KR19990022359A

KR19990022359A - 시토킨 시그날 트랜스듀서 ｇｐ130 ｍＲＮＡ에 특이적인 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR19990022359A
Application number: KR1019970708839A
Authority: KR
Inventors: 캐쓸린 앤 베커러; 나니브후산 다타굽타; 야티 엠. 나이두
Original assignee: 다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프; 젠-프로브 인코포레이티드
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-17
Publication date: 1999-03-25
Also published as: WO1996040908A1; EP0747480A1; AU5753196A; JPH11506601A; AU705122B2; CA2222520A1

Abstract

본 발명은 질병 관련 세포 증식의 효과적인 억제제인 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 gp130 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 제약 조성물 형태에서, 이 올리고뉴클레오티드는 암, 자기 면역 장애 및 바이러스 감염과 같은 질병으로 인한 이상 세포 증식의 치료를 위해 인간에게 투여하기에 적합하다.

Description

시토킨 시그날 트랜스듀서 ｇｐ130 ｍＲＮＡ에 특이적인 올리고뉴클레오티드

세포 성장, 기능, 분화 및 발달은 각종 다른 메카니즘에 의해 조절된다. 그 중에서, 가장 중요한 세포 조절제는 시토킨이라 불리우는 수용체 특이적 단백질이다. 이 단백질은 특이적 막 관련 수용체에 결합하며, 그후에 궁극적으로 결정적인 유전자의 발현을 조절하는 세포내 시그날을 형질도입함으로써 면역 반응 및 혈액생성과 같은 많은 정상 세포 기능을 조절한다. 또한, 시토킨 조절 장애는 암, 바이러스 감염 및 자기면역 장애와 같은 많은 다른 질병 상태에 관련되어 왔다.

개개의 시토킨은 그의 특이적 생물학적 활성에 있어서 다르긴 하지만, 많은 중복 부분이 존재한다. 특히, 인터루킨-6(IL-6) 및 관련 시토킨 옹코스타틴 M(OSM), 백혈병 억제 인자(LIF), 인터루킨-11(IL-11) 및 모양체 신경 영양 인자(CNTF)는 많은 중복되는 생물학적 기능을 나타낸다. 이러한 IL-6 유사 시토킨, 또는 IL-6 시토킨은 리간드 특이적 수용체의 공동 작용을 포함하는 복합 세포 표면 수용체 계 및 공통의 시그날 형질도입 분자 gp130을 통해 기능한다[Kishimoto, et al., Science 258: 593-597 (1992); Hibi, et al., Cell 63: 1149-1157 (1990) 참조]. IL-6 시토킨 중에서의 생물학적 활성의 중복은 공통의 시그날 트랜스듀서 gp130에 대한 그의 의존성에 기인한 것으로 생각된다. 이러한 중복은 IL-6 시토킨에 의해 유도되는 질병 관련 세포 증식에서 입증된다. 예를 들면, IL-6, OSM 및 LIF는 모두 골수종 세포의 성장을 유도하는 것으로 밝혀졌다[Kishimoto, et al., 상기 참조]. 또한, IL-6 및 OSM은 둘다 카포시 육종의 성장을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다[Miles et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 4068-4072 (1990) 참조].

최근에, 많은 연구가들이 각종 질병과 관련된 시토킨 유도된 세포 증식을 억제하는 잠재적으로 유용한 수단으로서 IL-6 생성의 억제에 관심을 기울였다. 빙크(Vink) 등은 문헌[J. Exp. Med. 172: 997-1000 (1990)]에서 IL-6 또는 그의 수용체 IL-6R에 대한 항체를 사용하여 생체내 형질세포종 성장을 억제하는 방법을 기재하고 있다. 레비(Levy) 등은 문헌[J Clin. Invest. 88: 696-699 (1991)]에서 IL-6 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용 방법을 기재하고 있다. 후지타(Fujita)(PCT 출원 제WO 94/25036호)는 IL-6R을 코딩하는 mRNA의 개시 코돈에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용을 기재하고 있다.

그러나, IL-6 시토킨 중에서의 생물학적 활성의 중복 때문에, IL-6 기능의 특정적인 억제는 이러한 시토킨족의 다른 성분의 동등한 활성에 거의 영향을 미치지 않을 수 있다. 그러므로, 전체 IL-6 시토킨족의 질병 관련 활성을 억제하는 것이 바람직하며, 이것은 그의 공통의 시그날 트랜스듀서 gp130을 억제함으로써 가장 잘 성취된다. 사실상, gp130에 대한 모노클로날 항체는 모든 IL-6 시토킨의 효과를 억제한다[Nishimoto et al., J. Exp. Med. 179: 1343-1347 (1994) 참조].

안티센스 치료학 분야는 표적 핵산, 가장 일반적으로 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 핵산 기능 조절제로서의 사용에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 즉 표적화되는 센스 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 핵산 기능을 조절하기 위해 많은 다른 방법으로 기능할 수가 있다. 표적화된 핵산이 mRNA일 때, 그것은 mRNA의 단백질로의 해독을 방지하거나 또는 리보좀의 결합 또는 전좌를 억제함으로써 기능을 할 수가 있다. 표적화된 핵산이 DNA일 때, 그것은 mRNA로의 전사를 방지할 수 있다.

