ES2220929T3 - Inhibidor de la actividad il-6. - Google Patents

Inhibidor de la actividad il-6.

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ES2220929T3 ES95919438T ES95919438T ES2220929T3 ES 2220929 T3 ES2220929 T3 ES 2220929T3 ES 95919438 T ES95919438 T ES 95919438T ES 95919438 T ES95919438 T ES 95919438T ES 2220929 T3 ES2220929 T3 ES 2220929T3
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Ottaviano Serlupi-Crescenzi
Annarita Pezzotti
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Abstract

LA INVENCION TRATA DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE ES CAPAZ DE INHIBIR LA ACTIVIDAD IL OMO LAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LA CONTIENEN. EN PARTICULAR, TRATA DE UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE INCLUYE: I) AL MENOS UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE ES UN ELEMENTO APRE DE FORMULA GENERAL ZCMYKGKAA, EN LA CUAL Z REPRESENTA T O G O TAMBIEN PUEDE ESTAR AUSENTE, X REPRESENTA T O TAMBIEN PUEDE ESTAR AUSENTE, M REPRESENTA C O A, Y REPRESENTA C O T, Y K REPRESENTA T O G, JUNTO CON II) AL MENOS UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS QUE CONSTITUYE UN SITIO DE UNION DEL FACTOR DE TRANSCRIPCION DISTINTO DEL ELEMENTO APRE, COMO POR EJEMPLO LOS QUE SE ENCUENTRAN PRESENTES EN LAS REGIONES PROMOTORAS.

Description

Inhibidor de la actividad IL-6.
Campo del invento
El presente invento se refiere a una secuencia de nucleótidos que es capaz de inhibir la actividad IL-6, a su uso en terapia y también a composiciones farmacéuticas que la contienen.
Antecedentes del invento
La IL-6 es una proteína perteneciente al grupo de las citoquinas de la que se ha demostrado que desempeña una función clave en la estimulación de la respuesta inmune y la hematopoyesis del organismo.
En realidad, se han hallado muchas funciones biológicas para la IL-6 en los sistemas hematopoyético y linfoide, en el hígado y en otros órganos y células diana. Algunas de estas funciones son beneficiosas, mientras que otras están relacionadas con estados patológicos. Entre estas últimas funciones, se ha hallado que la IL-6 es un factor de crecimiento para células de mieloma múltiple, mostrándose que anticuerpos anti-IL-6 bloquean transitoriamente la proliferación de células de mieloma en un paciente leucémico [véanse, p. ej., Klein et al., Blood, 78 (5), páginas 1.198-1.204, 1.991, y Lu et al., Eur. J. Immunol., 22, páginas 2.819-24, 1.992].
Niveles elevados de IL-6 han sido correlacionados con enfermedades autoinmunes e inflamatorias, tales como artritis reumatoide, glomerulonefritis, soriasis y enfermedad de Castelman (véase, por ejemplo, Graeve et al., Clin. Investig., 71, páginas 664-71, 1.993). Se ha mostrado también que la IL-6 desempeña una función directa en la pérdida ósea y la hipercalcemia [véanse, por ejemplo, Poli et al., Embo J., 13 (5), páginas 1.189-96, y Yoneda et al., Cancer Res., 53, páginas 737-40, Febrero de 1.993].
Por lo tanto, el desarrollo de inhibidores de la actividad IL-6 ha sido el objeto de una activa investigación. Para este fin, se han seguido diferentes planteamientos, incluyendo el uso de anticuerpos contra IL-6 (como fue comunicado por Klein et al., supra), gp130 o gp80; el uso de gp130 soluble: y el uso de muteínas para IL-6, o el receptor de IL-6.
Ya que estos planteamientos podrían estar asociados con efectos específicos indeseados en aplicaciones clínicas (como fue comunicado por Lu et al., supra), sería útil la puesta a punto de estrategias adicionales para inhibir la actividad IL-6.
Por lo tanto, el solicitante ha investigado un diferente planteamiento para inhibir la actividad IL-6: bloquear las proteínas intracelulares que median en la señal de IL-6.
La transducción de la señal de IL-6 en células sensibles ha sido ampliamente investigada. Fowlkes et al. (PNAS USA, 81, páginas 2.313-6, 1.984) sospecharon por vez primera de elementos sensibles de DNA específicos para IL-6 que flanquean los genes del fibrinógeno de rata.
