5 reveló una excelente tolerabilidad local en conejos después de la aplicación en embolada intratecal hasta una concentración de 500 microM de la solución de oligonucleótido.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Estudio de toxicidad local después de inyección en embolada intratecal en monos cynomolgus

La aplicación en embolada intratecal descrita en el ejemplo 1 se repitió en monos cynomolgus para investigar la seguridad y tolerancia local de una solución del oligonucleótido antisentido con la secuencia ID Nº 5 en un animal desarrollado superior. Debido a la excelente tolerabilidad local de la solución 500 microM de dicho oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 solamente se investigó una concentración.

Se trataron dos monos cynomolgus con 0,1 ml de una solución 500 microM (cloruro sódico al 0,9%) de un oligonucleótido que hibrida con el ARNm de TGF-beta 2 identificado en el protocolo de secuencias por la SEC ID Nº 5 por inyección en embolada intratecal sencilla en el espacio subaracnoideo de la región lumbar. Se inspeccionaron las reacciones locales macroscópicamente 2, 6 y 30 horas después de la administración y después se sacrificaron los animales. Se examinaron histológicamente muestras de tejido cerebral (grosor aprox. 5 micrómetros).

No se observaron signos clínicos de toxicidad y cambios macroscópicamente visibles en los monos. El examen histopatológico no reveló lesiones histomorfológicas relacionadas con la sustancia en el espacio subaracnoideo de la región lumbar. No se observaron cambios en la materia gris y blanca de la médula espinal. El tronco nervioso y las células nerviosas no mostraron ninguna anormalidad. Ambos monos revelaron una infiltración celular mixta focal leve de la leptomeninge, asociada con una mineralización focal leve en la región de la inflamación. No se consideró que los cambios estuvieran relacionados con la sustancia sino debidos al daño mecánico causado por la inyección
intratecal.

En conclusión, como se ha observado anteriormente en los experimentos con conejos descritos en el ejemplo 1, dicho oligonucleótido también reveló en monos una excelente tolerabilidad local cuando se aplicaba en forma de una solución 500 microM altamente concentrada. No pudieron observarse efectos tóxicos locales.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Estudio de toxicidad local después de infusión intracerebral continua en conejos

En base a la excelente tolerabilidad local de la solución 500 microM del oligonucleótido identificado por la SEC ID Nº 5 después de aplicación en embolada intratecal en conejos y monos descrita en el ejemplo 1 y 2, se investigó una infusión intracerebral continua a largo plazo de una solución 500 microM de dicho oligonucleótido durante siete días en conejos con respecto a la toxicidad local.

Se trataron ocho conejos (2/género/grupo de tratamiento) con una solución 500 microM (cloruro sódico al 0,9%) de un oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado en la lista de secuencias por la SEC ID Nº 5 por infusión continua en el parénquima cerebral del cerebro o con solución de cloruro sódico al 0,9% como control, respectivamente. La infusión se realizó a un caudal de 1 microl/h durante un periodo de 7 días empleando una bomba osmótica implantada de forma subcutánea. Se comprobaron los signos clínicos y la mortalidad y se registraron diariamente. Unas 6 y 30 horas después del final de la infusión se sacrificó 1 animal/género/grupo. Se examinaron histológicamente muestras de tejido cerebral (grosor aprox. 5 micrómetros).

En ninguno de los conejos se observaron signos clínicos de toxicidad o cambios macroscópicamente visibles.

En ambos grupos, el grupo tratado con sustancia y el de control, se observaron degeneración focal y necrosis del tejido nervioso con proliferación de las células gliales, y la existencia de un material amarillo-verdosos homogéneo y neuronas oscuras así como hemorragias de leves a moderadas. Estas lesiones se consideraron que estaban relacionadas con el proceso de infusión continua y con la fijación por inmersión y, por lo tanto, no están relacionadas con la sustancia. No hubo diferencia entre el sacrificio 6 y 30 horas después del final de la aplicación.

En conclusión, una solución 500 microM de dicho oligonucleótido cuando se aplicaba de forma intracerebral con un flujo de 1 microl/h se toleraba bien en conejos.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Efecto de la concentración de oligonucleótido en el tratamiento de pacientes con glioma maligno

La evaluación en este documento se realizó para comparar la dosificación 40 microM y 80 microM de oligonucleótido específico de TGF-beta 2 en pacientes con glioma maligno refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radioterapia, y diferentes terapias con sustancias antineoplásicas).

