KR19990022358A - 세포 증식을 억제하기 위한 ＩＬ-6 수용체 ｍＲＮＡ에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도 - Google Patents

세포 증식을 억제하기 위한 ＩＬ-6 수용체 ｍＲＮＡ에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도 Download PDF

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KR19990022358A
KR19990022358A KR1019970708838A KR19970708838A KR19990022358A KR 19990022358 A KR19990022358 A KR 19990022358A KR 1019970708838 A KR1019970708838 A KR 1019970708838A KR 19970708838 A KR19970708838 A KR 19970708838A KR 19990022358 A KR19990022358 A KR 19990022358A
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스티븐 조엘 브라운
나니브후산 다타굽타
야티 엠. 나이두
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다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프
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Abstract

본 발명은 질병에 관련된 세포 증식의 효과적인 억제제인 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 질병에 관련된 세포 증식을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인터루킨-6 수용체 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 제약 조성물 형태에서 이들 올리고뉴클레오티드는 암, 자가면역 질환 및 바이러스 감염과 같은 질병으로 인한 비정상적인 세포 증식의 치료를 위해 사람 대상에게 투여하는 데 적합하다.

Description

세포 증식을 억제하기 위한 ＩＬ-6 수용체 ｍＲＮＡ에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도
세포의 생장, 기능, 분화 및 발달은 다양한 여러 가지 메카니즘에 의해 제어된다. 가장 중요한 세포 제어물질 중에 사이토킨이라 불리는 수용체 특이적 단백질이 있다. 이들 단백질은 특수한 막결합 수용체에 결합하고, 막결합 수용체는 다시 궁극적으로 결정적인 유전자의 발현을 제어하는 세포내 신호를 전달하고 그럼으로써 많은 세포 기능을 조절한다.
인터루킨-6 (IL-6)는 가장 잘 파악되고 연구된 사이토킨 중 하나이다. 이 물질은 표적 세포의 표면에 있는 적어도 두 개의 막통과 당단백질 수용체 분자 (Taga et al., J. Exp. Med. 166:967-981 (1987); 인터루킨-6 수용체 (IL-6R) 및 신호 전달 물질, gp130 (Yamasaki et al., Science 241:825-828 (1988), Hibi et al., Cell 63:1149-1157 (1990))과의 상호작용을 통해 기능한다. IL-6에 의한 신호 전달은 IL-6R과 gp130 모두의 협동적인 움직임을 필요로 한다. 처음에는 IL-6가 낮은 친화도로 IL-6R에 결합한다 (Taga et al., Cell 58:573-581 (1989)). 이 최초의 결합 사건은 두 개의 IL-6/IL-6R 리간드-수용체 복합체와 이량체를 형성한 gp130 두 분자로 이루어진 3원 복합체의 형성을 유도한다. 이 삼원 복합체에서는 IL-6가 높은 친화도로 결합되어 있어 gp130 분자에 의한 세포내 신호의 전달을 초래한다 (Ward et al., J. Biol. Chem. 269:23286-23289 (1994)).
정상적인 세포 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 외에도 IL-6 과잉생산은 많은 상이한 질병 상태에 연루되어 왔다. 최근에는 많은 연구자들이 여러 가지 질병 상태에 관련되는 세포 증식을 억제하는 어쩌면 유용한 수단으로서 IL-6 생산, 기능 및(또는) 신호 전달의 억제에 초점을 맞추었다. 빙크(Vink) 등 [J. Exp. Med. 172:997-1000 (1990)]은 IL-6 또는 그의 수용체 성분인 IL-6R에 대응한 항체를 사용하는 것에 의한 생체내 형질세포종 증식의 억제를 설명하였다. 보다 최근에는, 세포 증식의 억제제로 사용하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드가 연구되어 왔다. 레비(Levi) 등 [J. Clin. Inves. 88:696-699 (1991)]은 IL-6 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용을 설명하였다. 후지따(Fujita) (국제 특허 공개 제94/25036호)는 IL-6R을 코딩한 mRNA의 개시 코돈에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 사용을 설명하였다.
안티센스 치료제라는 분야는 핵산 기능의 제어제로서 표적 핵산-통상은 mRNA-에 상보적인 올리고뉴클레오티드의 용도를 말한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 즉 그것이 표적으로 삼는 센스 핵산의 서열에 상보적인 핵산 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 많은 다양한 방식으로 작용하여 핵산 기능을 조절할 수 있다. 표적이 된 핵산이 mRNA일 때에는, mRNA가 단백질로 번역되는 것을 방지하거나 리보솜의 결합 또는 이동을 억제함으로써 작용할 수도 있다. 표적이 된 핵산이 DNA일 때에는 mRNA로의 전사를 방지할 수도 있다.
서열 특이적 안티센스 메카니즘에 의해 mRNA의 생산 및(또는) 기능을 억제하는 것 외에도 일부 올리고뉴클레오티드, 그리고 특히 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과는 부분적으로는 비서열 특이적 메카니즘에 기인한다고 할 수 있다. 이러한 메카니즘은 항바이러스제로서의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효과 중 일부를 설명해 준다고 보고되었다 (Stein et al., Pharmac. Ther. 52:361-384 (1991), Majumdar et al., Biochemistry 28:1340 (1989)).
