JPH07194385A - 安定化されたオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用 - Google Patents

安定化されたオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用

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JPH07194385A
JPH07194385A JP6278104A JP27810494A JPH07194385A JP H07194385 A JPH07194385 A JP H07194385A JP 6278104 A JP6278104 A JP 6278104A JP 27810494 A JP27810494 A JP 27810494A JP H07194385 A JPH07194385 A JP H07194385A
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Matthias Helsberg
マテイーアス・ヘルスベルク
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくとも１個の非末端ピリミジンヌクレオ
シドが改変されているオリゴヌクレオチド、そのウイル
ス感染症、癌またはインテグリンもしくは細胞-細胞接
着受容体が活性な疾患の診断または処置用医薬としての
使用。 【効果】 ヌクレアーゼに対する抵抗性の増大によりそ
の安定性と活性が改善され、有用なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの提供を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、少なくとも１個の非末端ピリミ
ジンヌクレオシドが改変されている新規な安定化された
オリゴヌクレオチドおよびそれらのウイルス感染症、癌
またはインテグリンもしくは細胞−細胞受容体が活性な
疾患の診断または治療薬としての使用に関する。
【０００２】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）
およびトリプル-ヘリックス-形成オリゴヌクレオチド
（ＴＦＯ）は、インビトロおよびインビボの両者におい
て多数の系で特異的な遺伝子発現インヒビタ−であるこ
とが証明されている［Uhlmann& Peyman，Chem．Rev．19
90，90，543；Milliganら、J．Med．Chem．1993，36，1
923；Stein & Cheng，Science 1993，261，1004］。
【０００３】天然に存在するホスホジエステル（ＰＯ）
オリゴヌクレオチドを用いる場合の大きな問題のひとつ
は細胞中および細胞培養培地中の両者における核酸加水
分解活性の範囲で急速に分解することである。ある範囲
の化学的改変がオリゴヌクレオチドの安定化に使用され
てきた。先行技術の総説にはたとえば、Milliganら（前
出）およびUhlmann & Peyman（前出）がある。核酸加水
分解による分解に対する安定化は、ホスフェート橋部、
糖単位、核酸塩基の改変もしくは置換、またはオリゴヌ
クレオチドの糖−ホスフェート骨格の置換によって行う
ことができる。ホスフェート橋(phosphate bridge)は核
酸加水分解の攻撃の中心であることから、とくに多数の
ヌクレオシド間橋部(internucleoside bridge)の改変が
報告されている。最も頻繁に用いられるヌクレアーゼ抵
抗性ヌクレオシド間橋部は、ホスホロチオエート（Ｐ
Ｓ）、メチルホスホネート（ＭｅＰ）およびホスホロジ
チオネ−ト（ＰＡ）橋部である。
【０００４】改変の導入は，ヌクレアーゼに対する安定
性のみでなく、同時にアンチセンスオリゴヌクレオチド
またはトリプル−ヘリックス−形成オリゴヌクレオチド
の多くの特性、たとえばそれらの細胞への侵入能力、Ｒ
ＮアーゼＨの活性化およびそれらがＲＮＡ（ＡＯの場
合）もしくはＤＮＡ（ＴＦＯの場合）とハイブリダイズ
する能力等も変化させることに留意すべきである。さら
に、ヌクレアーゼに対する安定性の基準としてよく用い
られる血清の安定性は必ずしも細胞内の活性を反映しな
いとの指摘がある［P．D．Cook in“Antisense Researc
h and Applications"，Crooke & Lebleu編、CRC Pres
s，Boca Raton，1993，第９章，149頁以下］。これは、
ヌクレアーゼに対する抵抗性のほかに、何故アンチセン
スオリゴヌクレオチドまたはトリプル−ヘリックス−形
成オリゴヌクレオチドの生物活性が、このような改変の
質についての情報を与えるかの理由である。
【０００５】このような改変を行うのに理想的なオリゴ
ヌクレオチドの位置の問題に関しては以下の戦略が開発
されている［P.D.Cook（前出），Uhlmann & Peyman（前
出），Milliganら（前出）］。
【０００６】Ｉ） すべてのヌクレオシド間橋部の交
換、たとえば全−ＰＳオリゴヌクレオチドの製造 この交換はヌクレアーゼに極めて安定なオリゴヌクレオ
チドを与える。たとえば、全−ＰＳオリゴヌクレオチド
のエンドヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼ）およびエン
ド／エキソヌクレアーゼＰ１による分解はＰＯオリゴヌ
クレアーゼに比べてファクター２〜４５までの低下によ
って示されている［Steinら、Nucl．AcidsRes．1988，1
6，1763］。全−ＰＳオリゴヌクレオチドは無傷細胞に
おいても抵抗性を示す。アフリカツメガエル卵母細胞ま
たは胚では、マイクロインジェクションしたＰＯオリゴ
ヌクレオチドの分解は半減期３０分で進行するが。全−
ＰＳオリゴヌクレオチドは同じ条件下で、３時間を越え
る半減期を有する［Woolfら、Nucl．Acids Res．1990，
18，1763］。全−ＭｅＰオリゴヌクレオチドもヌクレア
ーゼに対して極めて強い抵抗性を示す。
【０００７】全-ＰＳまたは全−ＭｅＰオリゴヌクレオ
チドの欠点は、ＰＯオリゴヌクレオチドに比べて、標的
ＲＮＡと安定なハイブリッドを形成する能力が低下して
いることである。全−ＰＳオリゴヌクレオチドの他の欠
点は非特異的（「非アンチセンス」）作用であり、これ
はこの種類の化合物にしばしば認められる［Milliganら
（前出）、Stein & Cheng（前出）］。
【０００８】他の均一に改変された誘導体、たとえば全
−２′−Ｏ−メチル誘導体または全−α−２′−デオキ
シリボ誘導体もまた一般的にＲＮアーゼＨを活性化する
能力を欠くという特徴がある。
【０００９】II） 改変および非改変ホスホジエステル
橋部のコポリマー Ghoshら［Anti−Cancer Drug Design 1993，8，15］
は、様々なパーセンテージのＰＳ橋部を含むホスホロチ
オエート−ホスホジエステルオリゴヌクレオチドを記載
している。それらの構造はたとえば以下のパターン[Ｐ
Ｓ−ＰＯ−ＰＯ−ＰＯ]n、[ＰＯ−ＰＯ−ＰＳ]n、[ＰＳ
−ＰＯ]n、[(ＰＯ)2−(ＰＳ)2]n、[ＰＯ−ＰＳ−ＰＳ]n
に従う。彼らは、選択的翻訳阻害のためには少なくとも
５０％のＰＳ橋部含量が必要であること、およびこの含
量がもっと低い場合には活性は劇的に低下することを教
示している。本発明は、これらの結果は正しくなく、改
変が正しく（下記参照）配置されれば、ＰＳ結合の含量
は５０％よりはるかに少なくても選択的阻害に十分であ