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 se administró por un catéter intratumoral en el centro de la lesión tumoral diana. Los pacientes se trataron con una solución 40 microM (4 pacientes) y 80 microM (13 pacientes) de dicho oligonucleótido (cloruro sódico al 0,9%) a un caudal de 4 microl/min. y 8 microl/min., respectivamente.

La Tabla Nº 1 muestra la comparación entre la supervivencia media de los pacientes y la cantidad de pacientes con remisión completa después del tratamiento con la solución 40 microM y 80 microM del oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado en el protocolo de secuencias por la SEC ID Nº 5.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA Nº 1

1

Los pacientes tratados con la solución 40 microM mostraron una media de aproximadamente 9,6 semanas de supervivencia después del inicio del tratamiento con dicho oligonucleótido, mientras que los pacientes tratados con la solución 80 microM mostraron una media de aproximadamente 35,9 semanas de supervivencia después del inicio del tratamiento con dicho oligonucleótido. Sin embargo, solamente en el grupo tratado con la solución 80 microM se observaron pacientes con remisión completa.

Las concentraciones elegidas de las soluciones de oligonucleótido así como los caudales fueron muy inferiores en comparación con las condiciones usadas en los experimentos con animales descritos en el ejemplo 3 donde no se observaron efectos tóxicos locales con solución de oligonucleótido hasta 500 microM y un caudal de 1 microl/h.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Efecto de soluciones de oligonucleótido de baja concentración en el tratamiento de pacientes con glioma maligno

La evaluación en este documento se realizó para comparar la dosificación 2,5 microM y 10 microM de baja concentración de oligonucleótido específico de TGF-beta 2 en pacientes con glioma maligno refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radioterapia, y diferentes terapias con sustancias antineoplásicas).

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 se administró por un catéter de forma intratumoral en el centro de la lesión tumoral diana. Los pacientes se trataron con una solución 2,5 microM (3 pacientes) y 10 microM (4 pacientes) de dicho oligonucleótido (cloruro sódico al 0,9%) a un flujo de 4 microl/min.

La Tabla Nº 2 muestra la comparación entre la supervivencia media de los pacientes y la cantidad de pacientes con remisión completa después del tratamiento con la solución 2,5 microM y 10 microM del oligonucleótido que hibrida con el ARNm de TGF-beta 2 identificado en el protocolo de secuencias por la SEC ID Nº 5.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA Nº 2

2

\vskip1.000000\baselineskip

Sorprendentemente, las soluciones de baja concentración de dicho oligonucleótido mostraron una elevada supervivencia media de los pacientes tratados cuando se administraba la solución al caudal de 4 microl/min. Los pacientes tratados con la solución 2,5 microM mostraron una media de aproximadamente 52 semanas de supervivencia después del inicio del tratamiento con dicho oligonucleótido. Los pacientes tratados con la solución 10 microM mostraron una media de aproximadamente 44 semanas de supervivencia después del inicio del tratamiento con dicho oligonucleótido. Sin embargo, solamente en el grupo tratado con la solución 10 microM se observaron pacientes con remisión completa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Efecto de la concentración de oligonucleótido en el tratamiento de pacientes de astrocitoma anaplásico

La evaluación en este documento se realizó para comparar la dosificación 2,5 microM, 10 microM y 80 microM de oligonucleótido específico de TGF-beta 2 en pacientes de astrocitoma anaplásico refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radioterapia, y diferentes terapias con sustancias antineoplásicas).

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado en el protocolo de secuencias por la SEC ID Nº 5 se administró por un catéter de forma intratumoral en el centro de la lesión tumoral diana. Los pacientes se trataron con una solución 2,5 microM, 10 microM y 80 microM de dicho oligonucleótido (cloruro sódico al 0,9%) a un caudal de 4 microl/min. y 8 microl/min., respectivamente. El oligonucleótido tiene un peso molecular de 6142,4 g/M como sal sódica y 7115,3 g/M como sal sódica hidrato. Por lo tanto, la cantidad total del oligonucleótido aplicada era aproximadamente 344 microg/d (sal sódica), respectivamente 398 microg/d (sal sódica que comprende agua cristalina).

