JP2818031B2 - 保存ｇ▲下４▼コア配列を有するオリゴヌクレオチド - Google Patents

保存ｇ▲下４▼コア配列を有するオリゴヌクレオチド

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、インビボもしくはインビトロにおいてウイ
ルス活性を阻害し、かつウイルス関連性疾患を治療する
のに利用することができるオリゴヌクレオチドの設計お
よび合成に関する。これらの化合物は、HIV、HSV、GCM
V、およびインフルエンザのようなウイルスに関連する
疾患について予防的もしくは治療的のいづれかで使用す
ることができる。ホスホリパーゼA2酵素活性を阻害する
ことができるオリゴヌクレオチドも提供されるが、この
オリゴヌクレオチドは炎症性疾患ならびに神経学的症状
の治療に役立つ可能性がある。癌の治療用、および老化
を遅らせるために設計されたオリゴヌクレオチドも本発
明により意図される。
発明の背景 抗ウイルス剤 ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純疱疹ウイルス（H
SV）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、およびイン
フルエンザのようなウイルスの活性を阻害することにつ
いての多くの研究方法が存在する。このような従来の技
術による方法には、ヌクレオシドアナログ療法（例え
ば、HSV）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド療
法（例えば、HIV、インフルエンザ）がある。
多種多様な研究方法によりHIVを阻害する従来の試み
が数多くの研究者によて行われて来た。例えばZamecnik
および共同研究者は、逆転写酵素のプライマー部位およ
びスプライスドナー／アクセプター部位を標的とするホ
スホジエステルアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用
している。P.C.Zamecnik、J.Goodchild、Y.Taguchi、P.
S.Sarin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1986、83、4143。Goo
dchildおよび共同研究者は、転写開始部位、キャップ部
位、ポリアデニル化シグナル、５′反復領域、プライマ
ー結合部位、スプライス部位、およびgag遺伝子とpol遺
伝子との間の部位を標的とするホスホジエステルアンチ
センス化合物を作製した。J.Goodchild、S.Agrawal、M.
P.Civeira、P.S.Sarin、D.Sun、P.C.Zamecnik、Proc、Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.1988、85、5507;米国特許第4,806,4
63号。Agrawalおよび共同研究者は、キャップ部位およ
びスプライスドナー／アクセプター部位を標的とする化
学修飾化アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを使
用した。S.Agrawal、J.Goodchild、M.P.Civeira、A.H.T
hornton、P.S.Sarin、P.C.Zamecnik、Proc.Nat′l.Aca
d.Sci.USA1988、85、7079。Agrawaおよび共同研究者は
スプライスドナー／アクセプター部位を標的とするアン
チセンスオリゴヌクレオチドアナログを使用して、初期
感染している細胞および慢性感染を生じている細胞にお
けるHIV感染を阻害した。S.Agrawal、T.Ikeuchi、D.Su
n、P.S.Sarin、A.Konopka、J.Maizel、Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A.1989、86、7790。
Sarinおよび共同研究者もやはり、HIVキャップ部位お
よびスプライスドナー／アクセプター部位を標的とする
化学修飾化アンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを
使用した。P.S.Sarin、S.Agrawal、M.P.Civeira、J.Goo
dchild、T.Ikeuchi、P.C.Zamecnik、Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.1988、85、7448。Zaiaおよび共同研究者もやは
り、スプライスアクセプター部位を標的とするアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドアナログを使用してHIVを阻害
した。J.A.Zaia、J.J.Rossi、G.J.Murakawa、P.A.Spall
one、D.A.Stephens、B.E.Kaplan、J.Virol.1988、62、3
914。Matsukuraおよび共同研究者は、HIVのrev遺伝子mR
ANの翻訳開始部位を標的とするアンチセンスオリゴヌク
レオチドを合成した。M.Matsukura、K.Shinozuka、G.Zo
n、Proc.Natl.Acad.Sci.USA1987、84、7706;R.L.Letsin
ger、G.R.Zhang、D.K.Sun、T.Ikeuchi、P.S.Sarin、Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1989、86、6553。Moriおよび共
同研究者は、Matsukuraと同一の領域を標的とする異な
るアンチセンスオリゴヌクレオチドアナログを使用し
た。K.Mori、C.Boiziau、C.Cazenave、Nucleic Acids R
es.1989、17、8207。Shibaharaおよび共同研究者は、ス
プライスアクセプター部位ならびに逆転写酵素プライマ
ー結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドアナログを使用した。S.Shibahara、S.Mukai、H.Mori
sawa、H.Nakashima、S.Kobayashi、N.Yamamoto、Nucl.A
cids Res1989、17、239。Letsingerおよび共同研究者
は、スプライス部位を標的とするものであってコレステ
ロールと共有結合させてあるオリゴヌクレオチドアナロ
グの合成および検査を行っている。K.Mori、C.Boizia
u、C.Cazenave、Nucleic Acids Res.1989、17、8207。S
tevensonおよびIversenは、スプライスドナーおよびHIV
tat遺伝子の第一エキソンの５′−端を標的とするアン
チセンスオリゴヌクレオチドアナログにポリリシンを共
役（conjugate）結合させた。M.Stevenson、P.L.Iverse
n、J.Gen.Virol.1989、70、2673。Buckおよび共同研究
者は、HIVのmRNAおよびDNAを標的とするリン酸メチル化
DNAオリゴヌクレオチドの使用を記載している。H.M.Buc
k、L.H.Koole、M.H.P.van Gendersen、L.Smith、J.L.M.
C.Green、S.Jurriaans、およびJ.Goudsmit、Science199
0、248、208−212。
HIV活性阻害におけるこれらの従来の試みは、主とし
てオリゴヌクレオチドアナログにおいて用いられる化学
修飾の性質に焦点を当てていた。先の刊行物の各々はウ
イルスの幾つかの機能を阻害することにある程度成功し
たことを報告してはいるものの、HIVおよび他のウイル
スを標的とする一般的な治療計画は未だに見いだされて
いない。従って、有効な治療的利用が可能な組成物の設
計が長い間要望されてきており、そして現在でもその要
望は続いている。
最近では、ヌクレオチドアナログはヘルペス（HSV）
感染の好ましい治療剤となっている。数々のピリミジン
デオキシリボヌクレオシド化合物がウイルスにコードさ
れているチミジン（dCyd）キナーゼ酵素についての特異
的親和性を示す。これらの化合物の作用が特異的である
ため、ウイルス感染細胞へのこれらの化合物のリン酸化
および抗ウイルス活性が制限される。５−ヨード−dUrd
（IDU）、５−トリフルオロ−メチル−dUrd（FMAU）、
５−エチル−dUrd（EDU）、（Ｅ）−５−（２−ブロモ
ビニル）−dUrd（BVDU）、５−ヨード−dUyd（IDC）、
および５−トリフルオロメチル−dUrd（TFT）を例とす
るこの型からの数々の薬剤は、実際に臨床的に使用され
ているか、そうでなければ近い将来臨床的利用に役立つ
ようになるであろう。IDUは、HSV口内炎および眼基質性
角膜炎（ocular stromal keratitis）に適用させる場合
には適度に有効な局所用抗ウイルス剤であるが、HSV脳
炎の管理状況下の臨床実験においてこれを利用したとこ
ろ、IDU治療に関連する高い毒性が示された。５−アラ
ビノフラノシルシトシン（Ara−Ｃ）の抗ウイルス特異
性は当初は有望なものであったが、これを臨床実験に使
用したところIDUと同じ経過をたどることとなってしま
った。ウイルス性チミジンキナーゼを合成する能力が欠
損しているHSV株が臨床的に確認されたことにより、こ
の型の化合物が将来有効なものになるであろうという関
心が更に高まった。
抗−HSV化合物の開発のために数々のウイルス性標的
の利用性が明らかにされてきている。チオセミカルバゾ
ン化合物での実験により、ウイルス性リボヌクレオチド
レダクターゼ酵素の阻害はインビトロでのHSV複製を阻
害する有効な手段であることが示されている。その上、
ウイルス性DNA複製に害を及ぼす数々のプリンヌクレオ
シドがヒトのHSV感染の治療について是認されている。
９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニン（Ara−
Ａ）は、HSV−１角膜炎、HSV−１脳炎、および新生児の
ヘルペス感染の治療に利用されている。臨床効果につい
ての報告には相いれないものが存在し、そして実際の利
用についての主な欠点は、水中におけるAra−Ａの極端
に低い溶解度である。９−（２−ヒドロキシエトキシメ
チル）グアニン（アシクロビル（Acyclovir）、ACV）が
主な目的物である。ヒトにおいては、ACVは、局所性播
種性HSV感染の治療での使用については成功を収めてい
る。しかしながら、薬剤耐性ウイルス変異体の存在、お
よびACVでのHSV−１治療の二重盲検法検査の陰性結果と
いう両方のものが存在しているようである。Ara−Ａ同
様ACVも水中においては可溶性に乏しく（0.2％）、そし
てこの物理学的特徴によりACVの適用形態が制限されて
いる。より広範な臨床状況にプリンヌクレオチドアナロ
グを実際に適用させたところ、そのアナログは被検体固
有の効率のよい異化作用を受てしまい、そのことにより
その薬剤の生物学的活性が低下するのみならず毒性異化
産物がもたらされる可能性までもが存在する。
近年用いられている、もしくは臨床試験が進められて
いる有効な抗−HSV化合物は、ヌクレオシドアナログで
ある。これらの化合物の効力は、水性溶液中での各固有
の乏しい溶解度、迅速な細胞内異化作用、および高い細
胞毒性により減少している。いずれかの特定のヌクレオ
シドアナログの長期使用についての追加警告事項は、臨
床試験において投与されたヌクレオシド化合物による阻
害に耐性を示すHSVの臨床的単離物が最近検出されたこ
とである。これらの典型的なヌクレオシドアナログと比
較して、より良い化合物溶解度、より低い細胞毒性、お
よび標的遺伝子におけるヌクレオチド点突然変異へのよ
り低い感受性を生じる可能性が、抗ウイルス性オリゴヌ
クレオチドにより与えられる。
数々の抗ウイルス剤が研究されているにもかかわら
ず、サイトメガロウイルス（CMV）についての有効治療
法は未だに開発されていない。インターフェロン、転移
因子、アデニンアラビノシド（Ara−Ａ）、アシクログ
アノシン（アシクロビル、ACV）、およびこれらの薬剤
の内の所定の組み合わせ物はCMV感染を抑制させるのに
は効果を示さなかった。前臨床実験および臨床実験デー
タに基づくと、フォスカルネ（foscarnet）（PFA）およ
びガンシクロビル（ganciclovir）（DHPG）は抗ウイル
ス剤としての可能性が制約されていることが判明してい
る。PFA治療により、５人のAIDS患者におけるCMV網膜炎
の消散がもたらされている。DHPGの研究により、CMV網
膜炎もしくは結腸炎に対する効力が示された。治療を施
した個体はDHPGに対して良好な耐性を示したものの、可
逆性好中球減少症の発症、長期投与の際のCMV耐性株の
出現、およびCMV肺炎に対する効力の欠損によりこの化
合物の長期適用が制約される。より効力が高く、そして
より毒性の低い治療用化合物および方法の開発が、急性
利用および慢性利用の両方において必要とされている。
古典的治療学は一般的に、蛋白質の疾患誘導性もしく
は疾患増強性機能を調節する試みにおいて、蛋白質との
相互作用に焦点を当ててきた。このような治療研究法
は、サイトメガロウイルス感染においては失敗に終わっ
ている。従って、サイトメガロウイルス活性を阻害する
ことが可能な有効な組成物についてのかなえられていな
い必要性が存在する。
インフルエンザウイルスに対して幾分かの予防効果を
示す数種類の薬剤が存在する。しかしながら、いずれの
ものもインフルエンザタイプＢに対しては有効ではな
い。その上、それらは一般的に治療的用途が非常に制約
されており、そして症状の出現以降の疾患の治療には広
くは用いられていない。従って、インフルエンザウイル
ス感染の治療のための、改良を加えた治療剤についての
必要性が世界規模で存在している。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるインフルエ
ンザウイルスの阻害における従来の試みが報告されてい
る。Leiterおよび共同研究者は、インフルエンザＡおよ
びインフルエンザＣウイルスをホスホジエステルおよび
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの標的とした。
Leiter、J.、Agrawal、S.、Palese、P.＆ ZamecniK、P.
C.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA;1990、87、3430−3434。
これらの研究者は、vRNA3′領域中のポリメラーゼPBI遺
伝子ならびにmRNA5′領域中のmRNAを各々標的とした。
インフルエンザＡの配列特異的阻害は観察されなかった
が、インフルエンザＣの幾分かの特異的阻害が記載され
ている。
Zerialおよび共同研究者は、インターカレート剤と同
時に作用させた場合のオリゴヌクレオチドによるインフ
ルエンザＡの阻害を報告している。Zerial、A.、Thuon
g、N.T.、＆ Helene、C.、Nucleic Acids Res.1987、5
7、9909−9919。Zerial et al.は、８つのvRNAセグメン
トの３′末端配列を標的とした。彼らのオリゴヌクレオ
チドアナログは、細胞培養物中のウイルスの細胞障害性
効果を阻害することが報告されている。
Kabanovおよび共同研究者は、RNAポリメラーゼ３をコ
ードするRNAのループ形成部位に相補的なオリゴヌクレ
オチドを合成した。Kabanov、A.V.、Vinogradov、S.
V.、Ovcharenko、A.V.、Krivonos、A.V.、Melik−Nubar
ov、N.S.、Kiselev、V.I.、Severin、E.S.、FEB;1990、
259、327−330。彼らのオリゴヌクレオチドは、５′端
のリン酸基においてウンデシル残基と共役結合されてい
た。彼らは、彼らのオリゴヌクレオチドがMDCK細胞中で
のインフルエンザＡウイルス感染を阻害することを発見
した。
前述の研究者の各々はインフルエンザウイルスの幾つ
かの機能を幾分か阻害することに成功したことを報告し
ているが、インフルエンザウイルスを標的とする一般的
な治療計画は未だ発見されていない。その上、インフル
エンザウイルスの治療には効力を改善する必要性が存在
する。従って、有効な治療的利用が可能なオリゴヌクレ
オチドの設計が長く要望されており、そしてその要望は
今も続いている。
ホスホリパーゼA2の酵素活性 ホスホリパーゼA2は、膜のリン脂質を加水分解する脂
質分解酵素の一種である。ホスホリパーゼA2は、リン脂
質のsn−２結合の加水分解の触媒作用を生じ、遊離脂肪
酸およびリゾリン脂質の産生をもたらす。数種類のホス
ホリパーゼA2酵素がヒト細胞よりクローン化および配列
決定されている。しかしながら、ホスホリパーゼA2の追
加形態が存在するという生化学的証拠が存在する。哺乳
類が分泌するホスホリパーゼA2は、毒蛇の毒液から単離
されたホスホリパーゼA2と強い配列類似性を共有する。
分泌型のホスホリパーゼA2は、蛋白質中のシステイン残
基の位置に基づき２つの範疇に分けられている。タイプ
ＩホスホリパーゼA2には、エラピダエ（Elapidae）（コ
ブラ）およびヒドロフィダエ（Hydrophidae）（ウミヘ
ビ）の毒液から単離された酵素、ならびに哺乳類の脾臓
酵素がある。タイプIIホスホリパーゼA2には、クロタリ
ダエ（Crortalidae）（ガラガラヘビおよびマムシ亜科
の毒蛇）およびビペリダエ（Viperidae）（クサリヘ
ビ）の毒液から単離された酵素、ならびに血小板および
他の哺乳類細胞から分泌される酵素がある。
哺乳類のタイプIIホスホリパーゼA2は、リューマチ性
関節炎、炎症性腸疾患、および敗血症性ショックを初め
とする多種多様の炎症性疾患、ならびに精神分裂病のよ
うな神経学的症状においてこの酵素の濃度の上昇が検出
されている点で、より一層注目されてきている。Pruzan
ski、W.、Keystone、E.C.、Sternby、B.、Bombardier、
C.、Snow、K.M.、およびVadas、P.J.Rheumatol.1988、1
5、1351;PruzanskiおよびVadasJ.Rheumatol.1988、15、
11;Oliason、G.、Sjodahl、R.、およびTagesson、C.Dig
estion1988、41、136;Vadas et al.、Crit.Care Med.19
88、16、1;Gattaz、W.F.、Hubner、C.v.K.、Nevalaine
n、T.J.、Thuren、T.、およびKinnunen、P.K.J.Biol.Ps
ychiatry1990、28、495。最近では、タイプIIホスホリ
パーゼA2の分泌は、インターロイキン−１、インターロ
イキン−６、腫瘍壊死因子、インターフェロン−γ、お
よび細菌性リポ多糖のような多種多様の前炎症性サイト
カインにより誘導されることが示されている。Hulkowe
r、K.、Hope、W.C.、Chen、T.、Andrson、C.M.、Coffe
y、J.W.、およびMorgen、D.W.、Biochem.Biophys.Res.C
omm.1922、184、712;Crowl、R.M.、Stoller、T.J.、Con
roy、R.R.およびStoner、C.R.、J.Biol.Chem.1991、26
6、2647;Schalkwijk、C.、Pfeilschafter、J.、Marki、
F.、およびvan den Bosch、J.Biochem.Biophs.Res.Com
m.1991、174、268;Gilman、S.C.およびChang、J.、J.Rh
eumatol.1990、17,1392;Oka、S.、およびArita、H.、J.
