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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen
zur Behandlung der Duchenne Muskeldystrophie, wobei die pharmazeutischen
Zusammensetzungen so gestaltet sind, dass eine existierende Verschiebung
des Aminosäureleserasters
in der Dystrophin-prä-mRNA durch Induzieren
eines Exon-Skippings in der prä-mRNA,
die das verschobene Leseraster als Folge von Abnormalitäten im Dystrophin-Gen
aufweist, in einer vorherbestimmten Weise korrigiert wird. Die vorliegende
Erfindung betrifft insbesondere eine Splicing-Enhancer-Sequenz (SES) im
Dystrophin-Gen, die zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
zur Behandlung eines speziellen Typs der Duchenne Muskeldystrophie
verwendet werden kann, ebenso wie Antisense-Oligonukleotide gegen
die Splicing-Enhancer-Sequenz und therapeutische pharmazeutische
Zusammensetzungen, die solche Oligonukleotide enthalten.
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Hintergrund
der Erfindung
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Heute
ist eine Diagnostik für
Erbkrankheiten verfügbar,
die von einem abnormalen Spleißen
von prä-mRNA-Molekülen verursacht
sind. Eine bis jetzt nicht nachweisbare Krankheit, die Muskeldystrophie,
hat insofern besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Die Muskeldystrophie
wird in zwei Gruppen unterteilt: die Duchenne Muskeldystrophie (DMD)
und die Becker Muskeldystrophie (BMD). DMD ist eine muskuläre Erbkrankheit
mit der höchsten
Inzidenz, die bei einem von 3.500 lebend geborenen Kindern auftritt.
Patienten mit DMD zeigen zunächst
eine niedrigere Muskelkraft in ihrer Kindheit und leiden dann unter
einem konstanten Fortschreiten einer Muskelatrophie und sterben
tatsächlich
um das Alter von 20. Dies im Gegensatz zu BMD, bei der der Beginn
der Krankheit relativ spät
erfolgt, irgendwann im Erwachsenenalter, und obwohl ein geringer Verlust
der Muskelkraft nach Beginn der Krankheit zu beobachten ist, können die
Patienten ein nahezu normales Leben führen. Es ist bis jetzt kein
Arzneistoff für
eine effektive Behandlung von DMD verfügbar, und deswegen war die
Entwicklung eines Arzneistoffes zu ihrer Behandlung ein langes Bedürfnis für die Patienten
in der gesamten Welt. 1987 wurde das Dystrophin-Gen, das verursachende
Gen von DMD, mittels retrospektiver Genetik herausgefunden, und
es hat sich ebenfalls herausgestellt, dass BMD von einer Abnormalität im selben Dystrophin-Gen
herrührt
(Koenig, M. et al., Cell, 50: 509–517 (1987)).
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Das
Dystrophin-Gen befindet sich in der Subregion 21 des kurzen Arms
des X-Chromosoms. Die Größe des Gens
beträgt
3,0 Mb, das größte bekannte
humane Gen. Trotz seiner beträchtlichen
Größe codieren nur
14-kb Regionen insgesamt des Dystrophin-Gens das gesamte Dystrophin-Protein,
und solche codierenden Regionen sind in nicht weniger als 79 Exons
eingeteilt, die über
das gesamte Gen verteilt sind (Roberts, RG., et al., Genomics, 16:
536–538
(1993)). Das Transkript des Dystrophin-Gens, d.h. prä-mRNA, wird
in die reife 14-kb-mRNA aufgespleißt. Das Gen weist acht unterschiedliche
Promotorregionen auf, die ebenfalls innerhalb des Gens verteilt
sind und diese sind für
die Erzeugung unterschiedlicher mRNAs jeweils verantwortlich (Nishio,
H., et al., J. Clin. Invest., 94: 1073–1042 (1994), Ann, AH. und
Kunkel, LM., Nature Genet., 3: 283–291 (1993), D'Souza, VN. et al.,
Hum. Mol. Genet., 4: 837–842
(1995)). Somit ist das Dystrophin-Gen und sein Transkript strukturell
sehr komplex.
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Die
genetische Diagnose von DMD und BMD wurde in früheren Jahren durch Southern
Blotting unter Verwendung von Fragmenten des Dystrophin-Gens und
dann unter Verwendung von cDNAs als Sonden durchgeführt. Es
hat sich somit gezeigt, dass ungefähr 6/10 der DMD/BMD-Patienten
Abnormalitäten
wie beispielsweise einen umfangreichen Verlust oder eine Vervielfachung
des Dystrophin-Gens aufweisen (Hoffman, EP. und Kunkel, LM., Neuron,
2: 1019–1029
(1989)).
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Die
meisten der Abnormalitäten,
die im Gen bei DMD/BMD-Patienten zu finden sind, war ein Verlust des
Genes mit Größen von
bis zu mehreren kb. Als Abnormalitäten im Dystrophin-Gen durch
Southern Blotting nachgewiesen und auf zwei „Hot-Spots" im Gen konzentriert wurden, wurde eine
Multiplex-PCR für
die genetische Diagnose entwickelt, die bequem eine Deletion unter
Verwendung von zwei PCR-(Polymerasekettenreaktion)-Systemen durch
Fokussieren auf 19 Exons in diesen Hot-Spots identifizieren kann
(Chamberlain, JS., et al., Nucleic Acids Res., 16: 11141–11156 (1988).
Die Multiplex-PCR ist bis heute die populärste Diagnosemethode, weil
sie Resultate in kurzer Zeit ergibt und 98% der genetischen Abnormalitäten nachweisen
kann, die durch Southern Blotting nachweisbar sind.
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Es
ist ein Tiermodell für
DMD bekannt, mdx (mit dem X-Chromosom verbundene Muskeldystrophie)-Mäuse (Bulfield,
G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1189–1192 (1984)).
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Aufgrund
einer Nonsense-Mutation innerhalb Exon 23 von Maus-Dystrophin ist
das Gen in den mdx-Mäusen
inaktiviert, d.h. die Translation wird innerhalb von Exon 23 terminiert.
Kein funktionelles Dystrophin-Molekül wird in mdx-Mäusen exprimiert,
wohingegen eine Spur einer Dystrophin-positiven Muskelfaser histochemisch
nachweisbar ist.
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Zur
Ursache des großen
Unterschieds in den pathologischen Bedingungen, die klinisch zwischen
den beiden Krankheiten DMD und BMD, zu beobachten sind, die sich
beide aus offensichtlich ähnlichen
Abnormalitäten
im selben Dystrophin-Gen ergeben, wurde keine Erklärung gegeben,
bis die sogenannte Frameshift- bzw. Raster-Verschiebungshypothese
vorgestellt wurde (Monaco, AP., et al., Genomics, 2: 90–95 (1988)):
In DMD verursacht eine Teildeletion des Gens eine Verschiebung von
Aminosäure-Leserastern
entlang der Dystrophin-mRNA (d.h. eine Out-of-Frame-Verschiebung)
und ein eventuell auftretendes Stoppcodon bedeutet für die Dystrophin-Synthese
vor ihrem Abschluss das Ende. Im Gegensatz hierzu wird in BMD das
Leseraster intakt gehalten (d.h. in-frame) trotz einer Teildeletion,
die im Gen vorliegt, und ein Dystrophin-Protein wird deswegen synthetisiert,
obwohl es sich in seiner Größe von Wild-Dystrophin unterscheidet.
Die Analysen von Dystrophin in Patientenmuskeln demonstrierte, dass
Dystrophin in DMD verlorengeht, während es in BMD mit einer veränderten
Färbeeigenschaft
auftritt. Zusätzlich
hat sich auf Grundlage eines Vergleichs, der mit den Phänotypen
DMD/BMD mit den Typen der Leseraster gemacht wurde, die von den
jeweiligen Abnormalitäten
im Dystrophin abgeleitet waren, die Raster-Verschiebungshypothese
in mehr als 90% der Patienten als richtig bewiesen.
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Für die Behandlung
einer Muskeldystrophie wurde die Einbringung eines funktionellen
Dystrophin-Gens durch Myoblasten-Implantation oder Verwendung von
Plasmiden oder viralen Vektoren erreicht (Morgan, J., Hum. Gene.
Ther. 5: 165–173
(1994)).
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Die
Dystrophin-positiven Muskelfasern sind ebenfalls bei vielen DMD-Patienten
zu finden (Nicholson, L. et al., J. Neurol. Sci., 94: 137–146 (1989)).
Die Dystrophin-positiven Fasern, die bei DMD-Patienten zu finden
sind, wurden durch Exon-Skipping erzeugt (Klein, C. et al., Am.
J. Hum. Genet., 50: 950–959
(1992)). Im mdx-Mäusen
wurde ein In-frame-Dystrophintranskript
identifiziert, bei dem ein Exon, das eine Nonsense-Hauptmutation
enthielt, geskippt bzw. übersprungen
wurde (Wilton, S. et al., Muscle Nerve, 20: 728–734 (1997)).
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Introns,
die genetische Information einschlossen, die von dem Gen transkribiert
wurde, machen ein Spleißen
zur Entfernung der Introns durch und somit wird reife mRNA erzeugt,
die ausschließlich
aus Exon-Sequenzen besteht. Die reife mRNA wird dann entlang ihrem
Leseraster translatiert, um ein Protein zu synthetisieren, das mit
der genetischen Information, die im Gen codiert ist, strikt inkonsistent
ist. Im Schritt des Spleißens
der prä-mRNA
existiert ein Mechanismus zur präzisen
Unterscheidung von Introns von Exons in der prä-mRNA-Nukleotidsequenz. Für diesen Zweck werden Sequenzen
an Intron-Exon-Grenzen in jedem Gen gemäß bestimmter Regeln konserviert,
die als Konsensus-Sequenzen bekannt sind.
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Konsensus-Sequenzen
sind an drei Orten bekannt: einer Spleiß-Donorstelle am 5'-Ende eines Introns (der
Ort, der eine Exon-Intron-Kreuzung bereitstellt), einen Spleiß-Akzeptorort
bzw. eine Spleiß-Akzeptorstelle am
3'-Ende des Introns
und eine Verzweigungsstelle.
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Für mehrere
Krankheiten wurde berichtet, dass eine Substitution von nur einem
Nukleotid in einer dieser Konsensus-Sequenzen zu einem abnormalen
Spleißen
führen
würde.
Dies zeigt an, dass die Konsensus-Sequenzen die Schlüssel zum
Spleißen
sind (Sakuraba, H. et al., Genomics, 12: 643–650 (1992)).
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Die
Erfinder führten
eine PCR-Diagnose von Dystrophin-Gen-Abnormalitäten bei DMD/BMD-Patienten in
Japan zum ersten Mal durch und zeigten dadurch, dass kein signifikanter
Unterschied zwischen westlicher Bevölkerung und japanischer Bevölkerung
bei der Art der Abnormalitäten
im Gen existiert, d.h. es existiert kein signifikanter Rassenunterschied.