본 발명의 목적은 질병에 관련된 세포 증식 및(또는) 성장을 효과적으로 억제하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 IL-6R을 코딩하는 mRNA에 대해 상보적이며 서열 특이적 및(또는) 비서열 특이적 메카니즘을 통해 작용한다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드를 함유한, 사람 대상에게 투여하기에 적절한 제약 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 질병에 관련된 세포 증식을 억제하는 올리고뉴클레오티드 및 방법을 주로 다룬 것이다. 바람직한 표적 부위는 인터루킨-6 수용체 단백질을 코딩하는 mRNA의 초기 코딩 영역이며, 인터루킨-6 수용체 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 치료제를 사용한다. 본 명세서에서 설명된 올리고뉴클레오티드 및 방법의 바람직한 용도는 신장 세포 암종과 같은 암, 자가면역 질환 또는 바이러스 감염증에 걸린 환자의 치료 분야이다. 본 발명의 다른 용도에는 올리고뉴클레오티드를 시험관내 검출 프로브로 사용함으로써 인터루킨-6 수용체 mRNA의 존재를 검출하는 것이 포함된다. 이들 검출 프로브는 인터루킨-6 수용체 mRNA 수준을 감소시키는 데 대한 다른 치료제의 유효성을 평가하는 데 특히 유용할 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 다음의 바람직한 서열을 바탕으로 한다:
서열 확인 번호 2: CCACAGCGCC GCACCTGAGC
서열 확인 번호 3: GAAAACATTT GAGGAACTC
서열 확인 번호 4: ACACTGCGAG TCCCTCG
서열 확인 번호 5: GCGGACTGGC TAATGGGAA
서열 확인 번호 6: GAGTCGTGGA GCTGCACCGA
서열 확인 번호 7: GCTCCGAGGA CCCCACTCA
서열 확인 번호 8: CGGGACTGCT AACTGGCA
서열 확인 번호 9: GCTCCCGACA CTACTGGCGA C
서열 확인 번호 10: GGTGGACACC TCGTTCT
서열 확인 번호 11: TTTCCCCTGG CGTAGAACCT
서열 확인 번호 12: GGGCAGCCAG CAGCGCGCA
서열 확인 번호 13: AGCTGCACCG ACCTCAGCAG CAG
서열 확인 번호 14: CCTGCTGCCG GCTTCCTGAG
서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
바람직한 핵산 서열과 실질적으로 일치하고 바람직한 핵산 서열을 주로 하여 이루어진 핵산 서열을 갖는 (즉, 실질적으로 동일한 핵산 서열을 갖는) 올리고뉴클레오티드 역시 본 발명에 포함된다. 특히, 각각 상기 서열 확인 번호 5, 14 및 16과 실질적으로 일치하며 다음 서열 확인 번호 17, 18 및 19로 나타내어지는 핵산 서열은 특별히 본 발명에 포함된다.
서열 확인 번호 17: GCGGACAGGC TAATGGGAA
서열 확인 번호 18: CCTGCAGCCG GCTTCCTGAG
서열 확인 번호 19: CCCATGCCAG CCCATCTGCT
본 발명의 다른 측면은 IL-6R을 코딩하는 mRNA에 있는 핵산 서열에 실질적으로 상보적인, 길이가 12 내지 100 뉴클레오티드인 정제된 올리고뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 단계로 이루어지는, 질병에 관련된 세포 증식을 억제하는 방법인데, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는
서열 확인 번호 2: CCACAGCGCC GCACCTGAGC
서열 확인 번호 3: GAAAACATTT GAGGAACTC
서열 확인 번호 4: ACACTGCGAG TCCCTCG
서열 확인 번호 5: GCGGACTGGC TAATGGGAA
서열 확인 번호 6: GAGTCGTGGA GCTGCACCGA
서열 확인 번호 7: GCTCCGAGGA CCCCACTCA
서열 확인 번호 8: CGGGACTGCT AACTGGCA
서열 확인 번호 9: GCTCCCGACA CTACTGGCGA C
서열 확인 번호 10: GGTGGACACC TCGTTCT
서열 확인 번호 11: TTTCCCCTGG CGTAGAACCT
서열 확인 번호 12: GGGCAGCCAG CAGCGCGCA
서열 확인 번호 13: AGCTGCACCG ACCTCAGCAG CAG
서열 확인 번호 14: CCTGCTGCCG GCTTCCTGAG
서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
서열 확인 번호 17: GCGGACAGGC TAATGGGAA
서열 확인 번호 18: CCTGCAGCCG GCTTCCTGAG
서열 확인 번호 19: CCCATGCCAG CCCATCTGCT
로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 주로 하여 이루어진다.
본 발명의 또다른 측면은
서열 확인 번호 1:
CGGCTGCAGG CTCCCACCCC AGCAGATGGG CTGGCATGGG AAGGAGGCTG
로 이루어진, IL-6R 코딩 mRNA에 존재하지만 U를 대신하여 T를 갖는 50 뉴클레오티드의 핵산 서열 영역에 실질적으로 상보적인, 길이가 12 내지 100 뉴클레오티드인 정제된 올리고뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 단계로 이루어지는, 질병에 관련된 세포 증식을 억제하는 방법인데, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 생체내 또는 시험관내에서 세포의 증식을 억제한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구의 범위를 보면 자명해진다.
