JP4030598B2 - Ｈｓｖ１に対する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの製造 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】
ヒトヘルペスウイルスは一連の共通した特色、例えば共通した構造形態、複製の態様および一生持続する感染を起こす能力によって特徴付けられる。これは特に１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）にあてはまる。ＨＳＶは、皮膚、粘膜および角膜上皮の比較的軽い障害から、死に至るような結果をしばしば招く脳炎の重症ケースに至るまで、広範囲の疾患を引き起こす。宿主の生存中における潜伏ウイルスの周期的再活性化は皮膚障害を再発させ、しばしば重度の罹患率を伴う。
【０００２】
ＨＳＶの場合の抗ウイルス療法には様々な手法が存在する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばウイルス遺伝子発現を選択的に阻害し、したがって分子レベルで潜伏または再活性化から細胞を保護得る可能性を有している。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のメッセンジャーＲＮＡ配列と相補的であり、この配列と特異的に結合し、それによって遺伝子発現を特異的に阻害するものである(E.Uhlmann and A.Peyman,Chem.Rev.90(1990),543)。
【０００４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して知られ求められる、例えばヌクレアーゼに対する安定性、細胞に接近できる能力等、に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドがそれらの効果を発揮しうる標的配列の選択も非常に重要である。ＲＮＡの多くの領域はハイブリッド形成に通常適しているが、特に強い遺伝子発現の阻害を引き起こす領域も存在している。ヌクレアーゼに対する安定性、細胞に接近できる能力等に関して求められる事項は、化学的修飾により、例えばホスフェート（phosphate ）架橋を修飾すること、糖構築ブロックを変えること等により満たすことができる。標的配列の選択は塩基の配列によって唯一決定されるため、例えば糖‐リン酸主鎖（backbone）のような他の構造的要素は修飾できるが、但しハイブリッドを形成しうる能力は修飾（例えば、リン酸ジエステルに代わるホスホロチオエート（phoshorothioate ）により制限されてはならない。Watson-Crick塩基対形成の特異性が修飾（例えば、シトシンに代わる５‐メチルシトシン）により変わらないならば、修飾塩基も使用できる。
【０００５】
ＨＳＶ１ゲノムのある領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドをウイルスのコントロールに用いるとの報告がなされている。
要約すると、“全”ホスホロチオエート、即ちリン酸ジエステル架橋がホスホロチオエート架橋にすべて代えられたオリゴヌクレオチドは、細胞培養物中においてＨＳＶ１の阻害剤であるとされている（これに関連して、例えばJ.F.Milligan et al,J.Med.Chem.36(1993),1923 参照）。ＵＬ１３ｍＲＮＡに対する２１ｍｅｒホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４μＭの濃度で９０％以上ウイルスを阻害する（G.D.Hoke et al,Nucleic Acids Res.19(1991),5743）。同配列は、未修飾オリゴヌクレオチドとして、または各場合で３つのホスホロチオエート架橋を５´または３´末端に有するオリゴヌクレオチドとして用いられるとき、活性ではない。同時に、“全”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、アンチセンスメカニズムよりも他のメカニズムに起因した実質上非特異的な効果を示す。このため、例えばＳ（ｄＣ）28は１μＭの濃度であっても９０％ＨＳＶ１を阻害する(W.Gao et al,J.Biol.Chem.265(1990),20172）。
【０００６】
メチルホスホネート（Methylphosphonate ）オリゴヌクレオチドは、ＨＳＶ１に対して試験されたもう１つの種類の化合物である。ＨＳＶ１のＩＥ４遺伝子の５´スプライスアクセプター部位のエキソン／イントロン領域の重複配列に対する一連の４種の１２ｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドは１００μＭで個別に試験され、９〜９８％と広く分散したウイルス阻害結果を示した。ＩＥ１１０の翻訳開始に対する１２ｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドも同様に、ＨＳＶ１で最少の阻害を示すだけか、または全く阻害を示さなかった(M.Kulka et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989),6868;L.Aurelian et al，ＷＯ ９２／０５２８４（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６６４６））。
【０００７】
【発明の概要】
意外にも、我々は標的遺伝子の配列の限定されない１つのセグメントに対してアンチセンスオリゴヌクレオチドを配向させても決して十分ではないが、その代わりに標的配列に沿った最少の置換は活性上大きな変化があることを発見した。例えば、ＨＳＶ１のＩＥ１１０遺伝子の翻訳開始に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いても十分ではないが、その代わりに多数の考えうる配列の極く一部だけは、ＨＳＶ１に対して活性であることが見出され、それは表１で明らかにされている。用いられた試験条件下（８０μＭ以下の濃度でオリゴヌクレオチドを用いる試験）において、他の配列は今度は活性を示さないか、または最少限の活性を示すだけである。我々は他の標的遺伝子についても匹敵しうる結果を得ることができた（表２〜４）。意外にも、我々はＨＳＶ１に対して良好なレベルの活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを確認することができたが、それらは既に記載された“最良の”配列（G.D.Hoke et al,Nucleic Acids Res.19(1991),5743）においては、ＨＳＶ１に対していかなる活性も示さなかった最少限の化学的修飾（各ケースにおいて５´または３´末端いずれかで２つのホスホロチオエート架橋）を有しているだけである。
【０００８】
【発明の具体的説明】
したがって、本発明は下記配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの混合体に関する：
ＡＯ１ (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
ＡＯ２ (Herp018):5´-GCAGGAGGATGCTGAGGAGG-3´
ＡＯ３ (Herp002):5´-GGGGCGGGGCTCCATGGGGG-3´
ＡＯ４ (Herp112):5´-GGCGGGGCTCCATGGGGGTC-3´
ＡＯ５ (Herp034):5´-GGGGCTCCATGGGGGTCGTA-3´
ＡＯ６ (Herp024):5´-AACAGGTCCATTGGGTGGGG-3´または
ＡＯ７ (Herp028):5´-GGCCCTGCTGTTCCGTGGCG-3´。
【０００９】
好ましい配列は、
ＡＯ１ (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
ＡＯ２ (Herp018):5´-GCAGGAGGATGCTGAGGAGG-3´または
ＡＯ３ (Herp002):5´-GGGGCGGGGCTCCATGGGGG-3´
である。
【００１０】
特に好ましい配列は、
ＡＯ１ (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
である。
【００１１】
本発明は、２以内のヌクレオチド、好ましくは１つのヌクレオチドで、互いに独立して、各末端において切除（truncated ）または伸長されている、本発明によるオリゴヌクレオチドにも関する。加えて、本発明はそれらの９０％、特にそれらの９５％ホモログ（homolog ）と修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