Informes de casos

El paciente nº 1 diagnosticado con astrocitoma anaplásico se trató con una solución 2,5 microM (cloruro sódico al 0,9%) del oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 con la SEC ID Nº 5 aplicado con un flujo continuo de 4 microl/min. durante 4 días (2 ciclos) directamente en el tumor por un catéter. El paciente nº 1 mostró una supervivencia de aproximadamente 146 semanas después del tratamiento que fue sorprendentemente elevada en comparación con la terapia convencional con temozolomida que provoca una supervivencia media de aproximadamente 42 semanas (Theodosopoulos y col. 2001).

El paciente nº 4 diagnosticado con astrocitoma anaplásico (4 lesiones tumores/metástasis, incluyendo dos en el lado contralateral) se trató con una solución 10 microM (cloruro sódico al 0,9%) del oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 con la SEC ID Nº 5 que se aplicó a un caudal continuo de 4 microl/min. durante 4 días directamente en el tumor más grande por un catéter.

\newpage

El paciente nº 17 diagnosticado con astrocitoma anaplásico se trató con una solución 80 microM (cloruro sódico al 0,9%) del oligonucleótido que hibrida con el ARNm de TGF-beta 2 identificado en el protocolo de secuencias por la SEC ID Nº 5 a un caudal de 8 microl/min.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA Nº 3

3

\vskip1.000000\baselineskip

El paciente nº 4 tratado con una preparación farmacéutica que comprende 10 microM del oligonucleótido identificado en el protocolo de secuencias con la SEC ID Nº 5 así como el paciente nº 17 tratado con la misma preparación farmacéutica con 80 de dicho oligonucleótido mostraron casi el mismo volumen del tumor en la medida inicial. El paciente nº 4 alcanzó el máximo del tamaño tumoral de aproximadamente 58 cm^{3} después de aproximadamente 2,5 meses, mientras que en el paciente nº 17 podía observarse crecimiento tumoral hasta un máximo de 66 cm^{3} hasta aproximadamente 9,7 meses.

Después de aproximadamente 17 meses de observación, el volumen del tumor del paciente nº 4 se redujo a aproximadamente 12 cm^{3}, mientras que el tumor del paciente nº 17 aún tenía aproximadamente el doble del volumen (27 cm^{3}).

Además, en comparación con el paciente dosificado con 10 microM (nº 4) que ya mostraba regresión tumoral solamente después de un ciclo de aplicación, el paciente dosificado con 80 microM (nº 17) necesitó 12 ciclos para conseguir regresión tumoral.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Efecto de la concentración de oligonucleótido en el tratamiento de pacientes con glioma maligno por aplicación con un flujo de 4 microl/min

La evaluación en este documento se realizó para comparar la dosificación 10 microM y 80 microM de una oligonucleótido específico de TGF-beta 2 aplicado a un caudal de 4 microl/min. en pacientes con glioma maligno refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radioterapia, y diferentes terapias con sustancias antineoplásicas).

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 se administró en forma de una microperfusión de elevado flujo intratumoral continua. Los pacientes se trataron con solución de oligonucleótido (cloruro sódico al 0,9%) 10 microM (9 pacientes) y 80 microM (10 pacientes) con un flujo de 4 microl/min. durante siete días seguido de un intervalo sin fármaco de siete días (= un ciclo). Los pacientes se trataron con hasta 12 ciclos.

TABLA Nº 4

4

La Tabla Nº 4 representa una comparación de la reducción del tamaño tumoral entre la medida inicial y la última visita, la cantidad de pacientes con enfermedad progresiva y con una reducción en el tamaño tumoral entre pacientes con glioma maligno tratados con una solución 10 microM y 80 microM del oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 aplicado a un caudal de 4 microl/min.

