WO2013088853A1 - オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクター - Google Patents

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あかね 田中
浩珍 松田
彬 松田
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国立大学法人東京農工大学
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Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide, a glucocorticoid sensitivity enhancer, a pharmaceutical composition, and an expression vector.
  • Glucocorticoids are a type of hormone made in the adrenal cortex and are involved in metabolism and immunity. Since glucocorticoid has a strong anti-inflammatory action and an immunosuppressive action, its artificial composition has been used as a therapeutic agent for allergic diseases and autoimmune diseases. In addition, since glucocorticoid has a growth-inhibiting action on cancerous lymphocytes, an artificial compound thereof has been used for chemotherapy of lymphoma and lymphocytic leukemia. Since side effects such as myelosuppression and severe gastrointestinal symptoms rarely occur with glucocorticoid administration, glucocorticoid is an indispensable therapeutic agent for lymphoma and lymphocytic leukemia.
  • glucocorticoid resistance has been reported to be as high as 5-10% of patients with asthma, approximately 30% of patients with rheumatism, 20-50% of patients with inflammatory bowel disease, and 10-25% of children with acute lymphoblastic leukemia. Therefore, the development of a technology for releasing glucocorticoid resistance is awaited.
  • Glucocorticoid receptor Glucocorticoid receptor
  • GR glucocorticoid receptor
  • N3C1 Gene ID: 2908, NCBI Reference Sequence: NC_000005.9
  • GR ⁇ and GR ⁇ are created by alternative splicing within exon 9 (base number 4111).
  • GR ⁇ is a 777 amino acid residue protein translated from mature mRNA linked to exons 1-9.
  • GR ⁇ translocates into the nucleus in a ligand-dependent manner and functions as a transcription factor.
  • GR ⁇ is a protein of 742 amino acid residues that is translated from a mature mRNA in which exons 1 to 8 and a part of exon 9 are linked (2631 to 4111 from the 5 ′ end of exon 9).
  • GR ⁇ lacks a part of the ligand binding domain and has no ligand binding ability.
  • GR ⁇ competitively antagonizes GR ⁇ bound to the ligand and inhibits the transcription factor activity of GR ⁇ .
  • glucocorticoid resistance of cells the following reports have been made.
  • CL-1 cells, GL-1 cells glucocorticoid resistance is released by inhibiting the function of Nuclear factor- ⁇ B (NF- ⁇ B).
  • NF- ⁇ B Nuclear factor- ⁇ B
  • cell proliferation is suppressed (for example, see Document 1). From this, it was considered that inhibition of the function of NF- ⁇ B increases the expression level of GR in the cell, and the cell growth inhibitory action of glucocorticoid is likely to reach the cell.
  • glucocorticoid resistance is released, and GR ⁇ expression It has been reported that the amount increases (for example, see Document 2). From this, it was suggested that the glucocorticoid resistance may be released by increasing the expression level of GR ⁇ in the cell.
  • the SR protein is a splicing factor, and is a protein that controls splicing from pre-mRNA to mature mRNA in the nucleus of the cell.
  • SRp30c serine / arginine-rich protein 30c
  • SRp30c is one type of SR protein. That is, it is considered that the exon 9 of the pre-mRNA of GR has a site to which SRp30c binds, and SRp30c binds to this site and splices the pre-mRNA of GR into the mature mRNA of GR ⁇ .
  • SRp30c binds to this site and splices the pre-mRNA of GR into the mature mRNA of GR ⁇ .
  • Reference 1 Matsuda A, et al. Res. Vet. Sci., 2010, 89 (3): 378-382.
  • Reference 2 Matsuda A, et al. The 14th International Congress of Immunology, Aug. 2010, Volume 22, Supplement number 1, p. V8.
  • Reference 3 Piotrowska H, et al. Arch. Med. Res., 2009, 40: 156-162.
  • Reference 4 Watanuki T, et al. J. Affect. Disord., 2008, 110 (1-2): 62-69.
  • Reference 5 Xu Q, et al. J. Biol. Chem., 2003, 278: 27112-27118.
  • Reference 6 Paradis C, et al. RNA, 2007, 13: 1287-1300.
  • Reference 7 Karakama Y, et al. Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54 (8): 3179-318.
  • Reference 8 Pamphlet of International Publication No. 2005/063293
  • SRp30c is known to be involved in gonadotropin receptor splicing in addition to GR, and even when the activity of SRp30c alone is suppressed, the possibility of disturbing homeostasis cannot be denied.
  • a technique for selectively inhibiting the control of the GR splicing variant carried by SRp30c is required.
  • the present invention has been made under the above circumstances. Under the above circumstances, there is a need for novel compounds having an activity to increase the sensitivity of cells to glucocorticoids.
  • oligonucleotide that prevents binding between the pre-mRNA of the glucocorticoid receptor gene and serine / arginine-rich protein 30c (SRp30c) in vivo.
  • SRp30c serine / arginine-rich protein 30c
  • oligonucleotide according to ⁇ 1> which is a base sequence having a length of 15 to 50 bases complementary to a continuous part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • SEQ ID NO: 22 a base sequence having a total molar ratio of adenine and guanine of 50% or more.
  • ⁇ 4> an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the oligonucleotide according to ⁇ 1> which is any one of the oligonucleotides having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • a glucocorticoid sensitivity enhancer comprising at least one of the oligonucleotides according to ⁇ 1> to ⁇ 4> as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising at least one of the oligonucleotides according to ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • An expression vector comprising at least one of the oligonucleotides according to ⁇ 1> to ⁇ 4>.
  • an oligonucleotide having an activity to increase glucocorticoid sensitivity of cells.
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer which contains the said oligonucleotide as an active ingredient is provided.
  • the pharmaceutical composition containing the said oligonucleotide is provided.
  • an expression vector for expressing the oligonucleotide is provided.
  • 4 is a graph showing the cell growth inhibition rate in Example 2.
  • 4 is a graph showing the cell growth inhibition rate in Example 2.
  • 4 is a graph showing the cell growth inhibition rate in Example 2.
  • 4 is a graph showing the cell growth inhibition rate in Example 2.
  • 4 is a graph showing the cell growth inhibition rate in Example 2.
  • 10 is a graph showing the cell growth inhibition rate in Example 4.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the oligonucleotide of the present invention is an oligonucleotide that prevents binding of a pre-mRNA of a glucocorticoid receptor gene (GR gene) and a serine / arginine-rich protein 30c (SRp30c) in vivo. is there. Since the oligonucleotide inhibits the pre-mRNA of glucocorticoid receptor (GR) from being spliced into mature mRNA of GR ⁇ , it is considered that the relative expression level of GR ⁇ to GR ⁇ is increased. As a result, the glucocorticoid sensitivity of the cells is considered to increase.
  • GR gene glucocorticoid receptor gene
  • SRp30c serine / arginine-rich protein 30c
  • SR protein As a candidate site (splice element) that is present in exon 9 of GR pre-mRNA and to which SRp30c binds, it is a continuous part of exon 9 of GR pre-mRNA, and is the sum of adenine (A) and guanine (G) Base sequences having a molar ratio of 50% or more.
  • SR protein is considered to easily bind to a base sequence rich in A and / or G
  • SRp30c which is one type of SR protein, is also likely to bind to a base sequence rich in A and / or G. . Therefore, a base sequence that is a continuous part of exon 9 of the pre-mRNA of GR and whose total molar ratio of adenine and guanine is 50% or more is highly likely to be the splice element.
  • the total molar ratio of adenine and guanine is 50% or more (preferably 60% or more) from exon 9 of human GR gene (NR3C1, Gene ID: 2908, NCBI Reference Sequence: NC_000005.9).
  • a base sequence having a length of 15 to 50 bases may be selected, and a base sequence having a length of 15 to 50 bases complementary to this base sequence may be used as the oligonucleotide of the present invention.
  • This oligonucleotide is considered to bind to the pre-mRNA of the GR either completely or partially overlapping the splice element, or bind to the pre-mRNA of the GR at a position sufficiently close to the splice element.
  • the binding between SRp30c and the splice element is inhibited, the production of mature mRNA of GR ⁇ is inhibited, and the relative expression level of GR ⁇ to GR ⁇ is increased.
  • the glucocorticoid sensitivity of the cells is considered to increase.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 corresponds to nucleotide numbers 156091 to 157582 of the human GR gene, that is, corresponds to a part of exon 9 of human GR gene (2620th to 4111th from the 5 ′ end side of exon 9).
  • GR ⁇ is a protein translated from mature mRNA in which exons 1 to 8 of GR pre-mRNA are linked to a part of exon 9 (in human, positions 2631 to 4111 from the 5 ′ end of exon 9). Therefore, it is considered that the splice element is present in the base sequence shown in SEQ ID NO: 22 of the pre-mRNA of human GR.
  • the oligonucleotide of the present invention preferably has a base sequence length of 15 to 50 bases complementary to a continuous part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22. Furthermore, the oligonucleotide of the present invention is complementary to a nucleotide sequence that is a continuous part of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 22 and has a total molar ratio of adenine and guanine of 50% or more (more preferably 60% or more). More preferably, the base sequence is 15 to 50 bases long.
  • the oligonucleotide of the present invention is preferably any of the following oligonucleotide 1, oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5. Oligonucleotides 1 to 5 have an activity to increase glucocorticoid sensitivity of cells.
  • Oligonucleotide 1 An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 (5′-CTTTCTGGTTTAACCCACATAACATTCTA-3 ′).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 is a base sequence that is complementary to a continuous part of exon 9 of the human GR gene (2626-2656th from the 5 ′ end side of exon 9).
  • Oligonucleotide 2 An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (5′-AAAAGGGCACAGCTTCTTTTCCCATTAATGAAA-3 ′).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is a base sequence complementary to a continuous part of exon 9 of the human GR gene (2796th to 2829th from the 5 ′ end side of exon 9).
  • Oligonucleotide 3 An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (5′-TAAGATGAACTTTCTTTTCCCCCACGTATCCCT-3 ′).
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is a nucleotide sequence complementary to a continuous part of exon 9 of the human GR gene (2830 to 2860th from the 5 ′ end side of exon 9).