Obwohl die Gen-Abnormalitäten,
die somit durch Gen-Diagnose aufgefunden wurden, ohne Ausnahme groß waren,
die mehrere kb bis mehrere hundert kb-Nukleotide einschlossen, führten weitere
Analysen zum ersten Mal zur Identifizierung der Nukleotidsequenz
des deletierten Teils eines Dystrophin-Gens. Das Ergebnis wurde
zusammen mit dem entsprechenden Fall berichtet, mit dem Namen „Dystrophin
Kobe" (Matsuo, M.
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 170: 963–967 (1990)).
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Der
Fall mit der Gen-Abnormalität
mit dem Namen „Dystrophin
Kobe" ist der DMD-Fall.
Die Ergebnisse dieser Multiplex-PCR-Analysen zeigten, dass keine
Bande entsprechend Exon 19 an dieser erwarteten Position in amplifizierten
Produkten von genomischer DNA zu finden war, was offensichtlich
auf den Verlust von Exon 19 hinweist. Jedoch wurde in einer Reaktion,
die zum Ziel hatte, die Exon-19-Region der genomischen DNA zu amplifizieren,
Exon 19 als das Amplifikationsprodukt nachgewiesen, obwohl es kleiner
als seine normale Größe war,
was darauf hinweist, dass die Krankheit nicht durch eine einfache
Exon-Deletion, die häufig im
Dystrophin-Gen zu beobachten war, mit sich gebracht wurde. Die PCR-Amplifikation
wurde an der Exon-19-Region der Dystrophin-Gene aus den Familienmitgliedern
des Patienten durchgeführt.
Die DNAs von seiner Mutter und jüngeren
Schwester ergaben zusammen mit einer Normalen, ein Amplifikationsprodukt
derselben Größe wie das
Amplifikationsprodukt des Patienten, was darauf hinweist, dass die
Ersteren beiden Träger
dieses abnormalen Gens waren.
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Danach
zeigte das Sequenzieren des abnormalen Amplifikationsproduktes,
das aus dem Patienten gewonnen wurde, dass 52 Nukleotide aus Exon
19 verloren waren, das aus 88 Nukleotiden besteht. Der Verlust dieser
52 Nukleotide in der Exon-Sequenz würde zu einer Verschiebung des
Leserasters in der Dystrophin-mRNA führen (und dieses out-of-frame
machen), wodurch ein Stoppcodon innerhalb von Exon 20 erzeugt wird.
Die Folge der Gen-Diagnose war mit der klinisch gegebenen Diagnose,
nämlich
DMD, konsistent.
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Dystrophin-mRNA
vom Patienten wurde analysiert, um die Wirkung des verlorenen Anteils
von Exon 19 zu überprüfen, der
in Dystrophin Kobe beim Spleißen
identifiziert wurde (Matsuo, M., et al., J. Clin. INvest., 87: 2127–2131 (1991)).
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Zunächst wurde
cDNA unter Verwendung von mRNA aus Leukozyten des Patienten und
reverser Transkriptase hergestellt. Die cDNA wurde dann durch Nested-PCR
amplifiziert. Die Amplifikation einer Region, die Exon 18 bis Exon
20 abdeckte, ergab ein amplifiziertes Fragment, das kleiner als
die Größe war,
die aus der identifizierten Abnormalität im Genom zu erwarten war.
Dies legte eine Möglichkeit
nahe, dass entweder die mRNA einen unterschiedlichen Abnormalitätstyp von
der Abnormalität
in der genomischen DNA aufweist, oder dass einige Unterschiede zwischen
den mRNAs von Leukozyten und den Muskelzellen bestanden. Dann wurde,
um klarzustellen, ob diese mRNA-Abnormalität durch mRNA aus Muskelzellen
geteilt wurde, eine Region, die von Exon 18 bis Exon 20 abdeckte,
durch PCR unter Verwendung von cDNA amplifiziert, die aus mRNA von
den Muskelzellen als Matrize hergestellt wurde. Das gewonnene Produkt
war dasselbe wie das Amplifikationsprodukt der Region, die Exon
18 bis 20 aus Leukozyten abdeckt.
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Darauf
zeigte das Sequenzieren der so gewonnenen kleinen abnormalen Amplifikationsprodukte, dass
die gesamte Exon-19-Sequenz aus der Dystrophin-cDNA des Dystrophin-Kobe-Patienten verlorengegangen
war, wobei Exon 18 direkt mit Exon 20 verbunden war. Dieses Ergebnis
stand nicht mit der Tatsache in Übereinstimmung,
dass die genomische Exon-19-Sequenz
genau 52 Nukleotide nicht aufwies, wobei die anderen 36 Nukleotide
an ihrem Platz verblieben. Dies zeigt an, dass im Dystrophin Kobe
ein Exon-Skipping im Reifungsprozess der prä-mRNA durch Aus-Spleißen der
36 Nukleotide, die in Exon 19 verblieben, stattfand.
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Es
wurde von keiner geringen Anzahl von Fällen berichtet, bei denen ein
Exon-Skipping als Folge einer Abnormalität eines Gens eintritt. Es wurde
zur ersten Mal von den Erfindern berichtet, dass eine Punktmutation
im Dystrophin-Gen ein Exon-Skipping verursachte (Hagiwara, Y., Am.
J. Hum. Genet., 54: 53–61
(1994)). All diese Mutationen des Genes, die ein Exon-Skipping verursachen,
waren solche, die in den Konsensus-Sequenzen zu lokalisieren waren,
die die Spleißstellen
wie vorher erwähnt
bestimmen.
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Im
Gegensatz hierzu wurde in den Konsensus-Sequenzen in Dystrophin
Kobe keine Abnormalität nachgewiesen,
wobei 52 Nukleotide von „innerhalb" des Exons deletiert
aufgefunden wurden. Der Grund für das
Exon-Skipping war in diesem Falle unbekannt.
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Weil
dem Exon-Skipping, das in Dystrophin Kobe gefunden wurde, keine
Abnormalität
in der Primärstruktur
seiner DNA oder prä-mRNA
zugeordnet werden konnte, wurde angenommen, dass die Ursache des Exon-Skippings
in einer Abnormalität
in der Sekundärstruktur
seiner prä-mRNA liegt. Seine
Sekundärstruktur wurde
deswegen anschließend
untersucht. Eine Analyse wurde am Computer unter Verwendung eines
Algorithmus von Zuker et al. durchgeführt, der für die Berechnung der Sekundärstruktur
mit der energetisch stabilsten Bindung der Basen entwickelt wurde
(Matsuo, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 182: 495–500 (1992)).
Gemäß einer
Analyse der 617 Basen, die Nukleotidsequenzen von Wild-Typ Dystrophin
Exon 19 einschließen
und der Introns auf beiden Seiten, wies die prä-mRNA eine relativ einfache Stem-Loop-(Stamm-Schlaufen)-Struktur
auf. Eine charakteristische Intra-Exon Hairpin-Struktur wurde bemerkt, bei der Basenpaare
in der Exon-19-Sequenz selbst hergestellt wurden. Im Gegensatz hierzu
ergab eine Ableitung, die aus der Sekundärstruktur der prä-mRNA aus
einer Sequenz gemacht wurde, die aus dem Dystrophin Kobe Exon mit
der 52 Basen Intra-Exon-Deletion
und den benachbarten Intronen bestand, ein Ergebnis, das sich in
großem
Umfang vom Ergebnis unterschied, das mit dem Wild-Typ gewonnen wurde.
Das erwähnenswer teste
Merkmal bezüglich
Dystrophin Kobe bestand darin, dass es eine einfache Stamm-Struktur aufwies,
bei der die Exon-Sequenz eine Paarbildung nur mit einer Intron-Sequenz
durchführten.
Dieses Ergebnis legte nahe, dass die Intra-Exon Hairpin-Struktur,
die im Wild-Typ zu finden war, der Faktor sein könnte, der die Struktur des
Dystrophin Exons charakterisieren könnte.
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Danach
wurden von den 79 Exons des Dystrophin-Gens 22 Exons ausgewählt, von
denen die Nukleotidsequenzen der jeweiligen benachbarten Introns
bekannt waren und die Sekundärstrukturen
ihrer prä-mRNA
wurde analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle analysierten
Exons eine Intra-Exon Hairpin-Struktur aufwiesen. Somit wurde angenommen,
dass die Intra-Exon
Hairpin-Strukturen essentielle Elemente für die Funktion dieser Exons
waren. Diese Erkenntnisse legten in starker Weise nahe, dass das Exon-Skipping,
das bei Dystrophin Kobe zu finden war, aufgrund der Elimination
der entsprechenden Intra-Exon Hairpin-Struktur in ihrer prä-mRNA eintrat.
Hierdurch wurde ebenfalls nahegelegt, dass einige Exon-Sequenzen
selbst eine bedeutende Rolle bei der Exon-Erkennung während des
Spleißens
spielten.
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Es
wurde kürzlich
davon berichtet, dass zusätzlich
zu einer Abnormalität
in den Konsensus-Sequenzen
eine abnormale Sequenz innerhalb eines Exons ebenfalls ein Exon-Skipping
verursachen könnte
(Dietz, HC., et al., Science, 259: 680–683 (1993)). Somit wurde nicht
nur den Konsensus-Sequenzen, sondern auch Sequenzen innerhalb von
Exons als Faktoren Aufmerksamkeit gezollt, die dazu dienen, Spleißstellen
zu bestimmen. Diese Erkenntnisse erfordern eine Korrektur des konventionellen
Konzepts des Spleißens
in der Molekularbiologie.
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Als
eine Sequenz innerhalb von Exon 19 als für die Bestimmung einer Spleißstelle
wichtig vorgeschlagen wurde, wurde ein in vitro Spleißsystem
konstruiert und ein Test wurde durchgeführt, um diese Möglichkeit zu
bestätigen
(Takeshima, Y., et al., J. Clin. Invest., 95: 515–520 (1995),
japanische Patentanmeldung Nr. H11-140930). Zunächst wurde ein Mini-Gen erzeugt,
das aus den Exons 18 und 19 plus Intron 18 des Dystrophin-Gens bestand.
Eine Radioisotopenmarkierte prä-mRNA
wurde unter Verwendung des Mini-Gens synthetisiert. Die so gewonnene
prä-mRNA
wurde mit einem HeLa-Zellkernextrakt vermischt, um ein in vitro
Spleißen zu
ermöglichen.
So produzierte reife mRNA wurde durch Elektrophorese aufgetrennt.
In diesem Reaktionssystem trat ein Spleißen wie normal bei der prä-mRNA auf,
die das normale Exon 19 aufwies, und ließ eine reife mRNA entstehen,
bei der die Exons 18 und 19 direkt verbunden waren. Wenn das Exon
19 mit demjenigen von Dystrophin Kobe ersetzt wurde, wurde jedoch reife
mRNA nicht erzielt. Dies zeigt, dass die von Exon 19 in Dystrophin
Kobe verlorengegangenen 52 Nukleotide eine bedeutende Rolle beim
Spleißen
aufwiesen.