Biol.Chem.1991、266、9956。トランスホーミング成長
因子−βおよびゲルココルチコイドのような抗−炎症剤
が、タイプIIホスホリパーゼA2の分泌を阻害することが
発見されている。OKa、S.、およびArita、H.、J.Biol.C
hem.1991、266、9956;Schalkwijk、C.、Pfeilschifte
r、J.、Marki、F.およびvan den Bosch、H.、J.Biol.Ch
em.1992、267、8846。タイプIIホスホリパーゼA2は、血
小板、色素細胞（chrondrocytes）、滑膜形成細胞（syn
oviocytes）、血管平滑筋細胞、腎糸球体間質細胞、お
よびケラチノサイトを初めとする多種多様な種類の細胞
から分泌されることが証明されている。Kramer、R.M.、
Hession、C.、Johansen、B.、Hayes、G.、McGray、P.、
Chow、E.P.、Tizard.R.、およびPepinsky、R.B.、J.Bio
l.Chem.1989、264、5768;Gilman、S.C.、およびChang、
J.、J.Rheumatol.1990、17、1392;Gilman、S.C.、Chan
g、J.、Zeigler、P.R.、Uhl、J.およびMochan、E.、Art
hritis and Rheumatol.1988、31、126;Nakano、T.、Oha
ra、O.、Teraoka、、H.およびArita、H.、FEBS Lett.、
1990、261、171;Schalkwijk、C.、Pfeilschifter、J.、
Marki、F.およびvan den Bosch、H.Biochem.Biophys.Re
s.Comm.1991、174、268。
タイプIIホスホリパーゼA2の直接注射については、こ
れをウサギの皮内もしくは間接腔内に注入した際に十分
な炎症性反応が生じたため、慢性炎症性疾患において観
察される幾つかの病態生理作用を亢進させることにおけ
るタイプIIホスホリパーゼA2の役割が示唆された。Pruz
anski、W.、Vadas、P.、Fornasier、V.、J.Invest.Derm
atol.1986、86、380−383;Bomalaski、J.S.、Lawton、
P.、およびBrowning、J.L.、J.Immunol.1991、146、390
4;Vadas.P.、Pruzanski、W.、Kim.J.、およびFornasie
r、V.、Am.J.Pathol.1989、134、807。注入前にその蛋
白質を変性させると前炎症性活性が遮断されることが見
いだされている。
これらの所見を理由にして、タイプIIホスホリパーゼ
A2の有望かつ選択的な阻害剤を同定するという目的が存
在する。今日までには、タイプIIホスホリパーゼA2の非
毒性かつ選択的な阻害剤を同定するという試みはほとん
ど成功に至っていない。従って、ホスホリパーゼA2活性
の有効な阻害剤を同定するというかなえられていない必
要性が存在する。
末端小粒長の調節 各染色体の先端に位置する反復ヌクレオチドからなる
長い鎖である末端小粒が、染色体の保護および構成にお
いてある役割を担っていることが認められている。細胞
種および年齢によって異なるが、ヒト細胞においては配
列TTAGGGが各染色体の両端において何百回から何千回ま
で繰り返されている。Harley、C.B.el al.、Nature、19
90、345、458−460;Hastie、N.D.et al.、Nature、199
0、346、866−868。末端小粒は、加齢研究に関連するこ
とが明白である細胞加齢ならびに癌細胞により示される
細胞の不朽性においてある役割を担っているようであ
る。
複数の研究者により、細胞が分裂する際には常時末端
小粒長が減少することが証明されており、そして末端小
粒は細胞の先天的な寿命が尽きる前の分裂回数を調節す
ることが示唆されている。Harley、C.B.et al.、Natur
e、1990、345、458−460;Hastie、N.D.et al.、Natur
e、1990、346、866−868。例えば、正常なヒト細胞は70
−100回の間分裂し、そして各分裂毎にそれらの末端小
粒の内の約50ヌクレオチドを失うようである。幾人かの
研究者は、末端小粒長と人間そのものの加齢との間には
強い相関関係が存在することを示唆している。Greide
r、C.W.、Curr.Opinion Cell Biol.、1991、３、444−4
51。他の研究により、末端小粒は、癌の発生および進行
中に劇的な形質転換を受けることが示されている。Hast
ie、N.D.et al.Nature、1990、346、866−868。例え
ば、細胞が悪性腫瘍になるときに末端小粒は各細胞分裂
毎に短くなることが報告されている。Hastie、N.D.et a
l.、Nature、1990、346、866−868。GreiderおよびBacc
hettiならびにそれぞれの共同研究者は、腫瘍発達の非
常に急進的かつ活動的段階において末端小粒の縮みは停
止もしくは逆転さえすることがあることを発見した。Co
unter、C.M.et al.、EMBO J.1992、11、1921−1929。従
って、末端小粒遮蔽剤は癌治療に有用である可能性が示
唆されている。インビトロでの研究により、融合ヒト−
ハムスター細胞株内へヒト染色体断片を含む直線化ベク
ターを導入する電気穿孔法によって末端小粒長を変化さ
せることが可能であることも示されている。染色体断片
は、約500塩基対のヒト末端小粒反復配列TTAGGG、なら
びにTTGGGGのような関連変異体からなり、隣接するGCに
富む反復配列がそれに随伴する（Farr,C.et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA1992,88,7006−7010）。この研究に
より末端小粒長が細胞分裂に影響を及ぼすことが示唆さ
れたものの、加齢過程もしくは癌の調節についての有効
な方法は未だに発見されていない。従って、末端小粒長
の有効な調節物を同定するというかなえられていない必
要性が存在する。
グアノシンヌクレオチドは、モノヌクレオチドとして
も、そしてオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチ
ドとなっていても、どちらの場合でもグアニンカルテッ
トすなわちＧ−カルテットとして知られる並び方を形成
することができる。総説として、Williamson、J.R.、
（1993）Curr.Opin.Struct.Biol.3:357−362、を参照せ
よ。Ｇ−カルテットは何年も以前から知られているもの
の、末端小粒構造および機能においてそれらが何らかの
役割を担っている可能性があるためにここ数年でＧ−カ
ルテットに対する興味が高まってきてきている。この領
域に対する分析的研究法は、GGGGTTTTGGGG,GGGTTTTGGG,
UGGGGU,GGGGGTTTTT,TTAGGG,TTGGGG、およびWilliamson
により記載される他のもの、Shida et al.（Shida.T.、
Yokoyama、K.、Tamai、S.、およびJ.Sekiguchi（1991）
Chem.Pharm.Bull.39:2207−2211）により記載されるTTG
GGGTT、ならびにその他のグアノシンのクラスターを含
む短いオリゴヌクレオチドにより形成される構造の研究
である。
それらの天然の役割（例えば、末端小粒において、但
し他のものも存在する可能性がある）に加えて、Ｇ−カ
ルテットを形成するオリゴヌクレオチドおよびＧのクラ
スターを含むオリゴヌクレオチドは、ウイルスの遺伝子
発見およびウイルス増殖の阻害、ならびにPLA2酵素活性
の阻害に役立ち、そしてまた、末端小粒長の調節剤とし
ても有用である可能性がある。このような利用のための
オリゴヌクレオチドの化学修飾は望ましいものであり、
そしてこの化学修飾は幾つかの場合においては最大活性
に必須なものとなっている。
プリンに富むプロモーター成分と三重らせんを形成す
る、ＧおよびＴのみを含むオリゴヌクレオチドが転写を
阻害する目的で設計されている。これらの三重らせん形
成性オリゴヌクレオチド（TFO）は28から54ヌクレオチ
ドの長さがあり、これらを使用して腫瘍遺伝子c-erb B
2/neuの発現が阻害されている（国際公開第93/09788
号、Hogan）。また、31−38ヌクレオチドの長さのアミ
ン修飾化TFOを使用してHIVの転写が阻害されている。Mc
Shan、W.M.et al.（1992）J.Biol.Chem.267:5712−572
1。
発明の目的 ウイルス活性を阻害することが可能なオリゴヌクレオ
チドを提供することは、本発明の目的である。
HIV、HSV、HCMV、およびインフルエンザのようなウイ
ルス関連性疾患の予防、診断、および治療の方法を提供
することは、本発明の他の目的である。
ホスホリパーゼA2を阻害することが可能なオリゴヌク
レオチドを提供することは、本発明の別の目的である。
更に本発明の別の目的は、炎症性疾患ならびにホスホ
リパーゼA2のレベルの上昇に関連する神経学的症状を治
療するための予防、診断、および治療の方法を提供する
ことである。
染色体上の末端小粒長を調節するためのオリゴヌクレ
オチドを提供することは、本発明の他の目的である。
HIVを阻害することが可能なオリゴヌクレオチド複合
体を提供することは、本発明の他の目的である。
これらの目的および他の目的は、本明細書および添付
される請求の範囲を精査することから当業者に明らかに
なるであろう。
発明の要約 本明細書においては保存G4コア配列として命名される
配列GGGG（G4）を含むオリゴヌクレオチドが、HIV、HS
V、HCMV、およびインフルエンザウイルスを含むがこれ
らに限定はされない数々のウイルスに対する抗ウイルス
活性を有することを、我々は発見した。４つのグアニン
（Ｇ）もしくは３つのＧの２連分（Stretch）を含む配
列が有意な抗ウイルス活性にとって有効であることを見
いだした。また、保存G4コア配列もしくは３つのＧの２
連分を含むオリゴヌクレオチドがホスホリパーゼA2活性
の有効な阻害剤であることをも発見した。またこのよう
なオリゴヌクレオチドは染色体上の末端小粒長の調節に
も役立つ可能性があるものと考えている。
活性配列についての式は、一般的には（NXG4NY）Qも
しくは（G3-4NXG3-4）Q［式中、ＸおよびＹは１−８で
あり、そしてＱは１−４である］である。配列（N
XG3-4）QNX［式中、Ｘは１−８であり、そしてＱは１−
６である］も、やはり本発明の幾つかの態様において有
用であることを発見した。
すなわち、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号10、配列番
号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号
15、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号2
0、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号2
4、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号2
8、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号3
2、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号3
6、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号4
0、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号4
4、配列番号45、配列番号48、配列番号49、配列番号5
0、配列番号51、配列番号54、配列番号55、配列番号5
8、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号6
2、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号6
6、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号7
1、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号7
5、配列番号76、配列番号78、配列番号79、配列番号8
0、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号8
4、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号8
8、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号9
2、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号9
6、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号10
2、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号
123、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番
号127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列
番号131、配列番号132、配列番号133、配列番号137、配
列番号139、配列番号141、TTGGGGTT,GCGGGGTA、TCGGGGT
T、GGGGGGTA、CGGGGGTA、CCGGGGCC、GCGGGGTA、GTGGGGT
A、およびGCGGGGTAからなる群より選択される核酸配列
を含む、８から27核酸塩基ユニットの長さのオリゴヌク
レオチド、ならびに核酸配列TTGGGGTTからなるオリゴヌ
クレオチドを提供する。
本発明はまた、ウイルスを本発明のオリゴヌクレオチ
ドと接触させることを含む、ウイルスの活性を阻害する
方法を提供する。本発明はまた、細胞を本発明のオリゴ
ヌクレオチドと接触させることを含む、ホスホリパーゼ
A2酵素活性を阻害する方法を提供する。本発明はまた、
配列（T1-8G4T2-8）1-10を含む化合物を投与することを
含む、ヒト免疫不全ウイルスの活性を阻害する方法、な
らびに配列（T1-8G4T2-8）1-10を含むオリゴヌクレオチ
ドで被覆された避妊用具を提供する。
図面の簡単な記述 図１は、ウイルス収量アッセイにより測定されたG4オ
リゴヌクレオチドの抗−HSV活性を示すグラフである。
細胞は、３μＭもしくは10μＭの用量でのオリゴヌクレ
オチドで処理した。ウイルスの力価は未処理の感染細胞
からのウイルス力価に対するパーセンテージとして示
す。検査した全てのオリゴヌクレオチドは、Ｐ＝Ｏと記
載されるものを例外として、ホスホロチオエート主鎖を
含む。
図２は、G4オリゴヌクレオチド5651（配列番号35）、
5652（配列番号37）、5653（配列番号38）、5676（配列
番号39）、および4015（配列番号21）の用量依存的抗−
HSV活性を示すグラフである。3383（配列番号122）は陰
性対照オリゴヌクレオチドである。ACVはアシクロビル
（陽性対照）である。
図３は、ウイルス収量アッセイにより測定されるG4オ
リゴヌクレオチドの抗−インフルエンザ活性を示すグラ
フである。オリゴヌクレオチドは10mMの単回用量で検査
した。ウイルスの力価は未処理の感染細胞から得られる
力価に対するパーセンテージとして表示する。
図４は、多様な２′−置換オリゴヌクレオチドによる
ホスホリパーゼA2の阻害を示すグラフである。
図５は、様々な源から単離されたホスホリパーゼA2の
酵素活性に対するISIS 3196（配列番号47）の影響を示
すグラフである。
図６は、ヒトのホスホリパーゼA2を、オリゴヌクレオ
チドISIS 3196（配列番号47）およびISIS 3481（配列番
号77）の存在下において大腸菌（E. coli）基質の増加
量と共にインキュベートした実験の結果を示すグラフで
ある。
図７は、HSV−１阻害におけるオリゴヌクレオチド添
加の時間の影響を示すグラフである。
図８は、HSV−１に対するISIS 4015および２′−Ｏ−
プロピルによるギャップ形成を施してあるホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチドの活性を示す線グラフであ
る。
図９は、HSV−１に対するISIS 3657および２′−Ｏ−
プロピルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの活性
を示す線グラフである。
図10は、ISIS 4015およびTFTのそれぞれの単独物およ
それらのび組み合わせ物のHSV−１に対する影響を示す
三次元棒グラフである。
図11は、ISIS 4015およびACVのそれぞれの単独物およ
びそれらの組み合わせ物のHSV−１に対する影響を示す
三次元棒グラフである。
図12は、Ｇ−が連なるオリゴヌクレオチド5684、505
8、5060、6170、および4015の抗ウイルス活性を示す線
グラフである。
図13は、１−131日の期間にわたるサイズ排除クロマ
トグラフィーによりモニターしたISIS 5320四量体の解
離を示す曲線である。
図14は、平行鎖状四量体のパターンの特徴を示すゲル
電気泳動実験のオートラジオグラムである。レーン1:IS
IS 5320（T2G4T2）単独。レーン2:T13G4G4と共にインキ
ュベートしたISIS 5320。レーン3:T13G4T4単独。
図15は、数日間の期間にわたるNa＋中のホスホロチオ
エートISIS 5320（四角）、Ｋ＋中のISIS 5320（ダイヤ
モンド型）、およびホスホジエステル型（丸）により形
成される四量体の解離を示す線グラフである。
図16は、405nmの吸光度により測定したgp120へのISIS
5320の結合を示す線グラフである。
図17は、硫酸デキストランがビオチニル化ISIS 5320
がgp120に結合する際の競合阻害剤であることを示す線
グラフである。
図18は、免疫蛍光フローサイトメトリにより決定した
ところISIS 5320はgp120のV3ループ（実線）に特異的な
抗体の結合は遮断するが、CD44（均一破線）もしくはCD
4（不均一破線）に特異的な抗体の結合は遮断しないと
いうことを示す線グラフである。
発明の詳細な記述 配列GGGG（G4）［この場合、Ｇはグアニン含有性ヌク
レオチドもしくはアナログであり、そして本明細書にお
いては保存G4配列として命名されている］は強力な抗−
ウイルス活性を有し、そしてホスホリパーゼA2の有効な
阻害剤および染色体の末端小粒長の調節物質である可能
性があることを我々は発見した。本発明の文脈中では、
用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸もしくはデオ
キシリボ核酸のオリゴマーもしくはポリマーを意味す
る。この用語には、天然の塩基、糖、および糖間（主
鎖）連結からなるオリゴマー、ならびに同様の機能を示
す非天然の部分を有するオリゴマーが含まれる。このよ
うに化学的修飾もしくは置換を受けたオリゴヌクレオチ
ドが天然の形態に勝って好ましいということが良くあ
り、例えば細胞取り込みの上昇およびヌクレアーゼの存
在下における安定性の増大というような性質がその理由
となっている。
本発明について思い浮かぶ幾つかの好ましいオリゴヌ
クレオチドの具体例には、ホスホロチオエート、ホスホ
トリエステル、ホスホン酸メチル、鎖状アルキル、ある
いはシクロアルキル糖間連結、あるいは短鎖ヘテロ原子
性もしくは複素環式糖間連結のような修飾を受けた糖間
連結（主鎖）が含まれる。最も好ましいものは、CH2−N
H−Ｏ−CH2，CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2，CH2−Ｏ−Ｎ
（CH3）−CH2，CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−CH2および
Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2の主鎖（この場合、ホスホジ
エステルはＯ−Ｐ−Ｏ−CH2である）を有するものであ
る。モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも
やはり好ましい。Summerton、J.E.、およびWeller、D.