  • Oligonucleotide 4 An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (5′-TTTGTCCCCATTATATAGCATTT-3 ′).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 4 is a base sequence complementary to a continuous part of exon 9 of human GR gene (position 3730 to 3752 from the 5 ′ end of exon 9).
  • Oligonucleotide 5 An oligonucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (5′-CAGATTTTTTTATTATGAGT-3 ′).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 5 is a base sequence complementary to a continuous part of exon 9 of the human GR gene (4080 to 4100th from the 5 ′ end side of exon 9).
  • Oligonucleotides 1-5 are thought to bind to the pre-mRNA of GR either completely or partially overlapping with the splice element, or bind to the pre-mRNA of GR at a position sufficiently close to the splice element. Therefore, it is considered that the binding between SRp30c and the splice element is inhibited, the production of mature mRNA of GR ⁇ is inhibited, and the relative expression level of GR ⁇ to GR ⁇ is increased. As a result, the glucocorticoid sensitivity of the cells is considered to increase. Oligonucleotides 1 to 5 are considered to bind in a sequence-specific manner to a specific site of exon 9 of the GR pre-mRNA from its base sequence.
  • oligonucleotides 1 to 5 do not affect the functions of SR proteins other than SRp30c, and do not affect splicing other than exon 9 of GR among the splicing controlled by SRp30c. It is done.
  • the oligonucleotide of the present invention also includes oligonucleotides that are homologous to any of oligonucleotide 1, oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5.
  • an oligonucleotide that is recognized to be homologous with oligonucleotide 1 only needs to exhibit an action equivalent to that of oligonucleotide 1, and is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably It has a homology of 95% or more.
  • oligonucleotide having homology with any of oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5.
  • the homology is, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI or Altschul, SF et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)), which is a widely used homology search algorithm. Can be determined by sequence comparison using.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1 as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 1. Is done.
  • the length of the oligonucleotide hybridized under stringent conditions with the oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 1 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 1.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 15 to 45 bases.
  • the length of the oligonucleotide is 15 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high.
  • the length of the oligonucleotide is 45 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei.
  • the length of the oligonucleotide is more preferably 20 to 40 bases, further preferably 22 to 38 bases, particularly preferably 23 to 35 bases, and most preferably 24 to 30 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 2 as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 2. Is done.
  • the length of the oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide that is complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2 is not particularly limited as long as it exhibits an action comparable to that of oligonucleotide 2.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 15 to 50 bases.
  • the length of the oligonucleotide is 15 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high.
  • the length of the oligonucleotide is 50 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei.
  • the length of the oligonucleotide is more preferably 20 to 45 bases, further preferably 25 to 40 bases, particularly preferably 28 to 38 bases, and most preferably 30 to 34 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 3 as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 3. Is done.
  • the length of the oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 3 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 3.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 15 to 45 bases.
  • the length of the oligonucleotide is 15 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high.
  • the length of the oligonucleotide is 45 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei.
  • the length of the oligonucleotide is more preferably 20 to 40 bases, further preferably 22 to 38 bases, particularly preferably 23 to 35 bases, and most preferably 24 to 30 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 4 as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 4. Is done.
  • the length of the oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide that is complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 4.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 12 to 35 bases.
  • the length of the oligonucleotide is 12 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high.
  • the length of the oligonucleotide is 35 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei.
  • the length of the oligonucleotide is more preferably 15 to 32 bases, further preferably 18 to 30 bases, particularly preferably 20 to 28 bases, and most preferably 22 to 25 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with an oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 5 as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 5. Is done.
  • the length of the oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with the oligonucleotide having a base sequence complementary to SEQ ID NO: 5 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of oligonucleotide 5.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 12 to 35 bases.
  • the length of the oligonucleotide is 12 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high.
  • the length of the oligonucleotide is 35 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei.
  • the length of the oligonucleotide is more preferably 15 to 30 bases, further preferably 16 to 25 bases, particularly preferably 18 to 23 bases, and most preferably 20 to 22 bases.
  • Oligonucleotide hybridization should be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can do.
  • the stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 mM to about 40 mM, preferably about 19 mM to about 20 mM, and the temperature is about 50 ° C. to about 70 ° C., preferably about 60 ° C. to about 65 ° C. Show. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is preferable.
  • the oligonucleotide of the present invention includes an oligonucleotide in which a base is deleted, substituted or added in any of oligonucleotide 1, oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5.
  • an oligonucleotide in which a base is deleted, substituted or added in the oligonucleotide 1 only needs to exhibit an action equivalent to that of the oligonucleotide 1, and the position of the base deletion, substitution or addition is not particularly limited.
  • oligonucleotide in which the base is deleted, substituted or added in any of oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5.
  • the number of deleted bases includes 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases. It is.
  • the number of substituted bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 10 bases, preferably 1 base to 5 bases, more preferably 1 base or 2 bases.
  • the number of added bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases.
  • the length of the oligonucleotide in which the base is deleted, substituted or added in the oligonucleotide 1 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of the oligonucleotide 1.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 20 to 40 bases. When the length of the oligonucleotide is 20 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high. On the other hand, when the length of the oligonucleotide is 40 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei. From the above viewpoint, the length of the oligonucleotide is more preferably 22 to 38 bases, further preferably 23 to 35 bases, and particularly preferably 24 to 30 bases.
  • the number of deleted bases is 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases. It is.
  • the number of substituted bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 10 bases, preferably 1 base to 5 bases, more preferably 1 base or 2 bases.
  • the number of added bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases.
  • the length of the oligonucleotide in which the base is deleted, substituted or added in the oligonucleotide 2 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of the oligonucleotide 2.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 20 to 45 bases. When the length of the oligonucleotide is 20 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high. On the other hand, when the length of the oligonucleotide is 45 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei. From the above viewpoint, the length of the oligonucleotide is preferably 25 to 40 bases, more preferably 28 to 38 bases, and particularly preferably 30 to 34 bases.
  • the number of deleted bases is 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases. It is.
  • the number of substituted bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 10 bases, preferably 1 base to 5 bases, more preferably 1 base or 2 bases.
  • the number of added bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases.
  • the length of the oligonucleotide in which the base is deleted, substituted or added in the oligonucleotide 3 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of the oligonucleotide 3.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 20 to 40 bases. When the length of the oligonucleotide is 20 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high. On the other hand, when the length of the oligonucleotide is 40 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei. From the above viewpoint, the length of the oligonucleotide is more preferably 22 to 38 bases, further preferably 23 to 35 bases, and particularly preferably 24 to 30 bases.
  • examples of the number of deleted bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases. It is.
  • examples of the number of substituted bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 10 bases, preferably 1 base to 5 bases, more preferably 1 base or 2 bases.
  • Examples of the number of added bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases.
  • the length of the oligonucleotide in which the base is deleted, substituted or added in the oligonucleotide 4 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of the oligonucleotide 4.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 15 to 32 bases. When the length of the oligonucleotide is 15 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high. On the other hand, when the length of the oligonucleotide is 32 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei. From the above viewpoint, the length of the oligonucleotide is preferably 18 to 30 bases, more preferably 20 to 28 bases, and particularly preferably 22 to 25 bases.
  • the number of deleted bases is 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases. It is.
  • the number of substituted bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 10 bases, preferably 1 base to 5 bases, more preferably 1 base or 2 bases.
  • the number of added bases include 1 base or 2 bases or more, for example, 1 base to 15 bases, preferably 1 base to 10 bases, more preferably 1 base to 5 bases.
  • the length of the oligonucleotide in which the base is deleted, substituted or added in the oligonucleotide 5 is not particularly limited as long as it exhibits an action equivalent to that of the oligonucleotide 5.
  • the length of the oligonucleotide is preferably 15 to 30 bases. When the length of the oligonucleotide is 15 bases or more, non-sequence-specific binding is unlikely to occur, and the stability of binding to the target mRNA is high. On the other hand, when the length of the oligonucleotide is 30 bases or less, it is easy to move into cells and nuclei. From the above viewpoint, the length of the oligonucleotide is more preferably 16 to 25 bases, further preferably 18 to 23 bases, and particularly preferably 20 to 22 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention may be phosphorothioate oligo DNA and phosphorothioate oligo RNA as well as oligo DNA and oligo RNA.
  • a phosphorothioate nucleotide is a nucleotide in which the oxygen atom of the phosphate group at the binding site between nucleotides is replaced with a sulfur atom. Since phosphorothioate nucleotides are resistant to various nucleolytic enzymes, they are preferred because they are more stable than nucleotides. From the viewpoint of stability, the oligonucleotide of the present invention is preferably an oligo DNA, more preferably a phosphorothioate oligo DNA.
  • the oligonucleotide of the present invention can be obtained by chemical synthesis according to a general method of oligonucleotide synthesis.
  • Oligonucleotide 1 can be synthesized by PCR using an appropriate primer with a site containing the 2626 to 2656th sequence from the 5 ′ end of exon 9 of human GR gene as a template.
  • Oligonucleotide 2 can be synthesized by PCR using an appropriate primer with a site containing the 2796th to 2829th sequence from the 5 ′ end of exon 9 of human GR gene as a template.
  • Oligonucleotide 3 can be synthesized by PCR using an appropriate primer with a site containing the 2830 to 2860th sequence from the 5 ′ end of exon 9 of human GR gene as a template.
  • Oligonucleotide 4 can be synthesized by PCR using appropriate primers and a site containing the 3730th to 3752th sequence from the 5 ′ end of exon 9 of the human GR gene.
  • Oligonucleotide 5 can be synthesized by PCR using an appropriate primer with a site containing 4080 to 4100th sequence from the 5 ′ end of exon 9 of human GR gene as a template.
  • the “activity for increasing the sensitivity of a cell to glucocorticoid” as used for an oligonucleotide means that when the oligonucleotide is brought into contact with a cell, the glucocorticoid of the cell is compared with the case where the oligonucleotide is not brought into contact with the cell.