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Dieses
abnormale Spleißen
jedoch könnte
auf die „Größe" von Exon 19 zurückzuführen sein,
die um 36 Nukleotide verkürzt
war. Somit wurde ein Experiment in derselben Art und Weise unter
Verwendung eines Mini-Gens durchgeführt, bei dem die deletierte
Sequenz von Exon 19 in der umgekehrten Orientierung eingefügt wurde,
um den Verlust wettzumachen. Mit dieser prä-mRNA fand ein Spleißen statt,
jedoch nur mit einer geringen Effizienz. Dieses Ergebnis legte nahe,
dass die Spleiß-Effizienz
mit einer abnormalen Intra-Exon-Sequenz sogar dann gesenkt wird,
wenn ein solches Exon eine normale Größe aufweist, und legte weiterhin
nahe, dass es die Nukleotidsequenz im Exon ist (nicht die Größe), die
entscheidend ist.
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Um
die Wirkung von Intra-Exon-Nukleotidsequenzen auf das Spleißen zu überprüfen, wurden prä-mRNAs synthetisiert,
die eine von zwei unterschiedlichen Sequenzen enthielten, die anstelle
der verlorenen 52 Nukleotide eingefügt wurden, und ihre Effizienz
des Spleißens
wurde bestimmt. Mit zwei prä-mRNAs, die
ein eingefügtes
Fragment des β-Globin-Gens
oder ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthielten, wurde ein Spleißen beobachtet,
jedoch mit einer sehr geringen Effizienz. Die β-Globin-Gen-Insertion jedoch
führte
zu einer relativ hohen Spleißeffizienz
im Vergleich mit der Einfügung
des Ampicillin-Resistenz-Gens. Die frühere Nukleotidsequenz war reich
an Purin-Basen. Eine Purin-dominierte Sequenz innerhalb eines Exons
nimmt angenommenermaßen
an der Exon-Erkennung teil (Watanabe, A., et al., Genes dev., 7:
407–418
(1993)).
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Diese
Ergebnisse der Experimente demonstrieren, dass nicht nur Konsensus-Sequenzen,
sondern auch eine Sequenz innerhalb des stromabwärts gelegenen Exons in das
Spleißen
involviert ist, und führten somit
ein neues Konzept in die Prozessierung bzw. Verarbeitung der genetischen
Information ein.
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Regulation
des Spleißens
mit Antisense-Oligonukleotiden
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Auf
Grundlage der obigen Erkenntnis, dass eine Sequenz innerhalb von
Exon 19 des Dystrophin-Gens für
das Stattfinden eines Spleißens
hoch bedeutend ist, haben die Erfinder eine Studie fortgesetzt,
die sich auf die Möglichkeit
fokussierten, ein künstliches
Spleißen
durch Stören
der Sequenz zu induzieren. Somit wurde eine 2'-O-methyl oligo-RNA synthetisiert, die
zur 31-Nukleotidsequenz komplementär war, die im Sequenzprotokoll
als SEQ ID NO: 2 bezeichnet wird, und die die Nukleotidsequenz einschloss,
die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO: 1 aufgeführt ist,
die wiederum einen Teil der 52-Nukleotidsequenz darstellte, die
in Dystrophin Kobe verloren gegangen war. Unter Verwendung des oben
erwähnten
in vitro Spleißsystems
wurde eine Bestimmung der Wirkung dieser Oligo-RNA auf das Spleißen von
prä-mRNA
gemacht, die aus (Exon 18)-(Intron 18)-(Exon 19) bestand. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Spleißreaktion
abhängig
von der Menge des zugesetzten Antisense-Oligonukleotids gehemmt wurde und abhängig von
der Dauer der Reaktion. Es wurde somit zum ersten Mal experimentell
bewiesen, dass ein Spleißen
von Dystrophin durch ein Antisense-Oligonukleotid gehemmt werden
konnte. Dies legte dann nahe, dass die Spleißreaktion, die im Kern auftrat,
künstlich manipuliert
werden könnte
(Takeshima, Y. et al., J. Clin. Invest., 95: 515–520 (1995)).
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Regulation
des Spleißens
innerhalb des Nucleus
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Um
zu überprüfen, ob
es ebenfalls innerhalb des Nucleus lebender Zellen möglich war,
das Spleißen von
Dystrophin-prä-mRNA
mit dem Antisense-Oligonukleotid zu regulieren, führten die
Erfinder eine Antisense-Oligo-DNA mit einer Nukleotidsequenz in
humane normale Lymphoblastoidzellen ein, die zu der Nukleotidsequenz
komplementär
war, wie sie im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO: 2 dargelegt ist,
die die Nukleotidsequenz einschloss, wie sie in SEQ ID NO: 1 aufgeführt ist,
und untersuchten dann die reife Dystrophin-mRNA, die so in Gegenwart
der Antisense-Oligo-DNA erzeugt wurde (Zacharias A. DP. Et al.,
B. B. R. C., 226: 445–449
(1996)). Kurz gesagt, wurde die Antisense-Oligo-DNA mit LipofectAMINE
gemischt und das Gemisch wurde dem Kulturmedium der Lymphoblastoidzellen
zugesetzt, um die Oligo-DNA in den Kern einzubringen. Es hat sich
als Folge herausgestellt, dass trotz der früheren Ergebnisse, die mit dem
in vitro Spleißsystem
erzielt wurden, ein Überspringen
von Exon 19 in den humanen Lymphoblastoidzellen durch die Antisense-Oligo-DNA
gegen die Nukleotidsequenz von Dystrophin Exon 19 induziert wurde,
was eine mRNA entstehen ließ, bei
der Exon 18 direkt an Exon 20 angeschlossen ist. Eine verlängerte Zeitdauer
der Kultur führte
zu einer vollständigen
Induktion dieses Exon-Skippings, was somit exklusiv eine mRNA bereitstellte,
von der Exon 19 deletiert war. Es wurde ebenfalls bestätigt, dass
ein Spleißprozess
der anderen Exons durch diese Antisense-Oligo-DNA nicht beeinträchtigt wurde.
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Antisense-Oligonukleotide
(AOs) wurden bisher angewendet, um die Gen-Expression durch Hemmung
der Proteintranslation zu regulieren. AOs wurden ebenfalls dazu
verwendet, eine spezielle Region innerhalb einer DNA anzugreifen,
um ihre Transkription durch RNA-Polymerase-II
zu hemmen. Ein weiterer Ansatz war ebenfalls bekannt, bei dem ein
abnormales Spleißen
der prä-mRNA
unter Verwendung eines Antisense-Oligonukleotids gehemmt wurde (japanische
Offenlegungsschrift Patentanmeldung Nr. I-[8-510130). Weil sie die
Ribonuklease-H-Aktivität nicht
induziert, wurde Phosphorothioat-2'-O-methyl Oligonukleotid dazu verwendet,
eine verschobene Spleißstelle
in der prä-mRNA
in Patienten mit einer Thalassämiebasierten
Anämie zu
blockieren, um ein richtiges Spleißen wiederherzustellen.
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Therapeutische
Anwendung einer künstlichen
Induktion des Exon-Skippings
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Wie
oben erwähnt,
ergibt sich die DMD aus einer Abnormalität, die eine Out-of-Frame-Verschiebung der
Aminosäureleseraster
von Dystrophin-mRNA verursacht. Sollte dieses anomale Leseraster
in ein In-Frame-Arrangement umgewandelt werden, dann würde DMD
zu BMD umgewandelt werden, und deswegen würde eine Linderung der Symptome
zu erwarten sein. Unter der Annahme eines Patienten mit einem einfachen Verlust
von Exon 20 beispielsweise wird sein Phänotyp DMD sein, weil der einfache
Verlust von Exon 2, das aus 242 Nukleotiden besteht, natürlicherweise
eine Rasterverschiebung verursachen wird und dadurch die Entstehung
eines Stoppcodons früher
im Translationsprozess ermöglichen
wird, was somit zu einer unvollständigen Dystrophin-Synthese
führt.
Wenn jedoch Exon-19-Skipping künstlich
durch Verabreichung eines Antisense-Nukleotids gegen Exon 19 an
den Patienten induziert werden könnte,
wie beispielsweise eines, das im vorher erwähnten Experiment verwendet
wurde, könnte
das Leseraster wiederum in-frame werden, wegen des Gesamtverlustes
von 330 Nukleotide aus der prä-mRNA
aufgrund des Verlustes von 242 Nukleotiden von Exon 20 plus 88 Nukleotiden
von Exon 19. Deswegen kann zumindest theoretisch DMD zu BMD umgewandelt werden.
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Wie
jedoch oben erwähnt,
ist das Dystrophin-Gen strukturell sehr komplex, und seine prä-mRNA nimmt eine komplexe
Sekundärstruktur
ein, die eine Anzahl großer
Introns, die ausgespleißt
werden müssen, einschließt, wobei
die Sekundärstruktur
die normale Prozessierung des Spleißens reguliert. Deswegen war
die praktische Anwendbarkeit nicht vorhersehbar, weil nicht klar
war, ob das Skipping von Exon 19 wie erwünscht durch ein Antisense- Oligonukleotid gegen
Exon 19 in Myoblasten von einem Patient induziert werden konnte, mit
einer einfachen Deletion von Exon 20 wie in normalen humanen Lymphoblastoidzellen;
ob unter der Annahme, dass das Exon-19-Skipping erfolgreich induziert
wurde, eine Verschiebung des mRNA-Leserasters von der Out-of-Frame-
in die In-Frame-Position stattfinden könnte, ohne das Ausspleißen von
Exon 20 oder das Spleißen
an anderen Stellen in der prä-mRNA zu beeinträchtigen,
die bereits eine Abnormalität
aufwiesen, die zu einem Ausspleißen von Exon 20 führte; oder,
ob unter der Annahme, dass eine In-Frame-Konversion erreicht wurde,
so erzeugte mRNA dazu dienen könnte,
effizient ein Dystrophin-artiges Protein zu erzeugen.
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Vor
diesem Hintergrund demonstrierte einer der Erfinder, dass das Ausspleißen von
Exon 19 mit einem Antisense-Oligonukleotid gegen Exon 19 in den
Zellen eines DMD-Patienten mit einem vollständigen Verlust von Exon 20
in einer reifen Dystrophin-mRNA induziert werden konnte, und dass
die bestehende Verschiebung des Leserasters entlag der reifen Dystrophin-mRNA deswegen korrigiert
werden konnte, wodurch die Dystrophin-negativen Zellen zu positiven
umgewandelt wurden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Mittel
zur Behandlung von DMD offenbart (japanische Offenlegungsschrift
Patentanmeldung Nr. 11-140930).