서열 특이적 안티센스 메카니즘에 의해 mRNA의 생성 및(또는) 기능을 억제하는 것 이외에도, 임의의 올리고뉴클레오티드, 특히 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과는 부분적으로 비서열 특이적 메카니즘에 기인할 수 있다. 그러한 메카니즘은 항바이러스제로서의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 일부 효과에 대한 설명이 되는 것으로 보고되었다[Stein, et al., Pharmac. Ther. 52: 365-384 (1991); Majumdar, et al., Biochemistry 28: 1340 (1989) 참조].

본 발명의 목적은 질병 관련 세포 증식을 효과적으로 억제하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 gp130을 코딩하는 mRNA에 상보적이며 서열 특이적 (안티센스) 및(또는) 비-서열 특이적 메카니즘을 통해 기능한다. 본 발명의 다른 목적은 이러한 올리고뉴클레오티드로 이루어진, 인간에게 투여하기에 적합한 제약 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 질병 관련 세포 증식을 억제하기 위한 올리고뉴클레오티드 및 방법에 관한 것이다. 바람직한 타겟 부위는 시그날 트랜스듀서 gp130을 코딩하는 mRNA이다. 바람직한 치료제는 gp130 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드의 바람직한 용도는 신장 세포암, 자기면역 질병 또는 바이러스 감염과 같은 암을 앓고 있는 환자의 치료이다. 본 발명의 다른 용도로는 올리고뉴클레오티드를 시험관내 검출 프로브로서 사용하여 gp130 mRNA의 존재를 검출하는 것을 들 수가 있다. 이러한 검출 프로브는 gp130 mRNA 농도를 감소시키는데 있어서의 다른 치료제의 효능을 평가하는데 특히 유용할 것이다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다음 바람직한 서열을 기준으로 한 것이다:

바람직한 핵산 서열에 실질적으로 상응하는 핵산 서열을 가지며 바람직한 핵산 서열을 필수적으로 함유하는 (즉, 실질적으로 동일한 핵산 서열을 갖는) 올리고뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범위내에 든다.

본 발명의 다른 면은 길이가 12 내지 100 뉴클레오티드이며, gp130 mRNA에 실질적으로 상보적이며 생체내 또는 시험관내의 세포 증식을 억제하는 정제된 올리고뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 질병 관련 세포 증식의 억제 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 특징 및 잇점은 다음 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명확해질 것이다.

본 발명은 올리고뉴클레오티드 및 세포 증식을 억제하는데 있어서의 그의 사용 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 gp130 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 치료제로서의 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 세포 증식을 억제하는 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 주제를 더욱 명확하게 설명하기 위하여, 본 명세서에 사용된 용어는 달리 명시하지 않으면 다음과 같이 정의될 것이다:

안티센스 올리고뉴클레오티드: 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 센스 핵산에 상보적이며, 서열 특이적 메카니즘에 의해 적어도 부분적으로 기능하여 표적 핵산의 기능화를 조절하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

상보적: 상보적은 핵산에 관해 사용될 때, 염기가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 수소 결합을 통해 반대 극성의 다른 핵산의 뉴클레오티드 염기와 쌍 형성하는, 즉 아데닌(A)가 티미딘(T) 또는 우라실(U)와 쌍 형성하며 구아닌(G)가 시토신(C)와 쌍 형성하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 극성의 핵산을 의미한다. 예를 들면, 5'에서 3' 방향으로 서열 GCAU를 갖는 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서열 CGTA를 갖는 핵산에 상보적이다. 본 명세서에서 상보적이란 용어는 때때로 가닥 사이를 잘못 짝짓는 경우에도 불구하고 안정한 이중체가 형성될 수 있도록, 실질적으로 상보적인 핵산을 포함하도록 사용된다. 상보적인 핵산 쌍의 개개의 가닥은 플러스((+)) 또는 센스 가닥 및 마이너스((-)) 또는 안티센스 가닥으로 의미될 수도 있다.

질병 관련 세포 증식: 질병 관련 세포 증식은 암 또는 바이러스 감염과 같은 특별한 질병에 의해 야기되는 세포 분열 및(또는) 성장의 이상 수준을 의미한다.

혼성화: 혼성화는 염기쌍 상호 작용을 통한 상보적 핵산 사이의 이중체의 형성을 의미한다.

리포좀: 리포좀은 구형의 이중층(들)에 배열된 양친매성 지방으로 이루어진 소포를 의미한다.

변형된: 변형된은 핵산에 관해 사용될 때, 임의의 천연 구조가 변형된 핵산을 의미한다. 이러한 변형은 포스포디에스테르 결합, 당(RNA의 경우에 리보오스 또는 DNA의 경우에 데옥시리보오스) 및(또는) 퓨린 또는 피리미딘 염기에 대한 변형을 포함한다. 변형된 포스포디에스테르 결합으로는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트 및 포스포로디티오에이트를 들 수가 있다. 변형된 dNTPs는 핵산에 혼입될 때 변형된 핵산 형성의 결과를 낳을 뉴클레오시드 트리포스페이트를 의미한다.

