JP4030598B2 - Hsv1に対する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの製造 - Google Patents

Hsv1に対する新規アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの製造 Download PDF

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Description

【0001】
【発明の背景】
ヒトヘルペスウイルスは一連の共通した特色、例えば共通した構造形態、複製の態様および一生持続する感染を起こす能力によって特徴付けられる。これは特に1型および2型単純ヘルペスウイルス(HSV1およびHSV2)にあてはまる。HSVは、皮膚、粘膜および角膜上皮の比較的軽い障害から、死に至るような結果をしばしば招く脳炎の重症ケースに至るまで、広範囲の疾患を引き起こす。宿主の生存中における潜伏ウイルスの周期的再活性化は皮膚障害を再発させ、しばしば重度の罹患率を伴う。
【0002】
HSVの場合の抗ウイルス療法には様々な手法が存在する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばウイルス遺伝子発現を選択的に阻害し、したがって分子レベルで潜伏または再活性化から細胞を保護得る可能性を有している。
【0003】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のメッセンジャーRNA配列と相補的であり、この配列と特異的に結合し、それによって遺伝子発現を特異的に阻害するものである(E.Uhlmann and A.Peyman,Chem.Rev.90(1990),543)。
【0004】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して知られ求められる、例えばヌクレアーゼに対する安定性、細胞に接近できる能力等、に加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドがそれらの効果を発揮しうる標的配列の選択も非常に重要である。RNAの多くの領域はハイブリッド形成に通常適しているが、特に強い遺伝子発現の阻害を引き起こす領域も存在している。ヌクレアーゼに対する安定性、細胞に接近できる能力等に関して求められる事項は、化学的修飾により、例えばホスフェート(phosphate )架橋を修飾すること、糖構築ブロックを変えること等により満たすことができる。標的配列の選択は塩基の配列によって唯一決定されるため、例えば糖‐リン酸主鎖(backbone)のような他の構造的要素は修飾できるが、但しハイブリッドを形成しうる能力は修飾(例えば、リン酸ジエステルに代わるホスホロチオエート(phoshorothioate )により制限されてはならない。Watson-Crick塩基対形成の特異性が修飾(例えば、シトシンに代わる5‐メチルシトシン)により変わらないならば、修飾塩基も使用できる。
【0005】
HSV1ゲノムのある領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドをウイルスのコントロールに用いるとの報告がなされている。
要約すると、“全”ホスホロチオエート、即ちリン酸ジエステル架橋がホスホロチオエート架橋にすべて代えられたオリゴヌクレオチドは、細胞培養物中においてHSV1の阻害剤であるとされている(これに関連して、例えばJ.F.Milligan et al,J.Med.Chem.36(1993),1923 参照)。UL13mRNAに対する21merホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、4μMの濃度で90%以上ウイルスを阻害する(G.D.Hoke et al,Nucleic Acids Res.19(1991),5743)。同配列は、未修飾オリゴヌクレオチドとして、または各場合で3つのホスホロチオエート架橋を5´または3´末端に有するオリゴヌクレオチドとして用いられるとき、活性ではない。同時に、“全”ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、アンチセンスメカニズムよりも他のメカニズムに起因した実質上非特異的な効果を示す。このため、例えばS(dC)28は1μMの濃度であっても90%HSV1を阻害する(W.Gao et al,J.Biol.Chem.265(1990),20172)。
【0006】
メチルホスホネート(Methylphosphonate )オリゴヌクレオチドは、HSV1に対して試験されたもう1つの種類の化合物である。HSV1のIE4遺伝子の5´スプライスアクセプター部位のエキソン/イントロン領域の重複配列に対する一連の4種の12merアンチセンスオリゴヌクレオチドは100μMで個別に試験され、9〜98%と広く分散したウイルス阻害結果を示した。IE110の翻訳開始に対する12merアンチセンスオリゴヌクレオチドも同様に、HSV1で最少の阻害を示すだけか、または全く阻害を示さなかった(M.Kulka et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989),6868;L.Aurelian et al,WO 92/05284(PCT/US91/06646))。