Más tarde, Kunz et al. (Nuc. Ac. Res., 17 (3), 1.121-37, 1.989) mostraron que un elemento sensible con una secuencia central idéntica a la de genes del fibrinógeno de rata (CTGGGA) respondía a IL-6 en el gen de la \alpha2-macroglobulina de rata.
Elementos sensibles de DNA con secuencias relacionadas con las anteriormente mencionadas han sido también definidos en los genes que codifican la proteína C reactiva (CRP; del inglés, C Reactive Protein) humana (véase Toniatti et al., Mol. Biol. Med., 7, páginas 199-212, 1.990) y la haptoglobina humana (véase Oliviero et al., Embo J., 6 (7), páginas 1.905-12, 1.987) y en otros genes que codifican adicionales proteínas de fase aguda inducidas por IL-6 (véase Heinrich et al., Biochem. J., 265, páginas 621-36, 1.990), lo que conduce a la definición de una secuencia central de consenso CTGGGAW o CTGGRAA, en la que W significa A o T y R significa A o G.
Hocke et al. [Mol. Cell. Biol., 12 (5), páginas 2.282-94, 1.992] indicaron que múltiples secuencias centrales relacionadas, similares a la secuencia central anteriormente mencionada, podrían estar presentes en regiones reguladoras de genes de tipo silvestre que responden a IL-6 y que esta multiplicidad conduce a la amplificación de la respuesta, como se analiza funcionalmente con un ensayo de gen informador.
Wegenka et al. [Mol. Cell. Biol., 13 (1), páginas 276-88, 1.993] han señalado recientemente una versión ampliada de la secuencia central de consenso como el elemento de respuesta de fase aguda (APRE; del inglés, Acute Phase Response Element), activo en células de hepatoma, que puede ser representado por la fórmula KTMYKGKAA, en la que M representa C o A, K representa T o G, e Y representa C o T.
Yuan et al. [Mol. Cell. Biol., 14 (3), páginas 1.657-68, 1.994] han mostrado que dichas secuencias de tipo APRE se unen a un factor de transcripción proteico, llamado APRF, que tiene un peso molecular de aproximadamente 90 kDa y que ha sido clonado recientemente (véase Akira et al., Cell, 77, páginas 63-71, 1.994). Por lo tanto, en la práctica, la unión de APRF activado a secuencias APRE conduciría a la activación de genes inducibles por IL-6 (que contienen dichas secuencias APRE) en células sensibles a IL-6.
Como una consecuencia de esto, un elemento APRE puede ser usado como potenciador de un gen diana en células sensibles a IL-6 del modo siguiente: en células sensibles a IL-6, el tratamiento con IL-6 induce la síntesis de proteínas APRF, que se unen al elemento APRE, y dicha unión activa la expresión del gen diana.
Serlupi Crescenzi et al. (póster del 12th European Immunol. Meeting, Barcelona, 14-17 de Junio de 1.994) han mostrado que una repetición óctuple de la secuencia APRE de DNA (M8) es responsable de un aumento de inducción de 50-100 veces, por IL-6, de un gen informador en células HepG2 de hepatoma humano.
Sumario del invento
El objeto principal del presente invento es una secuencia de nucleótidos que es capaz de inhibir la actividad IL-6, que comprende:
i)
al menos una secuencia de nucleótidos que es un elemento APRE de fórmula general ZXMYKGKAA, en la que Z representa T o G o también puede estar ausente, X representa T o también puede estar ausente, M representa C o A, Y representa C o T, y K representa T o G,
conjuntamente con
ii)
al menos una secuencia de nucleótidos que constituye un sitio ligante para factores de transcripción distinto del elemento APRE, tal como los presentes en regiones promotoras.
Los ejemplos de este último tipo de secuencias de nucleótidos incluyen: la caja TATA y los sitios ligantes para factores de transcripción, tales como los factores de transcripción AP-1 (véase Riabowol et al., PNAS USA, 89, páginas 157-61, 1.992),AP-2, HNF-1 (véase Clusel et al., Nuc. Ac. Res., 21 (15), páginas 3.405-11), SP-1 (véase Wu et al., Gene, 89, páginas 203-9, 1.990), NF-\kappaB (véase Bielinska et al., Science, 250, páginas 997-1.000, 1.990), Oct-1, E-2 y SRF.
