JP3392143B2 - 二本鎖オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤 - Google Patents
二本鎖オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はヒト癌の治療及び予防に有用な二本鎖オリゴ
ヌクレオチド又はその誘導体に関する。
ヌクレオチド又はその誘導体に関する。
背景技術
最近、多くの癌関連遺伝子が発見され、徐々にではあ
るが癌化の機序が明らかになりつつある。その結果、多
くの癌は遺伝子の異常により引き起こされる一種の遺伝
子病であることが示された。変異した異常細胞はもとも
と正常細胞由来であるため、体内で異物として認識され
にくく、またその生物学あるいは生化学的性質も他の生
物の襲来による感染症とは異なり正常細胞のそれとの差
は、それほど大きくない。
るが癌化の機序が明らかになりつつある。その結果、多
くの癌は遺伝子の異常により引き起こされる一種の遺伝
子病であることが示された。変異した異常細胞はもとも
と正常細胞由来であるため、体内で異物として認識され
にくく、またその生物学あるいは生化学的性質も他の生
物の襲来による感染症とは異なり正常細胞のそれとの差
は、それほど大きくない。
従って癌に関する種々の薬剤、治療法及び試薬が開発
されているが、これらは癌細胞に対する選択性が低く癌
細胞ばかりでなく、正常組織及び正常細胞にも影響を与
え、如何に有効な薬剤とはいえ、その副作用のために使
用が著しく制限されているのが現状である。
されているが、これらは癌細胞に対する選択性が低く癌
細胞ばかりでなく、正常組織及び正常細胞にも影響を与
え、如何に有効な薬剤とはいえ、その副作用のために使
用が著しく制限されているのが現状である。
これに対し最近では核酸及びその誘導体を用いた特定
の遺伝子の発現制御法が開発されつつあり、癌は、上記
したように遺伝子疾患であるため、特定の遺伝子、特に
癌化因子を標的とした場合、その発現制御による癌細胞
特異的な効力は十分に期待できる。
の遺伝子の発現制御法が開発されつつあり、癌は、上記
したように遺伝子疾患であるため、特定の遺伝子、特に
癌化因子を標的とした場合、その発現制御による癌細胞
特異的な効力は十分に期待できる。
その一つの手段としてアンチセンス法がある。これ
は、標的とする遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を
もつ短い（15−30塩基長程度）オリゴヌクレオチドを細
胞内に導入し、癌化遺伝子の転写、あるいは翻訳を阻害
する方法である。
は、標的とする遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列を
もつ短い（15−30塩基長程度）オリゴヌクレオチドを細
胞内に導入し、癌化遺伝子の転写、あるいは翻訳を阻害
する方法である。
しかしながら、アンチセンス法を用いる一本鎖オリゴ
ヌクレオチドは、細胞内で安定性が低く、更に生体内に
おいて素早く代謝されてしまうこと等により未だ医薬品
として実用化されていないのが現状である。
ヌクレオチドは、細胞内で安定性が低く、更に生体内に
おいて素早く代謝されてしまうこと等により未だ医薬品
として実用化されていないのが現状である。
一方、本来癌細胞では、細胞分裂能が高いため細胞増
殖に関与する遺伝子の発現が亢進している。そのため、
過去及び現在においてもこれらDNA合成及び細胞増殖に
関わる因子は、制癌剤の標的とされてきた。しかしなが
ら、個々の遺伝子の発現の程度には個体差、臓器差、組
織型差が存在しており、また同一癌組織内においても個
々の細胞間でばらつきが大きいことが知られている。そ
の結果、従来の単一の細胞増殖因子を標的とした薬剤で
は、スペクトラムが狭くその効力には限界があった。
殖に関与する遺伝子の発現が亢進している。そのため、
過去及び現在においてもこれらDNA合成及び細胞増殖に
関わる因子は、制癌剤の標的とされてきた。しかしなが
ら、個々の遺伝子の発現の程度には個体差、臓器差、組
織型差が存在しており、また同一癌組織内においても個
々の細胞間でばらつきが大きいことが知られている。そ
の結果、従来の単一の細胞増殖因子を標的とした薬剤で
は、スペクトラムが狭くその効力には限界があった。
従って、本発明の目的は、スペクトラムが広く、かつ
効力の強い制癌剤等の医薬組成物として有用なオリゴヌ
クレオチド又はその誘導体、該医薬組成物を用いた癌の
予防・治療方法を提供することにある。
効力の強い制癌剤等の医薬組成物として有用なオリゴヌ
クレオチド又はその誘導体、該医薬組成物を用いた癌の
予防・治療方法を提供することにある。
発明の開示
かかる実情に鑑み、本発明者らは、まず細胞内転写因
子E2Fが制癌剤の標的として優れた性質を有することに
着目した。この細胞内転写因子E2FはアデノウイルスE2
プロモーターに結合する因子として発見されたものであ
るが、研究が進むにつれて、細胞の増殖制御に重要な働
きをしていることが明らかとなってきた〔ネヴィス,J.
R.,サイエンス（Nevis,J.R.,Science），258,424−429
（1992）、国際公開WO95/11687〕。すなわち、E2FはDNA
合成や細胞増殖に必須の遺伝子であるDNAポリメラーゼ
α、デヒドロ葉酸還元酵素、ｃ−mycのプロモーター領
域に存在する特定の８個の塩基配列（即ち、TTTCGCGCお
よびTTTCCCGC）に結合して、これら遺伝子の転写を活性
化することが明らかにされてきた。
子E2Fが制癌剤の標的として優れた性質を有することに
着目した。この細胞内転写因子E2FはアデノウイルスE2
プロモーターに結合する因子として発見されたものであ
るが、研究が進むにつれて、細胞の増殖制御に重要な働
きをしていることが明らかとなってきた〔ネヴィス,J.
R.,サイエンス（Nevis,J.R.,Science），258,424−429
（1992）、国際公開WO95/11687〕。すなわち、E2FはDNA
合成や細胞増殖に必須の遺伝子であるDNAポリメラーゼ
α、デヒドロ葉酸還元酵素、ｃ−mycのプロモーター領
域に存在する特定の８個の塩基配列（即ち、TTTCGCGCお
よびTTTCCCGC）に結合して、これら遺伝子の転写を活性
化することが明らかにされてきた。
そこで本発明者らは、E2F蛋白質の機能を阻害するこ
とで、細胞増殖関連遺伝子の発現をまとめて抑制し、そ
の結果スペクトラムが広くかつ効力の強い新規制癌剤の
開発が可能であると考えた。
とで、細胞増殖関連遺伝子の発現をまとめて抑制し、そ
の結果スペクトラムが広くかつ効力の強い新規制癌剤の
開発が可能であると考えた。
しかしながら、E2F蛋白質は１種類ではなく、少なく
とも５種類の蛋白質が存在し、所謂遺伝子ファミリーを
形成していることが、報告されている〔ハバー,H.E.