  • the activity which raises the sensitivity with respect to. Whether or not an oligonucleotide has an “activity to increase glucocorticoid sensitivity of a cell” is to compare the cell growth rate when the oligonucleotide and glucocorticoid are brought into contact with the cell and when not in contact with the cell. It can be confirmed with. For example, it can be confirmed by introducing the oligonucleotide into a cell derived from lymphoma or lymphocytic leukemia and adding glucocorticoid to the cell culture medium to reduce the cell growth rate.
  • the oligonucleotide of the present invention can be introduced into a cell by culturing the cell in a medium containing the oligonucleotide. At this time, the efficiency of introduction into cells can be increased by using a mixture of oligonucleotide and lipofectamine. In addition, the efficiency of introduction into cells can be increased by electroporation.
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer of the present invention contains at least one of the oligonucleotides of the present invention as an active ingredient in a pharmaceutically acceptable medium.
  • the relative expression level of GR ⁇ to GR ⁇ in cells can be increased.
  • the said glucocorticoid sensitivity enhancer can be used as a chemical
  • medium and formulation additive used in the preparation of the glucocorticoid sensitivity enhancer.
  • the medium include a solid medium (for example, gelatin and lactose) and a liquid medium (for example, water, physiological saline, and aqueous glucose solution).
  • the additive for preparation include surfactants (for example, sugars, polyhydric alcohols, polyhydric alcohol esters), buffers (for example, sodium citrate, sodium phosphate) and the like.
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer is preferably one in which an appropriate amount of at least one of the oligonucleotides of the present invention is contained in a liquid medium suitable for intravenous administration.
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer is administered by intravenous injection or instillation into the application subject.
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer is also preferably freeze-dried from the viewpoint of storage stability. In this case, it may be used by dissolving in a liquid medium at the time of use.
  • the said glucocorticoid sensitivity enhancer is normally used with the glucocorticoid which is a corticosteroid.
  • the said glucocorticoid sensitivity enhancer may be administered simultaneously with glucocorticoid, and may be administered before administration of glucocorticoid or after administration of glucocorticoid.
  • the glucocorticoid used together may be a natural product or a synthetic steroid (eg, dexamethasone, betamethasone, prednisolone, etc.).
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer is an allergic disease such as asthma and atopic dermatitis, autoimmune diseases such as rheumatism and inflammatory bowel disease, and all patients who can be administered steroids such as lymphoma and lymphocytic leukemia. Can be administered.
  • the glucocorticoid sensitivity enhancer can be used not only for patients who are resistant to glucocorticoid in the above patients but also for patients who are not resistant to glucocorticoid. In this case, it is useful in that the dose of glucocorticoid can be reduced.
  • the glucocorticoid sensitivity-enhancing agent is preferably administered in an amount of 0.01 mg / kg to 100 mg / kg as an effective dose per adult, although it depends on the type and severity of the target disease. A dose of ⁇ 30 mg / kg is more preferred.
  • count of administration It may be used by single administration, may be used by repeated administration, and may be used by continuous administration.
  • the administration interval and administration period can be selected by those skilled in the art according to clinical findings, imaging findings, blood findings, comorbid diseases, past medical history, and the like.
  • glucocorticoid sensitivity enhancer is not limited to human use. You may use for domestic animals, such as a cow, a horse, and a sheep, and pets, such as a dog, a cat, and a monkey.
  • the oligonucleotide contained as an active ingredient in the glucocorticoid sensitivity enhancer is preferably at least one selected from the group consisting of oligonucleotide 1, oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5.
  • Oligonucleotides 1 to 5 are considered to bind specifically to a specific site of exon 9 in the pre-mRNA of GR and selectively inhibit the binding between SRp30c and the splice element. Therefore, a glucocorticoid sensitivity enhancer containing at least one of oligonucleotides 1 to 5 as an active ingredient has few side effects even when administered to a living body.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises at least one oligonucleotide of the present invention in a pharmaceutically acceptable medium.
  • the said pharmaceutical composition provides the pharmaceutical composition which can increase the relative expression level with respect to GR (beta) of GR (alpha) in a cell, and can enhance the glucocorticoid sensitivity of a biological body.
  • the type of the medium used for the preparation of the pharmaceutical composition and the additive for the preparation is not particularly limited.
  • Examples of the medium and the additive for preparation include the solid medium, the liquid medium, the surfactant, and the buffer agent described above for the glucocorticoid sensitivity enhancer.
  • the pharmaceutical composition can be used for treatment of various diseases such as allergic diseases, autoimmune diseases, cancer, endocrine diseases, psychiatric diseases, infectious diseases, trauma, and body damage.
  • the pharmaceutical composition is suitable for patients who can be administered steroids such as allergic diseases, autoimmune diseases, lymphomas, and lymphocytic leukemias.
  • the pharmaceutical composition can be administered to a patient by methods such as intravascular administration, bladder administration, intraperitoneal administration, and local administration. Therefore, according to the pharmaceutical composition, there are provided methods for treating various diseases and body damage (for example, allergic diseases, autoimmune diseases, cancer, endocrine diseases, mental diseases, infectious diseases, trauma, etc.). .
  • the therapeutic method involves administering the pharmaceutical composition to patients with various diseases and physical injuries (for example, allergic diseases, autoimmune diseases, cancer, endocrine diseases, psychiatric diseases, infectious diseases, trauma, etc.). including.
  • diseases and physical injuries for example, allergic diseases, autoimmune diseases, cancer, endocrine diseases, psychiatric diseases, infectious diseases, trauma, etc.
  • treatment may be any improvement of symptoms, and the term also includes suppression of severity and reduction or alleviation of symptoms.
  • the pharmaceutical composition can be used with a glucocorticoid that is a corticosteroid. When both are used together, the pharmaceutical composition may be administered simultaneously with the glucocorticoid, or may be administered before administration of the glucocorticoid or after administration of the glucocorticoid.
  • the glucocorticoid used together may be a natural product or a synthetic steroid (eg, dexamethasone, betamethasone, prednisolone, etc.).
  • the use of the pharmaceutical composition is not limited to human use. You may use for domestic animals, such as a cow, a horse, and a sheep, and pets, such as a dog, a cat, and a monkey.
  • the oligonucleotide contained in the pharmaceutical composition is preferably at least one selected from the group consisting of oligonucleotide 1, oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5.
  • Oligonucleotides 1 to 5 are considered to bind specifically to a specific site of exon 9 in the pre-mRNA of GR and selectively inhibit the binding between SRp30c and the splice element. Therefore, a pharmaceutical composition containing at least one of oligonucleotides 1 to 5 as an active ingredient has few side effects even when administered to a living body.
  • the expression vector of the present invention contains the oligonucleotide of the present invention and is used for expression of the oligonucleotide of the present invention.
  • the expression vector can be obtained by inserting a double-stranded nucleotide (preferably double-stranded DNA) containing the oligonucleotide (preferably DNA) of the present invention in one strand into an arbitrary vector.
  • the vector for inserting the double-stranded nucleotide is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA.
  • Plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5 etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24).
  • phage DNA includes ⁇ phage DNA (for example, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • vectors derived from animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and vectors derived from insect viruses such as baculovirus can also be used.
  • Double-stranded nucleotides containing oligonucleotide 1 in one strand can be obtained, for example, using primers 2626 to 2656 from the 5 ′ end of exon 9 of the human GR gene as a template, and primers containing appropriate restriction enzyme sites, It can be synthesized by the PCR method.
  • the double-stranded nucleotide containing the oligonucleotide of oligonucleotide 2 in one strand is, for example, a primer containing an appropriate restriction enzyme site using the 2796-2829th position from the 5 ′ end of exon 9 of the human GR gene as a template. And can be synthesized by the PCR method.
  • the double-stranded nucleotide containing the oligonucleotide 3 in one strand is, for example, using a primer containing an appropriate restriction enzyme site using the 2830 to 2860th position from the 5 ′ end of exon 9 of the human GR gene as a template, It can be synthesized by the PCR method.
  • the double-stranded nucleotide containing oligonucleotide 4 in one strand is, for example, using a primer containing an appropriate restriction enzyme site from 3730 to 3752 from the 5 ′ end of exon 9 of the human GR gene as a template, It can be synthesized by the PCR method.
  • the double-stranded nucleotide containing the oligonucleotide 5 in one strand is, for example, using primers 4080 to 4100 from the 5 ′ end of exon 9 of the human GR gene as a template and using a primer containing an appropriate restriction enzyme site, It can be synthesized by the PCR method.
  • the double-stranded nucleotide thus obtained is cleaved with a suitable restriction enzyme and inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector to obtain the expression vector.
  • oligonucleotide 1 [Examination of expression level of GR ⁇ and GR ⁇ ]
  • oligonucleotide 2 As oligonucleotides to be introduced into cells, oligonucleotide 1, oligonucleotide 2, oligonucleotide 3, oligonucleotide 4, and oligonucleotide 5 were prepared. These oligonucleotides were obtained by conventional chemical synthesis. These base sequences are shown in Table 1.
  • corresponding position in exon 9 means the position (from the 5 ′ end side of exon 9) where a base sequence complementary to each oligonucleotide exists in exon 9 (base number 4110) of the human GR gene. Counted base number).
  • the base sequence of oligonucleotide 1 is a base sequence complementary to the 2626 to 2656th base sequence from the 5 'end of exon 9 of the human GR gene.
  • Raji cells manufactured by Japan Health Science Foundation derived from human Burkitt lymphoma were used. Raji cells are cultured in RPMI 1640 medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (manufactured by Filtoron), 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin at 37 ° C./5% CO 2 atmosphere. And maintained.
  • RPMI 1640 medium Gibco
  • FBS fetal bovine serum
  • GR ⁇ and GR ⁇ The expression levels of GR ⁇ and GR ⁇ in Raji cells into which the oligonucleotide was introduced were measured by RT-PCR method and PCR method. As an endogenous control, the expression level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was measured. Raji cells were washed with PBS, RNA was extracted using FastPure RNA Kit (manufactured by Takara Bio), and reverse transcription reaction was performed using PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit (manufactured by Takara bio).
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • the obtained cDNA was amplified using Platinum Taq DNA polymerase (manufactured by Invitrogen) and PCR primers specific to the target gene (the base sequence is shown in Table 2).