これに関連して、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、例えばヌクレアーゼに対する安定性と細胞に接近できる能力のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質を改善して、しかも当業者に知られる化学的修飾を意味するとして理解されている（例えば：E.Uhlmann and A.Peyman,Chem.Rev.90(1990),543;P.D.Cook,Anti-Cancer Drug Design,6(1991),585;J.Goodchild,Bioconjugate Chem.1(1990),165;S.L.Beaucage and R.P.Iyer,Tetrahedron,49(1993),6123;F.Eckstein,Ed.,"Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach",IRL Press,1991)。
【００１２】
このような修飾の例としては下記のものが上げられる。
ａ）ホスフェート架橋の修飾；例示される修飾はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、メチルホスホネート、ホスホルアミデート（phosphoramidate ）、ボラノフォスフェート（boranophosphate ）、リン酸メチルエステル、リン酸エチルエステルおよびフェニルホスホネート（phenylphosphonate ）である。好ましいホスフェート架橋の修飾はホスホロチオエートおよびメチルホスホネートである。上記修飾による本発明のオリゴヌクレオチドのホスフェート架橋の全部の置換は除かれる。
【００１３】
ｂ）ホスフェート架橋の置換；例示される置換はホルムアセタール、３´‐チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよびシリル基による置換である。ホルムアセタールおよび３´‐チオホルムアセタールによる置換が好ましい。
【００１４】
ｃ）糖の修飾；例示される修飾はα‐アノマー糖、２´‐Ｏ‐メチルリボース、２´‐Ｏ‐ブチルリボース、２´‐Ｏ‐アリルリボース、２´‐フルオロ‐２´‐デオキシリボース、２´‐アミノ‐２´‐デオキシリボース、α‐アラビノフラノースおよび炭素環式糖アナログである。好ましい修飾は２´‐Ｏ‐メチルリボースによる場合である。
【００１５】
ｄ）Watson-Crick塩基対形成の特異性を減少させない塩基の修飾；例示される修飾は５‐プロピン‐２´‐デオキシウリジン、５‐プロピン‐２´‐デオキシシチジン、５‐フルオロ‐２´‐デオキシシチジン、５‐フルオロ‐２´‐デオキシウリジン、５‐ヒドロキシメチル‐２´‐デオキシウリジン、５‐メチル‐２´‐デオキシシチジンおよび５‐ブロモ‐２´‐デオキシシチジンである。好ましい修飾は５‐プロピン‐２´‐デオキシウリジンおよび５‐プロピン‐２´‐デオキシシチジンである。
【００１６】
ｅ）例えば“モルホリノヌクレオシド”オリゴマー(E.P.Stirchak et al,Nucleic Acids Res.17(1989),6129)または“ペプチド核酸”（例えば、Hanvey et al,Science,258(1992),1481)による糖リン酸主鎖の置換。
【００１７】
ｆ）５´および３´ホスフェートと５´および３´チオホスフェート。
【００１８】
ｇ）例えば３´または５´末端における複合体（更に、３´誘導化に関してはＥＰ‐Ａ２‐０ ５５２ ７６６参照）；例示される複合体はＤＭＡＢ‐３´またはポリリジン、ピレン、アクリジン、フェナジンまたはフェナントリジンのような挿入剤、フルオレセインのようなケイ光化合物、プソラレンまたはアジドプロフラビンのような架橋剤、Ｃ12‐Ｃ20アルキルのような親油性分子、１，２‐ジヘキサデシル-rac- グリセロールのような脂質、コレステロールまたはテストステロンのようなステロイド、ビタミンＥのようなビタミン、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、（Ｃ１‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステル、‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ18）アルキルとの複合体、特に例えば本発明による化合物ＡＯ２６のようなピレン誘導体との複合体である。
【００１９】
ｈ）３´‐３´および５´‐５´反転（例えば、M.Koga et al,J.Org.Chem.56(1991),3757)。
【００２０】
下記修飾が特に好ましい。
ａ）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートによるホスフェート架橋の置換。上記修飾による本発明のオリゴヌクレオチドの全ホスフェート架橋の置換は除かれる。
【００２１】
ｂ）Ｃ12‐Ｃ20アルキルのような親油性分子、コレステロールまたはテストステロンのようなステロイド、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、ビタミンＥ、ピレンのような挿入剤、（Ｃ14‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステルおよび‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ16）アルキルとの複合体。
【００２２】
下記修飾が特に好ましい。
ａ）５´および／または３´末端においてホスホロチオエートによる１、２または３つのホスフェート架橋の置換、特に５´および３´末端においてホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートによる２つのホスフェート架橋の置換。
【００２３】
ｂ）５´および／または３´末端においてホスホロチオエートによる１、２または３つのホスフェート架橋の置換、これに加えて中間においてホスホロチオエートによる１‐５ホスフェート架橋の置換。
【００２４】
ｃ）特に５´および／または３´末端においてホスホロチオエートによる１、２または３つのホスフェート架橋の置換と組み合わされた、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、コレステロール、テストステロン、ピレン、バチルおよびビタミンＥ、（Ｃ14‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステル並びに‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ16）アルキルとの複合体。
【００２５】
本発明は、更に当業者に公知の方法、特に化学合成による本発明の化合物の製造法、ＨＳＶ１に対する薬剤の製造に関する本発明による化合物の使用、本発明による１種以上の化合物が生理学上許容される賦形剤並びに適宜に適切な添加剤および／または補助物質と混和されるＨＳＶ１に対する薬剤の製造法と、ＨＳＶ１に対する薬剤の製造に関する本発明による化合物の使用にも関する。
【００２６】
注射が好ましい投与方式である。この目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは液体溶液、好ましくは例えばハンクス溶液またはリンゲル溶液のような生理学上許容される緩衝液中で処方される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは固体形で処方して、使用前に溶解または懸濁してもよい。全身投与上好ましい投与量は約０．０１〜約５０ mg/kg体重／日である。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ オリゴヌクレオチド合成