본 발명은 세포 증식의 효과적인 억제제인 올리고뉴클레오티드 및 이런 올리고뉴클레오티드를 사용하여 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인터루킨-6 수용체 mRNA 서열에 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 질병에 관련된 세포 증식을 억제하는 데 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포 증식을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 및 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 주제를 더 상세히 설명하기 위해, 본 명세서에서 사용되는 몇몇 용어를 달리 표시되지 않는 한 아래와 같이 정의할 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드: 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 센스 핵산에 상보적이고 적어도 부분적으로는 서열 특이적 메카니즘에 의해 작용하여 표적 핵산의 기능을 제어하는 올리고뉴클레오티드를 뜻한다.
상보적: 상보적이 핵산을 언급할 때 사용되면 염기들이 왓슨-크릭 수소 결합을 통해 반대 극성의 다른 핵산의 뉴클레오티드 염기들과 쌍을 이루는, 즉 아데닌(A)은 티민(T) 또는 우라실(U)과 쌍을 이루고 구아닌(G)은 시토신(C)과 쌍을 이루는, 일련의 뉴클레오티드를 함유한 한 극성의 핵산을 뜻한다. 예를 들면, 5'에서 3' 방향으로 GCAU의 서열을 갖는 핵산은 3'에서 5' 방향으로 CGTA의 서열을 갖는 핵산에 상보적이다. 본 명세서에서 상보적이라는 용어의 사용은 가닥들 사이에 가끔씩 미스매치가 존재함에도 불구하고 안정한 이중가닥이 형성되게 실질적으로 상보적인 핵산들을 포함하기로 한다. 상보적인 핵산쌍의 개별 가닥은 플러스((+)) 또는 센스 가닥과 마이너스((-)) 또는 안티센스 가닥으로 지칭할 수도 있다.
질병에 관련된 세포 증식: 질병에 관련된 세포 증식은 암 또는 바이러스 감염과 같은 특정한 질병에 의해 유발되거나 거기에 관련되는 비정상적인 정도의 세포 분열 및(또는) 성장을 뜻한다.
혼성화: 혼성화는 염기쌍 상호작용을 통해 상보적인 핵산들간의 이중가닥이 형성되는 것을 뜻한다.
리포좀: 리포좀은 구형의 이중층 또는 이중층들로 배열된 양쪽친화성 지질로 이루어진 소포를 뜻한다.
수식되다: 핵산을 가리키는 데 사용될 때 수식되다라는 것은 본래의 구조가 조금이라도 변경된 핵산을 뜻한다. 여기에는 포스포디에스테르 연결부, 당 (RNA의 경우에는 리보오스, DNA의 경우에는 디옥시리보오스) 및(또는) 퓨린 또는 피리미딘 염기에 대한 수식이 포함된다. 수식된 포스포디에스테르 연결부에는 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트 및 포스포로디티오에이트가 포함된다. 수식된 dNTP는 핵산 내에 편입되었을 때 수식된 핵산의 형성을 초래하게 되는 뉴클레오시드 트리포스페이트를 말한다.
핵산 서열: 핵산 서열 또는 서열은 특정한 서열의 뉴클레오티드를 가진 핵산과 특정한 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열 또는 순서 모두를 뜻한다. 이들 두 가지 의미 중 어느 것이 적용되는가는 이 용어가 사용되는 문맥으로부터 자명해질 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 확정된 핵산 서열을 가진 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 뜻한다.
약리학적으로 적합한 담체: 약리학적으로 적합한 담체는 허용할 수 없는 수준의 독성 또는 약리학상의 부작용을 전혀 나타내지 않으면서 올리고뉴클레오티드의 환자에 대한 투여 및(또는) 효능을 촉진하도록 올리고뉴클레오티드를 첨가할 수 있는 제제를 뜻한다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 자연상태에 존재하는 포스포디에스테르 연결부 자리에 모두 포스포로티오에이트 연결부를 갖는 올리고뉴클레오티드를 뜻한다.
포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나, 그리고 최대 전부의 포스포로티오에이트 연결부를 가진 올리고뉴클레오티드를 뜻한다. 이 용어는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 한다.
극성: 극성은 한 데옥시리보오스 (또는 리보오스) 잔기의 C3 위치를 포스페이트 연결부를 통해 인접한 데옥시리보오스 (또는 리보오스) 잔기의 C5와 서로 연결시켰을 때 만들어지는 핵산 중합체의 배향을 뜻한다. 핵산의 극성은 5'에서 3', 또는 3'에서 5'으로 지칭한다.
폴리머라제: 폴리머라제는 핵산에 대한 뉴클레오티드의 순차적 첨가를 촉매할 수 있는 효소를 뜻한다.
프라이머: 프라이머는 주형과 혼성화하여 역전사효소와 같은 폴리머라제에 의한 합성을 개시하고, 3' 말단에 연결되는 주형에 상보적인 공유결합된 뉴클레오티드의 순차적인 첨가에 의해 연장되는, 주형에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 뜻한다.
실질적으로 상보적: 실질적으로 상보적이란, 핵산을 말할 때 사용되면, 뉴클레오티드 전체가 다른 핵산의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루는 것은 아니지만 두 핵산이 그럼에도 불구하고 적절한 조건 하에서 안정한 하이브리드를 형성할 수 있게 되는 서열을 갖는 것을 뜻한다.
