JP2000004883A - Ｉｌ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents
Ｉｌ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドInfo
- Publication number
- JP2000004883A JP2000004883A JP10177188A JP17718898A JP2000004883A JP 2000004883 A JP2000004883 A JP 2000004883A JP 10177188 A JP10177188 A JP 10177188A JP 17718898 A JP17718898 A JP 17718898A JP 2000004883 A JP2000004883 A JP 2000004883A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- antisense oligonucleotide
- protein
- sequence
- atopic dermatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＩＬ−１０蛋白を病因とする疾患に有効なア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、及びそれを有効成分と
して含有するアトピー性皮膚炎等の疾患の治療薬を提供
する。 【解決手段】 一定の配列を有し、ＩＬ−１０蛋白をコ
ードする染色体ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡと特異的
にハイブリダイズし、ＩＬ−１０蛋白の発現を阻害する
ことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及
びそれを有効成分として含有するアトピー性皮膚炎、ア
レルギー性皮膚疾患、ＳＬＥ、ＥＢウイルス感染症また
はリンパ腫用治療薬。
ンチセンスオリゴヌクレオチド、及びそれを有効成分と
して含有するアトピー性皮膚炎等の疾患の治療薬を提供
する。 【解決手段】 一定の配列を有し、ＩＬ−１０蛋白をコ
ードする染色体ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡと特異的
にハイブリダイズし、ＩＬ−１０蛋白の発現を阻害する
ことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、及
びそれを有効成分として含有するアトピー性皮膚炎、ア
レルギー性皮膚疾患、ＳＬＥ、ＥＢウイルス感染症また
はリンパ腫用治療薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＩＬ−１０（ヒト
インターロイキン−１０）蛋白をコードする染色体ＤＮ
Ａおよび／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし
て、ＩＬ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドと、それを有効成分として含有するアト
ピー性皮膚炎等の疾患の治療薬に関する。
インターロイキン−１０）蛋白をコードする染色体ＤＮ
Ａおよび／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし
て、ＩＬ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドと、それを有効成分として含有するアト
ピー性皮膚炎等の疾患の治療薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】アトピー性皮膚炎は、増悪、寛解を繰り
返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患である。その
罹病率は、全人口の３〜１０％を占めると考えられてい
る（上田宏：皮膚科ＭＯＯＫアトピー性皮膚炎、金原出
版、１２−１８、１９８５）。アトピー性皮膚炎の発症
メカニズムは未だ明らかにされていないが、少なくとも
ＩｇＥを介したアレルギー反応のみではなく、皮膚の易
刺激性という因子もその病態形成に大きく関与すると言
われている。
返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患である。その
罹病率は、全人口の３〜１０％を占めると考えられてい
る（上田宏：皮膚科ＭＯＯＫアトピー性皮膚炎、金原出
版、１２−１８、１９８５）。アトピー性皮膚炎の発症
メカニズムは未だ明らかにされていないが、少なくとも
ＩｇＥを介したアレルギー反応のみではなく、皮膚の易
刺激性という因子もその病態形成に大きく関与すると言
われている。
【０００３】アトピー性皮膚炎の病巣部では、肥満細胞
や好酸球の脱顆粒、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を主とした細胞浸
潤が認められる。皮膚に侵入したアレルゲンは、肥満細
胞上のＩｇＥを架橋し、化学伝達物質やサイトカインを
遊離させ、血管透過性の亢進や白血球の遊走を促す。ま
た、アレルゲンは、ランゲルハンス細胞などに捕捉さ
れ、Ｔ細胞に抗原提示される。活性化されたＴ細胞は、
様々なサイトカインを産生し炎症を助長している（Ｃｏ
ｏｐｅｒ，Ｋ.Ｄ.，Ｊ.Ｉｎｖｅｓｔ.Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ.，１０２，１２８，１９９４）。
や好酸球の脱顆粒、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を主とした細胞浸
潤が認められる。皮膚に侵入したアレルゲンは、肥満細
胞上のＩｇＥを架橋し、化学伝達物質やサイトカインを
遊離させ、血管透過性の亢進や白血球の遊走を促す。ま
た、アレルゲンは、ランゲルハンス細胞などに捕捉さ
れ、Ｔ細胞に抗原提示される。活性化されたＴ細胞は、
様々なサイトカインを産生し炎症を助長している（Ｃｏ
ｏｐｅｒ，Ｋ.Ｄ.，Ｊ.Ｉｎｖｅｓｔ.Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ.，１０２，１２８，１９９４）。
【０００４】アトピー性皮膚炎に対する治療は、ステロ
イド薬によるものと非ステロイド薬によるものとがあ
り、ステロイド薬は薬物治療の中心となっている。治療
は長期に渡ることが多く、薬物の副作用が大きな問題と
なっている。ステロイド薬を経口投与した場合、全身性
の副作用である副腎機能抑制、骨髄抑制、日和見感染症
等に注意する必要がある。また、外用ステロイド薬の副
作用としては、毛細血管拡張、ステロイド潮紅、皮膚萎
縮等のいわゆるステロイド皮膚や、カンジダ、白癬など
の皮膚真菌症、癰（よう）等の化膿性皮膚炎、単純性疱
疹等のウイルス性疾患などの皮膚感染症が誘発、増悪す
ることがある。また、投与の漸減もリバウンドに注意し
て慎重に行う必要がある。このような副作用の問題か
ら、現在の治療法に代わる新しい治療法の開発が強く望
まれている。
イド薬によるものと非ステロイド薬によるものとがあ
り、ステロイド薬は薬物治療の中心となっている。治療
は長期に渡ることが多く、薬物の副作用が大きな問題と
なっている。ステロイド薬を経口投与した場合、全身性
の副作用である副腎機能抑制、骨髄抑制、日和見感染症
等に注意する必要がある。また、外用ステロイド薬の副
作用としては、毛細血管拡張、ステロイド潮紅、皮膚萎
縮等のいわゆるステロイド皮膚や、カンジダ、白癬など
の皮膚真菌症、癰（よう）等の化膿性皮膚炎、単純性疱
疹等のウイルス性疾患などの皮膚感染症が誘発、増悪す
ることがある。また、投与の漸減もリバウンドに注意し
て慎重に行う必要がある。このような副作用の問題か
ら、現在の治療法に代わる新しい治療法の開発が強く望
まれている。
【０００５】一方、アトピー性皮膚炎の詳細な発症メカ
ニズムが近年の研究により明らかになりつつある。Ｏｈ
ｍｅｎらは、アトピー性皮膚炎患者の炎症組織におい
て、サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ
−１０）蛋白が過剰発現しており、これがアトピー性皮
膚炎の発症に関与すること、アトピー性皮膚炎において
は単球、マクロファージ系の細胞よりＩＬ−１０蛋白が
分泌されていること、及びＩＬ−１０蛋白の過剰発現を
抑制することができればアトピー性皮膚炎の治療が可能
であることを報告している（Ｊ.Ｄ.Ｏｈｍｅｎ，ｅｔ
ａｌ.，Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.，１５４，１９５６，１９
９５）。
ニズムが近年の研究により明らかになりつつある。Ｏｈ
ｍｅｎらは、アトピー性皮膚炎患者の炎症組織におい
て、サイトカインであるインターロイキン−１０（ＩＬ
−１０）蛋白が過剰発現しており、これがアトピー性皮
膚炎の発症に関与すること、アトピー性皮膚炎において