未修飾オリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学およびヨウ素による酸化を用いて、自動ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystems Model 380Bまたは394)で合成した。混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチドにホスホロチオエート架橋を導入するためには、ヨウ素(Applied Biosystems User Bulletin 65) の代わりにＴＥＴＤ（テトラエチルチウラムジスルフィド）を用いて酸化を行った。固体支持体（ＣＰＧまたはTentagel）からの開裂と５５℃で１８時間濃ＮＨ３を用いた保護基の除去の後に、オリゴヌクレオチドを最初にブタノール沈降(Sawadogo,Van Dyke,Nucl.Acids Res.19(1991),674）により精製した。次いでナトリウム塩をエタノール２．５容量部を用いてＮａＣｌの０．５Ｍ溶液からの沈降により得た。
【００２８】
〔４‐（１‐ピレニル）ブタニル〕ホスホジエステルは、J.S.Mann et al.,Bioconj.Chem.3(1992),554に記載されているように、５´末端で導入する。
オリゴヌクレオチドを：
ａ）２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５mMトリス‐ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０中における分析ゲル電気泳動、および／または
ｂ）ＨＰＬＣ分析：Water´s GenPak FAX、勾配ＣＨ３ＣＮ（４００ml）、Ｈ２Ｏ（１．６リットル）、ＮａＨ２ＰＯ４（３．１ｇ）、ＮａＣｌ（１７５．３ｇ）、ｐＨ６．８（ＮａＣｌ中１．５Ｍ）後にＣＨ３ＣＮ（４００ml）、Ｈ２Ｏ（１．６リットル）、ＮａＨ２ＰＯ４（３．１ｇ）、ＮａＣｌ（１１．７ｇ）、ｐＨ６．８（ＮａＣｌ中０．１Ｍ）、および／または
ｃ）キャピラリーゲル電気泳動、 Beckmann Kapillare eCAP（登録商標）、U100P ゲルカラム、長さ６５cm、I.D.１００mm、一端から１５cmに窓、緩衝液１４０μＭトリス、３６０μＭホウ酸、７Ｍ尿素、および／または
ｄ）電子流（electrospray）質量スペクトル測定
により分析した。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの分析では、それらが各場合において９０％以上の純度で存在していることを示した。
【００３０】
下記オリゴヌクレオチドを合成した。
No 配 列 a) 標 的 b)
ＡＯ１ (Herp099):5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´ IE110, TI
ＡＯ２ (Herp018):5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-3´ UL30,DNA-Pol, 中間
ＡＯ３ (Herp002):5´-G*G*GGCGGGGCTCCATGGG*G*G-3´ IE110, TI
ＡＯ４ (Herp112):5´-G*G*CGGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´ IE110, TI
ＡＯ５ (Herp034):5´-G*G*GGCTCCATGGGGGTCG*T*A-3´ IE110, TI
ＡＯ６ (Herp024):5´-A*A*GAGGTCCATTGGGTGG*G*G-3´ UL48, α-TIF,TI
ＡＯ７ (Herp028):5´-G*G*CCCTGCTGTTCCGTGG*C*G-3´ UL52, 中間
ＡＯ８ (HERP111):5´-G*G*GCGGGGCTCCATGGGG*G*T-3´ IE110, TI
ＡＯ９ (HERP100):5´-C*C*GGGGCGGGGCTCCATG*G*G-3´ IE110, TI
ＡＯ１０(HERP113):5´-C*G*GGGCTCCATGGGGGTC*G*T-3´ IE110, TI
ＡＯ１１(HERP114):5´-G*G*GCTCCATGGGGGTCGT*A*T-3´ IE110, TI
ＡＯ１２(HERP115):5´-G*C*TCCATGGGGGTCGTAT*G*C-3´ IE110, TI
ＡＯ１３(HERP017):5´-C*C*GGAAAACATCGCGGTT*G*T-3´ UL30,DNA-POL., TI
ＡＯ１４(HERP091):5´-C*C*GGGGGCGCTTGGCCGG*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１５(HERP092):5´-C*A*GCAGCTTGCGGGGCTT*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１６(HERP093):5´-C*C*CCCAACAGGTGGGAGA*A*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１７(HERP094):5´-G*G*GGGGTGCCACACTTCG*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１８(HERP016):5´-C*C*CACCCGAACCCCTAAA*G*A-3´ UL30, 5´- 非翻訳
ＡＯ１９(HERP023):5´-G*T*CCGCGTTCATGTCGGC*A*A-3´ UL48, α-TIF,TI
ＡＯ２０(HERP022):5´-A*A*CAGAGGCAGTCAAACA*G*G-3´ UL48, α-TIF, 中間
ＡＯ２１(HERP025):5´-A*T*ACGGGAAAGACCATAT*C*G-3´ UL48, 5´- 非翻訳
ＡＯ２２(HERP027):5´-G*T*CTTCCTGCCCCATTGC*G*T-3´ UL52, TI
ＡＯ２３(HERP026):5´-T*G*CGTCCGCGCGCCCAAG*G*G-3´ UL52, 5´- 非翻訳
ＡＯ２４ :5´-GCGGGGCTCCATGGGGG*T*C*G-3´ IE110, TI
ＡＯ２５ :5´-G*C*G*GGGCTCCATGGGGG T C G-3´ IE110, TI
ＡＯ２６ :5´-PY-G*C*GGGGCTCCATGGGGG T*C*G-3´ IE110, TI
ＡＯ２７ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-P-C14-3´UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ２８ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C12-3´UL30,DNA-POL.中間
ＡＯ２９ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C14-3´UL30,DNA-POL., 中間
ＡＯ３０ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C16-3´UL30,DNA-POL., 中間
ＡＯ３１ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C18-3´UL30,DNA-POL., 中間
ＡＯ３８ :5´-FAM-GCGGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´ JE110, TI
ＡＯ３９ :5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-3´ JE110, TI
ＡＯ４０ :5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-DMAB-3´ JE110, TI
ＡＯ４１ :5´-G-FAM-GCGGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-VITE-3´ JE110, TI
ＡＯ４２ :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´ JE110, TI
ＡＯ４３ :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-P-C14-3´ JE110, TI
ＡＯ４４ :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-P-BAT-3´ JE110, TI
コントロール
ＡＯ３２ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-3´
ＡＯ３３ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-P-C14-3´