Del grupo de pacientes tratados con la solución 10 microM de dicho oligonucleótido administrado a un caudal de 4 microl/min. solamente el 33,3% de los pacientes mostró una enfermedad progresiva en comparación con el 50% de los pacientes tratados con la solución 80 microM de dicho oligonucleótido al mismo caudal. Cinco de los nueve pacientes mostraron una reducción en el tamaño del tumor en el grupo de 10 microM en comparación con solamente 2 de los 10 pacientes en el grupo de 80 microM. La diferencia en el tamaño del tumor entre la medida inicial y la última visita se redujo a -264 mm^{3} (media) en el grupo de 10 microM. En contraste, el grupo que recibió la solución 80 microM mostró un aumento en el tamaño del tumor a 19940 mm^{3} (media).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Efecto de la concentración de oligonucleótido en el tratamiento de pacientes de astrocitoma anaplásico

La evaluación en este documento se realizó para comparar la dosificación 10 microM y 80 microM de un oligonucleótido específico de TGF-beta2 en pacientes de astrocitoma anaplásico, refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radioterapia, y diferentes terapias con sustancias antineoplásicas). Los pacientes se seleccionaron como se ha descrito en el ejemplo 2.

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 se administró en forma de una microperfusión de elevado flujo intratumoral continua. Los pacientes se trataron con solución (cloruro sódico al 0,9%) 10 microM (11 pacientes) y 80 microM (11 pacientes) de dicho oligonucleótido a un caudal de 4 microl/min. durante siete días seguido de un intervalo sin fármaco de siete días (= un ciclo). Los pacientes se trataron con hasta 12 ciclos.

La cantidad de pacientes de astrocitoma anaplásico con síntomas debidos al progreso de la enfermedad (Ae grado 1 a 4 y SAE) en el grupo de pacientes tratados con la solución 10 microM de dicho oligonucleótido fue sorprendentemente baja en comparación con pacientes infundidos con la solución 80 microM como se muestra en la Figura 1. Solamente un paciente de once del grupo de 10 microM estaba afectado en comparación con nueve de los once pacientes del grupo de 80 microM. En el grupo de 10 microM solamente se observaron síntomas de grado 3. En el grupo de 80 microM 6 de los 9 síntomas estaban clasificados/considerados como SAE (acontecimientos adversos graves).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Compatibilidad del caudal en el tratamiento de pacientes con glioma maligno

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado en la lista de secuencias por la SEC ID Nº 5 se administró en forma de una microperfusión de elevado flujo intratumoral continua. Los pacientes se trataron con una solución 10 microM de dicho oligonucleótido a un caudal de 4 microl/min., y 40 microl/min. aplicando 5,75 ml y 57 ml en 24 h, respectivamente. Cada caudal se toleró bien lo que demuestra la seguridad de la aplicación de una solución 10 microM hasta 40 microl/min. en pacientes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Efecto de la concentración de oligonucleótido en el tratamiento de pacientes con glioma maligno

La evaluación en este documento se diseñó para ensayar la dosificación 10 microM de un oligonucleótido específico de TGF-beta 2 en pacientes de astrocitoma anaplásico refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radioterapia, y diferentes terapias con sustancias antineoplásicas).

El oligonucleótido antisentido contra el ARNm de TGF-beta 2 identificado por la SEC ID Nº 5 se administró en forma de una microperfusión de elevado flujo intratumoral continua. Los pacientes se trataron con solución 10 microM de oligonucleótido (cloruro sódico al 0,9%) con un caudal a 4 microl/min. durante siete días seguido de un intervalo sin fármaco de siete días (= un ciclo). Los pacientes se trataron con hasta 12 ciclos.

La Figura 2 muestra la disminución en el tamaño del tumor en tres pacientes de astrocitoma anaplásico tratados con una solución 10 microM de dicho oligonucleótido aplicado a un caudal de 4 microl/min. El paciente nº 409 (Figura 2A) mostró una reducción del tamaño del tumor de aproximadamente 19 cm^{3} a aproximadamente 7 cm^{3} después de cinco meses de tratamiento. El tumor del paciente nº 412 (Figura 2B) se encogió de aproximadamente 39 cm^{3} a aproximadamente 26 cm^{3} después de solamente dos meses de tratamiento con la solución 10 microM de dicho oligonucleótido. El tamaño del tumor del paciente nº 413 (Figura 2C) se redujo de aproximadamente 19 cm^{3} a aproximadamente 11 cm^{3} después del tratamiento con solución 10 microM de dicho oligonucleótido.