주형: 주형은 목적하는 올리고뉴클레오티드를 생산하기 위한 원형을 제공하고 기질로 작용하게 되는 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산을 뜻한다. 그런 역할을 하기 위해 주형은 또한 프라이머와 혼성화할 수 있는, 또는 자가-프라이밍 주형의 경우에는 자가-프라이밍 영역을 형성할 수 있는 서열을 함유해야 한다.
치료 유효량: 치료 유효량은 IL-6의 과잉생산에 관련된 질병에 걸린 환자에게서 질병에 관련된 세포 증식 및(또는) 성장을 억제하는 데 유효한 양을 뜻한다. 바람직하게는, 치료 유효량은 질병에 관련된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도까지는 완화한다.
올리고뉴클레오티드를 사용하는 치료법의 개발은 이제 광범위하게 이루어지고 있다. 치료제로서의 올리고뉴클레오티드의 정확한 작용 메카니즘은 종종 단정하기 어렵지만 많은 가설적인 메카니즘이 제안되었으며 이들 다양한 메카니즘 중 어느 하나 또는 모두가 한꺼번에 작용하여 목적하는 효과를 이끌어낼 수도 있다. 한 작용 메카니즘은 안티센스를 기초로 하고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 DNA, mRNA 또는 전구 mRNA와 같은 표적 핵산에서 발견되는 특수한 서열에 상보적인 서열을 갖도록 설계된다.
특정한 올리고뉴클레오티드의 안티센스 기능을 설명할 수 있는 가설적인 메카니즘 중 일부는 RNase H 활성을 가진 효소에 의한 RNA:DNA 하이브리드 중에 있는 RNA의 절단, 단백질 번역을 위한 부위로의 mRNA의 이동 방지, mRNA 인트론/엑손에 혼성화함으로써 mRNA 프로세싱을 방해, 비단백질 코딩 (비번역) 영역에 혼성화함으로써 mRNA 기능을 방해, 및(또는) mRNA 개시 코돈에 혼성화함으로써 리보솜 결합을 방해하는 것을 포함한다. 요약하면, 상기 서열 특이적 안티센스 메카니즘 각각은 모종의 방면으로 작용하여 특정한 유전자의 발현을 억제한다.
서열 특이적 안티센스 메카니즘 외에, 일부 수식된 올리고뉴클레오티드는 비서열 특이적 메카니즘을 통해 핵산 기능을 억제할 수 있다. 어떤 경우에는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 동일한 염기를 무작위적인 순서로 함유한 대조 올리고뉴클레오티드에 비교해보면 대조 올리고뉴클레오티드 역시 단백질 생산의 억제를 보여준다. 이러한 비서열 특이적 메카니즘에 대한 정확한 메카니즘은 알려져 있지 않지만 이러한 효과는 대조 올리고뉴클레오티드에 의한 다른 필수적인 유전자의 우연한 억제에 기인한다고 여겨졌다 (Milligan et al., Antisense Therapeutics; Development of Antisense Therapeutics, Annals of the New York Academy of Science, pp. 229-241 참조).
신장 암종 세포의 증식에 대한 올리고뉴클레오티드의 비서열 특이적 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 토포이소머라제의 억제이다. 신장 세포 암종에 대항하는 활성을 지닌 많은 항암제는 토포이소머라제를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Shuin et al., Anticancer Research 14:2621-2626 (1994)). 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 기인한 것으로 볼 수 있는 관찰되는 항증식 효과의 일부분을 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 토포이소머라제 억제가 설명할 수도 있다고 가정되고 있다.
어느 경우이든, 서열 특이적 및 비서열 특이적 메카니즘 둘 다가 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 효과를 설명해줄 수도 있다. 작용 메카니즘의 완전한 이해가 세포 기능 억제 올리고뉴클레오티드의 설계에 필수적인 것은 아니다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 IL-6R 단백질을 코딩하는 mRNA에 상보적이며, 안티센스 및(또는) 다른 메카니즘을 통해 IL-6R 생산을 억제할 수 있다. IL-6의 기능수행을 억제하는 치료제, 예컨대 IL-6R의 생산을 제어하는 것들은 IL-6 과잉생산의 효과를 중화하는 데 사용할 수 있다. IL-6의 정상적인 기능수행에는 부상 또는 감염에 대한 반응으로서 섬유아세포, 대식세포, 내피세포 및 케라티노사이트와 같은 많은 각종의 세포 유형에 의한 IL-6 생산의 유도가 필요하다. 부상 또는 감염이 없는 경우에는 이들 세포는 정상적으로는 IL-6를 생산하지 않는다. IL-6 생산은 T-세포 및 대식세포 활성화뿐 아니라 B-세포 및 T-세포 증식 또는 분화를 비롯한 다양한 메카니즘을 통해 면역 반응의 강화를 초래한다.