ＡＯ３４ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCG*G*C*C-P-C12-3´
ＡＯ３５ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-P-C14-3´
【００３１】
ａ）ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した；５´‐ＰＹは５´‐〔４‐（１‐ピレニル）ブタニル〕ホスホジエステルを表す；
ｂ）ＨＳＶ１のゲノム上における標的配列、ＴＩ：標的遺伝子の翻訳開始部位、中間：標的遺伝子の中間
ｃ）３´誘導化オリゴヌクレオチドをＥＰ０５５２７６６ Ａ２に記載されたように合成した。これに関連して、ｐ‐Ｃ12‐３´は３´‐ｎ‐Ｃ12Ｈ25ホスフェート、ｐ‐Ｃ14は３´‐ｎ‐Ｃ14Ｈ29ホスフェート、ｐ‐Ｃ16は３´‐ｎ‐Ｃ16Ｈ33ホスフェート、ｐ‐Ｃ18は３´‐ｎ‐Ｃ18Ｈ37ホスフェートである；Ｐ‐３´は３´‐リン酸である；Ｐ‐ＶＩＴＥは３´ビタミンＥホスフェート、Ｐ‐ＢＡＴ‐３´‐は３´‐バチルホスフェートである；ＤＭＡＢ‐３´は
【００３２】
【化１】
であり、下記式のように標準ホスホルアミダイト化学を用いて誘導化支持体（ＤＭＴｒ：ジメトキシトリチル、ＣＰＧ：制御された孔のあるガラス）により導入した。
【００３３】
【化２】
【００３４】
５´‐ＦＡＭは３´‐ヒドロキシ‐２‐（Ｎ‐チオ尿素‐フルオレセイン‐４‐アミノブチル）プロピル‐１‐Ｏ‐ホスフェートであり、F.Schubert et al,Nucl.Acids Res.18(1990),3427 のように対応ホスホルアミダイトにより導入する。
【００３５】
実施例２ ヘルペスウイルスに対する試験物質のインビトロ抗ウイルス活性の研究
ヒトにとり病原性である異なるヘルペスウイルスに対する試験物質の抗ウイルス活性を細胞培養試験系で研究する。
実験のために、血清含有ダルベッコＭＥＭ（５％牛胎児血清、ＦＣＳ）中のサル腎臓細胞（Vero、２×１０５/ml)を９６ウェル微量滴定プレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。次いで血清含有培地を吸出し、細胞を無血清ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）で２回洗浄した。
【００３６】
試験物質を６００μＭの濃度までＨ２Ｏで前希釈し、−１８℃で貯蔵する。更にダルベッコ最少必須培地（ＭＥＭ）による希釈ステップを試験のために実施する。各場合において、個々の試験物質希釈液１００μリットルを無血清ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）１００μリットルと一緒に洗浄された細胞に加える。
【００３７】
３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートした後、細胞ローン（ｌａｗｎ）が３日間以内で完全に壊される濃度で細胞を単純ヘルペスウイルス１型（ＡＴＣＣ ＶＲ７３３、ＨＳＶ１ Ｆ株）で感染させる。ＨＳＶ１の場合に感染の大きさは５００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ウェルであり、ＨＳＶ２の場合には３５０PFU/ウェルである。その際に、実験混合液はペニシリンＧ１００U/mlおよびストレプトマイシン１００mg/lを補充したＭＥＭ中８０〜０．０４μＭの濃度で試験物質を含有している。すべての実験は二重測定として実施するが、但しコントロールでは各プレートで８回実施する。
【００３８】
実験混合液を３７℃および５％ＣＯ２で１７時間インキュベートする。試験物質の細胞毒性は細胞培養物の顕微鏡評価により２０時間の全インキュベート時間後に調べる。上記実験条件下でいかなる顕微鏡で認識しうる細胞障害も示さない調製物の最大濃度は、最大許容用量（ＭＴＤ）と称される。
【００３９】
次いで最終濃度４％までＦＣＳを加え、更に３７℃および５％ＣＯ２で５５時間インキュベートする。その際に、未処理感染コントロールは完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。顕微鏡で評価した後、細胞培養物をFinter(1966)の生体染色法に従いニュートラルレッドで染色する。試験物質の抗ウイルス活性は、ウイルスに起因する細胞病原性効果から細胞を３０〜６０％保護するために要求される最少阻害濃度（ＭＩＣ）として規定される。
【００４０】
実験の結果は表１〜６に示されている。
表１：
ＨＳＶ１のＩＥ１１０遺伝子の翻訳開始に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４１】
【００４２】
表２：
ＨＳＶ１のＵＬ３０遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４３】
【００４４】
表３：
ＨＳＶ１のＵＬ４８遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４５】
【００４６】
表４：
ＨＳＶ１のＵＬ５２遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４７】
【００４８】
表５：
【００４９】
【００５０】
表６：コントロール
【００５１】
ＡＯ３２： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-3´ >80
ＡＯ３３： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-p-C14-3´ >80
ＡＯ３４： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCG*G*C*C-p-C12-3´ >80
ＡＯ３５： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-p-C14-3´ >80
【００５２】
実施例３ ヘルペスウイルスに対する試験物質のインビボ抗ウイルス活性の研究
特定の病原体を有しない体重約１５ｇのＮＭＲＩマウス（ＮＭＲＩ：Naval Medical Research Institute）を単純ヘルペス１型で腹腔内感染させ、その後下記化合物で腹腔内、皮下または経口処理した。本発明による化合物の投与量は１〜１００μｇであった。動物を感染後から始めて２．５日間にわたり１日２回処理した。処理動物における罹患および生存率と未処理感染コントロールの場合との経過の比較を用いて、治療の成功を調べた。試験される化合物の代わりに、未処理感染コントロールの水溶性メチルヒドロキシエチルセルロース（２％溶液中粘度３００Pa）（(R)Tylose MH 300 P）を投与した。
【００５３】
下記オリゴヌクレオチドを試験した。
5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´
【００５４】
予備評価では、試験されたオリゴヌクレオチドが試験された濃度範囲においてコントロールと比較して活性であることが示された。
【００５５】
【配列表】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【００６０】
【００６１】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
【００９０】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【発明の背景】
ヒトヘルペスウイルスは一連の共通した特色、例えば共通した構造形態、複製の態様および一生持続する感染を起こす能力によって特徴付けられる。これは特に１型および２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）にあてはまる。ＨＳＶは、皮膚、粘膜および角膜上皮の比較的軽い障害から、死に至るような結果をしばしば招く脳炎の重症ケースに至るまで、広範囲の疾患を引き起こす。宿主の生存中における潜伏ウイルスの周期的再活性化は皮膚障害を再発させ、しばしば重度の罹患率を伴う。
【０００２】
ＨＳＶの場合の抗ウイルス療法には様々な手法が存在する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばウイルス遺伝子発現を選択的に阻害し、したがって分子レベルで潜伏または再活性化から細胞を保護得る可能性を有している。