D.、米国特許第5,034,506号。蛋白質核酸（PNA）主鎖等
の他の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドの
ホスホジエステル主鎖をポリアミド主鎖と置き替えるこ
とができ、この場合塩基はそのポリアミド主鎖のアザ窒
素原子に直接もしくは間接的に結合している。P.E.Niel
sen、M.Egholm、R.H.Berg、O.Buchardt、Science1991、
254、1497。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２′
位に以下に示す置換基の内の一つを含む修飾化糖部分を
含むことができ、それらの置換基は、OH、SH,SCH3、
Ｆ、OCN、Ｏ（CH2）nNH2、もしくはＯ（CH2）nCH3［式
中、ｎは１から約10までである］、C1からC10までの低
級アルキル、置換されている低級アルキル、アルカリ
ル、もしくはアラルキル、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、Ｏ
−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしく
はＮ−アルケニル、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH
2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリー
ル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換
されているシリル、RNA開裂用の基、フルオレセイン、
レポーター基、挿入剤、オリゴヌクレオチドの薬理動態
特性を改善するための基、オリゴヌクレオチドの薬力学
特性を改善するための基、ならびに類似特性を有する他
の基である。フルオレセイン部分は、オリゴヌクレオチ
ドの５′端に添加することができる。オリゴヌクレオチ
ドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのよ
うな糖疑似物を有することもできる。標準的なベーター
（β）ヌクレオチドの代わりにアルファー（α）アノマ
ーを使用することもできる。７−デアザ−７−メチルグ
アノシンのような修飾化塩基を使用することもできる。
イノシンのような「万能」塩基を、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、も
しくはＵと置き替えることもできる。
キメラオリゴヌクレオチドも利用することができ、こ
れらの分子は各々が少なくとも一つのヌクレオチドを含
む２つ以上の化学的に区別される領域を含む。これらの
オリゴヌクレオチドは典型的に、一つもしくは複数の有
益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内へ
の取り込みの増加、標的分子への結合親和性の増加のよ
うなもの）を付与する修飾化ヌクレオチド領域、ならび
にRNアーゼＨ開裂に向けられる能力を保持する未修飾化
領域を含む。
本発明に従うオリゴヌクレオチドは、約６から約27ま
での核酸塩基単位を含むことが好ましい。このようなオ
リゴヌクレオチドは約６から約24までの核酸単位を有す
ることが好ましい。理解されることであろうが、核酸塩
基単位は、ホスホジエステルもしくは他の結合を介して
隣接する核酸塩基単位に適切な様式で結合している塩基
−糖の組み合わせ物である。
本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、固
相合成の良く知られる技術を介して簡便かつ日常的に作
成することができる。このような合成のための装置は、
Applied Biosystems社を初めとする種々の販売業者によ
り販売されている。このような合成のための他のいずれ
かの手段を利用することもできるが、オリゴヌクレオチ
ドの実際の合成は通常合成を行っている技術者の技術範
囲内に十分含まれるものである。類似技術を使用してホ
スホロチオエートおよびアルキル化誘導体のような他の
オリゴヌクレオチドを製造することも良く知られてい
る。
一列の４つを上回るＧを有する化合物は活性を示す
が、有意な阻害活性には一列のG4つ、あるいは一列のG3
つの２もしくはそれ以上の連続が必要であることを見い
だした。本発明の文脈においては、有意なレベルの阻害
活性とは、適切で標準的なアッセイにおいて測定される
活性の少なくとも50％阻害を意味する。このようなアッ
セイは当業者に良く知られている。保存G4コア配列すな
わちG4薬剤活性中心（pharmacophore）が必要である。
しかし、周辺配列を置換もしくは欠失させることにより
活性を調節することが可能であることが見いだされてい
るため、G4コア配列を挟み込む配列が阻害活性における
重要な役割を演じていることを発見した。本発明の文脈
においては、用語「調節」は、増大もしくは減少を意味
する。
本発明の必須の特徴は、保存G4コア配列および活性を
有意に阻害するために十分な数の追加的フランク塩基で
ある。主鎖におけるアナログが許容されることも発見し
た。例えば、デオキシ、ホスホロチオエート、および
２′−Ｏ−メチルアナログの評定を行った。
活性配列についての式は、 （NxG4Ny）Qもしくは（G4NxG4）Q ［式中、Ｇ＝グアニン含有性ヌクレオチドもしくはア
ナログ、Ｎ＝いずれかのヌクレオチド、Ｘ＝１−８、Ｙ
＝１−８、およびＱ＝１−４である］ である。本発明の幾つかの態様においては、式（N
xG3-4）QNx［式中、Ｘは１−８であり、そしてＱは１−
６である］が活性を示すことを見いだした。
抗ウイルス剤 G4もしくは２連をなすG3を含む一群のオリゴヌクレオ
チドをHSV複製の阻害について検査した。抗ウイルス活
性はELISAにより決定した。この結果を表１に示す。活
性は、対照感染細胞に比較した場合のHSV複製の50％阻
害を提供するオリゴヌクレオチドの濃度であるE.C.50と
して示す。オリゴヌクレオチドは一般的には３μＭおよ
びそれを下回る用量において検査した。
G4配列を含むオリゴヌクレオチドを、ヒトサイトメガロ
ウイルス（HCMV、表２）およびインフルエンザウイルス
（図３）に対する抗ウイルス活性についても検査した。
ここでも、抗ウイルス活性はELISAにより決定し、そし
て示されるI.C.50を、未処理対照からのウイルス力価に
対するパーセテージとして表示する。
この実験においては、R4コアが抗ウイルス活性に必須
であることを見いだした。G4を包囲するヌクレオチドは
抗ウイルス活性に寄与しており、それはG4コアを挟み込
むヌクレオチドの欠損により抗ウイルス活性が減少した
という理由による。ホスホロチオエート主鎖を含むオリ
ゴヌクレオチドは、これらの実験においてはHSVに対し
て最も高い活性を示した。ホスホジエステル主鎖を含む
化合物は、一般的にはこれらの調査において不活性であ
ることを見いだした。G4とT2との種々の重複を有する化
合物はHSVに対して同程度の活性を示した。しかしなが
ら、T2G4T2G4は活性が劣り、そしてT2G4T2は不活性であ
った。G4がT2に挟まれていることは必ずしも必要ではな
いと考えているが、それはG4Cの重複を含む化合物が、G
4T2について観察されるものに類似する抗ウイルス活性
を有するという理由による。G4を含むオリゴヌクレオチ
ドは、図１に示すように、HSVウイルス収量アッセイに
おいても抗ウイルス活性を示した。T2G4T2G4T2G4T2G
4（ISIS＃5651、配列番号35）は、3mMの用量で、アシク
ロビルが示したものと比較してより強い抗ウイルス活性
を示した。その後、幾つかのG4オリゴヌクレオチドが用
量依存的な様式においてウイルス収量を減少させること
を見いだした（図２）。G4を含むオリゴヌクレオチド
は、HCMV（表２）およびインフルエンザウイルス（図
３）に対する有意な抗ウイルス活性をも示した。G4配列
を含まない対照化合物は抗ウイルス活性を示さなかっ
た。
G4を含む一連の化合物を、HIV活性について検査し
た。その結果を表３に示す。
有意なHIV抗ウイルス活性（I.C.50が２μＭもしくはそ
れを下回る）を有する数々の化合物を同定した。化合物
5058は、G4コアを含む始原型のホスホロチオエート八量
体オリゴヌクレオチドである。G4コアをG5もしくはG6と
延長していっても活性は維持された。G4コアをA4、C4、
もしくはT4で置き換えると活性は消失した。主鎖をホス
ホロチオエートからホスホジエステルへと変化させても
不活性化合物が生じた。１つのG4のみを含むオリゴヌク
レオチドもホスホジエステルと同様に不活性であること
を見いだした。しかしながら、複数のG4反復を有するオ
リゴヌクレオチドはホスホジエステルアナログと同様に
活性を示すことを見いだした。G4コアを挟むヌクレオチ
ドを置換しても、HIV抗ウイルス活性は保持された。化
合物TTGGGGTT（ISIS 5320）は一連の化合物の内で最も
活性が高かった。一列のG3つあるいは一列のG2つを有す
る化合物は不活性であることを見いだした。G4とT2との
様々な重複を有する化合物は、親であるTTGGGGTTと比較
して一般的により高い活性を示した。しかしながら、T2
G4とG4とは活性は劣っていた。G4T2G4が非常に高い活性
を示すという理由から、G4はその両脇を挟まれていると
いうことが絶対に必要である訳ではないことを見いだし
た。
ホスホリパーゼA2の酵素活性 ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2および選択された蛇
毒液からのタイプIIホスホリパーゼA2を選択的に阻害す
る、G4保存配列を有する特異的オリゴヌクレオチド組成
物をも同定した。これらの作用物質は、過増殖性疾患
（hyperproliferative disorders）、悪性腫瘍性疾患、
精神分裂病のような中枢神経系疾患、心臓疾患、ならび
に毒蛇（最も著名なのはガラガラヘビである）に咬まれ
た結果もたらされる後遺症の治療に役立つことが証明さ
れる可能性がある。
タイプIIホスホリパーゼA2を増加量のホスホロチオエ
ートデオキシオリゴヌクレオチドと共にインキュベート
すると、ホスホリパーゼA2酵素活性の配列特異的阻害が
もたらされた。検査したオリゴヌクレオチドの中ではIS
IS 3196（配列番号47）はI.C.50値＝0.4μＭであって最
も高い活性を示すことを発見した。ISIS 3631（配列番
号81）および3628（配列番号78）が約10倍高いI.C.50値
を示し、そしてISIS 1573（配列番号120）は、10μＭと
いう高濃度においてもホスホリパーゼA2活性を有意に阻
害するということはなかった。
ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2活性を直接阻害する
オリゴヌクレオチドの配列特異性をさらに詳細に特定す
るために、一連のホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドを、酵素活性の直接阻害について検査した。43の異な
る配列からの結果を編集して表４に示した。
ほとんどのオリゴヌクレオチドは、１μＭの濃度にお
いてホスホリパーゼA2酵素活性を有意に阻害した。その
上、ある集団のオリゴヌクレオチドは１μＭの濃度にお
いて完全にホスホリパーゼA2活性を阻害することを見い
だした。50％を上回るホスホリパーゼA2酵素活性を阻害
するこれらのオリゴヌクレオチドに共通の特性は、２つ
以上のグアニン残基の連なりが出現していることであ
り、各連なり毎に少なくとも３つの塩基が含まれてい
る。所定の連なりより多くのグアニン残基が含まれてい
る場合または連なりの数がより多い場合には、オリゴヌ
クレオチドの効力がより高いものとなった。その一例と
して、ISIS 3196（配列番号47）およびISIS 3470（配列
番号66）は双方とも各連なり毎に３塩基の長さがあるグ
アニンの連なりを３セット有している。両オリゴヌクレ
オチドとも１μＭの濃度でヒトのタイプIIホスホリパー
ゼA2酵素活性を完全に阻害した。２つのオリゴヌクレオ
チドがこの所見についての例外であることを見いだし
た。ISIS 3477（配列番号73）は３セット分のグアニン
の連なりを含むが、それらの連なりの長さはわずか２塩
基分であった。このオリゴヌクレオチドは１μＭにおい
て酵素活性を54.7％阻害した。第二のヌクレオチドISIS
4338（配列番号12）は、長さが４塩基分あるグアニン
残基の連なりを１つのみ含んでいた。この実験において
は、ISIS 4338（配列番号12）は、１μＭの濃度におい
てヒトのタイプIIホスホリパーゼA2を完全に阻害した。
ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2の阻害の原因となる
最小薬剤活性中心をさらに詳しく特定するために、切断
型のISIS 3196（配列番号47）および4015（配列番号2
1）を活性について検査した。その上、切断型のISIS 31
96（配列番号47）の活性についての塩基置換の効果を調
査した。その結果を表５に示す。塩基置換および切断の
効果は２つの別々の実験において実施したため、両方の
実験からのデータを示す。
これらの結果により、最低限の薬物活性中心は、４つ
のＧ、あるいは２連の３つのグアニンであることが示さ
れる。ISIS 4015（配列番号21）については、配列GGGGT
TGGGGを含む10−塩基のホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドは完全な阻害活性を維持している。配列TGGGG
を有する５−塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド（ISIS 5544）は、１μＭで酵素活性を50％阻害