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Es
wurde somit demonstriert, dass ein Antisense-Oligonukleotid, wenn
es dem Kulturmedium von Myoblasten aus einem DMD-Patienten mit einem
einfachen Verlust von Exon 20 zugesetzt wurde, gegen Dystrophin
Exon 19 in die Myoblasten inkorporiert wurde und danach in den Kern
eingebaut wurde und zur Wiederherstellung des Leserasters führte, das
sich nunmehr zurück
in die In-Frame-Position aus der früheren Out-of-Frame-Position
umwandelte, obwohl sie einen vollständigen Verlust von Exon 19
und 20 aufwies, wodurch ein Dystrophin mit voller Länge erzeugt
wurde, außer
des deletierten Teils, der durch Exons 19 und 20 codiert war. Dieses
Ergebnis legt stark die Möglichkeit
nahe, dass durch Verabreichung eines Antisense-Oligonukleotids gegen Exon 19 an einen
DMD-Patienten, der einen einfachen Verlust von Exon 20 aufweist,
der sehr ernsthafte DMD-Fall in einen milderen BMD-Fall umgewandelt
werden kann.
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Deswegen
spielt zusätzlich
zu den bisher bekannten Konsensus-Sequenzen, die sich an den Exon-Intron-Grenzen
befinden, eine Spleiß-Enhancer-Sequenz
(SES) innerhalb des Exons eine bedeutende Rolle bei der Bestimmung
des Ortes des Spleißens,
wenn eine prä-mRNA,
transkribiert aus dem Genom, in eine reife mRNA aufgespleißt wird.
Wie vorher erwähnt,
identifi zierte einer der Erfinder ein SES in Exon 19 und demonstrierte
weiterhin, dass ein Antisense-Oligonukleotid
gegen das SES ein Skipping von Exon 19 induzieren kann.
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In
weiteren Studien identifizierten die Erfinder durch Verwendung eines
in vitro Spleißsystems
erfolgreich neue SES, die als SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 im Sequenzprotokoll
innerhalb der Dystrophin-Exons 43 und 53 dargelegt waren. Auf Grundlage
solcher SES-Sequenzen wurden therapeutische Mittel für Duchenne-Muskeldystrophie
erzeugt, die Antisense-Oligonukleotide
enthalten, die hierzu komplementär
sind, insbesondere, Antisense-Oligonukleotide,
die die Nukleotidsequenzen umfassen, die als SEQ ID NO: 5 und 6
im Sequenzprotokoll dargelegt sind (japanische Patentanmeldung Nr.
2000-125448 (fallengelassen) und japanische Patentanmeldung Nr.
2000-348957 (unveröffentlicht),
bei denen eine Priorität
auf Grundlage der früheren Anmeldung
beansprucht wurde). Diese Mittel sind zur Behandlung des Typs von
Duchenne-Muskeldystrophie vorgesehen, der durch eine Veränderung
der Anzahl der Nukleotide in den Nukleotidsequenzen verursacht ist, die
ein oder mehrere Exons benachbart in Exons 43 oder 53 im humanen
Dystrophin-mRNA codieren, wobei das Netto der Veränderung
in der Anzahl der Nukleotide als Verlust von (3 × N + 1) Nukleotiden ausgedrückt wird,
wobei N Null ist oder eine natürliche
Zahl.
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Somit
wird es durch Korrigieren der existierenden Verschiebung des Leserasters
durch Induktion eines Exon-Skippings im Prozess des Spleißens von
Dystrophin-prä-mRNA
möglich
sein, DMD zu BMD umzuwandeln, wobei bei Letzterem ein Dystrophin-Protein
mit einer teilweise wiederhergestellten Funktion erzeugt wird. Jedoch
wird eine Vielzahl von Mutationsorten im Dystrophin-Gen existieren,
die zu DMD führen.
Deswegen ist es zur Bereitstellung einer Behandlung für DMD, die
durch die jeweiligen Mutationen verursacht ist, notwendig, SES in
früheren
Exons zu identifizieren und dadurch ihre jeweiligen Antisense-Oligonukleotide
bereitzustellen. Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, das
SES in Exon 45 zu identifizieren und danach ein Mittel zur Behandlung
von DMA durch Induzieren eines Exon-45-Skippings bereitzustellen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Nach
dem oben genannten Hintergrund identifizierten die Erfinder erfolgreich
ein neues SES innerhalb von Exon 45 des Dystrophin-Gens und erzeugten
danach ein neues Mittel zur Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie.
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Somit
stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes und aufgereinigtes
Oligonukleotid bereit, ausgewählt
aus der Gruppe, die aus einer DNA besteht, die die Nukleotidsequenz
umfasst, dargelegt als SEQ ID NO: 15 im Sequenzprotokoll und eine
RNA, die die Nukleotidsequenz umfasst, die zur Nukleotidsequenz
komplementär
ist, die wiederum zur Nukleotidsequenz komplementär ist, die
in SEQ ID NO: l 5 im Sequenzprotokoll dargelegt ist.
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Die
RNA funktioniert als SES innerhalb von Exon 45 von humaner Dystrophin
prä-mRNA.
Die DNA und RNA werden als Matrizen zur Erzeugung von Antisense-Nukleotiden
als therapeutische Mittel für
eine Art von Duchenne-Muskeldystrophie verwendet, die unten diskutiert
wird. Die DNA oder RNA kann zumindest bis zu einem solchen Grade
isoliert werden, der erforderlich ist, um eine Präparierung
bzw. Herstellung eines Antisense-Oligonukleotids zu ermöglichen,
das zu der in SEQ ID NO: 15 dargelegten Sequenz komplementär ist, unter
Verwendung der DNA oder RNA als Matrize.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes und aufgereinigtes
Antisense-Oligonukleotid bereit,
das die Nukleotidsequenz umfasst, die zur Nukleotidsequenz komplementär ist, die
im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 15 dargelegt ist.
-
Die
Antisense-Oligonukleotide können,
wenn sie verabreicht werden, ein Skipping bzw. Überspringen von Exon 45 im
Spleißprozess
von humaner Dystrophin-mRNA induzieren, weil sie zu SES innerhalb
von Exon 45 von humanem Dystrophin-mRNA komplementär sind.
Deswegen sind diese Antisense-Oligonukleotide als therapeutische
Mittel gegen eine spezielle Art von Duchenne-Muskeldystrophie von
Nutzen, auf Grundlage der Korrektur der Verschiebung des Leserasters.
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Das
Antisense-Oligonukleotid kann eine DNA oder Phosphorothioat-DNA
sein, die die Nukleotidsequenz umfasst, die als SEQ ID NO: 19 im
Sequenzprotokoll dargelegt ist. Die Sequenz ist zu SES komplementär und zu
den flankierenden Sequenzen auf beiden Seiten hiervon innerhalb
von Exon 45. Deswegen hybridisiert die DNA (oder Phosphorothioat-DNA),
die die Sequenz von Interesse umfasst, mit den Exon-45-SES in der
prä-mRNA
stärker,
um seine Funktionen zu blockieren.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung eines isolierten
und aufgereinigten Antisense-Oligonukleotids bereit, das die Oligonukleotidsequenz
umfasst, die zur Nukleotidsequenz komplementär ist, die als SEQ ID NO: 15
im Sequenzprotokoll dargelegt ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zur Behandlung der Duchenne-Muskeldystrophie, die durch eine Veränderung
der Anzahl der Nukleotide in den Nukleotidsequenzen verursacht ist,
die ein oder mehrere Exons benachbart zu Exon 45 in humaner Dystrophin-mRNA
aufgrund der Deletion einer oder mehrerer Nukleotide aus den normalen
Nukleotidsequenzen verursacht ist, wobei die Nettoveränderung
der Anzahl der Oligonukleotide als Verlust von (3 × N + 1)
Nukleotiden ausgedrückt
wird, wobei N Null oder eine natürliche
Zahl ist. Das Antisense-Oligonukleotid kann die DNA oder Phosphorothioat-DNA
sein, die die Nukleotidsequenz umfasst, wie sie in SEQ ID NO: 19
im Sequenzprotokoll dargelegt ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine therapeutische pharmazeutische
Zusammensetzung bereit, die eine dieser isolierten und aufgereinigten
Antisense-Nukleotide gegen Exon-45-SES
in einem pharmazeutisch verträglichen
injizierbaren Medium umfasst. Die therapeutisch pharmazeutische
Zusammensetzung wird für
einen Typ von Duchenne-Muskeldystrophie verwendet, die durch eine
Veränderung
der Anzahl der Nukleotide in den Nukleotidsequenzen verursacht ist,
die ein oder mehrere Exons codieren, die Exon 45 in der humanen
Dystrophin-mRNA
benachbart sind, aufgrund der Deletion einer oder mehrerer Nukleotide
aus den normalen Nukleotidsequenzen, wobei die Nettoveränderung
der Anzahl der Nukleotide als Verlust von (3 × N + 1) Nukleotiden ausgedrückt wird,
wobei N Null oder eine natürliche
Zahl ist.
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Deswegen
stellt die vorliegende Erfindung weiterhin die Behandlung eines
humanen Patienten mit Duchenne Muskeldystrophie bereit, die durch
eine Veränderung
der Anzahl der Nukleotide in den Nukleotidsequenzen verursacht ist,
die ein oder mehrere Exons benachbart zu Exon 45 in humaner Dystrophin-mRNA
codieren, aufgrund einer Deletion ein oder mehrerer Nukleotide aus
den normalen Nukleotidsequenzen, wobei die Nettoveränderung
in der Anzahl der Nukleotide als Verlust von (3 × N + 1) Nukleotiden ausgedrückt ist, wobei
N Null oder eine natürliche
Zahl ist, wobei die Verwendung die Verabreichung einer therapeutisch
wirksamen Menge eines isolierten und aufgereinigten Antisense-Oligonukleotids
umfasst, das die Nukleotidsequenz umfasst, die zur Nukleotidsequenz
komplementär
ist, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 15 bezeichnet wird,
in einem pharmazeutisch akzeptablen injizierbaren Medium. In der
Behandlung wird das Antisense-Oligonukleotid aus der Gruppe ausgewählt, die
aus ei ner DNA oder Phosphorothioat-DNA besteht, die die in SEQ ID
NO: 15 im Sequenzprotokoll dargelegte Nukleotidsequenz umfasst.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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In
der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff „Oligonukleotid" nicht nur Oligo-DNA
und Oligo-RNA ein, sondern auch Phosphorothioat-Analoga, wie beispielsweise
Phosphorothioat-Oligo-DNA.
Phosphorothioat-DNAs sind Nukleotide, bei denen ein oder mehrere
Sauerstoffatome in der Phosphatgruppe durch Schwefelatome ersetzt
werden. Sie sind Nukleotidanaloge, die gegenüber verschiedenen Nukleotid-abbauenden
Enzymen resistenter sind und deswegen in breitem Maße auf dem
Gebiet der Gentechnik verwendet werden, beispielsweise für eine ortsspezifische
Substitution in Genen. Phosphorothioat-DNAs bilden Basenpaare in
derselben Weise wie natürliche
DNAs, sind jedoch gegenüber
verschiedenen abbauenden Enzymen resistenter. Deswegen kann Phosphorothioat-DNA
in der vorliegenden Erfindung mit speziellem Vorteil verwendet werden. „Phosphorothioat-Analoga" bedeutet hierin
eine Struktur, bei der ein oder mehrere Phosphodiestergruppen zwischen
den Nukleotiden in einer DNA-Kette durch Phosphorothioatgruppen
ersetzt sind.