핵산 서열: 핵산 서열 또는 서열은 뉴클레오티드의 특별한 서열을 갖는 핵산, 및 특별한 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열 또는 배열 둘다를 의미한다. 이러한 두 의미가 적용되는 것은 이 용어가 사용된 내용으로부터 명확해질 것이다.

올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 정의된 핵산 서열을 갖는 올리고 데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다.

약리학적 상용성 담체: 약리학적 상용성 담체는 올리고뉴클레오티드가 첨가되어 환자로의 그의 투여를 용이하게 하고 임의의 허용되지 않는 정도의 독성 또는 약리학적 부작용 없이 효력을 나타나게 하는 제제를 의미한다.

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포디에스테르 결합 대신에 모든 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나 및 모든 포스포로티오에이트 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 사용된다.

극성: 극성은 하나의 데옥시리보오스 (또는 리보오스) 잔기의 C3 위치가 포스페이트 결합을 통해 인접한 데옥시리보오스 (또는 리보오스) 잔기의 C5와 결합될 때 형성되는 핵산 중합체의 배향을 의미한다. 핵산의 극성은 5'에서 3' 또는 3'에서 5'로서 칭해진다.

폴리머라제: 폴리머라제는 뉴클레오티드의 핵산으로의 순차적인 첨가를 촉매화할 수 있는 효소를 의미한다.

프라이머: 프라이머는 역전사 효소와 같은 폴리머라제에 의한 합성을 개시하기 위해 주형과 혼성화하고 그 주형에 상보적인 그의 3' 말단에 연결된 공유 결합된 뉴클레오티드의 순차적인 첨가에 의해 연장되는, 주형에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

실질적으로 상보적: 실질적으로 상보적은 핵산에 관해 사용될 때, 모든 뉴클레오티드가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 나타내는 것은 아니지만, 두 핵산은 적절한 조건하에서 안정한 혼성체를 형성할 수 있도록 하는 서열을 갖는 것을 의미한다.

주형: 주형은 목적하는 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위한 패턴을 제공하며 기질로서 작용하는 뉴클레오티드의 서열을 갖는 핵산을 의미한다. 그렇게 작용하기 위하여, 주형은 프라이머와 혼성화할 수 있거나, 또는 자기-프라이밍 주형의 경우에 자기 프라이밍 영역을 형성할 수 있는 서열을 함유하여야 한다.

치료학적 유효량: 치료학적 유효량은 IL-6의 과도 생성과 관련된 질병을 앓고 있는 환자에서 질병 관련 세포 증식 및(또는) 성장을 억제하는데 효과적인 양을 의미한다. 바람직하게는, 치료학적 유효량은 질병과 관련된 1가지 이상의 증상을 어느 정도로 완화시킨다.

올리고뉴클레오티드를 사용한 치료 분야의 개발은 현재 광범위하다. 올리고뉴클레오티드의 치료제로서의 작용의 정확한 메카니즘은 종종 확인하기가 어렵긴 하지만, 많은 추정된 메카니즘이 제안되었으며 이러한 임의의 또는 모든 다른 메카니즘은 연계하여 작용하여 원하는 결과를 얻을 수 있다. 한 작용 메카니즘은 안티센스를 기초로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 DNA, mRNA 또는 전구체 mRNA와 같은 표적 핵산에서 발견되는 특정 서열에 상보적인 서열을 갖도록 정해진다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에서의 특정 서열에 혼성화함으로써 DNA의 단백질 코딩 기능을 저해한다.

특별한 올리고뉴클레오티드의 안티센스 기능을 설명할 수 있는 몇가지 제안된 메카니즘으로는 RNase H 활성을 갖는 효소에 의한 RNA:DNA 혼성체에서의 RNA의 분해; mRNA 전사의 조기 종결; mRNA의 단백질 해독 부위로의 전좌의 억제; mRNA 인트론/엑손으로의 혼성화에 의한 mRNA 처리의 방해; 비단백질 코딩 (비해독) 영역으로의 혼성화에 의한 mRNA 기능의 방해; 및(또는) mRNA 개시 코돈으로의 혼성화에 의한 리보좀 결합의 방해를 들 수가 있다. 요약하면, 이러한 서열 특이적 안티센스 메카니즘 각각은 어떻게든 해서 특별한 유전자의 발현을 억제하는 작용을 한다.

서열 특이적 안티센스 메카니즘 이외에, 특정의 변형된 올리고뉴클레오티드는 비서열 특이적 메카니즘을 통해 핵산 기능을 억제할 수 있다. 몇몇 경우에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 동일한 염기를 무작위 순서로 함유하는 대조군 올리고뉴클레오티드와 비교할 때, 대조군 올리고뉴클레오티드도 또한 단백질 생성의 억제 기능을 나타낸다. 그러한 비서열 특이적 메카니즘의 정확한 메카니즘이 알려지지는 않았지만, 이러한 효과는 대조군 올리고뉴클레오티드에 의한 다른 필수적인 유전자의 비본질적인 억제에 기인하였다[Milligan, et al., in Antisense Therapeutics; Development of Antisense Therapeutics, Annals of the New York Academy of Sciences, p. 229-241 참조].