ることを明らかにしたのである。Ghoshらはさらに、以
下のIIIに記載するエンドキャッピング／ギャップ法を
用いると良好な結果が達成されることを教示している。
【００１０】ヌクレオシド間の橋部をひとつ置きに交互
にたとえばＭｅＰ橋部で交換しても（Furdanら、Nucl．
Acids Res．1989，17，9193）、均一に改変したＭｅＰ
オリゴヌクレオチドに比べて利点はない。たとえば、交
互にＭｅＰ改変したオリゴヌクレオチドは同様にＲＮア
ーゼを活性化しない。比較により、交互にホスフェート
−Ｏ−エチルまたはホスフェート−Ｏ−イソプロピルエ
ステルを有するオリゴヌクレオチドおよび交互のＭｅＰ
オリゴヌクレオチドもまた、全−ＭｅＰあるいは全-Ｐ
Ｓオリゴヌクレオチドよりも活性が低い［Marcus-Secur
aら、Nucl．AcidsRes．1987，15，5749］。
【００１１】III） オリゴヌクレオチドの５′または
３′末端における１、２または３ヌクレオシド間橋部の
交換（エンドキャッピング）およびオリゴヌクレオチド
の５′および３′末端における１、２または３ヌクレオ
シド間橋部の交換(ギャップ法) エンドキャッピングの効果に関しては、結果は場合によ
って一致しない。とくにＰＳ、ＰＡまたはＭｅＰ橋部に
よる３′エンドキャッピングは、ヌクレアーゼに対する
保護として記載されている［P．D．Cook（前出）、Mill
iganら（前出）］。３′エンドキャッピングによる保護
は一連の他の改変によっても達成される。３′−３′エ
ンドキャッピングは、核酸加水分解に対する保護として
様々な著者により記載されている［Shawら，Nucl．Acid
s Res．1991，19，747；Seligerら、Nucleoside & Nucl
eotides 1991，10，469］、３′エンドキャッピングの
他の変形には、３′末端への接合分子、たとえば３′−
ドデカノールもしくは３′−アクリジン［P．D．Cook，
全出］、または３−アミノ−２,３−プロパンジオール
［WO92／20697］の導入があり、これもヌクレアーゼに
対する安定性を増大させる。ギャップ法、すなわちオリ
ゴヌクレオチドの５′および３′末端における１、２ま
たは３ヌクレオシド間橋部の交換は、ＰＳオリゴヌクレ
オチドとは異なり、大部分の均一な改変はＲＮアーゼＨ
を活性化する能力の喪失、したがって活性の著しい喪失
を伴うことから、とくに有利なことが明らかにされてい
る。この場合も、広範囲の誘導体、改変ホスホジエステ
ル橋部、改変された糖、改変された塩基たとえばＭｅＰ
−、ＰＳ−、ＰＡ−、２′−Ｏ−アルキル−または２′
−Ｆ−誘導化オリゴヌクレオチドが安定化の目的に使用
された。これらの結果は、P．D．Cook（前出）に一致す
る。ギャップ内では、２〜４のＰＤ結合の配列がＲＮア
ーゼＨの活性化に十分であることになる。
【００１２】Gilesら［Anti-cancer Drug Design 199
3，8，33］は、非改変ＰＯ橋部のギャップを８から２橋
部に連続的に低下させたキメラのメチルホスホネート−
ホスホジエステルを記載している。ギャップが低下する
と細胞への取り込みは改善する傾向が見出されたが、オ
リゴヌクレオチドのアンチセンス活性は検討されなかっ
た。
【００１３】様々な戦略の間の興味ある比較を、Hokeら
［Nucl．Acids Res．1991，19，5743］に見ることがで
きる。著者らは細胞培養中のＨＳＶ−１に対するある範
囲のＰＳ−改変アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性
を比較している。彼らの所見は３′、または３′＋５′
をエンドキャップしたオリゴヌクレオチド（最初の３つ
のヌクレオシド橋部は各場合とも改変されている）は血
清中、全−ＰＳオリゴヌクレオチドと同様に、ヌクレア
ーゼによる分解に対して十分保護されていることを確認
するものである。これに反し、内部改変（３ＰＳ橋部）
オリゴヌクレオチド、および５′末端のみがキャップさ
れたオリゴヌクレオチド（この場合も、最初の３つのヌ
クレオシド橋部が改変されている）は迅速に分解され
る。これに反し、著者らは、５′もしくは３′エンドキ
ャッピングまたはそれらの両者も、細胞内での活性には
十分ではないことを見出し、彼らは細胞中におけるヌク
レア−ゼに対する十分な安定性を達成するには、均一な
改変（全−ＰＳ）が必要であると結論した。
【００１４】驚くべきことに、ヌクレアーゼに抵抗性に
なると、ピリミジンヌクレオシドがオリゴヌクレオチド
における弱点であることが見出されたのである。これら
の部位がヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させる改変
によって保護されると、これは一方では、安定性および
活性に顕著な改善を生じる。
【００１５】したがって、本発明は、式 ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ (Ｉ) ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡ (II) ＧＴＣＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＡ (III) ＧＣＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡ (IV) ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡ (Ｖ) ＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧ (VI) ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＧ (VII) ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣ (VIII) ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＡＣＡＣ (IX) ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ (Ｘ) ＣＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ (XI) ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣ (XII) ＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣ (XIII) ＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＡＧ (XIV) ＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧ (XV) ＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧ (XVI) ＣＡＣＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣ (XVII) ＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣ (XVIII) ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣ (XIX) ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧ (XX) ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＧ (XXI) ＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡＧＴＴＡＣＴＣＡ (XXII) ＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡ (XXIII) ＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＴＧ (XXIV) ＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ (XXV) ＣＴＧＴＡＧＴＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧ (XXVI) ＧＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣ (XXVII) ＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣ (XXVIII) ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣ (XXIX) ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣ (XXX) ＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＡＧＣＧＡＧＧ (XXXI) ＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧ (XXXII) ＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴＴＣ (XXXIII) （式中，少なくとも１個の非末端ピリミジンヌクレオシ
ドは改変されている）のオリゴヌクレオチドに関する。
【００１６】好ましいオリゴヌクレオチドは、２〜１
０、とくに３〜６の非末端ピリミジンヌクレオシドが改
変され、とくに８以下の以後のヌクレオチドが改変され
ているオリゴヌクレオチドである。とくに好ましいオリ
ゴヌクレオチドは、さらに５′および／または３′末端
が改変された、とくに最初の１〜５、とくに１〜３、と
くに２〜３のヌクレオチドが５′および／または３′末
端に、好ましくはホスホロチオエート橋部、ホスホロジ
チオエート橋部および／またはメチルホスホネート橋部
によって連結しているオリゴヌクレオチドである。とく
に好ましいものは、互いに連結している少なくとも１〜
４、とくに３〜４の非改変ヌクレオチドの１または２以
上のグループを含有する改変オリゴヌクレオチドであ
る。
【００１７】たとえば、表１にＨＳＶ−１に対するアン
チセンスオリゴヌクレオチド０１を示す。これは５′お
よび３′末端上がＰＳで二重にキャップされ、２７μＭ
の濃度で活性である。５′および３′末端への３つのＰ
Ｓ橋部の導入は、活性を９μＭに上昇させ、また、シト
シン基Ｃの３′へのさらに１個のＰＳ橋部の導入でも同
じ効果が達成される（アンチセンスオリゴヌクレオチド
０３）。ＴおよびＣの５′または３′への２個のＰＳ橋
部の導入（アンチセンスオリゴヌクレオチド０５）、ま
たはＴおよびＣへの５′もしくは３′への４個のＰＳ橋
部の導入（アンチセンスオリゴヌクレオチド０６）はさ
らにＭＩＣ値（最小阻止濃度）それぞれ３および１μＭ
の活性への上昇をもたらす。相当する全−ＰＳ誘導体の
ＭＩＣ値も１μＭである。これは、ピリミジンヌクレオ
シドの保護によって、全−改変オリゴヌクレオチドに匹
敵する安定性および活性の増大が、しかもこのような激
烈な変化による上述の欠点を回避して、達成できたこと
を意味する。
【００１８】ピリミジン位置ならびに５′および／また
は３′末端における安定化は、互いに独立に、以下のよ
うに行うことができる。 ａ） ３′および／または５′ホスホジエステル橋部
の、たとえばホスホロチオエート、ホスホロジチオエー
ト、ＮＲ1Ｒ2−ホスホロアミデート、ボラノホスフェ−
ト、ホスフェート−(Ｃ1〜Ｃ21)−Ｏ−アルキルエステ
ル、ホスフェート−［(Ｃ6〜Ｃ12)アリール−(Ｃ1〜Ｃ
21)−Ｏ−アルキル］エステル、２,２,２−トリクロロ
ジメチルエチルホスホネート、(Ｃ1〜Ｃ8)−アルキルホ
スホネート、または(Ｃ6〜Ｃ12)−アリールホスホネー
ト橋部による置換。ホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエート、ＮＲ1Ｒ2−ホスホロアミデート、ホスフェー
ト−Ｏ−メチルエステル、ホスフェート−Ｏ−エチルエ
ステル、ホスフェート−Ｏ−イソプロピルエステル、メ
チルホスホネートまたはフェニルホスホネート橋部によ
る置換が好ましい。ホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエートまたはメチルホスホネート橋部による置換がと
くに好ましい。ホスホロチオエート橋部による置換が最
も好ましい。
【００１９】Ｒ1およびＲ2は互いに独立に水素、Ｃ1〜
Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ20−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14)−
アリール−(Ｃ1〜Ｃ8)−アルキルまたは−(ＣＨ2)c−
[ＮＨ(ＣＨ2)c]d−ＮＲ3Ｒ3（式中、ｃは２〜６の整数
であり、ｄは０〜６の整数であり、Ｒ3は互いに独立に
水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキルまたはＣ1〜Ｃ4−アルコキシ
−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルである）であり、Ｒ1およびＲ2は
好ましくは水素、Ｃ1〜Ｃ8−アルキルもしくはメトキシ
エチルであり、とくに好ましくは水素、Ｃ1〜Ｃ 4−アル
キルもしくはメトキシエチルである。Ｒ1およびＲ2はそ
れらが結合した窒素原子とともに、さらにＯ、Ｓおよび
Ｎからなる系よりのヘテロ原子を含有していてもよい５
〜６員のヘテロ環を形成することもできる。
【００２０】ｂ） ３′または５′ホスホジエステル橋
部の、デホスホノ橋部による置換［たとえば Uhlmann &
Peyman in“Methods in Molecular Biology"，20巻：
“Protocols for Oligonucleotides and Analogs"，S．
Agrawal編、Human Press，Totowa 1993，16章、355頁以
下参照］、たとえばホルムアセタール、３′−チオホル
ムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、
メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンまたは
シリル基による置換。ホルムアセタールおよび３′−チ
オホルムアセタールによる置換が好ましい。
【００２１】ｃ） 糖−ホスフェート骨格の、たとえば
モルホリノヌクレオシドオリゴマーによる置換［E．P．
Stirchakら、Nucl．Acids Res．17(1989)，6129］。
【００２２】ｄ） β−Ｄ−２′−デオキシリボース