En contraste, el paciente nº 17 (Figura 2D), tratado con una concentración 80 microM de dicho oligonucleótido y a un caudal de 8 microl/min., mostró un crecimiento tumoral aumentado durante los primeros 5 meses de aproximadamente 8 cm^{3} a aproximadamente 18 cm^{3}.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Datos de supervivencia de pacientes con astrocitoma anaplásico

Se realizó un estudio clínico en fase II controlado con activo aleatorizado multi-nacional. Los pacientes elegibles tenían AA, WHO grado III refractario o recurrente después de terapia convencional (cirugía, radio y quimioterapia) y no eran adecuados para otra resección tumoral. Los pacientes no habían recibido terapias antitumorales durante 10 días antes de entrar en el estudio (media: 42 días, intervalo de 10 a 295 días antes del inicio del tratamiento con el oligonucleótido). El estado funcional de Karnofsky (KPS) era al menos del 70%. Se excluyeron los pacientes con infecciones agudas clínicamente significativas, anormalidades cardiovasculares mayores o ataques mal controlados así como mujeres embarazadas o en lactación.

Se implantó un catéter en cada paciente y la parte perforada del catéter se puso en el área sólida, que potencia el contraste de la lesión tumoral. El catéter se insertó a través de un orificio de trépano convencional en la lesión tumoral más grande presente.

Se implantó un sistema de acceso en una bolsa subcutánea sobre la pared pectoral. El catéter de acceso se abrió subcutáneamente y se conectó al catéter del tumor, y el acceso a una bomba externa.

El oligonucleótido con la SEC ID Nº 5 disuelto en solución al 0,9% de cloruro sódico se infundió mediante la bomba a través del acceso en el tumor con un flujo continuo. Durante el intervalo de siete días entre dos ciclos de tratamiento con oligonucleótido, se infundió solución salina isotónica a 1 microl/min. Durante el transcurso del estudio la mayoría de los pacientes recibió antibióticos profilácticos de forma preoperatoria, pero no esteroides profilácticos. El oligonucleótido se administró de forma intratumoral en forma de una microperfusión de elevado flujo continua usando dispositivos de bombeo externos, PEGASUS® Vario (PEGASUS GmbH, Kiel). El catéter y el sistema de aplicación se retiraron al final del periodo de infusión completo. Para la evaluación de seguridad, se realizó el seguimiento del paciente durante 28 días. Los investigadores continuaron recogiendo datos de supervivencia.

Se evaluaron los datos de supervivencia de 38 pacientes de los que 12 pacientes se trataron con solución 10 microM de oligonucleótido, 14 pacientes se trataron con 80 microM y 12 pacientes en el grupo de control recibieron una quimioterapia convencional con temozolomida o PCV (un régimen quimioterapéutico, que consiste en procarbazina, CCNU, y vincristina, véase a continuación para más detalles).

En el grupo de 10 microM el 83,3% de los pacientes estaban por debajo de la edad de 55, en el grupo de 80 microM el 85,7% y en el grupo de control el 91,7%. Como se sabe que la edad es un factor pronóstico que influye en el efecto del paciente, el grupo de control con más del 90% de pacientes más jóvenes tenía una mejor oportunidad de supervivencia en comparación con los grupos tratados con el oligonucleótido, especialmente el grupo con la concentración 10 microM de oligonucleótido. A pesar de una por situación en la medida inicial, el grupo con el oligonucleótido con la SEC ID Nº 5 tenía una oportunidad de supervivencia mucho mayor que en el grupo de control o el grupo con la concentración 80 microM de oligonucleótido. Ajustada de acuerdo con la edad (análisis de la covarianza), esta diferencia llegó a ser incluso más significativa.

También se conoce el Estado Funcional de Karnofsky (KPS) como factor pronóstico. En el grupo de control, se incluyeron muchos más pacientes con un KPS mayor (= mejor): KPS > 80 en el grupo AP10 del 66,6%, en el grupo de AP80 del 71,4%, y en grupo de control del 83,3%. La distribución del género también era diferente. El grupo con oligonucleótido 10 microM tenía un 50% de hombres, el grupo de 80 microM tenía un 92,9% de hombres, y el grupo de control tenía un 50% de hombres. No parece que el género tenga efecto sobre la oportunidad de supervivencia, por lo tanto, no se necesitó ajuste para este parámetro.

