HUT70965A - Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence - Google Patents

Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence Download PDF

Info

Publication number
HUT70965A
HUT70965A HU9500911A HU9500911A HUT70965A HU T70965 A HUT70965 A HU T70965A HU 9500911 A HU9500911 A HU 9500911A HU 9500911 A HU9500911 A HU 9500911A HU T70965 A HUT70965 A HU T70965A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
oligonucleotides
sequence
isis
activity
Prior art date
Application number
HU9500911A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9500911D0 (en
Inventor
David J Ecker
Kevin P Anderson
Timothy A Vickers
Ronnie C Hanecak
C Frank Bennett
Ming-Yi Chiang
Vickie L Brown-Driver
Jacqueline R Wyatt
Jean Louis Imbach
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9500911D0 publication Critical patent/HU9500911D0/hu
Publication of HUT70965A publication Critical patent/HUT70965A/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1133—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against herpetoviridae, e.g. HSV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C12N2310/151—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs more than 3 strands, e.g. tetrads, H-DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/18—Type of nucleic acid acting by a non-sequence specific mechanism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)

Description

A találmány tárgya olyan oligonukleotidok tervezése és szintetizálása, melyek felhasználhatók vírusok aktivitásának in vivő vagy in vitro gátlására, illetve vírusfertőzéssel kapcsolatos betegségek kezelésére. Ezek a vegyületek a vírusokkal (mint a
HÍV. HSV. HCMV vagy influenza) kapcsolatos betegségek megelőzéséhez vagy kezeléséhez alkalmazhatók.
találmány további tárgya olyan oligonukleotidok, melyek képesek gátolni a foszfolipáz A2 enzim aktivitását, és amelyek alkalmasak gyulladásos betegségek és ideggyógyászati esetek kezelésére. A találmány egy másik tárgya rák kezeléséhez és az öregedés késleltetéséhez tervezett oligonukleotidok.
Vírusellenes szerek
A vírusok — úgymint a humán immundeficiencia vírus (HÍV), a herpes simplex vírus (HSV). a humán citomegalovírus (HCMV) és az influenza — aktivitásának gátlására számos megközelítés létezik. Ezek közé tartoznak a nukleozid analógokkal (pl- HSV ellen) és az antiszensz oligonukleotidokkal végzett kezelések (pl. HÍV és influenza ellen).
A különböző megközelítések alkalmazásával számos kutató tett kísérletet a HÍV gátlására. Zamecnik és munkatársai például a reverz transzkriptáz primer helyet és a donor/akceptor illeszkedési helyet megcélzó foszfodiészter antiszensz oligonukleotidokat alkalmaztak (P.C. Zamecnik, J.
• · · · ·· · · · · • · · · · · ··· · · · ··· · • * · a ·
Goodchild. Y.
U.S.A., 83.
Taguchi. P.S. Sárin, Proc. Natl. Acad.
4143, 1986). Goodchild és munkatársai a transzlációs kezdőhelyekhez, cap helyhez, a poliadenilációs .jelhez, az 5' ismétlődő régióihoz, a primer kötőhelyhez, az illeszkedési helyekhez és a gag és pol gének közötti helyhez célzott antiszensz foszfodiészter vegyületeket állítottak elő (J.
Goodchild,
S. Agrawal, M.P.
Civeira, P.S. Sárin, D. Sun,
P.C. Zamecnik, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 85. 5507, 1988; 4 806 463 számú Amerikai
Egyesült Államok-beli szabadalom). Agrawal és munkatársai a cap és a donor/akceptor illeszkedési helyeket célzó, kémiailag módosított antiszensz oligonukleotid analógokat alkalmaztak (S. Agrawal, J Goodchild, M.P. Civeira, A.H. Thornton. P.S. Sárin, P.C. Zamecnik, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85. 7079, 1988). Agrawal és munkatársai a frissen fertőzött és a krónikusan fertőzött sejtekben a HÍV fertőzés gátlásához donor/'akceptor illeszkedési helyet célzó antiszensz oligonukleotid analógokat alkalmaztak (S. Agrawal. T. Ikeuchi. D. Sun. P.S. Sárin. A. Konopka. J. Maizei. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 7790, 1989).
Sárin és munkatársai szintén kémiailag módosított, a HÍV cap és donor/akceptor illeszkedési helyeket megcélzó antiszensz oligonukleotid analógokat alkalmaztak (P.S.
Sárin, S Agrawal. M.P. Civeira. 0. Goodchild, T. Ikeuchi, P.C. Zamecnik. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 85. 7448.
1988). Zaia és munkatársai a HÍV gátlása érdekében szintén az akceptor illeszkedési helyre célzott antiszensz oligonukleotid analógot alkalmaztak (J.A. Zaia. J.J. Rossi,
G.J. Murakawa, P.A. Spallone, D.A. Stephens, B.E. Káplán, J.
Virol.. Q2, 3914, 1988). Matsukura és munkatársai a HÍV rév gén mRNS transzlációs kezdőhelyre célzott antiszensz oligonukleotid analógokat szintetizáltak (M. Matsukura. K.
Shinozuka, G. Zon, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., fi4, 7706, 1987; R.L. Letsinger, G.R. Zhang, D.K. Sun, T. Ikeuchi, P.S.
Sárin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., fífi, 6553, 1989). Móri és munkatársai az előbbi régióira célzott különböző antiszensz oligonukleotid analógokat alkalmaztak (K. Móri, C. Boiziau, C. Cazenave, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86.
6553, 1989). Shibahara és munkatársai akceptor illeszkedési helyre, valamint reverz transzkriptáz primer kötőhelyre célzott antiszensz oligonukleotid analógokat alkalmaztak (S.
Shibahara.
S.
Mukai, H. Morisawa. H.
Nakashima. S.
Kobayashi
N.
Yamamoto. Proc. Acids Rés.,
17, 239. 1989).
Letsinger és munkatársai illeszkedési helyre célzott.
koleszterinnel konjugált oligonukleotid analógokat szintetizáltak és teszteltek. M. Stevenson és P.L Iversen ( J. Gén. Virol., 70. 2673. 1989) a donor illeszkedési helyre és a HÍV tat gén első exon.jára célzott antiszensz oligonukleotid analógokhoz polilizint kon.iugáltak. Buck és munkatársai HÍV mRNS-t és DNS-t célzó, foszfát-metilezett DNS oligonukleotidők alkalmazását írták le (H.M. Buck. L.H. Koole, M.H.P. van Gendersen. L. Smith. J.L.M.C. Green. S. Jurriaans és J. Goudsmit. Science. 248. 208-212. 1990).
A HÍV aktivitás gátlására végzett eddigi kísérletek főként • ·· ·· ·· ···· • · · ···· · • · · · · · · · · · · • · · · · · az oligonukleotid analóghoz alkalmazott kémiai modifikálás természetére összpontosultak. Annak ellenére. hogy valamennyi említett publikációban beszámoltak a vírus valamely működésének gátlásában elért sikerről, a HIV-et és más vírusokat megcélzó általános terápiás rendszert azonban nem találtak. Ennek megfelelően, továbbra is szükség van olyan készítmények létrehozására, amelyek megfelelőek a hatékony terápiás alkalmazáshoz.
Herpes (HSV) fertőzések kezelésére Jelenleg a nukleozid analógok az előnyben részesítettek. Számos pirimidin dezoxiribonukleinsav vegyület specifikus aktivitást mutat a vírus által kódolt timidin (dCyd) kináz enzimre. E vegyületek működésének specifitása korlátozza a vegyületek vírusfertőzött sejtekre gyakorolt foszforilációs és vírusellenes (antivirális) aktivitását. E vegyületcsoportból számos gyógyszert, például az 5-jód-dUrd-t (IDU).
5-trifluor-metil-dUrd-t (FMAU).
5-etil-dUrd-t (E ) -5-(2-bróm-vinil)-dUrd-t (BVDU).
5-jód-dCyd-t (IDC), és
5-(trifluor-metil)-dUrd-t (TFT) klinikailag alkalmaznak.
illetve ezek a közeljövőben a klinikai alkalmazás szempontjából hozzáférhetővé válnak. Az IDU a HSV fogíny- és szájgyulladás (gingivostomatitis) es a szem stroma szaruhártyagyulladása (keratitis) ellen alkalmazva mérsékelten hatásos helyi antivirális szer, a HSV agyvelögyulladás kontrollált klinikai vizsgálataiban való alkalmazásakor azonban nagy toxicitást mutatott. Az arabinofuranozil-citozin (Ara-C) antivirális specifitása • · · ·
kezdetben ígéretes volt, klinikai vizsgálata azonban az IDUéval megegyező eredményt mutatott.
Az olyan HSV törzsek klinikai megjelenése.
melyek virus timidin-kinázt szintetizáló képessége elégtelen.
az említett vegyületcsoport hatásosságának további vonatkozását képezi.
Az anti-HSV vegyületek kifejlesztéséhez számos virális cél (target) típust meghatároztak. A tio-szemikarbazon vegyületekkel végzett vizsgálatokkal kimutatták, hogy a vírus ribonukleotid-reduktáz enzim gátlása a HSV replikációjának in vitro megakadályozásának hatásos módja. A humán HSV fertőzések kezeléséhez számos olyan purin nukleozidot Jóváhagytak, melyek akadályozzák a virális
DNS-replikációt. A 9-(β-D-arabinofuranozil)-adenint (Ara-A) a HSV-1 szaruhártyagyulladás. a HSV-1 agyvelőgyulladás és az újszülöttkori herpes fertőzések kezeléséhez alkalmazták. A klinikai hatásosságról szóló beszámolók ellentmondóak.
Gyakorlati alkalmazást illetően az Ara-A fő hátránya a vízben való nagyon csekély oldhatósága.
Az érdeklődés középpontjában
9-(2-hidroxi-etoxi-metil)-guanin (Acyclovir: ACV) áll. Emberek esetében az ACV-t sikeresen alkalmazták a lokalizált és disszeminált (szétszórt) HSV fertőzések kezelésében. A HSV-1 ACV-vel végzett kezelésének double-blind vizsgálataiból azonban úgy tűnik. drogrezisztens vírus mutánsok és negatív eredmények egyaránt léteznek Az ACV. hasonlóan az Ara-A-hoz. alig oldódik vízben (0,2 %). s ez a fizikai Jellemző korlátozza alkalmazási módjait. A hosszú ideig tartó klinikai kezelések esetén a ·· · · • · · · ··· ··· · • · · · · · • * * ·« ·· · ♦ * purin nukleozid analógok gyakorlati alkalmazhatóságát csökkenti a természetükből eredő hatékony lebontásuk, amely nemcsak csökkenti a gyóyszer biológiai hatását, hanem toxikus anyagcseretermékek kialakulását is eredményezheti.
A jelenleg használt vagy klinikai tesztelés alatt álló, hatásos anti-HSV vegyületek nukleozid analógok. E vegyületek hatékonyságát csökkenti a vizes oldatokban mutatott csekély mértékű oldékonyságuk, gyors intracelluláris lebomlásuk és erős celluláris toxicitásuk. A nukleozid analógok hosszú ideig történő alkalmazása elleni további kifogást jelent az olyan HSV klinikai izolátumok utóbbi időben történt detektálása, melyek rezisztensek a klinikai kísérletek során adott nukleozid vegyületek gátló hatására. A vírusellenes oligonukleotidok a nukleozid analógokkal általánosan tapasztaltaknál jobb oldódási képességet. kisebb mértékű celluláris toxicitást. és a célgénben a nukleotid pontmutációkkal szemben mutatott kisebb érzékenységet ígérnek.
Annak ellenére. hogy számos vírusellenes szerrel végeztek kísérleteket. a citomegolvirus (CMV) fertőzés hatásos kezelését még nem fejlesztették ki. A CMV fertőzés legyőzésében az interferon. a transzfer faktor. az adenin-arabinozid (Ara-A), az aciklo-guanozin (Acyclovir; ACV). illetve ezen drogok bizonyos kombinációi egyaránt hatástalanok voltak. Klinikai vizsgálatokat megelőző, és klinikai adatok alapján a foscarnet (PFA) és a ganciclovir
• · · • *· ·· · · (DHPG) vírusellenes szerként korlátozott hatást mutatott. A PFA-val végzett kezelés öt AIDS-es beteg esetében a recehártyagyulladás (retinitis) oldódását eredményezte. A DHPG-vel végzett vizsgálatok a CMV recehártyagyulladással és vastagbélgyulladással (colitis) szemben mutattak hatékonyságot. Ögy tűnik, a DHPG-t a kezelt személyek Jól tolerálják, de a reverzibilis neutropenia (neutrofll leukociták csökkent száma) megjelenése, a rezisztens CMV törzsek hosszú ideig tartó kezelés hatására történő kifejlődése, és a CMV helyi tüdőgyulladás (pneumonitis) elleni hatékonyság hiánya korlátozza e vegyület hosszan tartó alkalmazhatóságát. Mind az akut. mind a krónikus alkalmazást illetően hatásosabb és kevésbé toxikus vegyületek kifejlesztésére van szükség.
A klasszikus gyógykezelések a betegséget okozó vagy betegség kialakulását elősegítő hatásuk mérséklése érdekében általában proteinekkel való kölcsönhatásra összpontosulnak. A citomegalovirus fertőzések esetében az ilyen gyógyászati megközelítések kudarcot vallottak, így továbbra is szükség van a citomegalovirus aktivitását gátló. hatásos készítményekre.
Több olyan gyógyszer áll rendelkezésre, amely megelözésszerü (profilaktikus) alkalmazás esetén bizonyos mértékű aktivitást mutat az influenza vírus ellen. azonban az influenza B vírus ellen egyik sem hatásos. Sőt, gyógyászati alkalmazhatóságuk általában nagyon korlátozott, s a tünetek
·· ··· · megjelenése után a. betegség kezelésére egyiket sem alkalmazzák széles körben. Ennek megfelelően, világszerte szükség van az influenza vírusos fertőzések kezelésére alkalmazható, javított hatású gyógyszerekre.
Az influenza vírus antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával végzett gátlására több kísérletet írtak le.
Leiter és munkatársai az influenza A és C vírusokat foszforsav-diészter és foszforsav-triészter oligonukleotidokkal célozták meg (J. Leiter. S. Agrawal, P. Palese és P.C. Zamecnik, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87. 3430-3434, 1990). E kutatók a vRNS 3' régióban, illetve az mRNS 5' régióban a polimeráz PB1 gént, illetve az mRNS-t célozták meg. Az influenza A szekvencia-specifikus gátlását nem tapasztalták, az influenza C bizonyos mértékű specifikus gátlását azonban igen.
Zerial és munkatársai az influenza A vírus interkaláló ágenshez megfelelően kötött oligonukleotidokkal történt gátlásáról számoltak be (A. Zerial, N.T. Thuong és C Helene, Nucleic Acids Rés.. 57. 9909-9919. 1987). Zerial és mtsi. nyolc vRNS szegmens 3' terminális szekvenciáját célozták meg. Leírták, hogy oligonukleotid analógjuk sejttenvészetben gátolja a vírus citopatológiás hatásait.
Kabanov és mtsi. az RNS polimeráz 3-at kódoló RNS hurokképző helyével komplementer oligonukleotidőt szintetizáltak (A.V. Kabanov, S.V. Vinogradov. A.V. Ovcharenko. A.V.
• ·· · · ·· ···· ··< · * · · · • ··· ··« ··· · • · · · ♦ · ··· ·· ·· ·· ·
Krivonos, N.S. Melik-Nubarov. V.I. Kiselev. E.S. Severin. FEB, 259. 327-330, 1990). Az általuk szintetizált oligonukleotidot az 5' terminális foszfátcsoport undecilgyökéhez kapcsolták. Azt találták, hogy ez az oligonukleotid MDCK sejtekben gátolta az influenza A vírusos fertőzést.
Bár az influenza vírus valamely funkciójának gátlásában az eddig felsorolt kutatók mindegyike beszámolt valamilyen fokú sikerről, az influenza vírusok elleni általános gyógykezelési rendszert nem sikerült kialakítani, sőt, az influenza vírus elleni gyógykezelések fokozott hatékonyságára van szükség van olyan szükség. Ennek megfelelően, továbbra is oligonukleotidok tervezésére, amelyek alkalmasak hatásos gyógyászati kezelések elvégzésére.
Foszfolipáz A2 enzimaktivitás
A foszfolipáz Az enzimcsalád membrán foszfolipideket hidrolizáló. zsírbontó enzimeket foglal magában. A foszfolipáz A2 a foszfolipidek sn-2 kötésének hidrolízisét katalizálja. miáltal szabad zsírsavak és lizofoszfolipidek termelődését eredményezi. Humán sejtekből a foszfolipáz A2 több különböző típusát klónozták és szekvenált.ák. azonban biokémiailag bizonyított. hogy a foszfolipáz A2 további formái léteznek. Az emlősök által szekretált foszfolipáz A2 nagy szekvencia hasonlóságot mutat a mérgeskigyók mérgéből izolált foszfolipáz A2-vel. A foszfolipáz A2 szekretált formáit a ciszteingyökök proteinben való elhelyezkedése • ·· ·· ·· «··· ··· ···· · • ··· · ·-* ··« · • · · · · · ··· ·· ·· ·· ·
- 11 alapján két csoportra osztják. Az I. típusú foszfolipáz Az családba az Elapidae (kobrák) és Hydrophidae (tengeri kígyók) családba tartozó kígyók mérgéből izolált enzim és az emlős hasnyálmirigy enzim tartozik. A II. típusú foszfolipáz Az családba a Crotalidae (csörgőkígyók és gödörkésarcú viperák) és a Viperidae (óvilági viperák) családba tartozó kígyók mérgéből izolált enzimek, és a vérlemezkék és más emlős sejtek által szekretált enzim tartozik.
A II. típusú emlős foszfolipáz Az-vel sokan foglalkoztak, mivel számos gyulladásos betegség esetében (köztük a reumatoid arthritis, a gyulladásos bélbetegségek, a szeptikus sokk, valamint az ideggyógyászati esetek, mint a skizofrénia) ezen enzim emelkedett koncentrációját mutatták ki (W. Pruzanski, E.C. Keystone, B. Sternby, C. Bombardier, K.M. Snow. P. Vadas. J. Rheiunatol. . IS. 1351. 1988;
Pruzanski és Vadas, J. Rheumat.ol. . 15. 11. 1988; G. Oliason.
R. Sjodahl és C. Tagesson. C. Disestion. 41. 136. 1988. Vadas és mtsi.. Őrit·. Care Med.. 16. 1. 1988; W.F. Gattaz, C.v.K. Hubner. T.J. Nevalainen. T. Thuren és P.K. Kinnunen, Bioi. Psychiatry. 26- 495. 1990). Az utóbbi időben bebizonyították, hogy a II. típusú foszfolipáz Az szekrécióját különböző. gyulladás előtti citokinek indukálják. mint az interleukin-1. interleukin-6. tumor nekrózis faktor. gamma-interferon és a bakteriális lipopoliszacharid (K. Hulkower. W.C. Honé. T. Chen. C.M. Anderson. J.W. Coffey és D.W. Morgan. Biochem. Biophys. Rés.
Comnt.. 184. 712, 1992. R.M. Crowl. T.J. Stoller. R.R. Conroy • ·· · és C.R. Stoner. J. Bioi. Chem.. 2££l. 2647, 1991; C.
Schalkwijk, J. Pfeilschafter, F. Marki és J. van den Bosch, Biochem. Biophys. Rés. Comm.. 174. 268, 1991; S.C. Gilman és
J. Chang, J. Rheumatol.. 17, 1392, 1990; S. Oka és H. Arita,
J. Bioi. Chem.. 266. 9956, 1991). Kimutatták, hogy a gyulladást gátló ágensek, mint a .transzformáló növekedési faktor-β és a glükokortikoidok gátolják a II. típusú foszfolipáz Az szekrécióját (S. Oka és H. Arita, Biochem. J.
Bioi. Chem., 266. 9956, 1991; C. Schalkwijk, J. Pfeilschafter, F. Marki és J. van den Bosch, J. Bioi. Chem..
267. 8846, 1992). Bebizonyították, hogy a II. típusú foszfolipáz Á2-t különböző sejttípusok szekretálják, mint a vérlemezkék, porcsejtek, synoviociták, vaszkuláris símaizomsejtek, vese mesangiális sejtek és keratinociták (R.M.
Kramer, C. Hession. B. Johansen. G.
Hayes. P. McGray,
E.P.
Chow, R. Tizard és R.B. Pepinsky. J.
Bioi. Chem., 264
5768
1989;
S.C. Gilman és J. Chang. J. Rheumatol. . 17.
1392.
1990:
S.C. Gilman.
E. Mochan,
Arthritis és
Rheumatol.. 31. 126. 1988: T.
Nakano. 0.
171, 1990:
Ohara, H. Teraoka és H. Arita. FEBS Lett.. 261
C. Schalkwijk. J. Pfeilschifter. F. Marki és H.
van den Bosch, Biochem. Biophys. Rés. Comm.. 174. 268.
1991 ) .
A II. típusú foszfolipáz A2 krónikus gyulladásos betegségek során tapasztalt kórélettani folyamatok elősegítésében betöltött szerepét feltételezték. mivel nyulakba intradermálisan vagy izületi területbe injektálva komoly • ·· ·· ·« ···« ··« · · · · * * ··· ··· ··· · • · · · · · «·· ·· ·· «· « gyulladásos reakciókat váltott ki (W. Pruzanski. P. Vadas. V. Fornasier, J. Invest. Dermatol.. Ö6, 380-383, 1986; J.S. Bomalaski. P. Lawton és J.L. Browning, J. Immunoi., 14S, 3904, 1991; P. Vadas. W. Pruzanski, J. Kim és V. Fornasier, Am. J. Pathol.. 134. 807, 1989). Azt tapasztalták, hogy a protein injektálás előtti denaturálása gátolja az előgyulladásos aktivitást.
A felsorolt kutatási eredmények miatt szükség van a II. típusú foszfolipáz A2 hatásos és szelektív inhibitorainak azonosítására. A II. típusú foszfolipáz Az nem toxikus és szelektív inhibitorainak azonosítására tett kísérletek mindeddig kevés sikerrel jártak, ezért sürgősen szükség van a foszfolipáz A2 aktivitás hatásos inhibitorainak azonosítására.
A telomerhosszűság módosítása
Felismerték, hogy a telomerek, a kromoszómák csúcsán elhelyezkedő, ismétlődő nukleotidőkből álló hosszú láncok szerepet játszanak a kromoszóma védésében és szerveződésében. Humán sejtekben a TTAGG szekvencia a sejt típusától és korától függően mindegyik kromoszóma mindkét végén több százszor, több ezerszer ismétlődik (Hartley. C.B. és mtsi. Natúré. 345. 458-460. 1990: N.D. Hastie és mtsi. Natúré. 346. 866-868. 1990). Ügy tűnik, a telomerek a sejtek öregedésében is szerepet játszanak. ami a sejtek öregedésének és a rákos sejtekben megnyilvánuló
- 14 elpusztithatatlanságuk vizsgálatában nagy jelentőséggel bír.
A kutatók meghatározták, hogy a telomer hosszúsága minden egyes sejtosztódással csökken, s felvetették annak lehetőségét, hogy a telomerhosszúság szabályozza a sejt természetes élettartama alatt lezajló osztódások számát (C.B. Harley és mtsi., Natúré, 345, 458-460, 1990; N.D.
Hastie és mtsi, Natúré, 346. 866-868, 1990). A normális humán sejtek például 70-100 alkalommal osztódnak, s úgy tűnik, minden egyes osztódás alkalmával telomerükből kb. 50 nukleotidot veszítenek. Néhány kutató felvetette, hogy szoros kapcsolat lehet a telomerhosszúság és az ember életkora között (C.W. Greider, Curr. Opinion Cell Bioi., 3, 444-451, 1991). Más vizsgálatokkal kimutatták, hogy a rák kifejlődése és előrehaladása során a telomerek drámai mértékű átalakuláson mennek át (N.D. Hastie és mtsi. Natúré.
346. 866-868, 1990). Leírták például, hogy amikor a sejt rosszindulatúvá válik, a telomerek minden egyes sej tosztódáskor rövidebbek lesznek (N.D. Hastie és mtsi.
Natúré, 346.
866-868.
1990). Greider, Bachetti és munkatársaik kiséleteikke1 kimutatták. hogy a daganat kifejlődésének nagyon előrehaladott és agresszív stádiumában a telomerek hosszúságának csökkenése megszűnhet. sőt.
növekedéssé alakulhat át (C.M. Counter és mtsi, EMB0 J.. 11.