ら、プロシーディングズ オブ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンセス（Huber,H.E.et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.）USA.,90,3525−3529（1993）〕、〔リー
ス,J.A.ら、モレキュラー アンド セルラー バイオ
ロジー（Lees,J.A.,et al.,Mol.Cell.Biol.），13,781
3−7825（1993）等〕。また、個々のE2F蛋白質の機能分
担については、依然明らかになっていない。この状況下
においては、通常のアンチセンス法を用いてもE2F遺伝
子群すべての発現を抑制することは困難であった。
とも５種類の蛋白質が存在し、所謂遺伝子ファミリーを
形成していることが、報告されている〔ハバー,H.E.
ら、プロシーディングズ オブ ナショナル アカデミ
ー オブ サイエンセス（Huber,H.E.et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.）USA.,90,3525−3529（1993）〕、〔リー
ス,J.A.ら、モレキュラー アンド セルラー バイオ
ロジー（Lees,J.A.,et al.,Mol.Cell.Biol.），13,781
3−7825（1993）等〕。また、個々のE2F蛋白質の機能分
担については、依然明らかになっていない。この状況下
においては、通常のアンチセンス法を用いてもE2F遺伝
子群すべての発現を抑制することは困難であった。
そこで、本発明者らは、このE2F蛋白質群の認識配列
である、TTTSSCGSを含む二本鎖オリゴヌクレオチドによ
り、細胞内E2F蛋白質群を吸収すれば、細胞内E2F蛋白質
群の枯渇を引き起こし、その結果、E2Fの関与する細胞
増殖関連遺伝子の発現抑制及び癌細胞に対する極めて強
い殺細胞活性が得られることを見いだし本発明を完成し
た。
である、TTTSSCGSを含む二本鎖オリゴヌクレオチドによ
り、細胞内E2F蛋白質群を吸収すれば、細胞内E2F蛋白質
群の枯渇を引き起こし、その結果、E2Fの関与する細胞
増殖関連遺伝子の発現抑制及び癌細胞に対する極めて強
い殺細胞活性が得られることを見いだし本発明を完成し
た。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
1. ５′−TTTSSCGS−３′（ＳはＧ又はＣを示す。）で
表される塩基配列を少なくとも一方の鎖上に少なくとも
１個有する15〜40塩基対からなることを特徴とする二本
鎖オリゴヌクレオチド又はそのホスホジエステル結合が
メチルホスホエート結合又はホスホロチオエート結合に
変換されたもの、５′又は３′末端に脂溶性化合物を結
合したもの、及びダンベル型二本鎖オリゴヌクレオチド
から選択される誘導体の少なくとも１種を有効成分とす
る医薬組成物。
表される塩基配列を少なくとも一方の鎖上に少なくとも
１個有する15〜40塩基対からなることを特徴とする二本
鎖オリゴヌクレオチド又はそのホスホジエステル結合が
メチルホスホエート結合又はホスホロチオエート結合に
変換されたもの、５′又は３′末端に脂溶性化合物を結
合したもの、及びダンベル型二本鎖オリゴヌクレオチド
から選択される誘導体の少なくとも１種を有効成分とす
る医薬組成物。
2. 塩基対が15〜32である請求の範囲第１項に記載の二
本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体の少なくとも１
種を有効成分とする医薬組成物。
本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体の少なくとも１
種を有効成分とする医薬組成物。
3.5′−TTTSSCGS−３′で表される塩基配列を一方の鎖
上に１〜５個有する塩基対からなることを特徴とする請
求の範囲第１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は
その誘導体の少なくとも１種を有効成分とする医薬組成
物。
上に１〜５個有する塩基対からなることを特徴とする請
求の範囲第１項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は
その誘導体の少なくとも１種を有効成分とする医薬組成
物。
4. ５′−（TTTSSCGS）ｎ−３′（ＳはＧ又はＣを示
す。ｎは２〜５を示す。）で表される塩基配列を一方の
鎖上に有する塩基対からなることを特徴とする二本鎖オ
リゴヌクレオチド又はその誘導体。
す。ｎは２〜５を示す。）で表される塩基配列を一方の
鎖上に有する塩基対からなることを特徴とする二本鎖オ
リゴヌクレオチド又はその誘導体。
5. ｎが２〜４である前記第４項に記載の二本鎖オリゴ
ヌクレオチド又はその誘導体。
ヌクレオチド又はその誘導体。
6. 配列番号１記載の塩基配列であることを特徴とする
前記第４項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその
誘導体。
前記第４項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその
誘導体。
7. ５′−TTTSSCGSSAAA−３′（ＳはＧ又はＣを示
す。）で表される塩基配列を一方の鎖上に有する塩基対
からなることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド又
はそのホスホジエステル結合がメチルホスホエート結合
又はホスホロチオエート結合に変換されたもの、５′又
は３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、及びダンベ
ル型二本鎖オリゴヌクレオチドから選択される誘導体。
す。）で表される塩基配列を一方の鎖上に有する塩基対
からなることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド又
はそのホスホジエステル結合がメチルホスホエート結合
又はホスホロチオエート結合に変換されたもの、５′又
は３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、及びダンベ
ル型二本鎖オリゴヌクレオチドから選択される誘導体。
8. 配列番号２記載の塩基配列であることを特徴とする
前記第７項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその
誘導体。
前記第７項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその
誘導体。
9. ５′−SCGSSAAATTTSSCGS−３′（ＳはＧ又はＣを示
す。）で表される塩基配列を一方の鎖上に有する塩基対
からなることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド又
はそのホスホジエステル結合がメチルホスホエート結合
又はホスホロチオエート結合に変換されたもの、５′又
は３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、及びダンベ
ル型二本鎖オリゴヌクレオチドから選択される誘導体。
す。）で表される塩基配列を一方の鎖上に有する塩基対
からなることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチド又
はそのホスホジエステル結合がメチルホスホエート結合
又はホスホロチオエート結合に変換されたもの、５′又
は３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、及びダンベ
ル型二本鎖オリゴヌクレオチドから選択される誘導体。
10. 配列番号３記載の塩基配列であることを特徴とす
る前記第９項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はそ
の誘導体。
る前記第９項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はそ
の誘導体。
11. 配列番号３の１番目の塩基対のＧとＣとをTTTTTを
介して結合させ、かつ該28番目の塩基対のＣとＧとをTT
TTTを介して結合させたダンベル状であることを特徴と
する前記第10項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は
その誘導体。
介して結合させ、かつ該28番目の塩基対のＣとＧとをTT
TTTを介して結合させたダンベル状であることを特徴と
する前記第10項に記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又は
その誘導体。
12. 前記第４項〜第11項に記載のオリゴヌクレオチド
又はその誘導体の少なくとも１種を有効成分とする医薬
組成物。
又はその誘導体の少なくとも１種を有効成分とする医薬
組成物。
13. 癌の予防・治療剤であることを特徴とする前記第