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Die
therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung umfasst vorzugsweise 0,05 bis 5 μmol/ml des Antisense-Oligonukleotids,
0,02 bis 10 g/v-% zumindest eines Kohlenhydrats oder Polyalkohols
von 0,01 bis 0,4 g/v-% zumindest eines pharmazeutisch verträglichen
oberflächenaktiven
Stoffes. Vorzugsweise ist das Antisense-Oligonukleotid zu 0,1 bis
1 μmol/ml
enthalten.
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Für die obigen
Kohlenhydrate sind insbesondere bevorzugt Monosaccharide und/oder
Disaccharide. Beispiele für
die Kohlenhydrate und Polyalkohole schließen Glucose, Galactose, Mannose,
Lactose, Maltose, Mannitol und Sorbitol ein. Sie können alleine
oder in Kombination verwendet werden.
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Beispiele
für bevorzugte
oberflächenaktive
Stoffe bzw. Tenside schließen
Polyoxyethylensorbitanmono- bis -tri-ester, Alkylphenylpolyoxyethylen,
Natriumtaurocholat, Natriumcholat und Polyalkoholester ein. Ein besonders
bevorzugtes ist Polyoxyethylensorbitanmono- bis -triester und besonders
bevorzugte Ester sind Oleat, Laurat, Stearat und Palmitat. Sie können alleine
oder in Kombination verwendet werden.
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Die
therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung umfasst besonders bevorzugt 0,03 bis 0,09 M zumindest
eines pharmazeutisch verträglichen
neutralen Salzes wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid
und/oder Calciumchlorid etc.
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Die
therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung kann besonders bevorzugt weiterhin 0,002 bis 0,05 M eines
pharmazeutisch verträglichen
Puffermittels enthalten. Beispiele für bevorzugte Puffermittel schließen Natriumcitrat,
Natriumglycinat, Natriumphosphat und Tris(hydroxymethyl)aminomethan
ein. Solche Puffermittel können
alleine oder in Kombination verwendet werden.
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Die
obige therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung kann in flüssigen Formen
zugeführt werden.
Jedoch unter Berücksichtigung
von Fällen,
bei denen diese für
eine bestimmte Zeitspanne gelagert werden soll, wird allgemein bevorzugt,
dass diese in einer lyophilisierten bzw. gefriergetrockneten Form
bereitgestellt werden, um das Antisense-Oligonukleotid zur Vermeidung
einer Verringerung seiner therapeutischen Aktivität zu stabilisieren.
Vor der Anwendung wird eine derartige Zusammensetzung rekonstituiert,
d.h. wird in flüssige
Form zur Injektion zurückgeführt, durch
Verwendung eines Lösungsmittels
wie beispielsweise injizierbaren destillierten Wassers. Deswegen
schließt
die therapeutische pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung eine derartige Zusammensetzung ein, die in lyophilisierter
Form bereitgestellt wird, die zur Rekonstitution bzw. Wiederherstellung
entwickelt wurde, um Konzentrationen ihrer Inhaltsstoffe zu ergeben,
die in vorherbestimmte Bereiche fallen, vor Verabreichung an den
Patienten. Zur Erhöhung
der Solubilität bzw.
Löslichkeit
derartiger lyophilisierter Zusammensetzungen können Albumin oder Aminosäuren wie
Glycin zugesetzt werden. Bei der Entwicklung der lyophilisierten
Zusammensetzung können
Lösungsmittel
zur Rekonstitution injizierbares destilliertes Wasser sein oder
sie kann einige Inhaltsstoffe enthalten, die vom Antisense-Oligonukleotid
der therapeutischen pharmazeutischen Zusammensetzung verschieden
sind.
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Die
vorliegende Erfindung wird nunmehr ausführlich unten unter Bezugnahme
auf eine Testreihe, die durchgeführt
wurde, beschrieben.
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1. Induktion eines Exon-Skippings
in Lymphoblastoidzellen, die von einem Patienten stammen
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Wie
vorher erwähnt,
wurde bestätigt,
dass Antisense-Oligonukleotide gegen die Nukleotidsequenz von Dystrophin
Exon 19 (Vergleichsbeispiel) ein Skipping des Exons in der Spleißreaktion
auf der prä-mRNA, die
aus dem Dystrophin-Gen mit normaler Struktur transkribiert wurde,
effizient induziert. Es wird andererseits erwartet, dass die Dystrophin-prä-mRNA eines
DMD-Patienten mit einem deletierten Exon 20 eine abnormale Sekundär- oder
Tertiärstruktur
aufwies, weil seine Gen-Struktur von derjenigen eines normalen Gens
verschieden war. Somit wurde eine Studie durchgeführt, um
zu überprüfen, ob
das oben erwähnte
31-Basen-Antisense-Oligonukleotid
tatsächlich
bei einem solchen DMD-Patienten funktionieren würde. Kurz gesagt, wie es ausführlich unten
beschrieben werden wird, wurden EB-Virus-transformierte Lymphoblastoidzelllinien
aus zwei DMD-Patienten etabliert, denen das Dystrophin Exon 20 fehlte.
Unter Verwendung dieser Zelllinien wurde bestätigt, dass das Antisense-Oligonukleotid
ein Exon-Skipping induzieren kann.
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(a) Etablieren von Lymphoblastoidzelllinien
aus DMD-Patienten
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EB-Virus-transformierte
Lymphoblastoidzelllinien wurden wie folgt aus zwei DMD-Patienten
etabliert, denen das Dystrophin Exon 20 fehlte: 2 ml Ganzblut, das
jedem der Patienten entnommen wurde, wurde mit 2 ml RPMI1640-Medium
(ergänzt
mit 10% FBS) vermischt und auf 3 ml Ficoll Paque (Pharmacia) aufgeladen und
danach einer Dichtegradientenzentrifugation unterworfen. Die Lymphozytenschicht
wurde dann selektiv gesammelt, zweimal mit RPMI1640-Medium (ergänzt mit
10% FBS) gewaschen und in 0,5 ml RMPI1640-Medium (ergänzt mit
10% FBS) suspendiert, so dass sich eine Lymphozytensuspension ergab.
Diese Suspension wurde mit einer 0,5 ml EB-Viruslösung gemischt,
die vorher hergestellt wurde, und das Gemisch wurde bei 37°C für eine Woche
kultiviert. Eine Woche später
wurde die Kultur mit RPMI1640-Medium (ergänzt mit 10% FBS) gewaschen,
um das EB-Virus zu entfernen, und die Kultur wurde mit demselben
Medium fortgesetzt. Somit wurden die Lymphozyten aus den Patienten
mit EB-Virus infiziert und ergaben morphologisch große Lymphoblastoidzellen.
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(b) Einführung eines
Antisense-Oligonukleotids
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Die
oben gewonnene Kultur von Lymphoblastoidzelllinien wurde zentrifugiert,
um zelluläre
Bestandteile abzutrennen. Die Zellen wurden bei 36°C für 5 Stunden
in einem Aufrechterhal tungsmedium kultiviert, das ungefähr 200 nM
(200 pmol/ml) Antisense-Oligo-DNA enthielt, die aus einer 31-Nukleotidsequenz
bestand, die zur Nukleotidsequenz komplementär war, wie sie in SEQ ID NO:
2 im Sequenzprotokoll dargelegt ist, und 2% fötales Rinderserum (FBS). Das
Medium wurde dann durch ein Serummedium ersetzt und die Kultur wurde
für zusätzliche
12 Stunden fortgesetzt. Nach der Kultur wurden die Zellen gesammelt
und Gesamt-RNA in herkömmlicher
Weise extrahiert.
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(c) Analyse der Dystrophin-cDNA
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Unter
Verwendung der somit gewonnenen vollständigen RNAs als Matrizen wurden
cDNAs in einer herkömmlicher
Weise durch reverse Transkriptase mit zufallsbedingten Oligonukleotidprimern
synthetisiert, die aus Hexaoligonukleotiden bestanden. Unter Verwendung
der so gewonnenen cDNAs wurde eine Region, die das Dystrophin Exon
18 bis Exon 21 abdeckte, durch Nested-PCR amplifiziert. Der erste
Amplifikationszyklus wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die
für Exon
18 und Exon 21 entwickelt wurden. Unter Verwendung dieses Amplifikationsproduktes
als Matrize wurde die zweite PCR mit Primern ausgeführt, die
so aufgebaut waren, dass sie zu inneren Regionen von solchen passten,
die für
die ersten Primer entwickelt wurde. Diese Amplifikation wurde mit
einer Annealing-Temperatur, die auf 60°C eingestellt war, durchgeführt.
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(d) Bestätigung eines
Exon-19-Skippings
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Die
Amplifikation der Region, die Exon 18 bis Exon 21 von Dystrophin-cDNA
abdeckt, ergab, wenn sie ohne Zusatz des Antisense-Oligonukleotids
durchgeführt
wurde, eine klare Bande von 384 Basenpaaren. Eine Sequenzierung
dieses Amplifikationsproduktes in einer üblichen Weise bestätigte, dass
es aus den Exons 18, 19 und 21 bestand. Dies war mit dem Ergebnis
einer Gen-Analyse konsistent, die bei den Patienten durchgeführt wurde.
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Andererseits
wurde auch unter Verwendung von cDNA, die aus den Zellen, die mit
der Antisense-Oligo-DNA behandelt wurden, ein kleineres Amplifikationsprodukt
mit einem intakten Leseraster seit dem vierten Tag der Kultur gewonnen,
zusammen mit einem Amplifikationsprodukt mit derselben Größe als eines,
das aus den Zellen gewonnen wurde, denen keine Antisense-Oligo-DNA
zugesetzt wurde. Durch dasselbe Verfahren ergaben die Lymphoblastoidzellen,
die aus Fall 2 etabliert wurden, ebenfalls zwei Typen von Banden.
Eine Sequenzierung der kleineren dieser Amplifikationsprodukte zeigte,
dass Exon-18-Sequenz direkt zu derjenigen von Exon 21 verbunden
war, wobei die Exons 19 und 20 beide deletiert werden. Dies zeigt,
dass die Behandlung mit dem Antisense-Oligonukleotid ein Skipping
von Exon 19 verursachte. Andererseits ergaben Lymphoblastoidzellen,
die aus einem normalen Donor etabliert waren, nur ein kleines Amplifikationsprodukt,
bei dem Exon nur 19 nur übersprungen
wurde. Die Überprüfung, die
an der Ganz-Dystrophin-cDNA durchgeführt wurde, die in 10 Antikörperregionen
amplifiziert wurde, ergab kein Fragment, was eine weitere Abnormalität beim Spleißen nahelegt.