の、たとえばα−Ｄ−２′−デオキシリボース、Ｌ−
２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシリ
ボース、２′−Ｏ−(Ｃ1〜Ｃ6)アルキル−リボース、
２′−Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ6)アルケニルリボース、２′−ＮＨ
2−２′−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノー
ス、α−アラビノフラノース、２,４−ジデオキシ−β
−Ｄ−エリスロ-ヘキソ−ピラノースおよび炭素環［た
とえばFroehler，J．Am．Chem．Soc．1992，114，832
0］および開環した鎖状糖類縁体［たとえばVanden-drie
sscheら、Tetraherron 1993，49，7223］もしくは二環
糖類縁体［たとえば，M.Tarkovら、Helv．Chim．Acta 1
993，76，481］による置換。２′−Ｆ−２′−デオキシ
リボース、２′−Ｏ−(Ｃ1〜Ｃ6)アルキル−リボース、
２′−Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ6)アルケニルリボース、または２′
−ＮＨ2−２′−デオキシリボースによる置換が好まし
い。２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′-Ｏ−(Ｃ
1〜Ｃ4)アルキル−リボース、もしくは２′−Ｏ−(Ｃ2
〜Ｃ4)アルケニル−リボース、または２′−ＮＨ2−
２′−デオキシリボースによる置換がとくに好ましい。
とくに、２′−Ｏ−メチル−、２′−Ｏ−アリル−、ま
たは２′−Ｏ−ブチルリボースによる置換が最も好まし
い。
【００２３】ｅ） 天然のヌクレオシド塩基の、たとえ
ば、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウ
ラシル、プソイドウラシル、ジヒドロウラシル、５−
(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキルウラシル、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アル
ケニルウラシル、５−(Ｃ2〜Ｃ 6)−アルキニルウラシ
ル、５−(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキルシトシン、５−(Ｃ2〜Ｃ
6)−アルケニルシトシン、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルキニル
シトシン、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシ
ン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブ
ロモウラシルまたは５−ブロモシトシンによる置換。５
−(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキルウラシル、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−ア
ルケニルウラシル、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルキニルウラシ
ル、５−(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキルシトシン、５−(Ｃ2〜Ｃ
6)−アルケニルシトシン、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルキニル
シトシン、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシ
ン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブ
ロモウラシルまたは５−ブロモシトシンによる置換が好
ましい。５−(Ｃ3〜Ｃ6)−アルキルウラシル、５−(Ｃ2
〜Ｃ6)−アルケニルウラシル、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルキ
ニルウラシル、５−(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキルシトシン、５
−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルケニルシトシンまたは５−(Ｃ2〜Ｃ
6)−アルキニルシトシンによる置換がとくに好ましい。
とくに、５−ペンチニルシトシン、５−ヘキシニルウラ
シルまたは５−ヘキシニルシトシンによる置換が最も好
ましい。
【００２４】上述の改変中、好ましい改変は群ａ）、
ｂ）、ｃ）およびｄ）の改変であり、とくに好ましい改
変は群ａ）およびｄ）の改変であり、最も好ましい改変
は群ａ）の改変である。
【００２５】さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、
たとえば３′および／または５′末端において、アンチ
センスオリゴヌクレオチドまたはトリプル−ヘリックス
−形成オリゴヌクレオチドの特性（たとえば、細胞透過
性、ヌクレアーゼによる分解、標的ＲＮＡ／ＤＮＡへの
親和性、ファーマコキネティクス）に増強作用を有する
分子と連結（接合）させることができる。たとえば、ポ
リリジン、挿入剤たとえばピレン、アクリジン、フェナ
ジン、フェナンスリジン、蛍光化合物たとえばフルオレ
セイン、架橋剤たとえばプソラレン、アジドプロフラビ
ン、ならびに親油性分子たとえばＣ12〜Ｃ20−アルキル
もしくはそれらの誘導体、たとえばヘキサメチレンテト
ラミン、テルペンたとえばファルネゾールもしくはフィ
トール、脂質たとえば１,２−ジヘキサデシル−rac−グ
リセロール、ステロイドたとえば胆汁酸、コレステロー
ルもしくはテストステロン、ビタミンたとえばビタミン
Ｅ、ポリ−もしくはオリゴエチレングリコール、(Ｃ12
〜Ｃ18)−アルキルホスフェート−ジエステルまたは−
Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−(Ｃ12〜Ｃ18)−アルキル
との接合体を挙げることができる。親油性分子たとえば
Ｃ12〜Ｃ20−アルキル、ステロイドたとえばコレステロ
ールもしくはテストステロン、ポリ−もしくはオリゴエ
チレングリコール、ビタミンＥ、挿入剤たとえばピレ
ン、(Ｃ14〜Ｃ18)−アルキルホスフェート−ジエステ
ル、または−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−(Ｃ12〜
Ｃ16)−アルキルとの接合体が好ましい。
【００２６】このようなオリゴヌクレオチド接合体の製
造は、本技術分野の熟練者には既知である（たとえば、
Uhlmann & Peyman，Chem．Rev．1990，90，543；M．Man
oharan in Antisense Research & Applications，Crook
e & Lebleu編、CRC Press，Boca Raton，1993，17章，3
03頁以下；EP0552766A2参照）。
【００２７】さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは
３′および／または５′末端に３′−３′および５′−
５′逆位をもつことができる［たとえば、Kogaら、J．O