１〜３項及び第12項の何れかに記載の医薬組成物。
１〜３項及び第12項の何れかに記載の医薬組成物。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、５′−TTTSSC
GS−３′（ＳはＧ又はＣを示す。）で表される塩基配列
を少なくとも一方の鎖上に少なくとも１個有する15〜40
塩基対からなる（以下、５′−TTTSSCGS−３′配列を基
本配列と称す）。例えば、基本配列を１個有するもの
は、その５′端および／または３′に任意の塩基Ｎを総
和で７〜32連結して二本鎖の一方が５′−Ｎ……NTTTSS
CGSN……Ｎ−３′（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）
を形成し、もう一方の鎖が前記配列と相補の配列である
ものを含む意味であり、二本鎖オリゴヌクレオチドの形
態は直鎖状でも環状でもよい。
GS−３′（ＳはＧ又はＣを示す。）で表される塩基配列
を少なくとも一方の鎖上に少なくとも１個有する15〜40
塩基対からなる（以下、５′−TTTSSCGS−３′配列を基
本配列と称す）。例えば、基本配列を１個有するもの
は、その５′端および／または３′に任意の塩基Ｎを総
和で７〜32連結して二本鎖の一方が５′−Ｎ……NTTTSS
CGSN……Ｎ−３′（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）
を形成し、もう一方の鎖が前記配列と相補の配列である
ものを含む意味であり、二本鎖オリゴヌクレオチドの形
態は直鎖状でも環状でもよい。
また、基本配列が複数存在する場合も、上記基本配列
は１個の場合と同様で、上記Ｎ……Ｎの一部もしくは全
部を基本配列に置き換えることにより形成できる。その
基本配列の置き換えは、Ｎを単独または複数介在させて
もさせないで基本配列を連続に連結したものであっても
それらの組合せであってもよい。更に、各基本配列のＳ
は互いに同一でも異なっていてもよい。
は１個の場合と同様で、上記Ｎ……Ｎの一部もしくは全
部を基本配列に置き換えることにより形成できる。その
基本配列の置き換えは、Ｎを単独または複数介在させて
もさせないで基本配列を連続に連結したものであっても
それらの組合せであってもよい。更に、各基本配列のＳ
は互いに同一でも異なっていてもよい。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは塩基対が15〜32
であるものが好ましく、塩基対が22〜32であるものが特
に好ましい。
であるものが好ましく、塩基対が22〜32であるものが特
に好ましい。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドを基本配列のみで
構成した場合は、好ましくは基本配列は１本当たり２〜
５が好ましく、２〜４であるものがより好ましい。基本
配列のみで構成するとは、すなわち５′−（TTTSSCGS）
ｎ−３′で表される二本鎖オリゴヌクレオチドを意味
し、ｎは２〜５が好ましく、２〜４であるものがより好
ましい。特に配列番号１のものが好ましい。
構成した場合は、好ましくは基本配列は１本当たり２〜
５が好ましく、２〜４であるものがより好ましい。基本
配列のみで構成するとは、すなわち５′−（TTTSSCGS）
ｎ−３′で表される二本鎖オリゴヌクレオチドを意味
し、ｎは２〜５が好ましく、２〜４であるものがより好
ましい。特に配列番号１のものが好ましい。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドをＮを介在させて
構成した場合は、好ましくは基本配列を両方の鎖上に設
けて構成した場合が好ましく、より好ましくはSSCGSの
全部又は一部を両鎖上で共有する場合及び５′−TTTSSC
GS−３′とその相補塩基対である５′−SCGSSAAA−３′
が連続した塩基対である場合が好ましく、特に５′−TT
TSSCGSSAAA−３′で表される塩基配列又は５′−SCGSSA
AATTTSSCGS−３′で表される塩基配列を一方の鎖上に有
する場合が好ましい。具体的にはそれぞれ配列番号２及
び３に開示のものが挙げられるがこれに限定されるもの
ではない。
構成した場合は、好ましくは基本配列を両方の鎖上に設
けて構成した場合が好ましく、より好ましくはSSCGSの
全部又は一部を両鎖上で共有する場合及び５′−TTTSSC
GS−３′とその相補塩基対である５′−SCGSSAAA−３′
が連続した塩基対である場合が好ましく、特に５′−TT
TSSCGSSAAA−３′で表される塩基配列又は５′−SCGSSA
AATTTSSCGS−３′で表される塩基配列を一方の鎖上に有
する場合が好ましい。具体的にはそれぞれ配列番号２及
び３に開示のものが挙げられるがこれに限定されるもの
ではない。
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常、公知の手段に
従い市販のDNA合成装置により合成することができる。
またこの際、ホスホジエステル結合については、細胞内
取り込み性及び安定性の面から、メチルホスホエート結
合（米国特許第4511713号）やホスホロチオエート結合
（特開平１−503302号）に置き換えてもよい。これらの
いずれもまた市販のDNA合成装置で合成可能である。ま
た合成後二本鎖にするには通常使用されているアニーリ
ング法でよい。
従い市販のDNA合成装置により合成することができる。
またこの際、ホスホジエステル結合については、細胞内
取り込み性及び安定性の面から、メチルホスホエート結
合（米国特許第4511713号）やホスホロチオエート結合
（特開平１−503302号）に置き換えてもよい。これらの
いずれもまた市販のDNA合成装置で合成可能である。ま
た合成後二本鎖にするには通常使用されているアニーリ
ング法でよい。
また、この配列を含むオリゴヌクレオチドの５′又は
３′末端にコレステロール等の脂溶性化合物を結合する
ことにより、細胞内取り込みを上昇させること、並びに
二本鎖の末端同士を酵素などを用いて結合させて所謂ダ
ンベル型DNAにすることで極めて高いヌクレアーゼ耐性
を得ることも可能である〔（クルセル,C.ら、ヌクレイ
ック アシッヅ リサーチ（Clusel,C.,et al.,Nuclei
c Acids Res.,）21,3405−3411（1993）〕。
３′末端にコレステロール等の脂溶性化合物を結合する
ことにより、細胞内取り込みを上昇させること、並びに
二本鎖の末端同士を酵素などを用いて結合させて所謂ダ
ンベル型DNAにすることで極めて高いヌクレアーゼ耐性
を得ることも可能である〔（クルセル,C.ら、ヌクレイ
ック アシッヅ リサーチ（Clusel,C.,et al.,Nuclei
c Acids Res.,）21,3405−3411（1993）〕。
本発明において、二本鎖オリゴヌクレオチドがダンベ
ル状であるとは、二本鎖オリゴヌクレオチドの両端に水
素結合が形成され得ない塩基配列を二本鎖オリゴヌクレ
オチドが二本鎖領域を含めて環状の１本鎖オリゴヌクレ
オチドとなるように結合される。言い換えれば、二本鎖
オリゴヌクレオチドの一端の５′端と３′端の各塩基に
上記水素結合が形成され得ない塩基配列を両端に各々の
連結せしめ、形成されたものがダンベル状、即ち、両端
が一本鎖で中央部が二本鎖となるものである。該水素結
合が形成され得ない塩基配列の長さとしては、１端部当
たり１〜15、好ましくは３〜８である。
ル状であるとは、二本鎖オリゴヌクレオチドの両端に水
素結合が形成され得ない塩基配列を二本鎖オリゴヌクレ
オチドが二本鎖領域を含めて環状の１本鎖オリゴヌクレ
オチドとなるように結合される。言い換えれば、二本鎖
オリゴヌクレオチドの一端の５′端と３′端の各塩基に
上記水素結合が形成され得ない塩基配列を両端に各々の
連結せしめ、形成されたものがダンベル状、即ち、両端
が一本鎖で中央部が二本鎖となるものである。該水素結
合が形成され得ない塩基配列の長さとしては、１端部当
たり１〜15、好ましくは３〜８である。
例えば、上記12項で示したように配列番号３の１番目
の塩基対のＧとＣとをTTTTTを介して結合させ、かつ該2
8番目の塩基対のＣとＧとをTTTTTを介して結合させたダ
ンベル型二本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。
の塩基対のＧとＣとをTTTTTを介して結合させ、かつ該2
8番目の塩基対のＣとＧとをTTTTTを介して結合させたダ
ンベル型二本鎖オリゴヌクレオチドが挙げられる。
尚、本発明におけるダンベル型二本鎖オリゴヌクレオ
チドのダンベル部のＮは本発明の二本鎖オリゴヌクレオ
チドを構成する15〜40塩基対の塩基には含まれないもの
とする。
チドのダンベル部のＮは本発明の二本鎖オリゴヌクレオ
チドを構成する15〜40塩基対の塩基には含まれないもの
とする。
従って、本発明における二本鎖オリゴヌクレオチドの
誘導体としては、上述のオリゴヌクレオチドと同様にE2
Fの関与する増殖関連遺伝子の発現抑制効果を有し、そ