En una realización preferida del presente invento, cada uno del elemento APRE (i) y/o la secuencia (ii) de nucleótidos de la anterior fórmula general está repetido al menos 2 veces, más preferiblemente de 3 a 10 veces, aún más preferiblemente 8 veces.
En otra realización preferida del presente invento, el elemento (i) comprende al menos dos elementos APRE diferentes y/o la secuencia (ii) de nucleótidos comprende al menos dos secuencias oligonucleotídicas diferentes que constituyen un sitio ligante para factores de transcripción distinto del elemento APRE.
La secuencia (ii) de nucleótidos es preferiblemente el promotor precoz del SV40.
El elemento APRE (i) comprende, por ejemplo, la siguiente secuencia de nucleótidos: TTCTGGGAA.
La Figura 2 presenta una secuencia de nucleótidos que cae dentro del alcance del invento, de acuerdo con sus realizaciones preferidas. Dicha secuencia de nucleótidos es también presentada como ID. SEC. nº 1 y constituye un objeto del invento.
Un objeto más del presente invento es un vector plasmídico que contiene la secuencia de nucleótidos del invento.
Un aspecto adicional del presente invento es el uso de la secuencia de nucleótidos del invento como una herramienta terapéutica para inhibir la acción de IL-6 en aquellos estados en que IL-6 desempeña una función patológica.
El presente invento también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una secuencia de nucleótidos o un vector plasmídico de acuerdo con el invento. Dichas composiciones pueden ser formuladas para uso oral, rectal, intravenoso o tópico. Las formulaciones del presente invento pueden incluir el uso de cualquier combinación de transferencia génica víricamente mediada, formulación liposómica, distribución de DNA mediada por receptores y/o estructuras de tipo mancuerna ("dumbbell") de la secuencia inhibidora activa de nucleótidos de acuerdo con el invento.
La acción inhibidora de la secuencia de nucleótidos del invento ha sido determinada con un ensayo de gen informador.
El ensayo de gen informador del invento se basa en la capacidad del elemento APRE para actuar como potenciador de cualquier gen en células sensibles a IL-6 (como se indicó anteriormente). En este caso, el elemento APRE se usa como potenciador de un gen informador diana (que es, por ejemplo, el gen de la luciferasa) en células sensibles a IL-6 (que son, por ejemplo, células hepáticas tales como HepG2). Las células son luego tratadas con IL-6: si mediante un exceso de la secuencia de nucleótidos del invento se captura lo suficiente de las proteínas APRF producidas, el gen diana no resultará activado.
De acuerdo con este ensayo, se construyen plásmidos inhibidores que contienen la secuencia de nucleótidos del invento. En la Figura 1 se presenta un ejemplo de dichos plásmidos, junto con la estrategia de su construcción.
Éste y otros plásmidos, que contienen la secuencia de nucleótidos del invento, están también destinados a constituir una realización más del invento.
El invento será ahora descrito por medio de los ejemplos siguientes, que no han de ser considerados en modo alguno como restrictivos del presente invento. Los ejemplos se referirán a las figuras especificadas más adelante.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: Estrategia de construcción del plásmido pM8SV. pM8SVL es sometido a digestión con Sal I y Hind III, y los extremos cohesivos son transformados en extremos romos mediante la reacción de Klenow. El resultante fragmento de DNA de 3,2 kb es purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y es luego sometido a autoligación. Se genera de este modo el plásmido pM8SV, que contiene la secuencia de M8 [aproximadamente 170 pares de bases (bp; del inglés, base pairs)] y la secuencia del promotor precoz del virus SV40 (aproximadamente 190 bp) pero carece del gen de la luciferasa.
Figura 2: Secuencia del fragmento de DNA inhibidor BamH I-Hind III del plásmido pM8SV. La línea continua situada encima de la parte superior de la secuencia de nucleótidos mostrada representa la secuencia de M8. La línea continua negrita situada encima de la parte inferior de la secuencia de nucleótidos representa la secuencia del promotor de SV40. También se indican los sitios de restricción BamH I y Hind III.