【0007】
【発明の概要】
意外にも、我々は標的遺伝子の配列の限定されない1つのセグメントに対してアンチセンスオリゴヌクレオチドを配向させても決して十分ではないが、その代わりに標的配列に沿った最少の置換は活性上大きな変化があることを発見した。例えば、HSV1のIE110遺伝子の翻訳開始に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いても十分ではないが、その代わりに多数の考えうる配列の極く一部だけは、HSV1に対して活性であることが見出され、それは表1で明らかにされている。用いられた試験条件下(80μM以下の濃度でオリゴヌクレオチドを用いる試験)において、他の配列は今度は活性を示さないか、または最少限の活性を示すだけである。我々は他の標的遺伝子についても匹敵しうる結果を得ることができた(表2〜4)。意外にも、我々はHSV1に対して良好なレベルの活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを確認することができたが、それらは既に記載された“最良の”配列(G.D.Hoke et al,Nucleic Acids Res.19(1991),5743)においては、HSV1に対していかなる活性も示さなかった最少限の化学的修飾(各ケースにおいて5´または3´末端いずれかで2つのホスホロチオエート架橋)を有しているだけである。
【0008】
【発明の具体的説明】
したがって、本発明は下記配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの混合体に関する:
AO1 (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
AO2 (Herp018):5´-GCAGGAGGATGCTGAGGAGG-3´
AO3 (Herp002):5´-GGGGCGGGGCTCCATGGGGG-3´
AO4 (Herp112):5´-GGCGGGGCTCCATGGGGGTC-3´
AO5 (Herp034):5´-GGGGCTCCATGGGGGTCGTA-3´
AO6 (Herp024):5´-AACAGGTCCATTGGGTGGGG-3´または
AO7 (Herp028):5´-GGCCCTGCTGTTCCGTGGCG-3´。
【0009】
好ましい配列は、
AO1 (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
AO2 (Herp018):5´-GCAGGAGGATGCTGAGGAGG-3´または
AO3 (Herp002):5´-GGGGCGGGGCTCCATGGGGG-3´
である。
【0010】
特に好ましい配列は、
AO1 (Herp099):5´-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3´
である。
【0011】
本発明は、2以内のヌクレオチド、好ましくは1つのヌクレオチドで、互いに独立して、各末端において切除(truncated )または伸長されている、本発明によるオリゴヌクレオチドにも関する。加えて、本発明はそれらの90%、特にそれらの95%ホモログ(homolog )と修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
これに関連して、修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、例えばヌクレアーゼに対する安定性と細胞に接近できる能力のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質を改善して、しかも当業者に知られる化学的修飾を意味するとして理解されている(例えば:E.Uhlmann and A.Peyman,Chem.Rev.90(1990),543;P.D.Cook,Anti-Cancer Drug Design,6(1991),585;J.Goodchild,Bioconjugate Chem.1(1990),165;S.L.Beaucage and R.P.Iyer,Tetrahedron,49(1993),6123;F.Eckstein,Ed.,"Oligonucleotides and Analogues - A Practical Approach",IRL Press,1991)。
【0012】
このような修飾の例としては下記のものが上げられる。
a)ホスフェート架橋の修飾;例示される修飾はホスホロチオエート、ホスホロジチオエート(phosphorodithioate)、メチルホスホネート、ホスホルアミデート(phosphoramidate )、ボラノフォスフェート(boranophosphate )、リン酸メチルエステル、リン酸エチルエステルおよびフェニルホスホネート(phenylphosphonate )である。好ましいホスフェート架橋の修飾はホスホロチオエートおよびメチルホスホネートである。上記修飾による本発明のオリゴヌクレオチドのホスフェート架橋の全部の置換は除かれる。
【0013】
b)ホスフェート架橋の置換;例示される置換はホルムアセタール、3´‐チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよびシリル基による置換である。ホルムアセタールおよび3´‐チオホルムアセタールによる置換が好ましい。
【0014】
c)糖の修飾;例示される修飾はα‐アノマー糖、2´‐O‐メチルリボース、2´‐O‐ブチルリボース、2´‐O‐アリルリボース、2´‐フルオロ‐2´‐デオキシリボース、2´‐アミノ‐2´‐デオキシリボース、α‐アラビノフラノースおよび炭素環式糖アナログである。好ましい修飾は2´‐O‐メチルリボースによる場合である。
【0015】
d)Watson-Crick塩基対形成の特異性を減少させない塩基の修飾;例示される修飾は5‐プロピン‐2´‐デオキシウリジン、5‐プロピン‐2´‐デオキシシチジン、5‐フルオロ‐2´‐デオキシシチジン、5‐フルオロ‐2´‐デオキシウリジン、5‐ヒドロキシメチル‐2´‐デオキシウリジン、5‐メチル‐2´‐デオキシシチジンおよび5‐ブロモ‐2´‐デオキシシチジンである。好ましい修飾は5‐プロピン‐2´‐デオキシウリジンおよび5‐プロピン‐2´‐デオキシシチジンである。
【0016】
e)例えば“モルホリノヌクレオシド”オリゴマー(E.P.Stirchak et al,Nucleic Acids Res.17(1989),6129)または“ペプチド核酸”(例えば、Hanvey et al,Science,258(1992),1481)による糖リン酸主鎖の置換。
【0017】
f)5´および3´ホスフェートと5´および3´チオホスフェート。
【0018】
g)例えば3´または5´末端における複合体(更に、3´誘導化に関してはEP‐A2‐0 552 766参照);例示される複合体はDMAB‐3´またはポリリジン、ピレン、アクリジン、フェナジンまたはフェナントリジンのような挿入剤、フルオレセインのようなケイ光化合物、プソラレンまたはアジドプロフラビンのような架橋剤、C12‐C20アルキルのような親油性分子、1,2‐ジヘキサデシル-rac- グリセロールのような脂質、コレステロールまたはテストステロンのようなステロイド、ビタミンEのようなビタミン、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、(C‐C18)アルキルリン酸ジエステル、‐O‐CH‐CH(OH)‐O‐(C12‐C18)アルキルとの複合体、特に例えば本発明による化合物AO26のようなピレン誘導体との複合体である。
【0019】
h)3´‐3´および5´‐5´反転(例えば、M.Koga et al,J.Org.Chem.56(1991),3757)。
【0020】
下記修飾が特に好ましい。
a)ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネートによるホスフェート架橋の置換。上記修飾による本発明のオリゴヌクレオチドの全ホスフェート架橋の置換は除かれる。
【0021】
b)C12‐C20アルキルのような親油性分子、コレステロールまたはテストステロンのようなステロイド、ポリエチレングリコールまたはオリゴエチレングリコール、ビタミンE、ピレンのような挿入剤、(C14‐C18)アルキルリン酸ジエステルおよび‐O‐CH‐CH(OH)‐O‐(C12‐C16)アルキルとの複合体。
【0022】
下記修飾が特に好ましい。
a)5´および/または3´末端においてホスホロチオエートによる1、2または3つのホスフェート架橋の置換、特に5´および3´末端においてホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートによる2つのホスフェート架橋の置換。
【0023】
b)5´および/または3´末端においてホスホロチオエートによる1、2または3つのホスフェート架橋の置換、これに加えて中間においてホスホロチオエートによる1‐5ホスフェート架橋の置換。
【0024】
c)特に5´および/または3´末端においてホスホロチオエートによる1、2または3つのホスフェート架橋の置換と組み合わされた、ポリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール、コレステロール、テストステロン、ピレン、バチルおよびビタミンE、(C14‐C18)アルキルリン酸ジエステル並びに‐O‐CH‐CH(OH)‐O‐(C12‐C16)アルキルとの複合体。
【0025】
本発明は、更に当業者に公知の方法、特に化学合成による本発明の化合物の製造法、HSV1に対する薬剤の製造に関する本発明による化合物の使用、本発明による1種以上の化合物が生理学上許容される賦形剤並びに適宜に適切な添加剤および/または補助物質と混和されるHSV1に対する薬剤の製造法と、HSV1に対する薬剤の製造に関する本発明による化合物の使用にも関する。
【0026】
注射が好ましい投与方式である。この目的のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは液体溶液、好ましくは例えばハンクス溶液またはリンゲル溶液のような生理学上許容される緩衝液中で処方される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは固体形で処方して、使用前に溶解または懸濁してもよい。全身投与上好ましい投与量は約0.01〜約50 mg/kg体重/日である。
【0027】
【実施例】
以下の実施例によって本発明を更に詳細に説明する。
実施例1 オリゴヌクレオチド合成
未修飾オリゴヌクレオチドは、標準ホスホルアミダイト化学およびヨウ素による酸化を用いて、自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems Model 380Bまたは394)で合成した。混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチドにホスホロチオエート架橋を導入するためには、ヨウ素(Applied Biosystems User Bulletin 65) の代わりにTETD(テトラエチルチウラムジスルフィド)を用いて酸化を行った。固体支持体(CPGまたはTentagel)からの開裂と55℃で18時間濃NHを用いた保護基の除去の後に、オリゴヌクレオチドを最初にブタノール沈降(Sawadogo,Van Dyke,Nucl.Acids Res.19(1991),674)により精製した。次いでナトリウム塩をエタノール2.5容量部を用いてNaClの0.5M溶液からの沈降により得た。
【0028】
〔4‐(1‐ピレニル)ブタニル〕ホスホジエステルは、J.S.Mann et al.,Bioconj.Chem.3(1992),554に記載されているように、5´末端で導入する。
オリゴヌクレオチドを:
a)20%アクリルアミド、8M尿素、45mMトリス‐ホウ酸緩衝液、pH7.0中における分析ゲル電気泳動、および/または
b)HPLC分析:Water´s GenPak FAX、勾配CHCN(400ml)、HO(1.6リットル)、NaHPO(3.1g)、NaCl(175.3g)、pH6.8(NaCl中1.5M)後にCHCN(400ml)、HO(1.6リットル)、NaHPO(3.1g)、NaCl(11.7g)、pH6.8(NaCl中0.1M)、および/または
c)キャピラリーゲル電気泳動、 Beckmann Kapillare eCAP(登録商標)、U100P ゲルカラム、長さ65cm、I.D.100mm、一端から15cmに窓、緩衝液140μMトリス、360μMホウ酸、7M尿素、および/または
d)電子流(electrospray)質量スペクトル測定
により分析した。
【0029】
オリゴヌクレオチドの分析では、それらが各場合において90%以上の純度で存在していることを示した。
【0030】
下記オリゴヌクレオチドを合成した。
No 配 列 a) 標 的 b)
AO1 (Herp099):5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´ IE110, TI
AO2 (Herp018):5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-3´ UL30,DNA-Pol, 中間
AO3 (Herp002):5´-G*G*GGCGGGGCTCCATGGG*G*G-3´ IE110, TI
AO4 (Herp112):5´-G*G*CGGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´ IE110, TI
AO5 (Herp034):5´-G*G*GGCTCCATGGGGGTCG*T*A-3´ IE110, TI
AO6 (Herp024):5´-A*A*GAGGTCCATTGGGTGG*G*G-3´ UL48, α-TIF,TI
AO7 (Herp028):5´-G*G*CCCTGCTGTTCCGTGG*C*G-3´ UL52, 中間
AO8 (HERP111):5´-G*G*GCGGGGCTCCATGGGG*G*T-3´ IE110, TI
AO9 (HERP100):5´-C*C*GGGGCGGGGCTCCATG*G*G-3´ IE110, TI
AO10(HERP113):5´-C*G*GGGCTCCATGGGGGTC*G*T-3´ IE110, TI
AO11(HERP114):5´-G*G*GCTCCATGGGGGTCGT*A*T-3´ IE110, TI
AO12(HERP115):5´-G*C*TCCATGGGGGTCGTAT*G*C-3´ IE110, TI
AO13(HERP017):5´-C*C*GGAAAACATCGCGGTT*G*T-3´ UL30,DNA-POL., TI
AO14(HERP091):5´-C*C*GGGGGCGCTTGGCCGG*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
AO15(HERP092):5´-C*A*GCAGCTTGCGGGGCTT*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
AO16(HERP093):5´-C*C*CCCAACAGGTGGGAGA*A*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
AO17(HERP094):5´-G*G*GGGGTGCCACACTTCG*G*G-3´ UL30,DNA-POL.,中間
AO18(HERP016):5´-C*C*CACCCGAACCCCTAAA*G*A-3´ UL30, 5´- 非翻訳
AO19(HERP023):5´-G*T*CCGCGTTCATGTCGGC*A*A-3´ UL48, α-TIF,TI
AO20(HERP022):5´-A*A*CAGAGGCAGTCAAACA*G*G-3´ UL48, α-TIF, 中間
AO21(HERP025):5´-A*T*ACGGGAAAGACCATAT*C*G-3´ UL48, 5´- 非翻訳
AO22(HERP027):5´-G*T*CTTCCTGCCCCATTGC*G*T-3´ UL52, TI
AO23(HERP026):5´-T*G*CGTCCGCGCGCCCAAG*G*G-3´ UL52, 5´- 非翻訳
AO24 :5´-GCGGGGCTCCATGGGGG*T*C*G-3´ IE110, TI
AO25 :5´-G*C*G*GGGCTCCATGGGGG T C G-3´ IE110, TI
AO26 :5´-PY-G*C*GGGGCTCCATGGGGG T*C*G-3´ IE110, TI
AO27 :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-P-C14-3´UL30,DNA-POL.,中間
AO28 :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C12-3´UL30,DNA-POL.中間
AO29 :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C14-3´UL30,DNA-POL., 中間
AO30 :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C16-3´UL30,DNA-POL., 中間
AO31 :5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGG*A*G*G-P-C18-3´UL30,DNA-POL., 中間
AO38 :5´-FAM-GCGGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´ JE110, TI
AO39 :5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-3´ JE110, TI
AO40 :5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-DMAB-3´ JE110, TI
AO41 :5´-G-FAM-GCGGGGCTCCATGGGGGT*C*G-P-VITE-3´ JE110, TI
AO42 :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´ JE110, TI
AO43 :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-P-C14-3´ JE110, TI
AO44 :5´-G*G*C*GGGGCTCCATGGGGG*T*C-P-BAT-3´ JE110, TI
コントロール
AO32 :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-3´
AO33 :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-P-C14-3´
AO34 :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCG*G*C*C-P-C12-3´
AO35 :5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-P-C14-3´
【0031】
a)ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中*で示した;5´‐PYは5´‐〔4‐(1‐ピレニル)ブタニル〕ホスホジエステルを表す;
b)HSV1のゲノム上における標的配列、TI:標的遺伝子の翻訳開始部位、中間:標的遺伝子の中間
c)3´誘導化オリゴヌクレオチドをEP0552766 A2に記載されたように合成した。これに関連して、p‐C12‐3´は3´‐n‐C1225ホスフェート、p‐C14は3´‐n‐C1429ホスフェート、p‐C16は3´‐n‐C1633ホスフェート、p‐C18は3´‐n‐C1837ホスフェートである;P‐3´は3´‐リン酸である;P‐VITEは3´ビタミンEホスフェート、P‐BAT‐3´‐は3´‐バチルホスフェートである;DMAB‐3´は
【0032】
【化1】
Figure 0004030598
であり、下記式のように標準ホスホルアミダイト化学を用いて誘導化支持体(DMTr:ジメトキシトリチル、CPG:制御された孔のあるガラス)により導入した。
【0033】
【化2】
Figure 0004030598
【0034】
5´‐FAMは3´‐ヒドロキシ‐2‐(N‐チオ尿素‐フルオレセイン‐4‐アミノブチル)プロピル‐1‐O‐ホスフェートであり、F.Schubert et al,Nucl.Acids Res.18(1990),3427 のように対応ホスホルアミダイトにより導入する。
【0035】
実施例2 ヘルペスウイルスに対する試験物質のインビトロ抗ウイルス活性の研究
ヒトにとり病原性である異なるヘルペスウイルスに対する試験物質の抗ウイルス活性を細胞培養試験系で研究する。
実験のために、血清含有ダルベッコMEM(5%牛胎児血清、FCS)中のサル腎臓細胞(Vero、2×10/ml)を96ウェル微量滴定プレートに播種し、37℃および5%COで24時間インキュベートする。次いで血清含有培地を吸出し、細胞を無血清ダルベッコMEM(−FCS)で2回洗浄した。
【0036】
試験物質を600μMの濃度までHOで前希釈し、−18℃で貯蔵する。更にダルベッコ最少必須培地(MEM)による希釈ステップを試験のために実施する。各場合において、個々の試験物質希釈液100μリットルを無血清ダルベッコMEM(−FCS)100μリットルと一緒に洗浄された細胞に加える。
【0037】
37℃および5%COで3時間インキュベートした後、細胞ローン(lawn)が3日間以内で完全に壊される濃度で細胞を単純ヘルペスウイルス1型(ATCC VR733、HSV1 F株)で感染させる。HSV1の場合に感染の大きさは500プラーク形成単位(PFU)/ウェルであり、HSV2の場合には350PFU/ウェルである。その際に、実験混合液はペニシリンG100U/mlおよびストレプトマイシン100mg/lを補充したMEM中80〜0.04μMの濃度で試験物質を含有している。すべての実験は二重測定として実施するが、但しコントロールでは各プレートで8回実施する。
【0038】
実験混合液を37℃および5%COで17時間インキュベートする。試験物質の細胞毒性は細胞培養物の顕微鏡評価により20時間の全インキュベート時間後に調べる。上記実験条件下でいかなる顕微鏡で認識しうる細胞障害も示さない調製物の最大濃度は、最大許容用量(MTD)と称される。
【0039】
次いで最終濃度4%までFCSを加え、更に37℃および5%COで55時間インキュベートする。その際に、未処理感染コントロールは完全な細胞変性効果(CPE)を示す。顕微鏡で評価した後、細胞培養物をFinter(1966)の生体染色法に従いニュートラルレッドで染色する。試験物質の抗ウイルス活性は、ウイルスに起因する細胞病原性効果から細胞を30〜60%保護するために要求される最少阻害濃度(MIC)として規定される。
【0040】
実験の結果は表1〜6に示されている。
表1:
HSV1のIE110遺伝子の翻訳開始に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中*で示した。
【0041】
Figure 0004030598
【0042】
表2:
HSV1のUL30遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中*で示した。
【0043】
Figure 0004030598
【0044】
表3:
HSV1のUL48遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中*で示した。
【0045】
Figure 0004030598
【0046】
表4:
HSV1のUL52遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドとそれらの抗ウイルス活性。ホスホロチオエート架橋で置換されたホスホジエステル結合は配列中*で示した。
【0047】
Figure 0004030598
【0048】
表5:
【0049】
Figure 0004030598
【0050】
表6:コントロール
【0051】
AO32: 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-3´ >80
AO33: 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-p-C14-3´ >80
AO34: 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCG*G*C*C-p-C12-3´ >80
AO35: 5´-C*C*AGGGTACAGGTGGCCGG*C*C-p-C14-3´ >80
【0052】
実施例3 ヘルペスウイルスに対する試験物質のインビボ抗ウイルス活性の研究
特定の病原体を有しない体重約15gのNMRIマウス(NMRI:Naval Medical Research Institute)を単純ヘルペス1型で腹腔内感染させ、その後下記化合物で腹腔内、皮下または経口処理した。本発明による化合物の投与量は1〜100μgであった。動物を感染後から始めて2.5日間にわたり1日2回処理した。処理動物における罹患および生存率と未処理感染コントロールの場合との経過の比較を用いて、治療の成功を調べた。試験される化合物の代わりに、未処理感染コントロールの水溶性メチルヒドロキシエチルセルロース(2%溶液中粘度300Pa)((R)Tylose MH 300 P)を投与した。
【0053】
下記オリゴヌクレオチドを試験した。
5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´
【0054】
予備評価では、試験されたオリゴヌクレオチドが試験された濃度範囲においてコントロールと比較して活性であることが示された。
【0055】
【配列表】
Figure 0004030598
【0056】
Figure 0004030598
【0057】
Figure 0004030598
【0058】
Figure 0004030598
【0059】
Figure 0004030598
【0060】