のホスホジエステル結合がメチルホスホエート結合又は
ホスホロチオエート結合に変換されたもの、５′又は
３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、ダンベル型二
本鎖オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
誘導体としては、上述のオリゴヌクレオチドと同様にE2
Fの関与する増殖関連遺伝子の発現抑制効果を有し、そ
のホスホジエステル結合がメチルホスホエート結合又は
ホスホロチオエート結合に変換されたもの、５′又は
３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、ダンベル型二
本鎖オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体
（以下、本発明化合物とも称す。）は、強い殺細胞効
果、E2Fの関与する増殖関連遺伝子の発現抑制効果を有
し、医薬組成物の有効成分として使用できる。
（以下、本発明化合物とも称す。）は、強い殺細胞効
果、E2Fの関与する増殖関連遺伝子の発現抑制効果を有
し、医薬組成物の有効成分として使用できる。
本発明の医薬組成物は、同一の組成物内に上記本発明
の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体を単独また
は組み合わせて１種以上含有させることができ、各二本
鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体の配合割合を適宜
調整して使用し得る。
の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体を単独また
は組み合わせて１種以上含有させることができ、各二本
鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体の配合割合を適宜
調整して使用し得る。
本発明の医薬組成物は、前記二本鎖オリゴヌクレオチ
ド又はその誘導体と公知の医薬用担体から構成され得、
特に癌の予防・治療剤に有用である。
ド又はその誘導体と公知の医薬用担体から構成され得、
特に癌の予防・治療剤に有用である。
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体を
医薬としてヒトを含む哺乳動物に用いるに当たっては、
予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能で
あり、該形態としては、例えば、注射剤、坐剤、外用剤
（例えばパップ剤、テープ剤等の貼付剤、軟膏剤、クリ
ーム剤、ローション剤等）、点眼剤、点鼻剤などのいず
れでも良く、これらは、各々当業者に公知慣用の製剤方
法により製造できる。
医薬としてヒトを含む哺乳動物に用いるに当たっては、
予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能で
あり、該形態としては、例えば、注射剤、坐剤、外用剤
（例えばパップ剤、テープ剤等の貼付剤、軟膏剤、クリ
ーム剤、ローション剤等）、点眼剤、点鼻剤などのいず
れでも良く、これらは、各々当業者に公知慣用の製剤方
法により製造できる。
注射剤を調製する場合は、本発明化合物に常法により
pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等
を添加すれば、皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤とする
ことができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としては
クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウ
ム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリ
ウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられ
る。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイ
ン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウ
ム、ブドウ糖などが例示できる。
pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等
を添加すれば、皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤とする
ことができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としては
クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウ
ム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリ
ウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられ
る。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイ
ン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウ
ム、ブドウ糖などが例示できる。
坐剤は、本発明化合物に当業界において公知の製剤用
担体、例えばポリエチレングリコール、ラノリン、カカ
オ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じ
てツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた
後、常法により製造することができる。
担体、例えばポリエチレングリコール、ラノリン、カカ
オ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じ
てツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた
後、常法により製造することができる。
軟膏剤は、本発明化合物に通常使用される基剤、安定
剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法に
より混合、製剤化すればよい。基剤としては、流動パラ
フィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデ
シルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤と
しては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香
酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられ
る。
剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法に
より混合、製剤化すればよい。基剤としては、流動パラ
フィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデ
シルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤と
しては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香
酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられ
る。
貼付剤を製造する場合には、通常の支持体に前記軟
膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれ
ば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる
織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウ
レタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当であ
る。
膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれ
ば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる
織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウ
レタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当であ
る。
更に、本発明化合物はリポソーム内にカプセル化され
て投与されてもよく、有効成分が脂肪性層に粘着性の水
性同心層からなる微粒子内に分散されるか、又は別の形
態で存在して含有される薬学的組成物であってもよい。