신장 암 세포의 증식에 대한 올리고뉴클레오티드의 비서열 특이적 효과에 대한 가능한 설명 중 하나는 토포이소머라제의 억제이다. 신장 세포암에 대해 활성을 갖는 많은 항암제는 토포이소머라제를 억제하는 것으로 입증되었다[Shuin, et al., Anticancer Research 14: 2621-2626 (1994) 참조]. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 토포이소머라제의 억제는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 기인한 관찰된 증식 방지 효과 일부의 원인이 될 수 있는 것으로 가정된다.

어떠한 경우에, 서열 특이적 및 비서열 특이적 메카니즘은 둘다 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 효과를 설명할 수 있다. 작용 메카니즘의 완전한 이해가 세포 기능 억제 올리고뉴클레오티드의 고안에 필수적인 것은 아니다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 mRNA 코딩 gp130에 상보적이며, 안티센스 및(또는) 다른 메카니즘을 통해 gp130 생성을 억제할 수 있다. gp130의 생성을 조절하는 것과 같은, IL-6 및 관련 시토킨의 기능화를 억제하는 치료제는 IL-6 시토킨의 과도 생성의 효과를 없애는데 사용될 수 있다.

IL-6의 정상적인 기능화는 손상 또는 감염에 대한 반응으로서, 섬유아세포, 대식세포, 내피세포 및 표피세포와 같은 많은 다른 세포 유형에 의한 IL-6 생성의 유도를 포함한다. 손상 또는 감염되지 않은 경우, 이들 세포는 정상적으로는 IL-6을 생성하지 않는다. IL-6 생성은 B- 및 T- 세포 증식 또는 분화 뿐만 아니라 T-세포 및 대식 세포 활성화를 포함한 각종 메카니즘을 통한 면역 반응 강화의 결과를 낳는다.

그러나, IL-6 과도 생성은 많은 다른 질병 상태에 영향을 미친다. 예를 들면, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 감염된 B 임파구에서의 IL-6 과발현은 종양생성원에 부분적으로 원인이 되는 것으로 밝혀졌다[Scala et al., J. Exp. Med. 172: 61-68 (1990) 참조]. 표피 세포에 의한 IL-6의 과도 생성은 건선과 관련된 외피 이상증식에서 원인제 역할을 하는 것으로 밝혀졌다[Grossman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 86: 6367-6371 (1989) 참조]. 신장 암 세포에 의한 IL-6의 과도 생성은 증가된 물질대사와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다[Takenawa, et al., Journal of the National Cancer Institute 83 (22): 1668-1672 (1991) 참조]. IL-6은 또한 파골세포 발달의 강화로 인한 폐경기 중의 골 흡수 증가에 역할을 하는 것으로 보고되었다[Jilka et al., Science 257: 88-91 (1992); and Girasole et al., Journal of Clinical Investigation 89: 883-891 (1992) 참조].

또한, IL-6은 다발성 골수종 세포에 대한 종양 성장 인자인 것으로 밝혀졌다[Klein, et al., Eur. Cytokine Net., 1(4): 193-201 (1990) 참조]. IL-6 과도 생성과 관련된 다른 질병 상태로는 형질구성 백혈병, 악액질, 맥관막 증식성 사구체 신염, 카포시 육종, 류머티스 관절염, 초 감마글로불린 혈증, 캐슬 질병, IgM 감마글로불린 장애, 심장 점액종 및 자기면역 인슐린 의존성 당뇨병을 들 수가 있다.

따라서, IL-6 기능을 억제하는 것으로 고안된 치료제는 광범위한 치료 용도를 갖는다. 그것은 상기 임의의 질병 상태를 치료하는데 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 신장 세포 암을 치료하는데 사용된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA일 수 있다. 그 올리고뉴클레오티드는 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 화학 합성은 스텍(Stec) 등의 문헌(J. Am. Chem. Soc. 106: 6077-6079 (1984))에 기재된 방법에 따라 포스포로아미다이트 방법 및 모델 380-B(Applied Biosystems, Inc., Foster City, California)와 같은 자동 합성기를 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.

본 발명 내에 포함된 올리고뉴클레오티드는 비변형되거나 또는 변형될 수 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드는 핵산의 임의의 천연 구조를 변화시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 구조는 포스포디에스테르 결합, 당(RNA의 경우에 리보오스 또는 DNA의 경우에 데옥시리보오스) 및(또는) 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함한다. 올리고뉴클레오티드에 대한 임의의 변형은 표적 핵산에 대한 혼성화에서 올리고뉴클레오티드를 비효과적으로 하거나 또는 생체내에서 사용될 경우 독성으로 만들지 않는다면 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 안정한 이중체의 형성을 완전히 억제하지 않고 혼성화 효능을 감소시킬 수 있는 임의의 변형을 포함한다.