1921-1929. 1992). Emiatt felvetették annak lehetőségét, hogy a telomert blokkoló anyagok hasznosak lehetnek a rák kezelésében. Az ín vitro vizsgálatok szintén azt mutatták, hogy humán kromoszóma fragmenseket tartalmazó linearizált • ·« 4 · *»·«·» • · · * · 4 ·« • ··· ··· ··· · • · · · ♦ * «·· »4 44 «4·
- 15 vektorok hibrid ember-hörcsög sejtvonalakba történő elektroporáclójával változtatható a telomerhosszúság. A kromoszóma fragmensek a szomszédos GC-ban gazdag ismétlődő (repetitív) szekvenciákkal együtt hozzávetőleg 500 bázispár hosszú humán TTAGGG ismétlődő telomer szekvenciából és rokon variánsokból (mint a TTGGGG) állnak (C. Farr és mtsi., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88. 7006-7010, 1992). Bár ez a vizsgálat azt sugallja, hogy a telomerhosszúság befolyásolja a sejtosztódást, az öregedési folyamat vagy a rák kontrollálására nem találtak hatásos eljárást. Ilyenformán, szükség van a telomerhosszúság hatásos modulátorainak azonosítására.
A guanozin nukleotidok — mononukleotidok, oligonukleotidok vagy polinukleotidok alakjában egyaránt — guanozin kvartettek vagy G-kvartettek néven ismert elrendeződéseket képesek létrehozni (ld. J.R. Williamson. Curr. Opin. Struct.
Bioi.. 3· 357-362. 1993). Bár a G-kvartettek évek óta ismertek, az érdeklődés (a telomerek szerkezetében és funkciójában játszott esetleges szerepüknek köszönhetően) csak az utóbbi néhány évben kezdett növekedni irántuk. E terület egyik analitikai megközelítését a guanozin clustereket tartalmazó rövid oligonukleotidok (pl. a Williamson által leírt GGGGTTTTGGGG, GGGTTTTGGG, UGGGGU, GGGGGTTTTT, TTAGGG. TTGGGG és mások, vagy a Shida és mtsi. által leírt TTGGGGTT ET. Shida. K. Yokoyama, S. Tamai és J. Sekiguchi. Chem. Phaivn. Bull., 39. 2207-2211. 1991]) szerkezetének vizsgálata képezi.
··· • · • e «· «· • · · * ♦ ·· ···
« «· ««
Felfedeztük. hogy a G-kvartetteket képező, és a guanozin cluster-eket tartalmazó oligonukleotidok természetes szerepükön kívül (pl. a telomerekben; bár létezhetnek egyebek is) hasznosak a virális génexpresszió és vírusfejlődés, illetve a PLAz enzimaktivitás gátlásában, s alkalmazhatók lehetnek a telomerhosszúság modulátoraiként is. Az említett alkalmazások érdekében kívánatos az oligonukleotidok kémiai módosítása, s bizonyos esetekben, a maximális aktivitás elérése érdekében szükséges is.
A transzkripció gátlása érdekében — purinban gazdag promoter elemeket tartalmazó hármas szál kialakításához — csak guanint és timint tartalmazó oligonukleotidokat terveztek. Ezeket a triplex-képző oligonukleotidokat (TFO). melyek 28-54 nukleotid hosszúságúak, a c-erb B2/neu onkogén expressziójának gátlásához alkalmazták (WO 93/09788. Hogan).
A HÍV transzkripciójának gátlásához 31-38 nukleotid hosszúságú. aminnal modifikált TFO-kat is alkalmaztak (W.M. McShan és mtsi. J. Bioi. Chem., 267, 5712-5721. 1992).
A találmány tárgya vírus aktivitásának gátlására képes oligonukleotidok.
A találmány egy másik tárgya profilaktikus. diagnosztizáló és terápiás eljárások vírusokkal (mint a HÍV. HSV, HCMV és influenza) kapcsolatos betegségek kezelésére.
A találmány további tárgya a foszfolipáz A2 gátlására képes oligonukleotidők.
A találmány további tárgya prof Hektikus, diagnosztizáló és terápiás eljárások gyulladásos betegségek, valamint fokozott foszfolipáz szinttel kapcsolatos ideggyógyászati esetek kezelésére.
·«· «··« t 9 · *· »····· · « ·«
A találmány további tárgya a kromoszómák telomerhosszúságát befolyásoló oligonukleotidők.
A találmány további tárgya a HÍV gátlására képes oligonukleotid komplexek.
A találmány felsorolt és egyéb tárgyai a következő leirás és szabadalmi igénypontok alapján a szakemberek számára könnyen érthetők lesznek.
Felfedeztük, hogy a GGGG (G4) szekvenciát (melyet konzervált nevezünk) tartalmazó oligonukleotidők számos vírus ellen (többek között a HÍV. HSV. HCMV és influenza vírus ellen) antivirális aktivitással rendelkeznek.
Azt találtuk.
hogy a négy guanint vagy két.
három guaninból álló szakaszt vírusellenes aktivitással rendelkezik. Felfedeztük továbbá.
hogy a konzervált G4 core szekvenciát vagy két. három guaninból álló szakaszt tartalmazó oligonukleotidok a foszfolipáz A2 aktivitás hatásos inhibitorai. Ogy tartjuk, hogy az ilyen oligonukleotidok alkalmasak lehetnek a «V ··· • « • 9 ·- b· bb»« b · b» bbb«·· • ·9 ·· ··* kromoszómák telomerhosszúságának módosítására.
Az aktív szekvencia általános képlete (NxG4Ny)<a vagy (G3-4NXG3-4)o. melyekben X és Y = 1 és 8 közötti egész szám, és Q = 1 és 4 közötti egész szám . A találmány néhány megvalósítási módja esetében az (NxG3-4)qNx képlettel leírható szekvenciát (melyben X = 1 és 8 közötti egész szám, és Q - 1 és 6 közötti egész szám) szintén alkalmasnak találtuk.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán grafikusan mutatjuk be a G4 oligonukleotidok vírusszaporodás vizsgálattal mért HSV ellenes aktivitását. A sejteket 3 jíA vagy 10 /41 dózisú oligonukleotiddal kezeltük. A vírustiter értékeket a kezeletlen, vírusfertőzött sejtek vírustiterének százalékos arányaként tüntetjük fel. Valamennyi tesztelt oligonukleotid lánc foszfor-tioátos (P=S) gerincet tartalmaz. kivéve a P=0-val jelölteket.
A 2. ábrán grafikusan mutatjuk be az 5651 (35 . számú
szekvencia). 5652 (37. számú sz ekvenc ia). 5653 (38 . számú
szekvencia)- 567 6 (39. számú szekvencia) és 4015 (21 . számú
szekvencia) G< oligonukleotid dózisfüggő HSV ellenes
aktivitását. A 3383 oligonukleot időt. (122. számú szekvencia) negatív kontrollként alkalmaztuk. Az ACV az Acvclovir (pozitív kontroll) rövidítése.
3. ábrán grafikusan mutatjuk be a G4 oligonukleotidok vírusszaporodás vizsgálattal mért influenzaellenes aktivitását. Az oligonukleotidokat 10 mM egyszeri dózissal teszteltük.
vírustiter értékeket a kezeletlen.
vírusfertőzött sejtek vírustiterének százalékos arányaként fejezzük ki.
A 4. ábrán grafikusan mutatjuk be a különböző,
2'-szubsztituált oligonukleotidok foszfolipáz
A2-t gátló aktivitását.
Az 5. ábrán grafikusan mutatjuk be az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) különböző forrásokból izolált foszfolipáz Αε enzim aktivitására gyakorolt hatását.
A 6. ábrán grafikusan mutatjuk be annak a kísérletnek az eredményeit. melyben humán foszfolipáz Αε-t az ISIS 3196 (47. számú szekvencia) és ISIS 3481 (77. számú szekvencia) oligonukleotid jelenlétében növekvő mennyiségű E. coli szubsztráttal inkubáltunk.
A 7. ábrán grafikonon mutatjuk be az oligonukleotid hozzáadási idejének HSV-1 gátlásra gyakorolt hatását.
A 8. ábrán grafikonon mutatjuk az ISIS 4015 oligonukleotid és a 2'-0-propil foszfcr-tioát oligonukleotidok HSV-1 elleni aktivitását.
A 9. ábrán grafikonon mutatjuk be az ISIS 3657 és a 2'-0propil foszfor-tioát oligonukleotidok HSV-1 elleni aktivitását.
A 10. ábrán háromdimenziós oszlopgrafikonon mutatjuk be az
ISIS 4015 és a TFT HSV-l-re külön-külön, illetve együttesen gyakorolt hatását.
A 11. ábrán háromdimenziós oszlopgrafikonon mutatjuk be az ISIS 4015 és az ACV HSV-l-re külön-külön, illetve együttesen gyakorolt hatását.
A 12. ábrán grafikonon mutatjuk be az 5684, 5058, 5060, 6170 és 4015 G-szálú oligonukleotidok vírusellenes aktivitását.
A 13. ábrán vonalgörbén mutatjuk be az ISIS 5320 tetramer disszociációját, melyet 1-131 napos időtartamon keresztül méretkizárásos krcmatográfiával ellenőriztünk.
A 14. ábrán gélelektroforézises kísérlet autoradiogram.ia látható. mellyel párhuzamos szálú tetramer mintázatát mutatjuk be. 1. oszlop: csak ISIS 5320 (T2G4T2): 2. oszlop: TisG4G4-gyel inkubált ISIS 5320: 3. oszlop: csak T13G4G4.
A 15. ábrán vonalas grafikonon mutatjuk be az ISIS 5320 foszfor-tioát által Na*-oldatban (négyzetek), az ISIS 5320 által K'-oldatban (rombuszok), és a foszfodiészter változat (körök) által képzett tetramerek disszociációját.
• · ·· ·· ···· • · · · · · • · · ··· · · · · • · · · ·
A 16. ábrán grafikonon mutatjuk be az ISIS 5320 gpl20-hoz való kötődését, amit 405 nm-nél tapasztalt abszorbanciával mértünk.
A 17. ábrán grafikonon mutatjuk be, hogy a dextrán-szulfát a biotinilált ISIS 5320 oligonukleotid gpl20-hoz való kötődésének kompetitív inhibitora.
A 18. ábrán grafikonon mutatjuk be, hogy az ISIS 5320 blokkolja a gpl20 V3 hurokjára specifikus antitest (folytonos vonal) kötődését, míg a CD44-re (folyamatos szaggatott vonal) vagy CD4-re specifikus (nem folyamatos szaggatott vonal) antitestekét nem (immunfluoreszcens áramlásos citometria alapján).
Felfedeztük, hogy a GGGG (G4) szekvenciát (melyben a G guanin tartalmú nukleotidot vagy -analógot jelent, s melyet konzervált. G4 szekvenciának nevezünk) tartalmazó oligonukleotidok hatásos vírusellenes aktivitással rendelkeznek, s hatékony inhibitorai lehetnek a foszfolipáz
Az aktivitásának.
illetve modulátorai a kromoszómák telomerhosszúságának.
találmány leírásában az oligonukleotid kifejezés ribonukleinsav vagy dezoxiribonukleinsav oligomerre vagy polimerre vonatkozik. A kifejezés magában foglalja a természetesen előforduló bázisokból.
cukrokból és cukrok közötti kapcsolódásokból (gerincváz) álló oligomereket, illetve a hasonló működésű.
de nem természetesen előforduló részekből álló oligomereket ·· ·· ···· • · · · • · · · · · · • · · ·· · · · is. A kémiailag módosított vagy szubsztituált oligonukleotidők olyan tulajdonságok miatt, mint a fokozott celluláris felvétel és a nukleázok jelenlétében mutatott nagyobb stabilitás, gyakran előnyösebbek, mint a természetes formák.
A találmányban leírt néhány előnyben részesített oligonukleotidok jellemző példái módosított cukrok közötti kapcsolódásokat (gerincváz) tartalmaznak, például foszfortioátokat, foszforsav-triésztereket. metil-foszfonátokat, alkil- láncokat, cikloalkil cukrok közötti kapcsolódásokat, rövid láncú heteroatomos vagy heterociklikus cukrok közötti kapcsolódásokat. A legelőnyösebbek azok, amelyek -CH2-NH-OCH2-, -CH2-N(CH3)-0-CH2-, -CH2-O-N(CH3)-CH2-. -CH2-N(CH3)N(CH3)-CH2- és O-N(CH3)-CH2-CH2- gerincváz láncokat tartalmaznak (melyekben a foszforsav-diészter csoport 0-P-0CH2).
Szintén előnyben részesítettek azok az oligonukleotidok.
amelyek morfolin gerincváz struktúrákat tartalmaznak (J.E.
Summerton és D.D. Weller
034 506 számú
Amerikai Egyesült
Államok-beli szabadalom).
Egyéb, előnyben részesített megvalósítási módokban (mint pl. a proteinnukleinsav [PNA] gerincváz) az oligonukleotid foszforsavdiészter gerince poliamid gerinccel helyettesíthető, melyben a bázisok közvetlenül vagy közvetve a poliamid gerinc aza nitrogénatomjához kapcsolódnak (P.E. Nielson. M. Egholm. R.H. Berg. 0. Buchardt. Science. 254. 1497. 1991). Más. előnyben részesített oligonukleotidok módosított cukorrészeket tartalmazhatnak. melyek 2' helyzetben az ··· ···
- 23 alábbi szubsztituensek valamelyikét tartalmazzák: OH,
SH,
SCHs,
F,
OCN,
O(CH2)nNH2 (melyben η = 1 és kb. 10 közötti egész szám),
1-10 szénatomos alkilcsoport, kis szénatomszámú, szubsztituált alkilalkil-aril- vagy aralkilcsoport;
Cl: Br: CN: CF3: OCFs: 0-,
S— vagy Nalkilcsoport; 0-, S- vagy N-alkenllcsoport; SOCH3; SO2CH3;
ONOz; NO2; N3; NH2; hetero-cikloalkilcsoport; hetero-ciklo alkll-arilcsoport; amino-alkil-aminocsoport; pollalkilaminocsoport; szubsztituált szililcsoport; RNS-t hasító csoport; fluoreszceincsoport; riportercsoport; interkalátor; az oligonukleotid farmakokinetikus tulajdonságait javító csoport; vagy az oligonukleotid farmakodinamikus tulajdonságait javító csoport. A fluoreszceingyököt az oligonukleotid 5' végéhez kapcsolhatjuk. Az oligonukleotidok a pentofuranozilcsoport helyett cukrot utánzó csoportot is tartalmazhatnak, például ciklobutilcsoportot. A standard béta-nukleotidők helyett alfa-nukleotidők szintén alkalmazhatók. Módosított bázisok, mint a 7-deaza-7-metilguanozin is alkalmazhatók. Az A. C, G, T vagy U univerzális bázissal, mint amilyen az inozin, szintén helyettesíthető.
A kiméra oligonukleotidok szintén alkalmazhatók: ezek a molekulák két vagy több kémiailag eltérő régiót tartalmaznak, melyek mindegyike legalább egy nukleotidot tartalmaz. Ezek az oligonukleotidok rendszerint egy módosított nukleotidőkből álló régiót (amely egy vagy több előnyös tulajdonságot biztosít, például nukleázokkal szembeni fokozott rezisztenciát vagy a sejtek által történő • ·· · fokozott felvételt), és egy módosítatlan régiót (amely fenntartja az RNáz-os H hasítást irányító képességet) tartalmaznak.
A találmány szerinti oligonukleotidok lehetőleg körülbelül 6-27, előnyösen körülbelül 6-24 nukleotidot (nukleinsav bázis egység) tartalmaznak. A nukleotid (nukleinsav bázis egység) kifejezés a szomszédos nukleotidhoz foszforsavdiészter vagy más kötéssel megfelelően kapcsolódó báziscukor egységet jelent.
A találmány szerinti oligonukleotidok a jól ismert szilárd fázisú szintézissel könnyen és rutinszerűen állíthatók elő.
Ilyen szintézishez való berendezéseket számos forgalmazó árusít, mint pl. az Applied Biosystems. Bármilyen más szintetizálási módszer alkalmazható, az oligonukleotidok adott szintézise azonban a szakember felkészültségének megfelelő eljárással történik. Egyéb oligonukleotidok. mint a foszfor-tioátok és az alkilezett származékok előállításának hasonló technikái szintén jól ismertek.
Az egymás után négy guanozinnál többet tartalmazó vegyületek aktivak. azonban úgy találtuk. hogy a jelentős inhibitor aktivitás bitosításához egymás után négy guaninozin, vagy két vagy több. egymás után három guanozinból álló szakasz szükséges. A találmány leírásában jelentős inhibitor aktivitáson az aktivitás legalább 50 %-os gátlását értjük (melyet alkalmas, standard vizsgálattal mérünk). Annak • ·· • ♦ · · · · ··· ·· ·· *· ·
- 25 ellenére. hogy az inhibitor aktivitáshoz konzervált G4 core szekvencia vagy G4 farmakofór szükséges, úgy találtuk, hogy a G4 core-szekvenciát szegélyező szekvenciák fontos szerepet játszanak a gátlási aktivitásban, mivel azt tapasztaltuk, hogy az aktivitás a core-szekvenciát szegélyező szekvenciák szubsztitúciójával vagy deléciójával modulálható. A modulálás kifejezés fokozást vagy csökkentést jelent.
A találmány fő tárgya konzervált G4 core szekvencia és a jelentős inhibitor aktivitáshoz szükséges számú további szegélyező bázisok. Felfedeztük azt is. hogy az analógok a vázgerincben különböznek; például dezoxi, foszfor-tioát és 2'-0-metil analógokat értékeltünk
Az aktív szekvencia képlete (NxG4Nv)q vagy (G4NxG4)<a, melyekben G jelentése guanint tartalmazó nukleotid vagy -analóg. N jelentése bármilyen nukleotid. X = 1-8. Y - 1-8. és Q = 1-4. A találmány néhány megvalósítási módjában az (Nx(33-4)aGx szekvenciát (melyben X - 1-8, és Q - 1-6) találtuk aktívnak.
Vírusellenes szerek
A HSV replikáció gátlásában G4 vagy két Gs szekvenciát tartalmazó oligonukleotidokat teszteltünk. A vírusellenes aktivitást ELISA vizsgálattal határoztuk meg. Az eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be. Az aktivitást • ·· · ♦ ·· ···· ··· · · · · · • ··· ··· ··· · • · · · · · ··· ·· ·· ·· ·
ECso értékként fejezzük ki. amely a HSV replikációjának (a fertőzött kontroll sejtekhez viszonyított) 50 %-os gátlását bitosító oligonukleotid koncentrációt jelenti. Az oligonukleotidokat általában 3 vagy alacsonyabb dózisokban teszteltük.
1. TÁBLÁZAT
Oligonukleotidok HSV replikációt gátló hatása
ISIS Szekvencia
Hossz össze- ECso Szekv.
szám tétel száma
1220 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GGC 2 lmer P=S 0,24; 0,16 1.
4881 GAA AGG CAT GAC CGG GGC 18mer P=S 0,7; 0,65 2.
4874 AGG CAT GAC CGG GGC 15mer P=S 1,1; 0,83 3.
4873 CAT GAC CGG GGC 12mer P=S 1,4; 1,0 4.
5305 CAC GAA AGG CAT GAC CGG G 19mer P=S >3,0 5.
5301 CAC GAA AGG CAT GAC CGG 18mer P=S >3,0 6.
5302 CAC GAA AGG CAT GAC 15mer P=S >3,0 7.
4274 CAT GGC GGG ACT ACG GGG GCC 21mer P=S 0,15; 0,15 8.
4882 CAT GGC GGG ACT ACG 15mer P=S 1.7: 1.4 9.
4851 T GGC GGG ACT ACG GGG GC 18mer P=S 0,55: 0,5 10.
4872 GGC GGG ACT ACG GGG 15mer P=S 1.9: 1.7 11.
4338 ACC GCC AGG GGA ATC CGT CAT 21mer P=S 0.2: 0.2 12.
4883 GCC AGG GGA ATC CGT CAT 18mer P=S 1,8: 1,8 13.
4889 AGG GGA ATC CGT CAT 15mer P=S 2,0; 2.0 14.
4890 GCC AGG GGA ATC CGT 15mer F=S 0.75: 0.7 15.
3657 CAT CGC CGA TGC GGG GCG ATC 21mer PrS 0.2 16.
4891 CAT CGC CGA TGC GGG GCG 18mer P = S 0.3 17.
4894 CAT CGC CGA TCG GGG 15mer P=S >3.0 18.
4895 CGC CGA TGC GGG GCG 15mer P=S 0.55 19.
4896 GC ( IGA TGC < 3GG G 12mer P=£ 1.2 20.
4015 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG 2 lmer P=S 0,22; 0,22 21.
4549 GGA GAC CGG GGT TGG GG 17mer P=S 0,22; 0,27 22.
• ·· · • · · « · · ··· ·«···« · • · · 4♦ • · · · ·« ·
1. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS szám Szekvencia Hossz össze- tétel ECbo (^1) Szekv száma
5365 GA GAC CGG GGT TGG GG 16mer P=S 0,47 23.
4885 A GAC CGG GGT TGG GG 15mer P=S 0 ,42; 0, 51 24.
5356 CGG GGT TGG GG llmer P=S 0,7 25.
4717 GG GGT TGG GG lOmer P=S 0,6 26.
5544 TGG GG 5mer P=S >3.0
4803 GG GG 4mer P=S >3,0
4771 GTT GGA GAC CGG GGT TG 17mer P=S 0,7 27.
4398 CAC GGG GTC GCC GAT GAA CC 20mer P=S 0,1 28.
4772 GGG GTC GCC GAT GAA CC 17mer P=S 0.4 29.
4773 CAC GGG GTC GCC GAT GA 17mer P=S 0.2 30.
4897 CAC GGG GTC GCC GAT 15mer P=S 0.13 31.
4721 CAC GGG GTC G lOmer P=S 0.4 32.
5366 TTG GGG TTG GGG TGG GGG TTG 25mer P=S 0.16 33.
GGGG
5367 TTG GGG TTG GGG TGG GGG TTG 25mer P=0 >4.0 34.
GGGG
5651 TT GGGG TT GGGG TT GGGG TT 24mer P=S 0.17 35.
GGGG
5677 GGGG TT GGGG TT GGGG TT GGGG 22mer P=S 0.2 36.
5652 TT GGGG TT GGGG TT GGGG TT 20mer P=S 0.16 37.
5653 TT GGGG TT GGGG TT GGGG 18mer P=S 0.2 38.
5676 GGGG TT GGGG TT GGGG 16mer P=S 0.23 39.
5675 TT GGGG TT GGGG TT 14mer P=S 0.42 40.
··· ··»
1. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS szám Szekvencia Hossz Össze- tétel ECbo (pM) Szekv száma
5674 TT GGGG TT GGGG 12mer P=S 1,5 41.
5320 TT GGGG TT 8mer P=S >3,0
5739 TT GGGG 6mer P=S >3,0
5544 T GGGG 5mer P=S >3,0
4803 GGGG 4mer P=S >3,0
4560 GGGG C GGGG C GGGG C GGGG C G 21mer P=S 0,18 42.
5649 TT GGGG TT GGGG TT GGGG TT GGGG 24mer P=0 >3,0 43.
5670 GGGG TT GGGG TT GGGG TT GGGG 22mer P=0 >3,0 44.
5650 TT GGGG TT GGGG TT GGGG TT 20mer P=0 >3,0 45.
5590 GGGG TT GGGG lOmer P=0 >3.0 46.
3196 GGG T GGG T ATA G AAG G G GOT CC 2 lmer P=S 0.2 47.
4664 GGG T GGG T ATA G AAG G GC 18mer P=S 0.2 48.
4671 GGG T GGG T ATA GAA G 15mer P=S 0.4 49.
4672 GGG T GGG T ATA G 12mer P=S 0.2 50.
4692 T GGG T ATA G AAG GGC TCC 18mer P=S 1.5 51.
4693 G T ATA G AAG GGC TCC 15mer P=S >3.0 52.
4694 TA G AAG GGC TCC 12mer P=S >3.0 53.
5753 UUG GGG UU 8mer O-Me >3.0
5756 TTA GGG TT 8mer P=S >3.0
5755 CCC CGG GG 8mer P=S >3.0
4«·4
- 30 A Ü4 szekvenciákat tartalmazó oligonukleotidokat humán citomegalovírus (HCMV, 2. táblázat) és influenza vírus (3. ábra) elleni antivirális aktivitásra is teszteltük. A vírusellenes aktivitást ezekben az esetekben is ELISA vizsgálattal határoztuk meg. s az I.C.50 értékeket a kezeletlen kontrollok vírus titerének százalékaként fejezzük ki.