有効化合物はその溶解性に依存して、水性層及び脂肪性
層の両方に存在してもよく、又は一般にリポソーム懸濁
液と呼ばれる形態で存在してもよい。疎水性層は、例え
ばリン脂質例えばレシチン、ステロイド例えばコレステ
ロール、幾分イオン性の界面活性剤例えばジセチルホス
フェート、ステアリルアミン、又はホスファチジン酸及
び／又は疎水性のその他の物質からなる。リポソームの
直径は一般に約15nmないし約５ミクロンの範囲内であ
る。
て投与されてもよく、有効成分が脂肪性層に粘着性の水
性同心層からなる微粒子内に分散されるか、又は別の形
態で存在して含有される薬学的組成物であってもよい。
有効化合物はその溶解性に依存して、水性層及び脂肪性
層の両方に存在してもよく、又は一般にリポソーム懸濁
液と呼ばれる形態で存在してもよい。疎水性層は、例え
ばリン脂質例えばレシチン、ステロイド例えばコレステ
ロール、幾分イオン性の界面活性剤例えばジセチルホス
フェート、ステアリルアミン、又はホスファチジン酸及
び／又は疎水性のその他の物質からなる。リポソームの
直径は一般に約15nmないし約５ミクロンの範囲内であ
る。
製剤中における本発明オリゴヌクレオチドの含量は製
剤により種々異なるが通常１〜70重量％程度とすること
が好ましい。
剤により種々異なるが通常１〜70重量％程度とすること
が好ましい。
本発明製剤の投与方法は特に制限されず、各種製剤形
態、患者の年齢、性別その他の条件、症状の程度等によ
り適宜決定すればよい。例えば、注射剤は単独で又はブ
ドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与
され、更に必要に応じ単独で動脈内、筋肉内、皮内、皮
下もしくは腹腔内投与される。坐剤は直腸内に、また軟
膏剤は皮膚、口腔内粘膜等に塗布される。
態、患者の年齢、性別その他の条件、症状の程度等によ
り適宜決定すればよい。例えば、注射剤は単独で又はブ
ドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与
され、更に必要に応じ単独で動脈内、筋肉内、皮内、皮
下もしくは腹腔内投与される。坐剤は直腸内に、また軟
膏剤は皮膚、口腔内粘膜等に塗布される。
本発明化合物の投与量は、用法、患者の年齢、性別そ
の他の条件、症状の程度等により適宜選択できる。通常
の投与量は、本発明化合物を0.01〜1000mg/kg/日程度、
好ましくは0.01〜10mg/kg/日程度である。これら本発明
製剤は１日に１回又は２〜４程度に分けて投与すること
ができる。
の他の条件、症状の程度等により適宜選択できる。通常
の投与量は、本発明化合物を0.01〜1000mg/kg/日程度、
好ましくは0.01〜10mg/kg/日程度である。これら本発明
製剤は１日に１回又は２〜４程度に分けて投与すること
ができる。
図面の簡単な説明
第１図は配列番号１で示されるオリゴヌクレオチドの
赤外吸収スペクトルを示す。第２図はダンベル型二本鎖
オリゴヌクレオチド製造の一本鎖DNA特異的切断酵素を
用いた確認結果を示す。第３図は、本発明化合物（ダン
ベル型、配列番号１）によるE2Fで制御される遺伝子蛋
白をウェスタンブロット法で解析した結果を示す。第４
図は本発明化合物によるmRNA量変化をRT−PCR法で解析
した結果を示す。第５図は本発明化合物へのE2F蛋白の
結合をゲルシフトアッセイで解析した結果を示す。
赤外吸収スペクトルを示す。第２図はダンベル型二本鎖
オリゴヌクレオチド製造の一本鎖DNA特異的切断酵素を
用いた確認結果を示す。第３図は、本発明化合物（ダン
ベル型、配列番号１）によるE2Fで制御される遺伝子蛋
白をウェスタンブロット法で解析した結果を示す。第４
図は本発明化合物によるmRNA量変化をRT−PCR法で解析
した結果を示す。第５図は本発明化合物へのE2F蛋白の
結合をゲルシフトアッセイで解析した結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例、試験例及び製剤例を挙げて本発明をさ
らに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
らに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。
実施例１ 二本鎖オリゴヌクレオチドの設計及び製造
β−シアノエチル合成法を用いた市販の自動DNA合成
装置（アプライド−バイオシステム社製）によって、配
列番号１〜３で示されるオリゴヌクレオチドおよびその
各々の相補鎖を合成し、各対になるオリゴヌクレオチド
を混合後、通常のアニーリング法により二本鎖化（直鎖
状）した。また配列番号３の１番目の塩基対のＧとＣと
をTTTTTを介して結合させ、かつ該28番目の塩基対のＣ
とＧとをTTTTTを介して結合させたダンベル型オリゴヌ
クレオチド（以下、単に「ダンベル型」と称す）は、該
20番目のＣを５′−末端として38マー（mer）の一本鎖D
NAを合成し、アニーリング反応により分子内で配列番号
３と同じ二本鎖部分を形成させた後、T4リガーゼで閉環
させて作製した。
装置（アプライド−バイオシステム社製）によって、配
列番号１〜３で示されるオリゴヌクレオチドおよびその
各々の相補鎖を合成し、各対になるオリゴヌクレオチド
を混合後、通常のアニーリング法により二本鎖化（直鎖
状）した。また配列番号３の１番目の塩基対のＧとＣと
をTTTTTを介して結合させ、かつ該28番目の塩基対のＣ
とＧとをTTTTTを介して結合させたダンベル型オリゴヌ
クレオチド（以下、単に「ダンベル型」と称す）は、該
20番目のＣを５′−末端として38マー（mer）の一本鎖D
NAを合成し、アニーリング反応により分子内で配列番号
３と同じ二本鎖部分を形成させた後、T4リガーゼで閉環
させて作製した。
配列番号１の赤外吸収スペクトル（KBr法）のチャー
トを第１図に示す。
トを第１図に示す。
又、製造したダンベル型が適切な構造を取っているこ
とを一本鎖DNA特異的切断酵素を用いた消化試験により
確認した結果を第２図に示す。すなわち、32Pで標識し
たダンベル型を一本鎖DNA特異的切断酵素、マングビー
ンヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）で消化した
後、20％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲ
ルを乾燥し放射能分布をBAS−2000バイオ・イメージン
グアナライザー（フジフィルム社製）で解析した。その
結果、検出された各バンドの移動度から判断すると、閉
環反応を行った分子はマングビーンヌクレアーゼ消化に
より一本鎖のTTTTT部分が消化され、配列番号３と同じ
長さの28マーの二本鎖オリゴヌクレオチドが生じ、ダン
ベル型構造を形成していることが確認された。
とを一本鎖DNA特異的切断酵素を用いた消化試験により
確認した結果を第２図に示す。すなわち、32Pで標識し
たダンベル型を一本鎖DNA特異的切断酵素、マングビー
ンヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）で消化した
後、20％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後、ゲ
ルを乾燥し放射能分布をBAS−2000バイオ・イメージン
グアナライザー（フジフィルム社製）で解析した。その
結果、検出された各バンドの移動度から判断すると、閉
環反応を行った分子はマングビーンヌクレアーゼ消化に
より一本鎖のTTTTT部分が消化され、配列番号３と同じ
長さの28マーの二本鎖オリゴヌクレオチドが生じ、ダン
ベル型構造を形成していることが確認された。
試験例１
実施例１で得た二本鎖オリゴヌクレオチドおよび同様
に合成した表１に記載のオリゴヌクレオチドあるいはア
ドリアマイシンの殺細胞活性を培養系でヒト子宮体癌He
La細胞を用い検討した。すなわち、10％牛胎児血清を添
加したMEM培地に懸濁したHeLa細胞を96穴シャーレに５
×102個/100μl/ウェル（well）まき、２日間培養後、
予め室温で１時間反応しておいた４μＭリポフェクチン
と各種オリゴヌクレオチドを含むMEM培地を100μｌ添加
した。更に、３日間培養後クリスタルバイオレット染色
法により細胞数を定量し、IC50を求めた。その結果を表
１に示す。
に合成した表１に記載のオリゴヌクレオチドあるいはア
ドリアマイシンの殺細胞活性を培養系でヒト子宮体癌He
La細胞を用い検討した。すなわち、10％牛胎児血清を添
加したMEM培地に懸濁したHeLa細胞を96穴シャーレに５
×102個/100μl/ウェル（well）まき、２日間培養後、
予め室温で１時間反応しておいた４μＭリポフェクチン
と各種オリゴヌクレオチドを含むMEM培地を100μｌ添加
した。更に、３日間培養後クリスタルバイオレット染色
法により細胞数を定量し、IC50を求めた。その結果を表
１に示す。
上記表１の結果から配列番号１〜３およびダンベル型
の本発明化合物は、配列番号４〜８の比較化合物に比べ
数倍〜1000倍以上の非常に強い殺細胞活性を有すること