【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のメッセンジャーＲＮＡ配列と相補的であり、この配列と特異的に結合し、それによって遺伝子発現を特異的に阻害するものである(E.Uhlmann and A.Peyman,Chem.Rev.90(1990),543)。
【０００４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して知られ求められる、例えばヌクレアーゼに対する安定性、細胞に接近できる能力等、に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドがそれらの効果を発揮しうる標的配列の選択も非常に重要である。ＲＮＡの多くの領域はハイブリッド形成に通常適しているが、特に強い遺伝子発現の阻害を引き起こす領域も存在している。ヌクレアーゼに対する安定性、細胞に接近できる能力等に関して求められる事項は、化学的修飾により、例えばホスフェート（phosphate ）架橋を修飾すること、糖構築ブロックを変えること等により満たすことができる。標的配列の選択は塩基の配列によって唯一決定されるため、例えば糖‐リン酸主鎖（backbone）のような他の構造的要素は修飾できるが、但しハイブリッドを形成しうる能力は修飾（例えば、リン酸ジエステルに代わるホスホロチオエート（phoshorothioate ）により制限されてはならない。Watson-Crick塩基対形成の特異性が修飾（例えば、シトシンに代わる５‐メチルシトシン）により変わらないならば、修飾塩基も使用できる。
【０００５】
ＨＳＶ１ゲノムのある領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドをウイルスのコントロールに用いるとの報告がなされている。
要約すると、“全”ホスホロチオエート、即ちリン酸ジエステル架橋がホスホロチオエート架橋にすべて代えられたオリゴヌクレオチドは、細胞培養物中においてＨＳＶ１の阻害剤であるとされている（これに関連して、例えばJ.F.Milligan et al,J.Med.Chem.36(1993),1923 参照）。ＵＬ１３ｍＲＮＡに対する２１ｍｅｒホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、４μＭの濃度で９０％以上ウイルスを阻害する（G.D.Hoke et al,Nucleic Acids Res.19(1991),5743）。同配列は、未修飾オリゴヌクレオチドとして、または各場合で３つのホスホロチオエート架橋を５´または３´末端に有するオリゴヌクレオチドとして用いられるとき、活性ではない。同時に、“全”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、アンチセンスメカニズムよりも他のメカニズムに起因した実質上非特異的な効果を示す。このため、例えばＳ（ｄＣ）28は１μＭの濃度であっても９０％ＨＳＶ１を阻害する(W.Gao et al,J.Biol.Chem.265(1990),20172）。
【０００６】
メチルホスホネート（Methylphosphonate ）オリゴヌクレオチドは、ＨＳＶ１に対して試験されたもう１つの種類の化合物である。ＨＳＶ１のＩＥ４遺伝子の５´スプライスアクセプター部位のエキソン／イントロン領域の重複配列に対する一連の４種の１２ｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドは１００μＭで個別に試験され、９〜９８％と広く分散したウイルス阻害結果を示した。ＩＥ１１０の翻訳開始に対する１２ｍｅｒアンチセンスオリゴヌクレオチドも同様に、ＨＳＶ１で最少の阻害を示すだけか、または全く阻害を示さなかった(M.Kulka et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989),6868;L.Aurelian et al，ＷＯ ９２／０５２８４（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０６６４６））。
【０００７】
【発明の概要】
意外にも、我々は標的遺伝子の配列の限定されない１つのセグメントに対してアンチセンスオリゴヌクレオチドを配向させても決して十分ではないが、その代わりに標的配列に沿った最少の置換は活性上大きな変化があることを発見した。例えば、ＨＳＶ１のＩＥ１１０遺伝子の翻訳開始に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いても十分ではないが、その代わりに多数の考えうる配列の極く一部だけは、ＨＳＶ１に対して活性であることが見出され、それは表１で明らかにされている。用いられた試験条件下（８０μＭ以下の濃度でオリゴヌクレオチドを用いる試験）において、他の配列は今度は活性を示さないか、または最少限の活性を示すだけである。我々は他の標的遺伝子についても匹敵しうる結果を得ることができた（表２〜４）。意外にも、我々はＨＳＶ１に対して良好なレベルの活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを確認することができたが、それらは既に記載された“最良の”配列（G.D.Hoke et al,Nucleic Acids Res.19(1991),5743）においては、ＨＳＶ１に対していかなる活性も示さなかった最少限の化学的修飾（各ケースにおいて５´または３´末端いずれかで２つのホスホロチオエート架橋）を有しているだけである。
【０００８】
【発明の具体的説明】
したがって、本発明は下記配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの混合体に関する：
ＡＯ１ (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
ＡＯ２ (Herp018):5´-GCAGGAGGATGCTGAGGAGG-3´
ＡＯ３ (Herp002):5´-GGGGCGGGGCTCCATGGGGG-3´
ＡＯ４ (Herp112):5´-GGCGGGGCTCCATGGGGGTC-3´
ＡＯ５ (Herp034):5´-GGGGCTCCATGGGGGTCGTA-3´
ＡＯ６ (Herp024):5´-AACAGGTCCATTGGGTGGGG-3´または
ＡＯ７ (Herp028):5´-GGCCCTGCTGTTCCGTGGCG-3´。
【０００９】
好ましい配列は、
ＡＯ１ (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
ＡＯ２ (Herp018):5´-GCAGGAGGATGCTGAGGAGG-3´または
ＡＯ３ (Herp002):5´-GGGGCGGGGCTCCATGGGGG-3´
である。
【００１０】
特に好ましい配列は、
ＡＯ１ (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
である。
【００１１】
本発明は、２以内のヌクレオチド、好ましくは１つのヌクレオチドで、互いに独立して、各末端において切除（truncated ）または伸長されている、本発明によるオリゴヌクレオチドにも関する。加えて、本発明はそれらの９０％、特にそれらの９５％ホモログ（homolog ）と修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
これに関連して、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、例えばヌクレアーゼに対する安定性と細胞に接近できる能力のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質を改善して、しかも当業者に知られる化学的修飾を意味するとして理解されている（例えば：E.Uhlmann and A.Peyman,Chem.Rev.90(1990),543;P.D.Cook,Anti-Cancer Drug Design,6(1991),585;J.Goodchild,Bioconjugate Chem.1(1990),165;S.L.Beaucage and R.P.Iyer,Tetrahedron,49(1993),6123;F.Eckstein,Ed.,"Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach",IRL Press,1991)。
【００１２】
このような修飾の例としては下記のものが上げられる。