바람직한 변형은 뉴클레아제의 존재하에 그것을 더욱 안정하게 하는 포스포디에스테르 결합에 대한 것이다. 포스포디에스테르 결합을 변형시키면 세포 흡수를 증가시킬 수도 있다. 변형된 포스포디에스테르 결합으로는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포셀레네이트 결합을 들 수가 있다. 올리고뉴클레오티드는 모든 변형된 결합, 다른 변형된 결합의 혼합, 변형된 결합 및 비변형된 결합의 혼합 또는 키메릭 올리고뉴클레오티드에서와 같이 올리고뉴클레오티드의 다른 영역에 선택적으로 위치하거나 또는 존재하는 이들의 임의의 배합을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드는 상기한 많은 방법을 포함한 공지된 방법에 의해 비변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 방법으로 합성될 수 있다.

다른 변형 예로는 알파-아노머와 같은 변형된 당 기의 혼입 또는 2'-O-메틸올리고뉴클레오티드로 혼입된 당을 포함한다. 뉴클레오티드 퓨린 또는 피리미딘 염기에 대한 변형도 또한 예상된다.

바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 안정성을 증가시키고, 세포 흡수를 용이하게 하고 올리고뉴클레오티드가 서열 독립적 메카니즘 및 서열 특이적 안티센스 메카니즘에 의해 세포 기능을 억제할 수 있도록 하는 포스포로티오에이트 결합을 함유한다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 12 내지 100 뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게는, 이들 올리고뉴클레오티드는 길이가 14 내지 50 뉴클레오티드이고, 가장 바람직하게는 길이가 18 내지 35 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 길이는 질병 관련 세포 증식 및(또는) 성장을 억제하는데 있어서의 올리고뉴클레오티드의 효능을 최적화하도록 선택되어야 한다. 올리고뉴클레오티드에서의 임의의 변형의 존재는 또한 올리고뉴클레오티드의 전체 효능에 대한 길이의 효과에 영향을 미칠 것이다.

최적의 올리고뉴클레오티드 크기를 확인하기 위하여, 몇가지 인자가 고려되어야 한다. 짧은 올리고뉴클레오티드는 세포에 의해 더욱 용이하게 내화되는 잇점을 갖는다. 그러나, 그들이 충분히 길지 않다면, 예를 들면 10 염기 미만이라면, 그들은 표적 서열과 특이적이고 안정한 혼성체를 형성하지 않을 수 있다. 한편, 더 긴 올리고뉴클레오티드는 리보좀이 올리고뉴클레오티드를 대체하는 것을 방지함으로써 해독 정지를 강화시킬 수 있는 안정성이 증가된 그의 표적에 혼성화할 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드가 너무 긴 경우, 예를 들면 150 염기를 초과하는 경우, 그것은 세포에 의해 효율적으로 흡수될 수 없고 및(또는) 잠재적으로 세포독성이 될 수 있다.

정상적인 생리학적 조건과 유사하도록 고안된 올리고뉴클레오티드 스크리닝 분석은 생활 세포에서 올리고뉴클레오티드가 혼성화하여 갖는 효능을 예측하는데 이용될 수 있다. 그러한 스크리닝 분석은 넬슨(Nelson) 등에 의해 국제 공개 제95/03427호에 기재되어 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 gp130 mRNA에 상보적이다. gp130 mRNA의 서열은 문헌[Hibi, et al., Cell 63: 1149-1157 (1990)]에 보고되었다. 바람직하게는, 표적 서열은 gp130 mRNA의 단백질 코딩 영역이다. 본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 다음 서열에 의해 제공된다:

2가지의 특히 바람직한 서열은 서열 3 및 5에 의해 제공된다.

전체 올리고뉴클레오티드 서열이 표적 gp130 mRNA 서열에 완전히 상보적이 될 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 상보적이 되는 것, 즉 표적과 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 것이 필요할 뿐이다. 추가의 비상보적 뉴클레오티드는 임의의 위치에서, 예를 들면 3' 또는 5' 말단에서, 또는 그들 사이의 임의의 다른 위치에서 안티센스 올리고뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 그러한 추가의 비상보적 뉴클레오티드는 생체내 분해를 억제하고 및(또는) 유전자 발현을 간섭하는 올리고뉴클레오티드의 효과를 강화시키는 작용을 할 수 있다. 표적 서열과 안정한 혼성체를 형성하는데 필요한 상보성의 정도는 존재하는 변형의 유형 및 정도, 수소 결합에 포함된 염기의 종류(예를 들면, G:C 수소 결합은 A:T 보다 더 강하다) 및 올리고뉴클레오티드의 길이에 좌우될 것이다.

본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오티드는, 치료제로서의 유용성 이외에 진단 프로브로서 또한 연구 수단, 예를 들면 증폭 프라이머로서도 유용하다. gp130 mRNA에 특이적인 표지화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써, gp130 mRNA의 존재 또는 양이 확인될 수 있다. 표지화된 올리고뉴클레오티드 프로브의 고안 및 생성 및 혼성화 방법에서의 그의 사용은 당업계의 숙련인에 의해 쉽게 이루어진다.

치료 용도로는 올리고뉴클레오티드 약리학 및 전달을 들 수가 있다. 치료제로서의 사용을 위해서, 올리고뉴클레오티드는 약리학적으로 안정되어야 한다. 즉, 그것은 최소 독성 및 적당한 분포 및 물질 대사를 나타내어야 한다. 다른 약리학적 가치는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 평가될 수 있다.