  • PCR conditions an initial dissociation treatment was performed at 94 ° C. for 2 minutes, and 35 cycles of dissociation (94 ° C., 30 seconds), annealing (55 ° C., 30 seconds), and extension (72 ° C., 1 minute) were performed. Further, final extension was performed at 72 ° C. for 4 minutes.
  • Table 3 shows the expression levels of GAPDH, GR ⁇ , and GR ⁇ in Raji cells into which any of oligonucleotides 1 to 5 have been introduced.
  • the “relative value of GR ⁇ / GR ⁇ ” in Table 3 is a relative value when “value obtained by dividing the expression amount of GR ⁇ by the expression amount of GR ⁇ ” in a cell into which no oligonucleotide is introduced is 1.
  • Table 4 shows the expression levels of GAPDH, GR ⁇ , and GR ⁇ in Raji cells into which oligonucleotide 1 was introduced at different concentrations. Each experiment was performed three times. Tables 3 and 4 show the average.
  • Raji cells were cultured in RPMI 1640 medium without serum for 12 hours, then resuspended in RPMI 1640 medium with serum and seeded in a 96-well plate. After the addition of dexamethasone, the cells were cultured for 22 hours, and BrdU was added, followed by further incubation for 2 hours. After centrifugation, the supernatant was discarded, dried and fixed, and then reacted with peroxidase-labeled anti-BrdU antibody for 1 hour at room temperature. Thereafter, the plate was washed three times with PBS, tetramethylbenzidine was added, and when an appropriate color was obtained, H 2 SO 4 (1M) was added to stop the reaction. After stirring well, the absorbance was measured at 450 nm with a plate reader. The results are shown in Table 5.
  • the oligonucleotide which has the activity which raises the glucocorticoid sensitivity of a cell can be provided.
  • the rate of cell growth inhibition by dexamethasone was significant in Raji cells into which any of oligonucleotides 2 to 5 were introduced, compared to Raji cells into which no oligonucleotide was introduced. Increased to. From this, it can be seen that introduction of any of oligonucleotides 2 to 5 increased the glucocorticoid sensitivity of the cells. Therefore, according to this invention, the oligonucleotide which has the activity which raises the glucocorticoid sensitivity of a cell can be provided.
  • ER The estrogen receptor
  • SRp30c is involved in splicing control of ER mRNA.
  • the expression levels of ER ⁇ and ER ⁇ in Raji cells into which oligonucleotide 1 was introduced were measured by the RT-PCR method and the PCR method.
  • Raji cells into which oligonucleotide 1 was introduced were obtained in the same manner as in [Cell culture] and [Introduction of oligonucleotide into cells] in Example 1.
  • the concentration of oligonucleotide 1 when introduced into the cells was 300 nM.
  • Table 9 shows the expression levels of GAPDH, ER ⁇ , and ER ⁇ in Raji cells into which oligonucleotide 1 has been introduced.
  • the “relative value of ER ⁇ / ER ⁇ ” in Table 9 is a relative value when “value obtained by dividing the expression level of ER ⁇ by the expression level of ER ⁇ ” in a cell into which no oligonucleotide has been introduced is 1.
  • oligonucleotides ON4-Sense and ON4-Antisense
  • annealed 95 ° C. for 30 seconds, then 72 ° C. for 2 minutes, then 37 ° C. for 2 minutes
  • double-stranded DNA was prepared at 25 ° C. for 2 minutes. This double-stranded DNA was stored at ⁇ 20 ° C. until used in subsequent experiments.
  • RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector (Takara bio) and the above double-stranded DNA were mixed, and ligation was performed using a Ligation kit (Takara bio). Similarly, the control DNA attached to the kit was also ligated with RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector to obtain a negative control vector. PCR was performed using the primers shown in Table 11, and it was confirmed that the vector and double-stranded DNA were ligated to produce a circular plasmid (plasmid vector).
  • the plasmid vector obtained above was mixed with HIT competent cells HIT-DH5a (manufactured by RBC Bioscience), held at 4 ° C. for 5 minutes, seeded on an agar medium, and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
  • HIT competent cells HIT-DH5a manufactured by RBC Bioscience
  • the generated E. coli colonies were collected and PCR was performed using the primers shown in Table 11 to confirm that the plasmid vector was introduced into E. coli.
  • Escherichia coli into which the above plasmid vector was introduced was seeded in a liquid medium and cultured at 37 ° C. for 16 hours, and then the plasmid vector was extracted using Endofree plasmid purification kit (manufactured by Qiagen). PCR was performed using the primers shown in Table 11 to confirm that the target plasmid vector was extracted.
  • the above plasmid vector and pCMV-VSV-G envelope vector were introduced into Platinum-GP retroviral packaging cell line (Cell Biolabs) using FuGene HD transfection reagent (Roche) to produce a retroviral vector .
  • the culture supernatant containing this retroviral vector was collected, filtered, and stored at -20 ° C.
  • oligonucleotide 4 expressing Raji cells are cultured in a medium containing the above culture supernatant for 48 hours, Raji cells are infected with a retrovirus vector, and Raji cells constitutively expressing oligonucleotide 4 (this cell is labeled with the fluorescent protein ZsGreen) .) was produced. And ZsGreen positive cells were fractionated by FACS sorting.
  • mice inoculated with the control Raji cells and the mice inoculated with the oligonucleotide 4 expressing Raji cells had comparable lethality.
  • Administration of dexamethasone to mice inoculated with control Raji cells did not increase the survival rate of mice, but administration of dexamethasone to mice inoculated with oligonucleotide 4-expressing Raji cells significantly increased the survival rate of mice. I let you.
  • RNA chromatin immunoprecipitation reaction Oligonucleotide 4 expressing Raji cells and control Raji cells were fixed with 1% formaldehyde, and the nucleic acid and protein were cross-linked. After washing each cell, lysis, DNase treatment and anti-RNase treatment were performed using RNA ChIP-IT kit (Active motif), and immunization was carried out with anti-SRp30c antibody and protein G magnetic beads (hereinafter “beads”). A sedimentation reaction (reaction at 4 ° C. for 4 hours) was carried out. Subsequently, the beads were collected and washed, and a decrosslinking process was performed.
  • GR pre-mRNA bound to SRp30c was detected by RT-PCR and PCR.
  • an initial dissociation treatment was performed at 94 ° C. for 2 minutes, and 35 cycles of dissociation (94 ° C., 30 seconds), annealing (55 ° C., 30 seconds), and extension (72 ° C., 1 minute) were performed. Further, final extension was performed at 72 ° C. for 4 minutes.
  • the primers shown in Table 15 were designed to amplify a site corresponding to base numbers 152873 to 153556 of the human GR gene, which is a part of the GR pre-mRNA.

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Abstract

　生体内において、グルココルチコイド受容体遺伝子のプレｍＲＮＡとセリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（ＳＲｐ３０ｃ）との結合を妨げるオリゴヌクレオチドである。

Description

オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクター
　本発明は、オリゴヌクレオチド、グルココルチコイド感受性増強剤、医薬組成物、及び発現ベクターに関する。
　グルココルチコイドは、副腎皮質で作られるホルモンの一種であり、代謝や免疫に関与する。グルココルチコイドは、強い消炎作用及び免疫抑制作用を有することから、その人工合成物がアレルギー疾患や自己免疫性疾患の治療薬として使用されてきた。
　また、グルココルチコイドは、がん化したリンパ球に対して増殖抑制作用を有することから、その人工合成物がリンパ腫及びリンパ性白血病の化学療法に用いられてきた。骨髄抑制や激しい消化器症状などの副作用がグルココルチコイド投与で発現することは非常に稀であることから、グルココルチコイドはリンパ腫及びリンパ性白血病に対して必須の治療薬である。
　様々な疾患に使用されてきたグルココルチコイドであるが、患者の中にはグルココルチコイドに対する耐性を発現する症例があり、グルココルチコイドが効かないことがある。グルココルチコイド耐性は、喘息患者の５～１０％、リウマチ患者の約３０％、炎症性腸疾患患者の２０～５０％、小児の急性リンパ性白血病患者の１０～２５％にも上ると報告されており、グルココルチコイド耐性を解除する技術の開発が待たれている。