2. TÁBLÁZAT
HCMV ellen tesztelt oligonukleotidok vírusellenes aktivitása
ISIS szám Szekvencia össze- tétel I.C.50 (Mi) Szekv száma
4015 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG P=S 0.17 21.
4717 GGG GTT GGG G P=S 1.0 26.
5366 TTG GGG TTG GGG TTG GGG TTG GGG G P=S 0.1 33.
4560 GGG GCG GGG CGG GGC GGG GCG P=S 0.15 42.
5367 TTG GGG TTG GGG TTG GGG TTG GGG G P=0 >2.0 34.
A kísérletek során azt tapasztaltuk.
hogy a G4 coreszekvencia szükséges volt a vírusellenes aktivitáshoz. A G4 szekvenciát körülvevő nukleotidők hozzájárultak a vírusellenes aktivitáshoz, hiszen a G4 core-t szegélyező nukleotidők de léc iója csökkentette vírusellenes aktivitást.
kísérletekben a HSV ellen a foszfor-tioát gerincvázat tartalmazó oligonukleotidok voltak • ·· ·· «·«« ·· * · · · ♦ • ··« ·«· «
·..· ..· .,· :
- 31 legaktívabbak. Azt tapasztaltuk. hogy ezekben a vizsgálatokban a foszforsav-diészter gerincvázat tartalmazó vegyületek általában inaktívak voltak. A különböző számú Ga és T2 szekvenciát tartalmazó vegyületek a HSV ellen hasonló aktivitást mutattak, a T2G4T2G4 azonban kevésbé volt aktív, a T2G4T2 pedig inaktív volt. Ogy tartjuk, hogy a G4 szekvenciát nem szükséges T2 szekvenciának szegélyeznie, mivel a több G4C szekvenciát tartalmazó vegyület a G4T2 szekvenciát tartalmazó vegyületek esetében tapasztalhatóhoz hasonló vírusellenes aktivitást mutatott. A G4 szekvenciát tartalmazó oligonukleotidok a HSV vírusszaporodás vizsgálatban is mutattak vírusellenes aktivitást (ld. 1. ábra). A T2G4T2G4T2G4T2G4 oligonukleotid (ISIS 5651, 35. számú szekvencia) nagyobb vírusellenes aktivitást mutatott.
mint az Acyclovir 3 mM dózisban. Következésképpen, több G4 oligonukleotid dózisfüggő módon csökkentette a vírusok szaporodását <2. ábra). A G4 szekvenciát tartalmazó oligonukleotidok a HCMV (2. táblázat) és az influenza vírus (3. ábra) ellen is .jelentős vírusellenes aktivitást mutattak. A G4 szekvenciát. nem tartalmazó kontroll vegyületek nem mutattak víruséllense aktivitást.
HÍV aktivitásra G4 szekvenciát tartalmazó vegyületek sorozatát teszteltük. Az eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be.
3. TÁBLÁZAT
Oligonukleotidok HIV-et gátló hatása
ISIS Szekvencia össze- ICeo TCeo TI (TCbo/ Szekv.
szám tétel (μΜ) (z±l) IC50) száma
5274 GCC CCC TA P=0 inaktív
5273 GCT TTT TA P=O inaktív
5272 GCG GGG TA P=0 inaktív
5271 GCA AAA TA P=0 inaktív
5312 GCG GGG TA P=S 1,3
5311 GCA AAA TA P=S inaktív >200
5307 GCT TTT TA P=S inaktív
5306 GCC CCC TA P=S inaktív
5319 TCG GGG TT P=S 1
5059 GGG GGG TA P=S 0,53
5325 CGG GGG TA P=S 1,1
5321 CCG GGG CC P=S 1.7
5753 UUG UGGG UU 0-Me ,P=0 inaktív »50
5058 GC GGGG TA P=S 1,5 >25
5756 TTA GGG TT P=S 29 >50
5755 CCC CGG GG P=S 34 >>50
5543 TTT GGG TT P-S inakt ív
5542 TTT GG TTT P=S inaktív
5544 TGGGG P=S 5
4560 GGG GCG GGG CGG GGC F-S 0.14
GGG GCG
4721 CAC GGG GTC G
P=S 0,21:0.26 142 546
32.
3. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS Szekvencia össze- ICeo TCco TI (TCbo/ Szekv.
szám tétel (uM) (pM) 1 [Cső) száma
4338 ACC GCC AGG GGA ATC P=S 0.42 12.
CGT CAT
4897 CAC GGG GTC GCC GAT P=S 0,43 31.
3657 CAT CGC CGA TGC GGG P=S 0,43 16.
GCG ATC
4873 CAT GAC CGG GGC P=S 1 4.
5366 TTG GGG TTG GGG TTG P=S 0.08:0 ,1 22 220 33.
GGG TTG GGGG
5651 TT GGGG TT GGGG TT P=S 0.1:0. 18 19:19 175 35.
GGGG TT GGGG
5677 GGGG TT GGGG TT GGGG P=S 0.1:0. 19 15:14 146 36.
TT GGGG
5652 TT GGGG TT GGGG TT P=S 0.1:0. 18 22: 19 227 37.
GGGG TT
5653 TT GGGG TT GGGG TT P=S 0.12: 27 38.
GGGG 0.19
5676 GGGG TT GGGG TT GGGG P=S ' 0.18:0. 28 21:23 114 39.
5675 TT GGGG TT GGGG TT P=S 0.38 14 36 40.
5674 TT GGGG TT GGGG P=S 0.43 >200 41.
4717 GGGG TT GGGG P=S 0.41 >25:39 26.
5320 TT GGGG TT P=S 0.47 195:52 415
5739 TT GGGG P=S 3.8 -200
4803 GGGG P=S 4 >25:13
• ♦ *
• ·
- 34 3. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS szám Szekvencia Össze- ICbo TCbo TI (TCbo/ Szekv
tétel (/jM) ICbo ) száma
5367 TTG GGG TTG GGG TTG P=0 0,09; 52 400 34.
GGG TTG GGGG 0,13
5649 TT GGGG TT GGGG TT P=0 <0,08; 24; 31 300 43.
GGGG TT GGGG 0,3
5670 GGGG TT GGGG TT GGGG P=0 0,17; 15 44.
TT GGGG 0,75
5650 TT GGGG TT GGGG TT P=0 0.64 7,6 12 45.
GGGG TT
5666 TT GGGG TT GGGG TT P=0 0,17; 16.7; 100 54.
GGGG 0,6 5
5669 GGGG TT GGGG TT GGGG P=0 1,2 9,6 9 55.
5667 TT GGGG TT GGGG TT P=0 >22 5.6 56.
5668 TT GGGG TT GGGG P=0 >21 5,2 57.
5590 GGGG TT GGGG P=0 >21 20 46.
5671 TT GGGG TT P=0 16 18; 15 1
5672 TT GGGG P=0 >16 18
5673 GGGG P=0 >1 43
Számos olyan vegyületet azonosítottunk, melynek jelentős HÍV vírusellenes aktivitása volt (ICbo = 2 pi vagy kevesebb). Az 5058-as vegyület G4 core-t tartalmazó foszfor-tioát 8-mer oligonukleotid minta. Ha a G4 core-t Gs-re vagy Ge-ra
hosszabitottuk. az aktivitás fennmaradt. ha azonban a G< core-t A4-re. C4-re vagy T4-re cseréltük, az aktivitás megszűnt. A gerincváz foszfor-tioátról foszforsav-diészterre való változtatása szintén inaktív vegyületeket eredményezett. Az egy G4 szekvenciát tartalmazó oligonukleotidőkről szintén azt találtuk, hogy foszforsavdiészterekként inaktívak. A több G4 ismétlődést tartalmazó oligonukleotidokkal kapcsolatban azonban azt tapasztaltuk, hogy foszforsav-diészterekként aktívak. A G4 core-t szegélyező nukleotidok szubsztitúciója a HÍV vírusellenes aktivitás megmaradását eredményezte. A TTGGGGTT vegyület (ISIS 5320) a sorozat legaktívabb tagja volt. Az egymás után három vagy két guanozint tartalmazó vegyületeket inaktívnak találtuk. A különböző számú G4 és T2 szekvenciát tartalmazó vegyületek általában aktívabbak, mint az eredeti TTGGGGTT vegyület. A T2G4 és a G4 azonban kevésbé volt aktív. Azt találtuk, hogy nem feltétlenül szükséges, hogy a G4 szekvencia mindkét oldalról szegélyezve legyen, hiszen a G4T2G4 nagyon aktív.
Foszfolipáz A2 enzimaktivitás
Olyan, konzervált
G4 szekvenciát tartalmazó specifikus oligonukleotidokat is azonosítottunk, amelyek szelektíven gátolják a
II.
típusú humán foszfolipáz
A2-t és a kiválasztott.
II. t ipusú foszfolipáz
A2-t. Ezek a szerek hasznosak lehetnek gyulladásos betegségek, hiperproliferatív rendellenességek,
- 36 rosszindulatú daganatos betegségek, központi idegrendszeri rendellenességek (mint a skizofrénia), szív- és érrendszeri betegségek, valamint a mérgeskígyók, elsősorban a csörgőkígyók harapása következményeinek kezelésében.
A II. típusú foszfolipáz A2 növekvő mennyiségű foszfor-tioát dezoxi-oligonuklotidokkal történő inkubálása a foszfolipáz A2 enzimaktivitás szekvencia-specifikus gátlását eredményezte. A tesztelt oligonukleotidok közül az ISIS 3196 (47. számú szekvencia) mutatta a legnagyobb aktivitást (IC50 = 0,4 jjM). Az ISIS 3631 (81. számú szekvencia) és az ISIS 3628 (78. számú szekvencia) hozzávetőleg tízszeres ICeo értéket mutatott, míg az ISIS 1573 (120. számú szekvencia) még 10 koncentrációban sem gátolta jelentősen a foszfolipáz A2-t.
A II. típusú humán foszfolipáz Az aktivitást közvetlenül gátló oligonukleotidok szekvencia specifitásának további meghatározásához az enzimaktivitás közvetlen gátlására foszfor-tioát oligonukleotidok sorozatát teszteltük. A 43 különböző szekvenciával kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.
4. TÁBLÁZAT
A II. típusú humán foszfolipáz A2 szekvencia-specifikus gátlása foszfor-tioát dezoxi-oligonukleotldokkal
ISIS szám Szekvencia %-os gátlás (1 jjM) ' Szekvencia száma
3181 TCTGCCCCGGCCGTCGCTCCC 42,7 58.
3182 CAGAGGACTCCAGAGTTGTAT 30,2 59.
3184 TTCATGGTAAGAGTTCTTGGG 25.1 60.
3185 CAAAGATCATGATCACTGCCA 22,7 61.
3191 TCCCATGGGCCTGCAGTAGGC 41,5 62.
3192 GGAAGGTTTCCAGGGAAGAGG 28,1 63.
3193 CCTGCAGTAGGCCTGGAAGGA 22.6 64.
3196 GGGTGGGTATAGAAGGGCTCC 98.5 47.
3468 GGGACTCAGCAACGAGGGGTG 97.5 65.
3470 GTAGGGAGGGAGGGTATGAGA 88,9 66.
3471 AAGGAACTTGGTTAGGGTAGG 34.5 67.
3472 TGGGTGAGGGATGCTTTCTGC 69.0 68.
3473 CTGCCTGGCCTCTAGGATGGG 25.9 69.
3474 ATAGAAGGGCTCCTGCCTGGC 13.3 70.
3475 TCTCATTCTGGGTGGGTATAG 67.0 71.
A xi *7* θ GCTGGAAATCTGCTGGATGTC 43.4 72.
3477 GTGGAGGAGAGCAGTAGAAGG 54.7 73.
3478 TGGTTAAGCACGGAGTTGAGG 26.4 74.
3479 CCGGAGTACAGCTTCTTTGGT 42.3 75.
3480 TTGCTTTATTCAGAAGAGACC 24.5 76.
3481 TTTTTGATTTGCTAATTGCTT 2.2 77.
4. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS szám Szekvencia %-os gátlás (1 jjM) Szekvencia száma
3628 GGAGCCCTTCTATACCCACCC 13.6 78.
3629 CACCCCTCGTTGCTGAGTCCC 20,5 79.
3630 TCTCATACCCTCCCTCCCTAC 17,6 80.
3631 AGGTCGAGGAGTGGTCTGAGC 20,7 81.
3632 CCAGGAGAGGTCGGTAAGGCG 29,2 82.
3633 CTAGGGATGGGAGTGAAGGAG 58,5 83.
3659 TGCTCCTCCTTGGTGGCTCTC 38,2 84.
3663 CTCTGCTGGGTGGTCTCAACT 16,3 85.
3665 GGACTGGCCTAGCTCCTCTGC 45,8 86.
3669 GGTGACAAATGCAGATGGACT 34.7 87.
3671 TAGGAGGGTCTTCATGGTAAG 49.3 88.
3676 AGCTCTTACCAAAGATCATGA 24.5 89.
3679 AGTAGGCCTGGAAGGAAATTT 30.3 90.
3688 TGGCCTCACCGATCCGTTGCA 43.1 91.
3694 ACAGCAGCTGTGAGGAGACAC 28.2 92.
3697 ACTCTTACCACAGGTGATTCT 39 93.
3712 AGGAGTCCTGTTTTGAAATCA 31.8 94.
4015 GTTGGAGACCGGGGTTGGGG 79.4 21.
4133 AGTGCACGTTGAGTATGTGAG 37.3 95.
4149 CTACGGCAGAGACGAGATAGC 20.2 96.
4338 ACCGCCAGGGGAATCCGTCAT 100 12.
4560 GGGGCGGGGCGGGGCGGGG 100 42.
• ·
- 39 A legtöbb oligonukleotid 1 liA koncentrációban jelentős mértékben gátolta a foszfolipáz A2 enzimaktivitást, sőt, az oligonukleotidok egy csoportjáról azt állapítottuk meg, hogy 1 fii koncentrációban teljesen meggátolták a foszfolipáz A2 aktivitást. A foszfolipáz A2 enzimaktivitást 50 %-nál nagyobb mértékben gátló oligonukleotidok közös jellemzője, hogy két vagy több sorozat guaningyököt tartalmaznak, mely sorozatok legalább három bázisból állnak. Egy sorozatban több guaningyök vagy több guaningyök sorozat jelenléte hatásosabb oligonukleotidokat eredményez. Például, az ISIS 3196 (47. számú szekvencia) és az ISIS 3470 (66. számú szekvencia) oligonukleotid egyaránt három guanin sorozatot tartalmaz, melyek mindegyike három bázis hosszúságú. A II. típusú humán foszfolipáz A2 enzimaktivitást 1 /41 koncentrációban mindkét oligonukleotid tökéletesen gátolta. Ezen tapasztalat alól két kivételt találtunk. Az ISIS 3477 oligonukleotid (73. számú szekvencia) három guanin sorozatot tartalmazott, de e sorozatok csak 2 bázis hosszúságúak voltak. Ez az oligonukleotid 1 /41 koncentrációban 54,7 % arányban gátolta az enzimaktivitást. Egy másik, oligonukleotid, az ISIS 4338 (12. számú szekvencia), csak egy guaningyök sorozatot tartalmaz, mely négy bázisból áll.
Ez az oligonukleotid ebben a kísérletben a II. típusú humán foszfolipáz A2-1. 1 /41 koncentrációban tökéletesen gátolta.
A II. típusú humán foszfolipáz As gátlásáért felelős minimális farmakofór (vegyületszakasz) további meghatározása érdekében az ISIS 3196 (47. számú szekvencia) és az ISIS
4015 (21. számú szekvencia) oligonukleotidők csonkított változatait teszteltük az aktivitásra. Ezenfelül, vizsgáltuk az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) egy csonkított változata bázis szubsztitúcióinak aktivitásra gyakorolt hatását is. Az eredményeket az 5. táblázatban mutatjuk be. Mivel a bázis szubsztitúció és a csonkítás hatásait két külön kísérletben vizsgáltuk, mindkét kísérlet eredményeit bemutatjuk.
5. TÁBLÁZAT
A PLA2 gátlásához szükséges minimális farmakofór azonosítása
ISIS Szekvencia %-os gátlás Szekvencia szám (1 száma
3196 GGG TGG GTA TAG AAG GGC TCC 76.2 47.
GGG TGG GTA TAG AAG GGC 85.3 97.
GGG TGG GTA TAG AAG' 82.5 98.
4672 GGG TGG GTA TAG 73,9 50.
TGG GTA TAG AAG GGC TCC 84.6 99.
GTA TAG AAG GGC TCC 9.2 100.
TAG AAG GGC TCC 0 101.
TGG GTA TAG AAG GGC 33.5 102.
3196 GGG TGG GTA TAG AAG GGC TCC 100 47 .
4672 GGG TGG GTA TAG 94.6 50.
4947 AGG TGG GTA TAG 22.7 103.
4955 GGG AGG GTA TAG 97,5 104.
4956 GGG GGG GTA TAG 92,0 105.
• *
- 41 5. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS szám Szekvencia %-os gátlás (1 ^M) Szekvencia száma
4957 GGG TGG ATA TAG 81,9 106.
4946 GGG TGG GAA TAG 73,2 107.
4962 GGG TGG GTA T 36,3 108.
4015 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG 98,5 21.
4771 GTT GGA GAC CGG GGT TGG 17.1 27.
4549 GGA GAC CGG GGT TGG GG 96,2 22.
4717 GG GGT TGG GG 83.1 26.
5544 TGG GG 50
4803 GG GG 0
Ezen eredmények azt mutatják, hogy a minimális farmakofór az egymás után álló nésv euanin. vagy a két. három guaninból álló sorozat. Az ISIS 4015 oligonukleotidot (21. számú szekvencia) illetően, a 10 bázisos, GGGGTTGGGG szekvenciából álló foszfor-tioát oligonukleotid tartja fenn a teljes gátló aktivitást. Az öt bázisból (TGGGG) álló foszfor-tioát oligonukleotid (ISIS
5544) 1 koncentrációban 50 %-os arányban gátolta az enzimaktivitást:
ezzel az oligonukleotiddal az enzimaktivitás teljes gátlását koncentrációnál tapasztaltuk.
A GGGTGGGTATAG szekvenciából álló, 12 bázisos foszfor-tioát • ··
- 42 oligonukleotidról (ISIS 4672: 50. számú szekvencia) egy kísérletben azt mutattuk ki, hogy majdnem ugyanolyan mértékű gátlást eredményez, mint a 21 bázisos oligonukleotid (ISIS 3196; 47. számú szekvencia; 5. táblázat). A 12-mer utolsó két 3' bázisának eltávolítása az aktivitás megszűnését eredményezi (ISIS 4962; 106. számú szekvencia). A bázis szubsztitúciós kísérletek azt bizonyítják, hogy a két guanin sorozatot elválasztó bázis nem befolyásolja jelentősen az aktivitást. Az 5' guanin adeninnel végzett szubsztitúciója az aktivitás megszűnését eredményezi, ami azt sugallja, hogy az 5' guanin fontos szerepet játszik az oligonukleotid aktivitásának fenntartásában. Az 5' guanin e szekvenciában betöltött fontos szerepét támasztja alá az a felfedezés is, hogy fluoreszcein-foszfor-amidit vagy 5'-foszfát hozzáadása az aktivitás megszűnését eredményezi.
A fentebb leírt vizsgálatokban alkalmazott valamennyi oligonukleotid dezoxio1igonukleotid. Annak meghatározása érdekében, hogy a hatások a DNS oligonukleotidokra specifikusak-e, 2'-szubsztituált analógokat teszteltünk az aktivitásra. Az eredményeket a 4. ábrán mutatjuk be. Az nukleozidok közötti kötések valamennyi esetben foszfor-tioát kötések voltak. 2' helyzetben fluorral szubsztituálva a hatásosságban nem tapasztaltunk különbséget, míg a metil- és propilcsoporttal végzett szubsztitúció fokozta a II. típusú humán foszfolipáz A2 elleni gátló aktivitást. A foszfor-tioát gerincváz foszfo-diészter vázzal való helyettesítése a gátló aktivitás megszűnését eredményezte. A foszfo-diészter' oligonukleotidok esetében a gátló aktivitás elvesztése nem az oligonukleotidok lebomlása következtében történt, hiszen az oligonukleotidok az inkubáló pufferben legalább 4 óráig stabilak voltak, a foszfolipáz A2 enzim vizsgálatok időtartama pedig 15 perc volt.
összegzésül; az eredmények azt bizonyítják, hogy a két vagy több guanin sorozatot tartalmazó foszfor-tioát oligonukleotidok (melyekben mindegyik guanin sorozat legalább három bázisból áll) a II. típusú humán foszfolipáz A2 enzim aktivitásának hatásos inhibitorai. 2' helyzetben metil- vagy propilcsoporttal végzett szubsztitúció fokozta a gátló aktivitást. Azt találtuk, hogy a foszfor-tioát internukleozidos kötés a biológiai aktivitáshoz elengedhetetlen.
A telomerhosszúság módosítása
A telomerhosszúság szintén a találmány módosítására képes oligonukleotidok tárgyát képezik. Humán sejtekben a
TTAGGG szekvencia a sejt típusától es korától függően valamennyi kromoszóma mindkét végén több százszor vagy ezerszer ismétlődik.
Úgy tartjuk.
hosv az (NxG3-4)öNx szekvenciával rendelkező oligonukleotidok.
melyekben X
1-8, és Q
1-6, hasznosak lehetnek a telomerhosszúság módosításában.
Mivel a telomerek szerepet játszanak a sejtek öregedésében.
vagyis a telomerhosszúság minden egyes sejtosztódással csökken. úgy tartjuk, hogy az ilyen oligonukleotidok hasznosak lehetnek a sejtek öregedési folyamatának befolyásolásában. A megváltoztatott telomerek rákos sejtekben is megtalálhatók, ezért úgy véljük, hogy az ilyen
oligonukleotidok a rosszindulatú sejtek növekedésének
kontrollálásában is hasznosak lehetnek. Ilyenformán, a
telomerhosszúság találmány szerinti oligonukleotidok
alkalmazásával végzett módosítása hasznos lehet a rákos betegségek kezelésében vagy az öregedési folyamat szabályozásában.
A következő példákat szemléltetési célokból, s nem a találmány korlátozásaként mutatjuk be.
1. példa: Oligonukleotid szintézis
Szabályozott pórusú üveghez (CPG: controlled-pore glass) kötött DNS szintetizáló reagenseket és B-ciano-etildiizopropil-foszfor-amiditeket az Applied Biosystems-től (Foster City. CA ) vásároltunk. 2'-Ο-metil-B-ciano-etildiizopropil-foszfor-amiditeket a Chemgenes-től (Needham. MA) vásároltunk. Az RNS szintézishez fenoxi-acetil csoporttal védett foszfor-amiditeket a BioGenex-től (Hayward, CA) vásároltunk.
Az oligonukleotidokat automata DNS szintetizátoron (Applied Biosystems 380B modell) szintetizáltuk. A
2'-0-metil-oligonukleotidokat a módosítatlan oligonukleotidokhoz használt standard szintetizálási ciklus alkalmazásával szintetizáltuk, azzal a különbséggel, hogy a tetrazol és a bázis pulzusszerű adagolása utáni várakozási időt 360 másodpercre növeltük. A szintézis elindításához alkalmazott, CPG-hez kötött 3'-bázis 2'-dezoxiribonukleotid volt. A CPG oszlopról végzett lehasítás és a védőcsoport koncentrált ammónium-hidroxid oldatban 55 ’C-on 18 órán keresztül végzett eltávolítása után az oligonukleotidokat 0,5 M NaCl oldatból, 2,5 térfogat etanollal kétszer végzett
kicsapással tisztítottuk. 20 ?! í-os akrilamidban, 8 M
karbamidban, 45 mM Tris-borát pufferben (pH = 7 ,0)
analitikai gélelektroforézist végeztünk. Az
oligonukleotidokról poliakrilamid gélelektroforézissel azt állapítottuk meg, hogy több. mint 85 %-ban teljes hosszúságúak.