Figura 3: Ensayo de gen informador para IL-6 en células T47D y M1. Prueba de diferentes plásmidos que contienen M8. Los valores presentados de emisión de luz son medias de determinaciones duplicadas de cps integradas a lo largo de un periodo de 30 segundos (ABC = Área Bajo la Curva), procedentes de células transfectadas. Cada columna representa la media de tres transfecciones \pm error estándar de la media (SEM; del inglés, standard error of the mean).
Figura 4: Curso temporal de la inducibilidad de luciferasa en células HepG2 transfectadas, después de tratamiento con IL-6. El plásmido pM8SVL fue usado como plásmido de gen informador positivo. Cada columna representa la media de dos transfecciones \pm SEM. En la Figura se muestran dos experimentos.
Figura 5: Ensayo de gen informador para IL-6 en HepG2. Prueba de pM8 como plásmido inhibidor frente a pM8SVL como plásmido de gen informador. Cada columna representa la media de tres transfecciones \pm SEM. En la Figura se muestran cuatro experimentos.
Figura 6: Ensayo de gen informador para IL-6 en HepG2. Prueba de pN8SV como plásmido inhibidor frente a pN8SVL como plásmido de gen informador. Cada columna representa la media de tres transfecciones \pm SEM. Los resultados se expresan como % de inhibición con respecto a células HepG2 transfectadas con plásmido portador pC sin plásmido inhibidor.
Figura 7: Ensayo de gen informador para IL-6 en HepG2. Prueba de pSV y pM8SV como plásmidos inhibidores frente a pN8SVL como plásmido de gen informador. Cada columna representa la media de tres transfecciones \pm SEM. Los resultados se expresan como % de inhibición con respecto a células HepG2 transfectadas con plásmido portador pC sin plásmido inhibidor.
Figura 8: Prueba de inhibición de la actividad IL-6 por los plásmidos inhibidores pM8 y pM8SV en un ensayo de gen informador en células HepG2 basado en el gen de la luciferasa bajo control de las secuencias reguladoras inducibles por IL-6 procedentes del promotor del gen de la haptoglobina humana. Cada columna representa la media de tres transfecciones \pm SEM. Los resultados se expresan como % de inhibición con respecto a células HepG2 transfectadas con plásmido portador pC sin plásmido inhibidor. Las transfecciones fueron llevadas a cabo con 0,1 \mug de DNA plasmídico informador y el exceso molar mostrado de plásmido inhibidor. La cantidad total de DNA introducido por transfección fue mantenida constante con el plásmido portador. Las células transfectadas fueron tratadas durante 18 horas con 1 ng/ml de IL-6.
Descripción detallada del invento Ejemplo 1 Construcción de plásmidos
Se construyó un plásmido de gen informador de luciferasa, que responde a IL-6, preparando primero, por medio de síntesis química, un oligonucleótido de doble cadena de 38 bp, con un sitio BamH I no cortado en su extremo romo 5', y una cadena inferior sobresaliente de 4 nucleótidos compatible con los sitios Bgl II y BamH I en el extremo 3'. Este oligonucleótido sintético fue denominado M2 y contenía dos secuencias APRE idénticas procedentes de la región promotora del gen de la \alpha2-macroglobulina de rata. La secuencia del oligonucleótido (cadena superior, 5' a 3') era la siguiente:
GGATCCTTCTGGGAATTCTGATCCTTCTGGGAATTCTG (ID. SEC. nº 2). Este oligonucleótido fue clonado en los sitios Sma I-Bgl II del plásmido pGL2-pv (de Promega Corporation), donde la expresión del gen informador de luciferasa es conducida por el promotor precoz del virus SV40, formándose de este modo, después de autoligación, el plásmido pM2SVL.
El oligonucleótido sintético fue también ligado, a través de su extremo romo 5', al sitio Sma I del mismo plásmido pGL2-pv, y el producto de ligación lineal resultante fue luego cortado con Hind III. El vector lineal resultante fue usado como receptor para clonar los siguientes fragmentos de DNA: 1) el fragmento BamH I-Hind III de 238 bp procedente del plásmido pM2SVL, formándose de este modo, después de autoligación, el plásmido pM4SVL; 2) el fragmento BamH I-Hind III de 280 bp procedente de pM4SVL, formándose de este modo, después de autoligación, el plásmido pM6SVL; y 3) el fragmento BamH I-Hind III de 322 bp procedente de pM6SVL, formándose de este modo, después de autoligación, el plásmido pM8SVL.