し、ISIS 5544による酵素活性の完全阻害は３μＭの濃
度において観察された。
配列GGGTGGGTATAGを有する12−塩基のホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチド（ISIS 4672、配列番号50）
は、ある実験において、ISIS 3196（配列番号47）であ
る21塩基のオリゴヌクレオチドとほぼ同一の阻害を示す
ことを見いだした（表５）。12量体から最後の２つの
３′−塩基を除去すると活性の喪失がもたらされた（IS
IS 4962、配列番号108）。塩基置換実験により、２つの
グアニンの連なりを分断する塩基は活性に有意な影響を
及ぼさないことが示される。アデニンで５′−グアニン
を置換すると活性の喪失がもたらされる。これらのデー
タにより、５′−グアニンはオリゴヌクレオチドの活性
の維持における重要な役割を担っていることが示唆され
る。フルオレセインホスホルアミダイトもしくは５′−
リン酸の添加により活性の喪失がもたらされるという知
見により、この配列内における５′−グアニンの重要な
役割が更に支持される。
先に記載されるアッセイにおいて用いられた全てのオ
リゴヌクレオチドはデオキシオリゴヌクレオチドであっ
た。この効果がDNAオリゴヌクレオチドに特異的である
か否かを決定するために、２′−置換アナログを活性に
ついて検査した。結果を図４に示す。各事例において
は、ヌクレオシド間結果はホスホロチオエートであっ
た。２′−位をフッ素で置換した場合には効力の差は認
められなかった。メチルおよびプロピルでの２′−位の
置換により、ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2に対する
阻害活性が亢進した。ホスホロチオエート主鎖をホスホ
ジエステル主鎖と置き替えると阻害活性の喪失がもたら
された。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドによるこ
の阻害活性喪失はオリゴヌクレオチドの分解に起因する
ものではなかったが、それはそれらのオリゴヌクレオチ
ドはインキュベーション緩衝液中で少なくとも４時間は
安定であることを見いだしたためである。ホスホリパー
ゼA2酵素アッセイはその持続期間が15分間であった。
まとめとして、これらの結果により、各連なりが少な
くとも３つの塩基分の長さを有する複数のグアニンの２
つ以上の連なりを含むホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドは、ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2酵素活性の
強力な阻害剤であることが示される。メチル基もしくは
プロピル基のいずれかでの２′−位の置換により阻害活
性が亢進する。我々はホスホロチオエートヌクレオシド
間連結が生物学的活性に必須であることを発見した。
末端小粒長の調節 末端小粒長を調節することが可能なオリゴヌクレオチ
ドも本発明により意図される。ヒト細胞においては、配
列TTAGGGは、細胞の種類および年齢に依存して各染色体
の両端で何百回から何千回まで反復している。配列（Nx
G3-4）QNX［式中、Ｘは１−８であり、Ｑは１−６であ
る］を有するオリゴヌクレオチドは末端小粒長を調節す
るのに役立つであろうと考えている。
末端小粒は細胞加齢におけるある役割を担っているよ
うであり、すなわち末端小粒長が各細胞分裂に伴って減
少するため、このようなオリゴヌクレオチドは細胞加齢
過程を調節するのに役立つであろうと考えている。変化
を伴う末端小粒も癌細胞内に見いだされており、このこ
とにより、このようなオリゴヌクレオチドは悪性腫瘍細
胞の増殖を抑制するのに役立つであろうとも考えてい
る。従って、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる末端
小粒長の調節は、癌の治療もしくは加齢過程を抑制する
のに役立つものと判明する可能性がある。
以下に示す実施例は説明のみを目的とするために提供
されるものであり、本発明を制限することを意図するも
のではない。
実施例 実施例1:オリゴヌクレオチドの合成 DNA合成機用試薬、制御孔付きガラス（CPG）結合およ
びＢ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト
は、Applyid Biosystems社（Foster City、CA）から購
入した。２′−Ｏ−メチル B−シアノエチルジイソプロ
ピルホスホルアミダイトは、Chemgenes社（Needham、M
A）から購入した。RNA合成用のフェノキシアセチル保護
化ホスホルアミダイトは、BioGenex社（Hayward、CA）
から購入した。
オリゴヌクレオチドは、自動DNA合成機（Applied Bio
systems社 モデル380B）上で合成した。２′−Ｏ−メ
チルオリゴヌクレオチドは、テトラゾールおよび塩基の
パルス輸送後の待機段階を360秒にまで増大させた以外
は未修飾オリゴヌクレオチド用の標準サイクルを使用し
て合成した。合成を開始するのに用いたCPG結合化３′
塩基は２′−デオキシリボヌクレオチドであった。55℃
における濃水酸化アンモニウム中でのCPGカラムからの
開裂および脱保護化（18時間）の後、オリゴヌクレオチ
ドを2.5倍容のエタノールで0.5MのNaCl溶液から２回沈
殿させることにより精製した。分析用ゲル電気泳動は、
20％のアクリルアミド、8Mの尿素、45mMのトリス−ホウ
酸緩衝液、pH＝7.0、中で行った。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動から、オリゴヌクレオチドは全長物質の85
％よりも大きいものと判定された。
実施例2:HIV阻害 急性HIV感染アッセイ ヒトのＴ−リンパ芽球腫CEM細胞株については、10％
のウシ胎児血清、グルタミン、および抗生物質を補足し
てあるRPMI 1640中で指数増殖期に植え継いだ。アッセ
イ当日、細胞を洗浄し、そしてトリパンブルー被染色細
胞を排除することにより生細胞を計数した。これらの細
胞（CEM−IIIB）を、ウエル当たり５×103細胞で96穴の
マイクロタイタープレートに撒いた。各ウエルに細胞を
添加した後、表示濃度およびその一連の半対数希釈のオ
リゴヌクレオチドを添加した。感染後６日には細胞を完
全に死滅させるように決定された感染多重度の感染性HI
V−1IIIBを直ちに各ウエルに添加した。37℃における６
日間のインキュベーションの後、上清分注を各ウエルか
ら取り出し、その後に各ウエルヘテトラゾリウム染色液
XTTを添加した。XTTは生細胞により異化作用を受けてホ
ルマザン産物へと変化し、そしてMolecular Devices Vm
ax Plate Readerでの分光測光によりその値を算出し
た。XTTアッセイは、検査用化合物の添加の結果もたら
されるHIV−誘導性細胞死滅からの保護作用を測定す
る。上清分注を利用してXTTアッセイにおいて決定され
る活性を確認した。逆転写酵素アッセイおよびp24 ELIS
Aを実施して、感作細胞から放出されるHIVの量を測定し
た。死滅化からの保護作用により、XTTアッセイにおけ
る吸光度の上昇、ならびにウイルス性逆転写酵素および
p24コア蛋白質のレベルの減少がもたらされる。
実施例3:HSV−１阻害 HSV−１感染のELISAアッセイ ヒト皮膚繊維芽細胞の密集単層に、0.05pfu/細胞の多
重度でHSV−１（KOS）を感作させた。37℃における90分
間の吸着の後にウイルスを除去し、そして表示濃度のオ
リゴヌクレオチドを含む培養培地を添加した。２日後に
感作培地を取り除き、そして95％エタノールの添加によ
り細胞を固定化させた。HSV抗原発現を酵素結合免疫ア
ッセイを用いて定量した。アッセイ中の第一反応抗体
は、HSV−１糖蛋白質Ｂに特異的なモノクローナル抗体
であった。第二抗体としてビオチン化ヤギ抗−マウスIg
Gを使用し、次にストレプトアビジンと共役結合させた
Ｂ−ガラクトシダーゼを反応させることにより検出を実
施した。クロロフェノールレッドＢ−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドの添加により発色反応を生じさせ、そして570ナ
ノメートルにおける吸光度を測定した。結果を、未処理
対照のパーセンテージとして表示する。
ウイルス収量アッセイ ヒト皮膚繊維芽細胞の密集単層に、0.05pfu/細胞でHS
V−１（KOS）を感染させた。37℃における90分間の吸着
の後にウイルスを除去し、そして表示濃度のオリゴヌク
レオチドを含む1mlの培養培地を添加した。対照ウエル
にはオリゴヌクレオチドを含まない1mlの培地を加え
た。感染後２日目に培養培地および細胞を回収し、そし
て各実験点について二重に用意した各ウエルのものそれ
ぞれを合わせた。上清の凍結および解凍を３回繰り返
し、その後22ゲージの注射針を通して押し出す作業を５
回繰り返した。ウイルス力価はVero細胞単層上でのプラ
ークアッセイにより決定した。各ウイルス調製物の希釈
液を調製し、そして二重に用意したそれらの希釈液を密
集しているVero単層上に90分間吸着させた。吸着後ウイ
ルスを取り除き、細胞をリン酸緩衝化食塩水で度一度す
すぎ、そして5.0％のFBSおよびメチルセルロースを含む
2mlの培地を重層した。細胞を37℃において72時間イン
キュベートし、その後プラークをホルムアルデヒドで固
定させ、そしてクリスタルバイオレッドで染色した。処
理を施したウエルからのプラーク数を、対照ウエルから
のプラーク数と比較した。結果を、未処理対照細胞から
のウイルス力価のパーセンテージとして表示し、そして
図２に示した。
実施例4:サイトメガロウイルス阻害 ELISAアッセイ ヒト皮膚繊維芽細胞の密集単層培養物を、無血清繊維
芽細胞増殖培地中での表示濃度のオリゴヌクレオチドで
処理した。37℃における一晩のインキュベーションの
後、オリゴヌクレオチドを含む培養培地を除去し、細胞
をすすぎ、そして0.1pfu/細胞の感染多重度のヒトサイ
トメガロウイルスを添加した。37℃における２時間の吸
着後にウイルスを取り除き、そして表示濃度のオリゴヌ
クレオチドを含む新鮮な繊維芽細胞増殖培地を添加し
た。感染後２日目に古い培養培地を除去し、そして表示
濃度のオリゴヌクレオチドを含む新鮮な繊維目細胞増殖
培地で置き替えた。感染後６日目に培地を取り除き、そ
して95％エタノールを添加して細胞を固定化させた。HC
MV抗原発現を酵素結合免疫アッセイを用いて定量した。
アッセイ中の第一反応抗体は、後期HCMVウイルス蛋白質
に特異的なモノクローナル抗体であった。第二抗体とし
てビオチン化ヤギ抗−マウスIgGを使用し、次にストレ
プトアビジンと共役結合させたＢ−ガラクトシダーゼと
反応させることにより検出を実施した。クロロフェノー
ルレッドＢ−Ｄ−ガラクトピラノシドの添加により発色
反応を生じさせ、そして575ナノメートルにおける吸光
度をELISAプレートリーダーを用いて測定した。結果
を、未処理対照のパーセンテージとして表示する。
実施例5:インフルエンザウイルスの阻害 ウイルス収量アッセイ Madin−Darby種のイヌの腎臓（MDCK）細胞の密集単層
培養物を、0.2％BSAを含む無血清のダルベッコー改変型
イーグル培地（DMEM）中の10mMの濃度のオリゴヌクレオ
チドで処理した。37℃における２時間のインキュベーシ
ョンの後、ヒトのインフルエンザウイルス（A/PR株）
を、0.00125pfu/細胞の感染多重度でその細胞に添加し
た。ウイルスを37℃において30分間吸着させた。細胞を
洗浄し、そして0.2％のBSAおよび3mg/mlのトリプシンを
補足してあり10μＭの濃度のオリゴヌクレオチドを含む
新鮮な培地に再度播いた。感染後一日目に培地を回収し
た。MDCK細胞上でウイルス上清の力価決定を行った。６
穴デッシュにおいて増殖させたMDCK細胞に各ウイルス調
製物の希釈液を感染させた。37℃において30分吸着させ
た後、ウイルスをその単層から除去し、そして細胞に0.
2％のBSA、３μg/mlのトリプシン、および0.44％のアガ
ロースを含む2.5mlの新鮮な培地を重層した。感染後24
時間目に細胞を3.5％のホルムアルデヒド中に固定化さ
せ、そしてクリスタルバイオレッドでその単層を染色す
ることによりプラークを可視化させた。結果を未処理MD
CK細胞からのウイルス保存物の力価のパーセンテージと
して表す。
実施例6:ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2のオリゴヌク
レオチド阻害の同定 ヒト表皮癌腫株A431をAmerican Type Culture Collec
tionから購入した。細胞を、リットル当たり4.5gmのグ
ルコースおよび10％のウシ胎児血清を含むダルベッコー
改変型イーグル培地中で増殖させた。タイプIIホスホリ
パーゼA2は、Opti−MEM（Gibco社）で密集単層を培養す
ることによりA431細胞から調製した。この培地を、YM−
５膜を用いるAmicon社の限外濾過装置上で５から10倍ま
でに濃縮した。濃縮された使用培地をヒトのタイプIIホ
スホリパーゼA2の源として用いた。これまでの研究によ
り、A431細胞はタイプIIホスホリパーゼA2のみを分泌す
ることが証明されている。
ホスホリパーゼA2アッセイは、基質として3H−オレイ
ン酸標識大腸菌（E.coll）を利用して実施した。3H−オ
レイン酸標識大腸菌は、Davidson et al.J.Biol.Chem.1
987、262、1698、により記載されるように調製した。反
応物は、200μＬの最終反応容量中に、100,000cpmの3H
−オレイン酸標識大腸菌、50mMのトリス−HCl、pH＝7.