2. példa: HÍV gátlás
Akut HÍV fertözéses vizsgálat
A humán T-limfoblasztoid CEM sejtvonalat 10 % magzati borjúszérummal. glutaminnal és antibiotikumokkal kiegészített RPMI 1640 tápközegben exponenciális növekedési fázisban tartottunk. A vizsgálat napján a sejteket mostuk és trypan blue kizárással számoltuk. A sejteket (CEM-IIIB) 96 üregű mikrotiter lemez üregeibe üregenként 5 x 103 sejt mennyiségben helyeztük. A sejtek hozzáadása után az oligonukleotidokat a jelzett koncentrációkban, és fél lóg ··· · ··· ··· sorozathígításokban adtuk az üresekhez, majd minden üreghez azonnal fertőző HIV-Iiiib vírusokat adtunk, olyan mennyiségben, amely a fertőzés után hat nappal teljes sejtpusztulást eredményez. 37 °C-on hat napig végzett inkubálás után, az XTT tetrazolium festék hozzáadása előtt minden egyes üregből eltávolitottuk a felülúsző egy alikvotját. Az XTT-t az életképes sejtek formazan termékké bontják, s az eredményeket spektrofotometrikusan Molecular
Devices Vmeoc
Plate Reader (lemez detektor) alkalmazásával számítottuk.
Az
XTT vizsgálat a HÍV által indukált sej tpusztulás tesztvegyületek hozzáadása általi kiküszöbölésének mértékét méri. A felülúszó alikvotot az XTT vizsgálatban alkalmaztuk.
mennyiségének meghatározott aktivitások alátámasztásához
A fertőzött sejtekből felszabaduló HÍV méréséhez reverz transzkriptáz vizsgálatokat és p24 ELISA vizsgálatot végeztünk. A sejtpusztulás kiküszöbölése az XTT vizsgálatban fokozott optikai denzitást. valamint a vírus reverz transzkriptáz és a p24 core -protein csökkent szintjét eredményezi.
3. példa: HSV-1 gátlás
HSV-1 fertőzéses ELISA vizsgálat
Egyrétegű, konfluens. humán dermális fibroblaszt sejtréteget 0,05 pfu/sejt mennyiségben HSV-1 (KOS) vírussal fertőztünk. 37 °C-on 90 perces adszorpció után a vírust, eltávolitottuk. s a sejtekhez a jelzett koncentrációban oligonukleotidot tartalmazó tenyészet tápközeget adtunk. A fertőzés után két ···· • w·
- 47 nappal a tápközeget eltávolítottuk. s a sejteket 95 %-os etanol hozzáadásával rögzítettük. A HSV antigén expressziót mennyiségileg enzim-kötött immunvizsgálattal határoztuk meg. A vizsgálatban az elsődleges reaktív antitest a HSV-1 glikoprotein B-re specifikus monoklonális antitest volt. A detektálást másodlagos antitestként biotinilált kecske antiegér IgG alkalmazásával, majd sztreptavidinnel konjugált βgalaktozidázzal végzett reakcióval hajtottuk végre. Klórfenol vörös β-D-galaktopiranozid hozzáadására szín fejlődött ki. s 570 nm-nél mértük az abszorbanciát. Az eredményeket a kezeletlen kontroll százalékaként fejezzük ki.
Vírusszaporodás vizsgálat
Egyrétegű, konfluens. humán dermális fibroblaszt sejtréteget 0,5 pfu/sejt mennyiségben HSV-1 (KOS) vírussal fertőztünk. 37 ’C-on 90 perces adszorpció után a vírust eltávolítottuk. s a sejtekhez a jelzett koncentrációban oligonukleotidőt tartalmazó 1 ml tenyészet tápközeget adtunk. A kontroll üregekhez 1 ml. oligonukleotidot nem tartalmazó tápközeget adtunk. A fertőzés után két nappal a tenyészet tápközeget és a sejteket begyűjtöttük, és mindegyik kísérlethez két üreg tartalmát egyesítettük. A szuszpenziót háromszor fagyasztottuk és olvasztottuk. majd 22-es tűvel ötször felszívtuk. A virustitert egyszeres Verő sejtrétegen plakk vizsgálattal határoztuk meg. Valamennyi víruskészítményből hígításokat készítettünk. s a kétszeres mennyiségeket konfluens Verő egyrétegű sejteken 90 percig adszorbeáltuk.
• · » ♦» ♦ ·
Az adszorpció után a vírust eltávolítottuk. a sejteket egyszer foszfát-pufferelt sóoldattal öblítettük, és 5,0 %
FBS-t és metil-cellulózt tartalmazó beborítottuk. A sejteket 37 ’C-on 72 ml tápközeggel órán át inkubáltuk.
majd plakkokat formaldehiddé1 rögzítettük és kristályibolyával festettük. A kezelt üregekből származó plakkok számát összehasonlítottuk a kontroll üregekből származó plakkok számával. Az eredményeket a kezeletlen kontroll sejtek esetében tapasztalt vírustiter százalékos arányaként fejezzük ki (ld. 2. ábra).
4. példa: Citomegalovírus gátlás
ELISA vizsgálat
Egyrétegű, kontinens, humán dermális fibroblaszt tenyészeteket szérum-mentes fibroblaszt nevelő tápközegben a Jelzett koncentrációjú oligonukleotiddal kezeltünk. 37 °C-on egy éjszakán át végzett inkubálás után az oligonukleot.idokat tartalmazó tenyészet tápközeget eltávolítottuk. a sejteket leöblítettük és 0.1 pfu/sejt fertőzés mennyiségben humán c itotnegalovirust adtunk hozzájuk. 37 QC-on két órás adszorpció után a vírust eltávolítottuk, és jelzett koncenrációjú oligonukleotidőt tartalmazó friss fibroblaszt nevelő tápközeget adtunk a sejtekhez. A fertőzést követően két nappal a régi tenyészet tápközeget eltávolítottuk. és Jelzett koncenrációJú oligonukleotidot tartalmazó friss fibroblaszt nevelő tápközegeel helyettesítettük. A fertőzés után hat nappal a tápközeget eltávolítottuk, és a sejteket %-os etanol hozzáadásával rögzítettük. A HCMV antigén expressziót enzim-kötött immunvizsgálattal határoztuk meg. A vizsgálatban az elsődleges reaktív antitest a késői HCMV vírus proteinre specifikus monoklonális antitest volt. A detektálást másodlagos antitestként biotinilált kecske antiegér IgG alkalmazásával, majd sztreptavidinnel konjugált βgalaktozidázzal végzett reakcióval hajtottuk végre. Klórfenol vörös β-D-galaktopiranozid hozzáadására szín fejlődött ki, s az abszorbanciát 575 nrn-nél ELISA lemezdetektor alkalmazásával mértük. Az eredményeket a kezeletlen kontroll százalékaként fejezzük ki.
5. példa: Influenza vírus gátlás
Vírusszaporodás vizsgálat
Madin-Darby kutyavese (MDCK) sejtek konfluens. egyrétegű tenyészetét 0,2 % BSA-t tartalmazó, szérum-mentes Dulbeccoféle módosított. Eagle tápközegben (DMEM' 10 mM oligonukloeotiddal kezeltük. 37 °C-on két órán át végzett inkubálás után a sejtekhez 0,00125 pfu/seJt fertőzés mennyisében humán influenza vírust <A/FR törzs) adtunk. A vírus adszorpcióját 37 °C-on 30 percig végeztük. A sejteket mostuk. és 10 líA koncentrációjú oligonukleotidőt. valamint 0.2 % BSA-t és 3 mg/ml tripszint tartalmazó friss tápközeggel tovább tenyésztettük. A fertőzés után egy nappal a tápközeget begyűjtöttük. s a vírusos felülúszó titerét MDCK sejteken határoztuk meg. Hatüregű csészékben tenyésztett. MDCK sejteket mindegyik víruskészítmény • ν
909 >
··· ·· « · • 99 ι ·· hígításaival megfertőztük. 37 ’C-on 30 oercig tartó adszorpció után a vírust eltávolítottuk az egyrétegű tenyészetről, és a sejteket 0,2 % BSA-t, 3 pg/ml tripszlnt és 0.44 % agarózt tartalmazó 2,5 ml friss tápközeggel fedtük be. A fertőzés után 24 órával a sejteket 3,5 %-os formaldehidben rögzítettük, s tenyészetek kristályibolyával láthatóvá. Az eredményeket a a plakkokat az egyrétegű végzett festésével tettük kezeletlen MDCK sejtekből származó vírus törzs titerének százalékaként fejezzük ki.
6. példa: A II. típusú humán foszfolipáz A2 oligonukleotidos gátlásának meghatározása
Az A431 humán epidermális karcinoma sejtvonalat az American Culture Type Collection-tói szereztük be. A sejteket 4,5 g/1 glükózt és 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó Dulbeccoféle módosított Eagle tápközegben tenyésztettük. II. típusú foszfolipáz As-t A431 sejtekből. a konfluens egyrétegű tenyészetek Opti-MEM-mel (Gibco) végzett tenyésztésével készítettünk. A tápközeget Amicon ultrafiltráló készülékben. YM-5 membrán alkalmazásával 5-10-szeresére koncentráltuk. A koncentrált, használt tápközeget a II. típusú humán foszfolipáz A2 forrásaként alkalmaztuk. Korábbi vizsgálatok azt mutatták. hogy az A431 sejtek csak a II. típusú foszfolipáz A2-t szekretálják.
A foszfolipáz A2 vizsgálatokat szubsztrátként 3H-olaJsavval Jelölt E. coli alkalmazásával végeztük. A 3H-olajsavval
Λ - www ♦ · · · · ·· ·· ·· ·
Chem..
200 pl
- 51 jelölt E. coli-t Davidson és mtsi. leírása (J. Bioi. 262. 1698, 1987) szerint készítettük. A reakcióelegy végtérfogatban 100 000 cpm 3H-olajsavval jelölt E. coli-t, 50 mM Tris-HCl-t (pH = 7,4). 50 mM NaCl oldatot, 1 mM CaC12 oldatot és 50 μζ szarvasmarha szérum albumint tartalmazott. A reakciókat az E. coli szubsztrát hozzáadásával indítottuk be, s 100 jul 2N sósav és 100 μΐ 100 mg/ml zsírsav-mentes szarvasmarha szérum albumin hozzáadásával állítottuk le. A mintákat vortexeztük, s 17000 g-vel 5 percig centrifugáltuk. A felülúszóban a sH-olajsav mennyiségét 300 pl alikvot folyadék szcintillációs számlálóban végzett számlálásával határoztuk meg. Az oligonukleotidokat a szubsztrát hozzáadása előtt adtuk az inkubálási elegyhez.
7. példa: A II. típusú humán foszfolipáz A2 foszfor-tioát oligonukleotidok általi gátlásának szerkezeti követelményei
A II. típusú humán foszfolipáz A2-t gátló oligonukleotidok a telomer DNS szekvenciákkal közös jellemzőket mutatnak, abban az értelemben. hogy mindkettő guaninban gazdag szekvenciákból áll. A telomer szekvenciák. mint az Oxytrioha-bö1 származó (XXXG4T4G4T4G4T4G4T4G4: 121. számú szekvencia). szokatlan, G kvartett elnevezésű szerkezetet képeznek. E szerkezet kialakulása egyértékú kation függő, s magas hőmérséklet hatására felbomlik. Annak meghatározása érdekében, hogy az oligonukleotid struktúra az aktív farmakofór része-e. az ISIS 3196 oligonukleotidőt (47. számú szekvencia) a vizsgálatban való felhasználás előtt 15 percre • · · · • · · · · · ·
- 52 forró vízbe helyeztük. A forralás az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) gátló aktivitását 94 %-ról 21 %-ra csökkentette. Az oligonukleotid denaturáló gélelektroforézissel végzett vizsgálata azt bizonyította, hogy a forralás nem okozta az oligonukleotid fragmensekre darabolódását. Az eredeti és a denaturált ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) Superdex G-75 oszlopon gélfiltrációs kromatográfiával végzett elválasztása azt bizonyította, hogy ez az oligonkulkeotid több molekuláris fajtaként létezik. Az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) kromatografálás előtt végzett forralása a nagy molekulatömegű forma elvesztését.
és az alacsonyabb molekulatömegü alak megjelenését eredményezte. Ezen vizsgálatokból arra következtethetünk, hogy ez a struktúra az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) farmakofórjának része.
8. példa: A foszfor-tioát oligonukleotid II. típusú foszfolipáz A2-t szelektáló specifitása
Szarvasmarha hasnyálmirigy foszfolipáz Aa-t. Apis mellifera foszfolipáz
A2“t ,
Naja na ja naja foszfolipáz
A2-t és
foszfolipáz A2—t a Sigma
Chemical Co.-tól (St. Louis,
MŰ) kaptunk. Trimeresurus flavcridis mérgéből izolált foszfolipáz A2-t a Calbiochem től (La Jolla, CA) kaptunk. Az Askistrodon píscivorus piscivorus-T>ól származó foszfolipáz As-t Mono S oszlopon (Pharmacia, Upsalla, Svédország) végzett kromatografálással teljes mérésből
(Sigma Chemical Co. ) részlegesen tisztítottuk.
Az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) II. típusú humán foszfolipáz A2-re vonatkozó specifitásának meghatározása érdekében különböző forrásokból származó foszfolipáz A2-t inhibitor aktivitásra teszteltünk (5. ábra). Az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) inhibitor aktivitására valamennyi tesztelt enzim közül a II. típusú humán foszfolipáz A2 volt a legérzékenyebb (I.C.50 = kb. 0,15 iM: 5. ábra). Az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) hatására a második legérzékenyebb enzim a Crotalus durissus (csörgőkígyó) mérgéből izolált, szintén II. típusú foszfolipáz Az (I.C.so = kb. 0,3 /41), míg a harmadik legérzékenyebb az Agkistrodon piscivorus piscivorus mérgéből izolált (szintén II. típusú) foszfolipáz A2 volt (I.C.so = kb. 3 pH). Az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) hatására valamennyi tesztelt enzim közül a szarvasmarha hasnyálmirigy foszfolipáz Az (I. típusú enzim) volt a legrezisztensebb (I.C.so kb.
100 /M: 5. ábra). A
Maja naja izolált I. típusú foszfolipá2 és a Trimeresurus flavoridis (ázsiai gödörkésarcú vipera, egyaránt viszonylag rezisztens volt az ISIS 3196 oligonukleotid ( 47. számú
Az Apis malii fara (háziméh) mérgéből izolált fosz folipáz A2 (amely nem I.. és nem II. típusú enzim) szintén elég rezisztens volt az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú • · · · · ♦ · • ··· ··· ·*· • · · · · • · · ·· ·· ··
- 54 szekvencia) inhibitor aktivitására (I.C.so > 100 t£1).
Ezen eredmények azt bizonyítják, hogy az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) szelektíven gátolja a II. típusú humán foszfolipáz A2-t. Más II. típusú foszfolipáz Az enzimek, mint a Crotalus és Agkistrodon méregből izoláltak, szintén érzékenyek voltak az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) hatásaira, miközben az I. típusú enzimek az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) hatásaira általában rezisztensebbek voltak. Bár a háziméh (Apis mellifera) méreg foszfolipáz A2 enzimje sem a I., sem a II. típusú enzimekkel nem mutat közeli szekvencia homológiát, közelebb áll az I. típusú enzimekhez. Egyéb I. típusú enzimekhez hasonlóan ez az enzim is viszonylag rezisztens volt az ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) inhibitor hatásaira.
9. példa: A II. típusú humán foszfolipáz A2 foszfor-tioát oligonukleotidok által történő gátlásának mechanizmusa
A foszfor-tioát oligonukleotidok foszfolipáz Az-t gátló aktivitása mechanizmusának tisztázása első lépéseként az oligonukleotidok enzimek szubsztrát kinetikájára gyakorolt hatásait határoztuk meg. A II. típusú humán foszfolipáz A2-t
az ISIS 3196 (47. számú szekvencia) és az ISIS 3481 (77.
számú szekvencia) oligonukleotid jelenlétében növekvő
mennyiségű E. coli szubsztráttal inkubáltuk. Az E. coli foszfolipid koncentrációját a Bartlett által leírt (J. Bioi.
• · • · · ·
Chem. , 23-4. 466. 1959) lipid-foszfor analízissel határoztuk
meg. Az eredmények azt bizonyítják. hogy az ISIS 3481
oligonukleotid (77. számú szekvencia) 0,2 μΜ és 2 μΜ
koncentrációban nem módosította a II. típusú humán
foszfolipáz A2 szubsztrát kinetikáját. Ezzel ellentétben, az
ISIS 3196 oligonukleotid (47. számú szekvencia) látszólagos nonkompetitív inhibitorként működött, mivel az oligonukleotid
Jelenlétében a látszólagos Km és
Vmeoc értékek megváltoztak.
Nem valószínű, hogy az
ISIS 3196 oligonukleotid (47.
számú szekvencia) kalciummal kelátkomplexet képezve gátolná a II.
típusú humán foszfolipáz A2-t, mivel a vizsgálat során a szabad kalcium az oligonukleotidhoz képest 500-5000-szeres feleslegben volt jelen.
10. példa: A telomerhosszúság módosítása Ga foszfor-tioát oligonukleotidokkal
Humán fibroblasztokban kimutattuk. hogy a telomer DNS mennyisége és hosszúsága az öregedés során az in vitro sorozatos passzálás következtében csökken. A G-4 foszfortioát oligonukleotidok e folyamatra gyakorolt hatásának vizsgálata érdekében humán bőr bicpszia fibroblasztokat Harley. C.B. leírása szerint (Meth. Molec. Bioi.. 5. 25-32. 1990) tenyésztettünk. A sejteket a 6. táblázatban felsorolt oligonukleotidokkal oly módon kezeltük, hogy azokat 1 μΜ. 3 μΜ és 10 /.Ü végkoncentrációban adtuk a tápközeghez. A kontroll sejtekhez nem adtunk oligonukleotidokat. A • ··
• · ·« ···· • · · · · ··· ·«· · • · · sejtpopulációk kettözödését nyomon követtük, és szabályos időközönként DNS-t izoláltunk. A telomerhosszúságot Southern biot analízissel határoztuk meg, és Harley, C.B. és mtsi. (Natúré, 345. 458-460, 1990) leírása szerint számos populáció kettőződésse1 szemben grafikusan ábrázoltuk. A kapott lineáris regressziós egyenesek meredeksége azt jelzi, hogy a kezeletlen fibroblasztok esetében a telomerhosszúság csökkenése átlagos sejtpopuláció kettőződésenként 50 bázispár (Harley, C.B. és mtsi, Natúré, 345, 458-460, 1990). A 6. táblázatban felsorolt oligonukleotidokkal végzett kezeléstől a telomerhosszúság befolyásolását várjuk.
6. TÁBLÁZAT
A G4 foszfor-tioát oligonukleotidok telomerhosszúságra mutatott hatása öregedő fibroblasztokban
ISIS szám
Szekvencia
Szekv. száma
TT AGGG
5739 TT GGGG
5756 TT AGGG TT
5320 TT GGGG TT
5675 TT GGGG TT GGGG TT 40.
5651 TT GGGG TT GGGG TT GGGG TT GGGG 35.
TTTT GGGG
TTTA GGGG
5673
GGGG • · ··· ···· · • · ·· ··· ··· · • · · · · · • · · ·· ·· ·· ·
11. példa: A G4 foezfor-tioát oligonukleotidők különböző vírusok elleni aktivitása
Az influenza vírus, adenovírus, légzési szincitiális vírus, humán rhinovírus, vaccinia vírus, HSV-2 és varicella zoster vírus esetében az oligonukleotidok vírusellenes aktivitását a CPE gátlási vizsgálattal határoztuk meg. Az MTT sejt életképességi vizsgálatot a HIV-re gyakorolt hatások vizsgálatához alkalmaztuk. A HSV-2-t, adenovírust, vaccinia vírust és rhinovírust MA104 sejtekben vizsgáltuk. A légzési szincitiális vírust HEp-2 sejtekben, az influenza vírust pedig MDCK sejtekben vizsgáltuk. A HÍV gátlásának MTT vizsgálatához CEM sejteket alkalmaztunk. Az oligonukleotidokat a vírusfertőzéssel egy időben adtuk a sejtekhez.
Az MDCK (normális kutyavese) sejteket és a ΗΕρ-2-t (amely egy folvamatos humán epidermoid karcinoma sejtvonal) az American Type Culture Collection-tól (Rockville. MD) kaptuk. Az ΜΑ-104-et (African green majomvese folvamatos sejtvonal) a Whittaker M.A. Bioproducts-tól (Walkersville, MD) szereztük be.
A kísérletekhez E194 HSV-2 törzset és A/NWS/33 (H1N1) influenza törzset alkalmaztunk. Az Adenoid 75 törzsbe tartozó 5-ös típusú (A-5) adenovírust. a légzési szincitiális vírus (RSV) Long törzsét, a rhinovírus 2 (R-2) HGP törzsét. és a vaccinia vírus Lederle-chorioallantoic • · · · · · ··· ··· ··· · • * · · * törzsét az American Type Culture Collection-tói (Rockville,
MD) kaptuk.
A sejteket Eagle minimál, esszenciális tápközegben, az MA104 sejtek esetében
Grand Island, nem esszenciális aminosavak (MÉM. GIBCO-BRL.
NY), 9 % magzati borjúszérum (FBS, Hyclone
Laboratories,
Logan, ÜT).
és 0,1 %
NaHCOs oldat jelenlétében;
az MDCK sejtek esetében MÉM, 5 % FBS és
0,1 %
NaHC03 oldat jelenlétében;
a HEp-2 sejtek esetében pedig
MÉM, %
FBS és 0.2 % NaHCOs oldat jelenlétében tenyésztettük.
A HSV-2,
A-5 R-2 és vaccinia vírus hígításához a teszt tápközeg MEM-et.
% FBS-t, 0,18 %
NaHCO3 oldatot és 50 pg/ml gentamicint tartalmazott. Az influenza vírus hígításához a teszt tápközeg szérum nélküli
MEM-ből. 0.18 % NaHC03 oldatból. 20 ^g/ml tripszinből. 2,0 ^g/ml EDTA-ból és 50 pg/ml géntamicinbői állt.
A ribavirint az ICN Pharmaceuticals-tól (Costa Mesa. CA) kaptuk. Az acyclovirt és a 9-6-D-arabinofuranozil-adenint (ara-A) a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis. M0) szereztük be. A ribavirint, acyclocirt és az ara-A-t 0.18 % NaHCOs oldatot és 50 με/ml gentamicint tartalmazó, szérum nélküli MEM-ben készítettük és hígítottuk. Az oligonukleotidokat ugyanebben az oldatban hígítottuk.
A sejteket. 96 üregű, lapos aljú szövettenyésztő lemezekre 0,2 ml/üreg mennyiségben vittük fel, s egyrétegű tenyészet kialakítása érdekében egy éjszakán át inkubáltuk. A
- 59 • ·· · tenyésztő táptalajt dekantáltuk a lemezekről. A vegyületek hígításait akkor adtuk a lemez üregeihez (minden hígítást 4 üreghez, üregenként 0,1 ml mennyiségben), amikor a sejtleves elérte a kívánt végkoncentráció kétszeresét. A sejt és vírus kontroll üregekhez a vegyületek hígításához használt tápközeget adtuk (0,1 ml/üreg). A megadott teszt tápközegben hígított vírusokat valamennyi vegyület tesztelő üregbe (hígításonként három üregbe) és a vírus kontroll üregekbe 0,1 ml/üreg mennyiségben adtuk. A vírus nélküli teszt tápközeget valamennyi toxicitást kontrolláló üreghez (tesztvegyület hígításonként egy üregbe), és a sejt kontroll üregekhez 0,1 ml/üreg mennyiségben adtuk. A lemezeket 5 % CO2-ból és 95 % levegőből álló atmoszférájú, párásított inkubátorban 37 °C-on addig inkubáltuk. míg a vírus kontroll üregek megfelelő CPE értéket nem mutattak. A tesztelő és a vírus kontroll üregekben lévő sejteket ezután mikroszkóppal vizsgáltuk, és a citotoxicitás következtében kialakuló morfológiai változások alapján osztályoztuk. Az 50 %-os végpontú effektív dózist (EDso). és az 50 %-os végpontú citotoxikus dózist (CDso) a vírális CPE adatok, illetve a toxicitás kontroll adatok regressziós analízisével számítottuk. Az EDso érték a vegyület azon koncentrációját fejezi ki. amelyet a sejt kontrollok (0) és a vírus kontrollok CPE értékének különbsége felének eléréséhez számítottunk. A CDso érték a vegyület azon koncentrációját fejezi ki. amelyet a sejtekben látható változást nem okozó koncentráció. és a teljes citotoxicitást eredményező koncentráció különbsége feleként számítottunk. A terápiás • · · *
- 60 • · · · · · · ··· ···· · • ··· ··· ··· · • · · · « · • ·· «· ·* *· · indexet (TI) valamennvi anyag esetében a TI = CDso/EDco képlet szerint számítottuk.