Se construyó el plásmido pM8L al someter pM8SVL a digestión con Sfan I y convertir los extremos cohesivos en extremos romos por reacción de compleción con la enzima de Klenow. Después de digestión con BamH I, el fragmento de DNA de M8 resultante, de 163 bp, fue ligado con un adaptador sintético BamH I-Kpn I de 16 bp y fue clonado en un fragmento de DNA de 5,6 kb que resultó de la digestión del vector pGL2-b (de Promega Corporation) con Sma I + Kpn I. El plásmido pGL-2b es idéntico al anteriormente mencionado plásmido pGL2-pv salvo por la ausencia de la secuencia promotora de SV40 en pGL2-b. El adaptador de 16 bp contenía un sitio de clonación múltiple y fue preparado por síntesis química con la secuencia siguiente:
cadena superior: ^{5'}CGCGGCCGCCTCGAGG^{3'} (ID. SEC. nº 3);
cadena inferior: ^{5'}GATCCCTCGAGGCGGCCGCGGTAC^{3'} (ID. SEC. nº 4). El plásmido que resultaba de la anterior construcción era pM8L, y tenía la secuencia de DNA de M8 sin promotor, encajada en un sitio de clonación múltiple, aguas arriba con respecto al gen de la luciferasa.
El plásmido pM8TKL de gen informador de luciferasa fue preparado al cortar el plásmido pGEM-TK-CAT (descrito por Cohen et al., EMBO J., 7 (5), páginas 1.411-9, 1.988) con Xba I y Bgl II. El fragmento de 181 bp resultante que contenía la secuencia promotora TK del gen de la timidina quinasa vírica de HSV fue ligado con el fragmento Nhe I-Bgl II de 5,8 kb del vector pM8L, entre M8 y las secuencias de DNA de luciferasa.
El plásmido pHPSVL de gen informador de luciferasa fue construido primero por multiplicación, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), de 841 bp de la región promotora del gen de la haptoglobina, procedente de DNA genómico humano. El extremo 3' del fragmento multiplicado por PCR correspondía a la posición -36 desde el inicio de transcripción del gen de la haptoglobina humana (como comunicaron Maeda et al., J. Biol. Chem., 260 (11), páginas 6.698-709, 10 de Junio de 1.985). Este producto de PCR fue preparado con cebadores superior e inferior que contenían, respectivamente, sitios de restricción Mlu I y Bgl II. Los cebadores de DNA sintetizados para la multiplicación genómica de la región promotora de la haptoglobina tenían las secuencias siguientes:
cebador superior: ^{5'}CTACGCGTGCAGTATTGACCCTTCCTCCT^{3'} (ID. SEC. nº 5);
cebador inferior: ^{5'}CGCAGATCTAGCTCACTTCTCCCCCTTC^{3'} (ID. SEC. nº 6).
El fragmento de PCR así obtenido fue insertado en sitios Mlu I y Bgl II del anteriormente mencionado plásmido pGL2-pv de gen informador de luciferasa, aguas arriba del promotor precoz de SV40. El plásmido resultante era pHPSVL.
Con objeto de construir el plásmido inhibidor pM8, el plásmido pM8L anterior fue sometido a digestión con Sal I y Bgl II, y los extremos cohesivos así generados fueron compuestos hasta extremos romos mediante la reacción de Klenow. El fragmento resultante de 3,1 kb, que carecía de la secuencia del gen de la luciferasa, fue purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y fue luego sometido a autoligación para generar el plásmido inhibidor pM8.
El plásmido inhibidor pM8SV fue preparado de la manera mostrada en la Figura 1. Se sometió pM8SVL a digestión con Sal I y Hind III y se transformaron los extremos cohesivos en extremos romos mediante la reacción de Klenow. El fragmento de DNA de 3,2 kb resultante fue purificado mediante electroforesis en gel de agarosa y fue luego sometido a autoligación. Se generó de este modo el plásmido pM8SV, que contenía la secuencia de M8 (aproximadamente 170 bp) y la secuencia procedente del promotor precoz del virus SV40 (aproximadamente 190 bp) pero carecía del gen de la luciferasa.