　グルココルチコイド受容体（Glucocorticoid receptor、ＧＲ）については、下記の知見が得られている。
　ＧＲは、グルココルチコイドと結合すると、核内で転写因子として働く。
　ヒトＧＲ遺伝子の塩基配列は既知である（NR3C1、Gene ID：2908、NCBI Reference Sequence：NC_000005.9）。ヒトＧＲ遺伝子には９個のエキソンが存在し、エキソン９（塩基数４１１１）の内部の選択的スプライシングによって、２つのスプライシングバリアント、ＧＲαとＧＲβが作られる。
　ＧＲαは、エキソン１～９が連結した成熟ｍＲＮＡから翻訳される、７７７アミノ酸残基の蛋白質である。ＧＲαはリガンド依存的に核内移行し、転写因子として働く。
　ＧＲβは、エキソン１～８とエキソン９の一部（エキソン９の５’末端側から２６３１～４１１１番目）とが連結した成熟ｍＲＮＡから翻訳される、７４２アミノ酸残基の蛋白質である。ＧＲβはリガンド結合ドメインの一部が欠損しており、リガンド結合能を有しない。ＧＲβは、核内において、リガンドと結合したＧＲαと競合的に拮抗し、ＧＲαの転写因子活性を阻害する。
　細胞のグルココルチコイド耐性に関しては、下記の報告がなされている。
　イヌのリンパ腫及び白血病に由来する細胞株（ＣＬ－１細胞、ＧＬ－１細胞）において、Nuclear factor-κB（ＮＦ－κＢ）の機能を阻害することでグルココルチコイド耐性が解除され、グルココルチコイド添加によって細胞増殖が抑制されることが報告されている（例えば、文献１参照）。このことから、ＮＦ－κＢの機能を阻害すると細胞内のＧＲの発現量が増加し、グルココルチコイドの細胞増殖抑制作用が細胞に及びやすくなるものと考えられた。
　また、ヒトのバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞及び急性リンパ性白血病患者の末梢血由来細胞において、ｓｉＲＮＡを用いてＮＦ－κＢの機能を阻害すると、グルココルチコイド耐性が解除されることと、ＧＲαの発現量が増加することが報告されている（例えば、文献２参照）。このことから、細胞内においてＧＲαの発現量が増加することで、グルココルチコイド耐性が解除される可能性が示唆された。
　ＧＲの発現に関しては、下記の報告がなされている。
　大腸癌細胞株（ＨＴ－２９細胞）及び乳癌細胞株（ＭＣＦ－７細胞）において、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であるトリコスタチンＡや酪酸ナトリウム、及びＤＮＡメチル基転移酵素の阻害剤である５－アザ－２’－デオキシシチジンが、ＧＲαの発現量を増加させＧＲβの発現量を減少させることが報告されている（例えば、文献３参照）。そのとき同時にセリン／アルギニンリッチ蛋白質（Serine/arginine-rich protein、ＳＲ蛋白質）の１種であるＡＳＦ／ＳＦ２の発現量が増加していることから、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＧＲのｍＲＮＡのスプライシング制御に関与している可能性が示唆された。ＳＲ蛋白質はスプライシング因子であり、細胞の核内でプレｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのスプライシングを制御する蛋白質である。
　ほかに、２８人の健康なボランティアの末梢血白血球におけるｍＲＮＡの発現量を比較した研究で、ＳＲ蛋白質の１種であるセリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（Serine/arginine-rich protein 30c、ＳＲｐ３０ｃ）の発現量と、ＧＲαとＧＲβとの発現量比（ＧＲα／ＧＲβ）に負の相関関係があることが報告されている（例えば、文献４参照）。
　さらに、好中球様細胞株（レチノイン酸によって刺激されたＰＬＢ－９８５細胞）において、ＳＲｐ３０ｃをアンチセンスオリゴヌクレオチドによってノックダウンすると、ＧＲβのｍＲＮＡ発現量が減少しＧＲαのｍＲＮＡ発現量が増加することが報告されている（例えば、文献５参照）。
　また、ＧＲ遺伝子にはＡＧＧＡＣという５塩基が比較的高い頻度で存在することが見出され、ＳＲｐ３０ｃの認識配列と予想された（例えば、文献６参照）。
　以上の知見から、ＧＲ遺伝子のエキソン９内部の選択的スプライシングは、ＳＲ蛋白質の１種であるＳＲｐ３０ｃによって制御されているものと考えられる。即ち、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９には、ＳＲｐ３０ｃが結合する部位が存在し、ＳＲｐ３０ｃはこの部位に結合して、ＧＲのプレｍＲＮＡをＧＲβの成熟ｍＲＮＡへとスプライシングさせているものと考えられる。
　ただし、ＳＲｐ３０ｃの機能阻害によって細胞のグルココルチコイド感受性が実際に変化するかについては、これまで報告がなく、不明である。
　ところで、ＳＲ蛋白質のリン酸化を抑制することで、その機能を阻害する技術が開示されている。例として、ＳＲ蛋白質のリン酸化酵素の阻害剤であるイソニコチンアミド化合物ＳＲＰＩＮ３４０を抗ウイルス剤として用いる技術が開示されている（例えば、文献７及び文献８参照）。
文献１：Matsuda A, et al. Res. Vet. Sci., 2010, 89(3):378-382.
文献２：Matsuda A, et al. The 14th International Congress of Immunology, Aug. 2010, Volume 22, Supplement number 1, p. v8.
文献３：Piotrowska H, et al. Arch. Med. Res., 2009, 40:156-162.
文献４：Watanuki T, et al. J. Affect. Disord., 2008, 110(1-2):62-69.
文献５：Xu Q, et al. J. Biol. Chem., 2003, 278:27112-27118.
文献６：Paradis C, et al. RNA, 2007, 13:1287-1300.
文献７：Karakama Y, et al. Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54(8):3179-318.
文献８：国際公開第２００５／０６３２９３号パンフレット
　ＳＲ蛋白質リン酸化酵素の阻害剤によってＳＲ蛋白質のリン酸化を抑制する手段（例えば、文献７及び文献８参照）では、特定のＳＲ蛋白質の活性を制御することは難しく、あらゆるＳＲ蛋白質の活性を抑制してしまうおそれがある。
　また、ＳＲｐ３０ｃは、ＧＲのほかに、性腺刺激ホルモン受容体のスプライシングにも関与することが知られており、ＳＲｐ３０ｃのみの活性を抑制した場合でも、生体の恒常性を乱す可能性は否定できない。
　副作用を起こすことなく細胞のグルココルチコイド感受性を上げるには、ＳＲｐ３０ｃが担っているＧＲスプライシングバリアント制御を選択的に阻害する技術が要求される。
　本発明は、上記状況のもとになされた。
　上記状況のもと、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有する新規な化合物が必要とされている。
　前記課題を解決するための具体的手段は、以下のとおりである。
　＜１＞　生体内において、グルココルチコイド受容体遺伝子のプレｍＲＮＡとセリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（ＳＲｐ３０ｃ）との結合を妨げるオリゴヌクレオチド。
　＜２＞　配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部に相補的な１５～５０塩基長の塩基配列である、前記＜１＞に記載のオリゴヌクレオチド。
　＜３＞　前記配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部は、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上の塩基配列である、前記＜２＞に記載のオリゴヌクレオチド。
　＜４＞　配列番号１に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、配列番号２に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、配列番号３に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、配列番号４に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、及び、配列番号５に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、のいずれかである、前記＜１＞に記載のオリゴヌクレオチド。
　＜５＞　前記＜１＞～＜４＞に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤。
　＜６＞　前記＜１＞～＜４＞に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む医薬組成物。
　＜７＞　前記＜１＞～＜４＞に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む発現ベクター。
　本発明によれば、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
　また、本発明によれば、前記オリゴヌクレオチドを有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤が提供される。
　また、本発明によれば、前記オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が提供される。
　さらに、本発明によれば、前記オリゴヌクレオチドを発現する発現ベクターが提供される。
実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例２における細胞増殖抑制率を示すグラフである。 実施例４における細胞増殖抑制率を示すグラフである。
　以下に、本発明の実施の形態について順次説明する。なお、これらの説明および実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
　本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
＜オリゴヌクレオチド＞
　本発明のオリゴヌクレオチドは、生体内において、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ遺伝子）のプレｍＲＮＡと、セリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（Serine/arginine-rich protein 30c、ＳＲｐ３０ｃ）との結合を妨げるオリゴヌクレオチドである。
　前記オリゴヌクレオチドは、グルココルチコイド受容体（Glucocorticoid receptor、ＧＲ）のプレｍＲＮＡがＧＲβの成熟ｍＲＮＡへとスプライシングされることを阻害するので、ＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量を増加させると考えられる。その結果、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇すると考えられる。
　ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９に存在しＳＲｐ３０ｃが結合する部位（スプライス要素）の候補として、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９の連続する一部であって、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）の合計のモル比が５０％以上である塩基配列が挙げられる。
　ＳＲ蛋白質はＡ及び／又はＧが豊富な塩基配列と結合しやすいと考えられており、ＳＲ蛋白質の１種であるＳＲｐ３０ｃも、Ａ及び／又はＧが豊富な塩基配列と結合しやすいと考えられる。したがって、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９の連続する一部であって、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上である塩基配列は前記スプライス要素である可能性が高い。
　上記を理由に、ヒトＧＲ遺伝子（NR3C1、Gene ID：2908、NCBI Reference Sequence：NC_000005.9）のエキソン９から、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上（好ましくは６０％以上）である例えば１５～５０塩基長の塩基配列を選択し、この塩基配列に相補的な１５～５０塩基長の塩基配列を本発明のオリゴヌクレオチドとしてよい。
　このオリゴヌクレオチドは、前記スプライス要素に完全に若しくは部分的に重なってＧＲのプレｍＲＮＡに結合するか、または前記スプライス要素に充分に近い位置でＧＲのプレｍＲＮＡに結合するものと考えられる。そのため、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合が阻害され、ＧＲβの成熟ｍＲＮＡの作製が阻害され、ＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量が増加するものと考えられる。その結果、細胞のグルココルチコイド感受性が上がるものと考えられる。
　配列番号２２に示す塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子の塩基番号１５６０９１～１５７５８２に相当し、即ち、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の一部（エキソン９の５’末端側から２６２０～４１１１番目）に相当する。ＧＲβは、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン１～８とエキソン９の一部（ヒトにおいては、エキソン９の５’末端側から２６３１～４１１１番目）とが連結した成熟ｍＲＮＡから翻訳される蛋白質である。したがって、ヒトＧＲのプレｍＲＮＡの配列番号２２に示す塩基配列内に、前記スプライス要素が存在すると考えられる。
　上記を理由に、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部に相補的な１５～５０塩基長の塩基配列であることが好ましい。
　さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部であってアデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上（より好ましくは６０％以上）である塩基配列に相補的な、１５～５０塩基長の塩基配列であることがより好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、以下のオリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかであることが好ましい。オリゴヌクレオチド１～５は、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有する。
　オリゴヌクレオチド１：配列番号１に示す塩基配列（５’－ＣＴＴＴＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡ－３’）であるオリゴヌクレオチド。
　配列番号１の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から２６２６～２６５６番目）に相補的な塩基配列である。
　オリゴヌクレオチド２：配列番号２に示す塩基配列（５’－ＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡ－３’）であるオリゴヌクレオチド。
　配列番号２の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から２７９６～２８２９番目）に相補的な塩基配列である。
　オリゴヌクレオチド３：配列番号３に示す塩基配列（５’－ＴＡＡＧＡＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＧＴＡＴＣＣＴ－３’）であるオリゴヌクレオチド。
　配列番号３の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から２８３０～２８６０番目）に相補的な塩基配列である。
　オリゴヌクレオチド４：配列番号４に示す塩基配列（５’－ＴＴＴＧＴＣＣＣＣＡＴＴＡＴＡＴＡＧＣＡＴＴＴ－３’）であるオリゴヌクレオチド。
　配列番号４の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から３７３０～３７５２番目）に相補的な塩基配列である。
　オリゴヌクレオチド５：配列番号５に示す塩基配列（５’－ＣＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＴ－３’）であるオリゴヌクレオチド。