rg．Chem．56(1991)，3757の記載］。
【００２８】本発明はさらに、本発明の化合物の本技術
分野の熟練者に既知の方法とくに化学合成による製造方
法、本発明の化合物の医薬の製造のための使用、本発明
のオリゴヌクレオチドを生理学的に許容される賦形剤お
よび必要に応じて適当な添加剤および／または補助剤と
混合することからなる医薬の製造法に関する。
【００２９】本発明はまた、全く一般的に少なくとも１
個の非末端ピリミジンヌクレオシドが改変された治療的
に活性なオリゴヌクレオチドの医薬の製造のための使用
を包含する。治療的に活性なオリゴヌクレオチドとは、
一般的にアンチセンスオリゴヌクレオチド、トリプル−
ヘリックス−形成オリゴヌクレオチド、アプタマー（特
異的標的分子たとえば蛋白質または受容体に結合できる
ＲＮＡまたはＤＮＡ分子；たとえば、L．C．Bockら、Na
ture 1992，355，564）またはリボザイム（触媒性ＲＮ
Ａ、たとえば、Castanettoら、Critical Rev．Eukar．G
ene Expr．1992，2，331参照）、とくにアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを意味するものと理解すべきである。
【００３０】さらに本発明は、少なくとも１個の非末
端、改変ピリミジンヌクレオシドを有するオリゴヌクレ
オチドの診断薬としての、たとえば生物学的サンプル中
の特定の二本鎖または一本鎖核酸分子の存在もしくは不
存在または量を検知するための使用に関する。
【００３１】本発明のこれらの使用のためには、オリゴ
ヌクレオチドは長さ約６〜１００、好ましくは約１０〜
４０、とくに約１２〜２５ヌクレオチドを有する。この
場合も上述の好ましい範囲、改変および接合は同様に適
用される。
【００３２】本発明の医薬はたとえばウイルスによって
起こる疾患たとえばＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、
インフルエンザ、ＶＳＶ、Ｂ型肝炎またはパピローマウ
イルスによって起こる疾患の処置に使用することができ
る。
【００３３】このような標的に対して活性な本発明のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの例を以下に掲げる。 ａ）ＨＩＶに対してたとえば
【化１】
【化２】 ｂ）ＨＳＶ−１に対して、たとえば
【化３】
【００３４】本発明の医薬はまた、たとえば癌の処置に
適当である。たとえば、癌の形成または増殖に関係する
標的に向けられたオリゴヌクレオチド配列を使用でき
る。このような標的の例は以下の通りである。 １） 核癌蛋白質、たとえばｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、
ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮ
Ａ、ｐ１２０。 ２） 細胞質／膜−関連癌蛋白質、たとえばＥＪ−ｒａ
ｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−
２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓ
ｒｃ、ｃ−ａｂｌ。 ３） 細胞受容体、たとえばＥＧＦ受容体、ｃ−ｅｒｂ
Ａ、レチノイド受容体、プロテイン−キナーゼ−調節サ
ブユニット、ｃ−ｆｍｓ。 ４） サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス、
たとえばＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１
ｂ、 ＩＬ−２、ＩＬ−４、ｂＦＧＦ、ミエロブラスチ
ン、フィブロネクチン。
【００３５】このような標的に対して活性な本発明のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの例を以下に掲げる。 ａ） ｃ−Ｈａ−ｒａｓに対して、たとえば
【化４】 ｃ） ｃ−ｍｙｃ、たとえば
【化５】 ｄ） ｃ−ｍｙｂ、たとえば
【化６】 ｅ） ｃ−ｆｏｓ、たとえば
【化７】 ｆ） ｐ１２０、たとえば
【化８】 ｇ） ＥＧＦ受容体、たとえば
【化９】 ｈ） ｐ５３腫瘍サプレッサー、たとえば
【化１０】 ｊ） ｃｄｃキナーゼに対するアンチセンスオリゴヌク
レオチド
【化１１】 ｋ） ＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）に対するアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド
【化１２】 ｌ） ＩＧＦ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チド
【化１３】 ｍ） ｂＦＧＦ翻訳開始部位に対するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド
【化１４】 ｎ） ｂＦＧＦコドン５８ｆｆに対するアンチセンスオ
リゴヌクレオチド
【化１５】 ｏ） ＦＧＦ受容体に対するアンチセンスオリゴヌクレ
オチド
【化１６】
【００３６】本発明の医薬はさらに、たとえばインテグ
リンまたは細胞−細胞接着受容体、たとえばＶＬＡ−
４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭもしくはＥＬＡＭによって影
響される疾患の処置に適当である。
【００３７】このような標的に対して活性な本発明のア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの例を以下に掲げる。
【化１７】
【００３８】医薬は、たとえば経口的に投与できる薬物
製剤の形態で、たとえば錠剤、コ−ト錠、硬質もしくは
軟質カプセル剤、溶液、乳化液または懸濁液の形態で使
用することができる。医薬はまた、経直腸的にたとえば
坐剤の形態で、または非経口的にたとえば注射用溶液の
形態で投与することもできる。薬物製剤の製造には、こ
れらの化合物は，治療的に不活性な有機および無機賦形
剤中に導入することができる。錠剤、コ−ト錠および硬
質ゼラチンカプセル剤用のこのような賦形剤の例には、
乳糖、ト−モロコシデンプンもしくはその誘導体、獣脂
およびステアリン酸もしくはその塩がある。溶液製剤に
適当な賦形剤は水、ポリオール、スクロース、転化糖お
よびグルコースがある。注射用溶液に適当な賦形剤は
水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物
油がある。坐剤用に適当な賦形剤は、植物油および硬化
油、ワックス、脂肪および半液体ポリオールである。薬
物製剤にはまた防腐剤、溶媒、安定化剤、湿潤剤、乳化
剤、甘味剤、着色剤、フレ−バー、浸透圧調節用の塩、
緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤および必要に応じ
て、他の治療活性物質を添加することができる。
【００３９】好ましい投与形態は注射である。この目的
には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、液体溶液中
に、好ましくは生理的に許容される緩衝液たとえばハン
クス液またはリンゲル液中に製剤化される。しかしなが
ら、アンチセンスオリゴヌクレオチドは固体の形態に製
剤化して、使用前に溶解または懸濁することもできる。
全身投与に好ましい用量は体重１kgあたり１日に約０.