Se construyó el plásmido inhibidor pSV al cortar el fragmento Sal I-Hind III que contenía el gen de la luciferasa procedente del plásmido pGL2-pv anteriormente mencionado. El fragmento resultante de 3,1 kb fue sometido a una reacción de compleción con la enzima de Klenow, purificado por electroforesis en gel de agarosa y luego sometido a autoligación, obteniéndose de este modo el plásmido pSV que contiene el promotor de SV40 pero carece del gen de la luciferasa.
Se preparó el plásmido portador pC al cortar el anteriormente mencionado plásmido pGL2-b con las enzimas de restricción Sal I y Hind III. El fragmento resultante de 2,9 kb fue sometido a una reacción de compleción con la enzima de Klenow, purificado por electroforesis en gel de agarosa y luego sometido a autoligación, obteniéndose de este modo el plásmido pC.
Todas las construcciones plasmídicas anteriormente descritas fueron usadas para transformar la cepa XL1-Blue de E. coli mediante técnicas estándares (R. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, EE.UU.). El DNA plasmídico fue extraído de los clones transformados, mediante el método de la lisis alcalina minipreparativa (de acuerdo con Ausubel, supra). El DNA plasmídico fue controlado por análisis de restricción y por electroforesis en gel de agarosa. Los clones con el patrón esperado fueron seleccionados. Para obtener preparaciones plasmídicas purificadas para ser usadas en la transfección de células de mamífero, se prepararon cultivos de 300 ml de los transformantes de XL1-Blue de E.coli seleccionados. Los plásmidos fueron luego purificados mediante minicolumnas QIAGEN-tip 500 para intercambio iónico, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 2 Líneas celulares y condiciones de cultivo
Células HepG2 de hepatoma humano (ATCC) fueron cultivadas en medio esencial mínimo (MEM) complementado con suero de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf serum) al 10%, L-glutamina 5 mM, HEPES 20 mM y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Células T47D de carcinoma humano de mama (ATCC) fueron cultivadas en medio DMEM complementado con FCS al 10%, L-glutamina 5 mM, HEPES 20 mM y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. Células M1 de leucemia mieloide de ratón (ATCC) fueron cultivadas en medio RPMI complementado con FCS al 10%,
L-glutamina 5 mM, HEPES 20 mM y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina. El cultivo de las anteriores líneas celulares fue llevado a cabo en presencia o ausencia de la dosis apropiada de IL-6 (IL-6 procedente de células de ovario de hámster chino, de Interpharm Laboratories), como se especifica más adelante.
Ejemplo 3 Transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa y \beta-galactosidasa
La transfección transitoria de células HepG2 de hepatoma humano y células T47D de carcinoma humano de mama fue llevada a cabo usando precipitación de DNA con fosfato cálcico en tampón Hepes, de acuerdo con procedimientos estándares (R. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, EE.UU.). La transfección transitoria de células M1 de leucemia mieloide de ratón fue llevada a cabo usando DEAE-dextrano, de acuerdo con procedimientos estándares (de acuerdo con Ausubel, supra).
Con objeto de detectar actividades luciferasa y \beta-galactosidasa, las células fueron sometidas a extracción in situ mediante incubación durante 15 minutos, a temperatura ambiental, con 1 ml de tampón de extracción (TRIS-fosfato 25 mM, pH de 7,8, DTT 2 mM, EDTA 2 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%)/10^{6} células. Para la actividad luciferasa, 20 \mul de extracto celular fueron directamente analizados con 100 \mul de tampón para ensayo de luciferasa [Tricina 20 mM, MgCO_{3})_{4}Mg(OH)_{2}-5H_{2}O 1,07 mM, MgSO_{4} 2,67 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 33,3 mM, coenzima A 0,27 mM, luciferina 0,47 mM, ATP 0,53 mM]. Para la actividad \beta-galactosidasa, 10 \mul de extracto celular fueron incubados durante 1 hora, a 37ºC, con 100 \mul de sustrato Lumigal (de Lumigen). Las lecturas de Lumigal y luciferasa fueron llevadas a cabo con un luminómetro Berthold Autolumat LB953, cuya salida son cuentas por segundo (cps) integradas a lo largo de un periodo de 30 segundos para luciferasa y de 15 segundos para \beta-galactosidasa.
Se mostró que el plásmido informador pM8SVL confiere sensibilidad a IL-6 después de la transfección transitoria de las células HepG2, aumentando hasta 50-100 veces la expresión de actividad luciferasa (Serlupi Crescenzi et al., póster del 12^{th} European Immunol. Meeting, Barcelona, 14-17 de Junio de 1.994).