が判る。尚、配列番号４は、配列番号１の塩基配列をシ
ャッフルした配列である。配列番号５はE2F−１（E2F蛋
白質群の１種）のアンチセンスおよび配列番号７はｃ−
mycのアンチセンス、配列番号６はE2F−１のナンセンス
および配列番号８はｃ−mycのナンセンスである。
の本発明化合物は、配列番号４〜８の比較化合物に比べ
数倍〜1000倍以上の非常に強い殺細胞活性を有すること
が判る。尚、配列番号４は、配列番号１の塩基配列をシ
ャッフルした配列である。配列番号５はE2F−１（E2F蛋
白質群の１種）のアンチセンスおよび配列番号７はｃ−
mycのアンチセンス、配列番号６はE2F−１のナンセンス
および配列番号８はｃ−mycのナンセンスである。
試験例２
試験例１で示した本発明化合物の殺細胞活性がE2Fの
機能阻害に起因していることを証明するために、ウエス
タンブロット法によりE2F−１、及びE2F−１による制御
が想定されている増殖関連遺伝子ｃ−myc、ｃ−myb、サ
イクリン（cyclin）D1、E2F−１自身の発現量の変動を
検討した。すなわち、24穴プレートにてHeLa細胞を２日
間培養後、試験例１で示した方法でオリゴヌクレオチド
処理を16時間行った。その後、細胞を可溶化剤（50mMト
リスバッファーpH7.5/0.05％SDS）で処理し細胞粗抽出
液を得た。各サンプルの蛋白量を定量後、一定量の蛋白
抽出液をSDS−PAGEにより電気泳動した。泳動後蛋白質
をニトロセルロース膜に転写し、表２に示す各種モノク
ローナル抗体により各サンプル中のそれぞれの蛋白発現
量を定量した。コントロール実験として、細胞の増殖状
況による変動の少ないGAPDH（グルタルアルデヒドリン
酸デヒドロゲナーゼ）のウエスタンブロットを同様の方
法で行った。表２に本発明化合物および比較化合物によ
るE2F−１及びE2F関連蛋白の発現に対する作用を示す。
機能阻害に起因していることを証明するために、ウエス
タンブロット法によりE2F−１、及びE2F−１による制御
が想定されている増殖関連遺伝子ｃ−myc、ｃ−myb、サ
イクリン（cyclin）D1、E2F−１自身の発現量の変動を
検討した。すなわち、24穴プレートにてHeLa細胞を２日
間培養後、試験例１で示した方法でオリゴヌクレオチド
処理を16時間行った。その後、細胞を可溶化剤（50mMト
リスバッファーpH7.5/0.05％SDS）で処理し細胞粗抽出
液を得た。各サンプルの蛋白量を定量後、一定量の蛋白
抽出液をSDS−PAGEにより電気泳動した。泳動後蛋白質
をニトロセルロース膜に転写し、表２に示す各種モノク
ローナル抗体により各サンプル中のそれぞれの蛋白発現
量を定量した。コントロール実験として、細胞の増殖状
況による変動の少ないGAPDH（グルタルアルデヒドリン
酸デヒドロゲナーゼ）のウエスタンブロットを同様の方
法で行った。表２に本発明化合物および比較化合物によ
るE2F−１及びE2F関連蛋白の発現に対する作用を示す。
その結果、0.01μＭの配列番号１の本発明化合物処理
により、E2F−１により発現の制御されているｃ−myc、
ｃ−mybの発現が特異的に抑制されていた。この時、E2F
−１蛋白質及びGAPDHの発現量には変化が認められなか
った。更に配列番号１の配列を並び変えてE2F結合配列
をなくした配列番号４の二本鎖オリゴヌクレオチドにお
いては、今回測定した全ての遺伝子産物、即ち蛋白質の
発現に全く変化は認められなかった。さらに、オリゴヌ
クレオチド処理48時間後で検討した第３図に示す結果か
ら、安定性が改善されたダンベル型は配列番号１では作
用が認められないサイクリンD1、E2F−１の蛋白を特異
的に減少させた。この時GAPDHの蛋白発現量には全く変
化は認められなかった。
により、E2F−１により発現の制御されているｃ−myc、
ｃ−mybの発現が特異的に抑制されていた。この時、E2F
−１蛋白質及びGAPDHの発現量には変化が認められなか
った。更に配列番号１の配列を並び変えてE2F結合配列
をなくした配列番号４の二本鎖オリゴヌクレオチドにお
いては、今回測定した全ての遺伝子産物、即ち蛋白質の
発現に全く変化は認められなかった。さらに、オリゴヌ
クレオチド処理48時間後で検討した第３図に示す結果か
ら、安定性が改善されたダンベル型は配列番号１では作
用が認められないサイクリンD1、E2F−１の蛋白を特異
的に減少させた。この時GAPDHの蛋白発現量には全く変
化は認められなかった。
また、同時に行った、E2F−１に対するアンチセンス
オリゴヌクレオチド（配列番号５）を用いた検討の結
果、この場合においては本発明化合物と異なりE2F−１
の転写を抑制することにより、E2F−１により制御され
ている遺伝子群の発現抑制を引き起こすことが明らかに
なった。しかし、配列番号５の化合物を用いて本発明化
合物と同程度の抑制効果を示すためには、本発明化合物
の50倍の濃度が必要であった。
オリゴヌクレオチド（配列番号５）を用いた検討の結
果、この場合においては本発明化合物と異なりE2F−１
の転写を抑制することにより、E2F−１により制御され
ている遺伝子群の発現抑制を引き起こすことが明らかに
なった。しかし、配列番号５の化合物を用いて本発明化
合物と同程度の抑制効果を示すためには、本発明化合物
の50倍の濃度が必要であった。
試験例３
更に試験例２で示されたE2Fで制御される蛋白の減少
が、mRNA合成の低下を介する遺伝子発現の抑制に由来す
ることを証明するために配列番号１とダンベル型の本発
明化合物処理によるmRNA量の変動を検討した。すなわ
ち、実験例２で示したごとく、HeLa細胞を配列番号１と
ダンベル型の本発明化合物と４μＭリポフェクチンで48
時間処理し、細胞内の各種mRNAの発現量をRT−PCR〔リ
バース トランスクリプション−ポリメラーゼ チェイ
ン リアクション（Reverse Transcription−Polymera
se Chain Reaction）〕法で解析した。即ち、細胞のR
NAをRNeasy RNA精製キット〔キアゲン（Qiagen）社〕
により精製し、ファーストストランドシンセシスキット
〔ライフサイエンス（Life Science）社〕を用い、RNA
を鋳型にポリ（poly）（dT）12-18をプライマーとしてA
MV逆転写酵素でcDNAを調製した。その後、E2Fで制御さ
れる遺伝子の各mRNAをPCR増幅するために、対応するプ
ライマーセットを用いてPCR法により対応するcDNA断片
を増幅した。この際、内部標準として細胞増殖状況によ
る変動の少ないGAPDHmRNAを同時増殖した。それぞれの
増幅回数は直線的増幅が得られる範囲で設定した。PCR
増幅したサンプルは２％アガロース電気泳動後、ゲル内
のDNAをエチジウムブロミドで染色した後、ゲルにUVを
照射しDNAを可視化した。これにより、DNAバンドの蛍光
強度としてDNA量を判断可能になる。（ワング,H.ら、ア
ナリティカル バイオケミストリー（Wang,H.,et al.,
Anal.Biochemistry 223,251−258,1994） 第４図にアガロース電気泳動の結果を示す（ただし、
DNA量は上記によった）。同時増幅したGAPDHのmRNAはオ
リゴヌクレオチド処理により変化しないが、ダンベル型
では、E2Fで発現の制御されているサイクリンD1、およ
びE2F−１自身のmRNAレベルが低下した。加えて、ダン
ベル型ではその他のE2Fで制御される遺伝子であるDHF
R、DNAポリメラーゼα（DNA polα）についてもmRNAレ
ベルが低下した。
が、mRNA合成の低下を介する遺伝子発現の抑制に由来す
ることを証明するために配列番号１とダンベル型の本発
明化合物処理によるmRNA量の変動を検討した。すなわ
ち、実験例２で示したごとく、HeLa細胞を配列番号１と
ダンベル型の本発明化合物と４μＭリポフェクチンで48
時間処理し、細胞内の各種mRNAの発現量をRT−PCR〔リ
バース トランスクリプション−ポリメラーゼ チェイ
ン リアクション（Reverse Transcription−Polymera
se Chain Reaction）〕法で解析した。即ち、細胞のR
NAをRNeasy RNA精製キット〔キアゲン（Qiagen）社〕
により精製し、ファーストストランドシンセシスキット
〔ライフサイエンス（Life Science）社〕を用い、RNA
を鋳型にポリ（poly）（dT）12-18をプライマーとしてA
MV逆転写酵素でcDNAを調製した。その後、E2Fで制御さ
れる遺伝子の各mRNAをPCR増幅するために、対応するプ
ライマーセットを用いてPCR法により対応するcDNA断片
を増幅した。この際、内部標準として細胞増殖状況によ
る変動の少ないGAPDHmRNAを同時増殖した。それぞれの
増幅回数は直線的増幅が得られる範囲で設定した。PCR
増幅したサンプルは２％アガロース電気泳動後、ゲル内
のDNAをエチジウムブロミドで染色した後、ゲルにUVを
照射しDNAを可視化した。これにより、DNAバンドの蛍光
強度としてDNA量を判断可能になる。（ワング,H.ら、ア
ナリティカル バイオケミストリー（Wang,H.,et al.,