Los resultados del estudio son como se representa en la en la Tabla Nº 5 y en la Figura 6.

Un ciclo PCV convencional típico consta de un periodo de tratamiento de 29 días seguido de un periodo sin tratamiento de 4 semanas. Durante el periodo de tratamiento de 29 días se administraron CCNU, Vincristina y Procarbazina de acuerdo con el siguiente esquema (Levin y col. 1990):

Día 1

110 mg/m^{2} de CCNU por vía oral

Días 8 y 29

1,4 mg/m^{2} (2 mg/m^{2} máximo) por día de Vincristina por vía intravenosa

Días 8 a 21

60 mg/m^{2} por día de Procarbazina por vía oral

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA Nº 5

5

La Proporción de Riesgo (HR) compara la oportunidad de supervivencia entre dos grupos en cualquier momento puntual. Como el efecto (supervivencia) está significativamente influenciado por la diferencia de edad al inicio, esta diferencia tiene que considerarse aplicando un análisis de la covarianza que ajuste los resultados para esta diferencia al inicio. Una Proporción de Riesgo ajustada a la edad (HR (edad)) de 1,8 para 10 microM frente al control significa que la oportunidad de supervivencia para cualquier paciente individual es 1,8 veces mayor cuando recibe la SEC ID Nº 5 en una concentración de 10 microM sobre recibir quimioterapia convencional (es decir, temozolomida o PCV = un régimen quimioterapéutico que consiste en procarbazina, CCNU y vincristina). Y la oportunidad de supervivencia es 3,8 veces mayor para pacientes que recibieron la SEC ID Nº 5 en una concentración de 10 microM sobre pacientes que recibieron este oligonucleótido en una concentración de 80 microM.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Comparación de diferentes concentraciones de oligonucleótido sobre la secreción de TGFbeta 2 en la línea celular A-172

Cultivo celular: Se estableció la línea celular de glioblastoma humano A-172 (Nº Acceso CRL-1620) a partir de un hombre de 53 años de edad con un glioblastoma.

Las células tumorales A-172 se cultivaron en medio DMEM con 4,5 g/l de glucosa y FCS al 10% (v/v) a 37ºC, CO_{2} al 5%, y humedad relativa del 95% de acuerdo con las instrucciones del Servicio de Líneas Celulares. Para investigar la supresión de TGF-beta 2, se sembraron 40.000 células A-172/pocillo en placas de cultivo tisular de 12 pocillos. Seis horas después de la siembra, se retiraron los sobrenadante y se remplazaron por una solución de tratamiento que constaba de medio de cultivo celular que contenía 5 microM, 10 microM, o 80 microM de oligonucleótido antisentido identificado por la SEC ID Nº 5. El medio del control negativo (= células no tratadas) se cambió sin adición de la SEC ID Nº 5. El intercambio se repitió después de 2 y 4 días. En el día 7 se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para TGF-beta 2 secretado usando Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA). Procedimientos: se cuantificó TGF-beta 2 por un Kit ELISA de TGF-beta 2 convencional de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se eliminaron los sobrenadantes de los componentes celulares por centrifugación (850 g, 5 min.). El análisis de TGF-beta 2 se realizó con el lector de placa Multiskan Ascent Tipo 354 200-240V usando un programa logístico de 4 parámetros. Resultados: La línea celular de glioblastoma humano A-172 se ensayó en una serie de experimentos de secreción de TGF-beta 2 para evaluar el efecto de diferentes concentraciones del oligonucleótido antisentido identificado por la SEC ID Nº 5. Las células A-172 producen TGF-beta 2 en condiciones de cultivo celular. Se eligieron la duración del tratamiento celular (7 días) así como las tres diferentes concentraciones (5 microM, 10 microM, 80 microM) de la SEC ID Nº 5. Se descubrió que 10 microM del oligonucleótido identificado por la SEC ID Nº 5 era el mejor inhibidor de la expresión de TGF-beta 2 en comparación con 5 y 80 microM de este oligonucleótido.