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(e) Diskussion
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Der
beobachtete Unterschied beim Exon-Skipping-induzierenden Effekt
des Antisense-Oligonukleotids
zwischen dem normalen Patienten und dem DMD-Patienten schien einen
Unterschied in der Sekundär- oder
Tertiärstruktur
bei oder um Exon 19 der prä-mRNA
herum zuschreibbar zu sein. Die Effizienz der Exon-Skipping-Induktion
wurde weiterhin für
die DMD-Patienten durch Anwenden des Antisense-Oligonukleotids bei
verschiedenen Konzentrationen bestimmt. Jedoch ließ sich kein
Zustand bzw. keine Bedingung finden, unter denen alle Transkripte
ein Exon-Skipping durchmachten, wie es in den Fällen gezeigt ist, die aus dem
normalen Subjekt abgeleitet wurden. Diese Induktion, die mit dem
Antisense-Oligonukleotid beobachtet wurde, wurde nicht bei einem
Antisense-Oligonukleotid oder mit Antisense-Oligonukleotiden gegen andere Regionen
beobachtet.
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass es möglich
ist, das Leseraster der Dystrophin-prä-mRNA durch Induzieren eines
Exon-Skippings durch Manipulation seines Spleißprozesses zu korrigieren.
Es war bisher jedoch unbekannt, ob eine mRNA mit einem Aminosäureleseraster,
das durch eine solche Korrektion wiederhergestellt wurde, effizient
das Protein ebenfalls in Muskelzellen effizient synthetisieren könnte.
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2. Expression
des Dystrophin-artigen Proteins in Muskelzellen von DMD-Patienten
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Danach
wurde eine Überprüfung durchgeführt, ob
ein Dystrophin-artiges Protein in Myoblasten von einem DMD-Patienten
exprimiert werden würde,
dem Exon 20 fehlte (Vergleichsbeispiel).
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(a) Etablierung einer
Muskelzelllinie von DMD-Patienten
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Eine
Probe eines Muskelgewebes wurde aseptisch einem Patienten entnommen,
dem das Dystrophin-Gen Exon 20 fehlte. Das Gewebe wurde zerhackt
und trypsinisiert, um dissoziierte Zellen zu ergeben. Die Zellen
wurden gewaschen und danach in einem Wachstumsmedium kultuviert
(Ham-F10 ergänzt
mit 20% FCS und 0,5% Hühnerembryoextrakt).
Zur Subkultivierung wurden die Muskelzellen auf Objektträgern kultiviert,
die in Kulturschalen angeordnet waren. Wenn der Anteil an Myoblasten
ungefähr
80% erreichte, wurde das Medium mit Fusionsmedium (DMEM, ergänzt mit
2% HS) ergänzt,
um eine Differenzierung in Muskelzellen zu induzieren.
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(b) Einführung einer
Antisense-Oligo-DNA
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Am
vierten Tag der Induktion der Differenzierung wurde Antisense-Oligo-DNA
(200 pmol) in die Zellen unter Verwendung von LipofectAMINE (6 μl) eingebracht
und weiter für
3, 7 und 10 Tage kultiviert.
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(c) Immunhistochemische
Färbung
von Dystrophin
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Nach
den jeweiligen Inkubationen wurden die Zellen einer immunhistochemischen
Färbung
unter Verwendung eines Antikörpers
gegen den C-Terminus von Dystrophin unterworfen. Als Ergebnis hat
sich herausgestellt, dass die Dystrophin-Färbung in den Zellen positiv
wurde, in denen keine Dystrophin-Färbung initial nachgewiesen
wurde. Dystrophin-positive Zellen waren in jeder der Kulturen zu
finden. Zusätzlich
ergab die Färbung
mit einem Antikörper
gegen den N-terminalen Bereich von Dystrophin ebenfalls ein ähnliches
Ergebnis mit demjenigen, das mit dem C-terminalen Färben erzielt
wurde, was somit bestätigt,
dass das erzeugte Protein sich vom N-Terminus bis zum C-Terminus
von Dystrophin erstreckte.
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Während die
Dystrophin-Färbung
sich somit in den Myoblasten positiv färbte, die mit der Antisense-Oligo-DNA
behandelt waren, blieb die Dystrophin-Färbung in Myoblasten negativ,
die teilweise, jedoch ohne Zusatz der Antisense-Oligo-DNA behandelt
wurden.
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(d) Analyse der Dystrophin-cDNA
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RNA
wurde in einer konventionellen Weise aus der obigen Myoblastenkultur
extrahiert, der Antisense-Oligo-DNA zugesetzt wurde. Nach der Synthese
der cDNA aus der RNA, die so gewonnen wurde, wurde eine Region amplifiziert,
die die Dystrophin-Exons 18 bis 21 abgedeckte, wie oben beschrieben,
bezüglich
der Extraktion von RNA aus Lymphoblastoidzellen.
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Das
Amplifikationsprodukt, das somit gewonnen wurde, wurde dann durch
ein konventionelles Verfahren sequenziert. Als Folge wurde seit
dem vierten Tag der Kultur das In-Frame-Amplifikationsprodukt gewonnen, bei
dem das Aminosäureleseraster
durch direkte Verbindung der Exon-18-Sequenz an die Exon-21-Sequenz
wiederhergestellt wurde.
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Danach
wurde die gesamte Region der cDNA, die aus den Myoblasten hergestellt
wurde, kultiviert mit der Antisense-Oligo-DNA, durch PCR in 10 unterschiedlichen
Anteilen separat amplifiziert. So gewonnene amplifizierte Fragmente
wurden einer Elektrophorese unterworfen, um ihre Größe in einer
konventionellen Art und Weise zu bestimmen. Als Folge war kein Fragment
zu finden, was ein abnormales Spleißen nahelegt, außer dem
Skipping der Exons 19 und 20. Diese Ergebnisse zeigen, dass die
erzielte reife Dystrophin-mRNA eine bezüglich des Leserasters wiederhergestellte,
Volle-Länge-mRNA
war, außer
dem Gesamtverlust der Exons 19 und 20.
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3. Transfer von Antisense-Oligo-DNA
in den Kern (Vergleichsbeispiel)
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Danach
wurde für
einen Beweis, der die Tatsache stützt, dass die Antisense-Oligo-DNA
tatsächlich
in den Kern bzw. Nucleus eingetreten ist und dort funktionierte,
eine Fluoreszenzmarkierte Antisense-Oligo-DNA verwendet und ihr
Transfer in den Kern wurde überwacht.
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Die
Antisense-Oligo-DNA, die oben verwendet wurde, wurde mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) durch
ein konventionelles Verfahren markiert, und ihr Transfer in den
Kern wurde überwacht.
Kurz gesagt, wurden Muskelzellen von einem DMD-Patienten in einem
Wachstumsmedium (Ham-F10 ergänzt
mit 20% FCS und 0,5% Hühnerembryoextrakt)
kultiviert. Die Kultur wurde auf Objektträgern durchgeführt, die
in Kulturschalen angeordnet wurden. Wenn die Zellen semikonfluent
waren, wurde das Medium mit Fusionsmedium ergänzt (DMEM ergänzt mit
2% HS), um die Differenzierung in den Muskelzellen zu induzieren.
Am vierten Tag der Induktion der Differenzierung wurde die FITC-markierte
Antisense-Oligo-DNA (200 pmol) in die Zellen unter Verwendung von
LipofectAMINE (6 μl)
eingebracht, und 1, 2, 3, 7 und 10 Tage später wurde eine Lokalisierung von
FITC überwacht.
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Als
Folge wurden Fluoreszenzsignale nachgewiesen, die im Kern lokalisiert
waren. Dies stellt eine Stützung
dafür bereit,
dass die Antisense-Oligo-DNA in den Kern eindrang und ein Skipping
bzw. Uberspringen des Spleißens
von Exon 19 verursachte.
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Wie
durch die obigen Ergebnisse der Experimente demonstriert, ist es
möglich,
Myoblasten eines DMD-Patienten herzustellen, um ein Protein zu synthetisieren,
das einem Dystrophin entspricht, in dem das Leseraster der Aminosäuren in
In-Frame-Position wiederhergestellt wird. Dies zeigt, dass es möglich ist,
Patienten mit sehr ernsthafter, bis jetzt nicht heilbarer DMD, insbesondere
solche mit einem einfachen Verlust von Exon 20, zu milderen BMD-Patienten umzuwandeln.
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4. Intraperitoneale Verabreichung
von Antisense-Oligonukleotid an mdx-Mäuse (Vergleichsbeispiel)
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Männliche
6 bis 8 Wochen alte mdx-Mäuse
wurde intraperitoneal 20 mg/kg Antisense-Oligonukleotid gegen Dystrophin-mRNA-Exon-19
injiziert. 2, 4, 7 und 14 Tage nach der intraperitonealen Verabreichung
wurden Gewebsproben aus Herz- und Skelettmuskeln der Mäuse entnommen
und die mRNAs, die darin enthalten waren, wurden in konventioneller
Art und Weise extrahiert. Unter Verwendung der mRNAs als Matrizen
wurde eine Region, die die Exons 18 bis 20 von Dystrophin-mRNA abdeckte,
durch RT-PCR amplifiziert, und die Amplifikationsprodukte wurden
durch Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Das Ergebnis zeigte klar,
zwei Tage nach der Verabreichung, dass ein Nukleotidfragment erzeugt
wurde, das nur aus den Exons 18 und 20 bestand, wobei Exon 19 übersprungen
wurde, bei beiden, den Herz- und Skelettmuskelproben. Das Fragment
war noch, obwohl schwächer,
vier Tage nach der Verabreichung zu bemerken. Die Ergebnisse zeigen,
dass ein Antisense-Oligonukleotid gegen ein Exon in Dystrophin-prä-mRNA ein
Skipping des Exons in Herz- und Skelettmuskelzellen induziert, nicht
nur in in vitro Tests sondern auch in einem ganzen Tier, das das
Antisense-Oligonukleotid
durch Injektion empfing.
-
Um
die Lokalisierung des verabreichten Antisense-Oligonukleotids im
Skelettmuskel über
die Zeit hinweg zu überprüfen, wurden
mdx-Mäusen
intraperitoneal 20 mg/kg des FITC- markierten Antisense-Oligonukleotids
verabreicht und 2, 4, 7 und 14 Tage nach der Verabreichung wurden
Gewebsproben aus dem Skelettmuskel der Mäuse entnommen und durch ein
Fluoreszenzmikroskop überprüft. Als
Ergebnis wurden die Zellmembranen der Skelettmuskelzellen zwei Tage
nach der intraperitonealen Verabreichung der FITC-markierten Antisense-Oligonukleotide Fluoreszenz-positiv
aufgefunden. Ab vier Tagen nach der Verabreichung wurde eine Fluoreszenz
ebenfalls im Kern der Muskelzellen beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt,
dass das injizierte Oligonukleotid auf den Kern der Muskelzellen übertragen
wurde.