Az oligonukleotid szekvenciákat az ISIS 3383 (122. számú szekvencia) és az ISIS 6071 oligonukleotid kivételével az 1. táblázatban mutatjuk be. Az ISIS 3383 oligonukleotid az ISIS 1082 (134. számú szekvencia) összekevert változata, az ISIS
6071 oligonukleotid pedig az ISIS 5320 összekevert változata. Az eredményeket a 7. táblázatban mutatjuk be. Ebben a vizsgálatban az 50 μΜ-nál kisebb EDso értékkel rendelkező oligonukleotidokat tartjuk aktívnak. s ezeket részesítjük előnyben.
7. TÁBLÁZAT
RNS és DNS vírusok elleni oligonukleotid aktivitás
Vegv. DNS vírusok RNS RSV vírusok Rhino HÍV Infl
HSV-2 vzv A-5 Vacc.
3383
EDec 2.8 ιΛΑ - >100 >100 0.7 >100 - 19
TI >36 - - - 60 - - >5
d. 15
EDso 0.8 29 >100 15 0,6 >100 0.16 0.6
TI >125 1.0 <1.0 >6.7 93 - 100 93
3657
EDeo 0.6 >100 >100 18 0,8 >100 - 1.0
TI >167 1.0 <1.0 >5.6 >125 — 56
···· • 4 · «·« ·« ♦ 4 «· 4
7. TÁBLÁZAT (folytatás)
DNS vírusok RNS vírusok
Vegy. HSV-2 VZV A-5 Vacc. RSV Rhino HÍV Infl.
4338
EDbo 0,6 - 68 19 1,0 >100 - 0,5
TI >53 - >1,5 >5,3 13 - - >200
1220
EDbo 0,7 - >50 46 - >50 - -
TI >71 - - >1,1 - - - -
5652
EDbo 0,3 18 >100 - 1.9 >100 0.18 0,6
TI >333 - <1,0 - >53 - 227 93
ACV
EDso 97,7 - - - - - - -
TI >45 — — — — — —
Ribavirin
ED50 - - 82 - 49 229 — 7.78
TI - - 28 - 20 10 - 202
Ara-A
EDbo - - - 15.8 - - - -
TI - - - 125 - - - -
5320
EDbo 4 >100 >100 >100 - - 0.4 40
TI - - - - - - 390 -
607 1
EDbo >100 >100 >100 >100 - - 50 >100
TI — — — — — - — -
4« · '♦ •44 ·«· — 82 —
12. példa: Az oligonukleotldok tesztelése HSV-1 elleni aktivitásra
Olyan foszfor-tioát oligonukleotidokat szintetizáltunk, amelyek komplementerek a HSV-1 RNS citozinok cluster-eit tartalmazó régióival. Az oligonukleotidokat a 8. táblázatban soroljuk fel.
8. TÁBLÁZAT
HSV-l-et célzó foszfor-tioát oligonukleotidok (a szekvenciákat 5'-3' irányban írjuk le)
ISIS Cél Target Szekv.
szám Szekvencia (target) funkciója száma
1220 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GGC UL9. AUG Őri kötő protein 1
4274 CAT GGC GGG ACT ACG GGG GCC UL27.AUG virion gB 8
4338 ACC GCC AGG GGA ATC CGT CAT UL42.AUG DNS kötő 12
protein
4346 GAG GTG GGC TTC GGT GGT GA UL42. 5'UTR 123
3657 CAT CGC CGA TGC GGG GCG ATC IE175. transzkrip. 16
AUG transzakt ivátor·
4015 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG UL29. 5'UTR ssDNS kötő protein 21
4398 CAC GGG GTC GCC GAT GAA CC UL29. 5'UTR 28
4393 GGG GTT GGG GAA TGA ATC CC UL29. 5'UTR 124
4348 GGG TTG GAG ACC GGG GTT GG UL29. 5'UTR
125.
• ·» ·· ·*44«· *· · · 4 « «4 • ··· ·ί· ·«·4 • 9 · ·· «
999 99 *· 4«·
8. TÁBLÁZAT (fοlytatá 8)
ISIS
Cél Target Szekv.
szám Szekvencia (target) funkciója száma
4349 GGT TGG AGA CCG GGG TTG GG UL29, 5'UTR 126.
4341 TGG AGA CCG GGG TTG GGG AA UL29, 5'UTR 127.
4342 TTG GAG ACC GGG GTT GGG GA UL29, 5'UTR 128.
4350 GAC GGT CAA GGG GAG GGT TGG UL29 , 5'UTR 129.
4435 GGG GAG ACC GAA ACC GCA AA UL20 . 5'UTR vírus 130.
kiáramlás
4111 CCT GGA TGA TGC TGG GGT AC UL30, kódoló DNS 131. polimeráz
4112 GAC TGG GGC GAG GTA GGG GT UL30, kódoló 132.
4399 GTC CCG ACT GGG GCG AGG AT UL30, kódoló 133.
(UTR: tre.nazl61atlan réslő)
A 8. táblázatban bemutatott oligonukleotidokat a 3. példában leírtak szerint ELISA vizsgálat alkalmazásával HSV-1 (KOS törzs) elleni aktivitásra teszteltük. Az eredményeket a kezeletlen kontroll eredményekből minden százalékaként fejezzük ki. Ezen egyes oligonukleotidra ECso értéket ( 50
át 1 ást.
biztosító hatásos oligonukleotid koncentráció) számítottunk. Ezen értékeket (M4~ban kifejezve) a 9. táblázatban mutatjuk be. Ebben az ELISA vizsgálatban az 1 /W vagy kisebb ECeo értékkel rendelkező oligonukleotidokat különösen jó aktivitásúnak ítéltük, s ezeket részesítjük előnyben. Az ISIS 1082 negatív kontroll
oliecnukleotid (amely komplementer a HSV UL13 transzlációs kezdő kodonjával, és nem rendelkezik guanin szakasszal) a kétszeri ismétléssel végzett kísérletekben 2,5 és 1,8 μΜ ECso értéket mutatott.
9. TÁBLÁZAT
Az oligonukleotidők HSV-l-et gátló hatása (valamennyi ollgonukleotid foszfor-tioát)
ISIS szám ECeo
1220 0.24; 0.16
4274 0,15; 0,15
4338 0.20; 0.20
4346 0.50
3657 0.20
4015 0.22: 0.22
4398 0.10
4393 0.20
4348 0.40
4349 0.25
4341 0.20
4342 0.20
4350 0.25
4435 0.22
4111 0.60
4112 0.30
4399 0.25
• ·· · · · · ·· • · » · · · · • ♦·· » · · ··· • · · · · · ··· ·· ·· ·· · * néhány kísérletet kétszeri ismétléssel végzetünk
13. példa: A G4 foszfor-tioát oligonukleotidok különböző HSV törzsek elleni aktivitása
Az ollgonukleotidokat HSV-2 és öt HSV-1 törzs ellen (melyek közül kettő, a HSV1-DM2.1 és a HSVl-PAAr, rezisztens az acyclovirra [ACV]) teszteltük. Az ollgonukleotidokat a 3. példában leírtak szerint ELISA vizsgálat alkalmazásával vizsgáltuk. s az eredményeket a 10. táblázatban közöljük. Ebben a vizsgálatban az 1 μΜ vagy kisebb ECbo értékkel rendelkező ollgonukleotidokat ítéltük különösen aktívnak, s ezeket részesítjük előnyben.
10. TÁBLÁZAT
Oligonukleotidok különböző HSV törzsek elleni aktivitása (az eredményeket jH-ban kifejezett ECbo értékként adjuk meg)
HSV törzs 4015 ( 21. ) Vegyület (szekvencia száma)
1220 ( 1. > 3657 ( 16. 4338 ) (12 . ) 4274 ( 8. ' 1082 ( 134. ACV )
HSV—1 (KOS> 0.25 0.34 0.38 0.24 0.21 2.1 2.5
HSV-2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.2 2.0 2.0
HSV1-F 0.22 0.22 0.22 0.25 0.25 >3.0 0.7
HSVl-McKrae 0.45 0.30 0.40 0.6ú >3.0 1.8
HSV1-DM2.1 0,10 0.10 0.10 0.70 0.40 >3.0 >3.0
HSVl-PAAr 0.35 0.12 0.10 0,30 0.25 >3.0 >3,0
• · · · · ·· ···· • · · ···· · • · ·· ··· ··· · • · · · · · ··· ·· ·· · · ·
14. példa: Az oligonukleotid hozzáadása időpontjának hatása a HSV-1 Ga foszfor-tioát oligonukleotidok általi gátlására
NHDF sejteket HSV-1 (KOS) vírussal 3.0 pfu/sejt MOI értékkel fertőztünk. Az oligonukleotidokat. illetve az ACV-t 12 mM koncentrációban a fertőzés után különböző időpontokban adtuk a sejtekhez. A HSV-t 48 órával a fertőzés után ELISA vizsgálattal detektáltuk. Azt találtuk, hogy ha a vírusfertőzéssel egy időben (t=0) adtuk a sejtekhez, valamennyi oligonukleotid. beleértve az összekevert szekvenciájú 3383-as kontroll oligonukleotidot is, gátolta a HSV replikációt, de abban az esetben, ha a vírusfertőzés után adtuk a sejtekhez, csak a HSV génekkel komplementer oligonukleotidok (ISIS 4274, 1220, 4015 és 3657) gátolták a HSV replikációt. Az oligonukleotidok a fertőzés után 8-11 órával adva jó vírusellenes aktivitást mutattak. Ez a jelenség hasonlít az ACV-vel kapcsolatban megfigvelthez (ld.
7. ábra).
15. példa: Kiméra 2'-0-metil G4 oligonukleotidok dezoxi résekkel (deoxy gap“)
Olyan foszfor-tioát oligonukleotidok sorozatát szintetizáltuk. mely oligonukleotidok a szélső régiókban mindegyik nukleotid cukor részén 2'-0-metil szubsztituenst. az oligonukleotid központi szakaszán pedig 2'-dezoxinukleotidokat (dezoxi rés) tartalmaznak. A dezoxi rések hosszúsága 0 nukleotidtól 7 nukleotidig változik. Ezeket a kimére oligonukleotidőket a 3. példában leírtak szerint ELISA módszerrel vizsgáltuk. s az eredményeket a 11. táblázatban mutatjuk be. Ebben a vizsgálatban az 1 /ü vagy kisebb ECso értékkel rendelkező oligonukleotidokat ítéltük különösen aktívnak, s ezeket részesítjük előnyben.
11. TÁBLÁZAT
2'-O-metil G< oligonukleotidok HSV elleni aktivitása (a 2‘’-0-metil-nukleotidokat vastag betűvel jelöljük)
ISIS Szekvencia Cél ECso Szekv.
szám (target) Típus (μΜ) száma
1220 CAC GGA AGG CAT GAC CGG GGC UL9.AUG eredeti 0.24: (dezoxi) 0.16 1.
4240 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GGC UL9.AUG dezoxi rés 1.
3657 CAT CGC CGA TGC GGG GGG ATC IE175.AUG eredeti 0.20 16.
< dezoxi )
5377 CAT CGC CGA TGC GGG GCG ATC 2'-0-Me 1.20 16.
4237 CAT CGC CGA TGC GGG GCG ATC dezoxi rés 16.
4015 GTT GGA GAC GGG GGT TGG GG UL29.5'tJ' TR eredeti 0.22 21.
< dezoxi) 0.22
4538 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG dezoxi rés 0.16 21.
5378 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG 2'-0-Me 0.40 21.
4398 CAC GGG GTC GCC GAT GAA CC eredeti 0.10 28.
(dezoxi >
5039 CAC GGG GTC GCC GAT GAA CC 2'-0-Me 2.70 28.
5189 CAC GGG GTC GCC GAT GAA cc .. dezoxi rés 0.16 28.
··· *··
Az ISIS 4015 és ISIS 4398 szekvenciáival rendelkező további kiméra oligonukleotidokat szintetizáltunk, melyek dezoxi résekkel rendelkező 2'-0-metil-oligonukleotidok voltak, de ezek a vegyületek az egyöntetű foszfor-tioát gerincváz helyett a dezoxi rés régióban foszfor-tioát nukleotidok közötti kötésekkel, a szegélyező régióban pedig foszforsav-diészter kötésekkel rendelkeznek. Ezek az oligonukleotidok az ELISA vizsgálatban nem voltak aktívak a
HSV ellen.
További olyan oligonukleotidokat szintetizáltunk, amelyek 2'-0-propil szubsztituenseket tartalmaznak. A 2'-0-propiloligonukleotidokat A, G, U(T) és C nukleinsav bázisok 2'-dezoxi-2'-0-propil-ribozid.iaiból állítottuk elő. mely utóbbiakat B.S. Sproat és mtsi. (Nucleic Acids Research, IS, 41-49. 1990) és H. Inoue és mtsi. (Nucleic Acids Research,
15. 6131-6148.
1987) által leírt irodalmi eljárások módosításával állítottuk elő.
foszfor-tioát oligonukleotid.
Az ISIS 7114 olyan amely az ISIS 4015-tel megegyező szekvenciával (21. számú szekvencia) rendelkezik, s mindegyik cukron 2'-0-propil szubsztituenst tartalmaz. Az ISIS 7171 az ISIS 4015-tel megegyező szekvencival rendelkező. foszfor-tioát szakaszt tartalmazó 2-0-propil oligonukleotid. amely 1-7 és 14-20 helyzetben 2'-0-propil szubsztituenst tartalmaz (6-dezoxi rés). Amint a 8. ábrán látható mindhárom oligonukleotid aktív a HSV-vel szemben. Az
ISIS 3657 (16. számú szekvencia) 2'-0-propil foszfor-tioát változatát is szintetizáltuk. s HSV-1 elleni aktivitásra teszteltük. Amint a 9. ábrán látható, ez az oligonukleotid (ISIS 7115) az ISIS 3657-nél is aktívabb volt. Ennek megfelelően, az 2'-0-propil módosítások a találmány előnyben részesített megvalósítási módjait képezik. A 9. ábrán az is látható, hogy az ISIS 3657 és ISIS 7115 többszörösen aktívak, mint az Acyclovir, amely viszont aktívabb, mint az ISIS 3383 kontroll oligonukleotid.
16. példa: Kémiai módosítások hatása a HSV-1 G< oligonukleotidok által történő gátlására
Inozin szubsztitúciók
Olyan oligonukleotidok sorozatát állítottuk elő. melyekben egy vagy több guanozint inozingyökkel helyettesítettünk. Az inozingyököket tartalmazó oligonukleotidokat a módosítatlan DNS oligonukleotidokhoz hasonlóan. a Glen Research-tól beszerzett inozin-foszforamiditek alkalmazásával szintetizáltuk. Ezeket a szekvenciákat a 3. példában leírtak szerint ELISA módszerrel vizsgáltuk az aktivitásra. Ezen oligonukleotidokat és eredeti (származási) szekvenciáikat, illetve az ECeo értékeket a 12. táblázatban mutatjuk be.
12. TÁBLÁZAT
Inozinnal szubsztituált oligonukleotidok HSV elleni aktivitása
ISIS Szekvencia Cél EC50 ! Szekv
szám (target ) Típus (μΜ) száma
1220 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GGC UL9,AUG eredeti 0,24; 1
0,16
5297 CAC GAA AGG CAT GAC CGI GGC inozin 18 >3.0 135
5308 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GIC inozin 20 >3,0 136
4015 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GG UL29. eredeti 0,22; 21
5'UTR 0,22
4925 GTT GGA GAC CGG IGT TGG IG inozin 13. 1.60 137
19
5295 GTT GGA GAC CGG GIT TGG GG .. inozin 14 >3,0 138
5296 GTT GGA GAC CGG GGT TGG IG inozin 19 0.80 139
5309 GTT GGA GAC CGI GGT TGG GG inozin 12 >3.0 140
5310 GTT GGA GAC CGG GGT TGG GI inozin 20 0.40 141
Ebben a vizsgálatban az 1 M4 vagy kisebb ECso értékkel rendelkező oligonukleotidokat ítéltük különösen aktívnak, s ezeket részesítjük előnyben.
Fluorszceinnel kon.iugált oligonukleotidok
Számos, a molekula 5' végéhez konjugált fluoreszcein gyököt «* tartalmazó ο 1igonukleotidőt szintetizáltunk. A fluorszceinnel konjugált oligonukleotidokat a Glen Research-tól beszerzett, fluoreszcelnnél Jelölt amiditek alkalmazásával szintetizáltuk.
Ezeket a szekvenciákat a 3. példában leírtak szerint ELISA módszerrel vizsgáltuk az aktivitásra. Ezen oligonukleotidokat és eredeti (származási) szekvenciáikat, illetve az ECco értékeket a 13. táblázatban mutatjuk be.
Ebben a vizsgálatban az 1 juM vagy kisebb ECso értékkel rendelkező oligonukleotidokat ítéltük különösen aktívnak, s ezeket részesítjük előnyben.
• · · · · · * • · · · · · · • ··· ··· ··· · • · · · · · < Δ
13. TÁBLÁZAT
Fluoreszceinnel konjugált oligonukleotidok HSV elleni aktivitása
ISIS Szekvencia Cél EC50 Szekv.
szám (target) Típus (pM) száma
1220 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GGC UL9, eredeti 0,24; 1.
AUG 0,16
5338 CAC GAA AGG CAT GAC CGG GGC · fluoreszcein 0,16 1.
3657 CAT CGC CGA TGC GGG GCG ATC IE175.AUG eredeti 0,20 16.
5340 CAT CGC CGA TGC GGG GCG ATC fluoreszc. 0,18 16.
4398 CAC GGG GTC GCC GAT GAA CC UL29, eredeti 0,10 28.
5'UTR
5324 CAC GGG GTC GCC GAT GAA CC ·· · fluoreszcein 0,16 28.
1082 GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC UL13, eredeti 2.50: 134.
AUG 1.80
5339 GCC GAG GTC CAT GTC GTA CGC fluoreszc. 0.65 134.
7-me til-' aza-i guanoain szubsztitúciók
A monomer előállítása:
0.8 g ' 20 mmól) 60 %-cs nátrium-hidrid hexán diszperzióban kevert szuszpenzióját dekantáltuk. szárítottuk. 100 ml vízmentes acetonitrilben reszuszpendáltuk. s a szuszpenzióhoz 3,21 g (15 mmól) 4-klór-5-met.il-2-(metiltio)-pirroloC2.3-d]pirimidint (Kondo és mtsi, Aeric. Bioi.
Chem.. 4, 1501-1507, 1977) adtunk. Az elegyet • ·· · · ·· ···· ·«· ···· · » ··· · · · ··· · • · a · · ·
- 73 szobahőmérsékleten. nitrogéngáz alatt egy óráig kevertük, majd részletekben 5,9 g (15 mmól) l-klór-2-dezoxi3,5-di0-(p-toluoil )-<t-D-eritro-pentofuranózt adtunk hozzá. Az elegyhez további 40 ml acetonitrilt adtunk, s 50 ’C-on kb.
3.5 óráig kevertük, majd leszűrtük. s a szilárd anyagot acetonitrillel mostuk és szárítottuk, miáltal 6,1 g (72 %)
4- klór-5-metil-2-(metil-tio)-7-(α-D-eritro-pentofuranozil)pirrolo[2,3-d]pirimidint kaptunk (op.: 163-163,5 ’C).
E termék DMF-ben 2-propenil-oxiddal végzett reakciója
5- metil-2- (metil-tio )-4-( 2-propenil-oxi )-7-( *:-D-eritro-pentofuranozil)-pirrolo[2,3-d]pirimidint eredményezett, amelyet metilén-kloridban két mól egyenérték 3-klór-perbenzoesawal oxidálva 5-metil-2-(metil-szulfonil)-4-(2-propenoil-oxi)-7- (ac-D-eritro-pentofuranozil)-pirrolo[2,3-d]pirimidint kaptunk.
E termék hidrazinnal végzett reakciójával 5-metil-2hidrazino-4-(2-propenoil-oxi)-7-(ac-D-eritro-pentofuranozil)pirroΙοΓ2.3-d]pirimidint állítottunk elő. A termék pl. Ranev nikkellel végzett redukciójával 7-deaza-2'-dezoxi-7-metilguanozint kaptunk.
A monomer védése:
Az előző lépésben kapott terméket piridin jelenlétében trimetil-klór-szilánnal. majd izovajsav-hidroxiddal kezeltük. miáltal 2-izobutiril-7-deaza-2'-dezoxi-7-metilguanozint kaptunk. amelyet, vízmentes piridin jelenlétében egy mól ekvivalens tritil-kloriddal reagáltatva
2-izobutiril-7-deaza-2'-dezoxi-7-metil-5'-tritil-guanozint • ·· • · kaptunk. Εξ utóbbi egy mól ekvivalens klór-β-(cianoetoxi)-N,N-diizopropil-amino-foszfinnal végzett reakciójával
2-izobutiril-7-deaza-2'-dezoxi-7-metil-3'-0-ΓΝ,N-diizopropilamino)-6-ciano-etoxi-foszfanil]-5'-tritil-guanozint kaptunk. Ezt a védett monomert az automatizált szintézis során oligonukleotidokba építettük.
Az ISIS 3657-tel megegyező szekvenciával rendelkező oligonukleotidot szintetizáltunk, melyben a 14-es és 15-ös helyzetben lévő guanozint 7-metil-7-deaza-guanozinnal helyettesítettük. Azt találtuk, hogy ezen oligonukleotid (ISIS 6303) IC50 értéke hozzávetőleg 10 /jM.
17. példa: Az ISIS 4015 oligonukleotid más vírusellenes szerekkel együttes aktivitása
Az ISIS 4015 oligonukleotidot a 3. példában leírt ELISA vizsgálattal az 5-(trifluor-metil)-dUrd (TFT) nukleozid analóggal kombinálva teszteltük. melynek során mindkét vegyületet 0-2 f.iá koncentrációban alkalmaztuk. Amint a 10. ábrán látható. az ISIS 4015 fokozza a TFT HSV-1 elleni akt ivitását.
Az ISIS 4015 oligonukleotidot hasonló módon, a 9-(2-hidroxietoxi-metil)-guaninnal (Acyclovir. ACV ) szemben teszteltük.
Az oligonukleotidot 0-2 /.i-1. az ACV-t pedig 0-16 μΜ koncentrációban alkalmaztuk. Amint a 11. ábrán látható, a két drog együttes hatása additívnak mutatkozott.
18. példa:
A G4 • ·· ·· · · ···· ··· ···« · • ··· ··· ··· · • · · · · · •·« ·· ·· ·· · szekvenciát tartalmazó 8-mer oligonukleotidok HSV-1 elleni
A 3. példában leírt ELISA aktívnak talált
8-mer aktivitása vizsgálatban a HSV-1 ellen foszfor-tioát oligonukleotid (Ecker,
1853-1956, 1993) az ISIS 5684 a oligonukleotid azonosítására progresszív randomizálatlan stratégiát
D.J. és mtsi, Nucl. Acids Rés., 21.
alkalmaztunk.
A “győztes oligonukleotid
GGGGGGTG szekvenciával rendelkezett. Ezen
EDso értéke hozzávetőleg 0.6 pM volt.
G4 szekvenciát tartalmazó
8-mer foszfor-tioát oligonukleotidok sorozatát szintetizáltuk, s ezeket a 3.
példában leírt HSV-1 ELISA vizsgálattal teszteltük. Ezeket az oligonukleotidokat a 14. táblázatban mutatjuk be.
14. TÁBLÁZAT
A G4 szekvenciát tartalmazó, rövid oligonukleotidok anti-HSV aktivitása
ISIS : =zám Szekvencia
5060 GTGGGGTA
6170 GTGGGGTG
5684 GGGGGGTG
5058 GCGGGGTA
• · ♦ · • · · · · • ·· ·«· · • · * · · — / 6 Amint a 12. ábrán látható, ezen ο 1igonukleotidők mindegyike μΜ alatti ICeo értékkel rendelkezik. s ilyenformán előnyben részesítettek. E 8-merek közül több nagyobb aktivitással rendelkezik, mint az ISIS 4015 20-mer.