は単球、マクロファージ系の細胞よりＩＬ−１０蛋白が
分泌されていること、及びＩＬ−１０蛋白の過剰発現を
抑制することができればアトピー性皮膚炎の治療が可能
であることを報告している（Ｊ.Ｄ.Ｏｈｍｅｎ，ｅｔ
ａｌ.，Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.，１５４，１９５６，１９
９５）。
【０００６】ＩＬ−１０蛋白は、１９８９年にＦｉｏｒ
ｅｎｔｉｎｏらにより、Ｔｈ２細胞から産生され、Ｔｈ
１細胞からのサイトカイン産生を抑制する因子として同
定されたサイトカインであり（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ
Ｄ.，ｅｔ ａｌ.，Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.，１７０，２０８
１，１９８９）、その後、マウスではＴｈ２細胞、ＣＤ
５陽性Ｂ細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、肥満
細胞より産生され、ヒトではＴｈ０細胞、 Ｔｈ２細
胞、活性化Ｔ細胞、単球、マクロファージ、活性化Ｂ細
胞等、多種の細胞より産生されることが明らかにされた
（ＩｓｈｉｄａＨ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ
ｏｌ．，４２，８４３，１９９４）。
ｅｎｔｉｎｏらにより、Ｔｈ２細胞から産生され、Ｔｈ
１細胞からのサイトカイン産生を抑制する因子として同
定されたサイトカインであり（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ
Ｄ.，ｅｔ ａｌ.，Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅｄ.，１７０，２０８
１，１９８９）、その後、マウスではＴｈ２細胞、ＣＤ
５陽性Ｂ細胞、マクロファージ、ケラチノサイト、肥満
細胞より産生され、ヒトではＴｈ０細胞、 Ｔｈ２細
胞、活性化Ｔ細胞、単球、マクロファージ、活性化Ｂ細
胞等、多種の細胞より産生されることが明らかにされた
（ＩｓｈｉｄａＨ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ
ｏｌ．，４２，８４３，１９９４）。
【０００７】上記のようにアトピー性皮膚炎の発症メカ
ニズムの解析が進行したことに伴い、これらの解析結果
を疾患治療に応用しようとする試みもなされるようにな
ってきた。その内容は、疾患の原因と考えられるＩＬ−
１０蛋白産生の抑制、あるいはＩＬ−１０蛋白の機能を
阻害して病状の改善を行おうとするものであり、例え
ば、抗ＩＬ−１０蛋白中和抗体での治療の検討がなされ
ている（ＩｓｈｉｄａＨ.，ｅｔ ａｌ，Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅ
ｄ.，１７９，３０５，１９９４）。
ニズムの解析が進行したことに伴い、これらの解析結果
を疾患治療に応用しようとする試みもなされるようにな
ってきた。その内容は、疾患の原因と考えられるＩＬ−
１０蛋白産生の抑制、あるいはＩＬ−１０蛋白の機能を
阻害して病状の改善を行おうとするものであり、例え
ば、抗ＩＬ−１０蛋白中和抗体での治療の検討がなされ
ている（ＩｓｈｉｄａＨ.，ｅｔ ａｌ，Ｊ.Ｅｘｐ.Ｍｅ
ｄ.，１７９，３０５，１９９４）。
【０００８】また、ＷＯ９７／３１５３２には、ＡＩＤ
Ｓ関連Ｂ細胞リンパ腫や慢性リンパ性白血病の治療を目
的としたＩＬ−１０アンチセンス技術が開示されている
が、ヒトのＩＬ−１０蛋白のｍＲＮＡ配列の内、３１５
−３４２に対するアンチセンスが、上記患者のＢ細胞か
ら過剰に産生されるＩＬ−１０蛋白のオートクライン作
用に対して抑制効果があることを開示しているのみであ
り、その他の配列に対しては全く記載されていない。
Ｓ関連Ｂ細胞リンパ腫や慢性リンパ性白血病の治療を目
的としたＩＬ−１０アンチセンス技術が開示されている
が、ヒトのＩＬ−１０蛋白のｍＲＮＡ配列の内、３１５
−３４２に対するアンチセンスが、上記患者のＢ細胞か
ら過剰に産生されるＩＬ−１０蛋白のオートクライン作
用に対して抑制効果があることを開示しているのみであ
り、その他の配列に対しては全く記載されていない。
【０００９】以上のような状況の下、アトピー性皮膚炎
に対し効果があり、しかも副作用が少ない医薬品が望ま
れており、特にアトピー性皮膚炎は単球またはマクロフ
ァージから過剰に産生されるＩＬ−１０蛋白が病因と考
えられることから、アトピー性皮膚炎治療に対する新規
な抗ＩＬ−１０製剤の開発が望まれている。
に対し効果があり、しかも副作用が少ない医薬品が望ま
れており、特にアトピー性皮膚炎は単球またはマクロフ
ァージから過剰に産生されるＩＬ−１０蛋白が病因と考
えられることから、アトピー性皮膚炎治療に対する新規
な抗ＩＬ−１０製剤の開発が望まれている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は、ＩＬ−１０蛋白の産生を抑制し、ＩＬ−１０蛋
白を病因とする疾患、例えばアトピー性皮膚炎、アレル
ギー性皮膚疾患、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、
エプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス感染症、リンパ腫
等を治療し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドと、そ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を
有効成分として含有する治療薬を提供することである。
目的は、ＩＬ−１０蛋白の産生を抑制し、ＩＬ−１０蛋
白を病因とする疾患、例えばアトピー性皮膚炎、アレル
ギー性皮膚疾患、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、
エプスタイン−バー（ＥＢ）ウイルス感染症、リンパ腫
等を治療し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドと、そ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘導体を
有効成分として含有する治療薬を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、単球また
はマクロファージから産生されるＩＬ−１０蛋白が原因
となる難治性の疾患に対して有効な治療薬を探索した結
果、単球またはマクロファージからのＩＬ−１０蛋白の
産生を強く抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド配
列を発見し、本発明を完成させた。なお、このアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド配列は、前述のＷＯ９７／３１
５３２に開示されているｍＲＮＡ配列の３１５−３４２
に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとは全く異な
る配列である。
はマクロファージから産生されるＩＬ−１０蛋白が原因
となる難治性の疾患に対して有効な治療薬を探索した結
果、単球またはマクロファージからのＩＬ−１０蛋白の
産生を強く抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド配
列を発見し、本発明を完成させた。なお、このアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド配列は、前述のＷＯ９７／３１
５３２に開示されているｍＲＮＡ配列の３１５−３４２
に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとは全く異な
る配列である。
【００１２】すなわち、本発明は、ヒトインターロイキ
ン−１０（ＩＬ−１０）蛋白をコードする染色体ＤＮＡ
および／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、
ＩＬ−１０蛋白の発現を阻害する、下記（Ａ）〜（Ｇ）
の配列のいずれか１以上を含むことを特徴とするアンチ
センスオリゴヌクレオチド （Ａ）配列番号１に記載の配列 （Ｂ）配列番号２に記載の配列 （Ｃ）配列番号３に記載の配列 （Ｄ）配列番号４に記載の配列 （Ｅ）配列番号５に記載の配列 （Ｆ）配列番号６に記載の配列 （Ｇ）配列番号７に記載の配列 と、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘
導体を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎、アレ
ルギー性皮膚疾患、ＳＬＥ、ＥＢウイルス感染症または
リンパ腫の治療薬である。
ン−１０（ＩＬ−１０）蛋白をコードする染色体ＤＮＡ