그러나, IL-6 과잉생산은 많은 각종 질병 상태에 연관되어 있다. 예를 들어, 엡스타인 바 바이러스에 감염된 B 림프구에서의 IL-6 과다발현은 종양발생성의 부분적인 원인인 것으로 밝혀졌다 (Scala et al., J. Exp. Med. 172:61-68 (1990)). 케라티노사이트에 의한 IL-6의 과잉생산은 건선에 관련된 상피 과형성에서 원인적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Grossman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:6367-6371 91989)). 신장 암종 세포에 의한 IL-6의 과잉생산은 전이 증가와 관련되는 것으로 밝혀졌다 (Takenawa et al., Journal of the National Cancer Institute 83(22):1668-1672 (1991)). IL-6는 또한 그에 의한 파골세포 발달의 강화로 인해 폐경기의 골 흡수 증가에 공표된 역할을 한다 (Jilka et al., Science 257:88-91 (1992), Girasole et al., Journal of Clinical Investigation 89:883-891 (1992)). 또한, IL-6는 다발성 골수종 세포에 대한 종양성장인자인 것으로 밝혀졌다 (Klein et al., Eur. Cytokine Net. 1(4):193-201 (1990)). IL-6 과잉생산과 관련지어져 온 다른 질병 상태로는 형질구성 백혈병, 악액질, 맥관막 증식성 사구체신염, 카포시 육종, 류마티스성 관절염, 과감마글로불린혈증, 캐슬맨씨병, IgM 면역기전 장해, 심장 점액종 및 자가면역 인슐린 의존성 당뇨병 등이 있다.
따라서, IL-6 기능을 억제하도록 설계된 치료제는 광범위한 치료적 응용범위를 가진다. 이런 치료제는 상기한 질병 상태 중 임의의 것의 치료에 치료제로 사용할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 신장 세포 암종을 치료하는 데 사용된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있지만 바람직하게는 DNA이다. 이 올리고뉴클레오티드는 임의의 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 써서 제조할 수 있다. 화학적 합성은 문헌[Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077-6079 (1984)]에 설명된 방법에 따라 포스포로아미다이트법과 자동화된 합성기, 예컨대 모델 380-B (Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 써서 간편하게 수행할 수 있다.
본 발명에 포함된 올리고뉴클레오티드는 수식되지 않은 상태나 수식된 상태일 수 있다. 수식된 올리고뉴클레오티드는 핵산의 자연 구조 중 어느 것을 변경시킴으로써 제조할 수 있다. 이런 구조에는 포스포디에스테르 연결부, 당 (RNA 경우의 리보오스 또는 DNA 경우의 데옥시리보오스) 및(또는) 퓨린 또는 피리미딘 염기가 포함된다. 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 혼성화하는 데 무력해지게, 또는 생체내에서 사용할 것이라면 독성이 있게 만들지 않는 한 올리고뉴클레오티드에 임의의 수식을 할 수 있다. 여기에는 안정한 이중가닥의 형성을 완전히 막지는 않으면서 혼성화 효율을 감소시키는 일부 수식이 포함된다.
바람직한 수식은 포스포디에스테르 연결부에 대해 이루어져 연결부가 뉴클레아제의 존재시에 더 안정하게 만드는 것이다. 포스포디에스테르 연결부를 수식하면 세포 흡수를 증진시킬 수도 있다. 수식된 포스포디에스테르 연결부에는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 또는 포스포셀레나이트 연결부가 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 전부 수식된 연결부, 서로 달리 수식된 연결부의 혼합, 수식된 연결부와 수식되지 않은 연결부의 혼합, 또는 선별적으로 위치하거나 키메라 올리고뉴클레오티드에서와 같이 올리고뉴클레오티드의 서로 다른 영역에 존재하는, 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 수식된 뉴클레오티드간 연결부를 지닌 올리고뉴클레오티드는 위에서 논의된 방법 중 다수를 비롯하여 공지된 방법에 의해 수식되지 않은 올리고뉴클레오티드와 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
수식의 다른 예로는 알파-아노머와 같은 수식된 당 기의 편입 또는 2'-O-메틸올리고뉴클레오티드에 편입된 당 등이 있다. 뉴클레오티드 퓨린 또는 피리미딘 염기에 대한 수식 역시 고려된다.
바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 안정성을 증가시키고 세포 흡수를 촉진하며 올리고뉴클레오티드가 서열 특이적 안티센스 메카니즘뿐 아니라 서열 독립적인 메카니즘에 의해 세포 기능을 억제할 수 있게 해줄지도 모르는 포스포로티오에이트 연결부를 함유한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 길이가 약 12 내지 100 뉴클레오티드이다. 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 14 내지 50 뉴클레오티드이고, 가장 바람직하게는 약 18 내지 35 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 길이는 질병에 관련된 세포 증식 및(또는) 성장을 억제함에 있어서 올리고뉴클레오티드의 효율성을 극대화하도록 선택해야 한다. 올리고뉴클레오티드 내 모든 수식의 존재는 올리고뉴클레오티드의 총체적인 효율성에 대한 길이의 효과에도 영향을 미칠 것이다.
최적의 올리고뉴클레오티드 크기를 확정하기 위해서는 몇 가지 요인들을 고려에 넣어야 한다. 짧은 올리고뉴클레오티드는 세포가 보다 쉽게 흡수한다는 이점을 지닌다. 그러나, 올리고뉴클레오티드가 충분히 길지 않으면, 예컨대 10 염기 미만이면 표적 서열과 특이적이고 안정한 하이브리드를 형성하지 않을 수도 있다. 반면, 보다 긴 올리고뉴클레오티드는 표적에 증가된 안정성으로 혼성화할 수 있고 이것은 리보솜이 올리고뉴클레오티드를 치환하는 것을 막음으로써 번역 저지를 강화할 수 있다. 그러나 올리고뉴클레오티드가 지나치게 길면, 예컨대 150 염기를 넘으면 세포가 효율적으로 흡수하지 않고(않거나) 잠재적으로 세포독성이 있을 수도 있다.