HÍV ellen aktív Gx olIgonukleotidők
19. példa: Oligonukleotid könyvtár szintézise
A foszfor-tioát oligonukleotidokat standard eljárások szerint szintetizáltuk. A kénes kezelést oxidálószerként 3H-1.2-benzo-ditiol-3-on-l.1-dioxid (Beaucage reagens) alkalmazásával hajtottuk végre (Iyer, R.P., Phillips, L.R., Egan. W.. Regan. J.B. és Beaucage. S.L.. J. Őre. Chem.. 55. 4693-4699. 1990). A véletlenszerű elrendeződésű oligonukleotidők előállításához az amiditeket az ABI 394-es szintetizátor ötödik nyílásán egy fiolában kevertük össze. Az elegyet úgy teszteltük. hogy dT-CPG-hez kapcsoltuk, a terméket lehasitottuk, eltávolitottuk a védoosoportokat.. és a nyers anyagot reverz fázisú HPLC-vel analizáltuk. Az egyes amiditek arányát úgy állítottuk be. hogy a négy dimer egyenlő mennyiségeit kapjuk. A DMT-off oligonukleotidokat és a védocscportok eltávolítása érdekében gradienssel. reverz-fázisú HPLC-vel
Több tisztított oligonukleotidot. nukleázzal végzett teljes emésztéssel, és az azt követő reverz fázisú HPLC-vel bázisösszetételre analizáltunk, s valamennyi bázis esetében a várt arányokat kaptuk.
a seraianiras metanol/víz tisztítottuk.
Alfa-konfigurációjú slikozidos kötéssel rendelkező oligonukleotidokat korábbi leírás szerint szintetizáltunk (Morván, F. . Rayner, B., Imbach, J-L., Thenet, S., Bertrand, J-R. , Paoletti. J., Malvy. C. és Paoletti, C. . Nucleic Acids Rés.. 1£. 3421-3437. 1993). A biotint a Glen Research-tól származó; biotin-kötött CPG alkalmazásával végzett szintézis során építettük be. A T2G4T2 oligonukleotidőt (ISIS 5320) a sók és a védőcsoportok eltávolítása érdekében reverz fázisú kromatografiával, majd a tetramer tisztítása érdekében (ld. 21. példa) méret kizárásos kromatografiával tisztítottuk.
A vírusellenes vizsgálat előtt az oligonukleotidokat 40 mM nátrium-foszfát oldatban (pH - 7,2) és 100 mM KC1 oldatban ImM koncentrációra hígítottuk. Az extinkciós koefficienst Puglisi és Tinoco leírása szerint határoztuk meg (Methods in Enzimoloey. RNA Processing. szerk.: Dahlberg. J.E. és Abelson. J.N.. CAcademic Press. Inc.. New York] 180. kötet.
pp. 304-324. A mintákat a sterilizálás érdekében 0.2 um-es cellulóz-acetát filtereken szűrtük.
20. példa: Akut HIV-1 vizsgálat
Az oligonukleotidokat akut HIV-1 fertőzéses vizsgálatban osztályoztuk. amely a HÍV által indukált citopatológiás hatások elleni védelmet méri. A CEM-SS se.itvonalat (Nara. P.L. és Fischinger, P.J.. Natúré. 332. 469-470. 1988) 10 %-os magzati borjúszérummal. 2 mM glutaminnal. penicillinnel (100 egység/ml) és sztreptomicinnel (100 ;;g/ml) kiegészített ·· ·· · < ··«· * · · · · · • ·· ··· ··· · • ♦ · b ·
RPMI 1640 tápközegben tartottuk. A HÍV által indukált sejtpusztulással szembeni drog-indukálta védelem mennyiségi meghatározásához XTT-tetrazolium alkalmazásával végzett antivirális vizsgálatot White, E.L.. Buckheite, Jr., R.W., Ross. L.J.. Germany. J.M.. Andries. K. . Pauwels, R.. Janssen, P.A.J., Shannon, W.M. és Chirigos, M.A. írták le {Antiviral Rés., Ifi, 257-266, 1991).
21. példa: Tetramer karakterizálás
Az oligonukleotidok monomer és tetramer formáit Pharmacia Superdex HR 10/30 méret kizárásos oszlopon (Pharmacia. Upsalla, Svédország) választottuk el. A futtató puffer 25 mM nátrium-foszfát oldatból (pH = 7,2) és 0,2 mM EDTA-ból állt. Az átfolyási sebesség 0.5 ml/perc volt, s a detektálást 260 nm-nél végeztük. A monomer és tetramer csúcsokat összegeztük. és meghatároztuk a tetramer frakciót. A tisztításhoz 10 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH = 7.2) Pharmacia Superdex 75 HiLoad 26/60 oszlopot alkalmaztunk (az átfolyási sebesség 2 ml/perc volt).
A tetramer disszociálódása a hígítás után következett. Az oligonukleotid 1 mM oldatát PBS-ben (137 mM MaCl: 2.7 mM KC1: 1.5 mM kálium-foszfát, egybázisú: 8 mM nátrium-foszfát, kétbázisú) 10 /jM koncentrációra hígítottuk. s 37 °C-on inkubáltuk. A T2G4T2 szekvenciával K* alakban rendelkező foszfor-t ioát. oligonukleotidokat. és a foszforsav-diészter T2G4T2 oligonukleotidot 40 mM nátrium-foszfát (pH - 7.2) és
100 mM KC1 oldatból hígítottuk. A T2G4T2 szekvenciával Na* alakban rendelkező oligonukleotidőt 40 mM nátrium-foszfát (pH = 7.2) és 100 mM NaCl oldatból hígítottuk. Az idő függvényében lejátszódó disszociációt méret kizárásos kromatográfiával követtük nyomon.
Amint a T2G4T2 és e'Ti3G4T43' szekvenciával (142. számú szekvencia) rendelkező foszfor-tioát oligonukleotidok által képzett komplexek analízisével meghatároztuk, a kialakult tetramerek párhuzamos szálúak voltak.
Valamennyi oligonukleotidőt az 5' végén 32P izotóppal jelöltük.
Mindegyik minta egyik vagy mindkettő oligonukleotid 125 jelöletlen.
és pM radioaktívan jelölt mennyiségét tartalmazta.
mintákat percig 50 mM nátrium-foszfát (pH
7.2) és
200 mM
KC1 oldatban forró vízfürdőben melegítettük.
majd 4 ’C-on 48 óráig inkubáltuk. A mintákat % nem denaturáló °z poliakrilamid (19:1 akrilamid:bisz) gélen. 4 ’C-on 1
TBE futtató pufferben futtatva autoradiográfiával analizáltuk.
22. példa: A HÍV által indukált sejtfúzió vizsgálata
HIV-1 vírussal krónikusan fertőzött. sztöchiometrikus mennyiségű Hűt 78 (Hut/4-3) sejteket és LTR által működtetett lac z gént tartalmazó CD4+ HeLa sejteket. 20 óráig oligonukleotid .jelenlétében vagy hiányában együtt tenyésztettünk. A sejteket rögzítettük (PBS-ben 1 % formaldehid és 0.2 % glutár-aldehid). s X-gal-lal addig
inkubáltuk. mié a sejtekkel kapcsolatos szín ki nem fejlődött. A puffer eltávolítása után a β-galaktozidáz expresszió mennyiségi meghatározásához standard onitrofenil-G-D-galaktopiranozidot alkalmaztunk. Kontrollként az LTR által működtetett lac Z gént tartalmazó HeLa CD4+ sejteket a kalcium-foszfátos módszer alkalmazásával 30 ug provírus DNS-sel (pNL 4-3) transzfektáltuk. Az oligonukleotidokat közvetlenül a glicerolos sokk után adtuk a sejtekhez. A sejteket a transzfekció után 48 órával rögzítettük, s a fenti módon vizsgáltuk.
23. példa: Az ISIS 5320 oligonukleotid kötődése a gpl20-hoz
A gpl20-hoz való közvetlen kötődést CD4 befogó ELISA kit-ből (American Bio-technologies) származó, immobilizált gpl20 alkalmazásával vizsgáltuk. A biotinilált oligonukleotidokat (melyeket a Glen Research-tól beszerzett, biotin-kötött CPG alkalmazásával végzett szintézis sorám biotiniláltunk) 100 ul térfogatban immobilizált gpl20-szal inkubáltuk. Egy óra elteltével az inkubáló üregeket mostuk, és mindegyik üreghez PBS-ben 1:1000 arányban hígított 200 μΐ sztreptavidin lúgos foszfatázt (Gibco BRL) adtunk. Szobahőmérsékleten egy óráig végzett inkubálás után az üregeket mostuk, és PNPP szubsztrátot (Pierce) adtunk hozzájuk. A lemezeket 37 °C-on inkubáltuk. s az abszorbanciát 405 nm-nél Titertek Multiscan MCC/340 ELISA lemezdetektorral mértük.
A gpl20 kötését illetően meghatároztuk az ISIS 5320 dex.trán-szulfáttal kcnkurráló képességét. Az immobilizált gpl20-at tartalmazó lemezekhez a .jelzett koncentrációjú dextrán-szulfáttal (Sigma. Mr· = 5000) együtt 0,5 μΜ biotinilált ISIS 5320-at adtunk. Egy órás inkubálás után a gpl20-szal kapcsolódott oligonukleotid mennyiségét a fentebb leírt módon határoztuk meg.
Az ISIS 5320 gpl20-hoz való kötődésének helyét a protein különböző régióira specifikus antiszérum kötődésének kompétícióJávái határoztuk meg (Rusche, J.R. és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 34- 6924-6928, 1987: Matsushita, S. és mtsi, J. Virol. . Q2.. 2107-2114, 1988; Meuller. W.T. és mtsi.
Science, 234. 1392-1395, 1986). gpl20-szal bevont mikrotiter lemezeket 25 μΜ koncentrációjú oligonukleotiddal szobahőmérsékleten egy óráig inkubáltunk. Az antiszérumot 1:250 arányú hígításban adtuk a lemezekhez, s 40 percig inkubáltuk. A lemezeket. PBS-sel négyszer mostuk, s a kötött
antitest mennyiségét PES-ben A.G protein - lúgos foszfatáz
(1:5000. Pierce) eleggyel szobahőmérsékleten egy órán át
végzett inkubálással határoztuk meg. Egyszeri, PBS-sel
végzett mosás után a lemezhez hozzáadtuk a szubsztrátot. s
az abszorbanciát 405 nm-nél mértük.
Meghatároztuk az ISIS 5320 sejteken expresszált gpl20-hoz. CD44-hez és CD4-hez való kötődését is. HIV-1 env c gént tartalmazó HeLa sejteket. < Gama Soma. M.A. és mtsi. Biochem. Bioohys. Rés. Comm.. 151. 305-311. 1989; és Ruprecht. R.M.
és mtsi. J. Acguir. Immuné Defic. Svndr.. 4. 48-55. 1991) 10
% FCS-sel és
100 μα/pl G-418-cal kiegészített DMEM-ben tenyésztettünk.
A gp!20-hoz való kötődés mértékét 1 pg FITCvei konjugált egér anti-gpl20
HIV-1 IIIB mAb IgG (Agmed) alkalmazásával detektáltuk.
CD44 kötést 1 pg FITC-vel konjugált egér anti-CD44 mAb IgG (Becton-Dickinson) alkalmazásával detektáltuk.
Valamennyi kísérlethez 200 000 sejtet alkalmaztunk. A sejteket 0,05 % NaN3-ot tartalmazó tenyészet tápközegben egyszer mostuk, majd az oligonukleotidot tartalmazó 100 pl tápközegben reszuszpendáltuk, s 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az antitest hozzáadása után az inkubálást 4 ’C-on egy óráig folytattuk. A sejteket PBS-ben kétszer mostuk. s az immunfluoreszcenciát Becton-Dickinson FACScan alkalmazásával mértük. Az átlagos fluoreszcencia intenzitást Lysis11 software alkalmazásával határoztuk meg.
CEM-T4 sejteket (Foley, G.E. és mtsi. Cancer, 18. 522-529.
1965' 10 % FCS-sel kiegészített MEM-ben tartottunk. A CD4-hez való kötődés mennyiségét 1 pg Q425 (egy egér antiCD4 mAb IgG) (Healey. D. és mtsi. J. Exp. Med. . 172. 1233-1242. 1990) alkalmazásával határoztuk meg. A sejteket begyűjtöttük. mostuk. és a fentiek szerint az oligonukleotiddal inkubáltuk. Az antitesttel szobahőmérsékleten 30 percig végzett inkubálás után a sejteket mostuk. és 5 pg kecske F(ab')z anti-egér IgG-t (Pierce) tartalmazó 100 pl tárközegben mostuk. A sejteket 30 percig inkubáltuk. mostuk, és a kapcsolt fluoreszcenciát a fentiek szerint határoztuk meg.
··
24. példa: A TzG^Ts» szelektálása és karakterizálása
A 19. példában leírtak szerint a nyolc nukleotid valamennyi lehetséges kombinációját tartalmazó foszfor-tioát oligonukleotid könyvtárat készítettünk. melyet 16 részre osztottunk, melyek mindegyike 4096 szekvenciából állt. A könyvtárat a 21. példában leírtak szerint a HÍV fertőzés gátlására screeneltük. Az eredményeket a 15. táblázatban foglaljuk össze.
15. TÁBLÁZAT
Kombinatorikus pool-ok X=A X=G X=C X=T
1. kör
NNA NXN NN inakt iv inakt ív inaktív inaktív
NNG NXN NN inaktív 19,5 (5%) inaktív inakt ív
NNC NXN NN inaktív inaktív (0%) inaktív inaktív
NNT NXN NN inaktív inaktív inaktív (0%) inaktív
2. kör
NNG XGN NN 60,7 1.8 (36%) 55.6 56.2 (3%:
3. kör
NNG GGX NN 8.0 0.5 (94%) 3.1 (19%* ) 8.6
4. kör
NAG GGG XN 0.5 0,5 0.5 0.5 (87%
NGG GGG XN 0,5 0.6 (99%*) 0.4 0.5
NCG GGG XN 0.7 0.6 0.5 (91%) 0.4
··· « • · · · 0 · ·· · ·· ·· ♦· ·
- 84 15. TÁBLÁZAT (folytatás)
Kombinatorikus pool-ok X=A X=G X=C X=T
NTG GGG XN 0,4 (82%) 0,5 0,4 0,5
5. kör
XTG GGG TN 0,2 (92%) 0,6 (89%*) 0,3 (94%) 0,3 (94%)
6. kör
TTGGGGTX 0.6 (90%) 0,6 0,5 0,3 (93%)
A random helyek (N) valamennyi bázis ekvimoláris elegyét jelentik. A vírusellenes adatokat a vírus által indukált sejtpusztulás 50 %-os gátlásához (ICco) szükséges hatóanyag mennyiségként (az oligonukleotid szál koncentrációjában) adtuk meg. Az ICso érték hibája ± 0,1 μΜ.
Az inaktív pool-ok 100 /jM koncentrációban nem mutattak vírusellenes aktivitást. A %-os tetramer arányt, amint a 21. példában leírtuk, a kiválasztott pool-oknál zárójelben adjuk meg. A csillagok a többszörösen aggregált formákat jelzik.
Az in vitro vizsgálattal a sejtek HÍV által indukált citopatológiás hatásokkal szembeni védettségét mértük (White. E.L. és mtsi. Antiviral Ess.. 16. 257-266. 1991). A szelektálás első körében vírusellenes aktivitást csak abban a csoportban tapasztaltunk. melynek tagjai két állandó ··· helyzetben tartalmaztak euanozint. A szelekció további lépései azt mutatták, hogy a négy egymás után következő guanozin biztosította a maximális aktivitást. A guanozin core-t szegélyező nukleotidokkal kapcsolatban erős szelekciós preferenciát nem figyeltünk meg. A további vizsgálatokhoz a T2G4T2 szekvenciát (ISIS 5320 oligonukleotid) választottuk. A vírus által indukált sejtpusztulás 50 %-os gátlásához (ICbo) szükséges ISIS 5320 koncentráció 0.3 μΜ volt. Ezen oligonukleotid vírusellenes aktivitását nem a sejt anyagcseréjének gátlása eredményezte: amíg a sejteket hozzávetőleg 100 /±1 koncentrációjú ISIS 5320 oligonukleotiddal inkubáltuk. citotoxikus hatásokat nem tapasztaltunk.
Annak ellenére. hogy az ISIS 5320 oligonukleotid foszfortioát gerincvázat tartalmaz, bizonyítékok azt mutatják, hogy az azonos szekvenciájú foszforsav-diészter oligonukleotidokhoz hasonlóan négvszálú. párhuzamos hélix szerkezetűek (Cheong. 0. és Moore. P.B.. Biochemistrv. 31. 8406-8414. 1992: Aboul-ela. F. és mtsi. Natúré. 360.
'280-282. 1992: Sarma. M.H. és mtsi. J. Bioi. Str. Dyn.. 9.
1131-1153. 1992; és Wang. Y. és Patel. D.J.. Biochemistry.
8112-8119. 1992'. A kombinatorikus könyvtár készlet (pool) vírusellenes aktivitást, mutató oligonukleotidjai <15. táblázat). és az ISIS 5320 oligonukleotid multimer komplexeket képeznek. amint azt méret kizárásos kromatografiával kimutattuk (13. ábra). A komplex retencióideje megegyezett a retencióidő vs. foszfor-tioát.
··· olieonukleotid standardok molekulatömege görbék alapján a tetramer alakokra várt értékkel (az adatokat nem mutatjuk be). Az ISIS 5320 oligonukleotid multimer alakjának cirkuláris dikroizmus (CD) spektrumát a dezoxioligonukleotid tetramerekről mások által közölt spektrumhoz hasonlóan (Sarma, M.H. és mtsi, <7. Biomol Str. Dyn., 2, 1131-1153; Lu, Μ. , Guo, Q. és Kallenbach. N.R.. Biochemistry, 31,
2455-2459,
USA, QSL,
1992; Jin, R. és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci.
8832-8836, 1992; és Hardin, C.C. és mtsi,
Biochemistry, 31, 833-841, 1992) egy 265 nm-nél látható csúcs, és egy 242 nm-nél látható völgy jellemzi (az adatokat nem mutatjuk be). Beszámoltak arról, hogy ha két különböző méretű, de egymás után egyaránt négy vagy öt guanozint
tartalmazó foszforsav-diészter oligonukleotidőt együtt
inkubáltak. nem denaturáló gélen öt különálló aggregált alak
képződött (Sen, D. és Gilbert . W.. Natúré, 344. 410 -414.
1990: és Kim. J.. Cheong. C. é s Moore. P.B.. Natúré. 351.
331-332. 1991 ) E jelenséget csak a párhuzamos szálú
tetramer magyarázhatja. Ha ezt a kísérletet két foszfortioát oligonukleotiddal. az ISIS 5320 vírusellenes oligonukleotiddal. és a 3' vég kezeiében 4 guanozint tartalmazó, 21 nukleotidból álló oligonukleotiddal (e'T13G4T45') végeztük. nem denaturáló· gélen a párhuzamos szálú tetramer esetében várt öt aggregált alakot figyeltük meg (14. ábra).
• ·· · · ·· »»*« • * I · t « · · • ··· ·«· ··· · • · · · · · ··« ♦ · ·· «· *
25. példa: A tetramer aktív a HTV ellen
Az oligonukleotidokat a 22. példában leírt módon screeneltük a vírusellenes aktivitásra. Az ISIS 5320 mintákat 1 mM törzsoldatból végzett hígítással készítettük. melyek legalább 98 %-ban tetramerből álltak. Az eredmények azt mutatták, hogy a tetramer 1 mM alapkoncentrációban korlátlan ideig stabil; szobahőmérsékleten, 5 hónap alatt 100 mM KC1 oldatot tartalmazó pufferben, 1 mM oldatban a tetramer mennyiségének csökkenését nem tapasztaltuk. A vírusellenes vizsgálatban használt koncentrációkra történő hígítás hatására (25 Ml alá) megkezdődött a tetramer disszociációja, de a disszociáció sebessége nagyon kicsi volt (15. ábra). Az intermolekuláris G kvartett komplexek asszociációjának és disszociációjának lassú kinetikájáról számoltak be (Jin, R. és mtsi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89- 8832-8836, 1992: és Sen. D. és Gilbert. W.. Natúré. 344. 410-414. 1990). Az ISIS 5320 kálium alakja disszociációjának felezési ideje kb. 45 nap. Az akut vírusellenes vizsgálat hatnapos időtartama alatt a minta legalább 70 %-a tetramer alakban maradt, függetlenül attól . hogy a mintát nátrium vagy kálium alakban készítettük. A nátrium és kálium forma az akut vírusellenes vizsgálatban egyforma ICeo értékkel rendelkezik, pedig a kálium jobban stabilizálta a'tetramert.
Az ISIS 5320 által képzett tetramer komplex vírusellenes vizsgálatban való alkalmazása előtti hődenaturálása az aktivitás elvesztését eredményezte; a vírusellenes aktivitás • · · · « · « · ♦ ··· ·»· · * · · · · · *·· ♦ * · · · · *
- 88 renaturálás hatására helyreállt (adatokat nem közlünk). A kombinatorikus screeneléshez használt kezdeti 16 oligonukleotid csoport vírusellenes aktivitása közötti különbség a G core jelenlétével, illetve hiányával, s ennek megfelelően a tetramer szerkezettel magyarázható (15. táblázat). A screenelés első körében az aktív e'NNGNGNNN3' pool-ba tartozó molekulák hozzávetőleg 12 %-a legalább négy egymás után álló guanozint tartalmazott, s méret kizárásos kromatográfiával kimutattuk, hogy az oligonukleotidok 5 %-a tetramereket képzett (15. táblázat). Ezzel szemben, az első körbe tartozó további három pool-ban (melyekben X=G), a molekulák csupán 0,4 %-a tartalmazott legalább négy, egymás után álló guanozint, s tetramert nem figyeltünk meg. A többi pool-ban négy egymás után álló guanozint nem találtunk.
A nukleotidok ISIS 5320 bármelyik végéről történő eltávolítása az aktivitás elvesztését eredményezte (16.
táblázat >.
···· • ·· * ·
16. TÁBLÁZAT
Szekvencia ICso (juM) tetramer %
T aT aGaGaGaGaTaT 0.3 98
TaTaGeGsGsGsTeT inaktív 0
(hődenaturált)
GaGeGeGeT aT 0,5 94*
GaGaGaGeT 1,4 61*
GaGaGaG 4 29*
TaTsGeGsGa^ 13 40*
TaGeGsGaG inaktív 57*
T0G0T0G0T ©GeT©G inaktív 0
0C“TeT sGaGsGsGsT oT 0.5 98
0C-T0T0G0G0G0G0T0T inaktív 97
ToToGoGoGoGoToT inaktív 93
T aT ©GoGoGoGaTaT 5.0 80
Tz-TcGaGaGaGcTcT inakt ív 72
ToT aG-'jgGoGaT cT inaktív 9
TgTcGgbcGabcTaT 5.3 83
TaTahaWia1 laTaTgE 0.4 85
A fenti táblázatban az akut HÍV vizsgálat ISIS 5320 szekvencia variánsaira és analógjaira vonatkozó adatokat mutajuk be. Az oligonukleotidok kémiai módosításait az alábbiak szerint jelöljük: s - foszfor-tioát gerincváz: o - f oszf orsav-diészter gerineváz: “oc - alfa90 konfiguráció.iú glikozidos kötés: B - biotin (melyet a Glen Research-tól származó, biotin-kötött CPG alkalmazásával végzett szintézis során építettünk be). Az inaktív jelzések azt jelentik, hogy 25 /M koncentrációnál nem tapasztaltunk aktivitást. A %-os tetramer arányt a 21. példában leírtak szerint határoztuk meg. A csillag egynél több aggregált formát jelent.
A GGGG foszfor-tioát is mutat bizonyos aktivitást; a közel optimális aktivitáshoz az szükséges, hogy a négy guanozin 3' oldalán két nukleotid helyezkedjen el. A csupasz G core-ral rendelkező oligonukleotidok esetében méretkizárásos kromatográfiával egynél több multimer alakot figyeltünk meg.
A foszforsav-diészter gerincvázú T2G4T2 szekvencia az anti-HIV vizsgálatban inaktív volt, annak ellenére, hogy a foszforsav-diészter tetramer kinetikailag stabilabbnak mutatkozott, mint az
ISIS 5320 foszfor-tioát (15. ábra). Bár nem kívánunk egy adott elmélethez ragaszkodni, két lehetőség feltételezhető: a foszfor-tioát vagy mechanikai okokból vagy módosított gerincváz megakadályozz az oligonukleotid nukleáz közvetítette lebomlását.
Az alfa-konfigurációjú glikozidos kötéssel rendelkező oligonukleotid analógok rezisztensek a nukleázos lebontásra (Morván, F. és mtsi. Nucleic Acids Rés.. 15- 3421-3437,
1993). Méret kizárásos kromatográfia alapján kimutattuk.