Este plásmido fue también probado en células T47D de carcinoma humano de mama y en células M1 de leucemia mieloide de ratón. Las células M1 fueron transfectadas con 0,5 \mug de DNA/10^{6} células usando DEAE/dextrano, mientras que se usaron 2,5 \mug de DNA/10^{5} células para la transfección de células T47D mediante fosfato cálcico.
Estas dos líneas celulares sólo comparten características muy limitadas, aparte de su respuesta común a IL-6 humana. Los resultados (Figura 3) mostraron que la molécula de DNA de M8 del plásmido pM8SVL era significativamente activa en ambas líneas celulares después del tratamiento con IL-6. Como se muestra en la Figura 3, también se observó una significativa respuesta a IL-6 en células M1 con el plásmido pM8TKL de gen informador, en el que la molécula de M8 estaba flanqueada por el promotor de timidina quinasa, que es diferente del promotor de SV40 presente en pM8SVL.
El curso temporal de la inducibilidad de luciferasa en células HepG2 transfectadas ha sido probado después de tratamiento con IL-6 (1 ng/ml). El plásmido pM8SVL fue usado como plásmido de gen informador positivo (con 0,2 \mug/10^{5} células). Las células fueron transfectadas durante la noche, divididas y luego expuestas al tratamiento con IL-6. Los resultados se presentan en la Figura 4 y muestran que podía alcanzarse una respuesta casi completa a IL-6 después de sólo dos horas de tratamiento con IL-6.
Ejemplo 4 Prueba del plásmido inhibidor pM8
La inhibición de la actividad IL-6 por moléculas de DNA de M8 fue medida después de la cotransfección de células HepG2 con i) el plásmido de gen informador pM8SVL que responde a IL-6 y ii) la molécula de M8 insertada en el plásmido inhibidor pM8. Este último plásmido alberga la secuencia de M8 pero no tiene la capacidad para conferir sensibilidad a IL-6. Las células HepG2 fueron transfectadas con hasta 2,5 \mug/10^{5} células del plásmido informador pM8SVL que responde a IL-6 (que contiene M8 y el gen de la luciferasa) y un exceso molar de pM8 de 10 ó 50 veces, en presencia de diversas dosis de IL-6. La cantidad total de DNA por transfección fue mantenida constante con el uso del plásmido portador pC, que es idéntico a pM8 salvo por la ausencia del fragmento específico de DNA de M8, de 165 bp de longitud, en el primer plásmido.
Como se presenta en la Figura 5, el plásmido inhibidor no mostraba una inhibición específica significativa y reproducible de la actividad IL-6 en los cuatro experimentos, ni siquiera con un exceso molar del plásmido inhibidor pM8 de 50 veces. En estos experimentos, el plásmido pM8SVL de gen informador que responde a IL-6 fue usado en una dosis de 0,1 \mug/10^{5} células, mientras que la cantidad constante de DNA total usada en la transfección fue 5 \mug/10^{5} células. La dosis subóptima de IL-6 usada en estos experimentos fue 1 ng/ml. Como se muestra en la Figura 5, la variabilidad fue aceptable con estas condiciones experimentales habida cuenta del hecho de que distintas transfecciones son per se una fuente inevitable de variabilidad.
Ejemplo 5 Prueba del plásmido inhibidor pM8SV
Los resultados presentados en la Figura 5 resultaron algo sorprendentes ya que la secuencia activa de DNA inhibidor de M8 del plásmido inhibidor pM8 es idéntica a la secuencia activa del plásmido de gen informador pM8SVL. Por lo tanto, después de la cotransfección, se esperaría una competición entre estas dos secuencias de M8 idénticas, presentes en plásmidos diferentes, lo que daría lugar a inhibición de actividad IL-6 en el ensayo de gen informador.
Más aún, los resultados anteriormente descritos no pueden ser explicados por la presencia de un exceso de fac-
tor(es) de transcripción específico(s) de IL-6 activado(s), que no es(son) suficientemente neutralizado(s) por las moléculas de DNA inhibidor de M8, ya que los datos fueron obtenidos en presencia de una cantidad restrictiva de IL-6. Además, datos publicados sobre experimentos similares con sitios ligantes de DNA para factores de transcripción conocidos (26-30) no son coherentes con los resultados presentados en la Figura 5.