약리학적으로 허용되는 담체 중의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 제약 조성물은 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 여러 가지의 다른 메카니즘에 의해 투여될 수 있다. 그러한 메카니즘으로는 경구 투여(흡입 또는 비경구), 주사(정맥내, 근육내, 피하, 복강내) 및 국소 투여(비내, 경피)를 들 수가 있다. 이러한 다른 메카니즘 각각에 적합한 조성물은 통상적으로 제조되고 이용된다.

약리학적으로 허용되는 담체의 예로는 물, 염수, 완충액 또는 탄수화물 용액과 같은 수용액; 및 리포좀, 중심체 또는 유제와 같은 전달 비히클을 포함한다. 전달 비히클은 생체내 안정성을 증가시키는데 이용될 수 있다. 리포좀은 세포내 전달을 향상시키는 능력, 긴 순환 반감기, 수용체 표적화된 분자의 혼입의 용이성, 그의 최소 독성 및 우수한 생물학적 분해성 때문에 바람직하다. 리포좀은 당업계에 공지된 각종 기술에 의해 제조될 수 있다[Bangham et al., J. Mol. Biol., 13: 238-252 (1965) 참조]. 이러한 방법은 일반적으로 먼저 유기 용매에 지방을 용해시키고 혼합한 후에 증발시키는 것을 포함한다. 그후에, 적당량의 수성상을 지방상과 혼합하고, 그후에 리포좀을 형성하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킨다. 수성상은 일반적으로 완충액 또는 당과 같은, 다른 용질과의 현탁액 중의 유생분자로 이루어질 것이다.

본 명세서에 기재된 제약 조성물의 정확한 투여량 및 투여 횟수는 질병 징후, 투여 경로, 전달 비히클 및 올리고뉴클레오티드 조성과 같은 몇가지 인자에 좌우된다. 치료 기간은 질병 증상에 대한 치료 효과에 좌우될 것이며 장기간 동안 1일 수회 투여를 포함할 수 있다.

실시예 I

올리고뉴클레오티드의 합성

포스포디에스테르 결합 뿐만 아니라 포스포로티오에이트와 같은 변형된 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 당업계에 잘 알려진 절차에 따라 합성하였다. 예를 들면, 문헌[Methods in Enzymology 154:287 (1987), Caruthers et al.]에서는 표준 포스포르아미다이트 고상 화학법에 의해 포스포디에스테르 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 절차를 기재하고 있다. 바트(Bhatt)의 미국 특허 제5,253,723호는 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 올리고뉴클레오티드의 합성 절차를 기재하고 있다. 클렘(Klem) 등의 PCT 국제 공개 제92/07864호는 메틸포스포네이트 결합을 포함한 다른 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성을 개시하고 있다.

실시예 II

포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 세포 증식의 억제

gp130에 대한 mRNA에 상보적인 몇가지의 다른 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 암 세포 증식 억제제로서의 효능을 시험하기 위하여, 2가지의 다른 세포주를 연구하였다. 이상적으로 고농도의 IL-6를 생성하는 것으로 알려진 신장 세포 암 유래된 세포주인 Caki-1 세포(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)를 대조군으로서 작용하는 EBV 형질변환된 정상 신장 세포주인 293 세포(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland)와 함께 사용하였다.

Caki-1 세포 또는 293 세포를 세포가 실험 시간 내에 융합되지 않는 조건하에서 48 웰 플레이트에서 배양하였다. 세포를 플레이트에 유착시킨 후에 (4-6 시간), 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 함유하는 세포 배지를 배양액에 첨가하고, 배지만을 비-올리고뉴클레오티드 대조군 세포에 첨가하였다. 세포를 표준 조건(37 ℃, 5% CO₂) 하에서 인큐베이션시키고 4일째에 배지를 대체하였다. 7일째에, 배지를 제거하고 트립신을 이용하여 플레이트로부터 세포를 방출시켰다. 웰 당 세포수를 혈구계를 이용하여 세포 밀도를 계수함으로써 확인하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 1 μM 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Caki-1 세포의 세포 증식을 70-90% 억제하였지만, 대조군 세포의 증식에 대해서는 거의 영향을 미치지 않았다.

올리고뉴클레오티드	Caki-1 세포의 감소율(%)
서열 1	99
서열 2	64
서열 3	91
서열 4	66
서열 5	85
서열 6	62
서열 7	60
서열 8	71
서열 9	85
서열 10	62
서열 11	32
서열 12	43

실시예 III

다른 세포주에서의 세포 증식의 억제

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 IL-6 과도 생성과 관련된 질병 상태를 나타내는 임의의 세포 증식을 억제하는 것으로 예상되었다. 이러한 가정을 시험하기 위하여, 다양한 정도의 IL-6 과도 생성을 나타내는 몇가지의 세포주, 즉 각각 신장 세포 암 세포주인 Caki-1 및 Caki-2 (American Type Culture Collection); 1차 신장 세포 선암종인 786-0 (American Type Culture Collection CRL-1932); 다발성 골수종인 U266 (American Type Culture Collection TIB 196); 및 대조군으로서 작용하는 293 세포를 선택하였다.