０１mg〜約５０mgである。
【００４０】以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例
示するものである。 実施例１ オリゴヌクレオチドの合成 非改変オリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡシンセサイザー
（Applied Biosystems，380Bまたは394型）を用い、標
準ホスホラミダイト化学およびヨ−素酸化によって合成
した。混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステル
オリゴヌクレオチドにおけるホスホロチオエート橋部の
導入には、酸化はヨー素に代えてＴＥＴＤ（テトラエチ
ルチウラムジスルフィド）を用いて実施した（Applied
BiosystemsUser Bulletin 65）。オリゴヌクレオチドを
固体支持体（ＣＰＧまたはテンタゲル）から分離したの
ち、保護基を濃ＮＨ3を用いて５５℃で１８時間処理し
て除去し、オリゴヌクレオチドを最初にブタノ−ルで沈
殿させて精製した［Sawadogo，Van Dyke, Nucl.Acids R
es．19(1991)674］。ついで０.５Ｍ−ＮａＣｌ溶液か
ら、２.５容量部のエタノ−ルを用いて沈殿させるとナ
トリウム塩が得られた。
【００４１】［４−(１−ピレニル)ブタニル］ホスホジ
エステルはJ．S．Mannら、Bioconj．Chem．3(1992)554
の記載のようにして、５′末端に導入した。
【００４２】オリゴヌクレオチドは以下のようにして分
析した。 ａ） ２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素中分析ゲル電気
泳動および／または ｂ） ＨＰＬＣ分析：Waters GenPack FAX，ＣＨ3ＣＮ
（４００ml）、Ｈ2Ｏ（１.６Ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4（３.
１ｇ）、ＮａＣｌ（１１.７ｇ）、pH６.８（０.１Ｍ−
ＮａＣｌ）から、ＣＨ3ＣＮ（４００ml）、Ｈ2Ｏ（１.
６Ｌ）、ＮａＨ2ＰＯ4（３.１ｇ）、ＮａＣｌ（１７５.
３ｇ）、pH６.８（１.５Ｍ−ＮａＣｌ）への勾配および
／または ｃ） 毛細管ゲル電気泳動BeckmannキャピラリーｅＣＡ
ＰTM、Ｕ １００Ｐゲルカラム、長さ６５cm、１００mm
I．D,，ウインドウ一端から１５cm、緩衝液１４０μＭ
トリス、３６０ｍＭホウ酸、７Ｍ尿素、および／または ｄ） 電気スプレ−質量分析 オリゴヌクレオチドの分析により、それらの純度はいず
れの場合も９０％を越えることが明らかにされた。
【００４３】合成されたオリゴヌクレオチドの構造は表
１に示す。
【００４４】実施例２ 試験物質のヘルペスウイルスに対するインビトロ抗ウイ
ルス活性の試験 ヒトに病原性を示す範囲のヘルペスウイルスに対する試
験物質の抗ウイルス活性を細胞−培養試験系において試
験した。試験には、サル腎臓細胞（Vero、２×１５5／m
l）を９６−ウエルのマイクロタイタープレート中血清
含有ダルベッコＭＥＭ（５％ウシ胎児血清ＦＣＳ）中に
接種し５％ＣＯ2下３７℃で２４時間インキュベ−トす
る。ついで血清含有培地を吸引して除去し、細胞を血清
を含まないダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）を用いて２回
洗浄する。
【００４５】試験物質は予めＨ2Ｏで６００μＭの濃度
に希釈し、−１８℃で保存する。試験を実施するために
は、ダルベッコの最小必須培地（ＭＥＭ）中にさらに前
希釈工程を行う。各試験物質希釈液１００μｌを無血清
ダルベッコＭＥＭ（−ＦＣＳ）１００μｌとともに洗浄
細胞に加える。
【００４６】５％ＣＯ2下３７℃で３時間インキュベ−
トしたのち、細胞に単純ヘルペスウイルス１型（ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ７３３、ＨＳＶ−１Ｆ株）または単純ヘルペス
ウイルス２型（ＡＴＣＣ ＶＲ７３４、ＨＳＶ−２Ｇ
株）を３日以内に細胞シートを完全に破壊する濃度で用
いて感染させる。ＨＳＶ−１の場合には感染密度はウエ
ルあたり５００プラーク形成単位（ＰＦＵ）、ＨＳＶ−
２の場合は３５０ＰＦＵ／ウエルとする。ついで試験バ
ッチに１００Ｕ／mlのペニシリンおよび１００mg／mlの
ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中８０μＭ〜０.
０４μＭ濃度の試験物質をを加える。各試験とも二重に
実施し、ただし対照については各プレートごとに８回反
復して行う。
【００４７】バッチを５％ＣＯ2下３７℃で１７時間イ
ンキュベートしする。総インキュベーション時間２０時
間ののちに、細胞培養液を顕微鏡下に観察して、試験物
質の細胞毒性を測定する。最大耐容用量（ＤＴＭ）と
は、上述の試験条件下、顕微鏡下に観察できる細胞傷害
を生じないそのプレパレーションの最高濃度を指示して
用いられる。
【００４８】ついで、ＦＣＳを最終濃度が４％になるよ
うに加え，つづいて５％ＣＯ2下３７℃でさらに５５時
間インキュベートする。この時点で、非処置感染対照に
は完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察される。培養細
胞を顕微鏡下に観察したのち，Finter(1966)によって記
載された生存染色法に従って、ニュートラルレッドで染
色する。試験物質の抗ウイルス活性は、ウイルスによっ
て引き起こされる細胞変性効果に対して細胞の３０〜６
０％を保護するのに必要な最小阻止濃度（ＭＩＣ）とし
て定義する。
【００４９】
【表１】
【００５０】実施例３ 平滑筋細胞における試験物質の抗増殖活性の試験 以下に掲げるオリゴヌクレオチドについて、平滑筋細胞
の増殖の阻害能力を試験した。試験は、S．Biroら［Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA 90(1993)654］の記載に従っ
て実施した。すべてのオリゴヌクレオチドが、５〜２０
μＭの範囲で活性を示した。ホスホロチオエート橋部
（Ｐ＝Ｓ）によって置換されたホスホジエステル結合に
は配列中に＊で標識した。
【化１８】
【００５１】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 配列 ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴ ＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ ２０
【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 配列 ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴ ＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡ ２０
【００５３】配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２８ 配列 ＧＴＣＧＡＣＡＣＣＣ ＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡ ＡＴＧＧＡＴＡＡ ２８
【００５４】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２５ 配列 ＧＣＴＡＴＧＴＣＧＡ ＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣ ＴＧＡＡＡ ２５
【００５５】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..３１ 配列 ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴ ＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴ ＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣ Ａ 31
【００５６】配列番号：６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＩＶ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..３１ 配列 ＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣ ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣ ＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡ Ｇ 31
【００５７】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ＨＳＶ-１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 配列 ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣ ＡＴＧＧＧＧＧＴＣＧ ２０
【００５８】配列番号：８ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１５ 他の情報：注＝“ｃ−Ｈａ−ｒａｓ” 配列 ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣ ＣＣＡＧＣ １５
【００５９】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２１ 他の情報：注＝“ｃ−ｍｙｃ” 配列 ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡ ＧＣＧＧＧＧＣＡＣＡ Ｃ ２１
【００６０】配列番号：１０ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１５ 他の情報：注＝“ｃ−ｍｙｃ” 配列 ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧ ＧＧＣＡＴ １５
【００６１】配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１５ 他の情報：注＝“ｃ−ｍｙｂ” 配列 ＣＡＣＧＴＴＧＡＧＧ ＧＧＣＡＴ １５