ａ）ホスフェート架橋の修飾；例示される修飾はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）、メチルホスホネート、ホスホルアミデート（phosphoramidate ）、ボラノフォスフェート（boranophosphate ）、リン酸メチルエステル、リン酸エチルエステルおよびフェニルホスホネート（phenylphosphonate ）である。好ましいホスフェート架橋の修飾はホスホロチオエートおよびメチルホスホネートである。上記修飾による本発明のオリゴヌクレオチドのホスフェート架橋の全部の置換は除かれる。
【００１３】
ｂ）ホスフェート架橋の置換；例示される置換はホルムアセタール、３´‐チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよびシリル基による置換である。ホルムアセタールおよび３´‐チオホルムアセタールによる置換が好ましい。
【００１４】
ｃ）糖の修飾；例示される修飾はα‐アノマー糖、２´‐Ｏ‐メチルリボース、２´‐Ｏ‐ブチルリボース、２´‐Ｏ‐アリルリボース、２´‐フルオロ‐２´‐デオキシリボース、２´‐アミノ‐２´‐デオキシリボース、α‐アラビノフラノースおよび炭素環式糖アナログである。好ましい修飾は２´‐Ｏ‐メチルリボースによる場合である。
【００１５】
ｄ）Watson-Crick塩基対形成の特異性を減少させない塩基の修飾；例示される修飾は５‐プロピン‐２´‐デオキシウリジン、５‐プロピン‐２´‐デオキシシチジン、５‐フルオロ‐２´‐デオキシシチジン、５‐フルオロ‐２´‐デオキシウリジン、５‐ヒドロキシメチル‐２´‐デオキシウリジン、５‐メチル‐２´‐デオキシシチジンおよび５‐ブロモ‐２´‐デオキシシチジンである。好ましい修飾は５‐プロピン‐２´‐デオキシウリジンおよび５‐プロピン‐２´‐デオキシシチジンである。
【００１６】
ｅ）例えば“モルホリノヌクレオシド”オリゴマー(E.P.Stirchak et al,Nucleic Acids Res.17(1989),6129)または“ペプチド核酸”（例えば、Hanvey et al,Science,258(1992),1481)による糖リン酸主鎖の置換。
【００１７】
ｆ）５´および３´ホスフェートと５´および３´チオホスフェート。
【００１８】
ｇ）例えば３´または５´末端における複合体（更に、３´誘導化に関してはＥＰ‐Ａ２‐０ ５５２ ７６６参照）；例示される複合体はＤＭＡＢ‐３´またはポリリジン、ピレン、アクリジン、フェナジンまたはフェナントリジンのような挿入剤、フルオレセインのようなケイ光化合物、プソラレンまたはアジドプロフラビンのような架橋剤、Ｃ12‐Ｃ20アルキルのような親油性分子、１，２‐ジヘキサデシル-rac- グリセロールのような脂質、コレステロールまたはテストステロンのようなステロイド、ビタミンＥのようなビタミン、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、（Ｃ１‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステル、‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ18）アルキルとの複合体、特に例えば本発明による化合物ＡＯ２６のようなピレン誘導体との複合体である。
【００１９】
ｈ）３´‐３´および５´‐５´反転（例えば、M.Koga et al,J.Org.Chem.56(1991),3757)。
【００２０】
下記修飾が特に好ましい。
ａ）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートによるホスフェート架橋の置換。上記修飾による本発明のオリゴヌクレオチドの全ホスフェート架橋の置換は除かれる。
【００２１】
ｂ）Ｃ12‐Ｃ20アルキルのような親油性分子、コレステロールまたはテストステロンのようなステロイド、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、ビタミンＥ、ピレンのような挿入剤、（Ｃ14‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステルおよび‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ16）アルキルとの複合体。
【００２２】
下記修飾が特に好ましい。
ａ）５´および／または３´末端においてホスホロチオエートによる１、２または３つのホスフェート架橋の置換、特に５´および３´末端においてホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートによる２つのホスフェート架橋の置換。
【００２３】
ｂ）５´および／または３´末端においてホスホロチオエートによる１、２または３つのホスフェート架橋の置換、これに加えて中間においてホスホロチオエートによる１‐５ホスフェート架橋の置換。
【００２４】
ｃ）特に５´および／または３´末端においてホスホロチオエートによる１、２または３つのホスフェート架橋の置換と組み合わされた、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、コレステロール、テストステロン、ピレン、バチルおよびビタミンＥ、（Ｃ14‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステル並びに‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ16）アルキルとの複合体。
【００２５】
本発明は、更に当業者に公知の方法、特に化学合成による本発明の化合物の製造法、ＨＳＶ１に対する薬剤の製造に関する本発明による化合物の使用、本発明による１種以上の化合物が生理学上許容される賦形剤並びに適宜に適切な添加剤および／または補助物質と混和されるＨＳＶ１に対する薬剤の製造法と、ＨＳＶ１に対する薬剤の製造に関する本発明による化合物の使用にも関する。
【００２６】
注射が好ましい投与方式である。この目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは液体溶液、好ましくは例えばハンクス溶液またはリンゲル溶液のような生理学上許容される緩衝液中で処方される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは固体形で処方して、使用前に溶解または懸濁してもよい。全身投与上好ましい投与量は約０．０１〜約５０ mg/kg体重／日である。
【００２７】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ オリゴヌクレオチド合成
未修飾オリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学およびヨウ素による酸化を用いて、自動ＤＮＡシンセサイザー(Applied Biosystems Model 380Bまたは394)で合成した。混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチドにホスホロチオエート架橋を導入するためには、ヨウ素(Applied Biosystems User Bulletin 65) の代わりにＴＥＴＤ（テトラエチルチウラムジスルフィド）を用いて酸化を行った。固体支持体（ＣＰＧまたはTentagel）からの開裂と５５℃で１８時間濃ＮＨ３を用いた保護基の除去の後に、オリゴヌクレオチドを最初にブタノール沈降(Sawadogo,Van Dyke,Nucl.Acids Res.19(1991),674）により精製した。次いでナトリウム塩をエタノール２．５容量部を用いてＮａＣｌの０．５Ｍ溶液からの沈降により得た。
【００２８】
〔４‐（１‐ピレニル）ブタニル〕ホスホジエステルは、J.S.Mann et al.,Bioconj.Chem.3(1992),554に記載されているように、５´末端で導入する。
オリゴヌクレオチドを：
ａ）２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５mMトリス‐ホウ酸緩衝液、ｐＨ７．０中における分析ゲル電気泳動、および／または
ｂ）ＨＰＬＣ分析：Water´s GenPak FAX、勾配ＣＨ３ＣＮ（４００ml）、Ｈ２Ｏ（１．６リットル）、ＮａＨ２ＰＯ４（３．１ｇ）、ＮａＣｌ（１７５．３ｇ）、ｐＨ６．８（ＮａＣｌ中１．５Ｍ）後にＣＨ３ＣＮ（４００ml）、Ｈ２Ｏ（１．６リットル）、ＮａＨ２ＰＯ４（３．１ｇ）、ＮａＣｌ（１１．７ｇ）、ｐＨ６．８（ＮａＣｌ中０．１Ｍ）、および／または