　配列番号５の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の連続する一部（エキソン９の５’末端側から４０８０～４１００番目）に相補的な塩基配列である。
　オリゴヌクレオチド１～５は、前記スプライス要素に完全に若しくは部分的に重なってＧＲのプレｍＲＮＡに結合するか、または前記スプライス要素に充分に近い位置でＧＲのプレｍＲＮＡに結合するものと考えられる。そのため、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合が阻害され、ＧＲβの成熟ｍＲＮＡの作製が阻害され、ＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量が増加するものと考えられる。その結果、細胞のグルココルチコイド感受性が上がるものと考えられる。
　オリゴヌクレオチド１～５は、その塩基配列から、ＧＲのプレｍＲＮＡのエキソン９の特定部位に配列特異的に結合するものと考えられる。そのため、オリゴヌクレオチド１～５は、ＳＲｐ３０ｃ以外のＳＲ蛋白質の機能には影響を及ぼさず、また、ＳＲｐ３０ｃが制御しているスプライシングのうち、ＧＲのエキソン９以外のスプライシングには影響を及ぼさないと考えられる。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかと相同性が認められるオリゴヌクレオチドも包含される。
　例えば、オリゴヌクレオチド１と相同性が認められるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せばよく、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、更に好ましくは９５％以上の相同性を有する。オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかと相同性が認められるオリゴヌクレオチドについても、上記と同様である。
　相同性は、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（ＮＣＢＩ、又はAltschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）を用いた配列比較で決定することができる。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号１と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
　配列番号１と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５～４５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２０～４０塩基長がより好ましく、２２～３８塩基長が更に好ましく、２３～３５塩基長が特に好ましく、２４～３０塩基長が最も好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド２と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号２と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
　配列番号２と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド２と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５～５０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが５０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２０～４５塩基長がより好ましく、２５～４０塩基長が更に好ましく、２８～３８塩基長が特に好ましく、３０～３４塩基長が最も好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド３と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号３と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
　配列番号３と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド３と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５～４５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２０～４０塩基長がより好ましく、２２～３８塩基長が更に好ましく、２３～３５塩基長が特に好ましく、２４～３０塩基長が最も好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド４と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号４と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
　配列番号４と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド４と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１２～３５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１２塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１５～３２塩基長がより好ましく、１８～３０塩基長が更に好ましく、２０～２８塩基長が特に好ましく、２２～２５塩基長が最も好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド５と同等程度の作用を示すものであれば、配列番号５と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも包含される。
　配列番号５と相補的な塩基配列であるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド５と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１２～３５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１２塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１５～３０塩基長がより好ましく、１６～２５塩基長が更に好ましく、１８～２３塩基長が特に好ましく、２０～２２塩基長が最も好ましい。
　オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd (J.　Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法等に従って行うことができる。
　前記ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９ｍＭ～約４０ｍＭ、好ましくは約１９ｍＭ～約２０ｍＭで、温度が約５０℃～約７０℃、好ましくは約６０℃～約６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかにおいて塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドも包含される。
　例えば、オリゴヌクレオチド１において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せばよく、塩基の欠失、置換又は付加の位置は特に限定されない。オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５のいずれかにおいて塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドについても、上記と同様である。
　オリゴヌクレオチド１において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１０塩基であり、好ましくは１塩基～５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。
　オリゴヌクレオチド１において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド１と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０～４０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが２０塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２２～３８塩基長がより好ましく、２３～３５塩基長が更に好まし、２４～３０塩基長が特に好ましい。
　オリゴヌクレオチド２において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１０塩基であり、好ましくは１塩基～５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。
　オリゴヌクレオチド２において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド２と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０～４５塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが２０塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４５塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２５～４０塩基長がより好ましく、２８～３８塩基長が更に好まし、３０～３４塩基長が特に好ましい。
　オリゴヌクレオチド３において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１０塩基であり、好ましくは１塩基～５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。
　オリゴヌクレオチド３において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド３と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは２０～４０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが２０塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが４０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、２２～３８塩基長がより好ましく、２３～３５塩基長が更に好まし、２４～３０塩基長が特に好ましい。
　オリゴヌクレオチド４において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１０塩基であり、好ましくは１塩基～５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。
　オリゴヌクレオチド４において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド４と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５～３２塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３２塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１８～３０塩基長がより好ましく、２０～２８塩基長が更に好まし、２２～２５塩基長が特に好ましい。
　オリゴヌクレオチド５において、欠失した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。置換した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１０塩基であり、好ましくは１塩基～５塩基であり、より好ましくは１塩基又は２塩基である。付加した塩基の数としては１塩基又は２塩基以上が挙げられ、例えば１塩基～１５塩基であり、好ましくは１塩基～１０塩基であり、より好ましくは１塩基～５塩基である。
　オリゴヌクレオチド５において塩基が欠失、置換又は付加したオリゴヌクレオチドの長さは、オリゴヌクレオチド５と同等程度の作用を示せば特に限定されない。当該オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１５～３０塩基長である。当該オリゴヌクレオチドの長さが１５塩基長以上であると、配列非特異的な結合が起こりにくく、また、標的ｍＲＮＡとの結合の安定性が高い。他方、当該オリゴヌクレオチドの長さが３０塩基長以下であると、細胞内及び核内に移行しやすい。上記観点から、当該オリゴヌクレオチドの長さは、１６～２５塩基長がより好ましく、１８～２３塩基長が更に好まし、２０～２２塩基長が特に好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴＤＮＡ及びオリゴＲＮＡのみならず、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡ及びホスホロチオエートオリゴＲＮＡであってよい。
　ホスホロチオエートヌクレオチドは、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたヌクレオチドである。ホスホロチオエートヌクレオチドは、各種の核酸分解酵素に対して耐性があることから、ヌクレオチドよりも安定性が高く好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、安定性の観点から、オリゴＤＮＡが好ましく、ホスホロチオエートオリゴＤＮＡがより好ましい。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、通常のオリゴヌクレオチド合成の方法に従って化学合成することで得ることができる。
　また、オリゴヌクレオチド１は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２６２６～２６５６番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド２は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２７９６～２８２９番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド３は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２８３０～２８６０番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド４は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から３７３０～３７５２番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド５は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から４０８０～４１００番目の配列を含む部位を鋳型にして、適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により合成できる。
　本発明において、オリゴヌクレオチドについて言う「細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性」とは、当該オリゴヌクレオチドを細胞に接触させた場合、当該オリゴヌクレオチドを細胞に接触させない場合に比して、細胞のグルココルチコイドに対する感受性を上げる活性をいう。
　オリゴヌクレオチドが「細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性」を有するか否かは、当該オリゴヌクレオチドとグルココルチコイドとを細胞に接触させた場合と細胞に接触させない場合とについて、細胞増殖率を比較することで確認できる。例えば、リンパ腫またはリンパ性白血病に由来する細胞に当該オリゴヌクレオチドを導入し、当該細胞の培地にグルココルチコイドを添加して、細胞増殖率が低下することで確認できる。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドを含む培地で細胞を培養することで、細胞への導入が可能である。このとき、オリゴヌクレオチドとリポフェクタミンとを混合して用いることで、細胞への導入効率を上げることができる。ほかに、電気穿孔法によっても細胞への導入効率を上げることができる。