【００６２】配列番号：１２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１８ 他の情報：注＝“ｃ−ｍｙｂ” 配列 ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴ ＣＴＴＣＧＧＧＣ １８
【００６３】配列番号：１３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１８ 他の情報：注＝“ｃ−ｍｙｂ” 配列 ＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴ ＣＴＣＣＧＧＧＣ １８
【００６４】配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２１ 他の情報：注＝“ｃ−ｆｏｓ” 配列 ＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣ ＡＴＧＧＴＣＧＡＡＡ Ｇ ２１
【００６５】配列番号：１５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２２ 他の情報：注＝“ｃ−ｆｏｓ” 配列 ＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡ ＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡ ＡＧ ２２
【００６６】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 他の情報：注＝“ｃ−ｆｏｓ” 配列 ＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣ ＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧ ２０
【００６７】配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 他の情報：注＝“ｐ−１２０” 配列 ＣＡＣＣＣＧＣＣＴＴ ＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣ ２０
【００６８】配列番号：１８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１８ 他の情報：注＝“ＥＧＦ−受容体” 配列 ＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧ ＣＧＣＡＧＣＧＣ １８
【００６９】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 他の情報：注＝“ＥＧＦ−受容体” 配列 ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴ ＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣ ２０
【００７０】配列番号：２０ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１９ 他の情報：注＝“ｐ５３腫瘍サプレッサー” 配列 ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧ ＡＧＧＡＴＧＡＧＧ １９
【００７１】配列番号：２１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２１ 他の情報：注＝“ｐ５３腫瘍サプレッサー” 配列 ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣ ＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡ Ｇ ２１
【００７２】配列番号：２２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１８ 他の情報：注＝“ｃｄｃ２−キナーゼ” 配列 ＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡ ＧＴＴＡＣＴＣＡ １８
【００７３】配列番号：２３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１８ 他の情報：注＝“ＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）” 配列 ＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴ ＧＣＣＴＣＡＡＡ １８
【００７４】配列番号：２４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２１ 他の情報：注＝“ＩＧＦ−１” 配列 ＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣ ＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴ Ｇ ２１
【００７５】配列番号：２５ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１５ 他の情報：注＝“ｂＦＧＦ翻訳部位” 配列 ＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧ ＧＴＣＣＣ １５
【００７６】配列番号：２６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１９ 他の情報：注＝“ｂＦＧＦコドン５８ｆｆ” 配列 ＣＴＧＴＡＧＴＴＴＧ ＡＣＧＴＧＴＧＧＧ １９
【００７７】配列番号：２７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｙｅｓ 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２２ 他の情報：注＝“ＦＧＦ−受容体” 配列 ＧＧＣＣＣＣＴＣＣＡ ＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣ ＣＣ ２２
【００７８】配列番号：２８ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１８ 他の情報：注＝“ＶＬＡ−４” 配列 ＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡ ＴＣＣＡＴＡＴＣ １８
【００７９】配列番号：２９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 他の情報：注＝“ＩＣＡＭ” 配列 ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣ ＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣ ２０
【００８０】配列番号：３０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２０ 他の情報：注＝“ＩＣＡＭ” 配列 ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣ ＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣ ２０
【００８１】配列番号：３１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..１９ 他の情報：注＝“ＩＣＡＭ” 配列 ＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣ ＡＴＡＧＣＧＡＧＧ １９
【００８２】配列番号：３２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２１ 他の情報：注＝“ＥＬＡＭ−１” 配列 ＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴ ＣＴＴＧＴＣＴＣＡＧ Ｇ ２１
【００８３】配列番号：３３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ ハイポセティカル：No アンチセンス：Yes 起源： 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を表す記号：ｅｘｏｎ 存在位置：１..２２ 他の情報：注＝“ＥＬＡＭ−１” 配列 ＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡ ＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴ ＴＣ ２２
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マテイーアス・マーク ドイツ連邦共和国デー−61440オーバーウ ルゼル．アンデアフリーデンスリンデ６ (72)発明者 ゲールハルト・クレツチユマル ドイツ連邦共和国デー−65760エシユボル ン．ウルメンヴエーク10 (72)発明者 マテイーアス・ヘルスベルク ドイツ連邦共和国デー−65779ケルクハイ ム．アム・ローゼンガルテン３ (72)発明者 イルヴイン・ヴインクラー ドイツ連邦共和国デー−65835リーダーバ ハ．インデンアイヒエン40