および／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、
ＩＬ−１０蛋白の発現を阻害する、下記（Ａ）〜（Ｇ）
の配列のいずれか１以上を含むことを特徴とするアンチ
センスオリゴヌクレオチド （Ａ）配列番号１に記載の配列 （Ｂ）配列番号２に記載の配列 （Ｃ）配列番号３に記載の配列 （Ｄ）配列番号４に記載の配列 （Ｅ）配列番号５に記載の配列 （Ｆ）配列番号６に記載の配列 （Ｇ）配列番号７に記載の配列 と、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその誘
導体を有効成分として含有するアトピー性皮膚炎、アレ
ルギー性皮膚疾患、ＳＬＥ、ＥＢウイルス感染症または
リンパ腫の治療薬である。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳しく説明
する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配
列表に示す配列番号１〜７の配列のうち１または２以上
の配列を含むものである。配列番号１に記載のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの
１７６〜１９３の塩基配列に対して相補的な塩基配列で
あり、配列番号２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの１８１〜１９８の塩
基配列に対して相補的な塩基配列であり、配列番号３に
記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−
１０ｍＲＮＡの３６７〜３８４の塩基配列に対して相補
的な塩基配列であり、配列番号４に記載のアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの６３
７〜６５４の塩基配列に対して相補的な塩基配列であ
り、配列番号５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの９１５〜９３２の塩基
配列に対して相補的な塩基配列であり、配列番号６に記
載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１
０ｍＲＮＡの１２４６〜１２６３の塩基配列に対して相
補的な塩基配列であり、配列番号７に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの１
２４９〜１２６６の塩基配列に対して相補的な塩基配列
である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
配列番号１〜７の塩基配列の１のみを含むものであって
も、２以上を組み合わせて含むものであってもよい。
する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配
列表に示す配列番号１〜７の配列のうち１または２以上
の配列を含むものである。配列番号１に記載のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの
１７６〜１９３の塩基配列に対して相補的な塩基配列で
あり、配列番号２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの１８１〜１９８の塩
基配列に対して相補的な塩基配列であり、配列番号３に
記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−
１０ｍＲＮＡの３６７〜３８４の塩基配列に対して相補
的な塩基配列であり、配列番号４に記載のアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの６３
７〜６５４の塩基配列に対して相補的な塩基配列であ
り、配列番号５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの９１５〜９３２の塩基
配列に対して相補的な塩基配列であり、配列番号６に記
載のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１
０ｍＲＮＡの１２４６〜１２６３の塩基配列に対して相
補的な塩基配列であり、配列番号７に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡの１
２４９〜１２６６の塩基配列に対して相補的な塩基配列
である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、
配列番号１〜７の塩基配列の１のみを含むものであって
も、２以上を組み合わせて含むものであってもよい。
【００１４】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、マクロファージにダメージを与えることがなく、マ
クロファージが産生するＩＬ−１０の発現を効果的に抑
制するが、この抑制効果は、本発明の配列番号１から７
の中でも、配列番号１、３、４、５及び６が優れてお
り、配列番号３及び４が特に優れている。
は、マクロファージにダメージを与えることがなく、マ
クロファージが産生するＩＬ−１０の発現を効果的に抑
制するが、この抑制効果は、本発明の配列番号１から７
の中でも、配列番号１、３、４、５及び６が優れてお
り、配列番号３及び４が特に優れている。
【００１５】なお、配列番号１〜７に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、５′側および／または３′側
の塩基を１個または２個以上短くしたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドであっても、ＩＬ−１０蛋白の産生を抑
制する活性は消失しないが、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡに
対する特異性を維持し、他の遺伝子に影響を与えないよ
うにするためには、配列番号１〜７に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチドを最小単位として使用することが
好ましい。
スオリゴヌクレオチドは、５′側および／または３′側
の塩基を１個または２個以上短くしたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドであっても、ＩＬ−１０蛋白の産生を抑
制する活性は消失しないが、ヒトＩＬ−１０ｍＲＮＡに
対する特異性を維持し、他の遺伝子に影響を与えないよ
うにするためには、配列番号１〜７に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチドを最小単位として使用することが
好ましい。
【００１６】また、配列番号１〜７に記載のアンチセン
スオリゴヌクレオチドの５′側および／または３′側の
塩基を１個または２個以上長くしたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドであっても、ＩＬ−１０蛋白の産生を抑制
する活性は消失しないが、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを化学的に合成する際に、ヌクレオチドの鎖長が長
くなるほど合成コストが高くなることから、配列番号１
〜７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの鎖長で
使用することが好ましい。
スオリゴヌクレオチドの５′側および／または３′側の
塩基を１個または２個以上長くしたアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドであっても、ＩＬ−１０蛋白の産生を抑制
する活性は消失しないが、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを化学的に合成する際に、ヌクレオチドの鎖長が長
くなるほど合成コストが高くなることから、配列番号１
〜７に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの鎖長で
使用することが好ましい。
【００１７】本発明のアンチセンスオリゴヌクオレチド
の合成方法としては、特に限定されず、通常のオリゴヌ
クレオチド合成機を用いたホスホロアミダイト法、ホス
ホロチオエート法、ホスホトリエステル法等を用いるこ
とができる。
の合成方法としては、特に限定されず、通常のオリゴヌ
クレオチド合成機を用いたホスホロアミダイト法、ホス
ホロチオエート法、ホスホトリエステル法等を用いるこ
とができる。
【００１８】また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドの安定性や細胞に対する親和性を高めるために、
その活性を著しく低下させない範囲で、リン酸エステル
基またはリボース部分の水酸基を他の安定な基に置換し