세포를, 서열 3에 의해 제공된 올리고뉴클레오티드 1 μM을 함유한 배지의 존재하에 플라스크 당 1 x 10⁵세포의 농도로 플라스크에 접종하였다. 5일 후에, 배지 1 ㎖를 각 플라스크로부터 모았다. 각 분취량 17 ㎕를 10% SDS-PAGE 겔 상에서 전기 이동시키고 그후에 나일론 막으로 이동시켰다. IL-6의 농도를 면역블롯팅법으로 정량화하고 ECL 웨스턴 블롯팅 분석 시스템에 의해 가시화하였다(Amersham Life Sciences, Arlington Heights, Illinois). 시그날을 앰비스(Ambis; San Diego, California) 화상 분석기를 사용하여 정량화하고 최종 세포수를 계수하였다. IL-6 농도를 Caki-1 세포로 관찰된 농도의 비로서 표시하였다.

세포 증식 연구는 실시예 II에서와 같이 수행하였다.

예측한 바와 같이, 최대량의 IL-6 생성을 나타내는 세포주는 또한 올리고뉴클레오티드의 존재하에 가장 큰 세포 증식 감소를 나타내었다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

세포 증식의 억제 및 IL-6 농도와의 상호 관계

세포주	세포 증식의 감소율(%)	IL-6 농도의 비
Caki-1	88	1.00
Caki-2	51	0.21
786-0	60	0.27
U266	38	0.26
293	11	0.07

실시예 IV

IL-6 수용체의 세포 표면 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과

세포 표면에 대한 IL-6의 고친화성 결합은 IL-6R 및 gp130 둘다의 존재를 필요로 한다. 따라서, gp130 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 IL-6 결합을 억제하는 것으로 예상되었다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 IL-6 결합에 대한 효과를 평가하기 위하여, Caki-세포의 유량 혈구 계산 분석을 실시하였다. IL-6 결합을 연구하는데 재조합 바이오틴-표지된 IL-6(RD Systems, Inc., Minneapolis, MN) 및 형광 이소티오시아네이트(FITC) 표지된 아비딘을 이용하였다. 또한, 세포 표면 단백질 발현에 대한 임의의 비특이적 효과를 조절하기 위하여, 피코에리트린(PE)으로 표지된 인간 HLA 분류 I 분자에 대한 모노클로날 항체를 이용하였다.

Caki-1 신장 암 세포를 4일 동안 융합에 도달하지 않고 성장하게 하는 밀도로 24웰 배양 플레이트에 접종시켰다. 세포를 멸균수 중의 배양액에 직접 첨가된 1 μM 포스포르티오에이트 올리고뉴클레오티드(최종 농도)로 처리하였다. 세포를 0.5 mM EDTA를 함유하는 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하여 매트릭스로부터 매일 제거하고, PBS 중에서의 원심 분리에 의해 세척하고 4 x 10⁶/㎖ 이하의 농도에서 PBS 25 ㎕ 중에 재현탁시켰다.

세포를 혈구 계산을 위해 바이오티닐화된 IL-6 10 ㎕를 첨가하고, 이어서 4 ℃에서 60분 동안 인큐베이션시켜 염색하였다. 초기의 인큐베이션 후에, FITC 아비딘 용액 10 ㎕ 및 PE-항-HLA 5 ㎕를 첨가하였다. 4 ℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션시킨 후에, 세포를 PBS에서 2회 세척하고 유량 혈구 계산법을 이용하여 분석하였다. FITC 및 PE 방출 파장 둘다에 대한 산란 도표 및 평균 형광 세기(MFI)를 얻었다. IL-6 또는 항-HLA 결합의 감소율(%)을, 염색되고 비처리된 대조군의 MFI로부터 비염색된 세포의 MFI 값을 빼고 그 수를 비염색된 세포 및 처리되고 염색된 세포 사이의 MFI 차이로 나누어 계산하였다. 최대 효과는 올리고뉴클레오티드에 노출시킨 지 3일 후에 관찰되었다. 그 결과(4회의 실험 결과를 평균함)를 하기 표 4에 나타내었다.

IL-6R의 감소율(%)

올리고뉴클레오티드	IL-6R의 감소율(%)	HLA의 감소율(%)
서열 3	24	6
서열 5	25	0

결과에서 알 수 있는 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대조군 세포 표면 단백질 발현의 부수적인 감소 없이 IL-6R에 대한 세포의 IL-6 결합을 억제한다.