·· ♦· ·· 4«·· « · · · · · • ·· ··· ··· · • * » · * • ·* «4 «· · hogy mind a foszfor-tioát alfa-oligonukleotid. mind a foszforsav-diészter alfa-oligonukleotid képzett tetramereket. azonban csak a foszfor-tioát analóg volt aktív a HÍV ellen (16. táblázat).
A kevert foszfor-tioát - foszforsav-diészter gerincvázú oligonukleotidok vizsgálata azt mutatta, hogy a foszfortioát kötések a láncvégeken, s nem a G-core-on belül szükségesek az aktivitáshoz (16. táblázat).
26. példa: A tetramer gátolja a HIV-1 CD4··· sejtekhez való kötődését vagy fúzióját
Az ISIS 5320 oligonukleotid nem volt hatással azokra a krónikusan fertőzött (H9 IIIB) sejt modellekre (adatokat nem közlünk). amelyek csak a poszt-integrációs lépésben működő inhibitorokra reagálnak. Srivastava. K.K. és mtsi. (J.
Virol. . 65. 3900-3902. 1991',’ leírása szerint végzett nagy sokaságú fertózéses (Möl) kísérletben az ISIS 5320 gátolta az intraoelluláris. PCR-rel amolifikálható DNS termelését (adatokat nem közlünk), ami azt jelzi, hogy ez a vegyület a HÍV replikáció egy korai lépését gátolja, mint például a kötődést. fúziót. internálizálódsst vagv a reverz transzkripciót.
Az ISIS 5320 tetramer alakja szintén gátolta a fertőző vírus CDá·*· sejthez valü kötődését vagv fúzióját. A vizsgálatot a 22. példában leírtak szerint végeztük. A HeLa-CD4-LTR-S-gal ··· • ♦
• · «· ·· sejteket (Kimvtcn. J.
és Emerman. M.. J. Vivői.
Q$,
2232-2239. 1992) a vírus hozzáadása előtt 37 °C-on 15 percig az oligonukleotiddal inkubáltuk. Egy óra elteltével a sejteket a kötetlen vírus és az oligonukleotid eltávolítása érdekében mostuk. Az inkubálás ideje alatt a vírus kötődése és membrán fúziós események játszódnak le (Srivastava, K.K. és mtsi, J. Vivői., 65, 3900-3902, 1991). 48 óra elteltével a fertőzés mértékét a szincitiumok mennyiségi meghatározásával és ELISA vizsgálattal határoztuk meg (Kimpton, J. és Emerman, M., J. Virol., 66, 2232-2239, 1992). Hozzávetőleg 0,4 fiá ISIS 5320 koncentrációnál a vírus termelődés a kontroll 50 %-ára csökkent (az adatokat nem mutatjuk be). A hödenaturált ISIS 5320 és a °'TGTGTGTG3' 5 /dl oligonukleotid koncentrációban fejtett ki kötődést gátló hatást. Ezek a fúzió és kötés gátlási kísérletek azt mutatják, hogy az ISIS 5320 tetramer alakja nagyon korai stádiumban, vagy a virion sejthez való kötődése, vagy a virion fúziója és internálizációja alatt gátolja a vírusfertőzést.
27. példa: A tetramer a gpl20 V3 doménjéhez kötődik
Sejtes kísérletek azt mutatták, hogy az ISIS 5320 blokkolja a vírus kötődését, illetve fúzióját, s ennek megfelelően, a 23. példában leírtak szerint meghatároztuk az ISIS 5320 CP4 és gpl20 iránti affinitását. A biotinilált· ISIS 5320 (16. táblázat) 1 /M-nál kisebb disszociációs konstans (Ka) értékkel kötődött az immobilizált gpl20-hoz. Ezzel szemben.
• ·· ·« ·· ·· · · · · · « • ··· ··· ··· · • · * * · · ··· ·· ·· ·» · a c'T-zA-iTz-biot in3' 260 becsült Ka értékkel gyengén kötődött a gpl20-hoz. A CD4 50 ^g/ml-ig terjedő koncentrációban történő hozzáadása nem volt hatással az ISIS 5320 gpl20-hoz való kötődésére (adatokat nem mutatunk be). CD4-gyel bevont mikrotiter lemezek alkalmazásával végzett hasonló kísérletek azt mutatták, hogy a biotinilált ISIS 5320 a CD4-gyel is kapcsolódik; e kötődés Ka értéke (hozzávetőleg 25 fM) azonban lényegesen gyengébb volt, mint a gpl20-hoz való kötődésé. A kontroll csak akkor kötötte a CD4-et, ha nagyon nagy koncentrációban alkalmaztuk (Ka - kb.
240 μΜ). Ezenfelül, az ISIS 5320 egyéb HÍV proteinek (Tat. p24, reverz transzkriptáz. vif. proteáz, gp41), szolubilis CD4 (sCD4) és nem rokon proteinek (BSA, transzferrin és RNáz Vi) iránti affinitásának meghatározása érdekében Fried. M. és Crothers. D.M. ( Nucleic Acids Rés.. 6505-6525. 1981) által leírt kvalitatív gélcserés vizsgálatokat végeztünk. Az ISIS 5320 monomer és tetramer alakja egyaránt kötődött a ESA-hoz és a reverz transzkriptázhoz. Tetramer-specifikus kötődést csak a gpl20 és sCD4 esetében figyeltünk meg.
A gpl20 V3 hurok.ját. (303-338. aminosavak) a protein fő neutralizáló doménjének tartják: az e régióból származó peptidek típus-specifikus módon neutralizáló antitestek kialakulását váltják ki. amelyek a fúzió gátlásával blokkolják a vírusfertőzést (Humán Retrovii'uses and AIDS 1992. szerk.: Myers. G. és mtsi.. Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos. NM).
A gp!20 V3 hurokja az anionos poliszacharidők működésének .94 • ·(» ··0·»ί0 ·· · « · · v · • ♦·· ·«··»· >
• · · · · · ··· ·· 99 ·»9 helvszíne is. mint például a dextrán-szulfáté. amely gátolja a vírus kötődését, replikációját és színeitium képzését (Callahan, L. és mtsi. J. Virol. . 65. 1543-1550. 1991). A dextrán-szulfát a biotinilált ISIS 5320 oligonukleotid mikrotiter lemezen rögzített gpl20-hoz való kötődésének kompetitív inhibitora. 10 jug/ml és 50 pg/ml közötti dextránszulfát koncentrációnál a tetramer kötődése kb. 50 % arányban volt gátolt (17. ábra). A dextrán-szulfátról kimutatták, hogy ebben a koncentráció tartományban gátolja a gpl20-specifikus antitestek gpl20-hoz való kötődését (Callahan. L. és mtsi. J. Virol.. 65. 1543-1550. 1991).
Az ISIS 5320 oligonukleotid a gpl20 V3 hurok régiója ellen irányuló antiszérum kötődését is. a protein más régióira specifikus antiszérumét azonban nem (Rusche. J.R. és mtsi.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
S. és mtsi.. J. Virol..
QA. 6924-6928. 1987: Matsushita.
02. 2107-2114. 1988: és Meuller.
22A. 1392-1395. 1986) . A kontroll
oligonukleotid az antitest kötődésre nem gyakorolt hatást.
A tetramer a sejteken e?:cresszált epl20 V3 hurok.?ához is kötődik. A gpl2ű V3 hurokJára specifikus monoklonális antitest kötődését az ISIS 5320 kb. 0.5 koncentrációban (Ki) gátolta, amit immunfluoreszcens áramlásos citometriával határoztunk meg (18. ábra). A kontroll oligonukleotid 50 /14 koncentrációig kis hatást gyakorolt a kötődésre. Az antitestek humán CD44-hez (ugyanezen sejteken) vagy CD4-hez (Harley. D. és mtsi. J. Exp. Med.. 172. 1233-1242. 1990)
(CEM-T4 sejteken) való kötődését egyik oligonukleotid sem csökkentette jelentősen.
legalább nukleotidból álló foszfor-tioát oligonukleotidokról ismert. hogy
HÍV nem szekvenciaspecifikus inhibitorai (Stein
C.A.
és mtsi, J. Acquir.
Immun e Defic.
Syndr.,
686-693,
1991). Az itt alkalmazott akut vizsgálati rendszerekben a korábban tesztelt 18-28 mnukleotidos oligonukleotidok ICeo értéke 0.2 μΜ és 4 jjM között volt (Vickers, T.
és mtsi. Nucleic Acids
Rés., Ifi, 3359-3368, 1991). Stein és mtsi.
kimutatták, hogy legalább nukleotidból álló foszfor-tioát ο1igonukleot idők kötődnek a gpl20 (40) V3 hurokjához, és a
CD4 receptorhoz.
illetve egyéb sédtfelületi antigénekhez (Stein. C.A. és mtsi. J.
Acquir. Immuné Defic. S.vndr., 4.
686-693.
1991).
A hosszú.
összekevert szekvenciájú oligonukleotidok kötési és vírusellenes aktivitásának különbözősége valószínűleg abból ered, hogy ezek a membrán felületi proteinek iránt különböző affinitású. ismeretlen struktúrákba szerveződnek. Ezekkel ellentétben, az ISIS 5320 oligonukleot id meghatározott tetramer szerkezetté1 rendelkezik.
vírusellenes aktivitása ιtömegre vonatkoztatva) mint a hosszabb lineáris oligonukleotidok
Hogy meghatározzuk, vajon az ISIS 5320 képes-e a CD4 és gpl20 közötti intrakció gátlására. ELISA vizsgálatot végeztünk (adatokat nem közlünk). Növekvő mennyiségű ISIS
5320 hozzáadása csökkentette a CD4 immobilizált gpl20-hoz való kötődését: 50 %-os gátlást hozzávetőleg 2,5 μΜ. koncentráció eredményezett. A kontroll oligonukleotid (5-TGTGTGTG3') nem gyakorolt hatást a CD4/gpl20 interakcióra. Ezen eredményeket gpl20 befogásos ELISA vizsgálattal is megerősítettük, melynek során a mikrotiter lemezeket CD4-gyel vontuk be (ICso értéke hozzávetőleg 20 μΜ). A gpl20 V3 hurokjához kötődő vegyületek a CD4 és gpl20 közötti intrakció teljes blokkolása nélkül képesek gátolni a fúziót (Callahan L. és mtsi. J. Virol., 1543-1550, 1991). Az ISIS 5320 oligonukleotiddal ellentétben a dextránszulfát az ELISA vizsgálatban még IC50 értékénél 10 000-szer nagyobb koncentrációban sem akadályozza a gpl20/CD4 interakciót (Callahan L. és mtsi. J. Virol.. £5. 1543-1550. 1991) .
A T2G4T2 foszfor-tioát tetramer alakja a gpl20 V3 hurokjához való kötődés által gátolja a HÍV fertőzés sejtről se.itre és virionról sejtre történő terjedését. A tetramer merev, kompakt szerkezetet biztosít, amely nagy tio-anionos töltéssúruséggel rendelkezik. ami a kationos V3 hurokkal létrejövő erős interakció alapját képezheti. Bár a V3 hurok hipervariábilis régió, a V3 hurok kationos gyökeivel szemben támasztott funkcionális követelmények korlátozhatják a vírus azon képességét, hogy rezisztenssé váljon a nagy polianionos sűrűségű inhibitorokra. A G kvartett szerkezeti motívumból leszármaztatott vegyületek potenciális lehetőséget jelentenek az anti-HIV kemoterápiában való alkalmazásban.
• · · • ···
Szekvencialista
Szekvenciák száma: 142
TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACGAAAGGC ATGACCGGGG C 21
TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GAAAGGCATG ACCGGGGC 18
TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 15
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
• · · • · • · • ·· • ·· · (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGGCATGACC GGGC 15
TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATGACCGGG GC 12
TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 19 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACGAAAGGC ATGACCGGG 19
TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (ü SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
• · ·
··· ·
CACGAAAGGC ATGACCGG18
TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 15
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACGAAAGGC ATGAC15
TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
< D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATGGCGGGA CTACGGGGGC C21
TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
( A > HOSSZÚSÁG: 15
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
( D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATGGCGGGA CTACG
- 1.00 TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 10. SZÁMÚ TGGCGGGACT ACGGGGGC
TUDNIVALÓK A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B) TÍPUS: nukleinsav (C1 SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 11. SZÁMÚ GGCGGGACTA CGGGG
TUDNIVALÓK A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK < A) HuSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 12. SZÁMÚ
ACCGCCAbGG GAATCCGTCA T
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
101
<i) SZEKVENCIA. JELLEMZIK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GCCAGGGGGAA TCCGTCAT 18
TUDNIVALÓK A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 15
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGGGGAATCC GTCAT 15
TUDNIVALÓK A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 <'B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú <D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GCCAGGGGAA TCCGT
TUDNIVALÓK A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
102 • ·· ·· ·· ···· ··♦ ···· · • ··· ··· ··· · • · · · · · ··· ·· ·· ·· · (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálu (D) ALAK: lineáris í xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATCGCCGAT GCGGGGCGAT C 21
TUDNIVALÓK A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 18
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATCGCCGAT GCGGGGCG 18
TUDNIVALÓK A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ ti' SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B> TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú <D) ALAK: lineáris
SZEKVENCIA LEÍRÁS: 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATCGCCGAT CGGGG 15
TUDNIVALÓK A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 • ·
- 103
(B) TÍPUS: : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CGCCGATGCG GGGCG 15
TUDNIVALÓK A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 12
(B) TÍPUS: : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GCCGATGCGG GG 12
TUDNIVALÓK A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (a) hosszúság: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTTGGAGACC GGGGTTGGGG 20
TUDNIVALÓK A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 17 (B) TÍPUS: nukleinsav • · · · · · · • · · · · » • «·· ··· ·· • · * · ··« * · ·· «·
- 1.04 - (C) SZÁL: egvszáliJ (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGAGACCGGG GTTGGGG 17
TUDNIVALÓK A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 16
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GAGACCGGGG TTGGGG 16
TUDNIVALÓK A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (Bí TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (Xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGACCGGGGT TGGGG 15
TUDNIVALÓK A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 11 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú • « ·
- 105 <D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CGGGGTTGGG G11
TUDNIVALÓK A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 10
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG10
TUDNIVALÓK A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 17
(B) TÍPUS: nukleinsav
( C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTTGGAGACC GGGGTTG17
TUDNIVALÓK A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris
106 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACGGGGTCG CCGATGAACC 20
TUDNIVALÓK A 29. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 17
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 29. SZÁMO SZEKVENCIA:
GGGGTCGCCG ATGAACC 17
TUDNIVALÓK A 30. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 17 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACGGGGTCG CCGATGA 17
TUDNIVALÓK A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i ) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACGGGGTCG CCGAT • ··«
H ·· ·««« * · » · · ··· ··· · • · ·
TUDNIVALÓK A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 10
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 32. SZÁMÚ
CACGGGGTCG 10
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 25
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 33. SZÁMÚ
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT GGGGG
TUDNIVALÓK A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 25 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 34. SZÁMÚ
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT GGGGG
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
108 (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 24
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 35. SZÁMÚ
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT GGGG
TUDNIVALÓK A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 22
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 36. SZÁMÚ
GGGGTTGGGG TTGGGGTTGG GG
TUDNIVALÓK A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (E) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris íxi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 37. SZÁMÚ
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT
TUDNIVALÓK A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
109
(A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyezálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGG 18
TUDNIVALÓK A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 16
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG TTGGGG 16
TUDNIVALÓK A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ < i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 14 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egvszálú (D) ALAK: lineáris 'xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTT 14
TUDNIVALÓK A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12
- tio -
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GG 12
TUDNIVALÓK A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGCGGGGC GGGGCGGGGC G 21
TUDNIVALÓK A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT GGGG 24
TUDNIVALÓK A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav
- Ili - (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG TTGGGGTTGG GG22
TUDNIVALÓK A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT20
TUDNIVALÓK A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 10
(E) TÍPUS: : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: 1ineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG10
TUDNIVALÓK A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú
- 112 (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT AGAAGGGCTC C 21
TUDNIVALÓK A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 18
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT AGAAGGGC 18
TUDNIVALÓK A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B) TÍPUS: nukleinsav ( CSZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT AGAAG 15
TUDNIVALÓK AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZ ÚSÁG: 12
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: 1ineáris
113
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT AG 12
TUDNIVALÓK AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGGTATAGA AGGGCTCC 18
TUDNIVALÓK AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú í I1 '> ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTATAGAAGG GCTCC 15
TUDNIVALÓK AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ ( i SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
- 1.14 TAGAAGGGCT CC
TUDNIVALÓK AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 18
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGG 18
TUDNIVALÓK AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 16 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris fyi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG TTGGGG 16
TUDNIVALÓK AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 14 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú 'D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTT • · · · · · • · · 9 · ··· ··♦ ··· • · · · · ·· ·· »· · • ·· ·
- 115
TUDNIVALÓK AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 12
( B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GG12
TUDNIVALÓK AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCTGCCCCGG CCGTCGCTCC C21
TUDNIVALÓK AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
< A ) Hosszúság: 21
( B) TÍPUS: nukleinsav
( C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CAGAGGACTC CAGAGTTGTA T21
TUDNIVALÓK A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ • ·· ·
-116íi) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTCATGGTAA GAGTTCTTGG G 21
TUDNIVALÓK A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CAAAGATCAT GATCACTGCC A 21
TUDNIVALÓK A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK 'Ai HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCCCATGGGC CTGCAGTAGG C 21
TUDNIVALÓK A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
- 117 (A) HOSSZÚSÁG: 2) (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris íxi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGAAGGTTTC CAGGGAAGAG G 21
TUDNIVALÓK A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCTGCAGTAG GCCTGGAAGGA 21
TUDNIVALÓK A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi' SZEKVENCIA LEÍRÁS: 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGACTCAGC AACGAGGGGT G 21
TUDNIVALÓK A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 • ·
- 118 -
(B) TÍPUS: nukl einsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTAGGGAGGG AGGGTATGAG A 21
TUDNIVALÓK A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AAGGAACTTG GTTAGGGTAG G 21
TUDNIVALÓK A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D ’ ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGGTGAGGG ATGCTTTCTG C 21
TUDNIVALÓK A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav
119
SZÁL: egyszálii (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTGCCTGGCC TCTAGGATGG G21
TUDNIVALÓK A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
ATAGAAGGGC TCCTGCCTGG C21
TUDNIVALÓK A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
< B · TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D· ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCTCATTCTG GGTGGGTATA G21
TUDNIVALÓK A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
20 (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GCTGGAAATC TGCTGGATGT C 21
TUDNIVALÓK A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 73. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTGGAGGAGA GCAGTAGAAG G 21
TUDNIVALÓK A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C> SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGTTAAGCA CGGAGTTGAG G 21
TUDNIVALÓK A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCGGAGTACA GCTTCTTTGG T
TUDNIVALÓK A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGCTTTATT CAGAAGAGAC C 21
TUDNIVALÓK A 77. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (O SZÁL: egyszálú ( D ’ A.LAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 77. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTTTTGATTT GCTAATTGCT T 21
TUDNIVALÓK A 78. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 78. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGAGCCCTTC TATACCCACC Γ 23
TUDNIVALÓK A 79. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 79. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACCCCTCGT TGCTGAGTCC C 21
TUDNIVALÓK A 80. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D> ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 80. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCTCATACCC TCCCTCCCTA C 21
TUDNIVALÓK A 81. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 81. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGGTCGAGGA GTGGTCTGAG ( • ·· ·· ·· ♦ · · • ·»· .., • · · · ·*· tt ·· • · ··· ··
12?
TUDNIVALÓK A 82. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ ♦
(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 82. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCAGGAGAGG TCGGTAAGGC G21
TUDNIVALÓK A 83. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 83. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTAGGATGG GAGTGAAGGA G21
TUDNIVALÓK A 84. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
íC) SZÁL: egvszálú
( D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 84. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGCTCCTCCT TGGTGGCTCT C21
TUDNIVALÓK A 85. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
124 (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 2J
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: esyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 85. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTCTGCTGGG TGGTCTCAAC T 21
TUDNIVALÓK A 86. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 86. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGACTGGCCT AGCTCCTCTG C 21
TUDNIVALÓK A 87. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 íB) TÍPUS: nuklein sav (C) SZÁL: egvszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 87. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGTGACAAAT GCAGATGGAC T 21
TUDNIVALÓK A 88. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 88. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TAGGAGGGTC TTCATGGTAA G 21
TUDNIVALÓK A 89. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 89. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGCTCTTACC AAAGATCATG A 21
TUDNIVALÓK A 90. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ ;i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 23
( B) TÍPUS: nukleinsav
(C; SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 90. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGTAGGCCTG GAAGGAAA TTT
TUDNIVALÓK A 91. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 ♦ ·♦
(E) TI FOS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 91. SZÁMO SZEKVENCIA:
TGGCCTCACC GATCCGTTGC A 21
TUDNIVALÓK A 92. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 92. SZÁMO SZEKVENCIA:
ACAGCAGCTG TGAGGAGACA C 21
TUDNIVALÓK A 93. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
A HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav <C> SZá.L: egyszálú (D) ALAK: 1ineári s (xi) SZEKVENCIA LEIFÁS: 93. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
ACTCTTACCA CAGGTGATTC T 21
TUDNIVALÓK A 94. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (<*) SZÁL: eevszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 94. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGGAGTCCTG TTTTGAAATC A 21
TUDNIVALÓK A 95. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 95. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGTGCACGTT GAGTATGTGA G 21
TUDNIVALÓK A 96. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 <B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris <xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 96. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTACGGCAGA GACGAGATAG C 21
TUDNIVALÓK A 97. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú
128 • ·· ·* ··*·· *♦ · · · · · • »·♦ ··· ·«·Λ • · * * « « ·♦· ·· ·· «4« (?) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 97. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT AGAAGGGC18
TUDNIVALÓK A 98. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 15
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(?) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 98. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT AGAAG15
TUDNIVALÓK A 99. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C> SZÁL: egyszálú (?) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 99. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGGTATAGA AGGGCToC 1c
TUDNIVALÓK A 100. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris
129 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 100. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTATAGAAGG GCTCC 15
TUDNIVALÓK A 101. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 101. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TAGAAGGGCT CC 12
TUDNIVALÓK A 102. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D-1 ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 102. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGGTATAGA AGGGC 15
TUDNIVALÓK A 103. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ ( i > SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egvszálú (D) ALA.K: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 103. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
• · · · ;
··· ··· , • · · ·· ·♦ ,
l.3i?
AGGTGGGTAT AG 12
TUDNIVALÓK A 104. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 104. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGAGGGTAT AG 12
TUDNIVALÓK A 105. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 105. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGCGGGTAT AG 12
TUDNIVALÓK A 106. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ ( i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HuSSZÚSÁG: 12 <'B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú <D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 106. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGATAT AG
131
TUDNIVALÓK A 1Π7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 12
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 107. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGAAT AG 12
TUDNIVALÓK A 108. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 108. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTGGGTAT 12
TUDNIVALÓK A 109. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 109. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT GGGG 24
TUDNIVALÓK A 110. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
- 132 (i) SZEKVENCIA JELLEMZIK
(A) HOSSZÚSÁG: 22
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 110. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG TTGGGGTTGG GG22
TUDNIVALÓK A 111. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 18
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 111. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGG18
TUDNIVALÓK A 112. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 16
(B) TIPUS: nuk1e insav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 112. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG TTGGGG16
TUDNIVALÓK A 113. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK • ·· ·· ·· ···· ··· · · · · · • ··· ··· ··· · • · · · r ·
V ’·* *· .....