た誘導体として用いることも可能である。このようなア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体の具体例として
は、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチル
ホスホネート基等で置換したもの、リボース部分の水酸
基をメトキシやアリロキシ等のアルコキシ基、アミノ
基、またはフッ素原子等で置換したもの等が挙げられる
が、これらの中でも、リン酸エステル基をチオリン酸エ
ステル基に置換したものがＩＬ−１０蛋白産生抑制効果
の点から好ましい。
オチドの安定性や細胞に対する親和性を高めるために、
その活性を著しく低下させない範囲で、リン酸エステル
基またはリボース部分の水酸基を他の安定な基に置換し
た誘導体として用いることも可能である。このようなア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体の具体例として
は、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチル
ホスホネート基等で置換したもの、リボース部分の水酸
基をメトキシやアリロキシ等のアルコキシ基、アミノ
基、またはフッ素原子等で置換したもの等が挙げられる
が、これらの中でも、リン酸エステル基をチオリン酸エ
ステル基に置換したものがＩＬ−１０蛋白産生抑制効果
の点から好ましい。
【００１９】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、ＤＮＡ型あるいはＲＮＡ型のいずれであってもＩＬ
−１０蛋白産生抑制効果が期待できるが、生体に投与し
た際の安定性がより高いという理由でＤＮＡ型の方が好
ましい。
は、ＤＮＡ型あるいはＲＮＡ型のいずれであってもＩＬ
−１０蛋白産生抑制効果が期待できるが、生体に投与し
た際の安定性がより高いという理由でＤＮＡ型の方が好
ましい。
【００２０】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、ヒトＩＬ−１０蛋白をコードするｍＲＮＡに対して
相補的且つ特異的な配列を有し、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ
の機能、すなわち、蛋白質への翻訳、細胞質内への輸
送、またはその総体的生物学的機能に必要な他の活性の
うちのいずれかを阻害することが可能である。さらに、
ステロイド剤使用の際に見られるような重篤な副作用が
なく、安全かつ効果的に治療を行うことが可能である。
は、ヒトＩＬ−１０蛋白をコードするｍＲＮＡに対して
相補的且つ特異的な配列を有し、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ
の機能、すなわち、蛋白質への翻訳、細胞質内への輸
送、またはその総体的生物学的機能に必要な他の活性の
うちのいずれかを阻害することが可能である。さらに、
ステロイド剤使用の際に見られるような重篤な副作用が
なく、安全かつ効果的に治療を行うことが可能である。
【００２１】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、単球またはマクロファージのＩＬ−１０の発現を抑
制するものであるため、単球やマクロファージのＩＬ−
１０蛋白過剰発現が原因の一つと考えられている疾患、
例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚疾患、Ｓ
ＬＥ、ＥＢウイルス感染症、リンパ腫等を有効に治療す
ることができる。
は、単球またはマクロファージのＩＬ−１０の発現を抑
制するものであるため、単球やマクロファージのＩＬ−
１０蛋白過剰発現が原因の一つと考えられている疾患、
例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚疾患、Ｓ
ＬＥ、ＥＢウイルス感染症、リンパ腫等を有効に治療す
ることができる。
【００２２】発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は、単独でも投与可能であるが、薬学的に許容され得る
物質と混合し、製剤として投与することも可能である。
例えば、注射剤とする場合には、本発明のアンチセンス
オリゴヌクレオチドを水、生理食塩水またはブドウ糖溶
液等に溶解させて調製することができ、必要に応じて緩
衝剤、保存剤あるいは安定化剤等を含有させてもよい。
は、単独でも投与可能であるが、薬学的に許容され得る
物質と混合し、製剤として投与することも可能である。
例えば、注射剤とする場合には、本発明のアンチセンス
オリゴヌクレオチドを水、生理食塩水またはブドウ糖溶
液等に溶解させて調製することができ、必要に応じて緩
衝剤、保存剤あるいは安定化剤等を含有させてもよい。
【００２３】軟膏剤とする場合には、本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを、油脂性、乳剤性または水溶
性基剤に溶解または分散させて調製することができ、必
要に応じて安定化剤、ｐＨ調節剤、可塑剤、乳化剤、界
面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤ま
たは吸収促進剤等を含有させてもよい。
ンスオリゴヌクレオチドを、油脂性、乳剤性または水溶
性基剤に溶解または分散させて調製することができ、必
要に応じて安定化剤、ｐＨ調節剤、可塑剤、乳化剤、界
面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤ま
たは吸収促進剤等を含有させてもよい。
【００２４】クリーム剤とする場合には、本発明のアン
チセンスオリゴヌクレオチドを、水相中に溶解または分
散させ、炭化水素や高級アルコール等の油相成分と乳化
することにより調製することができ、必要に応じて安定
化剤、ｐＨ調節剤、可塑剤、乳化剤、界面活性剤、可溶
化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤または吸収促進剤
等を含有させてもよい。
チセンスオリゴヌクレオチドを、水相中に溶解または分
散させ、炭化水素や高級アルコール等の油相成分と乳化
することにより調製することができ、必要に応じて安定
化剤、ｐＨ調節剤、可塑剤、乳化剤、界面活性剤、可溶
化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤または吸収促進剤
等を含有させてもよい。
【００２５】ローション剤またはリニメント剤とする場
合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、
溶剤中に溶解または分散させて調製することができ、必
要に応じて安定化剤、ｐＨ調節剤、乳化剤、懸濁化剤、
界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤または
吸収促進剤等を含有させてもよい。
合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、
溶剤中に溶解または分散させて調製することができ、必
要に応じて安定化剤、ｐＨ調節剤、乳化剤、懸濁化剤、
界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤または
吸収促進剤等を含有させてもよい。
【００２６】さらに、経皮または経粘膜に適用するイオ
ントフォレーシス製剤とする場合には、本発明のアンチ
センスオリゴヌクレオチドをデバイス中の導電性ゲルや
薬物貯留槽等に含有させて調製することができ、必要に
応じて安定化剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、可溶化剤、
湿潤剤、保存剤、防腐剤または吸収促進剤等を含有させ
てもよい。なお、これらの製剤は、薬理学的に許容でき
る治療上有用な他の成分を含有するものであってもよ
い。
ントフォレーシス製剤とする場合には、本発明のアンチ
センスオリゴヌクレオチドをデバイス中の導電性ゲルや
薬物貯留槽等に含有させて調製することができ、必要に
応じて安定化剤、ｐＨ調節剤、界面活性剤、可溶化剤、
湿潤剤、保存剤、防腐剤または吸収促進剤等を含有させ
てもよい。なお、これらの製剤は、薬理学的に許容でき
る治療上有用な他の成分を含有するものであってもよ
い。
【００２７】また、さらに効率的な投与方法を望む場合
には、薬学的に許容される担体と組み合わせた形で投与
することも可能である。担体としては、例えば、リポソ
ーム、脂肪乳剤、ミセル、等の脂質を主成分とする担
体、ポリリジンやポリオルニチン等のペプチド性担体、
ポリエチレンイミン、ポリ乳酸／グリコール酸共重合体
等の合成高分子担体等が挙げられるが、これらの中で
も、カチオン性の電荷を有する担体が好ましい。また、
細胞への取り込みの促進や標的とする細胞への指向性を
高める目的で上記担体を修飾したものも使用可能であ
る。
には、薬学的に許容される担体と組み合わせた形で投与