4、50mMのNaCl、1mMのCaCl2、および50μｇのウシ血清
アルブミンを含んでいた。大腸菌基質の添加により反応
を開始した。100μＬの2N HClおよび100μＬの100mg/ml
無脂肪酸血清アルブミンの添加により反応を終結させ
た。試料をボルテックスミキサーにかけ、そして17,000
×ｇで５分間遠心させた。液体シンチレーション計数器
内で300μＬの分注を計数することにより上清中の3H−
オレイン酸の量を決定した。オリゴヌクレオチドは、基
質添加前にインキュベーション用混合物中に添加した。
実施例7:ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる
ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2の阻害に必須な構造 ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2を阻害するオリゴヌ
クレオチドと末端小粒DNA配列とは、双方がグアニンに
富む配列からなるという点における共通な特性を共有し
ている。オキシトリカ（Oxytricha）からのもののよう
な、末端小粒配列（XXXG4T4G4T4G4T4G4T4G4，配列番号1
21）は、Ｇカルテットと称する変わった配列を形成して
いる。この構造の形成は一価カチオン依存性であり、そ
して高温により破壊される。オリゴヌクレオチド構造が
活性薬物中心の一部分であるか否かを決定するために、
ISIS 3196（配列番号47）を15分間沸騰水中に入れ、そ
の後アッセイに添加した。沸騰によりISIS 3196（配列
番号47）の阻害活性が94％阻害から21％阻害へと減少し
た。変性性ゲル電気泳動によるオリゴヌクレオチドの実
験により沸騰によるオリゴヌクレオチドの断片化は生じ
ていないことが示された。Superdex G−75カラム上での
ゲル濾過クロマトグラフィーによる自然および変性させ
たISIS 3196（配列番号47）の分離により、自然の立体
配座においてはこのオリゴヌクレオチドは幾つかの分子
種として存在することが示された。ISIS.3196（配列番
号47）を沸騰させてからクロマトグラフィーにかける
と、高分子量種がなくなり、そしてより低い分子量のオ
リゴヌクレオチド種が出現してきた。これらの実験によ
り、我々は、その構造がISIS 3196（配列番号47）につ
いての薬物活性中心の一部分であるらしいものと結論づ
けた。
実施例8:タイプIIホスホリパーゼA2の選択についてのホ
スホロチオエートオリゴヌクレオチドの特異性 ウシ脾臓のホスホリパーゼA2、アピス メリフェラ
（Apis mellifera）のホスホリパーゼA2、ナジャ ナジ
ャ ナジャ（Naja naja naja）のホスホリパーゼA2、お
よびクロタルス デゥリッスス テリフィクス（Crotal
us durissus terrificus）のホスホリパーゼA2を、Sigm
a Chemical Co.社（St. Louis、MO）から取得した。ト
リメレスルス フラボリディス（Trimeresurus Flavori
dis）からのホスホリパーゼA2はCalbiochem社（La Joll
a、CA）から取得し、そしてアグキストロドン ピスキ
ボルス ピスキボルス（Agkistrodon piscivorus pisci
vorus）からのホスホリパーゼA2は、Mono Sカラム（Pha
rmacia社、Upsalla、Sweden）上でのクロマトグラフィ
ーにより全毒液（Sigma Chemical Co.社）から部分精製
した。
ISIS 3196（配列番号47）のヒトのタイプIIホスホリ
パーゼA2に対する特異性を決定するために、様々な源か
らのホスホリパーゼA2を阻害活性について検査した（図
５）。ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2は、ISIS 3196
（配列番号47）の阻害効果に対して検査した酵素全ての
内で最も高い感受性を示した（I.C.50≒0.15μＭ）（図
５）。クロタルス デゥリッスス（Crotalus durissu
s）の毒液（ガラガラヘビ）からのホスホリパーゼA2も
やはりタイプII酵素であり、これがISIS 3196（配列番
号47）の効果に対する二番目に高い感受性を示し（I.C.
50≒0.3μＭ）、そして次にはやはりタイプII酵素であ
るアグキストロドン ピスキボルス ピスキボルス（Ag
kistrodon piscivorus piscivorus）（ヌママムシ）の
毒液から単離したホスホリパーゼA2が続く（I.C.50≒３
μＭ）。タイプＩ酵素であるウシ脾臓のホスホリパーゼ
A2は、ISIS 3196（配列番号47）の効果に対して検査し
た酵素全ての内で最も高い耐性を示した（I.C.50≒100
μＭ）（図５）。ナジャ ナジャ ナジャ（Naja naja
naja）の毒液（コブラ毒液）から単離したホスホリパー
ゼA2（こちらはタイプＩ酵素である）ならびにトリメレ
スルス フラボリディス（Trimeresurus flavoridis）
（アジア産毒ヘビ、ハブ）から単離したホスホリパーゼ
A2は、両方ともISIS 3196（配列番号47）の阻害効果に
対して比較的耐性を示し、I.C.50値は10μＭを上回るも
のであった。アピス メリフェラ（Apis mellifera）
（ミツバチ）から単離されたホスホリパーゼA2はタイプ
ＩあるいはタイプII酵素のいずれでもないが、これもや
はりISIS 3196（配列番号47）の阻害効果に対してかな
りの耐性を示し、I.C.50値は100μＭを上回っていた。
これらの結果により、ISIS 3196（配列番号47）は、
ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2を選択的に阻害するこ
とが示された。クロタルス（Crotalus）およびアグキス
トロドン（Agkistrodon）の毒液から単離されたものの
ような他のタイプIIホスホリパーゼA2もISIS 3196（配
列番号47）の効果に対して感受性を示した。その一方
で、タイプＩ酵素は一般的にISIS 3196（配列番号47）
の効果に対してより強い耐性を示した。ハチの毒液（ア
ピス メリフェラ（Apis mellifera））のホスホリパー
ゼA2は、タイプＩもしくはタイプIIのいずれに対しても
強い配列相同性を示さないものの、これはタイプＩ酵素
に対してより強く関連している。他のタイプＩ酵素同様
に、これはISIS 3196（配列番号47）の阻害効果に対し
て比較的耐性である。
実施例9:ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる
ヒトのタイプIIホスホリパーゼA2の阻害メカニズム ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがホスホリパ
ーゼA2を阻害するメカニズムの解明における第一段階と
して、酵素の基質反応速度におけるオリゴヌクレオチド
の効果を決定した。イトのタイプIIホスホリパーゼA
2を、オリゴヌクレオチドISIS 3196（配列番号47）およ
びISIS 3481（配列番号77）の存在下において、大腸菌
基質の増加量と共にインキュベートした（図６）。大腸
菌のリン脂質の濃度は、Bartlett、J.Biol.Chem.1959、
234:466により記載される脂質リン分析（lipid phospho
rus analysis）により決定した。この結果により、ISIS
3481（配列番号77）は、0.2μＭおよび２μＭにおいて
はヒトのタイプIIホスホリパーゼA2の基質反応速度を変
化させることはないことが示される。それとは対照的
に、ISIS 3196（配列番号47）は、見かけ上のKmおよびV
maxの両方ともがオリゴヌクレオチドの存在下において
変化したため、見かけ上非競合的阻害剤のような挙動を
示した。アッセイ中における遊離カルシウムはオリゴヌ
クレオチドに対して500−から5000倍過剰であるという
ことから、ISIS 3196（配列番号47）は活性には必須で
あるカルシウムを配位することによりヒトのタイプIIホ
スホリパーゼA2を阻害するということは考えにくい。
実施例10:G4ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに
よる末端小粒長の調節 ヒト繊維芽細胞中の末端小粒DNAの量および長さが、
インビトロでの一連の過程の関数として加齢中に減少す
ることが既に示されている。この過程に対するG4ホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドの影響を調査するため
に、ヒト皮膚生検材料である繊維芽細胞を、Harley、C.
B.、Meth.Molec.Biol.1990、５、25−32、において記載
されるように増殖させる。１μＭ、３μＭ、もしくは10
μＭの最終濃度を生じるように培地にオリゴヌクレオチ
ドを添加し、一方で対照細胞にはオリゴヌクレオチドを
添加しないことにより、表６に示されるオリゴヌクレオ
チドで細胞を処理する。集団の倍加を計数し、そしてDN
Aを一定間隔をおいて単離する。末端小粒長はサザンブ
ロット分析により決定し、Harley、C.B.et al.、Nature
1990、345、458−460、において記載されるように集団
に倍加数に対してプロットする。得られる直線回帰線の
傾きは、未処理繊維芽細胞中における平均集団倍加数当
たりに約50bpの末端小粒DNAが失われていることを示し
ている。Harley、C.B.et al.、Nature1990、345、458−
460。表６のオリゴヌクレオチドでの処理により末端小
粒長の調節が行われることが期待される。
実施例11 幾つかのウイルスに対するG4ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドの活性：オリゴヌクレオチドの抗ウイル
ス活性は、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、
呼吸器シンシチウムウイルス、ヒトライノウイルス、ワ
クシニアウイルス、HSV−２、および水痘帯状皮疹ウイ
ルスについてのCPE阻害アッセイにより決定した。MTT細
胞生存能力アッセイを使用してHIVにおける効果をアッ
セイした。HSV−２、アデノウイルス、ワクシニアウイ
ルス、およびライノウイルスはMA104細胞においてアッ
セイした。呼吸器シンシチウムウイルスはHEp−２細胞
においてアッセイし、そしてインフルエンザウイルスは
MDCK細胞においてアッセイした。HIV阻害のMTTアッセイ
においてはCEM細胞を使用した。オリゴヌクレオチドを
ウイルス感染時に添加した。
MDCK（正常なイヌの腎臓）細胞およびHEp−２、連続
継代ヒト類表皮腫細胞株は、American Type Culture Co
llection、Rockville、MD、から取得した。アフリカグ
リーンモンキーの腎臓細胞の連続継代株であるMA−104
は、Whittaker M.A.Bioproducts社、Walkersville、M
D、から取得した。
HSV−２株E194、およびインフルエンザ株A/NWS/33（H
1N1）を用いた。アデノウイルスのタイプ５（Ａ−５）
のAdenoid 75株、呼吸器シンシチウムウイルス（RSV）L
ong株、ライノウイルス２（Ｒ−２）HGP株、およびワク
シニアウイルスLederle−chorioallantoic株は、Americ
an Type Culture Collection、Rockville、MD、から取
得した。
細胞は、MA104細胞については９％のウシ胎児血清（F
BS、Hyclone Laboratories社、Logan UT）および0.1％
のNaHCO3を添加してある非必須アミノ酸添加済みイーグ
ル最小必須培地（MEM、GIBCO−BRL社、Grand Island、N
Y）中で、MDCK細胞については５％のFBSおよび0.1％のN
aHCO3を添加してあるMEM培地中で、HEp−２細胞につい
ては10％のFBSおよび0.2％のNaHCO3を添加してあるMEM
培地中で増殖させた。HSV−２、Ａ−５、Ｒ−２、およ
びワクシニアウイルス希釈物用の検査培地は、２％のFB
S、0.18％のNaHCO3、50μｇのゲンタマイシン/mlを添加
してあるMEMであった。RSVは５％のFBS、0.18％のNaHCO
3、50μｇのゲンタマイシンを添加してあるMEM中で希釈
した。インフルエンザウイルスの希釈液用の検査培地
は、0.18％のNaHCO3、20μｇのトリプシン/ml、2.0μｇ
のEDTA/ml、50μｇのゲンタマイシン/mlを添加してある
無血清のMEMであった。
リバビリンは、ICN Pharmaceuticals社、Costa Mes
a、CA、から取得した。アシクロビルおよび９β−Ｄ−
アラビノフラノシルアデニン（ara−Ａ）は、Sigma Che
mical Co.社、St.Louis、MO、から購入した。
リバビリン、アシクロビル、およびara−Ａを調製
し、そして0.18％のNaHCO3、50μｇのゲンタマイシン/m
lを添加してある無血清のMEM中で希釈した。オリゴヌク
レオチドを同一溶液中で希釈した。
細胞を96−ウエルの平底組織培養用プレートに撤き
（0.2ml/ウエル）、そして細胞の単一層を形成させる目
的で一晩インキュベートした。デカンテーションにより
増殖培地をプレートから除去した。化合物の希釈液を、
所望の最終濃度の二倍の濃度を有する保存溶液として、
プレートの各ウエルに添加した（４ウエル／希釈液、各
化合物当たり0.1ml/ウエル）。化合物希釈用培地を細胞
およびウイルス対照用ウエルに添加した（0.1ml/ウエ
ル）。特定の検査用培地中に希釈してあるウイルスを全
ての化合物検査用ウエル（３ウエル／希釈液）およびウ
イルス対照用ウエルに0.1ml/ウエルで添加した。ウイル
スを含まない検査用培地を全ての毒性対照ウエル（各検
査化合物に関して１ウエル／希釈液）、および細胞対照
ウエルに0.1ml/ウエルで添加した。ウイルス対照ウエル
のCP計測値が十分な値を示すようになるまで、このプレ
ートを５％のCO2および95％の空気を用いる加湿式イン
キュベーター内、37℃下でインキュベートした。その
後、テストウエルおよびウイルス対照用ウエル中の細胞
を顕微鏡で調べ、そして細胞障害性に起因する形態学的
変化についての等級付けを行った。効果用量の50％終点
（ED50）および細胞障害性用量の50％終点（CD50）を、
ウイルスCPEデータおよび細胞障害性対照データの回帰
分析によりそれぞれ算出した。ED50は、細胞対照の濃度
（０）とウイルス対照の濃度との間の中点のCPE等級を
生じるように算出される化合物濃度である。CD50は、細
胞に関する可視的効果を生じない濃度と完全な細胞障害
性を生じる濃度との中点として算出される化合物濃度で
ある。各物質についての治療指数（TI）を、式:TI＝CD5
0/ED50により算出した。
ISIS 3383（配列番号122）およびISIS 6071を除くオ
リゴヌクレオチド配列を表１に示す。ISIS 3383はISIS
1082（配列番号134）の配列を不規制にさせたものであ
る。ISIS 6071（TGTGTGTG）はISIS 5320の配列を不規則
にさせたものである。結果を表７に示す。50μＭを下回
るED50値のオリゴヌクレオチドをこのアッセイにおいて
活性であると判定し、そしてこのようなオリゴヌクレオ
チドが好ましい。
実施例12:HSV−１に対する活性についてのオリゴヌクレ
オチドの検査 シトシンクラスターを含むHSV−1 RNAの領域に相補的
なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを合成した。
これらのオリゴヌクレオチドを表８に示す。
実施例３に記載されるELISAアッセイを使用して、表
８に示されるオリゴヌクレオチドをHSV−１（KOS株）に
対する活性について検査した。結果を未処理対照に対す
るパーセンテージとして表示する。これらの結果より、
EC50（50％阻害を生じる有効オリゴヌクレオチド濃度）
を各オリゴヌクレオチドについて算出する。μＭで表さ
れるこれらの値を表９に示す。このELISAアッセイにお
いて１μＭもしくはそれを下回るEC50を示すオリゴヌク
レオチドを特に良好な活性を有するものと判定し、そし
てこのようなオリゴヌクレオチドが好ましい。陰性対照
オリゴヌクレオチドであるISIS 1082（HSV UL13翻訳開
始コドンに相補的であるが、Ｇの連なりを持たない）
は、二重実験において2.5および1.8μＭのEC50を示し
た。
実施例13:HSVの様々な株に対するG4ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドの活性 オリゴヌクレオチドをHSV−１、ならびにHSV−１の５