＜グルココルチコイド感受性増強剤＞
　本発明のグルココルチコイド感受性増強剤は、薬学的に許容し得る媒質中に、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含む。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤の投与により、細胞におけるＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量を増やすことができる。このため、前記グルココルチコイド感受性増強剤は、生体のグルココルチコイド感受性を増強させる薬剤として用いることができる。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤の調製に用いられる媒質および製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質としては、固体媒質（例えば、ゼラチン、乳糖）及び液体媒質（例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液）が挙げられる。製剤用添加物としては、界面活性剤（例えば、糖類、多価アルコール、多価アルコールエステル）、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム）等が挙げられる。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤は、静脈内投与するのに適した液体媒質に、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を適当量含有させたものが好ましい。この場合、前記グルココルチコイド感受性増強剤の投与は、適用対象者の静脈内に注射または点滴することにより行われる。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤は、保存安定性の観点からは、凍結乾燥された状態も好ましい。この場合は用時に液体媒質に溶かして用いればよい。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤は、通常、副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイドと共に用いられる。両者を共に用いる場合、前記グルココルチコイド感受性増強剤は、グルココルチコイドと同時に投与してもよく、グルココルチコイドの投与前に或いはグルココルチコイドの投与後に投与してもよい。
　共に用いられるグルココルチコイドは、天然物の精製物でもよく、人工合成物であるステロイド剤（例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン等）でもよい。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤は、喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、リウマチや炎症性腸疾患などの自己免疫性疾患、リンパ腫、リンパ性白血病などのステロイド剤の投与対象となりうる全ての患者に投与することができる。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤は、上記の患者でグルココルチコイド耐性になっている患者に使用するほか、グルココルチコイド耐性になっていない患者にも使用できる。この場合、グルココルチコイド投与量の減量が可能になるという点で有用である。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤は、対象となる疾患の種類や重傷度などにもよるが、成人１回当たりの有効量として０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの投与が好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの投与がより好ましい。投与回数に特に制限はなく、１回投与で用いてもよく、反復投与で用いてもよく、持続投与で用いてもよい。投与間隔および投与期間は、臨床所見、画像所見、血液所見、併存する疾患、既往歴などに応じて、当業者が選択できる。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤の使用は、ヒトでの使用に限定されない。ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、イヌ、ネコ、サル等のペット等に用いてもよい。
　前記グルココルチコイド感受性増強剤に有効成分として含まれるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
　オリゴヌクレオチド１～５は、ＧＲのプレｍＲＮＡにおけるエキソン９の特定部位に配列特異的に結合し、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合を選択的に阻害するものと考えられる。そのため、オリゴヌクレオチド１～５の少なくとも１種を有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤は、生体へ投与しても副作用の懸念が少ない。
＜医薬組成物＞
　本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る媒質中に、本発明のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む。
　前記医薬組成物は、細胞におけるＧＲαのＧＲβに対する相対的な発現量を増やし、生体のグルココルチコイド感受性を増強させうる医薬組成物を提供するものである。
　前記医薬組成物の調製に用いられる媒質および製剤用添加物の種類は、特に制限されない。媒質および製剤用添加物としては、前記グルココルチコイド感受性増強剤について既述した固体媒質、液体媒質、界面活性剤、緩衝剤などが挙げられる。
　前記医薬組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、内分泌疾患、精神疾患、感染症、外傷などの各種の疾患や身体損傷の治療のために使用することができる。なかでも、前記医薬組成物は、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、リンパ腫、リンパ性白血病などのステロイド剤の投与対象となりうる患者に好適である。
　前記医薬組成物は、血管内投与、膀胱投与、腹腔内投与、局所投与等の方法で患者に投与することができる。
　したがって、前記医薬組成物によれば、各種の疾患や身体損傷（例えば、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、内分泌疾患、精神疾患、感染症、外傷など）の治療方法が提供される。当該治療方法は、各種の疾患や身体損傷（例えば、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、内分泌疾患、精神疾患、感染症、外傷など）の患者に、前記医薬組成物を投与することを含む。当該治療方法において「治療」とは、症状の改善であればよく、重症化の抑制や症状の軽減若しくは緩和もこの用語に包摂される。
　前記医薬組成物は、副腎皮質ホルモンであるグルココルチコイドと共に用いることができる。両者を共に用いる場合、前記医薬組成物は、グルココルチコイドと同時に投与してもよく、グルココルチコイドの投与前に或いはグルココルチコイドの投与後に投与してもよい。
　共に用いられるグルココルチコイドは、天然物の精製物でもよく、人工合成物であるステロイド剤（例えば、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン等）でもよい。
　前記医薬組成物の使用は、ヒトでの使用に限定されない。ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、イヌ、ネコ、サル等のペット等に用いてもよい。
　前記医薬組成物に含まれるオリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
　オリゴヌクレオチド１～５は、ＧＲのプレｍＲＮＡにおけるエキソン９の特定部位に配列特異的に結合し、ＳＲｐ３０ｃと前記スプライス要素との結合を選択的に阻害するものと考えられる。そのため、オリゴヌクレオチド１～５の少なくとも１種を有効成分として含む医薬組成物は、生体へ投与しても副作用の懸念が少ない。
＜発現ベクター＞
　本発明の発現ベクターは、本発明のオリゴヌクレオチドを含み、本発明のオリゴヌクレオチドの発現に用いられる。前記発現ベクターは、本発明のオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチド（好ましくは二本鎖ＤＮＡ）を、任意のベクターに挿入することにより得ることができる。
　前記二本鎖ヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主細胞中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージＤＮＡ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを用いることもできる。
　オリゴヌクレオチド１を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２６２６～２６５６番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド２のオリゴヌクレオチドを一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２７９６～２８２９番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド３を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２８３０～２８６０番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド４を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から３７３０～３７５２番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
　オリゴヌクレオチド５を一方の鎖に含む二本鎖ヌクレオチドは、例えば、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から４０８０～４１００番目を鋳型にして、適当な制限酵素部位を含むプライマーを用いて、ＰＣＲ法により合成できる。
　そして、このようにして得た二本鎖ヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入すれば、前記発現ベクターが得られる。
　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその趣旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
〔ＧＲα及びＧＲβの発現量の検討〕
［オリゴヌクレオチドの用意］
　細胞内に導入するオリゴヌクレオチドとして、オリゴヌクレオチド１、オリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３、オリゴヌクレオチド４、及びオリゴヌクレオチド５を用意した。これらのオリゴヌクレオチドは、常法の化学合成によって得た。これらの塩基配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１において、「エキソン９中の対応位置」とは、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９（塩基数４１１０）において、各オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列が存在する位置（エキソン９の５’末端側から数えた塩基番号）である。換言すれば、例えば、オリゴヌクレオチド１の塩基配列は、ヒトＧＲ遺伝子のエキソン９の５’末端側から２６２６～２６５６番目の塩基配列に相補的な塩基配列である。
［細胞の培養］
　実験には、ヒトのバーキットリンパ腫由来のＲａｊｉ細胞（Japan Health Science Foundation製）を用いた。
　Ｒａｊｉ細胞は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）（Filtoron製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco製）を用いて、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気で培養し維持した。
［オリゴヌクレオチドの細胞内への導入］
　２×１０６個のＲａｊｉ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗浄後、Amaxa cell line Nucleofector Kit V（Lonza製）のトランスフェクション用試薬１００μｌに懸濁した。オリゴヌクレオチドを３００ｎＭの濃度となるように添加した後、速やかにNucleofector I device（Lonza製）を用いて電気穿孔法による細胞内への導入を行なった。
　濃度依存性を確かめる実験においては、オリゴヌクレオチドの濃度を５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭとした。
　Ｒａｊｉ細胞は、前記培地で２４時間培養した後、以降の各種実験に供した。
［ＧＲα及びＧＲβの発現量の測定］
　オリゴヌクレオチドを導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＲα及びＧＲβの発現量を、ＲＴ－ＰＣＲ法及びＰＣＲ法により測定した。内在性コントロールとしては、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現量を測定した。
　Ｒａｊｉ細胞はＰＢＳで洗浄した後、FastPure RNA Kit（Takara bio製）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit（Takara bio製）を用いて逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡは、Platinum Taq DNA polymerase（Invitrogen製）及び目的遺伝子に特異的なＰＣＲ用プライマー（表２にその塩基配列を示す）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、初回解離処理を９４℃で２分間行ない、解離（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、１分間）を３５サイクル行なった。さらに最終伸長を７２℃で４分間行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　ＰＣＲ後、エチジウムブロマイド添加２％アガロースゲルによる二次元電気泳動でＤＮＡを分離し、バンドの輝度をイメージアナライザー Gel Print 2000i/VGA（Genomic Solutions製）によって数値化した。
　オリゴヌクレオチド１～５のいずれかを導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＡＰＤＨ、ＧＲα及びＧＲβの発現量を表３に示す。表３中の「ＧＲα／ＧＲβの相対値」は、オリゴヌクレオチドを導入していない細胞における「ＧＲαの発現量をＧＲβの発現量で除した値」を１としたときの相対値である。
　また、濃度を変えてオリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＡＰＤＨ、ＧＲα及びＧＲβの発現量を表４に示す。
　なお、各実験は３回行った。表３及び表４にはその平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　表３に明らかなように、オリゴヌクレオチド１～５のいずれかを導入した細胞では、「ＧＲα／ＧＲβの相対値」が１．１を超えていた。このことから、これらのオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することにより、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇する可能性が示唆された。
　表４に明らかなように、オリゴヌクレオチド１は、濃度依存的にＧＲβの発現量を低下させた。
＜実施例２＞
〔オリゴヌクレオチド導入細胞のグルココルチコイド感受性の検討〕
［オリゴヌクレオチド１導入細胞］
　オリゴヌクレオチド１の導入による細胞のグルココルチコイド感受性の変化を検討するため、５－ブロモ－２－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込み試験を行い、細胞増殖の定量を行った。グルココルチコイドとしてデキサメサゾン（Biomol製）を使用し、デキサメサゾンの濃度は、０μＭ（添加なし）、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ、及び１０μＭとした。