することも可能である。担体としては、例えば、リポソ
ーム、脂肪乳剤、ミセル、等の脂質を主成分とする担
体、ポリリジンやポリオルニチン等のペプチド性担体、
ポリエチレンイミン、ポリ乳酸／グリコール酸共重合体
等の合成高分子担体等が挙げられるが、これらの中で
も、カチオン性の電荷を有する担体が好ましい。また、
細胞への取り込みの促進や標的とする細胞への指向性を
高める目的で上記担体を修飾したものも使用可能であ
る。
【００２８】また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド配列を発現させるようにデザインされたプラスミ
ドやウイルスベクターは遺伝子治療用のベクターとして
有用である。
オチド配列を発現させるようにデザインされたプラスミ
ドやウイルスベクターは遺伝子治療用のベクターとして
有用である。
【００２９】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと担体との混和
物は、経口投与、静脈内投与、経皮的投与、局所投与、
腹腔内投与等、投与経路に制限はないが、各疾患に対し
て有効性がより高い投与方法を選択することが好まし
い。例えば、アトピー性皮膚炎に対する治療の際には、
経皮的な投与、例えば、イオントフォレシスによる投
与、クリーム剤や軟膏等の外用剤としての投与が好まし
い。また、ＳＬＥに対しては静脈内投与が好ましい。投
与量は、各疾患の症状の度合いや投与経路に応じて増減
させることが好ましいが、目安として、静脈内投与では
体重当たり１ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、好ましくは５
ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０
ｍｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇである。
またはアンチセンスオリゴヌクレオチドと担体との混和
物は、経口投与、静脈内投与、経皮的投与、局所投与、
腹腔内投与等、投与経路に制限はないが、各疾患に対し
て有効性がより高い投与方法を選択することが好まし
い。例えば、アトピー性皮膚炎に対する治療の際には、
経皮的な投与、例えば、イオントフォレシスによる投
与、クリーム剤や軟膏等の外用剤としての投与が好まし
い。また、ＳＬＥに対しては静脈内投与が好ましい。投
与量は、各疾患の症状の度合いや投与経路に応じて増減
させることが好ましいが、目安として、静脈内投与では
体重当たり１ｍｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇ、好ましくは５
ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１０
ｍｇ／ｋｇから３００ｍｇ／ｋｇである。
【００３０】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるため
のものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例において、配列番号９は、ヒトＩＬ−１０蛋白の
ｃＤＮＡ塩基配列（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊ
ａｐａｎ：ＤＤＢＪ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.Ｍ５７
６２７）を示す。また、配列番号１〜７はヒトＩＬ−１
０遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖であり、
配列番号１は配列番号９の＋１７６〜＋１９３に、配列
番号２は配列番号９の＋１８１〜＋１９８に、配列番号
３は配列番号９の＋３６７〜＋３８４に、配列番号４は
配列番号９の＋６３７〜＋６５４に、配列番号５は配列
番号９の＋９１５〜＋９３２に、配列番号６は配列番号
９の＋１２４６〜＋１２６３に、配列番号７は配列番号
９の＋１２４９〜＋１２６６に、それぞれ対応する。さ
らに、配列番号８はマウスＩＬ−１０蛋白遺伝子のアン
チセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列であり、配列番号
９の＋１３７０から＋１３８７の中で、６つのミスマッ
チ配列を持つ陰性対照群である（比較例１）。また、実
施例に用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれ
もホスホロチオエート型であり、ファルマシアバイオテ
ク社により受託合成したものを用いた。
明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるため
のものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例において、配列番号９は、ヒトＩＬ−１０蛋白の
ｃＤＮＡ塩基配列（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊ
ａｐａｎ：ＤＤＢＪ，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.Ｍ５７
６２７）を示す。また、配列番号１〜７はヒトＩＬ−１
０遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖であり、
配列番号１は配列番号９の＋１７６〜＋１９３に、配列
番号２は配列番号９の＋１８１〜＋１９８に、配列番号
３は配列番号９の＋３６７〜＋３８４に、配列番号４は
配列番号９の＋６３７〜＋６５４に、配列番号５は配列
番号９の＋９１５〜＋９３２に、配列番号６は配列番号
９の＋１２４６〜＋１２６３に、配列番号７は配列番号
９の＋１２４９〜＋１２６６に、それぞれ対応する。さ
らに、配列番号８はマウスＩＬ−１０蛋白遺伝子のアン
チセンスオリゴヌクレオチド鎖の配列であり、配列番号
９の＋１３７０から＋１３８７の中で、６つのミスマッ
チ配列を持つ陰性対照群である（比較例１）。また、実
施例に用いたアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれ
もホスホロチオエート型であり、ファルマシアバイオテ
ク社により受託合成したものを用いた。
【００３１】実施例１ アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成及び精製 配列表の配列番号１〜８のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを、ＤＮＡ合成機Ｏｌｉｇｏ ＰｉｌｏｔII（ファ
ルマシアバイオテク社製）を用いて合成した。ホスホロ
チオエート法に基づき合成し、ＦＰＬＣ ｄｉｒｅｃｔ
ｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシアバイオテク社製）を
用い、イオン交換ＦＰＬＣ法に基づき精製した。
チドを、ＤＮＡ合成機Ｏｌｉｇｏ ＰｉｌｏｔII（ファ
ルマシアバイオテク社製）を用いて合成した。ホスホロ
チオエート法に基づき合成し、ＦＰＬＣ ｄｉｒｅｃｔ
ｏｒ ｓｙｓｔｅｍ（ファルマシアバイオテク社製）を
用い、イオン交換ＦＰＬＣ法に基づき精製した。
【００３２】試験例１（ヒトＩＬ−１０蛋白発現抑制効
果試験） （Ａ）培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの
導入 配列番号１〜８のアンチセンスオリゴヌクレオチドのヒ
トＩＬ−１０蛋白発現抑制効果を、培養細胞系において
検討した。細胞には、ヒト単球マクロファージ系のＵ９
３７細胞（大日本製薬製）を、３７℃、５％ＣＯ２の条
件下で、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ：三光純薬製）及び
抗生物質（１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢ
ＣＯ社製）と１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
（ＧＩＢＣＯ社製））を添加したＲＰＭＩ−１６４０培
地（株式会社日研生物医学研究所製）（以下、ＦＣＳ含
有培地と言う）中で維持した。このＵ９３７細胞を９６
ウェルプレートに１×１０５個／ウェルとなるように播
種した後、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭ
Ａ：和光純薬製）を１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加
し、１２時間培養した（分化誘導）。培養終了後、細胞
をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＣＳ含有培地
でさらに４８時間培養した後（休薬期間）、細胞をＰＢ
Ｓで洗浄し、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを２０