Anal.Biochemistry 223,251−258,1994） 第４図にアガロース電気泳動の結果を示す（ただし、
DNA量は上記によった）。同時増幅したGAPDHのmRNAはオ
リゴヌクレオチド処理により変化しないが、ダンベル型
では、E2Fで発現の制御されているサイクリンD1、およ
びE2F−１自身のmRNAレベルが低下した。加えて、ダン
ベル型ではその他のE2Fで制御される遺伝子であるDHF
R、DNAポリメラーゼα（DNA polα）についてもmRNAレ
ベルが低下した。
試験例４
かかるmRNAの発現量の低下を介した遺伝子発現の抑制
が、E2F蛋白の転写領域への結合を二本鎖オリゴヌクレ
オチドが配列特異的に競合阻害することに由来する事を
証明するために、二本鎖オリゴヌクレオチドへのE2F蛋
白の結合性について第５図に示すゲルシフトアッセイに
て検討した。すなわち、［γ−32P］ATPとT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて配列番号１、３、およびダンベ
ル型を32Pで標識した。これに〔ディグナムら、ヌクレ
イック アシッヅ リサーチ（Dignam,J.D.et al.,Nuc
l.Acids Res.,）11,1475−1489,1983〕の方法で調製し
た細胞抽出液と混和後、４℃で20分間反応させ、４％ア
クリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後、ゲルを乾燥
した後、放射能分布をBAS−2000バイオ・イメージング
アナライザー（フジフィルム社製）で解析した。
が、E2F蛋白の転写領域への結合を二本鎖オリゴヌクレ
オチドが配列特異的に競合阻害することに由来する事を
証明するために、二本鎖オリゴヌクレオチドへのE2F蛋
白の結合性について第５図に示すゲルシフトアッセイに
て検討した。すなわち、［γ−32P］ATPとT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて配列番号１、３、およびダンベ
ル型を32Pで標識した。これに〔ディグナムら、ヌクレ
イック アシッヅ リサーチ（Dignam,J.D.et al.,Nuc
l.Acids Res.,）11,1475−1489,1983〕の方法で調製し
た細胞抽出液と混和後、４℃で20分間反応させ、４％ア
クリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後、ゲルを乾燥
した後、放射能分布をBAS−2000バイオ・イメージング
アナライザー（フジフィルム社製）で解析した。
その結果、二本鎖オリゴヌクレオチドは蛋白の結合に
より二本鎖オリゴヌクレオチド単独とは異なる遅く移動
するバンドが出現した（コントロール）。この蛋白−DN
Aの結合体は32Pで標識していない同じ配列の二本鎖オリ
ゴヌクレオチド（非標識配列番号１または３）を32P標
識体の100倍量加えることで消失し、E2F蛋白の結合配列
をシャッフルした二本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号
４）を100倍量加えても消失しないことから、E2F蛋白の
結合配列に特異的に結合する蛋白すなわちE2F蛋白と二
本鎖オリゴヌクレオチドとの複合体と結論できる。
より二本鎖オリゴヌクレオチド単独とは異なる遅く移動
するバンドが出現した（コントロール）。この蛋白−DN
Aの結合体は32Pで標識していない同じ配列の二本鎖オリ
ゴヌクレオチド（非標識配列番号１または３）を32P標
識体の100倍量加えることで消失し、E2F蛋白の結合配列
をシャッフルした二本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号
４）を100倍量加えても消失しないことから、E2F蛋白の
結合配列に特異的に結合する蛋白すなわちE2F蛋白と二
本鎖オリゴヌクレオチドとの複合体と結論できる。
以上のような結果から、本発明化合物はE2F蛋白の転
写領域への結合を配列特異的に低濃度で競合阻害するこ
とで、E2Fにより制御されている増殖関連遺伝子の発現
抑制を引き起こし、結果的にアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを上回る強力な癌細胞増殖抑制効果を示すものと
考えられる。
写領域への結合を配列特異的に低濃度で競合阻害するこ
とで、E2Fにより制御されている増殖関連遺伝子の発現
抑制を引き起こし、結果的にアンチセンスオリゴヌクレ
オチドを上回る強力な癌細胞増殖抑制効果を示すものと
考えられる。
製剤例１ 注射剤
本発明化合物 5mg
注射用蒸留水 適量
１アンプル中 5ml
上記配合割合で、常法に従い注射剤を調製した。
製剤例２ 坐剤
本発明化合物 20mg
ウイテップゾールＷ−35
（登録商標、ダイナマイトノーベル社製） 1380mg
１個当たり 1400mg
上記配合割合で、常法に従い坐剤を調製した。
産業上の利用可能性
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドまたはその誘導体
は、E2F蛋白の転写領域への結合を配列特異的に低濃度
で競合阻害することで、E2Fにより制御されている増殖
関連遺伝子の発現を抑制するため、腫瘍増殖を抑制し、
副作用の低い癌の予防・治療剤とすることができる。
は、E2F蛋白の転写領域への結合を配列特異的に低濃度
で競合阻害することで、E2Fにより制御されている増殖
関連遺伝子の発現を抑制するため、腫瘍増殖を抑制し、
副作用の低い癌の予防・治療剤とすることができる。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：両形態
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス:No
配列番号:2
配列の長さ:30
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：両形態
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス:No
配列番号:3
配列の長さ:28
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：両形態
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス:No
配列番号:4
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列番号:5
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス:Yes
配列番号:6
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
配列番号:7
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
アンチセンス:Yes
配列番号:8
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成オリゴヌクレオチド
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 山田 雄次
埼玉県所沢市東狭山ケ丘２−2953−21
(56)参考文献 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．14，Ｎｏ．13
（1986），ｐ．5389−5398
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 31/70
C12N 15/00 - 15/09
C07H 21/04
C12Q 1/68
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】５′−TTTSSCGS−３′（ＳはＧ又はＣを示
す。）で表される塩基配列を少なくとも一方の鎖上に少
なくとも１個有する15〜40塩基対からなることを特徴と
する二本鎖オリゴヌクレオチド又はそのホスホジエステ
ル結合がメチルホスホエート結合又はホスホロチオエー
ト結合に変換されたもの、５′又は３′末端に脂溶性化
合物を結合したもの、及びダンベル型二本鎖オリゴヌク
レオチドから選択される誘導体の少なくとも１種を有効
成分とする医薬組成物。 - 【請求項２】塩基対が15〜32である請求の範囲第１項に
記載の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体の少な
くとも１種を有効成分とする医薬組成物。 - 【請求項３】５′−TTTSSCGS−３′で表される塩基配列
を一方の鎖上に１〜５個有する塩基対からなることを特
徴とする請求の範囲第１項に記載の二本鎖オリゴヌクレ
オチド又はその誘導体の少なくとも１種を有効成分とす
る医薬組成物。 - 【請求項４】５′−（TTTSSCGS）ｎ−３′（ＳはＧ又は
Ｃを示す。ｎは２〜５を示す。）で表される塩基配列を