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Um
die Dosis-Wirkungsrelation des Antisense-Oligonukleotids zu untersuchen,
wurde dmx-Mäusen intraperitoneal
0,2, 2, 20 oder 200 mg/kg jeweils des Antisense-Oligonukleotides
intraperitoneal verabreicht. Zwei Tage nach der Verabreichung wurden
die Gewebsproben aus den Herz- und Skelettmuskeln entnommen und
die mRNAs, die enthalten waren, wurden in einer konventionellen
Weise extrahiert. Eine Region, die Exon 18 bis Exon 20 abdeckte,
wurde durch RT-PCR amplifiziert und die Amplifikationsprodukte wurden
durch Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Als Ergebnis wurde das Nukleotidfragment,
das aus den Exons 80 und 20 mit einem übersprungenen Exon 19 bestand,
klar in den Geweben der Mäuse
erkannt, die 20 mg/kg oder 200 mg/kg des Antisense-Oligonukleotids
empfingen. Die Produktion des Fragments war bei der Probe aus den Mäusen am
bemerkenswertesten, die 20 mg/kg des Antisense-Oligonukleotids empfingen.
-
5. Nachweis von SES in
anderen Exons – 1
-
Auf
Grundlage der obigen Ergebnisse überprüften die
Erfinder Exons, die aus einer unerwarteten Anzahl von Nukleotiden
bestanden, bezüglich
eines Leserasters (deswegen würde
der Verlust eines derartigen Exons ein Out-of-Frame-Ablesen von
Aminosäuren
verursachen) in und um den Exons 45 bis 55 herum, die in Regionen
im Dystrophin-Gen, in denen eine hohe Inzidenz der Mutation bemerkt
wird, nach Sequenzen, die SES als Transkripte ergeben werden. Gemäß einer
in vitro Analyse ist, wie vorher erwähnt, SES reich an Purin-Nukleotiden
(insbesondere Wiederholungen bzw. Repeats einer Sequenz „AAG"). Auf Grundlage
dieser Tatsache selektierten die vorliegenden Erfinder drei Regionen
als Kandidaten, die Matrizen für
Transkripte bereitstellen könnten,
die relativ reich an Purin-Nukleotiden sind, und überprüften, ob
die Sequenzen Transkripte ergeben könnten, die eine SES-Aktivität aufweisen:
(1) eine 26-Nukleotidsequenz
(eine Nukleotidsequenz komplementär zur Nukleotidsequenz, die
unter SEQ ID NO: 3 dargelegt ist) innerhalb von Exon 46, (2) eine 28-Nukleotidsequenz
innerhalb von Exon 46 und (3) eine 26-Nukleotidsequenz innerhalb
von Exon 53 (Nukleotidsequenz komplementär zur Nukleotidsequenz dargelegt
unter SEQ ID NO: 4).
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Zur
Konstruktion einer prä-mRNA
zur Feststellung einer SES-Aktivität wurde das Plasmid, beschrieben
in Watakabe, A., et al., Genes & Development,
7: 407–418
(1993) als Standardplasmid verwendet, das Exon 3, Intro 3 und eine
5'-terminale Region
von Exon 4 des Drosophila-Doublesex(dsx)-Gens einschloss. Dies war
ein Plasmid, hergestellt durch Insertieren eines BglII-HincII-Fragmentes
von pSPdsxE34f (Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8092–8096 (1992))
in die BglII-SmaI-Stelle des Plasmids pSP72, das wiederum ein Plasmid
war, hergestellt durch Subklonieren in pSP73 (Promega), ein genomisches
dsx-Fragment, das sich von Exon 3 bis zum Ort 1128 bp stromabwärts der
weiblichen spezifischen Akzeptorstelle des Drosophila-Doublesex-Gens
(dsx) erstreckte. Das BglII-HincII-Fragment stellt ein System bereit,
bei dem kein Spleißen
zwischen den Exons stattfindet, die an beiden Enden von Intron 3
im Transkript flankieren, bis SES unmittelbar stromaufwärts der
5'-terminalen Region
von Exon 4 zugesetzt wird, was das weiblich-spezifische Exon ist,
jedoch tritt ein Spleißen
auf, wenn ein SES an der Position zugesetzt wird. Für jede der
auszuwertenden Nukleotidsequenzen wurden einsträngige, Vorwärts- und Rückwärts-DNAs separat synthetisiert.
Eine BamHI-Spaltstelle
wurde der Vorwärts-DNA
an ihrem 5'-Terminus
zugesetzt. Eine XhoI-Spaltstelle wurde der reversen DNA an ihrem
5'-Terminus zugesetzt.
Die Vorwärts-
und Rückwärts-DNAs, die so hergestellt
wurden, wurden kombiniert, erhitzt (94°C, 2 min) und auf Raumtemperatur
annealt, um eine doppelsträngige
DNA zu erhalten. Die doppelsträngige
DNA wurde in den BamHI-XhoI-Ort eingefügt, der sich unmittelbar stromabwärts der
5'-terminalen Region
des dsx-Exons 4 im Standardplasmid befand, für die oben beschriebene Feststellung. Somit
wurden Plasmide erzielt, von denen jedes ein Mini-Gen einschloss,
das aus einer Nukleotidsequenz bestand, die sich von Exon 3 bis
zum 5'-terminalen
Bereich von Exon 4 von dsx bewegte, und eine Nukleotidsequenz wurde
stromabwärts
zur Auswertung zugesetzt. Radioisotopen-markierte prä-mRNAs wurden
in einer konventionellen Weise mit RNA-Polymerase hergestellt unter
Verwendung dieser Plasmide als Matrizen. Diese prä-mRNA wurde
dann mit einem HeLa-Zellkernextrakt für 1 Stunde in derselben Weise
wie vorher erwähnt umgesetzt,
um ein Spleißen
zu ermöglichen,
und die Produkte wurden durch Gel-Elektrophorese in einer konventionellen
Weise analysiert.
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Als
Folge ergab die Spleißreaktion
auf der prä-mRNA,
die einen der SES-Kandidaten von 43 oder 53 aufwies, klarerweise
eine mRNA, bei der die Exons auf beiden Seiten von Intron 3 gespleißt waren.
Dies zeigt, dass dieses beiden SES-Kandidatensequenzen eine SES-Aktivität aufwiesen.
Wenn zwischen diesen beiden ein Vergleich angestellt wurde, war
die SES-Aktivität bei dem
Kandidaten aus Exon 43 stärker.
Andererseits war seine Aktivität
sehr schwach, obwohl die Spleißreaktion
die gespleißte
mRNA aus der prä-mRNA,
die das Exon 46 SES Kandidatenstück
aufwies, ergab.
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Somit
zeigten die Erfinder SESs innerhalb der Exons 43 und 53 von humaner
Dystrophin-mRNA.
Solche SESs in der mRNA sind die Ribonukleotidsequenzen, dargelegt
als SEQ ID NO: 3 und NO: 4 im Sequenzprotokoll.
-
Es
hat sich bereits durch die Erfinder herausgestellt, dass ein SES
im Exon 19 der Transkript-prä-mRNA des
Dystrophin-Gens vorliegt, und dass ein Überspringen von Exon 19 mittels
eines Antisense-Oligonukleotids gegen das SES induziert werden kann,
wodurch das Leseraster wiederhergestellt wird. Bezüglich der
zusätzlichen
SES, die oben innerhalb der Exons 43 bzw. 53 identifiziert wurden,
werden ihre Antisense-Oligonukleotide ein Überspringen von Exon 43 (173
Nukleotide, d.h. 3 × 57
+ 2 Nukleotide) und Exon 53 (212 Nukleotide, d.h. 3 × 70 + 2
Nukleotide) jeweils induzieren.
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Deswegen
wird für
einen Typ eines DMD-Falls, der durch eine Reduktion von (3 × N + 1)
Nukleotiden (N ist Null oder eine natürliche Zahl) aufgrund eines
Verlustes der Nukleotide in ein oder mehreren Exons charakterisiert
ist, die Exon 43 der Dystrophin-prä-mRNA benachbart sind, ein Überspringen
von Exon 43 während des
Spleißens
durch Verabreichung eines Antisense-Oligonukleotids gegen das SES
innerhalb von Exon 43 induziert werden. Indem dies vorgenommen wird,
ist es möglich,
die Out-of-Frame-Mutation zu korrigieren und eine In-Frame-Struktur wiederherzustellen,
weil der weitere Verlust von 173 Nukleotiden in Exon 43 durch Spleißen die
Gesamtanzahl verlorener Nukleotide in der gespleißten mRNA
zu einem Vielfachen von 3 machen wird. Somit wird, obwohl die Aminosäuren, die
der übersprungenen
Nukleotidsequenz entsprechen, verlorengehen werden, eine stromabwärts gelegene
Aminosäuresequenz
durch die Abnormalität
des Gens nicht beeinträchtigt
sein werden. Ein Dystrophin wird somit synthetisiert werden, das
ernsthaftes DMD zu milderem BMD umwandelt. Beispiele für solche
DMD-Fälle
schließen
solche mit dem Verlust von Exon 44 (148 Nukleotide, d.h. 3 × 49 + 1
Nukleotide) von Exons 44 bis 46 (148 + 176 + 18 = 472 Nukleotide,
d.h. 3 × 157
+ 1 Nukleotide) von Exons 44 bis 47 (148 + 176 + 148 + 150 = 622
Nukleotide, d.h. 3 × 207
+ 1 Nukleotide) von Exons 44 bis 48 (148 + 176 + 148 + 150 + 186
= 808 Nukleotide, d.h. 3 × 269
+ 1 Nukleo tide) oder von Exons 44 bis 49 (148 + 176 + 148 + 150
+ 1856 + 102 = 910 Nukleotide, d.h. 3 × 303 + 1 Nukleotide) einschließen.
-
In ähnlicher
Weise wird für
einen DMD-Fall, der durch eine Reduktion von (3 × N + 1) Nukleotiden gekennzeichnet
ist (N ist Null oder eine natürliche
Zahl), aufgrund eines Verlusts von Nukleotiden in einem oder mehreren
Exons benachbart Exon 53 einer Dystrophin prä-mRNA, ein Überspringen von Exon 53 während des Spleißens durch
Verabreichung eines Antisense-Oligonukleotids
gegen das SES innerhalb von Exon 53 induziert werden. Beispiele
für solche
DMD-Fälle
schließen
solche mit dem Verlust von Exon 52 (118 Nukleotide, d.h. 3 × 39 + 1
Nukleotide), von Exons 50, 51 und 52 (109 + 233 + 118 = 460 Nukleotide,
d.h. 3 × 153
+ 1 Nukleotide) ein. Für
diese Fälle
ist es durch Induzieren eines Exon-53-Überspringens während des
Spleißens durch
in Einführung
eines Antisense-Oligonukleotids gegen das SES in Exon 53 möglich, die
Anzahl deletierter Nukleotide in der gespleißten mRNA in 330 oder 672 jeweils
zu modifizieren. Indem dies durchgeführt wird, wird die Anzahl deletierter
Nukleotide in der gespleißten
mRNA ein Vielfaches von 3 werden und deswegen wird eine existierende
Verschiebung des Leserasters, die durch die originale Deletion verursacht
ist, korrigiert werden.