생리적 조건을 모방하도록 고안된 올리고뉴클레오티드 스크리닝 검정을 활용하여 올리고뉴클레오티드가 살아있는 세포 내에서 혼성화하는 효율성을 예측할 수 있다. 이러한 스크리닝 검정법은 넬슨(Nelson) 등의 국제 특허 공개 제95/03427호에 설명되어 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 특정한 표적 서열에 특이적이다. 보다 구체적으로는, 상기 표적 서열은 IL-6R을 코딩하는 mRNA이며 문헌[Yamasaki et al., Science 241:825-828 (1988)]에 설명되어 있다. 특이적이라는 것은 올리고뉴클레오티드가 표적 서열에 상보적이라는 것을 뜻하려는 것이다. 바람직하게는 표적 서열은 다음과 같이 서열 확인 번호 1로 주어지는 IL-6R mRNA의 초기 단백질 코딩 영역이다:
서열 확인 번호 1:
CGGCTGCAGG CTCCCACCCC AGCAGATGGG CTGGCATGGG AAGGAGGCTG
본 발명의 바람직한 올리고뉴클레오티드는 다음 서열로 주어진다:
서열 확인 번호 2: CCACAGCGCC GCACCTGAGC
서열 확인 번호 3: GAAAACATTT GAGGAACTC
서열 확인 번호 4: ACACTGCGAG TCCCTCG
서열 확인 번호 5: GCGGACTGGC TAATGGGAA
서열 확인 번호 6: GAGTCGTGGA GCTGCACCGA
서열 확인 번호 7: GCTCCGAGGA CCCCACTCA
서열 확인 번호 8: CGGGACTGCT AACTGGCA
서열 확인 번호 9: GCTCCCGACA CTACTGGCGA C
서열 확인 번호 10: GGTGGACACC TCGTTCT
서열 확인 번호 11: TTTCCCCTGG CGTAGAACCT
서열 확인 번호 12: GGGCAGCCAG CAGCGCGCA
서열 확인 번호 13: AGCTGCACCG ACCTCAGCAG CAG
서열 확인 번호 14: CCTGCTGCCG GCTTCCTGAG
서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
서열 확인 번호 17: GCGGACAGGC TAATGGGAA
서열 확인 번호 18: CCTGCAGCCG GCTTCCTGAG
서열 확인 번호 19: CCCATGCCAG CCCATCTGCT
특히 바람직한 서열은 서열 확인 번호 15 및 16으로 주어진다.
전체 올리고뉴클레오티드 서열이 표적 IL-6R mRNA 서열에 완벽히 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드가 실질적으로 상보적인, 즉 표적과 안정한 하이브리드를 형성할 수 있는 것만이 필요하다. 부가적인 비상보적 뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드 중 임의의 위치에, 예컨대 3' 또는 5' 말단 또는 그 사이 임의의 다른 위치에 있을 수 있다. 그러한 부가적인 비상보적 뉴클레오티드는 생체내 분해를 억제하고(억제하거나) 유전자 발현을 방해하는 올리고뉴클레오티드의 효과를 강화하는 데 도움이 될 수 있다. 표적 서열과 안정한 하이브리드를 형성하는 데 필요한 상보성의 정도는 존재하는 수식의 종류 및 양, 수소 결합에 관계한 염기의 종류 (예, G:C 수소 결합은 A:T보다 강함), 그리고 올리고뉴클레오티드의 길이에 달려있을 것이다.
치료제로서의 유용성 외에도, 본 명세서에서 기술한 올리고뉴클레오티드는 진단 프로브로서, 그리고 연구 도구, 예컨대 증폭 프라이머로서도 유용하다. IL-6R mRNA에 특이적인 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써 IL-6R mRNA의 존재 또는 양을 측정할 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 설계 및 생산, 그리고 혼성화법에 있어서 이들의 사용은 당업자가 쉽게 수행한다.
치료 용도를 위한 고려사항에는 올리고뉴클레오티드 약리학 및 전달 특성이 포함된다. 치료제로 사용하기 위해서는 올리고뉴클레오티드는 약리학적으로 적합해야, 즉 최소의 독성과 적절한 분배 및 대사과정을 보여야 한다. 여러 가지 약리학적 고려사항은 당업계에 공지된 기술을 써서 평가할 수 있다.
약리학적으로 허용되는 담체 중에 든 올리고뉴클레오티드로 이루어진 제약 조성물은 당업자에게 공지된 다양한 각종 메카니즘에 의해 투여할 수 있다. 그러한 메카니즘에는 경구 투여 (흡입 또는 비경구), 주사 (정맥내, 근육내, 피하, 복강내) 및 국소 투여 (비강내, 경피)가 포함된다. 상기 서로 다른 메카니즘 각각에 적합한 조성물이 일상적으로 조제 및 활용된다.