μＭとなるように添加し、４時間培養した。培養終了
後、リポ多糖（ＬＰＳ：和光純薬社製）ＦＣＳ含有培地
溶液（ＬＰＳ最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加し、さ
らに２４時間培養を続けた。
果試験） （Ａ）培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの
導入 配列番号１〜８のアンチセンスオリゴヌクレオチドのヒ
トＩＬ−１０蛋白発現抑制効果を、培養細胞系において
検討した。細胞には、ヒト単球マクロファージ系のＵ９
３７細胞（大日本製薬製）を、３７℃、５％ＣＯ２の条
件下で、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ：三光純薬製）及び
抗生物質（１００ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリン（ＧＩＢ
ＣＯ社製）と１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン
（ＧＩＢＣＯ社製））を添加したＲＰＭＩ−１６４０培
地（株式会社日研生物医学研究所製）（以下、ＦＣＳ含
有培地と言う）中で維持した。このＵ９３７細胞を９６
ウェルプレートに１×１０５個／ウェルとなるように播
種した後、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭ
Ａ：和光純薬製）を１０ｎｇ／ｍｌとなるように添加
し、１２時間培養した（分化誘導）。培養終了後、細胞
をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＣＳ含有培地
でさらに４８時間培養した後（休薬期間）、細胞をＰＢ
Ｓで洗浄し、各アンチセンスオリゴヌクレオチドを２０
μＭとなるように添加し、４時間培養した。培養終了
後、リポ多糖（ＬＰＳ：和光純薬社製）ＦＣＳ含有培地
溶液（ＬＰＳ最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を添加し、さ
らに２４時間培養を続けた。
【００３３】（Ｂ）ＩＬ−１０蛋白のＥＬＩＳＡによる
検出 次いで、上記（Ａ）において得られた培養液から採取し
た培養上清中のヒトＩＬ−１０蛋白を、ＥＬＩＳＡによ
り定量した。５０μｌの抗ＩＬ−１０モノクローナル抗
体（１μｇ／ｍｌ ０.１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4溶液、pH９：
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、９６穴プレート（ｓｕ
ｍｉｔｏｍｏＨ−ｔｙｐｅ）に添加し、４℃にて終夜放
置した後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（Ｖ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。非
特異的吸着を防ぐために、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆ
ｅｒ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を各ｗｅｌｌに２００
μｌずつ添加し、室温にて３０分放置した後、２００μ
ｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、１００μｌのＢｌ
ｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％
（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＢｌｏｃｋｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した上記（Ａ）の培養液から採取
した培養上清及びＩＬ−１０蛋白スタンダードをｗｅｌ
ｌに添加し、室温にて４時間放置した後、２００μｌの
ＰＢＳＴで４回洗浄した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆ
ｅｒ／Ｔｗｅｅｎ溶液により０.５μｇ／ｍｌに調整し
たビオチン標識抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体（Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ社製）をｗｅｌｌに１００μｌ添加
し、室温にて１時間放置した後、２００μｌのＰＢＳＴ
で６回洗浄した。さらに、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆ
ｅｒ／Ｔｗｅｅｎ溶液で０.５μｇ／ｍｌに調整したア
ビジン−パーオキシダーゼ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社
製）をｗｅｌｌに１００μｌ添加し、室温にて３０分放
置した後、２００μｌのＰＢＳＴで８回洗浄した。５０
μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社製）をｗｅ
ｌｌに添加し、室温にて３０分放置した後、反応停止剤
として、５０μｌの１Ｍ リン酸を添加し、４５０ｎｍ
での吸光度を測定した。結果を図１に示す。
検出 次いで、上記（Ａ）において得られた培養液から採取し
た培養上清中のヒトＩＬ−１０蛋白を、ＥＬＩＳＡによ
り定量した。５０μｌの抗ＩＬ−１０モノクローナル抗
体（１μｇ／ｍｌ ０.１Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4溶液、pH９：
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を、９６穴プレート（ｓｕ
ｍｉｔｏｍｏＨ−ｔｙｐｅ）に添加し、４℃にて終夜放
置した後、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％（Ｖ／
Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。非
特異的吸着を防ぐために、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆ
ｅｒ（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を各ｗｅｌｌに２００
μｌずつ添加し、室温にて３０分放置した後、２００μ
ｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、１００μｌのＢｌ
ｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％
（Ｖ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＢｌｏｃｋｉｎｇ
ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した上記（Ａ）の培養液から採取
した培養上清及びＩＬ−１０蛋白スタンダードをｗｅｌ
ｌに添加し、室温にて４時間放置した後、２００μｌの
ＰＢＳＴで４回洗浄した。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆ
ｅｒ／Ｔｗｅｅｎ溶液により０.５μｇ／ｍｌに調整し
たビオチン標識抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体（Ｐｈ
ａｒｍｉｎｇｅｎ社製）をｗｅｌｌに１００μｌ添加
し、室温にて１時間放置した後、２００μｌのＰＢＳＴ
で６回洗浄した。さらに、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆ
ｅｒ／Ｔｗｅｅｎ溶液で０.５μｇ／ｍｌに調整したア
ビジン−パーオキシダーゼ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社
製）をｗｅｌｌに１００μｌ添加し、室温にて３０分放
置した後、２００μｌのＰＢＳＴで８回洗浄した。５０
μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベン
ジジン）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社製）をｗｅ
ｌｌに添加し、室温にて３０分放置した後、反応停止剤
として、５０μｌの１Ｍ リン酸を添加し、４５０ｎｍ
での吸光度を測定した。結果を図１に示す。
【００３４】図１から明らかなように、本発明のアンチ
センスオリゴヌクレオチド（配列番号１〜７）のＩＬ−
１０蛋白の発現抑制効果は、非添加群や比較例１に比べ
て、非常に大きいことが判明した。なお、本発明のアン
チセンスオリゴヌクレオチドの中では、配列番号３＞配
列番号４＞配列番号６＞配列番号１＞配列番号５＞配列