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式 ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ (Ｉ) ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡ (II) ＧＴＣＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＡ (III) ＧＣＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡ (IV) ＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡ (Ｖ) ＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧＧＡＧ (VI) ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＧ (VII) ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣ (VIII) ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＡＣＡＣ (IX) ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ (Ｘ) ＣＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ (XI) ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣ (XII) ＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣ (XIII) ＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＡＧ (XIV) ＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧ (XV) ＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧ (XVI) ＣＡＣＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣ (XVII) ＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣ (XVIII) ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣ (XIX) ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧ (XX) ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＧ (XXI) ＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡＧＴＴＡＣＴＣＡ (XXII) ＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡ (XXIII) ＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＴＧＡＴＧＴＧ (XXIV) ＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ (XXV) ＣＴＧＴＡＧＴＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧ (XXVI) ＧＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣ (XXVII) ＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣ (XXVIII) ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣ (XXIX) ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣ (XXX) ＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＡＧＣＧＡＧＧ (XXXI) ＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧ (XXXII) ＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴＴＣ (XXXIII) （式中，少なくとも１個の非末端ピリミジンヌクレオシ
    ドは改変されている）のオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ２〜１０の非末端ピリミジンヌクレオシ
    ドが改変されている請求項１に記載のオリゴヌクレオチ
    ド。
  3. 【請求項３】 ５′および／または３′末端がさらに改
    変されている請求項１または２に記載のオリゴヌクレオ
    チド。
  4. 【請求項４】 互いに連結している少なくとも１〜４ヌ
    クレオチドの１または２以上のグループが改変されてい
    ない請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】 改変は ａ） 隣接ヌクレオチドの少なくとも１個の３′および
    /または５′ホスホジエステル結合の置換および／また
    は ｂ） 隣接ヌクレオチドのデホスホ結合および／または ｃ） 少なくとも１個の糖基の置換および／または ｄ） 少なくとも１個の天然に存在するヌクレオシドの
    置換 として定義される請求項１〜４のいずれかに記載のオリ
    ゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 改変は ａ） 隣接したヌクレオチドのホスホロチオエ−ト、ホ
    スホロジチオエ−ト、ＮＲ1Ｒ2−ホスホロアミデート、
    ボラノホスフェート、ホスフェート−(Ｃ1〜Ｃ 21)−Ｏ
    −アルキルエステル、ホスフェート−［(Ｃ6〜Ｃ12)ア
    リール−(Ｃ1〜Ｃ 21)-Ｏ-アルキル]エステル、２,２,２
    −トリクロロジメチルエチルホスホネート、(Ｃ1〜Ｃ8)
    −アルキルホスホネート、(Ｃ6〜Ｃ12)−アリールホス
    ホネート結合［式中、Ｒ1およびＲ2は互いに独立に、水
    素、Ｃ1〜Ｃ18−アルキル、Ｃ6〜Ｃ 20−アリール、(Ｃ6
    〜Ｃ14)−アリール−(Ｃ1〜Ｃ8)−アルキルまたは−(Ｃ
    Ｈ2) c−[ＮＨ(ＣＨ2)c］d−ＮＲ3Ｒ3（式中、ｃは２〜
    ６の整数であり、ｄは０〜６の整数であり、Ｒ3は互い
    に独立に水素、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル、またはＣ1〜Ｃ4-
    アルコキシ−Ｃ1〜Ｃ6−アルキルである）であるか、あ
    るいはＲ1およびＲ2はそれらが結合した窒素原子ととも
    に、さらにＯ、ＳおよびＮからなる系よりのヘテロ原子
    を所望により含有していてもよい５〜６員のヘテロ環を
    形成する］、 ｂ） 隣接ヌクレオチドのホルムアセタール、３′−チ
    オホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキ
    シム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホン
    またはシリル結合、 ｃ） 糖−ホスフェート骨格のモルホリノヌクレオシド
    オリゴマ−による置換、または、 ｄ） β−Ｄ−２′−デオキシリボースのα−Ｄ−２′
    −デオキシリボース、Ｌ−２′−デオキシリボース、
    ２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′−Ｏ−(Ｃ1〜
    Ｃ6)アルキル−リボース、２′−Ｏ−(Ｃ2〜Ｃ6)アルケ
    ニル−リボース、２′−ＮＨ2−２′−デオキシリボー
    ス、β−Ｄ−キシロフラノース、α−アラビノフラノー
    ス、２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソ−
    ピラノース、炭素環もしくは開環した鎖状糖類縁体また
    は二環糖類縁体による置換または ｅ） 天然のヌクレオシド塩基の５−（ヒドロキシメチ
    ル）ウリジン、５−アミノウリジン、プソイドウリジ
    ン、ジヒドロウリジン、５−(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキルウリ
    ジン、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルケニルウリジン、５−(Ｃ2
    〜Ｃ6)−アルキニルウリジン、５−(Ｃ1〜Ｃ6)−アルキ
    ルシチジン、５−(Ｃ2〜Ｃ6)−アルケニルシチジン、５
    −(Ｃ2〜Ｃ6)−アルキニルシチジン、５−フルオロウリ
    ジン、５−フルオロシチジン、５−クロロウリジン、５
    −クロロシチジン、５−ブロモウリジンまたは５−ブロ
    モシチジンによる置換、として定義される請求項５に記
    載のオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 オリゴヌクレオチドは親油性の基，好ま
    しくはファルネシル、フィチル、ヘキサデシル、コレス
    テリル、ヘキサメチレンテトラアミン、ビタミンＥまた
    は胆汁酸基を５′および／または３′末端に有する請求
    項１〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 化学合成による請求項１〜７のいずれか
    に記載のオリゴヌクレオチドの製造方法。
  9. 【請求項９】 請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴ
    ヌクレオチド少なくとも１種類を生理学的に許容される
    賦形剤および必要に応じて、適当な添加剤および／また
    は補助剤と混合することからなる医薬の製造方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜７のいずれかに記載のオリ
    ゴヌクレオチドの医薬の製造のための使用。
  11. 【請求項１１】 医薬または診断薬の製造のための少な
    くとも１個の非末端ピリミジンヌクレオシドが改変され
    ているオリゴヌクレオチドの使用。
  12. 【請求項１２】 ２〜１０の非末端ピリミジンヌクレオ
    シドが改変されている請求項１１に記載の使用。
  13. 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドはさらに５′およ
    び／または３′末端が改変されている請求項１１または
    １２に記載の使用。
  14. 【請求項１４】 互いに連結している少なくとも１〜４
    ヌクレオチドの１または２以上のグル−プが改変されて
    いない請求項１１〜１３のいずれかに記載の使用。
  15. 【請求項１５】 請求項５または６に定義されたように
    改変されている請求項１１〜１４のいずれかに記載の使
    用。
  16. 【請求項１６】 オリゴヌクレオチドは約６〜１００ヌ
    クレオチドの長さを有する請求項１１〜１５のいずれか
    に記載の使用。
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