　細胞周期を同期化するため、Ｒａｊｉ細胞を血清の入っていないＲＰＭＩ１６４０培地中で１２時間培養した後、血清の入ったＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し９６穴プレートに播種した。
　デキサメサゾンの添加後２２時間培養し、ＢｒｄＵを添加してさらに２時間培養した。遠心分離した後、上清を捨て、乾燥させ固定した後、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体と１時間、室温で反応させた。その後、ＰＢＳで３回洗浄し、テトラメチルベンジディンを加え、適度な発色が得られた段階でＨ２ＳＯ４（１Ｍ）を添加して反応を停止した。よく攪拌した後、プレートリーダーによって４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を表５に示す。
　デキサメサゾンを添加していないＲａｊｉ細胞を対照として、前記吸光度の相対比によって細胞増殖抑制率（％）を算出した。その結果を表６及び図１に示す。ここで、統計学的有意差の判定には、一元配置分散分析法及び多重比較法を用いた。多重比較としてはＴｕｋｅｙ法を使用した。危険率Ｐ＜ ．０５（ｖｓオリゴヌクレオチド無添加）を有意な差とした。
　なお、各実験は３回行った。表５及び表６にはその平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表５、表６及び図１に明らかなように、オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞では、オリゴヌクレオチドを導入していないＲａｊｉ細胞に比べて、デキサメサゾンの添加により、ＢｒｄＵの取り込み量が有意に低下し、また、細胞増殖抑制率が有意に増加した。このことから、オリゴヌクレオチド１を導入することにより、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇したことが分る。
　したがって、本発明によれば、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有するオリゴヌクレオチドを提供できる。
［オリゴヌクレオチド２～５導入細胞］
　上記と同様にしてＢｒｄＵ取り込み試験を行い、オリゴヌクレオチド２～５いずれかの導入による細胞のグルココルチコイド感受性の変化を検討した。細胞増殖抑制率（％）を表７及び図２～図５に示す。なお、各実験は４回行い、表７にはその平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７及び図２～図５に明らかなように、オリゴヌクレオチド２～５のいずれかを導入したＲａｊｉ細胞では、オリゴヌクレオチドを導入していないＲａｊｉ細胞に比べて、デキサメサゾンによる細胞増殖抑制率が有意に増加した。このことから、オリゴヌクレオチド２～５のいずれかを導入することにより、細胞のグルココルチコイド感受性が上昇したことが分る。
　したがって、本発明によれば、細胞のグルココルチコイド感受性を上げる活性を有するオリゴヌクレオチドを提供できる。
＜実施例３＞
〔エストロゲン受容体の発現量の検討〕
　エストロゲン受容体（ＥＲ）には２つのスプライシングバリアント、ＥＲαとＥＲβが存在する。ＥＲのｍＲＮＡのスプライシング制御に、ＳＲｐ３０ｃが関与することが知られている。
　オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞における、ＥＲα及びＥＲβの発現量を、ＲＴ－ＰＣＲ法及びＰＣＲ法により測定した。
　実施例１における［細胞の培養］及び［オリゴヌクレオチドの細胞内への導入］と同様にして、オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞を得た。なお、オリゴヌクレオチド１の細胞内への導入時の濃度は、３００ｎＭとした。
［エストロゲン受容体の発現量の測定］
　Ｒａｊｉ細胞はＰＢＳで洗浄した後、FastPure RNA Kit（Takara bio製）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit（Takara bio製）を用いて逆転写反応を行なった。得られたｃＤＮＡは、Platinum Taq DNA polymerase（Invitrogen製）及び目的遺伝子に特異的なＰＣＲ用プライマー（表８にその塩基配列を示す）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、初回解離処理を９４℃で２分間行ない、解離（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、１分間）を３５サイクル行なった。さらに最終伸長を７２℃で４分間行なった。
　内在性コントロールとして、配列番号１０及び１１のＰＣＲプライマーを用いてＧＡＰＤＨの発現量を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　ＰＣＲ後、エチジウムブロマイド添加２％アガロースゲルによる二次元電気泳動でＤＮＡを分離し、バンドの輝度をイメージアナライザー Gel Print 2000i/VGA（Genomic Solutions製）によって数値化した。
　オリゴヌクレオチド１を導入したＲａｊｉ細胞における、ＧＡＰＤＨ、ＥＲα及びＥＲβの発現量を表９に示す。表９中の「ＥＲα／ＥＲβの相対値」は、オリゴヌクレオチドを導入していない細胞における「ＥＲαの発現量をＥＲβの発現量で除した値」を１としたときの相対値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　表９に明らかなように、オリゴヌクレオチド１を導入しても、「ＥＲα／ＥＲβの相対値」がほぼ１であった。このことから、オリゴヌクレオチド１を細胞に導入しても、ＥＲのｍＲＮＡのスプライシング制御に影響を及ぼさないことが分る。
＜実施例４＞
〔オリゴヌクレオチドの抗腫瘍効果の検討〕
［オリゴヌクレオチド４発現用ベクターの作製］
　オリゴヌクレオチド４をベクターへ挿入するため、表１０に示すオリゴヌクレオチドを用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　上記の２種類のオリゴヌクレオチド、ＯＮ４－Ｓｅｎｓｅ及びＯＮ４－Ａｎｔｉｓｅｎｓｅをそれぞれ５０μＭとなるように混和し、アニーリング処理（９５℃で３０秒、続いて７２℃で２分間、続いて３７℃で２分間、続いて２５℃で２分間）を行い、二本鎖ＤＮＡを作製した。この二本鎖ＤＮＡを以降の実験に使用するまで－２０℃で保管した。
　RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vector（Takara bio製）と上記二本鎖ＤＮＡを混和し、Ligation kit（Takara bio製）を用いてライゲーションを行った。同様に、キットに附属のコントロールＤＮＡもRNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen vectorとのライゲーションを行い、陰性コントロール用のベクターとした。
　表１１に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、上記ベクターと二本鎖ＤＮＡがライゲーションされ環状プラスミド（プラスミドベクター）が作製されたことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記で得たプラスミドベクターをHIT competent cells HIT-DH5a（RBC Bioscience製）と混和し、４℃で５分間保持した後、寒天培地に播種し、３７℃で１８時間の培養を行った。
　発生した大腸菌コロニーを採取し、表１１に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、プラスミドベクターが大腸菌に導入されていることを確認した。
　上記プラスミドベクターを導入した大腸菌を液体培地に播種し、３７℃で１６時間の培養を行った後、Endofree plasmid purification kit（Qiagen製）を用いてプラスミドベクターを抽出した。表１１に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、目的のプラスミドベクターが抽出されたことを確認した。
　上記プラスミドベクターとpCMV-VSV-G envelope vector（Cell Biolabs製）をFuGene HD transfection reagent（Roche製）を用いてPlatinum-GP retroviral packaging cell line（Cell Biolabs製）に導入し、レトロウイルスベクターを作製した。このレトロウイルスベクターを含む培養上清を回収しフィルトレーション後、－２０℃で保管した。
［オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞の作製］
　上記培養上清を含む培地でＲａｊｉ細胞を４８時間培養し、レトロウイルスベクターをＲａｊｉ細胞に感染させ、オリゴヌクレオチド４を恒常的に発現するＲａｊｉ細胞（この細胞は、蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎによって標識されている。）を作製した。
　そして、ＺｓＧｒｅｅｎ陽性細胞をＦＡＣＳソーティングにより分取した。
［ＧＲα及びＧＲβの発現量の測定］
　実施例１における［ＧＲα及びＧＲβの発現量の測定］と同様にして、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞における、ＧＲα及びＧＲβの発現量を測定した。内在性コントロールとしては、ＧＡＰＤＨの発現量を測定した。
　ＧＡＰＤＨ、ＧＲα及びＧＲβの発現量を表１２に示す。表１２中の「ＧＲα／ＧＲβの相対値」は、コントロールＲａｊｉ細胞における「ＧＲαの発現量をＧＲβの発現量で除した値」を１としたときの相対値である。なお、実験は３回行い、表１２にはその平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２に明らかなように、オリゴヌクレオチド４を恒常的に発現させると、ＧＲαの発現量が増加し、ＧＲβの発現量が減少することが確認された。
［グルココルチコイド感受性の検討］
　オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞のグルココルチコイド感受性を検討するため、実施例２と同様にしてＢｒｄＵ取り込み試験を行い、細胞増殖の定量を行った。デキサメサゾンの濃度は、０μＭ（添加なし）及び５μＭとした。吸光度の測定結果を表１３に示す。なお、各実験は３回行い、表１３にはその平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
　表１３に明らかなように、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞では、コントロールＲａｊｉ細胞に比べて、デキサメサゾンの添加によりＢｒｄＵの取り込み量が有意に低下した。このことから、オリゴヌクレオチド４の恒常的な発現により、グルココルチコイド感受性が高まることが確認された。
［ｉｎ ｖｉｖｏ試験］
　６週齢のＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）に、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞及びコントロールＲａｊｉ細胞をそれぞれ１×１０７細胞／匹、腹腔内に接種し、デキサメサゾン１５ｍｇ／ｋｇを毎日、腹腔内投与して観察した。生存率（％）を表１４に示し、生存曲線を図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１４及び図６に明らかなように、コントロールＲａｊｉ細胞を接種したマウスと、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞を接種したマウスとは、同程度の致死率であった。コントロールＲａｊｉ細胞を接種したマウスにデキサメサゾンを投与しても、マウスの生存率を上昇させなかったが、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞を接種したマウスにデキサメサゾンを投与すると、マウスの生存率を顕著に上昇させた。
＜実施例５＞
〔オリゴヌクレオチドのブロッキング活性の検討〕
　オリゴヌクレオチド４によってＳＲｐ３０ｃとＧＲのプレｍＲＮＡとの結合が阻害されていることを確認するため、ＲＮＡクロマチン免疫沈降反応を行った。
［ＲＮＡクロマチン免疫沈降反応］
　オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞及びコントロールＲａｊｉ細胞を１％ホルムアルデヒドで固定し、核酸とタンパク質をクロスリンケージさせた。
　各細胞を洗浄後、RNA ChIP-IT kit（Active motif製）を用いて、細胞の溶解、ＤＮａｓｅ処理、及び抗ＲＮａｓｅ処理を行い、抗ＳＲｐ３０ｃ抗体とprotein G magnetic beads（以下「ビーズ」）で免疫沈降反応（４℃で４時間の反応）を行った。
　続いて、ビーズを回収し洗浄し、脱クロスリンケージ処理を行った。
　表１５に示すプライマーを使用し、ＲＴ－ＰＣＲ法及びＰＣＲ法により、ＳＲｐ３０ｃと結合していたＧＲのプレｍＲＮＡを検出した。ＰＣＲ条件は、初回解離処理を９４℃で２分間行ない、解離（９４℃、３０秒間）、アニーリング（５５℃、３０秒間）、伸長（７２℃、１分間）を３５サイクル行なった。さらに最終伸長を７２℃で４分間行なった。
　なお、表１５に示すプライマーは、ＧＲのプレｍＲＮＡの一部であって、ヒトＧＲ遺伝子の塩基番号１５２８７３～１５３５５６に対応する部位を増幅するように設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　ＰＣＲ後、エチジウムブロマイド添加２％アガロースゲルによる二次元電気泳動でＤＮＡを分離し、バンドの輝度をイメージアナライザー Gel Print 2000i/VGA（Genomic Solutions製）によって数値化した。陽性コントロールの輝度を１としたときの相対値を表１６に示す。なお、実験は３回行い、表１６にはその平均を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表１６に明らかなように、オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞からの抽出物においては、ＳＲｐ３０ｃと結合していたＧＲのプレｍＲＮＡの量が有意に低かった。オリゴヌクレオチド４発現Ｒａｊｉ細胞においては、ＳＲｐ３０ｃとＧＲのプレｍＲＮＡの結合が阻害されていることが確認された。
　２０１１年１２月１５日に出願の日本国出願番号第２０１１－２７４８９７号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (7)

  1. 　生体内において、グルココルチコイド受容体遺伝子のプレｍＲＮＡとセリン／アルギニンリッチ蛋白質３０ｃ（ＳＲｐ３０ｃ）との結合を妨げるオリゴヌクレオチド。
  2. 　配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部に相補的な１５～５０塩基長の塩基配列である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 　前記配列番号２２に示す塩基配列の連続する一部は、アデニンとグアニンの合計のモル比が５０％以上の塩基配列である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 　配列番号１に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    　配列番号２に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    　配列番号３に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    　配列番号４に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、及び、
    　配列番号５に示す塩基配列であるオリゴヌクレオチド、
    のいずれかである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 　請求項１～請求項４に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を有効成分として含むグルココルチコイド感受性増強剤。
  6. 　請求項１～請求項４に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む医薬組成物。
  7. 　請求項１～請求項４に記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含む発現ベクター。
     
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