番号２＞配列番号７の順で、ＩＬ−１０蛋白の発現抑制
効果が大きいことが判明した。なお、顕微鏡による観察
では細胞毒性は認められなかった。
センスオリゴヌクレオチド（配列番号１〜７）のＩＬ−
１０蛋白の発現抑制効果は、非添加群や比較例１に比べ
て、非常に大きいことが判明した。なお、本発明のアン
チセンスオリゴヌクレオチドの中では、配列番号３＞配
列番号４＞配列番号６＞配列番号１＞配列番号５＞配列
番号２＞配列番号７の順で、ＩＬ−１０蛋白の発現抑制
効果が大きいことが判明した。なお、顕微鏡による観察
では細胞毒性は認められなかった。
【００３５】
【発明の効果】以上説明した通り、本発明のアンチセン
スオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１０蛋白の発現を有効
に抑制することができるため、ＩＬ−１０蛋白が原因と
なる難治性の疾患、例えばアトピー性皮膚炎、アレルギ
ー性皮膚疾患、ＳＬＥ、ＥＢウイルス感染症、リンパ腫
等に対して有効である。
スオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１０蛋白の発現を有効
に抑制することができるため、ＩＬ−１０蛋白が原因と
なる難治性の疾患、例えばアトピー性皮膚炎、アレルギ
ー性皮膚疾患、ＳＬＥ、ＥＢウイルス感染症、リンパ腫
等に対して有効である。
【図１】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのＩ
Ｌ−１０蛋白の発現抑制効果を示すグラフである。
Ｌ−１０蛋白の発現抑制効果を示すグラフである。
【配列表】配列番号：1 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+176から+193に対応 配列 AGAAAGTCTTCACTCTGC 配列番号：2 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+181から+198に対応 配列 TTGAAAGAAAGTCTTCAC 配列番号：3 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+367から+384に対応 配列 GGTCTTCAGGTTCTCCCC 配列番号：4 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+637から+654に対応 配列 CTGGGTCAGCTATCCCAG 配列番号：5 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+915から+932に対応 配列 GCTTGGAATGGAAGCTTC 配列番号：6 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+1246から+1263に対応 配列 GGCTGGTTAGGAACTCCT 配列番号：7 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：配列番号9の+1249から+1266に対応 配列 CCAGGCTGGTTAGGAACT 配列番号：8 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：YES 配列の特徴：マウスIL-10蛋白遺伝子 配列 AGGTCCTGGAGTCCAGCA 配列番号：9 配列の長さ：1601 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA アンチセンス：No 配列の特徴：ヒトIL-10蛋白のcDNA 配列 AAACCACAAG ACAGACTTGC AAAAGAAGGC ATGCACAGCT CAGCACTGCT CTGTTGCCTG 60 GTCCTCCTGA CTGGGGTGAG GGCCAGCCCA GGCCAGGGCA CCCAGTCTGA GAACAGCTGC 120 ACCCACTTCC CAGGCAACCT GCCTAACATG CTTCGAGATC TCCGAGATGC CTTCAGCAGA 180 GTGAAGACTT TCTTTCAAAT GAAGGATCAG CTGGACAACT TGTTGTTAAA GGAGTCCTTG 240 CTGGAGGACT TTAAGGGTTA CCTGGGTTGC CAAGCCTTGT CTGAGATGAT CCAGTTTTAC 300 CTGGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCAAGGC GCATGTGAAC 360 TCCCTGGGGG AGAACCTGAA GACCCTCAGG CTGAGGCTAC GGCGCTGTCA TCGATTTCTT 420 CCCTGTGAAA ACAAGAGCAA GGCCGTGGAG CAGGTGAAGA ATGCCTTTAA TAAGCTCCAA 480 GAGAAAGGCA TCTACAAAGC CATGAGTGAG TTTGACATCT TCATCAACTA CATAGAAGCC 540 TACATGACAA TGAAGATACG AAACTGAGAC ATCAGGGTGG CGACTCTATA GACTCTAGGA 600 CATAAATTAG AGGTCTCCAA AATCGGATCT GGGGCTCTGG GATAGCTGAC CCAGCCCCTT 660 GAGAAACCTT ATTGTACCTC TCTTATAGAA TATTTATTAC CTCTGATACC TCAACCCCCA 720 TTTCTATTTA TTTACTGAGC TTCTCTGTGA ACGATTTAGA AAGAAGCCCA ATATTATAAT 780 TTTTTTCAAT ATTTATTATT TTCACCTGTT TTTAAGCTGT TTCCATAGGG TGACACACTA 840 TGGTATTTGA GTGTTTTAAG ATAAATTATA AGTTACATAA GGGAGGAAAA AAAATGTTCT 900 TTGGGGAGCC AACAGAAGCT TCCATTCCAA GCCTGACCAC GCTTTCTAGC TGTTGAGCTG 960 TTTTCCCTGA CCTCCCTCTA ATTTATCTTG TCTCTGGGCT TGGGGCTTCC TAACTGCTAC 1020 AAATACTCTT AGGAAGAGAA ACCAGGGAGC CCCTTTGATG ATTAATTCAC CTTCCAGTGT 1080 CTCGGAGGGA TTCCCCTAAC CTCATTCCCC AACCACTTCA TTCTTGAAAG CTGTGGCCAG 1140 CTTGTTATTT ATAACAACCT AAATTTGGTT CTAGGCCGGG CGCGGTGGCT CACGCCTGTA 1200 ATCCCAGCAC TTTGGGAGGC TGAGGCGGGT GGATCACTTG AGGTCAGGAG TTCCTAACCA 1260 GCCTGGTCAA CATGGTGAAA CCCCGTCTCT ACTAAAAATA CAAAAATTAG CCGGGCATGG 1320 TGGCGCGCAC CTGTAATCCC AGCTACTTGG GAGGCTGAGG CAAGAGAATT GCTTGAACCC 1380 AGGAGATGGA AGTTGCAGTG AGCTGATATC ATGCCCCTGT ACTCCAGCCT GGGTGACAGA 1440 GCAAGACTCT GTCTCAAAAA AATAAAAATA AAAATAAATT TGGTTCTAAT AGAACTCAGT 1500 TTTAACTAGA ATTTATTCAA TTCCTCTGGG AATGTTACAT TGTTTGTCTG TCTTCATAGC 1560 AGATTTTAAT TTTGAATAAA TAAATGTATC TTATTCACAT C 1601
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 秋山 勝彦 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内 (72)発明者 後藤 武 茨城県つくば市観音台１丁目25番11号 久 光製薬株式会社筑波研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA03 CA05 CA12 EA02 EA04 HA17 4B063 QA20 QQ43 QQ53 QQ58 QR32 QR33 QR59 QR90 QS05 4C084 AA13 NA06 NA14 ZA892 ZB072 ZB132 ZB262 ZB272 ZB332 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 NA06 NA14 ZB07 ZB13 ZB26 ZB27 ZB33
Claims (2)
- 【請求項１】 ヒトインターロイキン−１０（ＩＬ−１
０）蛋白をコードする染色体ＤＮＡおよび／またはｍＲ