약리학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 식염수, 완충액 또는 탄수화물 용액과 같은 수성 용액, 및 리포좀, 미세구 또는 유제와 같은 전달 비히클이 포함된다. 전달 비히클은 생체내 안정성을 증진시키기 위해 활용할 수 있다. 리포좀이 바람직한데 이것은 세포내 전달을 증진시키는 능력, 긴 순환 반감기, 수용체를 표적으로 삼은 분자 함유의 용이성, 최소의 독성 및 양호한 생분해성 때문이다. 리포좀은 당업계에 공지된 다양한 기술로 제조할 수 있다 (예컨대 Bangham et al., J. Mol. Biol. 13:238-252 (1965) 참조). 이들 방법은 대체로 먼저 지질을 유기 용매에 용해 및 혼합시킨 다음 증발시키는 것을 포함한다. 그 다음 적절한 양의 수성상을 지질상과 혼합하고, 다음으로 리포좀이 형성되기에 충분한 시간 동안 인큐베이션되게 한다. 수성상은 대체로 다른 용질, 예컨대 완충제 또는 당과의 현탁물 상태로 있는 생체 물질로 이루어질 것이다.
본 명세서에서 기술된 제약 조성물의 정확한 복용량 및 복용횟수는 질병 징후, 투여경로, 전달 비히클 및 올리고뉴클레오티드 조성물과 같은 몇 가지 인자에 따라 달라진다. 치료 지속기간은 질병 증상에 대한 치료의 효과에 의존할 것이고, 장기간 동안의 매일 수차례 복용을 포함할 수도 있다.
실시예 1
올리고뉴클레오티드 합성
포스포디에스테르 연결부 및 포스포로티오에이트와 같은 수식된 연결부를 함유한 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 과정에 의해 합성할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Methods in Enzymology 154:287 (1987)]에서 카루더스(Caruthers) 등은 표준 포스포르아미다이트 고체상 반응법에 의해 포스포디에스테르 연결부를 함유한 올리고뉴클레오티드를 합성하는 과정을 설명하였다. 미국 특허 제5,253,723호에서 바트(Bhatt)는 포스포로티오에이트 연결부를 함유한 올리고뉴클레오티드를 합성하는 과정을 설명하고 있다. 국제 특허 공개 제92/07864호에서 클렘(Klem) 등은 메틸포스포네이트 연결부를 비롯하여 여러 가지 연결부를 가진 올리고뉴클레오티드의 합성을 설명하였다.
실시예 2
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 신장 세포 암종의 세포 증식 억제
IL-6R의 mRNA에 상보적인 몇 가지 상이한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 암세포 증식 억제제로서의 효력을 시험하기 위해 두 가지 상이한 세포주를 조사하였다. 비정상적으로 높은 수준의 IL-6를 생산하는 것으로 알려진 신장 세포 암종 유래 세포주인 Caki-1 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재)를 대조용 역할을 하는, EBV 형질전환된 정상 신장 세포주인 293 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재)와 함께 사용하였다.
실험 기간 내에는 세포가 전면생장 상태가 되지 않는 조건 하에서 Caki-1 또는 293 세포를 48 웰 플레이트에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 부착된 후 (4-6 시간), 배양물에는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 함유한 세포 배양 배지를 첨가하고, 대조 세포에는 배지만을 첨가하였다. 세포를 표준 조건 (37℃, 5% CO2) 하에서 인큐베이션하고, 4 일째에 배지를 교환하였다. 7 일째에 배지를 제거하고 트립신을 써서 플레이트에서 세포를 방출시켰다. 혈구계를 써서 세포 밀도를 계측함으로써 웰 당 세포수를 측정하였다. 하기 표 2에 나타난 바와 같이 1 μM의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Caki-1 세포의 세포 증식을 70-90% 억제했지만 대조 세포의 증식에는 거의 영향이 없었다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 세포 증식 억제
올리고뉴클레오티드 Caki-1 세포의 % 감소율
서열 확인 번호 2 57
서열 확인 번호 3 38
서열 확인 번호 4 33
서열 확인 번호 5 45
서열 확인 번호 6 33
서열 확인 번호 7 42
서열 확인 번호 8 33
서열 확인 번호 9 52
서열 확인 번호 10 41
서열 확인 번호 11 35
서열 확인 번호 12 66
서열 확인 번호 13 43
서열 확인 번호 14 54
서열 확인 번호 15 92
서열 확인 번호 16 82
실시예 3
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 의한 다발성 골수종 세포 증식의 억제
서열 확인 번호 15로 주어지는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 존재시의 세포 증식을, 두 가지 상이한 다발성 골수종 세포주: U266 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재) 및 RPMI (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재)를 사용하여 실시예 2에 설명된 대로 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 무첨가 대조용에 비교해 보면 U266 및 RPMI 세포에서 각각 34% 및 20%의 세포 증식 감소가 있었다.
이상에서 본 발명을 특수한 실시태양에 의해 설명하였으나 그 내용에 비추어 본 발명의 많은 변경 및 변형이 가능하다. 따라서 첨부된 청구의 범위의 범주 안에서는 본 발명이 구체적으로 기술된 것과 달리 실시될 수 있다는 것을 이해해야 한다.