실시예 V

gp130 mRNA의 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과

안티센스 올리고뉴클레오티드의 생물학적 효과에 대해 제안된 메카니즘 중 하나는 혼성화 시점에서의 엔도뉴클레아제 RNAase H에 의한 표적 mRNA의 분열 및 그에 이어지는 분자의 엔도뉴클레아제 분해를 포함한다. 그러한 현상은 비-표적화된 RNA 분자의 감소가 수반되지 않고 특정 mRNA의 정상 상태 농도의 감소로서 실험적으로 그 자체를 증명한다. gp130 메시지 수준에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위하여, gp130, 및 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제(GAPDH)를 코딩하는 관련 없는 mRNA 둘다에 특이적인³²P-표지된 프로브를 이용하여 처리된 Caki-1 세포 대 비처리된 Caki-1 세포에 대해 노던 블롯 분석을 실시하였다. 백만의 세포를 양이온성 지질(Lipfectin(등록상표), BRL Life Sciences, Gaithersburg, MD)로 캡슐화된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 서열 3 400 nM의 존재하에 또는 대조군으로서 양이온성 지질 만의 존재하에 18시간 동안 예비 융합 밀도에서 배양시켰다. 처리한 후에, 세포를 배양 용기로부터 수거하고 RNA의 추출을 위해 시판되는 시약 및 프로토콜(RNAzolB, CinnaBioTecx, Houston, TX)을 이용하여 용해시켰다. 그후에, 폴리아데닐화 RNA(mRNA)를 마이크로 패스트 트랙(Micro Fast Track) 시스템(Invitrogen Corp., San Diego, CA)을 이용하여 분리하였다. 폴리아데닐화 RNA를 포름알데히드로 변성시키고, 3 ㎍을 수개의 레인 각각에 놓고 1% 아가로스를 통해 전기이동시켰다. 용해된 RNA를 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 형성된 노던 블롯을 gp130 및 GAPDH 표지된 프로브 둘다에 노출시켰다. 블롯의 방사선 사진술을 행한 결과, 비처리된 세포로부터 유래된 레인에 비해 처리된 세포로부터 얻은 RNA를 함유하는 레인에서 gp130의 밴드 세기의 뚜렷한 감소가 관찰되었지만, GAPDH는 그렇지 않았다. 앰비스(AMBIS) 포스포르이미징 시스템(North Arlington, IL) 상에서 밴드 세기를 정량화하였으며, 그 결과 처리된 세포에서 gp130 mRNA 농도는 40-50% 감소되었지만, GAPDH 메시지 농도는 감소되지 않았다.

본 발명을 특정 실시태양 면에서 설명하였지만, 본 발명의 많은 변형 및 변화의 실시가 가능하다. 그러므로, 첨부된 청구 범위의 영역내에서 본 발명이 특별하게 기재한 것과 다르게 실행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드

(ii) 발명의 명칭: 질병 관련 세포 증식을 억제하기 위한 방법 및 시토킨 시그날 트랜스듀서 gp130 mRNA에 특이적인 올리고뉴클레오티드

(iii) 서열수: 12

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 리온 앤 리온

(B) 거리: 633 웨스트 15번 스트리트

(C) 도시: 로스 앤젤레스

(D) 주: 캘리포니아

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 90071-2066

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 3.5 디스켓, 144 Mb

(B) 컴퓨터: IBM 호환성

(C) 작동 시스템: MS-DOS(버전 6.22)

(D) 소프트웨어: 워드 퍼팩트(버전 5.1)

(vi) 현출원 데이타:

(A) 출원번호:

(B) 출원일:

(C) 분류:

(vii) 선행 출원 데이타:

하기 출원을 포함한 모든 선행 출원

(A) 출원번호: 08/476,634

(B) 출원일: 06/07/95

(C) 출원번호: 08/484,518

(D) 출원일: 06/07/95

(viii) 변호사/대리인 정보:

(A) 성명: 쉬나이더, 캐롤

(B) 등록 번호: 34,923

(C) 참조/사건 번호: 219/076-PCT

(ix) 통신 정보:

(A) 전화: (213) 489-1600

(B) 팩스: (213) 955-0440

(C) 텔렉스:

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 25 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 1:

25

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 2:

20

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 26 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 3:

26

(2) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 23 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 4:

23

(2) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 25 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 5:

25

(2) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 24 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 6:

24

(2) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 25 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 7:

25

(2) 서열 8에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 26 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 8:

26

(2) 서열 9에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 34 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 9:

34

(2) 서열 10에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 21 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 10:

21

(2) 서열 11에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 11:

19

(2) 서열 12에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 서열 설명: 서열 12:

20

Claims

하기 서열

로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열 3을 함유하는 올리고뉴클레오티드.

서열 3
제2항에 있어서, 서열 5를 함유하는 올리고뉴클레오티드.

서열 5
하기 서열

로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 필수적으로 함유하는 올리고뉴클레오티드를 치료학적 유효량으로 함유하는, 환자의 질병 관련 세포 증식을 억제할 수 있는 치료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 담체가 리포좀인 치료 조성물.
제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드인 치료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 3을 함유하는 치료 조성물.

서열 3
제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 5를 함유하는 치료 조성물.

서열 5
길이가 12 내지 100 뉴클레오티드이며, gp130을 코딩하는 mRNA의 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 정제된 올리고뉴클레오티드를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 질병 관련 세포 증식의 억제 방법.
제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 하기 서열

로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 필수적으로 함유하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 포스포로티오에이트화된 올리고뉴클레오티드인 방법.
제11항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 핵산 서열 3을 필수적으로 함유하는 것인 방법.

서열 3
제11항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 핵산 서열 5를 필수적으로 함유하는 것인 방법.

서열 5