- 133 - (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 113. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GG 12
TUDNIVALÓK A 114. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚ SÁG: 20
(B) TÍPUS: nukleinsav
(0) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 114. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT 20
TUDNIVALÓK A 115. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ íi) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 14 ' B) TÍPUS: nukleinsav (0) SZÁL: egyszálú <D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 115. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTT 14
TUDNIVALÓK A 116. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 24 • ·· ·
• ·« * · · • · · < • ·
- 134 -
(B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 116. SZÁMÚ TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT GGGG SZEKVENCIA: 24
TUDNIVALÓK A 117. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 22
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 117. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG TTGGGGTTGG GG 22
TUDNIVALÓK A 118. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK <A' HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D i ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 118. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTGGGGTTGG GGTTGGGGTT 20
TUDNIVALÓK A 119. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 (E) TÍPUS: nukleinsav • · ·
35 < C) SZÁL: egvszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 119. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGGTTGGGG 10
TUDNIVALÓK A 120. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 18
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 120. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GAGGCTGAGG TGGGAGGA 18
TUDNIVALÓK A 121. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 39 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 121. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
XXXGGGGTTT TGGGGTTTTG GGGTTTTGGG GTTTTGGGG 39
TUDNIVALÓK A 122. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú • ·
- 136 - (D) ΑΙΛΚ: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 122. SZÁMÚ
TGGGCACGTG CCTGACACGG C 21
TUDNIVALÓK A 123. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
(A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 123. GAGGTGGGCT GTGGTGGTGA SZÁMÚ 20
TUDNIVALÓK A 124. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (Cl SZÁ.L: egyszálú <D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 124. SZÁMÚ
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
GGG'jTTG'.iGG AATGAATt út
TUDNIVALÓK A 125. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ íi) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS : nukleinsa
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
• · · • ··
- 137 (xü SZEKVENCIA LEÍRÁS: 125. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGTTGGAGA CCGGGGTTGG 20
TUDNIVALÓK A 126. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 126. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGTTGGAGAC CGGGGTTGGG 20
TUDNIVALÓK A 127. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú <D) ALAK: 1 iné ár i s (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 127. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGAGACCGG GGTTGGGGAA 20
TUDNIVALÓK A 128. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egvszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 128. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
- 138 -
TTGGAGACCG GGGTTGGGGA 20
TUDNIVALÓK A 129. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 129. SZÁMÚ
GACGGTCAAG GGGAGGGTTG G 21
TUDNIVALÓK A 130. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 130. SZÁMÚ
GGGGAGACCG AAACCGCAAA 20
TUDNIVALÓK A 131. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A> HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: 1ineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 131. SZÁMÚ
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
CCTGGATGAT GCTGGGGTAC
- 139 TUDNIVALÓK A 132. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 132. SZÁMÚ
GACTGGGGCG AGGTAGGGGT 20
TUDNIVALÓK A 133. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú <D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 133. SZÁMÚ GTCCCGACTG GGGCGAGGAT 20
TUDNIVALÓK A 134. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav iC) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 134. SZÁMÚ GCCGAGGTCC ATGTCGTACG C 21
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 135. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ • ·· ·
- 1.Λ(? íi) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 135. SZÁMÚ
CACGAAAGGC ATGACCGIGG C 21
TUDNIVALÓK A 136. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ íi) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: 1ineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 136. SZÁMÚ
CACGAAAGGC ATGACCGGGI C 21
TUDNIVALÓK. A 137. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú ' D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 137. SZÁMÚ
GTTGGAGACC GGIGTTGGIG 20
TUDNIVALÓK A 138. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
- 141 - (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 138. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTTGGAGACC GGGITTGGGG 20
TUDNIVALÓK A 139. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 139. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTTGGAGACC GGGTTTGGIG 20
TUDNIVALÓK A 140. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i'> SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B> TÍPUS: nukleinsav ’C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 140. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTTGGAGACC GIGGTTGGGG 20
TUDNIVALÓK A 141. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 •4 · * · · · « • * · · « ·<>·· ··· · • · · · • · · 4 « • ·· ''Β ) TÍPUS: nukleinsav (Ο SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 141. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GTTGGAGACC GGGGTTGGGI 20
TUDNIVALÓK A 142. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 142. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTTTTTTTTT tttqGGGTTT T 21

Claims (15)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. 6-27 nukleotid hosszúságú, kémiailag modifikált oligonukleotid, amely vírus vagy foszfolipáz A2 aktivitásának gátlásához vagy a kromoszóma telomerhosszúság módosításához legalább egy GGGG szekvenciát vagy legalább két GGG szekvenciát, és elégséges számú szegélyező nukleotidot tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, mely az 1.,
    2. vagy 3. táblázatban megadott szekvenciával rendelkezik.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a 21.,
    1., 8., 12., 16., 22., 28., 30., 31., 33., 35., 36., 37.,
    38., 39., 42., 47., 48., 50., 81., 82., 83., 84., 85., 86.,
    87., 88., 89., 90., 91., 92., 93., 94., 94., 95., 96., 123.,
    124., 125., 126., 127., 128., 129., 130., 131., 132. és 133. számú szekvenciák valamelyikével rendelkezik.
    4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely (NxG3—4 )qNx szekvenciával rendelkezik, melyben X = 1-8, és Q = 1-6. 5. A 4. igénypont szerinti oligonukleotid, amely
    NNGGGGNN szekvenciával rendelkezik.
  4. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely
    144 legalább egy cukrok közötti (gerincváz) foszfor-tioát kötéssel rendelkezik.
  5. 7. A 21. számú szekvenciával rendelkező foszfor-tioát oligonukleotid.
  6. 8. A TTGGGGTT szekvenciával rendelkező foszfor-tioát oligonukleotid.
  7. 9. Foszfor-tioát oligonukleotidok G-kvartett struktúráját tartalmazó vegyület, mely oligonukleotidok mindegyike (TxG<Ty)q szekvenciával rendelkezik, melyben x és y értéke, egymástól függetlenül, 0-8, és q értéke 1-10.
  8. 10. A 9. igénypont szerinti vegyület, melyben x = 2, és y = 2.
  9. 11. Eljárás vírus aktivitásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a vírust egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal vagy vegyülettel hozzuk érintkezésbe.
  10. 12. Eljárás foszfolipáz Αε aktivitásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a sejtet egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti oligonukleotiddal vagy vegyülettel hozzuk érintkezésbe.
    145
  11. 13. Eljárás kromoszóma telomerhosszúságának módosítására, azzal Jellemezve, hogy a kromoszómát 6-25 nukleotid hosszúságú, (NxG3-4)qNx szekvenciával rendelkező oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe, melyben X = 1-8, és
    Q = 1-5.
    • <·· ·<<· ·· · · · < · · • ··· ·4· »·· « • · · · · · ··· ·< ·♦ ·
  12. 14. Eljárás rosszindulatú sejt osztódásának gátlására, azzal Jellemezve, hogy a rosszindulatú sejtet 6-25 nukleotid hosszúságú, (NxGe-4)<aNx szekvenciával rendelkező oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe, melyben X = 1-8, és Q = 1-5.
  13. 15. Eljárás humán immundeficiencia vírus aktivitásának gátlására, azzal jellemezve, hogy az említett vírussal fertőzött sejthez a vírus aktivitásának gátlásához elégséges mennyiségben foszfor-tioát oligonukleotidok G-kvartett struktúráját tartalmazó említett oligonukleotidok vegyületet adunk, amelyben az mindegyike TxG4Ty szekvenciával rendelkezik, melyben x és y jelentése, egymástól függetlenül, 0-8.
  14. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy a humán immundeficiencia vírussal fertőzött sejthez olyan vegyületet adunk, melyben x = 2, és y = 2.
  15. 17. Profilaktikus eszköz, azzal jellemezve, hogy egy
    TxG4Ty szekvenciával (melyben x és y Jelentése, egymástól • *· ·- *· ·<·· • · · · · 4 4 « • ··· ·«· ··· * • · · « Λ Λ ··· ·ν φ#· Ζ
    L ι
    ; - 146 függetlenül, 0-8) rendelkező foszfor-tioát oligonukleotidok
    G-kvartett struktúráját tartalmazó vegyülettel van bevonva.
HU9500911A 1992-09-29 1993-09-29 Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence HUT70965A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95418592A 1992-09-29 1992-09-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9500911D0 HU9500911D0 (en) 1995-05-29
HUT70965A true HUT70965A (en) 1995-11-28

Family

ID=25495059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500911A HUT70965A (en) 1992-09-29 1993-09-29 Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence

Country Status (15)

Country Link
US (5) US5523389A (hu)
EP (2) EP1016715A1 (hu)
JP (1) JP2818031B2 (hu)
KR (1) KR0172153B1 (hu)
AT (1) ATE222290T1 (hu)
AU (1) AU668604B2 (hu)
BR (1) BR1100614A (hu)
CA (1) CA2145664C (hu)
DE (1) DE69332206T2 (hu)
FI (1) FI951467A (hu)
HU (1) HUT70965A (hu)
IL (1) IL107150A0 (hu)
NO (1) NO951191D0 (hu)
NZ (2) NZ256787A (hu)
WO (1) WO1994008053A1 (hu)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5514577A (en) * 1990-02-26 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses
US5869641A (en) * 1990-06-11 1999-02-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of CD4
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US7119184B2 (en) * 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US5629154A (en) * 1993-11-12 1997-05-13 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5989807A (en) 1992-05-13 1999-11-23 Geron Corporation & Board Of Regents Detecting cancerous conditions by assaying for telomerase activity
US5645986A (en) * 1992-05-13 1997-07-08 Board Of Reagents, The University Of Texas System Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5648215A (en) * 1992-05-13 1997-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Telomerase diagnostic methods
US5830644A (en) * 1992-05-13 1998-11-03 Geron Corporation Method for screening for agents which increase telomerase activity in a cell
US6007989A (en) 1992-05-13 1999-12-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of screening for compounds that derepress or increase telomerase activity
US5686306A (en) * 1992-05-13 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for lengthening telomeres
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5837453A (en) * 1992-05-13 1998-11-17 Geron Corporation Telomerase activity assays
IL107150A0 (en) * 1992-09-29 1993-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
US7067497B2 (en) * 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
US6288042B1 (en) 1993-04-23 2001-09-11 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich tetrad forming oligonucleotides
US6323185B1 (en) 1993-04-23 2001-11-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides and method of treating HIV
US5567604A (en) 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
WO1995013382A1 (en) * 1993-11-12 1995-05-18 Geron Corporation Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5804380A (en) * 1993-11-12 1998-09-08 Geron Corporation Telomerase activity assays
US5863726A (en) * 1993-11-12 1999-01-26 Geron Corporation Telomerase activity assays
WO1995026190A1 (fr) * 1994-03-25 1995-10-05 Akira Kaji Nouveau medicament anti-vih
AU3889595A (en) * 1994-10-05 1996-05-02 Amgen, Inc. Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein
US5698686A (en) 1994-10-20 1997-12-16 Arch Development Corporation Yeast telomerase compositions
WO1996016977A1 (en) * 1994-12-02 1996-06-06 Akira Kaji Novel anti-hiv agent
US20030032610A1 (en) 1996-06-03 2003-02-13 Gilchrest Barbara A. Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
US5741677A (en) * 1995-06-07 1998-04-21 Geron Corporation Methods for measuring telomere length
US6054442A (en) * 1995-07-06 2000-04-25 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for modulation and inhibition of telomerase in vitro
US6004939A (en) 1995-07-06 1999-12-21 Ctrc Research Foundation Board Of Regents Methods for modulation and inhibition of telomerase
AU725936B2 (en) * 1995-07-19 2000-10-26 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
US6093816A (en) 1996-06-27 2000-07-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
US5691145A (en) * 1996-08-27 1997-11-25 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids using G-quartets
US5849902A (en) * 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
WO1998033807A1 (en) * 1997-02-04 1998-08-06 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich tetrad forming oligonucleotides
US6127533A (en) * 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US5760209A (en) * 1997-03-03 1998-06-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protecting group for synthesizing oligonucleotide analogs
US5902881A (en) * 1997-03-03 1999-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Reagent useful for synthesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US6489304B2 (en) * 1997-05-01 2002-12-03 Hybridon, Inc. Hyperstructure-forming carriers
EP2085090A3 (en) * 1997-06-06 2012-05-02 The Regents of the University of California Inhibitors of DNA immunostimulatory sequence activity
JP2002510319A (ja) 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
ES2138924B1 (es) * 1998-01-23 2000-10-01 Consejo Superior Investigacion Promotor y secuencias reguladoras de ha ds10 g1: un gen lea de girasol expresado exclusivamente en semillas desde la fase de maduracion.
US7321828B2 (en) * 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
EP1469009A2 (en) 1998-05-21 2004-10-20 Isis Parmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides
AU753270B2 (en) * 1998-05-21 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
ES2226414T3 (es) 1998-06-10 2005-03-16 Biognostik Gesellschaft Fur Biomolekulare Diagnostik Mbh Estimulacion del sistema inmunitario.
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6492111B1 (en) * 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
CN1273478C (zh) * 1999-02-12 2006-09-06 三共株式会社 新型核苷及低聚核苷酸类似物
US20080318890A1 (en) * 1999-04-08 2008-12-25 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US20080318889A1 (en) * 1999-04-08 2008-12-25 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US7960540B2 (en) * 1999-04-08 2011-06-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
US8114850B2 (en) * 1999-04-08 2012-02-14 Advanced Cancer Therapeutics, Llc Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
EP1181304B1 (en) * 1999-04-08 2007-10-10 Antisoma Research Limited Antiproliferative activity of g-righ oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin
JP4151751B2 (ja) * 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6849610B1 (en) * 1999-11-24 2005-02-01 The Regents Of The University Of California Polynucleotide ligands as anti-viral agents
US20020091095A1 (en) 1999-12-13 2002-07-11 Phillips Nigel C. Modulation of Fas and FasL expression
WO2002018593A2 (en) * 2000-08-29 2002-03-07 Bioniche Life Sciences Inc. Modulation of fas and fasl expression
ES2288883T3 (es) * 1999-12-13 2008-02-01 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotidos sinteticos utiles terapeuticamente.
AU2001259370A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of obtaining active antisense compounds
WO2002002172A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Univ Jefferson Dna palindrome - oligoguanylic acid compositions and uses thereof
DE10051628B4 (de) * 2000-10-18 2007-06-06 Fresenius Hemocare Beteiligungs Gmbh Einzelsträngiges Oligonukleotid und dessen Verwendung
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
EP2330194A3 (en) * 2002-09-13 2011-10-12 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
US7790189B2 (en) 2003-05-15 2010-09-07 Mitsui Sugar Co., Ltd. Immunostimulating agents
US20050026198A1 (en) * 2003-06-27 2005-02-03 Tamara Balac Sipes Method of selecting an active oligonucleotide predictive model
BRPI0414222B8 (pt) 2003-09-09 2021-05-25 Geron Corp compostos oligonucleotídeos modificados para inibição da telomerase, métodos, composição farmacêutica e usos relacionados
GEP20094767B (en) 2003-10-30 2009-09-10 Coley Pharm Group Inc C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20080213891A1 (en) * 2004-07-21 2008-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi Agents Comprising Universal Nucleobases
WO2006093526A2 (en) * 2004-07-21 2006-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
WO2006042418A1 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Replicor Inc. Antiviral oligonucleotides
WO2006133099A2 (en) * 2005-06-03 2006-12-14 The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. Sirna microbicides for preventing and treating viral diseases
WO2007127163A2 (en) 2006-04-24 2007-11-08 Geron Corporation Cns-tumor treatment method and composition
JP2007304666A (ja) * 2006-05-08 2007-11-22 Sony Computer Entertainment Inc 情報出力システム及び情報出力方法
JP2010507386A (ja) * 2006-10-26 2010-03-11 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー オリゴリボヌクレオチドおよびその使用
EP2898887B1 (en) * 2006-10-30 2018-09-26 Geron Corporation Combined telomerase inhibitor and gemcitabine for the treatment of cancer
WO2008094640A2 (en) 2007-01-30 2008-08-07 Geron Corporation Compounds having anti-adhesive effects on cancer cells
US9155753B2 (en) * 2007-03-09 2015-10-13 Geron Corporation Treatment of carcinomas with a combination of EGF-pathway and telomerase inhibitors
US20090131351A1 (en) * 2007-11-16 2009-05-21 Antisoma Research Limited Methods, compositions, and kits for modulating tumor cell proliferation
WO2009067243A2 (en) 2007-11-20 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of cd40 expression
EP2236141A1 (en) * 2009-04-01 2010-10-06 Universität Zürich siDNA oligonucleotide as antiviral agent against Herpes virus Infections
FR2946881B1 (fr) * 2009-06-17 2013-04-26 Univ Victor Segalen Bordeaux 2 Activite multimodale d'oligonucleotides g-quartet et compositions microbicides.
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
AU2011268127B2 (en) * 2010-06-18 2016-01-14 Whitehead Institute For Biomedical Research PLA2G16 as a target for antiviral compounds
US9375485B2 (en) 2012-12-07 2016-06-28 Geron Corporation Use of telomerase inhibitors for the treatment of myeloproliferative disorders and myeloproliferative neoplasms
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
ES2781459T3 (es) * 2015-07-29 2020-09-02 Ifom Fondazione St Firc Di Oncologia Molecolare Oligonucleótidos terapéuticos
EP3124609A1 (en) * 2015-07-29 2017-02-01 IFOM Fondazione Istituto Firc di Oncologia Molecolare Therapeutics oligonucleotides
EP3147364A1 (en) * 2015-09-28 2017-03-29 Institut d'Investigacions Biomédiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) Antiviral agents comprising an oligonucleotide-lipid conjugate forming g-quadruplex
SG10202008046UA (en) 2015-12-23 2020-09-29 Univ Queensland Technology Nucleic acid oligomers and uses therefor
US9758786B2 (en) 2016-02-09 2017-09-12 Autotelic, Llc Compositions and methods for treating pancreatic cancer
WO2018140354A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisense oligonucleotides that inhibit influenza virus replication and uses thereof
WO2022229350A2 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Tirmed Pharma Ab Single-stranded oligonucleotides for use in the medical treatment and/or prophylaxis of virus infections

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) * 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
JPS5927900A (ja) * 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) * 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) * 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4824941A (en) * 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) * 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5258506A (en) * 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) * 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) * 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
JPS638396A (ja) * 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) * 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5585481A (en) * 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
DE3738460A1 (de) * 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
WO1989005358A1 (en) * 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5403711A (en) * 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US5082830A (en) * 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
US5262536A (en) * 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5176996A (en) * 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5457183A (en) * 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) * 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) * 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) * 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) * 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
FR2648045B1 (fr) * 1989-06-13 1991-09-27 Centre Nat Rech Scient Composes oligonucleotidiques anomeres alpha inhibant la replication des retrovirus
US5451463A (en) * 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5196305A (en) * 1989-09-12 1993-03-23 Eastman Kodak Company Diagnostic and amplification methods using primers having thymine at 3' end to overcome primer-target mismatch at the 3' end
US5254469A (en) * 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5292873A (en) * 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5578718A (en) * 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5623065A (en) * 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5220007A (en) * 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) * 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) * 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5514577A (en) * 1990-02-26 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses
EP0523140A4 (en) * 1990-03-21 1993-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Reagents and methods for modulating gene expression through rna mimicry
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JP2635212B2 (ja) * 1990-04-30 1997-07-30 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド アラキドン酸代謝のオリゴヌクレオチド変調
US5166195A (en) * 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
US5688941A (en) * 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5245022A (en) * 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
JPH06501843A (ja) * 1990-08-14 1994-03-03 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド アンチセンスオリゴヌクレオチドによるインフルエンザａ型ウイルス，アン・アーバｈ２ｎ２株の阻害
US5512667A (en) * 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
KR930702373A (ko) * 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
US5175266A (en) * 1991-04-19 1992-12-29 Triplex Pharmaceutical Corporation Nucleosides and oligonucleosides with a phosphate-free internucleoside backbone and process for preparing the same
WO1992021690A1 (en) * 1991-06-05 1992-12-10 Triplex Pharmaceutical Corporation Purine base modified 2'-deoxyribonucleosides, use in triplex forming oligonucleotides and process for preparing the same
US5371241A (en) * 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
WO1993009788A1 (en) * 1991-11-13 1993-05-27 Baylor College Of Medicine Triplex forming oligonucleotide reagents targeted to the neu oncogene promoter and method of use
US5700922A (en) * 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5595726A (en) * 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5565552A (en) * 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US6017895A (en) * 1992-02-10 2000-01-25 Genzyme Corporation Oligonucleotides possessing zwitterionic moieties
WO1993018187A1 (en) * 1992-03-13 1993-09-16 California Institute Of Technology Triple helix recognition of dna
US5633360A (en) * 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5489508A (en) * 1992-05-13 1996-02-06 University Of Texas System Board Of Regents Therapy and diagnosis of conditions related to telomere length and/or telomerase activity
US5272250A (en) * 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) * 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
AU678769B2 (en) * 1992-07-27 1997-06-12 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
WO1994007367A1 (en) * 1992-09-29 1994-04-14 Apollon, Inc. Anti-viral oligomers that bind polypurine tracts of single-stranded rna or rna-dna hybrids
US7067497B2 (en) * 1992-09-29 2006-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of telomere length by oligonucleotides having a G-core sequence
IL107150A0 (en) * 1992-09-29 1993-12-28 Isis Pharmaceuticals Inc Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
US5574142A (en) * 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
AU691550B2 (en) * 1993-12-09 1998-05-21 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5599922A (en) * 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5958680A (en) * 1994-07-07 1999-09-28 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5583016A (en) * 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5597696A (en) * 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US20030032610A1 (en) * 1996-06-03 2003-02-13 Gilchrest Barbara A. Method to inhibit cell growth using oligonucleotides
US5968506A (en) * 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US5652356A (en) * 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
US6015710A (en) * 1996-04-09 2000-01-18 The University Of Texas System Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids
US5945290A (en) * 1998-09-18 1999-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of RhoA expression
EP1992634A1 (en) * 1999-09-10 2008-11-19 Geron Corporation Oligonucleotide n3'- p5' thiophosphoramidates: their synthesis and use
US20030175906A1 (en) * 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20040009156A1 (en) * 2001-10-12 2004-01-15 Christoph Reinhard Antisense therapy using oligonucleotides that target human kinesin genes for treatment of cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2818031B2 (ja) 1998-10-30
FI951467A0 (fi) 1995-03-28
NZ314251A (en) 1999-05-28
DE69332206D1 (de) 2002-09-19
IL107150A0 (en) 1993-12-28
BR1100614A (pt) 2000-04-11
EP0672193A4 (en) 1995-11-22
WO1994008053A1 (en) 1994-04-14
NO951191L (no) 1995-03-28
FI951467A (fi) 1995-03-28
US20070015723A1 (en) 2007-01-18
CA2145664C (en) 2002-08-20
EP0672193B1 (en) 2002-08-14
AU5167393A (en) 1994-04-26
EP1016715A1 (en) 2000-07-05
JPH08500738A (ja) 1996-01-30
CA2145664A1 (en) 1994-04-14
US20110124715A1 (en) 2011-05-26
US20070270363A1 (en) 2007-11-22
NZ256787A (en) 1997-04-24
KR0172153B1 (ko) 1999-02-01
HU9500911D0 (en) 1995-05-29
US5952490A (en) 1999-09-14
DE69332206T2 (de) 2003-05-28
EP0672193A1 (en) 1995-09-20
AU668604B2 (en) 1996-05-09
ATE222290T1 (de) 2002-08-15
KR950703659A (ko) 1995-09-20
US5523389A (en) 1996-06-04
NO951191D0 (no) 1995-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT70965A (en) Oligonucleotides having a conserved g4 core sequence
EP0677056B1 (en) Oligonucleotide alkylphosphonates and alkylphosphonothioates
EP0652890B1 (en) Oligonucleotide alkylphosphonothioates
US7045609B2 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6015886A (en) Oligonucleotide phosphate esters
EP0650493B1 (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US6143881A (en) Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
Kibler-Herzog et al. Duplex stabilities of phosphorothioate, methylphosphonate, and RNA analogs of two DNA 14-mers
EP0680969B1 (de) Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
Cohen Antisense oligodeoxynucleotides as antiviral agents
JPH08501928A (ja) 治療剤としての自己安定化オリゴヌクレオチド
EP0570514A1 (en) Methylene phosphonate nucleoside analogs and oligonucleotide analogs made therefrom
JP2003012688A (ja) オリゴヌクレオチドｎ３’→ｐ５’ホスホルアミデート：合成および化合物；ハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼ耐性特性
WO1988007544A1 (en) Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
JP2000507928A (ja) ホスホトリエステルオリゴヌクレオチド、アミダイト、およびそれらの調製法
Moriguchi et al. Base and backbone modified oligonucleotides and their application as antisense agent
WO2012149906A1 (zh) 具有抗hiv-1融合活性的修饰的核酸结构
WO1996003500A1 (fr) Substance a activite antivirale
AU2001284570A1 (en) New sequences
WO2002016608A1 (en) New sequences
Tondelli et al. Native oligodeoxynucleotides specifically active against human immunodeficiency virus type 1 in vitro: a G-quartet-driven effect?
CA2154474A1 (en) Oligodeoxynucleotides containing 5-alkyl, 5-(1-alkenyl)-and 5-(1-alkynyl)pyrimidines and pharmaceutical compositions containing such compounds

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee