JP3558230B2 - 安定化されたオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用 - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも1個の非末端ピリミジンヌクレオシドが改変されている新規な安定化されたオリゴヌクレオチドおよびそれらのウイルス感染症、癌またはインテグリンもしくは細胞−細胞受容体が活性な疾患の診断または治療薬としての使用に関する。
【0002】
アンチセンスオリゴヌクレオチド(AO)およびトリプル−ヘリックス−形成オリゴヌクレオチド(TFO)は、インビトロおよびインビボの両者において多数の系で特異的な遺伝子発現インヒビタ−であることが証明されている[Uhlmann & Peyman,Chem.Rev.1990,90,543;Milliganら、J.Med.Chem.1993,36,1923;Stein & Cheng,Science 1993,261,1004]。
【0003】
天然に存在するホスホジエステル(PO)オリゴヌクレオチドを用いる場合の大きな問題のひとつは細胞中および細胞培養培地中の両者における核酸加水分解活性の範囲で急速に分解することである。ある範囲の化学的改変がオリゴヌクレオチドの安定化に使用されてきた。先行技術の総説にはたとえば、Milliganら(前出)およびUhlmann & Peyman(前出)がある。核酸加水分解による分解に対する安定化は、ホスフェート橋部、糖単位、核酸塩基の改変もしくは置換、またはオリゴヌクレオチドの糖−ホスフェート骨格の置換によって行うことができる。ホスフェート橋(phosphate bridge)は核酸加水分解の攻撃の中心であることから、とくに多数のヌクレオシド間橋部(internucleoside bridge)の改変が報告されている。最も頻繁に用いられるヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオシド間橋部は、ホスホロチオエート(PS)、メチルホスホネート(MeP)およびホスホロジチオネ−ト(PA)橋部である。
【0004】
改変の導入は,ヌクレアーゼに対する安定性のみでなく、同時にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはトリプル−ヘリックス−形成オリゴヌクレオチドの多くの特性、たとえばそれらの細胞への侵入能力、RNアーゼHの活性化およびそれらがRNA(AOの場合)もしくはDNA(TFOの場合)とハイブリダイズする能力等も変化させることに留意すべきである。さらに、ヌクレアーゼに対する安定性の基準としてよく用いられる血清の安定性は必ずしも細胞内の活性を反映しないとの指摘がある[P.D.Cook in“Antisense Research and Applications”,Crooke & Lebleu編、CRC Press,Boca Raton,1993,第9章,149頁以下]。これは、ヌクレアーゼに対する抵抗性のほかに、何故アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはトリプル−ヘリックス−形成オリゴヌクレオチドの生物活性が、このような改変の質についての情報を与えるかの理由である。
【0005】
このような改変を行うのに理想的なオリゴヌクレオチドの位置の問題に関しては以下の戦略が開発されている[P.D.Cook(前出),Uhlmann & Peyman(前出),Milliganら(前出)]。
【0006】
I) すべてのヌクレオシド間橋部の交換、たとえば全−PSオリゴヌクレオチドの製造
この交換はヌクレアーゼに極めて安定なオリゴヌクレオチドを与える。たとえば、全−PSオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼ(S1ヌクレアーゼ)およびエンド/エキソヌクレアーゼP1による分解はPOオリゴヌクレアーゼに比べてファクター2〜45までの低下によって示されている[Steinら、Nucl.AcidsRes.1988,16,1763]。全−PSオリゴヌクレオチドは無傷細胞においても抵抗性を示す。アフリカツメガエル卵母細胞または胚では、マイクロインジェクションしたPOオリゴヌクレオチドの分解は半減期30分で進行するが。全−PSオリゴヌクレオチドは同じ条件下で、3時間を越える半減期を有する[Woolfら、Nucl.Acids Res.1990,18,1763]。全−MePオリゴヌクレオチドもヌクレアーゼに対して極めて強い抵抗性を示す。
【0007】
全−PSまたは全−MePオリゴヌクレオチドの欠点は、POオリゴヌクレオチドに比べて、標的RNAと安定なハイブリッドを形成する能力が低下していることである。全−PSオリゴヌクレオチドの他の欠点は非特異的(「非アンチセンス」)作用であり、これはこの種類の化合物にしばしば認められる[Milliganら(前出)、Stein & Cheng(前出)]。
【0008】
他の均一に改変された誘導体、たとえば全−2′−O−メチル誘導体または全−α−2′−デオキシリボ誘導体もまた一般的にRNアーゼHを活性化する能力を欠くという特徴がある。
【0009】
II) 改変および非改変ホスホジエステル橋部のコポリマー
Ghoshら[Anti−Cancer Drug Design 1993,8,15]は、様々なパーセンテージのPS橋部を含むホスホロチオエート−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを記載している。それらの構造はたとえば以下のパターン[PS−PO−PO−PO]n、[PO−PO−PS]n、[PS−PO]n、[(PO)2−(PS)2]n、[PO−PS−PS]nに従う。彼らは、選択的翻訳阻害のためには少なくとも50%のPS橋部含量が必要であること、およびこの含量がもっと低い場合には活性は劇的に低下することを教示している。本発明は、これらの結果は正しくなく、改変が正しく(下記参照)配置されれば、PS結合の含量は50%よりはるかに少なくても選択的阻害に十分であることを明らかにしたのである。Ghoshらはさらに、以下のIIIに記載するエンドキャッピング/ギャップ法を用いると良好な結果が達成されることを教示している。
【0010】
ヌクレオシド間の橋部をひとつ置きに交互にたとえばMeP橋部で交換しても(Furdanら、Nucl.Acids Res.1989,17,9193)、均一に改変したMePオリゴヌクレオチドに比べて利点はない。たとえば、交互にMeP改変したオリゴヌクレオチドは同様にRNアーゼを活性化しない。比較により、交互にホスフェート−O−エチルまたはホスフェート−O−イソプロピルエステルを有するオリゴヌクレオチドおよび交互のMePオリゴヌクレオチドもまた、全−MePあるいは全−PSオリゴヌクレオチドよりも活性が低い[Marcus−Securaら、Nucl.AcidsRes.1987,15,5749]。
【0011】
III) オリゴヌクレオチドの5′または3′末端における1、2または3ヌクレオシド間橋部の交換(エンドキャッピング)およびオリゴヌクレオチドの5′および3′末端における1、2または3ヌクレオシド間橋部の交換(ギャップ法)
エンドキャッピングの効果に関しては、結果は場合によって一致しない。とくにPS、PAまたはMeP橋部による3′エンドキャッピングは、ヌクレアーゼに対する保護として記載されている[P.D.Cook(前出)、Milliganら(前出)]。3′エンドキャッピングによる保護は一連の他の改変によっても達成される。3′−3′エンドキャッピングは、核酸加水分解に対する保護として様々な著者により記載されている[Shawら,Nucl.Acids Res.1991,19,747;Seligerら、Nucleoside & Nucleotides 1991,10,469]、3′エンドキャッピングの他の変形には、3′末端への接合分子、たとえば3′−ドデカノールもしくは3′−アクリジン[P.D.Cook,全出]、または3−アミノ−2,3−プロパンジオール[WO92/20697]の導入があり、これもヌクレアーゼに対する安定性を増大させる。ギャップ法、すなわちオリゴヌクレオチドの5′および3′末端における1、2または3ヌクレオシド間橋部の交換は、PSオリゴヌクレオチドとは異なり、大部分の均一な改変はRNアーゼHを活性化する能力の喪失、したがって活性の著しい喪失を伴うことから、とくに有利なことが明らかにされている。この場合も、広範囲の誘導体、改変ホスホジエステル橋部、改変された糖、改変された塩基たとえばMeP−、PS−、PA−、2′−O−アルキル−または2′−F−誘導化オリゴヌクレオチドが安定化の目的に使用された。これらの結果は、P.D.Cook(前出)に一致する。ギャップ内では、2〜4のPD結合の配列がRNアーゼHの活性化に十分であることになる。
【0012】
Gilesら[Anti−cancer Drug Design 1993,8,33]は、非改変PO橋部のギャップを8から2橋部に連続的に低下させたキメラのメチルホスホネート−ホスホジエステルを記載している。ギャップが低下すると細胞への取り込みは改善する傾向が見出されたが、オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性は検討されなかった。
【0013】
様々な戦略の間の興味ある比較を、Hokeら[Nucl.Acids Res.1991,19,5743]に見ることができる。著者らは細胞培養中のHSV−1に対するある範囲のPS−改変アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を比較している。彼らの所見は3′、または3′+5′をエンドキャップしたオリゴヌクレオチド(最初の3つのヌクレオシド橋部は各場合とも改変されている)は血清中、全−PSオリゴヌクレオチドと同様に、ヌクレアーゼによる分解に対して十分保護されていることを確認するものである。これに反し、内部改変(3PS橋部)オリゴヌクレオチド、および5′末端のみがキャップされたオリゴヌクレオチド(この場合も、最初の3つのヌクレオシド橋部が改変されている)は迅速に分解される。これに反し、著者らは、5′もしくは3′エンドキャッピングまたはそれらの両者も、細胞内での活性には十分ではないことを見出し、彼らは細胞中におけるヌクレア−ゼに対する十分な安定性を達成するには、均一な改変(全−PS)が必要であると結論した。
【0014】
驚くべきことに、ヌクレアーゼに抵抗性になると、ピリミジンヌクレオシドがオリゴヌクレオチドにおける弱点であることが見出されたのである。これらの部位がヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させる改変によって保護されると、これは一方では、安定性および活性に顕著な改善を生じる。
【0015】
したがって、本発明は、式
(式中,少なくとも1個の非末端ピリミジンヌクレオシドは改変されている)のオリゴヌクレオチドに関する。
【0016】
好ましいオリゴヌクレオチドは、2〜10、とくに3〜6の非末端ピリミジンヌクレオシドが改変され、とくに8以下の以後のヌクレオチドが改変されているオリゴヌクレオチドである。とくに好ましいオリゴヌクレオチドは、さらに5′および/または3′末端が改変された、とくに最初の1〜5、とくに1〜3、とくに2〜3のヌクレオチドが5′および/または3′末端に、好ましくはホスホロチオエート橋部、ホスホロジチオエート橋部および/またはメチルホスホネート橋部によって連結しているオリゴヌクレオチドである。とくに好ましいものは、互いに連結している少なくとも1〜4、とくに3〜4の非改変ヌクレオチドの1または2以上のグループを含有する改変オリゴヌクレオチドである。
【0017】
たとえば、表1にHSV−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド01を示す。これは5′および3′末端上がPSで二重にキャップされ、27μMの濃度で活性である。5′および3′末端への3つのPS橋部の導入は、活性を9μMに上昇させ、また、シトシン基Cの3′へのさらに1個のPS橋部の導入でも同じ効果が達成される(アンチセンスオリゴヌクレオチド03)。TおよびCの5′または3′への2個のPS橋部の導入(アンチセンスオリゴヌクレオチド05)、またはTおよびCへの5′もしくは3′への4個のPS橋部の導入(アンチセンスオリゴヌクレオチド06)はさらにMIC値(最小阻止濃度)それぞれ3および1μMの活性への上昇をもたらす。相当する全−PS誘導体のMIC値も1μMである。これは、ピリミジンヌクレオシドの保護によって、全−改変オリゴヌクレオチドに匹敵する安定性および活性の増大が、しかもこのような激烈な変化による上述の欠点を回避して、達成できたことを意味する。
【0018】
ピリミジン位置ならびに5′および/または3′末端における安定化は、互いに独立に、以下のように行うことができる。
a) 3′および/または5′ホスホジエステル橋部の、たとえばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、NR1R2−ホスホロアミデート、ボラノホスフェ−ト、ホスフェート−(C1〜C21)−O−アルキルエステル、ホスフェート−[(C6〜C12)アリール−(C1〜C21)−O−アルキル]エステル、2,2,2−トリクロロジメチルエチルホスホネート、(C1〜C8)−アルキルホスホネート、または(C6〜C12)−アリールホスホネート橋部による置換。
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、NR1R2−ホスホロアミデート、ホスフェート−O−メチルエステル、ホスフェート−O−エチルエステル、ホスフェート−O−イソプロピルエステル、メチルホスホネートまたはフェニルホスホネート橋部による置換が好ましい。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネート橋部による置換がとくに好ましい。ホスホロチオエート橋部による置換が最も好ましい。
【0019】
R1およびR2は互いに独立に水素、C1〜C18−アルキル、C6〜C20−アリール、(C6〜C14)−アリール−(C1〜C8)−アルキルまたは−(CH2)c−[NH(CH2)c]d−NR3R3(式中、cは2〜6の整数であり、dは0〜6の整数であり、R3は互いに独立に水素、C1〜C6−アルキルまたはC1〜C4−アルコキシ−C1〜C6−アルキルである)であり、R1およびR2は好ましくは水素、C1〜C8−アルキルもしくはメトキシエチルであり、とくに好ましくは水素、C1〜C4−アルキルもしくはメトキシエチルである。R1およびR2はそれらが結合した窒素原子とともに、さらにO、SおよびNからなる系よりのヘテロ原子を含有していてもよい5〜6員のヘテロ環を形成することもできる。
【0020】
b) 3′または5′ホスホジエステル橋部の、デホスホノ橋部による置換[たとえば Uhlmann & Peyman in“Methods in Molecular Biology”,20巻:“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”,S.Agrawal編、Human Press,Totowa 1993,16章、355頁以下参照]、たとえばホルムアセタール、3′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンまたはシリル基による置換。
ホルムアセタールおよび3′−チオホルムアセタールによる置換が好ましい。
【0021】
c) 糖−ホスフェート骨格の、たとえばモルホリノヌクレオシドオリゴマーによる置換[E.P.Stirchakら、Nucl.Acids Res.17(1989),6129]。
【0022】
d) β−D−2′−デオキシリボースの、たとえばα−D−2′−デオキシリボース、L−2′−デオキシリボース、2′−F−2′−デオキシリボース、2′−O−(C1〜C6)アルキル−リボース、2′−O−(C2〜C6)アルケニルリボース、2′−NH2−2′−デオキシリボース、β−D−キシロフラノース、α−アラビノフラノース、2,4−ジデオキシ−β−D−エリスロ−ヘキソ−ピラノースおよび炭素環[たとえばFroehler,J.Am.Chem.Soc.1992,114,8320]および開環した鎖状糖類縁体[たとえばVanden−driesscheら、Tetraherron 1993,49,7223]もしくは二環糖類縁体[たとえば,M.Tarkovら、Helv.Chim.Acta 1993,76,481]による置換。
2′−F−2′−デオキシリボース、2′−O−(C1〜C6)アルキル−リボース、2′−O−(C2〜C6)アルケニルリボース、または2′−NH2−2′−デオキシリボースによる置換が好ましい。
2′−F−2′−デオキシリボース、2′−O−(C1〜C4)アルキル−リボース、もしくは2′−O−(C2〜C4)アルケニル−リボース、または2′−NH2−2′−デオキシリボースによる置換がとくに好ましい。
とくに、2′−O−メチル−、2′−O−アリル−、または2′−O−ブチルリボースによる置換が最も好ましい。
【0023】
e) 天然のヌクレオシド塩基の、たとえば、5−(ヒドロキシメチル)ウラシル、5−アミノウラシル、プソイドウラシル、ジヒドロウラシル、5−(C1〜C6)−アルキルウラシル、5−(C2〜C6)−アルケニルウラシル、5−(C2〜C6)−アルキニルウラシル、5−(C1〜C6)−アルキルシトシン、5−(C2〜C6)−アルケニルシトシン、5−(C2〜C6)−アルキニルシトシン、5−フルオロウラシル、5−フルオロシトシン、5−クロロウラシル、5−クロロシトシン、5−ブロモウラシルまたは5−ブロモシトシンによる置換。
5−(C1〜C6)−アルキルウラシル、5−(C2〜C6)−アルケニルウラシル、5−(C2〜C6)−アルキニルウラシル、5−(C1〜C6)−アルキルシトシン、5−(C2〜C6)−アルケニルシトシン、5−(C2〜C6)−アルキニルシトシン、5−フルオロウラシル、5−フルオロシトシン、5−クロロウラシル、5−クロロシトシン、5−ブロモウラシルまたは5−ブロモシトシンによる置換が好ましい。
5−(C3〜C6)−アルキルウラシル、5−(C2〜C6)−アルケニルウラシル、5−(C2〜C6)−アルキニルウラシル、5−(C1〜C6)−アルキルシトシン、5−(C2〜C6)−アルケニルシトシンまたは5−(C2〜C6)−アルキニルシトシンによる置換がとくに好ましい。
とくに、5−ペンチニルシトシン、5−ヘキシニルウラシルまたは5−ヘキシニルシトシンによる置換が最も好ましい。
【0024】
上述の改変中、好ましい改変は群a)、b)、c)およびd)の改変であり、とくに好ましい改変は群a)およびd)の改変であり、最も好ましい改変は群a)の改変である。
【0025】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、たとえば3′および/または5′末端において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはトリプル−ヘリックス−形成オリゴヌクレオチドの特性(たとえば、細胞透過性、ヌクレアーゼによる分解、標的RNA/DNAへの親和性、ファーマコキネティクス)に増強作用を有する分子と連結(接合)させることができる。たとえば、ポリリジン、挿入剤たとえばピレン、アクリジン、フェナジン、フェナンスリジン、蛍光化合物たとえばフルオレセイン、架橋剤たとえばプソラレン、アジドプロフラビン、ならびに親油性分子たとえばC12〜C20−アルキルもしくはそれらの誘導体、たとえばヘキサメチレンテトラミン、テルペンたとえばファルネゾールもしくはフィトール、脂質たとえば1,2−ジヘキサデシル−rac−グリセロール、ステロイドたとえば胆汁酸、コレステロールもしくはテストステロン、ビタミンたとえばビタミンE、ポリ−もしくはオリゴエチレングリコール、(C12〜C18)−アルキルホスフェート−ジエステルまたは−O−CH2−CH(OH)−O−(C12〜C18)−アルキルとの接合体を挙げることができる。親油性分子たとえばC12〜C20−アルキル、ステロイドたとえばコレステロールもしくはテストステロン、ポリ−もしくはオリゴエチレングリコール、ビタミンE、挿入剤たとえばピレン、(C14〜C18)−アルキルホスフェート−ジエステル、または−O−CH2−CH(OH)−O−(C12〜C16)−アルキルとの接合体が好ましい。
【0026】
このようなオリゴヌクレオチド接合体の製造は、本技術分野の熟練者には既知である(たとえば、Uhlmann & Peyman,Chem.Rev.1990,90,543;M.Manoharan in Antisense Research & Applications,Crooke & Lebleu編、CRC Press,Boca Raton,1993,17章,303頁以下;EP0552766A2参照)。
【0027】
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは3′および/または5′末端に3′−3′および5′−5′逆位をもつことができる[たとえば、Kogaら、J.Org.Chem.56(1991),3757の記載]。
【0028】
本発明はさらに、本発明の化合物の本技術分野の熟練者に既知の方法とくに化学合成による製造方法、本発明の化合物の医薬の製造のための使用、本発明のオリゴヌクレオチドを生理学的に許容される賦形剤および必要に応じて適当な添加剤および/または補助剤と混合することからなる医薬の製造法に関する。
【0029】
本発明はまた、全く一般的に少なくとも1個の非末端ピリミジンヌクレオシドが改変された治療的に活性なオリゴヌクレオチドの医薬の製造のための使用を包含する。治療的に活性なオリゴヌクレオチドとは、一般的にアンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプル−ヘリックス−形成オリゴヌクレオチド、アプタマー(特異的標的分子たとえば蛋白質または受容体に結合できるRNAまたはDNA分子;たとえば、L.C.Bockら、Nature 1992,355,564)またはリボザイム(触媒性RNA、たとえば、Castanettoら、Critical Rev.Eukar.Gene Expr.1992,2,331参照)、とくにアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味するものと理解すべきである。
【0030】
さらに本発明は、少なくとも1個の非末端、改変ピリミジンヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドの診断薬としての、たとえば生物学的サンプル中の特定の二本鎖または一本鎖核酸分子の存在もしくは不存在または量を検知するための使用に関する。
【0031】
本発明のこれらの使用のためには、オリゴヌクレオチドは長さ約6〜100、好ましくは約10〜40、とくに約12〜25ヌクレオチドを有する。この場合も上述の好ましい範囲、改変および接合は同様に適用される。
【0032】
本発明の医薬はたとえばウイルスによって起こる疾患たとえばHIV、HSV−1、HSV−2、インフルエンザ、VSV、B型肝炎またはパピローマウイルスによって起こる疾患の処置に使用することができる。
【0033】
このような標的に対して活性な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例を以下に掲げる。
a)HIVに対してたとえば
【化1】
【化2】
b)HSV−1に対して、たとえば
【化3】
【0034】
本発明の医薬はまた、たとえば癌の処置に適当である。たとえば、癌の形成または増殖に関係する標的に向けられたオリゴヌクレオチド配列を使用できる。このような標的の例は以下の通りである。
1) 核癌蛋白質、たとえばc−myc、N−myc、c−myb、c−fos、c−fos/jun、PCNA、p120。
2) 細胞質/膜−関連癌蛋白質、たとえばEJ−ras、c−Ha−ras、N−ras、rrg、bcl−2、cdc−2、c−raf−1、c−mos、c−src、c−abl。
3) 細胞受容体、たとえばEGF受容体、c−erbA、レチノイド受容体、プロテイン−キナーゼ−調節サブユニット、c−fms。
4) サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス、たとえばCSF−1、IL−6、IL−1a、IL−1b、 IL−2、IL−4、bFGF、ミエロブラスチン、フィブロネクチン。
【0035】
このような標的に対して活性な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例を以下に掲げる。
a) c−Ha−rasに対して、たとえば
【化4】
c) c−myc、たとえば
【化5】
d) c−myb、たとえば
【化6】
e) c−fos、たとえば
【化7】
f) p120、たとえば
【化8】
g) EGF受容体、たとえば
【化9】
h) p53腫瘍サプレッサー、たとえば
【化10】
j) cdcキナーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化11】
k) PCNA(増殖性細胞核抗原)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化12】
l) IGF−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化13】
m) bFGF翻訳開始部位に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化14】
n) bFGFコドン58ffに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化15】
o) FGF受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
【化16】
【0036】
本発明の医薬はさらに、たとえばインテグリンまたは細胞−細胞接着受容体、たとえばVLA−4、VLA−2、ICAMもしくはELAMによって影響される疾患の処置に適当である。
【0037】
このような標的に対して活性な本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例を以下に掲げる。
【化17】
【0038】
医薬は、たとえば経口的に投与できる薬物製剤の形態で、たとえば錠剤、コ−ト錠、硬質もしくは軟質カプセル剤、溶液、乳化液または懸濁液の形態で使用することができる。医薬はまた、経直腸的にたとえば坐剤の形態で、または非経口的にたとえば注射用溶液の形態で投与することもできる。薬物製剤の製造には、これらの化合物は,治療的に不活性な有機および無機賦形剤中に導入することができる。錠剤、コ−ト錠および硬質ゼラチンカプセル剤用のこのような賦形剤の例には、乳糖、ト−モロコシデンプンもしくはその誘導体、獣脂およびステアリン酸もしくはその塩がある。溶液製剤に適当な賦形剤は水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースがある。注射用溶液に適当な賦形剤は水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油がある。坐剤用に適当な賦形剤は、植物油および硬化油、ワックス、脂肪および半液体ポリオールである。薬物製剤にはまた防腐剤、溶媒、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、フレ−バー、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤および必要に応じて、他の治療活性物質を添加することができる。
【0039】
好ましい投与形態は注射である。この目的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、液体溶液中に、好ましくは生理的に許容される緩衝液たとえばハンクス液またはリンゲル液中に製剤化される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは固体の形態に製剤化して、使用前に溶解または懸濁することもできる。全身投与に好ましい用量は体重1kgあたり1日に約0.01mg〜約50mgである。
【0040】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例示するものである。
実施例1
オリゴヌクレオチドの合成
非改変オリゴヌクレオチドは自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems,380Bまたは394型)を用い、標準ホスホラミダイト化学およびヨ−素酸化によって合成した。混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート橋部の導入には、酸化はヨー素に代えてTETD(テトラエチルチウラムジスルフィド)を用いて実施した(Applied BiosystemsUser Bulletin 65)。オリゴヌクレオチドを固体支持体(CPGまたはテンタゲル)から分離したのち、保護基を濃NH3を用いて55℃で18時間処理して除去し、オリゴヌクレオチドを最初にブタノ−ルで沈殿させて精製した[Sawadogo,Van Dyke, Nucl.Acids Res.19(1991)674]。ついで0.5M−NaCl溶液から、2.5容量部のエタノ−ルを用いて沈殿させるとナトリウム塩が得られた。
【0041】
[4−(1−ピレニル)ブタニル]ホスホジエステルはJ.S.Mannら、Bioconj.Chem.3(1992)554の記載のようにして、5′末端に導入した。
【0042】
オリゴヌクレオチドは以下のようにして分析した。
a) 20%アクリルアミド、8M尿素中分析ゲル電気泳動および/または
b) HPLC分析:Waters GenPack FAX,CH3CN(400ml)、H2O(1.6L)、NaH2PO4(3.1g)、NaCl(11.7g)、pH6.8(0.1M−NaCl)から、CH3CN(400ml)、H2O(1.6L)、NaH2PO4(3.1g)、NaCl(175.3g)、pH6.8(1.5M−NaCl)への勾配および/または
c) 毛細管ゲル電気泳動BeckmannキャピラリーeCAPTM、U 100Pゲルカラム、長さ65cm、100mm I.D,,ウインドウ一端から15cm、緩衝液140μMトリス、360mMホウ酸、7M尿素、および/または
d) 電気スプレ−質量分析
オリゴヌクレオチドの分析により、それらの純度はいずれの場合も90%を越えることが明らかにされた。
【0043】
合成されたオリゴヌクレオチドの構造は表1に示す。
【0044】
実施例2
試験物質のヘルペスウイルスに対するインビトロ抗ウイルス活性の試験
ヒトに病原性を示す範囲のヘルペスウイルスに対する試験物質の抗ウイルス活性を細胞−培養試験系において試験した。
試験には、サル腎臓細胞(Vero、2×155/ml)を96−ウエルのマイクロタイタープレート中血清含有ダルベッコMEM(5%ウシ胎児血清FCS)中に接種し5%CO2下37℃で24時間インキュベ−トする。ついで血清含有培地を吸引して除去し、細胞を血清を含まないダルベッコMEM(−FCS)を用いて2回洗浄する。
【0045】
試験物質は予めH2Oで600μMの濃度に希釈し、−18℃で保存する。試験を実施するためには、ダルベッコの最小必須培地(MEM)中にさらに前希釈工程を行う。各試験物質希釈液100μlを無血清ダルベッコMEM(−FCS)100μlとともに洗浄細胞に加える。
【0046】
5%CO2下37℃で3時間インキュベ−トしたのち、細胞に単純ヘルペスウイルス1型(ATCC VR733、HSV−1F株)または単純ヘルペスウイルス2型(ATCC VR734、HSV−2G株)を3日以内に細胞シートを完全に破壊する濃度で用いて感染させる。HSV−1の場合には感染密度はウエルあたり500プラーク形成単位(PFU)、HSV−2の場合は350PFU/ウエルとする。ついで試験バッチに100U/mlのペニシリンおよび100mg/mlのストレプトマイシンを補充したMEM中80μM〜0.04μM濃度の試験物質をを加える。各試験とも二重に実施し、ただし対照については各プレートごとに8回反復して行う。
【0047】
バッチを5%CO2下37℃で17時間インキュベートしする。総インキュベーション時間20時間ののちに、細胞培養液を顕微鏡下に観察して、試験物質の細胞毒性を測定する。最大耐容用量(DTM)とは、上述の試験条件下、顕微鏡下に観察できる細胞傷害を生じないそのプレパレーションの最高濃度を指示して用いられる。
【0048】
ついで、FCSを最終濃度が4%になるように加え,つづいて5%CO2下37℃でさらに55時間インキュベートする。この時点で、非処置感染対照には完全な細胞変性効果(CPE)が観察される。培養細胞を顕微鏡下に観察したのち,Finter(1966)によって記載された生存染色法に従って、ニュートラルレッドで染色する。試験物質の抗ウイルス活性は、ウイルスによって引き起こされる細胞変性効果に対して細胞の30〜60%を保護するのに必要な最小阻止濃度(MIC)として定義する。
【0049】
【表1】
【0050】
実施例3
平滑筋細胞における試験物質の抗増殖活性の試験
以下に掲げるオリゴヌクレオチドについて、平滑筋細胞の増殖の阻害能力を試験した。試験は、S.Biroら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)654]の記載に従って実施した。すべてのオリゴヌクレオチドが、5〜20μMの範囲で活性を示した。ホスホロチオエート橋部(P=S)によって置換されたホスホジエステル結合には配列中に*で標識した。
【化18】
【0051】
【配列表】
配列番号:1
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HIV
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
配列
ACACCCAATT CTGAAAATGG 20
【0052】
配列番号:2
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HIV
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
配列
AGGTCCCTGT TCGGGCGCCA 20
【0053】
配列番号:3
配列の長さ:28
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HIV
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..28
配列
GTCGACACCC AATTCTGAAA ATGGATAA 28
【0054】
配列番号:4
配列の長さ:25
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HIV
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..25
配列
GCTATGTCGA CACCCAATTC TGAAA 25
【0055】
配列番号:5
配列の長さ:31
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HIV
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..31
配列
TCGTCGCTGT CTCCGCTTCT TCTTCCTGCC A 31
【0056】
配列番号:6
配列の長さ:31
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HIV
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..31
配列
CTGTCTCCGC TTCTTCTTCC TGCCATAGGA G 31
【0057】
配列番号:7
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:HSV−1
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
配列
GCGGGGCTCC ATGGGGGTCG 20
【0058】
配列番号:8
配列の長さ:15
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..15
他の情報:注=“c−Ha−ras”
配列
CAGCTGCAAC CCAGC 15
【0059】
配列番号:9
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..21
他の情報:注=“c−myc”
配列
GGCTGCTGGA GCGGGGCACA C 21
【0060】
配列番号:10
配列の長さ:15
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..15
他の情報:注=“c−myc”
配列
AACGTTGAGG GGCAT 15
【0061】
配列番号:11
配列の長さ:15
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..15
他の情報:注=“c−myb”
配列
CACGTTGAGG GGCAT 15
【0062】
配列番号:12
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..18
他の情報:注=“c−myb”
配列
GTGCCGGGGT CTTCGGGC 18
【0063】
配列番号:13
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..18
他の情報:注=“c−myb”
配列
GTGTCGGGGT CTCCGGGC 18
【0064】
配列番号:14
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..21
他の情報:注=“c−fos”
配列
GGAGAACATC ATGGTCGAAA G 21
【0065】
配列番号:15
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..22
他の情報:注=“c−fos”
配列
CCCGAGAACA TCATGGTCGA AG 22
【0066】
配列番号:16
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
他の情報:注=“c−fos”
配列
GGGGAAAGCC CGGCAAGGGG 20
【0067】
配列番号:17
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
他の情報:注=“p−120”
配列
CACCCGCCTT GGCCTCCCAC 20
【0068】
配列番号:18
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..18
他の情報:注=“EGF−受容体”
配列
GGGACTCCGG CGCAGCGC 18
【0069】
配列番号:19
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
他の情報:注=“EGF−受容体”
配列
GGCAAACTTT CTTTTCCTCC 20
【0070】
配列番号:20
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..19
他の情報:注=“p53腫瘍サプレッサー”
配列
GGGAAGGAGG AGGATGAGG 19
【0071】
配列番号:21
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..21
他の情報:注=“p53腫瘍サプレッサー”
配列
GGCAGTCATC CAGCTTCGGA G 21
【0072】
配列番号:22
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..18
他の情報:注=“cdc2−キナーゼ”
配列
GTCTTCCATA GTTACTCA 18
【0073】
配列番号:23
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..18
他の情報:注=“PCNA(増殖性細胞核抗原)”
配列
GATCAGGCGT GCCTCAAA 18
【0074】
配列番号:24
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..21
他の情報:注=“IGF−1”
配列
TGAAGACGAC ATGATGATGT G 21
【0075】
配列番号:25
配列の長さ:15
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..15
他の情報:注=“bFGF翻訳部位”
配列
GGCTGCCATG GTCCC 15
【0076】
配列番号:26
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..19
他の情報:注=“bFGFコドン58ff”
配列
CTGTAGTTTG ACGTGTGGG 19
【0077】
配列番号:27
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..22
他の情報:注=“FGF−受容体”
配列
GGCCCCTCCA GCCCCACATC CC 22
【0078】
配列番号:28
配列の長さ:18
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..18
他の情報:注=“VLA−4”
配列
GCAGTAAGCA TCCATATC 18
【0079】
配列番号:29
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
他の情報:注=“ICAM”
配列
CCCCCACCAC TTCCCCTCTC 20
【0080】
配列番号:30
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..20
他の情報:注=“ICAM”
配列
CTCCCCCACC ACTTCCCCTC 20
【0081】
配列番号:31
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..19
他の情報:注=“ICAM”
配列
GCTGGGAGCC ATAGCGAGG 19
【0082】
配列番号:32
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..21
他の情報:注=“ELAM−1”
配列
ACTGCTGCCT CTTGTCTCAG G 21
【0083】
配列番号:33
配列の長さ:22
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジ−:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
ハイポセティカル:No
アンチセンス:Yes
起源:
生物名:ヒト
配列の特徴
特徴を表す記号:exon
存在位置:1..22
他の情報:注=“ELAM−1”
配列
CAATCAATGA CTTCAAGAGT TC 22
Claims (4)
- 式(VII):GCGGGGCTCCATGGGGGTCG
からなる、表1中の番号03、05または06の改変されたオリゴヌクレオチド。 - 化学合成による請求項1記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
- 請求項1記載のオリゴヌクレオチド少なくとも1種類を生理学的に許容される賦形剤と混合することからなるHSV−1感染症の診断または治療のための医薬の製造方法。
- 請求項1記載のオリゴヌクレオチドを含有するHSV−1感染症の診断または治療薬。
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