つの株［この内の２つ（HSV1−DM2.1およびHSV1−PAA
r）はアシクロビル（ACV）に耐性を示す）に対して検査
した。オリゴヌクレオチドを実施例３において記載され
るELISAによりアッセイし、そして結果を表10に示す。
このアッセイにおいては、１μＭもしくはそれを下回る
EC50を有するオリゴヌクレオチドを特に活性を示すもの
と判定し、そしてこのようなオリゴヌクレオチドが好ま
しい。
実施例14:G4ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに
よるHSV−１阻害に関するオリゴヌクレオチド添加時間
の効果 NHDF細胞を、3.0pfu/細胞のMOIでHSV−１（KOS）に感
染させた。オリゴヌクレオチドもしくはACVを12μＭの
濃度で、感染後の様々な時間に添加した。HSVを感染後4
8時間目にELISAにより検出した。不規則の対照オリゴヌ
クレオチド3388を含む全てのオリゴヌクレオチドは、こ
れらをウイルス感染の時間（ｔ＝０）に細胞に添加した
際にはHSV複製を阻害したが、ウイルス感染の後に添加
した場合にはHSV遺伝子に相補的であるオリゴヌクレオ
チドのみ（ISIS 4274、12204015、および3657）がHSV複
製を阻害した。感染後８−11時間目に添加した場合には
これらのオリゴヌクレオチドは良好な抗ウイルス活性を
示した。このパターンは図７に示されるように、ACVに
ついて観察されたものに類似している。
実施例15:デオキシギャップを有する２′−Ｏ−メチルG
4キメラオリゴヌクレオチド フランク領域内の各ヌクレオチドの糖における２′−
Ｏ−メチル置換、ならびにオリゴヌクレオチドの中心部
分における２′−デオキシヌクレオチド（「デオキシギ
ャップ」と称する）を有する一連のホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドを合成した。デオキシギャップは長
さがゼロから７ヌクレオチドまで変化させた。これらの
キメラオリゴヌクレオチドを実施例３において記載され
るELISAによりアッセイし、そして結果を表11に示す。
このアッセイにおいては、１μＭもしくはそれを下回る
EC50のオリゴヌクレオチドを特に活性であると判定し、
そしてこのようなオリゴヌクレオチドが好ましい。
ISIS 4015およびISIS 4398の配列を有する追加のキメ
ラオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌク
レオチドは先に記載されるデオキシギャップを有する
２′−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドではあったが、こ
れらの化合物は、一様なホスホロチオエート主鎖の代わ
りにデオキシギャップ領域内にホスホロチオエートヌク
レオチド間連結を、そしてフランク領域内にホスホジエ
ステル連結を有していた。これらのオリゴヌクレオチド
は、このELIAアッセイにおいてはHSVに対する活性を示
さなかった。
２′−Ｏ−プロピル修飾基を有する追加のオリゴヌク
レオチドを合成した。２′−Ｏ−プロピルオリゴヌクレ
オチドは、B.S.Sproat、et al.、Nucleic Acids Resear
ch18:41−49（1990）、およびH.Inoue、et al.、Nuclei
c Acids Research15:6131−6148（1987）、により記載
される文献の方法を改変させることにより調製した核酸
塩基Ａ、Ｇ、Ｕ（Ｔ）、およびＣの２′−デオキシ−
２′−Ｏ−プロピルリボシドから調製した。ISIS 7114
は、ISIS 4015と同一配列（配列番号21）を有し、そし
て各糖に２′−Ｏ−プロピル修飾を有するホスホロチオ
エートである。ISIS 7171は、ISIS 4015と同一配列を有
し、そして位置１−７および14−20に２′−Ｏ−プロピ
ル置換基を有する（６−デオキシギャップ）ホスホロチ
オエートギャップ化２′−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオ
チドである。図８に示されるように、３つ全てのオリゴ
ヌクレオチドはHSVに対する活性を示す。ISIS 3675（配
列番号16）の一様な２′−Ｏ−プロピルホスホロチオエ
ート版も合成し、そしてHSV−１に対する活性について
検査した。図９において示されるように、このオリゴヌ
クレオチド（ISIS 7115）はISIS 3657よりもさらに高い
活性を示した。従って、２′−Ｏ−プロピル修飾は本発
明の好ましい態様である。図９にはまた、ISIS 3657お
よびISIS 7115の両方がアシクロビルよりも何倍も活性
が高いことが示されており、このアシクロビルは対照オ
リゴヌクレオチドであるISIS 3383よりも高い活性を示
すものである。
実施例16:G4オリゴヌクレオチドによるHSV−１の阻害に
おける化学修飾の効果 イノシン置換： 一つもしくは複数のグアノシンがイノシン残基で置き
替わっている一連のオリゴヌクレオチドを製造した。イ
ノシン残基を含むオリゴヌクレオチドを、Glen Researc
h社から購入したイノシンホスホルアミダイトを使用し
て、未修飾DNAオリゴヌクレオチドについて行ったのと
同じ要領で合成した。これらの配列を、実施例３に記載
したELISAアッセイにおいて活性についてアッセイし
た。これらのオリゴヌクレオチド、それぞれの親配列、
およびEV50値を表12に示す。
このアッセイにおいては１μＭもしくはそれを下回る
EC50のオリゴヌクレオチドを特に活性であると判定し、
そしてこのようなオリゴヌクレオチドが好ましい。
フルオレセイン−共役結合化オリゴヌクレオチド： オリゴヌクレオチドの５′端にフルオレセイン部分が
共役結合してある幾つかのオリゴヌクレオチドを合成し
た。フルオレセン共役結合化オリゴヌクレオチドは、Gl
en Research社から購入したフルオレセイン標識アミダ
イトを使用して合成した。
これらの配列を、実施例３に記載されるELISAアッセ
イにおいて活性についてアッセイした。これらのオリゴ
ヌクレオチド、それぞれの親配列、およびEV50値を表13
に示す。このアッセイにおいては１μＭもしくはそれを
下回るEC50のオリゴヌクレオチドを特に活性であると判
定し、そしてこのようなオリゴヌクレオチドが好まし
い。
７−メチル−７−デアザグアノシン置換： 単量体の製造法： ヘキサン分散液中の0.8g（20ミリモル）の60％水素化
ナトリウムの攪拌懸濁液をデカンテーションし、そして
乾燥させ、100mlの乾燥アセトニトリル中に再懸濁さ
せ、そしてこの懸濁液を3.21g（15ミリモル）の４−ク
ロロ−５−メチル−２−メチルチオピロロ［2,3−ｄ］
ピリミジンで処理した［Kondo et al.（1977）Agric.Bi
ol.Chem.4:1501−1507］。この混合物を室温下において
窒素下で１時間攪拌し、そしてその後5.9g（15ミリモ
ル）の１−クロロ−２−デオキシ−3,5−ジ−Ｏ−（ｐ
−トルオイル）−α−Ｄ−エリスロペントフラノースを
数回に分けて添加することにより処理した。40mlのアセ
トニトリルを追加添加し、この混合物を50℃において約
３時間半攪拌し、そしてその後濾過し、そして固体をア
セトニトリルで洗浄し、乾燥して6.1g（72％）の４−ク
ロロ−５−メチル−２−メチルチオ−７−［α−Ｄ−エ
リスロ−ペントフラノシル］ピロロ［2,3−ｄ］ピリミ
ジン、m.p.163−163.5℃、を生じた。
この産物をDMF中でナトリウム２−プロペニルオキシ
ドと反応させることにより、５−メチル−２−メチルチ
オ−４−（２−プロペニルオキシ）−７−（α−Ｄ−エ
リスロ−ペントフラノシル）ピロロ［2,3−ｄ］ピリミ
ジンが生じ、これを塩化メチレン中で２モル等量の３−
クロロ過安息香酸で酸化させると５−メチル−２−メチ
ルスルホニル−４−（２−プロペニルオキシ−７−（α
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）ピロロ［2,3−
ｄ］−ピリミジンを生じた。この産物をヒドラジンと反
応させることにより、５−メチル−２−ヒドラジノ−４
−（２−プロペニルオキシ）−７−（α−Ｄ−エリスロ
−ペントフラノシル）ピロロ［2,3−ｄ］ピリミジンを
生じた。この産物を例えばラネーニッケルと反応させる
と７−デアザ−２′−デオキシ−７−メチルグアノシン
を生じる。
単量体の保護： 後者化合物を、最初にピリジン存在下においてトリメ
チルクロロシランで、その後に水酸化イソブチルで連続
的に処理すると２−イソブチリル−７−デアザ−２′−
デオキシ−７−メチルグアノシンを生じ、これを乾燥ピ
リジン存在下において一モル等量の塩化トリチルと反応
させると２−イソブチリル−７−デアザ−２′−デオキ
シ−７−メチル−５′−トリチルグアノシンを生じる。
後者化合物を一モツ等量のクロロ−β−シアノエトキシ
−N,N−ジイソプロピルアミノホスフィンと反応させる
と２−イソブチリル−７−デアザ−２′−デオキシ−７
−メチル−３′−Ｏ−［N,N−ジイソプロピルアミノ−
β−シアノエトキシホスファニル］−５′−トリチルグ
アノシンを生じる。その後この保護化単量体を自動合成
中にオリゴヌクレオチド中に取り込ませる。
ISIS 3657と同一の配列を有するオリゴヌクレオチド
を合成したが、この配列中では位置14および15のグアノ
シンが７−メチル−７−デアザグアノシンに置き換わっ
ていた。このオリゴヌクレオチド（ISIS 6303）は約10
μＭのIC50を有することを見いだした。
実施例17:他の抗ウイルス剤と組み合わせた場合のISIS
4015の活性 ISIS 4015を、実施例３に記載されるELISAアッセイに
おいてヌクレオシドアナログである５−トリフルオロメ
チル−dUrd（TFT）と組み合わせて検査した。０から２
μＭまでの濃度のオリゴヌクレオチドおよびTFTを検査
した。図10において示されるように、ISIS 4015はHSV−
１に対するTFTの活性を亢進させるように思われる。
ISIS 4015を、０から２μＭまでのオリゴヌクレオチ
ド濃度および０から16μＭまでのACV濃度で、９−（２
−ヒドロキシエトキシメチル）グアニン（アシクロビ
ル、ACV）に対して同様の方法で検査を行った。図11に
示すように、組み合わせた場合これら２つの薬剤の効果
は相加的であるように思われた。
実施例18:HSV−１に対するG4含有８量体オリゴヌクレオ
チドの活性 漸進的作為化法（a progressive unrandomaization s
trategy）［Ecker、D.J.et al.、（1993）Nucl.Acids.R
es.21:1853−1956］を使用して、実施例３において記載
されるELISAアッセイにおいてHSV−１に対して活性を示
す８量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定
した。「勝利」オリゴヌクレオチドであるISIS 5684
は、配列GGGGGGTGを有していた。このオリゴヌクレオチ
ドのED50は約0.6μＭであることを見いだした。
G4配列を含む一連の８量体ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドを合成し、そして実施例３において記載さ
れるHSV−１のELISAアッセイにおける検査を行った。こ
れらのオリゴヌクレオチドを表14に示す。
図12に示されるように、これら全てのオリゴヌクレオチ
ドは１μＭを下回るIC50値を有しており、そしてそのた
めこれらは好ましいオリゴヌクレオチドである。これら
の８量体の内の幾つかのものは、20量体であるISIS 401
5のものと比較してより高い抗−HSV活性を示す。
HIVに対するG4オリゴヌクレオチド活性： 実施例19 オリゴヌクレオチドライブラリーの合成。
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標準的な
方法を使用して合成した。イオウ付加反応は、酸化剤と
して3H−1,2−ベンゾジチオール−３−オン−1,1−ジオ
キシド（「ボーケージ試薬（Beaucage reagent）」を使
用して実施した。Iyer、R.P.、Phillips、L.R.、Egan、
W.、Regan、J.B.＆ Beaucage、S.L.（1990）J.Org.Che
m.55、4693−4699。無作為的に操作された位置を有する
オリゴヌクレオチドについては、ABI 394合成機の第５
入口部の単一のバイアル内で各アミダイトを混合した。
この混合物を、dT−CPGに結合させ、開裂を行い、そし
て産物の脱保護を行い、そして逆相HPLC上で粗生成材料
を分析することにより検査した。個々のアミダイトの比
率を調節して、等量の４つの二量体が得られるようにし
た。DMTから取り外したオリゴヌクレオチドを、水中の
メタノールの濃度勾配度での逆相HPLCにより精製して、
脱塩および保護基の除去を行った。幾つかの精製オリゴ
ヌクレオチドを、ヌクレオアーゼでの完全消化およびそ
の後の逆相HPLC分析により各構成成分についての分析を
行い、各塩基の予想比率を得た。
グリコシド結合がα−立体配置になっているオリゴヌ
クレオチドを、既に記載されうように合成した。Morva
n、F.、Rayner、B.、Imbach、Ｊ−L.、Thenet、S.、Ber
trand、Ｊ−R.Paoletti、J.、Malvy、C.＆ Paoletti、
C.（1993）Nucleic Acids Res.15、3421−3437。ビオチ
ンは、Glen Research社からのビオチン結合化CPGを用い
て化学合成中に取り込ませた。オリゴヌクレオチドT2G4
T2（ISIS 5320）を逆相クロマトグラフィーにより精製
して脱塩および保護基の除去を行い、そしてその後サイ
ズ排除クロマトグラフィーにより実施例21に記載される
四量体を精製した。
抗ウイルス活性についてのスクリーニングを行う前
に、オリゴヌクレオチドを40mMのリン酸ナトリウム（pH
7.2）、100mMのKCl中の1mM鎖濃度に希釈し、そして室
温において一晩インキュベートした。吸光係数は、Pugl
isi ＆ Tinoco、（1989）Methods in Enzymology、RNA P
rocessing、eds.Dahlberg、J.E.＆ Abelson、J.N.（Aca
demic Press、Inc.、New York）、Vol.180、pp.304−32
4、により記載される要領で決定した。0.2μｍの酢酸セ
ルロースフィルターを通して試料を滅菌した。
実施例20 急性HIV−１セッセイ。
HIV−１誘導性細胞変性効果からの予防効果を測定す
る急性HIV−１感染アッセイにおいてオリゴヌクレオチ
ドをスクリーニングした。CEM−SS細胞株［Nara、P.L.
＆ Fischinger、P.J.（1988）Nature332、469−470］
を、10％のウシ胎児血清、2mMのゲルタミン、ペニシリ
ン（100単位mL-1）、およびストレプトマイシン（100
μg mL-1）を補足してあるRPMI 1640培地中で維持し
た。XTT−テトラゾリウムを使用してHIV誘導性細胞死滅
からの薬剤誘導性保護作用を定量する抗ウイルスアッセ
イが既に記載されている。White、E.L,、Buckheit、J
r.、R.W.、Ross、L.J.、Germany、J.M.、Andries、K.、
Pasuwels、R.、Janssen、P.A.J.、Shannon、W.M.＆ Chi
rigos、M.A.（1991）Antiviral&Res.16、257−266。
実施例21 四量体の特徴決定 単量体および四量体形態のオリゴヌクレオチドをPhar
macia Superdex HR 10/30のサイズ排除カラム（Pharmac
ia社、Upsalla、Sweden）上で分離した。溶出用緩衝液
は、25mMのリン酸ナトリウム（pH7.2）、0.2mMのEDTAで
あった。流速は0.5mL分-1であり、そして検出を260nmで
行った。単量体と四量体とのピークとを積分し、そして
四量体分画を決定した。精製のためには、Pharmacia Su
perdex 75 HiLoad 26/60のカラムを、2mL分-1の流速に
おける10mMのリン酸ナトリウム（pH7.2）の緩衝液と共
に使用した。
四量体の解離が希釈後に生じた。オリゴヌクレオチド
の1mM溶液をPBS（137mMのMaCl、2.7mMのKCl、1.5mMのリ
ン酸−カリウム、8mMのリン酸二ナトリウム）内に10μ
Ｍになるように希釈し、そして37℃においてインキュベ
ートした。K+中の配列T2G4T2を有するホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチド、およびホスホジエステルT2G4T2
は、40mMのリン酸ナトリウム（pH7.2）、100mMのKCl中
の溶液から希釈した。Na+中の配列T2G4T2を有するオリ
ゴヌクレオチドは、40mMのリン酸ナトリウム（pH7.