Figure 0004030598
【0061】
Figure 0004030598
【0062】
Figure 0004030598
【0063】
Figure 0004030598
【0064】
Figure 0004030598
【0065】
Figure 0004030598
【0066】
Figure 0004030598
【0067】
Figure 0004030598
【0068】
Figure 0004030598
【0069】
Figure 0004030598
【0070】
Figure 0004030598
【0071】
Figure 0004030598
【0072】
Figure 0004030598
【0073】
Figure 0004030598
【0074】
Figure 0004030598
【0075】
Figure 0004030598
【0076】
Figure 0004030598
【0077】
Figure 0004030598
【0078】
Figure 0004030598
【0079】
Figure 0004030598
【0080】
Figure 0004030598
【0081】
Figure 0004030598
【0082】
Figure 0004030598
【0083】
Figure 0004030598
【0084】
Figure 0004030598
【0085】
Figure 0004030598
【0086】
Figure 0004030598
【0087】
Figure 0004030598
【0088】
Figure 0004030598
【0089】
Figure 0004030598
【0090】
Figure 0004030598
【0091】
Figure 0004030598
【0092】
Figure 0004030598
【0093】
Figure 0004030598
【0094】
Figure 0004030598
【0095】
Figure 0004030598
【0096】
Figure 0004030598

Claims (8)

  1. 下記配列で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド
    AO1 (Herp099):5´-G*C*GGGGCTCCATGGGGGT*C*G-3´
    AO2 (Herp018):5´-G*C*AGGAGGATGCTGAGGA*G*G-3´
    AO3 (Herp002):5´-G*G*GGCGGGGCTCCATGGG*G*G-3´
    AO4 (Herp112):5´-G*G*CGGGGCTCCATGGGGG*T*C-3´
    AO5 (Herp034):5´-G*G*GGCTCCATGGGGGTCG*T*A-3´または
    AO7 (Herp028):5´-G*G*CCCTGCTGTTCCGTGG*C*G-3´
    (但し、*はホスホジエステル結合がホスホチオエート架橋により置換されたことを意味する)。
  2. 配列がAO1(Herp099)およびAO3(Herp002)から選択される、請求項1に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. オリゴヌクレオチドの5′および/または3′末端において、オリゴヌクレオチドが3´‐リン酸;フルオレセイン;(C12‐C20)アルキルである親油性分子;ステロイド;ポリエチレングリコール;オリゴエチレングリコール;ビタミンE;ピレン、アクリジン、フェナジン、およびフェナントリジンから選択される挿入剤;(C‐C18)アルキルリン酸ジエステルに、または‐O‐CH‐CH(OH)‐O‐(C12‐C16)アルキルに結合されている、請求項1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. (C‐C18)アルキルリン酸ジエステルが、Cl、Brおよび/またはOHにより1または2以上で置換された、請求項3に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. オリゴヌクレオチドの5′および/または3′末端において、オリゴヌクレオチドが(C12‐C20)アルキル、コレステロール、テストステロン、ヘキサエチレングリコールまたはピレンに結合されている、請求項3または4に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  6. オリゴヌクレオチドを化学合成する、請求項1〜5のいずれか一項に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造法。
  7. 請求項1〜5のいずれか一項に記載された少くとも1種のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、生理学上許容される賦形剤、並びに適宜に適切な添加剤および/または補助物質と混合される、HSV1に対する薬剤の製造法。
  8. 請求項1〜5のいずれか一項に記載されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる、HSV1に対する薬剤。
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