ＮＡと特異的にハイブリダイズし、ＩＬ−１０蛋白の発
現を阻害する、下記（Ａ）〜（Ｇ）のいずれか１以上の
配列を含むことを特徴とするアンチセンスオリゴヌクレ
オチド。 （Ａ）配列番号１に記載の配列 （Ｂ）配列番号２に記載の配列 （Ｃ）配列番号３に記載の配列 （Ｄ）配列番号４に記載の配列 （Ｅ）配列番号５に記載の配列 （Ｆ）配列番号６に記載の配列 （Ｇ）配列番号７に記載の配列 - 【請求項２】 請求項１記載のアンチセンスオリゴヌク
レオチドまたはその誘導体を有効成分として含有するア
トピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚疾患、全身性エリテ
マトーデス、エプスタイン−バーウイルス感染症または
リンパ腫の治療剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10177188A JP2000004883A (ja) | 1998-06-24 | 1998-06-24 | Ｉｌ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド |
| PCT/JP1999/003315 WO1999067388A1 (fr) | 1998-06-24 | 1999-06-22 | Oligonucleotide antisens inhibant l'expression de la proteine il-10 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10177188A JP2000004883A (ja) | 1998-06-24 | 1998-06-24 | Ｉｌ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000004883A true JP2000004883A (ja) | 2000-01-11 |
Family
ID=16026726
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10177188A Pending JP2000004883A (ja) | 1998-06-24 | 1998-06-24 | Ｉｌ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000004883A (ja) |
| WO (1) | WO1999067388A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006505280A (ja) * | 2002-11-07 | 2006-02-16 | チャン・ルン−ジ | 改変樹状細胞 |
-
1998
- 1998-06-24 JP JP10177188A patent/JP2000004883A/ja active Pending
-
1999
- 1999-06-22 WO PCT/JP1999/003315 patent/WO1999067388A1/ja active Application Filing
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006505280A (ja) * | 2002-11-07 | 2006-02-16 | チャン・ルン−ジ | 改変樹状細胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999067388A1 (fr) | 1999-12-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5663153A (en) | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs | |
| EP0703979B1 (en) | Method for treating kaposi's sarcoma with antisense oligonucleotides | |
| US8466116B2 (en) | Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth | |
| Karras et al. | Inhibition of antigen-induced eosinophilia and late phase airway hyperresponsiveness by an IL-5 antisense oligonucleotide in mouse models of asthma | |
| US20050075302A1 (en) | Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs | |
| JP3484198B2 (ja) | オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤 | |
| WO2018173069A9 (en) | Therapeutic agent for phosphodiesterase inhibition and its related disorders | |
| JPH09510714A (ja) | オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性 | |
| JP2003144184A (ja) | 免疫調節オリゴヌクレオチド | |
| KR20170012207A (ko) | Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물 | |
| US20050148017A1 (en) | Antisense oligonucleotides against tenascin for the treating of vitiligo | |
| JP4787409B2 (ja) | 治療用ホスホジエステラーゼ阻害剤 | |
| JP4030598B2 (ja) | Ｈｓｖ１に対する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの製造 | |
| JPH09500787A (ja) | 蛋白生産、細胞増殖および／または感染症病原体の増殖に対するオリゴヌクレオチド阻害の促進 | |
| US5856099A (en) | Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression | |
| US6645944B2 (en) | Inhibition of cellular proliferation by oligonucleotide binding to a chromosomal binding site for p53 protein | |
| JP3392143B2 (ja) | 二本鎖オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤 | |
| JP2000004883A (ja) | Ｉｌ−１０蛋白の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド | |
| US20100048673A1 (en) | Oligonucleotides affecting expression of phosphodiesterases | |
| KR19990022358A (ko) | 세포 증식을 억제하기 위한 ＩＬ-6 수용체 ｍＲＮＡ에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도 | |
| WO2013088853A1 (ja) | オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクター | |
| US5945336A (en) | Oligonucleotides and methods for inhibiting cellular proliferation | |
| US5780612A (en) | Oligonucleotides specific for cytokine signal transducer gp130 mRNA | |
| AU705122B2 (en) | Oligonucleotides specific for cytokine signal transducer gp130 mRNA | |
| KR20200090418A (ko) | 피부 투과성 핵산 복합체를 유효성분으로 함유하는 건선의 예방 또는 치료용 조성물 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050510 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070918 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080205 |