ｃ）キャピラリーゲル電気泳動、 Beckmann Kapillare eCAP（登録商標）、U100P ゲルカラム、長さ６５cm、I.D.１００mm、一端から１５cmに窓、緩衝液１４０μＭトリス、３６０μＭホウ酸、７Ｍ尿素、および／または
ｄ）電子流（electrospray）質量スペクトル測定
により分析した。
【００２９】
オリゴヌクレオチドの分析では、それらが各場合において９０％以上の純度で存在していることを示した。
【００３０】
下記オリゴヌクレオチドを合成した。
No 配 列 a) 標 的 b)
ＡＯ１ (Herp099):5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´ IE110, TI
ＡＯ２ (Herp018):5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-3´ UL30,DNA-Pol, 中間
ＡＯ３ (Herp002):5´-G*G*GGCGGGGCTCCATGGG*G*G-3´ IE110, TI
ＡＯ４ (Herp112):5´-G*G*CGGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´ IE110, TI
ＡＯ５ (Herp034):5´-G*G*GGCTCCATGGGGGTCG*T*A-3´ IE110, TI
ＡＯ６ (Herp024):5´-A*A*GAGGTCCATTGGGTGG*G*G-3´ UL48, α-TIF,TI
ＡＯ７ (Herp028):5´-G*G*CCCTGCTGTTCCGTGG*C*G-3´ UL52, 中間
ＡＯ８ (HERP111):5´-G*G*GCGGGGCTCCATGGGG*G*T-3´ IE110, TI
ＡＯ９ (HERP100):5´-C*C*GGGGCGGGGCTCCATG*G*G-3´ IE110, TI
ＡＯ１０(HERP113):5´-C*G*GGGCTCCATGGGGGTC*G*T-3´ IE110, TI
ＡＯ１１(HERP114):5´-G*G*GCTCCATGGGGGTCGT*A*T-3´ IE110, TI
ＡＯ１２(HERP115):5´-G*C*TCCATGGGGGTCGTAT*G*C-3´ IE110, TI
ＡＯ１３(HERP017):5´-C*C*GGAAAACATCGCGGTT*G*T-3´ UL30,DNA-POL., TI
ＡＯ１４(HERP091):5´-C*C*GGGGGCGCTTGGCCGG*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１５(HERP092):5´-C*A*GCAGCTTGCGGGGCTT*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１６(HERP093):5´-C*C*CCCAACAGGTGGGAGA*A*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１７(HERP094):5´-G*G*GGGGTGCCACACTTCG*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ１８(HERP016):5´-C*C*CACCCGAACCCCTAAA*G*A-3´ UL30, 5´- 非翻訳
ＡＯ１９(HERP023):5´-G*T*CCGCGTTCATGTCGGC*A*A-3´ UL48, α-TIF,TI
ＡＯ２０(HERP022):5´-A*A*CAGAGGCAGTCAAACA*G*G-3´ UL48, α-TIF, 中間
ＡＯ２１(HERP025):5´-A*T*ACGGGAAAGACCATAT*C*G-3´ UL48, 5´- 非翻訳
ＡＯ２２(HERP027):5´-G*T*CTTCCTGCCCCATTGC*G*T-3´ UL52, TI
ＡＯ２３(HERP026):5´-T*G*CGTCCGCGCGCCCAAG*G*G-3´ UL52, 5´- 非翻訳
ＡＯ２４ :5´-GCGGGGCTCCATGGGGG*T*C*G-3´ IE110, TI
ＡＯ２５ :5´-G*C*G*GGGCTCCATGGGGG T C G-3´ IE110, TI
ＡＯ２６ :5´-PY-G*C*GGGGCTCCATGGGGG T*C*G-3´ IE110, TI
ＡＯ２７ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-P-C14-3´UL30,DNA-POL.,中間
ＡＯ２８ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C12-3´UL30,DNA-POL.中間
ＡＯ２９ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C14-3´UL30,DNA-POL., 中間
ＡＯ３０ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C16-3´UL30,DNA-POL., 中間
ＡＯ３１ :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C18-3´UL30,DNA-POL., 中間
ＡＯ３８ :5´-FAM-GCGGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´ JE110, TI
ＡＯ３９ :5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-3´ JE110, TI
ＡＯ４０ :5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-DMAB-3´ JE110, TI
ＡＯ４１ :5´-G-FAM-GCGGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-VITE-3´ JE110, TI
ＡＯ４２ :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´ JE110, TI
ＡＯ４３ :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-P-C14-3´ JE110, TI
ＡＯ４４ :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-P-BAT-3´ JE110, TI
コントロール
ＡＯ３２ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-3´
ＡＯ３３ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-P-C14-3´
ＡＯ３４ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCG*G*C*C-P-C12-3´
ＡＯ３５ :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-P-C14-3´
【００３１】
ａ）ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した；５´‐ＰＹは５´‐〔４‐（１‐ピレニル）ブタニル〕ホスホジエステルを表す；
ｂ）ＨＳＶ１のゲノム上における標的配列、ＴＩ：標的遺伝子の翻訳開始部位、中間：標的遺伝子の中間
ｃ）３´誘導化オリゴヌクレオチドをＥＰ０５５２７６６ Ａ２に記載されたように合成した。これに関連して、ｐ‐Ｃ12‐３´は３´‐ｎ‐Ｃ12Ｈ25ホスフェート、ｐ‐Ｃ14は３´‐ｎ‐Ｃ14Ｈ29ホスフェート、ｐ‐Ｃ16は３´‐ｎ‐Ｃ16Ｈ33ホスフェート、ｐ‐Ｃ18は３´‐ｎ‐Ｃ18Ｈ37ホスフェートである；Ｐ‐３´は３´‐リン酸である；Ｐ‐ＶＩＴＥは３´ビタミンＥホスフェート、Ｐ‐ＢＡＴ‐３´‐は３´‐バチルホスフェートである；ＤＭＡＢ‐３´は
【００３２】
【化１】
【００３３】
【化２】
５´‐ＦＡＭは３´‐ヒドロキシ‐２‐（Ｎ‐チオ尿素‐フルオレセイン‐４‐アミノブチル）プロピル‐１‐Ｏ‐ホスフェートであり、F.Schubert et al,Nucl.Acids Res.18(1990),3427 のように対応ホスホルアミダイトにより導入する。
【００３５】
実施例２ ヘルペスウイルスに対する試験物質のインビトロ抗ウイルス活性の研究
ヒトにとり病原性である異なるヘルペスウイルスに対する試験物質の抗ウイルス活性を細胞培養試験系で研究する。