2）、100mMのNaCl中の溶液から希釈した。時間の関数と
して解離を行わせた後、サイズ排除クロマトグラフィー
を行った。
T2G4T2および５′T13G4T4 ３′（配列番号142）を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより形成さ
れる複合体の分析により決定したところ、形成される四
量体は鎖が平行に向き合っていた。各オリゴヌクレオチ
ドの５′末端を32Pで標識した。各試料は、125μＭの非
標識量および15pMの放射活性標識量の、一方もしくは両
方のオリゴヌクレオチドを含んでいた。これらの試料を
50mMのリン酸ナトリウム（pH7.2）、200mMのKCl中で沸
騰水槽中で15分間加熱し、そしてその後４℃において48
時間インキュベートした。試料は、１×TBE泳動緩衝液
中で４℃において泳動した20％の非変性ポリアクリルア
ミド（19:1、アクリルアミド：ビス）ゲルのオートラジ
オグラフィーにより分析した。
実施例22 HIV−１誘導化細胞融合のアッセイ 慢性的にHIV−１感染しているHut 78細胞（Hut/4−
３）と、LTR誘導性Lac z遺伝子を有するCD4＋HeLa細胞
との化学量論的な量を、オリゴヌクレオチドの存在下も
しくは非存在下において20時間同時培養した。細胞を固
定化し（PBS中の１％のホルムアルデヒドおよび0.2％の
グルタルアルデヒド）、そして細胞に関連する呈色反応
が生じるまでＸ−galと共にインキュベートした。緩衝
液を除去した後、標準ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
クトピラノシドを使用してβ−ガラクトシダーゼ発現を
定量した。対照として、LTR誘導性lac z遺伝子を含むHe
La CD4＋細胞を、リン酸カルシウム法を用いて30μｇの
プロウイルス性DNA（pNL4−３）でトランスフェクトさ
せた。グリセロールショックを与えた直後にオリゴヌク
レオチドを添加した。トランスフェクション後48時間目
に細胞を固定化し、そして上記のようにアッセイした。
実施例23 ISIS 5320のgp120への結合 gp120への直接結合を、CD4捕獲ELISAキット（America
n Bio−technologies社）からの固定化gp120を使用して
アッセイした。ビオチニル化オリゴヌクレオチド（Glen
Research社からのビオチン結合化CPGを使用して合成中
にビオチニル化させたもの）を、固定化gp120と共に100
μＬの容積中でインキュベートした。１時間のインキュ
ベーションの後、各ウエルを洗浄し、そしてPBS中にお
いて1:1000に希釈した200μＬのストレプトアビジン−
アルカリホスファターゼ（Gibco BRL社）を各ウエルに
添加した。室温において１時間インキュベーションした
後、各ウエルを洗浄し、そしてPNPP基質（Pierce社）を
添加した。プレートを37℃においてインキュベートし、
そして405nmにおける吸光度を、Titertek Multiscan MC
C/340 ELISAプレートリーダーを使用して測定した。
gp120への結合について硫酸デキストランと競合するI
SIS 5320の能力を決定した。0.5μＭの濃度のビオチニ
ル化ISIS 5320を、固定化gp120と共に表示濃度の硫酸デ
キスラン（Sigma、M.W.500）を含むプレートに添加し
た。１時間のインキュベーションの後、gp120に結合し
たオリゴヌクレオチドの量を先に記載の要領で決定し
た。
gp120に結合するISIS 5320の部位を、その蛋白質の様
々な領域に特異的な抗血清の結合についての競合反応に
より決定した。Rusche、J.R.、et al.、（1987） Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 84、6924−6918;Matsushita、
S.、et al.、（1988） J.Virol. 62、2107−2114;Meul
ler、W.T.、et al.、（1986） Science 234、1392−13
95。gp120をコーティングしてあるマイクロタイタープ
レートを、25μＭの濃度のオリゴヌクレオチドと共に室
温において１時間インキュベートした。1:250に希釈し
た抗血清を添加し、そしてそのプレートを40分間インキ
ュベートした。プレートをPBSで４回洗浄し、そしてPBS
中のプロテインA/G−アルカリホスファターゼ（1:500
0、Pierce社）と共に、室温において１時間インキュベ
ーションすることにより結合した抗体の量を定量した。
PBSで一度洗浄した後、基質を添加し、そして405nmにお
ける吸光度を測定した。
細胞上に発現されるgp120、CD44、およびCD4へのISIS
5320の結合を定量した。HIV−1 eny c遺伝子を有するH
eLa細胞［Gama Sosa、M.A.、et al.、（1989） Bioche
m.Biophys.Res.Comm. 161、305−311、およびRuprech
t、R.M.、et al.、（1991） J.Acquir.Immune Defic.S
yndr. 4、48−55］を、10％のFCSおよび100μ μＬ-1
のＧ−418を補足してあるDMEM中で培養した。gp120への
結合の程度は、１μｇのFITC−共役結合化マウス抗−gp
120 HIV−1 IIIB mAb IgG（Agmed社）を用いて検出し
た。CD44結合は、１μｇのFITC−共役結合化マウス抗−
CD44 mAb IgG（Becton−Dickinson社）を用いて検出し
た。各実験系は200,000の細胞から構成されていた。細
胞を、0.05％のNaN3を補足してある培養培地中で一度洗
浄し、そしてその後オリゴヌクレオチドを含む100μＬ
の培地中に再懸濁させ、そして室温において15分間イン
キュベートした。抗体を添加し、そしてインキュベーシ
ョンを４℃において１時間継続させた。細胞をPBSで２
回洗浄し、そして免疫蛍光をBecton−Dickinson FACSca
nにおいて測定した。Lysis11ソフトウエアーを用いて平
均蛍光強度を決定した。
CEM−T4細胞［Foley、G.E.、et al.、（1965） Canc
er18、522−529］を、10％のFCSを補足してあるMEM中で
維持した。CD4への結合の程度を、マウス抗−CD4 mAb I
gGであるQ425を１μｇ用いて決定した。Healey、D.、et
al.、（1990）J.Exp.Med.172、1233−1242。細胞を回
収し、そして洗浄し、そして先の要領でオリゴヌクレオ
チドと共にインキュベートした。抗体と共に室温におい
て30分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、そして
５μｇのヤギ（ab′）2抗−マウスIgG（pierce社）を含
む100μＬの培地と共にインキュベートした。細胞を30
分間インキュベートし、そして先の要領で結合蛍光を決
定した。
実施例24 T2G4T2の選択および特徴決定。
８つのヌクレオチドの全ての可能な配列を含むホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドライブラリーの各々が
4,096の配列を含む16の組を実施例19に記載されるよう
に製造し、そして実施例21に記載されるようにHIV感染
の阻害についてスクリーニングした。この結果を表15に
まとめた。
無作為位置であるＮは、各塩基の等モル量の混合物で
ある。抗ウイルスデータは、50％のウイルス誘導性細胞
死滅（IC50）に必要な薬物の量（オリゴヌクレオチド鎖
のμＭにおける量）として示される。IC50における誤差
は±0.1μ1Mである。「不活性」プールは、100μＭの鎖
濃度において抗ウイルス活性が認められないことを示
す。実施例21に記載されるように決定された％四量体率
を、選択されたプールについて括弧内に示す。星印は多
重結合体種を表す。
インビトロでのアッセイによって、HIV誘導化細胞変
性効果からの細胞の保護を測定した。White、E.L.、et
al.、（1991） Antiviral Res.16、257−266。選択初
回においては、抗ウイルス活性は、２つの固定位置にグ
アノシンを含む組においてのみ観察された。それ以降の
選択の際には、４つの連なるＧが最高の抗ウイルス活性
を提供することが明らかになった。グアノシンコアを挟
み込むヌクレオチドについては強い選択特異性は観察さ
れなかった。配列T2G4T2（オリゴヌクレオチドISIS 532
0）をこれ以降の研究用に選択した。ウイルス誘導性細
胞死滅（IC50）の50％阻害に必要なISIS 5320の濃度は
0.3μＭであった。このオリゴヌクレオチドの抗ウイル
ス活性は細胞異化作用の阻害の結果ではなく、細胞を約
100μＭのISIS 5320と共にインキュベートするまで細胞
毒性効果は観察されなかった。
オリゴヌクレオチドISIS 5320はホスホロチオエート
主鎖を有するものの、このオリゴヌクレオチドは類似す
る配列のホスホジエステルオリゴヌクレオチドがそうで
あるように、４本の鎖が平行になっているヘリックスの
形をとっていることを示唆する証拠がある。Cheong、C.
＆Moore、P.B.（1992） Biochemistry31、8406−8414;
Aboul−ela、F.、et al.、（1992） Nature360、280−
282;Sarma、M.H.、et al.、（1992） J.Biomol.Str.Dy
n.９、1131−1153;およびWang、Y.＆ Patel、D.J.（199
2） Biochemistry 31、8112−8119。抗ウイルス活性を
示す組み合わせのライブラリープール中のオリゴヌクレ
オチド（表15）とオリゴヌクレオチドISIS 5320とは、
サイズ排除クロマトグラフィーにより示されるように多
重複合体を形成する（表13）。この複合体の保持時間
は、保持時間 対 ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チド鎖のlogモル重量のプロットに基づくと四量体種に
ついて予測されるものであった（データ未公開）。オリ
ゴヌクレオチドISIS 5320の多重形態の偏光二色性（C
D）スペクトルは265nmにおけるピークおよび242nmにお
ける谷という特徴を有し（データ未公開）、デオキシオ
リゴヌクレオチド四量体についての他の研究者により報
告されるスペクトルに類似している。Sarma、M.H.、et
al.、（1992） J.Biomol.Str.Dyn. 9、1131−1153;L
u、M.、Guo、Q.＆ Kallenbach、N.R.（1992） Biochem
istry 31、2455−2459;Jin、R.、et al.、（1992）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 89、8832−8836、およびHardin、
C.C.、et al.、（1992） Biochemistry 31、833−84
1。類似しないサイズであるが、各々が一続きになって
いる４つもしくは５つのグアノシンを含む２つのホスホ
ジエステルオリゴヌクレオチドを共にインキュベートし
た際には、非変性ゲル上で区別される５つの集合体種が
形成されることが報告されている。Sen、D.＆ Gilber
t、W.（1990） Nature 344、410−414、およびKim、
J.、Cheong、C.＆ Moore、P.B.（1991） Nature351、3
31−332。原理的には、平行鎖の四量体のみがこのパタ
ーンを説明することができる。２つのホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチド、すなわち抗ウイルス性オリゴヌ
クレオチドISIS 5320、および３′端附近に４つのグア
ノシンを含む21残基のオリゴヌクレオチド（５′T13G4T
4 ３′）を用いてこの実験を実施した際には、平行鎖の
四量体について予測される５つの集合体種が非変性ゲル
上で観察された（図14）。
実施例25 四量体はHIVに対する活性を示す。
オリゴヌクレオチドを実施例22において記載される抗
ウイルス活性についてスクリーニングした。ISIS 5320
の試料を、少なくとも98％が四量体である1mMの保存溶
液から希釈した。この四量体は1mMの鎖濃度においては
無期限に安定であるという結果が得られた。室温におけ
る100mMのKClを含む緩衝液中の1mM試料中においては、
四量体の減少は５カ月を越える間観察されなかった。抗
ウイルスアッセイにおいて用いられる濃度（25μｍを下
回る濃度）にまで希釈する際には四量体の解離が開始す
るが、解離速度は非常に緩和である（図15）。分子間の
Ｇ−カルテット複合体の結合および解離の速度はゆっく
りであることが報告されている。Jin、R.、et al.、（1
992） Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89、8832−8836、およ
びSen、D.＆ Gilbert、W.（1990） Nature 44、410−4
14。ISIS 5320のカリウム形態の解離についての半減期
は約45日である。この試料をナトリウム中あるいはカリ
ウム中のいずれにおいて製造したとしても、急性抗ウイ
ルスアッセイの６日の期間の間には少なくとも70％の試
料が四量体形態を維持していた。四量体を安定化させる
にはカリウムがより好ましいが、ナトリウムおよびカリ
ウムの両形態は急性抗ウイルスアッセイにおいて同一の
IC50値を示す。
ISIS 5320により形成される四量体複合体の熱変性後
にこれを抗ウイルスアッセイに添加したところ活性が消
失し、復元時に抗ウイルス活性が回復した（データ未公
開）。組み合わせのスクリーニングに用いた最初の16組
のオリゴヌクレオチド間の抗ウイルス活性における決定
的な違いは、Ｇ−コアの存在もしくは非存在、したがっ
て四量体構造により説明される（表15）。初回のスクリ
ーニングにおいては、活性を示した５′NNGNGNNN３′プ
ール中の約12％の分子は少なくとも４つの連続するＧを
含んでおり、そしてサイズ排除クロマトグラフィーによ
り、５％のオリゴヌクレオチドが四量体を形成すること
が示された（表15）。それとは対照的に、Ｘ＝Ｇである
他の３つの初回プールにおいては、0.4％の分子のみが
少なくとも４つの連続するＧを含んでいたに過ぎず、四
量体は全く観察されなかった。他のプールにおいては、
４つの連なるＧを伴う分子は存在しなかった。
ISIS 5320配列のいずれかの末端からのヌクレオチド
の欠損により活性の消失がもたらされた（表16）。
ISIS 5320の配列変異体およびアナログについての急
性HIVアッセイからのデータ。オリゴヌクレオチドの化
学修飾状態は、「ｓ」はホスホロチオエート主鎖を、
「ｏ」はホスホジエステル主鎖を、「α」はグリコシド
結合のα−立体配置を、「Ｂ」はビオチン（Glen Resea
rch社からのビオチン結合化CPGを用いて化学合成中に取
り込ませる）を表す。「不活性」は、25μＭ濃度におい
て活性を示さないことを表す。％四量体率は実施例21に
おいて記載される要領で決定した。星印は２以上の集合
体種を表す。
ホスホロチオエートGGGGは幾らか活性を示し、ほぼ最
高に近い活性を示すには、４つのＧの３′側の２つのヌ
クレオチドが必要であった。サイズ排除クロマトグラフ
ィーにより、Ｇ−コアが露出されているオリゴヌクレオ
チドについて２以上の多重種が観察された。
たとえホスホジエステル四量体が、ホスホロチオエー
トISIS 5320により形成されるものよりも動力学的に安
定であると思われるが、ホスホジエステル主鎖を有する
配列T2G4T2は抗−HIVアッセイにおいては不活性であっ
た（図15）。特に理論に執着することを望む訳ではない
が、２つの仮説を提案する。ホスホロチオエート主鎖が
反応機構上必要である可能性があるか、あるいは修飾を
受けた主鎖がオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ介在性
分解を回避させる可能性がある、ということである。
グリコシド結合がα−位に配向しているオリゴヌクレ
オチドアナログは、ヌクレアーゼ分解に耐性を示す。Mo
rvan、F.、et al.、（1993） Nucleic Acids Res.15、
3421−3437。サイズ排除クロマトグラフィーに基づき、
ホスホロチオエートα−オリゴヌクレオチドおよびホス
ホジエステルα−オリゴヌクレオチドの両方が四量体を
形成することが示されたが、ホスホロチオエートアナト
グのみがHIVに対する活性示した（表16）。混合型ホス
ホロチオエート−ホスホジエステル主鎖を有するオリゴ
ヌクレオチドのアッセイにより、ホスホロチオエート結
合が末端に存在するがＧ−コア内には存在しないことが
活性に必要であることが示された。結果を表16に示す。
実施例26 四量体はCD4+細胞へのHIV−１の結合もしくは融合を
阻害する。
オリゴヌクレオチドISIS 5320は、組み込み後の段階
に作用する阻害剤に対してのみ反応する慢性感染（H9 I
IIB）細胞モデルには何の影響をも及ぼさなかった（デ
ータ未公開）。Srivastava、K.K.、et al.、（1991）
J.Virol. 65、3900−3902により記載される要領で実施
した高次の多重感染（MOI）実験においては、ISIS 5320
は細胞内PCR−増幅可能DNAの産生を阻害し（データ未公
開）、このことによりこの化合物は、結合、融合、内在
化、もしくは逆転写のようなHIV複製の初期段階を阻害
することが示された。
ISIS 5320の四量体形態は、CD4+細胞への感染性ウイ
ルスの結合もしくは融合も阻害した。このアッセイは実
施例22に記載される要領で実施した。HeLa−CD4−LTR−
Ｂ−gal細胞［Kimpton、J.＆ Emerman、M.（1992） J.
Virol. 66、2232−2239］をオリゴヌクレオチドと共に3
7℃において15分間インキュベートし、その後にウイル
スを添加した。１時間後、細胞を洗浄して結合していな
いウイルスおよびオリゴヌクレオチドを除去した。イン
キュベーション期間の間にウイルス結合および膜融合と
いう現象が生じる。Srivastava、K.K.、et al.、（199
1） J.Virol. 65、3900−3902。48時間後の感染の程度
を、Kimpton、J.＆ Emerman、M.（1992） J.Virol. 6
6、2232−2239により既に記載されるように、シンシチ
ウムの定量およびELISAにより決定した。約0.4μＭのIS
IS 5320濃度においては、ウイルス産生は対照の50％に
まで減少した（データ未公開）。熱変性させたISIS 532
0および５′TGTGTGTG３′は、５μＭのオリゴヌクレオ
チド濃度において結合の阻害を示した。これらの融合お
よび結合阻害実験により、ISIS 5320の四量体形態は、
ビリオンが細胞に結合する間、あるいはビリオンの融合
および内在化という初期現象の間のいずれかにおける非
常に初期の段階においてウイルス感染を阻害することが
強く示唆される。
実施例27 四量体はgp120のV3ドメインに結合する。
細胞実験により、ISIS 5320はウイルスの結合もしく
は融合を遮断することが示唆され、このためCD4およびg
p120に対するISIS 5320の親和性を実施例23において記
載される要領で決定した。ビオチニル化させたISIS 532
0（表16）は、１μＭを下回る解離係数（Kd）で固定化g
p120に結合した（図16）。それとは対照的に、対照ホス
ホロチオエートである５′T2A4T2−ビオチン3′は、260
μＭという推定Kdでgp120に緩く結合した。50μg mL-1
までの濃度のCD4を添加してもgp120へのISIS 5320の結
合には何の影響もなかった（データ未公開）。CD4−コ
ーティング化マイクロタイタープレートを用いる類似実
験により、ビオチニル化ISIS 5320はCD4にも結合するこ
とが示されたが、約25μＭというKdはgp120に対するも
のと比較するとかなり弱いものであった。対照は、非常
に高い濃度において添加した場合にのみCD4に結合した
（Kdは約240μＭ）。Fried、M.＆ Crothers、D.M.（198
1） Nucleic& Acids& Res. 9、6505−6525により記載
される要領で実施される定量的ゲルシフトアッセイを実
施して、他のHIV蛋白質（Tat、p24、逆転写酵素、vif、
プロテアーゼ、gp41）、可溶性CD4（sCD4）、および無
関係の蛋白質（BSA、トランスフェリン、およびRNアー
ゼV1）についてのISIS 5320の親和性を決定した。ISIS
5320の単量体および四量体形態の両方がBSAおよび逆転
写酵素に結合した。四量体特異的結合は、gp120およびs
CD4に対してのみ観察された。
gp120のV3ループ（アミノ酸303−338）はこの蛋白質
の主要中和ドメインであると考えられており、この領域
に由来するペプチドは融合を遮断することによりウイル
ス感染を遮断する型特異的中和抗体を誘導する。（199
2） Human Retroviruses and AIDS 1992、eds.Myers、
G.et al.（Theoretical Biology and Biophysics、Los
Alamos National Laboratory、Los Alamos、NM）。gp12
0のV3ループまたは、ウイルスの結合、複製、およびシ
ンシチウム形成を阻害する、硫酸デキストランのような
陰イオン性多糖類の作用部位でもある。Callahan、L.、
et al.、（1991） J.Virol.65、1543−1550。硫酸デキ
ストランは、マイクロタイタープレート上に固定化させ
たgp120にビオチニル化ISIS 5320が結合する際の競合阻
害剤である。四量体結合の内の約50％は、10と50μg mL
-1との間の濃度の硫酸デキストランで阻害された（図1
7）。硫酸デキストランは、この濃度範囲においてgp120
へのgp120−特異抗体の結合を阻害することが示されて
いる。Callahan、L.、et al.、（1991）J.Virol.65、15
43−1550。
オリゴヌクレオチドISIS 5320はまた、gp120のV3ルー
プ領域に対する抗血清の結合を妨害するが、その蛋白質
の他の領域に特異的な抗血清は妨害しない。Rusche、J.
R.、et al.、（1987） Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84、6
924−6928;Matsushita、S.、et al.、（1988） J.Viro
l. 62、2107−2114、およびMeuller、W.T.、et al.、
（1986） Science 234、1392−1395。対照オリゴヌク
レオチドは抗体結合に何の影響も及ぼさなかった。
四量体はまた細胞上に発現されたgp120のV3ループに
結合する。免疫蛍光フローサイトメトリを使用して決定
したところによると、gp120のV3ループに特異的なモノ
クローナル抗体の結合は約0.5μＭ（Ki）の濃度のISIS
5320により阻害された（図18）。対照オリゴヌクレオチ
ドは50μＭまでの濃度では結合にほとんど影響を及ぼさ
なかった。いずれのオリゴヌクレオチドも、同一細胞上
のヒトCD44もしくはCEM−T4細胞上のCD4［Healey、D.、
et al.、（1990） J.Exp.Med. 172、1233−1242］に対
する抗体の結合を有意に減少させることはなかった。
少なくとも15ヌクレオチドからなるホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドは、HIVの配列非特異的阻害剤で
あることが知られている。Stein、C.A.、et al.、（199
1） J.Acquir.Immune Defic. 4、686−693。ここで用
いられる急性アッセイ系においては、以前に検査した18
−28ヌクレオチドの長さのホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドは、0.2と４μＭとの間のIC50値を示す。Vic
kers、T.、et al.、（1991） Nucleic Acids Res. 1
9、3359−3368。Steinおよび共同研究者は、少なくとも
18ヌクレオチドの長さのホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドはgp120のV3ループに結合し（40）、そしてCD4
レセプターおよび他の細胞表面抗原に結合することを示
している。Stein、C.A.、et al.、（1991） J.Acquir.
Immune Defic.Syndr. 4、686−693。長い混合型配列の
オリゴヌクレオチドの結合および抗ウイルス活性が変化
するのは、そのオリゴヌクレオチドが、膜表面蛋白質に
対する親和性が様々である未知の構造に折り畳まれる結
果生じるものと思われる。それとは対照的にISIS 5320
は、特定された四量体構造をとっている。重量に基づく
と、抗ウイルス活性はより長い直鎖状のオリゴヌクレオ
チドと比較して２から25倍高い。
ELISAアッセイを実施して、ISIS 5320がCD4とgp120と
の間の相互作用を遮断することが可能であるか否かを決
定した（データ未公開）。増加量のISIS 5320を添加す
ると、固定化gp120へのCD4の結合が減少し、約2.5μＭ
の濃度で50％の結合が阻害された。対照オリゴヌクレオ
チド（５′TGTGTGTG３′）はCD4/gp120相互作用に対し
て何の影響も示さなかった。これらの結果を、マイクロ
タイタープレートをCD4（IC50は約20μＭ）でコーティ
ングするgp120−捕獲ELISAアッセイにおいて確認した。
gp120のV3ループに結合する化合物は、CD4とgp120との
間の相互作用を完全に遮断してしまうことなく融合を阻
害することができる。Callahan、L.、et al.、（1991）
J.Virol. 65、1543−1550。ISIS 5320とは違って硫酸
デキストランは、ELISAアッセイにおいて、そのIC50を1
0,000倍上回る濃度においてさえもgp120/CD4相互作用を
阻害しない。Callahan、L.、et al.、（1991） J.Viro
l. 65、1543−1550。
ホスホロチオエートT2G4T2の四量体形態は、gp120 V3
ループへ結合することにより、細胞から細胞へ、そして
ビリオンから細胞へと伝わるHIV感染を遮断する。この
四量体は、高いチオ陰イオン荷電密度を伴う堅く密集し
た構造を提供し、この構造が陽イオン性のV3ループとの
強い相互作用の基になっている可能性がある。V3ループ
は高頻度可変領域であるが、V3ループ内の陽イオン性残
基の機能の必要性のために、密度の高い多価陰イオン性
阻害剤に耐性を示すようになるためのウイルスの能力が
制限される可能性がある。Ｇ−カルテット構造モチーフ
から得られる化合物は抗−HIV化学療法に用いるための
有望な候補物である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/70 1/70 (72)発明者 ベネット，シー・フランク アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，ベイルウッド 2613 (72)発明者 チャン，ミン−イー アメリカ合衆国カリフォルニア州92653, ラグナ・ヒルズ，モス・ヒル・レーン14 (72)発明者 ブラウン−ドライヴァー，ヴィッキー・ エル アメリカ合衆国カリフォルニア州92117, サンディエゴ，ビルトモア・ストリート 5142 (72)発明者 エッカー，デヴィッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, ルーカディア，サキソニー・ロード 1041 (72)発明者 ヴィッカーズ，ティモシー・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92057, オーシャンサイド，ルイセノ・アベニュ ー 253 (72)発明者 ワイアット，ジャクリーン・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，ハイランド・ドライブ 2202 (72)発明者 エンバッシュ，ジャン・ルイス フランス共和国エフ―34000 モンペリ エ，リュー・ドゥ・ラ―ソルブ 1108, エムパース・ドゥ・ルクス (56)参考文献 国際公開91／16902（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／3454（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／18004（ＷＯ，Ａ１) 国際公開91／16901（ＷＯ，Ａ１) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．350，25 Ａ ｐｒｉｌ 1991，Ｐ．718−720 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．267，Ｎｏ．８（Ｍａｒｃ ｈ 15，1992）Ｐ．5712−5721 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｖ．ＳＡ，Ｖｏｌ．89，Ｎｏ．18 （ｓｅｐｔ，15，1992）ｐ．8631−8635

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号１、配列番号２、配列番号３、配
    列番号４、配列番号８、配列番号10、配列番号11、配列
    番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番
    号16、配列番号17、配列番号19、配列番号20、配列番号
    21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号2
    5、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号2
    9、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号3
    3、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号3
    7、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号4
    1、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号4
    5、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号5
    1、配列番号54、配列番号55、配列番号58、配列番号5
    9、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号6
    3、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号6
    7、配列番号68、配列番号69、配列番号71、配列番号7
    2、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号7
    6、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号8
    1、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号8
    5、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号8
    9、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号9
    3、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号9
    7、配列番号98、配列番号99、配列番号102、配列番号10
    4、配列番号105、配列番号107、配列番号123、配列番号
    124、配列番号125、配列番号126、配列番号127、配列番
    号128、配列番号129、配列番号130、配列番号131、配列
    番号132、配列番号133、配列番号137、配列番号139、配
    列番号141、GCGGGGTA、TCGGGGTT、GGGGGGTA、CGGGGGT
    A、CCGGGGCC、GCGGGGTA、GTGGGGTA、およびGCGGGGTAか
    らなる群より選択される核酸配列を含む、８から27核酸
    塩基ユニットの長さのオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】核酸配列TTGGGGTTからなるオリゴヌクレオ
    チド。
  3. 【請求項３】少なくとも１つの核酸塩基ユニットがさら
    に２′−置換を含む、請求項１または２に記載のオリゴ
    ヌクレオチド。
  4. 【請求項４】前記２′−置換が、OH、SH、SCH3、Ｆ、OC
    N、Ｏ（CH3）nNH2またはＯ（CH2）nCH3（式中、ｎは１
    から約10である）；C1からR10の低級アルキル、置換低
    級アルキル、アルカリールまたはアラルキル;Cl;Br;CN;
    CF3；OCF3;O−、Ｓ−、もしくはNH−アルキル;O−、Ｓ
    −、もしくはNH−アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；N
    O2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロア
    ルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミ
    ノ；置換シリル;RNA開裂基；フルオレセイン；レポータ
    ー基；およびインターカレーターからなる群より選択さ
    れる、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】前記２′−置換がC1からC10の低級アルキ
    ルである、請求項４記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】少なくとも１つのホスホロチオエート糖間
    結合を有する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレ
    オチド。
  7. 【請求項７】前記核酸配列が配列番号21を含む、請求項
    ６記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】前記核酸配列がTTGGGGTTを含む、請求項６
    記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】前記核酸配列が、配列番号１、配列番号
    ８、配列番号12、配列番号16、配列番号21、配列番号2
    2、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号3
    3、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号3
    8、配列番号39、配列番号42、配列番号48、配列番号5
    0、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号8
    4、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号8
    8、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号9
    2、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号9
    6、配列番号123、配列番号124、配列番号125、配列番号
    126、配列番号127、配列番号128、配列番号129、配列番
    号130、配列番号131、配列番号132、および配列番号133
    からなる群より選択される、請求項１記載のオリゴヌク
    レオチド。
  10. 【請求項１０】ウイルスの活性を阻害する方法であっ
    て、前記ウイルスを、配列番号１、配列番号２、配列番
    号３、配列番号４、配列番号８、配列番号10、配列番号
    11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号1
    5、配列番号16、配列番号17、配列番号19、配列番号2
    0、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号2
    4、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号2
    8、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号3
    2、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号3
    6、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号4
    0、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号4
    4、配列番号45、配列番号48、配列番号49、配列番号5
    0、配列番号51、配列番号54、配列番号55、配列番号12
    3、配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号
    127、配列番号128、配列番号129、配列番号130、配列番
    号131、配列番号132、配列番号133、配列番号137、配列
    番号139、配列番号141、TTGGGGTT、GCGGGGTA、TCGGGGT
    T、GGGGGGTA、CGGGGGTA、CCGGGGCC、GCGGGGTA、GTGGGGT
    A、およびGCGGGGTAからなる群より選択される核酸配列
    を含む、８から27核酸塩基ユニットの長さのオリゴヌク
    レオチドと接触させることを含む方法。
  11. 【請求項１１】少なくとも１つの核酸塩基ユニットがさ
    らに２′−置換を含む、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記２′−置換がC1からC10の低級アル
    キルである、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１
    つのホスホロチオエート糖間結合を有する、請求項10記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】ホスホリパーゼA2酵素活性を阻害する方
    法であって、細胞を、配列番号12、配列番号21、配列番
    号22、配列番号26、配列番号42、配列番号50、配列番号
    58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号6
    2、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号6
    6、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号7
    1、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号7
    5、配列番号76、配列番号78、配列番号79、配列番号8
    0、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号8
    4、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号8
    8、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号9
    2、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号9
    6、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号10
    2、配列番号104、配列番号105、および配列番号107から
    なる群より選択される核酸配列を含む８から27核酸塩基
    ユニットの長さのオリゴヌクレオチドと接触させること
    を含む方法。
  15. 【請求項１５】少なくとも１つの核酸塩基ユニットがさ
    らに２′−置換を含む、請求項14記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記２′−置換がC1からC10の低級アル
    キルである、請求項15記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１
    つのホスホロチオエート糖間結合を有する、請求項14記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】ヒト免疫不全ウイルスの活性を阻害する
    方法であって、前記ウイルスに感染した細胞に、前記ウ
    イルスの活性を阻害するのに十分な量の、配列（T1-8G4
    T2-8）1-10を含む化合物を投与することを含む方法。
  19. 【請求項１９】配列（T1-8G4T2-8）1-10を含むオリゴヌ
    クレオチドで被覆された避妊用具。
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