一方の鎖上に有する塩基対からなることを特徴とする二
本鎖オリゴヌクレオチド又はそのホスホジエステル結合
がメチルホスホエート結合又はホスホロチオエート結合
に変換されたもの、５′又は３′末端に脂溶性化合物を
結合したもの、及びダンベル型二本鎖オリゴヌクレオチ
ドから選択される誘導体。 - 【請求項５】ｎが２〜４である請求の範囲第４項に記載
の二本鎖オリゴヌクレオチド又はその誘導体。 - 【請求項６】配列番号１記載の塩基配列であることを特
徴とする請求の範囲第４項に記載の二本鎖オリゴヌクレ
オチド又はその誘導体。 - 【請求項７】５′−TTTSSCGSSAAA−３′（ＳはＧ又はＣ
を示す。）で表される塩基配列を一方の鎖上に有する塩
基対からなることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレオチ
ド又はそのホスホジエステル結合がメチルホスホエート
結合又はホスホロチオエート結合に変換されたもの、
５′又は３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、及び
ダンベル型二本鎖オリゴヌクレオチドから選択される誘
導体。 - 【請求項８】配列番号２記載の塩基配列であることを特
徴とする請求の範囲第７項に記載の二本鎖オリゴヌクレ
オチド又はその誘導体。 - 【請求項９】５′−SCGSSAAATTTSSCGS−３′（ＳはＧ又
はＣを示す。）で表される塩基配列を一方の鎖上に有す
る塩基対からなることを特徴とする二本鎖オリゴヌクレ
オチド又はそのホスホジエステル結合がメチルホスホエ
ート結合又はホスホロチオエート結合に変換されたも
の、５′又は３′末端に脂溶性化合物を結合したもの、
及びダンベル型二本鎖オリゴヌクレオチドから選択され
る誘導体。 - 【請求項１０】配列番号３記載の塩基配列であることを
特徴とする請求の範囲第９項に記載の二本鎖オリゴヌク
レオチド又はその誘導体。 - 【請求項１１】配列番号３の１番目の塩基対のＧとＣと
をTTTTTを介して結合させ、かつ該28番目の塩基対のＣ
とＧとをTTTTTを介して結合させたダンベル状であるこ
とを特徴とする請求の範囲第10項に記載の二本鎖オリゴ
ヌクレオチド又はその誘導体。 - 【請求項１２】請求の範囲第４項〜第11項に記載のオリ
ゴヌクレオチド又はその誘導体の少なくとも１種を有効
成分とする医薬組成物。 - 【請求項１３】癌の予防・治療剤であることを特徴とす
る請求の範囲第１〜３項及び第12項の何れかに記載の医
薬組成物。
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|---|---|---|---|
| JP6-283065 | 1994-11-17 | ||
| JP28306594 | 1994-11-17 | ||
| PCT/JP1995/002348 WO1996016074A1 (fr) | 1994-11-17 | 1995-11-16 | Oligonucleotide bicatenaire et agent carcinostatique le contenant en tant que constituant actif |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3392143B2 true JP3392143B2 (ja) | 2003-03-31 |
Family
ID=17660755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51672996A Expired - Fee Related JP3392143B2 (ja) | 1994-11-17 | 1995-11-16 | 二本鎖オリゴヌクレオチド及びこれを有効成分とする制癌剤 |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3392143B2 (ja) |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US7482158B2 (en) * | 2004-07-01 | 2009-01-27 | Mathison Brian H | Composite polynucleic acid therapeutics |
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| SI2158316T1 (sl) | 2007-05-11 | 2015-08-31 | Adynxx Inc. | Genska ekspresija in bolečina |
| ES2724851T3 (es) * | 2012-05-10 | 2019-09-16 | Adynxx Inc | Formulaciones para el suministro de principios activos |
| EP3626822A1 (en) | 2014-08-15 | 2020-03-25 | Adynxx, Inc. | Oligonucleotide decoys for the treatment of pain |
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|---|---|---|---|---|
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| NZ246432A (en) * | 1991-12-16 | 1996-06-25 | Genentech Inc | Fibrin-specific t-pa with a point mutation at position 276, vector cell cultures |
| US5759803A (en) * | 1992-05-13 | 1998-06-02 | Dana-Farber Cancer Institute | Recombinant retinoblastoma-associated protein 1 (E2F-1) polypeptides and cDNA |
| US5585479A (en) * | 1992-07-24 | 1996-12-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA |
| US5859226A (en) * | 1993-07-29 | 1999-01-12 | Regents Of The University Of California, The | Polynucleotide decoys that inhibit MHC-II expression and uses thereof |
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| ES2307293T3 (es) * | 1993-10-29 | 2008-11-16 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Utilizacion terapeutica de señuelos de elementos en cis in vivo. |
| WO1995024223A1 (en) * | 1994-03-08 | 1995-09-14 | Thomas Jefferson University | Inhibition of cell proliferation by e2f-1 antisense oligonucleotides |
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| US5496831A (en) * | 1994-05-13 | 1996-03-05 | The General Hospital Corporation | Inhibition of insulin-induced adiposis |
-
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- 1995-11-16 WO PCT/JP1995/002348 patent/WO1996016074A1/ja active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．１３（１９８６），ｐ．５３８９−５３９８ |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006132204A1 (ja) | 2005-06-06 | 2006-12-14 | Anges Mg, Inc. | 転写因子デコイ |
| WO2007072909A1 (ja) | 2005-12-22 | 2007-06-28 | Anges Mg, Inc. | 新規オリゴヌクレオチド及びそれから成るNF-κBデコイ |
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