実験のために、血清含有ダルベッコＭＥＭ（５％牛胎児血清、ＦＣＳ）中のサル腎臓細胞（Vero、２×１０５/ml)を９６ウェル微量滴定プレートに播種し、３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。次いで血清含有培地を吸出し、細胞を無血清ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）で２回洗浄した。
【００３６】
試験物質を６００μＭの濃度までＨ２Ｏで前希釈し、−１８℃で貯蔵する。更にダルベッコ最少必須培地（ＭＥＭ）による希釈ステップを試験のために実施する。各場合において、個々の試験物質希釈液１００μリットルを無血清ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）１００μリットルと一緒に洗浄された細胞に加える。
【００３７】
３７℃および５％ＣＯ２で３時間インキュベートした後、細胞ローン（ｌａｗｎ）が３日間以内で完全に壊される濃度で細胞を単純ヘルペスウイルス１型（ＡＴＣＣ ＶＲ７３３、ＨＳＶ１ Ｆ株）で感染させる。ＨＳＶ１の場合に感染の大きさは５００プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ウェルであり、ＨＳＶ２の場合には３５０PFU/ウェルである。その際に、実験混合液はペニシリンＧ１００U/mlおよびストレプトマイシン１００mg/lを補充したＭＥＭ中８０〜０．０４μＭの濃度で試験物質を含有している。すべての実験は二重測定として実施するが、但しコントロールでは各プレートで８回実施する。
【００３８】
実験混合液を３７℃および５％ＣＯ２で１７時間インキュベートする。試験物質の細胞毒性は細胞培養物の顕微鏡評価により２０時間の全インキュベート時間後に調べる。上記実験条件下でいかなる顕微鏡で認識しうる細胞障害も示さない調製物の最大濃度は、最大許容用量（ＭＴＤ）と称される。
【００３９】
次いで最終濃度４％までＦＣＳを加え、更に３７℃および５％ＣＯ２で５５時間インキュベートする。その際に、未処理感染コントロールは完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す。顕微鏡で評価した後、細胞培養物をFinter(1966)の生体染色法に従いニュートラルレッドで染色する。試験物質の抗ウイルス活性は、ウイルスに起因する細胞病原性効果から細胞を３０〜６０％保護するために要求される最少阻害濃度（ＭＩＣ）として規定される。
【００４０】
実験の結果は表１〜６に示されている。
表１：
ＨＳＶ１のＩＥ１１０遺伝子の翻訳開始に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４１】
表２：
ＨＳＶ１のＵＬ３０遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４３】
表３：
ＨＳＶ１のＵＬ４８遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４５】
表４：
ＨＳＶ１のＵＬ５２遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中＊で示した。
【００４７】
表５：
【００４９】
表６：コントロール
【００５１】
ＡＯ３２： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-3´ >80
ＡＯ３３： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-p-C14-3´ >80
ＡＯ３４： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCG*G*C*C-p-C12-3´ >80
ＡＯ３５： 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-p-C14-3´ >80
【００５２】
実施例３ ヘルペスウイルスに対する試験物質のインビボ抗ウイルス活性の研究
特定の病原体を有しない体重約１５ｇのＮＭＲＩマウス（ＮＭＲＩ：Naval Medical Research Institute）を単純ヘルペス１型で腹腔内感染させ、その後下記化合物で腹腔内、皮下または経口処理した。本発明による化合物の投与量は１〜１００μｇであった。動物を感染後から始めて２．５日間にわたり１日２回処理した。処理動物における罹患および生存率と未処理感染コントロールの場合との経過の比較を用いて、治療の成功を調べた。試験される化合物の代わりに、未処理感染コントロールの水溶性メチルヒドロキシエチルセルロース（２％溶液中粘度３００Pa）（(R)Tylose MH 300 P）を投与した。
【００５３】
下記オリゴヌクレオチドを試験した。
5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´
【００５４】
予備評価では、試験されたオリゴヌクレオチドが試験された濃度範囲においてコントロールと比較して活性であることが示された。
【００５５】
【配列表】
Claims (8)
- 下記配列で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＡＯ１ (Herp099):5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´
ＡＯ２ (Herp018):5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-3´
ＡＯ３ (Herp002):5´-G*G*GGCGGGGCTCCATGGG*G*G-3´
ＡＯ４ (Herp112):5´-G*G*CGGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´
ＡＯ５ (Herp034):5´-G*G*GGCTCCATGGGGGTCG*T*A-3´または
ＡＯ７ (Herp028):5´-G*G*CCCTGCTGTTCCGTGG*C*G-3´
（但し、＊はホスホジエステル結合がホスホチオエート架橋により置換されたことを意味する）。 - 配列がＡＯ１（Herp099）およびＡＯ３（Herp002）から選択される、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドの５′および／または３′末端において、オリゴヌクレオチドが３´‐リン酸；フルオレセイン；（Ｃ12‐Ｃ20）アルキルである親油性分子；ステロイド；ポリエチレングリコール；オリゴエチレングリコール；ビタミンＥ；ピレン、アクリジン、フェナジン、およびフェナントリジンから選択される挿入剤；（Ｃ１‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステルに、または‐Ｏ‐ＣＨ２‐ＣＨ（ＯＨ）‐Ｏ‐（Ｃ12‐Ｃ16）アルキルに結合されている、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- （Ｃ１‐Ｃ18）アルキルリン酸ジエステルが、Ｃｌ、Ｂｒおよび／またはＯＨにより１または２以上で置換された、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドの５′および／または３′末端において、オリゴヌクレオチドが（Ｃ12‐Ｃ20）アルキル、コレステロール、テストステロン、ヘキサエチレングリコールまたはピレンに結合されている、請求項３または４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- オリゴヌクレオチドを化学合成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造法。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載された少くとも１種のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、生理学上許容される賦形剤、並びに適宜に適切な添加剤および／または補助物質と混合される、ＨＳＶ１に対する薬剤の製造法。
- 請求項１〜５のいずれか一項に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、ＨＳＶ１に対する薬剤。
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