Claims (14)

  1. 서열 확인 번호 2: CCACAGCGCC GCACCTGAGC
    서열 확인 번호 3: GAAAACATTT GAGGAACTC
    서열 확인 번호 4: ACACTGCGAG TCCCTCG
    서열 확인 번호 5: GCGGACTGGC TAATGGGAA
    서열 확인 번호 6: GAGTCGTGGA GCTGCACCGA
    서열 확인 번호 7: GCTCCGAGGA CCCCACTCA
    서열 확인 번호 8: CGGGACTGCT AACTGGCA
    서열 확인 번호 9: GCTCCCGACA CTACTGGCGA C
    서열 확인 번호 10: GGTGGACACC TCGTTCT
    서열 확인 번호 11: TTTCCCCTGG CGTAGAACCT
    서열 확인 번호 12: GGGCAGCCAG CAGCGCGCA
    서열 확인 번호 13: AGCTGCACCG ACCTCAGCAG CAG
    서열 확인 번호 14: CCTGCTGCCG GCTTCCTGAG
    서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
    서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
    서열 확인 번호 17: GCGGACAGGC TAATGGGAA
    서열 확인 번호 18: CCTGCAGCCG GCTTCCTGAG
    서열 확인 번호 19: CCCATGCCAG CCCATCTGCT
    로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열에 실질적으로 상보적인, 길이가 12 내지 100 뉴클레오티드인 정제된 올리고뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 단계로 이루어진, 질병에 관련된 세포 증식을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 포스포로티오에이트로 연결된 올리고뉴클레오티드인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가
    서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
    의 핵산 서열을 주로 하여 이루어지는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가
    서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
    의 핵산 서열을 주로 하여 이루어지는 방법.
  5. 인터루킨-6 수용체 mRNA 핵산 서열:
    서열 확인 번호 1:
    CGGCTGCAGG CTCCCACCCC AGCAGATGGG CTGGCATGGG AAGGAGGCTG
    에 실질적으로 상보적인, 길이가 12 내지 100 뉴클레오티드인 정제된 올리고뉴클레오티드와 세포를 접촉시키는 단계로 이루어진, 질병에 관련된 세포 증식을 억제하는 방법.
  6. 서열 확인 번호 2: CCACAGCGCC GCACCTGAGC
    서열 확인 번호 3: GAAAACATTT GAGGAACTC
    서열 확인 번호 4: ACACTGCGAG TCCCTCG
    서열 확인 번호 5: GCGGACTGGC TAATGGGAA
    서열 확인 번호 6: GAGTCGTGGA GCTGCACCGA
    서열 확인 번호 7: GCTCCGAGGA CCCCACTCA
    서열 확인 번호 8: CGGGACTGCT AACTGGCA
    서열 확인 번호 9: GCTCCCGACA CTACTGGCGA C
    서열 확인 번호 10: GGTGGACACC TCGTTCT
    서열 확인 번호 11: TTTCCCCTGG CGTAGAACCT
    서열 확인 번호 12: GGGCAGCCAG CAGCGCGCA
    서열 확인 번호 13: AGCTGCACCG ACCTCAGCAG CAG
    서열 확인 번호 14: CCTGCTGCCG GCTTCCTGAG
    서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
    서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
    서열 확인 번호 17: GCGGACAGGC TAATGGGAA
    서열 확인 번호 18: CCTGCAGCCG GCTTCCTGAG
    서열 확인 번호 19: CCCATGCCAG CCCATCTGCT
    로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 주로 하여 이루어진 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 포스포로티오에이트로 연결된 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  8. 제2항에 있어서,
    서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
    로 이루어진 올리고뉴클레오티드.
  9. 제2항에 있어서,
    서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
    로 이루어진 올리고뉴클레오티드.
  10. 약리학적으로 허용되는 담체 중에 든,
    서열 확인 번호 2: CCACAGCGCC GCACCTGAGC
    서열 확인 번호 3: GAAAACATTT GAGGAACTC
    서열 확인 번호 4: ACACTGCGAG TCCCTCG
    서열 확인 번호 5: GCGGACTGGC TAATGGGAA
    서열 확인 번호 6: GAGTCGTGGA GCTGCACCGA
    서열 확인 번호 7: GCTCCGAGGA CCCCACTCA
    서열 확인 번호 8: CGGGACTGCT AACTGGCA
    서열 확인 번호 9: GCTCCCGACA CTACTGGCGA C
    서열 확인 번호 10: GGTGGACACC TCGTTCT
    서열 확인 번호 11: TTTCCCCTGG CGTAGAACCT
    서열 확인 번호 12: GGGCAGCCAG CAGCGCGCA
    서열 확인 번호 13: AGCTGCACCG ACCTCAGCAG CAG
    서열 확인 번호 14: CCTGCTGCCG GCTTCCTGAG
    서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
    서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
    서열 확인 번호 17: GCGGACAGGC TAATGGGAA
    서열 확인 번호 18: CCTGCAGCCG GCTTCCTGAG
    서열 확인 번호 19: CCCATGCCAG CCCATCTGCT
    로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열을 주로 하여 이루어진 올리고뉴클레오티드 치료 유효량으로 이루어진, 환자 내에 있는 세포의 질병에 관련된 증식을 억제할 수 있는 치료 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 담체가 리포좀인 치료 조성물.
  12. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 포스포로티오에이트로 연결된 올리고뉴클레오티드인 치료 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가
    서열 확인 번호 15: TCTGCTGGGG TGGGAGCCTG CA
    로 이루어지는 치료 조성물.
  14. 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가
    서열 확인 번호 16: CCCATGCCAG CCCATCTCCT
    로 이루어지는 치료 조성물.
KR1019970708838A 1995-06-07 1996-05-17 세포 증식을 억제하기 위한 ＩＬ-6 수용체 ｍＲＮＡ에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용도 KR19990022358A (ko)

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US8/484666 1995-06-07
US08/486,408 US5716846A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to interleukin-6 receptor mRNA
US8/486408 1995-06-07

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