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6. Nachweis von weiteren
SES in anderen Exons – 2
-
Die
Erfinder haben weitere Studien durchgeführt, um ein SES innerhalb von
Exon 45 zu identifizieren (dessen Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 7
im Sequenzprotokoll dargestellt ist), das eine Region mit einer
hohen Inzidenz von Mutationen im Dystrophin-Gen ist. Kurz gesagt,
wurde eine 163-Nukleotidsequenz, erzeugt durch Deletieren von Spleißstellen
(5'-terminal 7 Nukleotide
und 3'-terminal
6 Nukleotide) der Exon-45-Nukleotidsequenz (176 bp) in 5 Fragmente
(Fragmente 1 bis 5) eingeteilt, von denen jedes aus ungefähr 30 Nukleotiden bestand.
Die hergestellten Fragmente bestanden aus in Reihenfolge von 5'-Terminus zu 3'-Terminus: 31 Nukleotiden
(Fragment 1: dargelegt in SEQ ID NO: 8 im Sequenzprotokoll), 32
Nukleotiden (Fragment 2: dargelegt als SEQ ID NO: 9 im Sequenzprotokoll),
33 Nukleotiden (Fragment 3: dargelegt in SEQ ID NO: 10 im Sequenzprotokoll),
32 Nukleotiden (Fragment 4: dargelegt in SEQ ID NO: 11 im Sequenzprotokoll)
und 35 Nukleotiden (Fragment 5: dargelegt in SEQ ID NO: 12 im Sequenzprotokoll).
Die jeweiligen Mini-Gene wurden wie oben beschrieben durch Einbringen
jeder dieser DNA, die Matrizensequenzen für SES-Kandidaten aufwiesen,
in die 3'terminale
Region des Plasmids, das Exon 3, Intron 3 und eine 5'-terminale Region
von Exon 4 des Drosophila-Doublesex(dsx)-Gens enthielt. Für eine positive
Kontrolle wurde ein Mini- Gen
ebenfalls des gleichen konstruiert, bei dem die DNA, die das Exon-19-SES
aufwies (dargelegt in SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll) enthalten
war. Unter Verwendung des so gewonnenen SES-Aktivitätsbestimmungssystems
wurde die SES-Aktivität
für jedes
der Fragmente gemessen. Kurz gesagt, wurden radioisotop markierte
prä-mRNAs
durch RNA-Polymerase
unter Verwendung der Plasmide als Matrizen in einer herkömmlichen
Weise synthetisiert. Die jeweiligen prä-mRNAs wurden mit HeLa-Zellkernextrakt
für 1 Stunde
umgesetzt, um ein Spleißen
zu ermöglichen.
Nach der Spleißreaktion
wurde eine Analyse durch Gel-Elektrophorese
durch ein herkömmliches Verfahren
durchgeführt.
Als Folge hat sich herausgestellt, dass Fragment 4 eine ein wenig
stärkere
SES-Aktivität
im Vergleich zu den anderen Fragmenten aufwies.
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Danach
wurde die SES-Aktivität
für Sequenzen
um Fragment 4 herum bestimmt. Kurz gesagt, wurden von innerhalb
der Exon-45-Nukleotidsequenz die folgenden Fragmente hergestellt:
1) Ein Fragment, das aus den Nukleotiden der Region mit derselben
Länge bestand
und stromaufwärts
um 16 Basen verschoben war (Fragment 4a: dargelegt als SEQ ID NO:
13 im Sequenzprotokoll), 2) ein Fragment, das aus den Nukleotiden des
Bereichs mit derselben Länge
bestand und das stromaufwärts
um 13 Basen verschoben wurde (Fragment 4b: dargelegt als Sequenz
Nr. 14 im Sequenzprotokoll) und ein Fragment, das aus den Nukleotiden
der Region mit derselben Länge
bestand und das stromabwärts
um 16 Basen verschoben war (Fragment 4c: dargestellt in SEQ ID NO:
15 im Sequenzprotokoll). Für
jedes Fragment wurde die SES-Aktivität wie oben
beschrieben festgestellt. Als Folge erwies sich Fragment 4c als
wirkungsvoller als das ursprüngliche
Fragment Fragment 4. Die Aktivität
von Fragment 4c war genauso wirkungsvoll wie diejenige des Exons-19-SES.
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Exon
45 bestand aus 176 Nukleotiden (3 × 58 + 2 Nukleotiden). Deswegen
erfolgt eine Wiederherstellung des Leserasters durch Induzieren
eines weiteren Verlustes von 176 Nukleotiden durch Überspringen
von Exon 45 in einem Typ einer Duchenne-Muskeldystrophie, die durch
eine Veränderung
der Anzahl der Nukleotide in den Nukleotidsequenzen verursacht war,
die ein oder mehrere Exons, benachbart zu Exon 45 in humaner Dystrophin-mRNA
codieren, aufgrund einer Deletion einer oder mehrerer Nukleotide
aus den normalen Nukleotidsequenzen, wobei das Netto der Veränderung
der Anzahl der Nukleotide als ein Verlust von (3 × N + 1)
Nukleotiden ausgedrückt
ist, wobei N Null oder eine natürliche
Zahl ist. Beispiele für
solche DMD-Fälle schließen ein;
einen Fall mit einer Deletion von Exon 44 (148 Nukleotide, d.h.
3 × 49
+ 1 Nukleotide), ein Fall mit einer Deletion von Exon 46 (148 Nukleotide,
d.h. 3 × 49
+ 1 Nukleotide), ein Fall mit einer Deletion der Exons 46 und 47
(148 + 158 = 298 Nukleotide, d.h. 3 × 99 + 1 Nukleotide), ein Fall
mit einer Deletion der Exons 46 bis 48 (148 + 150 + 186 = 484 Nukleotide,
d.h. 3 × 161
+ 1 Nukleotide), ein Fall mit einer Deletion der Exons 46, 47 und
49 (148 + 150 + 102 = 400 Nukleotide, d.h. 3 × 133 + 1 Nukleotide), ein
Fall mit einer Deletion von Exons 46, 47, 49, 50 und 51 (148 + 150
+ 102 + 109 + 233 = 742 Nukleotide, d.h. 3 × 247 + 1 Nukleotide) und ein
Fall mit einer Deletion von 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54 und 55
(148 + 150 + 102 + 109 + 133 + 118 + 212 + 155 + 190 = 1417 Nukleotide,
d.h. 3 × 472
+ 1 Nukleotide).
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DNAs
und Phosphorothioatoligo-DNAs mit einer Nukleotidsequenz, die der
Nukleotidsequenz komplementär
war, dargelegt als SEQ ID NO: 15 im Sequenzprotokoll, können unter
Verwendung eines kommerziell erhältlichen
DNA-Synthesegerätes,
wie beispielsweise das Applied Biosystems Model 1380B, erzeugt werden und
gemäß des Verfahrens
beschrieben in Zon et al., (Oligonucleotides and Analogues: A practical
Approach, F. Eckstein, Hsg., Seiten 87–108, Oxford University Press,
Oxford, England; US-Patent Nr. 5 151 510).
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7. Klinische Anwendung
von Antisense-Oligonukleotiden gegen Exon45-SES
-
Ein
Antisense-Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung wird einem entsprechenden
DMD-Patienten wie
folgt verabreicht. Eine Antisense-Oligo-DNA oder eine Antisense-Phosphorothioat-Oligo-DNA,
die die Nukleotidsequenz umfasst, komplementär zur Nukleotidsequenz, dargelegt
als SEQ ID NO: 15, beispielsweise die Antisense-Oligo-DNA, die als
SEQ ID NO: 19 im Sequenzprotokoll dargelegt ist, oder eine Antisense-Phosphorothioat-Oligo-DNA, die dieselbe
Nukleotidsequenz aufweist, wird durch ein konventionelles Verfahren
hergestellt, das dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt ist, und
wird durch ein konventionelles Verfahren sterilisiert und beispielsweise
zu einer 1200 μg/ml
injizierbaren Lösung
ausgebildet. Die Lösung
wird dann intravenös
einem Patienten verabreicht, beispielsweise durch tropfenweise Infusion
einer parenteralen Flüssigkeit,
in einer Dosis von beispielsweise 20 mg des Antisense-Oligonukleotids
pro kg Körpergewicht.
Die Verabreichung wird beispielsweise viermal in zweiwöchigen Intervallen
durchgeführt.
Eine spätere
Verabreichung wird nach Bedarf wiederholt, während die Expression des Dystrophin-Gens
im Muskelgewebsbiopsie-Proben, die
Serumkreatin-Kinasewerte und der therapeutische Effekt überwacht
werden, der auf Basis der klinischen Symptome festgestellt wird.
Soweit sie therapeutisch wirksam ist, ohne offensichtliche Nebenwirkung,
wird die Therapie im Allgemeinen während des gesamten Lebens des
Patienten fortgeführt.
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Die
vorliegende Erfindung wird unten ausführlich unter Bezugnahme auf
die Beispiele beschrieben werden.
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Beispiele
-
Zusammensetzungsbeispiel
1
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Gemäß der nachfolgenden
Formel wurden notwendige Mengen an Basisbestandteilen bis zur Lösung vermischt.
Das Antisense-Oligonukleotid wurde dann in der Lösung gelöst, die Lösung wurde bis zu einem bestimmten
Volumen aufgefüllt
und durch einen Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm filtriert,
um eine Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung zu gewinnen.
| Antisense-Oligonukleotid
() | 500
mg |
| Natriumchlorid | 8,6
g |
| Kaliumchlorid | 0,3
g |
| Calciumchlorid | 0,33
g |
| Destilliertes
Wasser zur Injektion | ad
1000 ml |
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Zusammensetzungsbeispiel
2
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Gemäß der folgenden
Formel wurden notwendige Mengen der jeweiligen Basenbestandteile
bis zur Lösung
vermischt. Das Antisense-Oligonukleotid wurde dann in der Lösung gelöst, die
Lösung
wurde bis zu einem Volumen aufgefüllt und durch einen Filter
mit einer Porengröße von 15
nm (PLANOVE 15: Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) filtriert, um
eine Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung zu erhalten.
| Antisense-Oligonukleotid
() | 100
mg |
| Natriumchlorid | 8,3
g |
| Kaliumchlorid | 0,3
g |
| Calciumchlorid | 0,33
g |
| Natriumhydrogenphosphat·12H2O | 1,8
g |
| 1 N
Salzsäure | q.s.
(pH 7,4) |
| destilliertes
Wasser zur Injektion | ad
1000 ml |
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Zusammensetzungsbeispiel
3
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Gemäß der folgenden
Formel wurden notwendige Mengen der jeweiligen Basenbestandteile
bis zur Lösung
vermischt. Das Antisense-Oligonukleotid wurde dann in der Lösung gelöst, die
Lösung
wurde bis zu einem bestimmten Volumen aufgefüllt und durch einen Filter
mit einer Porengröße von 35
nm (PLANOVE 35: Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) filtriert, um
eine Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung zu erhalten.
| Antisense-Oligonukleotid
() | 100
mg |
| Natriumchlorid | 8,3
g |
| Kaliumchlorid | 0,3
g |
| Calciumchlorid | 0,33
g |
| Glucose | 0,4
g |
| Natriumhydrogenphosphat·12H2O | 1,8
g |
| 1 N
Salzsäure | q.s.
(pH 7,4) |
| Injizierbares
destilliertes Wasser | ad
1000 ml |
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