Referencias

Buur y col., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51

Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman y col. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, pág. 934-935

El-Hariri, L.M. y col., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, pág. 651-654

Krieg, A.M, y col., Annu. Rev. Immunol., 2002, 20, pág. 709-760

Langer et al Science, 1990, 249, pág. 1527-1533

Lee y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92ff

Lefebure, C. y col., Eur. Cytokine Netw, 1995, 6, pág. 7-19

Lewis, D.H., y col. Drug and Pharmaceutical Sciences, 1990

Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, pág. 1-33 Nielsen P.E. y col., Science, 1991, 254 (5037), pág. 1497-1500

Schlingensiepen, R. y col, The Oligonucleotide, 2005, 15(2), pág. 94-104

Takahasi, H. y col., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, pág. 252-257

Theodosopoulos y col., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2001, 20, pág. 2059 ff

Yamashita, S. y col., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, pág. 621-626

Wagner, y col., Science, 1993, 260, pág. 1510-1513

Wang y Martini, Clin. Invest., 1996/97, pág. 448-454

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Antisense Phrama GMBH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Dosificación de Oligonucleótidos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 061135wo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagtacacg atgg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgatgtgtt gaagaaca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctctgatgtg ttgaag

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatagtctt gcag

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcatgtct attttgta

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctttcacca aattggaagc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcttttg ggtt

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcacacag tagt

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgagcttcc ccca

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccgagccc aagg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgacgagc cgg

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgcaccaag gcga

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggttgtcg agccc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggcagtgcc ccg

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcaattctg ctcg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcgttgtgc tccc

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attccgactc ggtg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtgcgtca tcaccgt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaagaagcc

\hfill

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctaatgcct tcca

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagcagggc cagg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaaagttca gcagggc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcaaagttc agcagg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggcaaagt tcagcagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggcaaagt tcag

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaccgtggca aagttcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagaggctg accgt

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagagagaga ggctgac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acagagagag gctga

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggacagag agagg

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactggaca gagagagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcttcttgat gtggcc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctcttctt cttgatg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccctcttc ttct

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggatttct ttggcat

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatttcttt ggc

\hfill

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagttggact ctcttctc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taagttggac tctcttct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taggagtggt tgaggc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtaggagt ggttgag

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtgtagga gtgg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccacatgcc tgtg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatgaacaa cgag

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggcgatga acaacg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgctggcgat gaac

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagctagtcc cgttg

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgaagagct agtcc

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagttatgc gaagagc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccccagttat gcgaag

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggctcaccg cctcggc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catttgttgt gctgtagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtctgcatt cacatttg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catctgcaag tacgttcg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacatctgca agtacgtt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcacatctg caagtacg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttgaagat gtacctcg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaactgg atcatctc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttcttttgc aagtctgt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagctgtgc atgccttc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtcaggagg accag

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggtgccct ggcct

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgttaggc aggtt

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcatctcg gagatct

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaagtcttca ctctgc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaagttgt ccagctg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcacctcc tccag

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtcttcag gttctccc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cacggccttg ctcttgtt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttattaaagg cattcttc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagatgtcaa actcactc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagttgatg aagatgtc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattttggag acctct

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcagctatcc cagagc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggctgggtca gctat

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaatcgttca cagagaag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctttctaaa tcgttcac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagttcggac tatact

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcccaagttc aaca

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catagaaggt cgtttc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtttgcgt agac

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcctcatg cgcttc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttgcaact gctg

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccgtgcag aagtcctg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaagaaact atgagagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttagggaag aaactatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaacaaaga agagcc

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcaagaga acaaag

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacattcag taaaagtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttctggaga taactaga

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cataagacac agtcttac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaagcataa gacacagt

\hfill

18

Claims (14)

1. Uso de al menos un oligonucleótido con una longitud de 8 a 30 bloques de construcción nucleotídicos para fabricar una preparación farmacéutica para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades seleccionadas entre el grupo de cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso e inmunosupresión, en el que dicho oligonucleótido hibrida con un ARN mensajero de un TGF-beta 2 y en el que dicha preparación comprende dicho oligonucleótido en una concentración de 1 microM a 25 microM para la administración a un caudal de 2 microl/min. a 10 microl/min. durante 4 a 14 días.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la preparación farmacéutica comprende el oligonucleótido en una concentración de 1 microM a 15 microM, más preferida de 2,5 microM a 14 microM, incluso más preferiblemente de 4 microM a 13 microM, incluso más preferiblemente de 5 microM a 12,5 microM, mucho más preferiblemente de 20 microM, 10 microM, o 5 microM.

3. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que al menos un bloque de construcción nucleotídico comprende un nucleótido con una modificación 2' del ribonucleótido, en una realización preferida la modificación 2' es un grupo metoxi o metoxietiloxi.

4. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido monocatenario.

5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que al menos un enlace entre dos bloques de construcción nucleotídicos consecutivos es un fosforotioato o un metilfosfonato.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el oligonucleótido es uno de las secuencias identificadas en la lista de secuencias con las SEC ID Nº 1 a 93, son más preferidas secuencias con la SEC ID Nº 5.

7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha preparación se usa para administrar una infusión en un tejido, un tumor, o una cavidad corporal.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que dicho tejido se selecciona entre el grupo de conducto biliar, vejiga, hueso, médula ósea, cerebro, mama, colon, endometrio, epitelio, vesícula, vesícula biliar, cabeza, cabeza y cuello, corazón, intestino, articulaciones, riñón, laringe, hígado, pulmón, ganglio linfático, vasos linfáticos, músculo, esófago, ovario, páncreas, próstata, recto, conducto urinario, piel y sus capas, bazo, estómago, testículo, timo, tiroides, amígdala, o útero, o el tumor se selecciona entre el grupo de adamantinoma de huesos largos, adenoma, ameloblastoma, astrocitoma, carcinoma del conducto biliar, carcinoma de vejiga, carcinoma de los huesos, carcinoma de médula ósea, tumor cerebral, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer cervical, cáncer cervical del útero, condroma, coriocarcinoma, carcinoma de colon, carcinoma colorrectal, cistadenocarcinoma, carcinoma embrional, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, fibroma, timoma folicular, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, glioblastoma, glioma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer del corazón, cáncer hepatocelular, cáncer en la cavidad intraperitoneal, cáncer del intestino, carcinoma del riñón, cáncer de laringe, lipoma, carcinoma hepático, carcinoma pulmonar, cáncer del ganglio linfático, cáncer de los vasos linfáticos, glioma maligno, mesentelioma, meningioma, carcinoma medular, mioma, neuroblastoma, carcinoma broncogénico/pulmonar macrocítico, cáncer de esófago, osteosarcoma, cáncer de ovario, carcinoma de páncreas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, timoma papilar, feocromocitoma, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, carcinoma de células renales, carcinoma del conducto urinario, carcinoma de glándulas sebáceas, seminoma, cáncer cutáneo, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma del intestino delgado, cáncer de tejido blando, carcinoma del bazo, carcinoma de células escamosas, carcinoma de estómago, teratoma, carcinoma testicular, carcinoma de testículos, timoma, cáncer de la tiroides, tumores de la glándula tiroides, y cáncer del cuerpo uterino, o la cavidad corporal es la cavidad articular o el espacio ventricular.

9. El uso de la reivindicación 7, en el que la cavidad corporal es el espacio intraperitoneal o la cavidad pleural.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha preparación es para administración en un tumor cerebral, más preferido en astrocitoma incluyendo glioblastoma y oligoastrocitoma.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha preparación es para administración durante 3 a 8 días.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha preparación es para administrar una pluralidad de transcursos, más preferido de 2 a 20 veces, estando separados dichos transcursos por un intervalo entre un día y 12 semanas, más preferido de 2 días a 8 semanas, incluso más preferido de 4 días a 4 semanas, e incluso más preferido de 6 días a 12 días.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para el tratamiento de un mamífero, más preferido un ser humano.

\newpage

14. Una composición que comprende al menos un oligonucleótido con una longitud de 8 a 30 bloques de construcción nucleotídicos para su uso en la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades seleccionadas entre el grupo de cáncer, metástasis, enfermedad del sistema nervioso e inmunosupresión, en la que dicho oligonucleótido hibrida con un ARN mensajero de un TGF-beta 2 y, en la que dicho oligonucleótido está en una concentración de 1 microM a 25 microM para administración a un caudal de 2 microl/min. a 10 microl/min. durante 4 a 14 días.