Una explicación alternativa para los resultados mostrados en la Figura 5 podría ser que secuencias distintas de M8 en el plásmido de gen informador pudieran contribuir a la transducción de señales específicas de IL-6. Estas secuencias deberían faltar en el plásmido inhibidor pM8 pero deberían estar presentes en el plásmido pM8SVL de gen informador positivo (por ejemplo, secuencias del promotor génico precoz de SV40, que pueden unirse a factores de transcripción generales). Por lo tanto, el plásmido inhibidor pM8 sería ineficaz a la hora de competir con el plásmido pM8SVL de gen informador.
Con objeto de probar esta hipótesis, se construyó un plásmido inhibidor (pM8SV) que contenía, como secuencias de DNA inhibidoras de IL-6, tanto la secuencia de M8 como la secuencia del promotor de SV40 (véase la Figura 1). Este plásmido inhibidor fue probado en el ensayo de gen informador para IL-6 con células HepG2. Se llevaron a cabo cuatro experimentos independientes, con transfecciones duplicadas por experimento. Las transfecciones fueron llevadas a cabo con 0,1 \mug de DNA plasmídico informador y el exceso molar de plásmido inhibidor mostrado en la Figura 6. La cantidad total de DNA introducido por transfección fue mantenida constante con el plásmido portador. Las células transfectadas fueron tratadas durante 18 horas con 1 ng/ml de IL-6.
Los resultados, mostrados en la Figura 6, indicaban una clara inhibición, dependiente de la dosis, de la actividad IL-6 por el plásmido inhibidor pM8SV. Los datos originales de la Figura 6 se presentan en la Tabla 1. En cada experimento se llevaron a cabo tres transfecciones duplicadas por dosis de plásmido inhibidor. Para cada experimento, los valores inducidos y no inducidos mostrados en una sola fila proceden de la misma transfección. Los valores presentados de emisión de luz son cps integradas a lo largo de un periodo de 30 segundos. Como puede verse en dicha Tabla 1, se observó cierta variabilidad en estos experimentos, especialmente a dosis inferiores del plásmido inhibidor, pero normalmente los coeficientes de variación de las transfecciones duplicadas estaban bien por debajo de 20%.
Con objeto de descartar que la inhibición de actividad IL-6 proporcionada por el plásmido inhibidor pM8SV se debiera exclusivamente a la secuencia de DNA del promotor de SV40 y no a la combinación de secuencias de M8 y SV40, se construyó un plásmido inhibidor adicional y se probó en el ensayo de gen informador. Este plásmido contenía sólo la secuencia de DNA de SV40 como inhibidor de la actividad IL-6, sin la secuencia inhibidora de M8 ni el gen de la luciferasa.
Las transfecciones fueron llevadas a cabo con 0,1 \mug de DNA plasmídico informador y el exceso molar de plásmido inhibidor mostrado en la Figura 7. La cantidad total de DNA introducido por transfección fue mantenida constante con el plásmido portador. Las células transfectadas fueron tratadas durante 18 horas con 1 ng/ml de IL-6. Los resultados, presentados en la Figura 7, muestran que este plásmido inhibidor (pSV) sólo exhibía una inhibición parcial de la actividad IL-6, la cual nunca resultó superior a 40% y no era dependiente de la dosis. Esto permite concluir que la secuencia de DNA de SV40 sola no era suficiente para una inhibición eficaz de la actividad IL-6. Por otra parte, el plásmido informador pGL2-pv que contiene luciferasa contiene la secuencia promotora de SV40 pero no la secuencia de M8, lo que da lugar a un nivel basal de expresión de luciferasa no más inducible por IL-6. En este plásmido, el nivel basal de expresión de luciferasa no fue inhibido por el plásmido inhibidor pM8SV, lo que muestra que factores de transcripción que sólo están específicamente unidos a la región promotora de SV40 de pGL2-pv no son eficazmente eliminados por el plásmido inhibidor pM8SV. En realidad, en presencia del último plásmido inhibidor, la actividad luciferasa procedente del plásmido informador pGL2-pv resultó aún mayor que en ausencia del plásmido inhibidor (no mostrado).
Ejemplo 6 Inhibición, por pM8SV, de la actividad IL-6 conferida por el plásmido pHPSVL de gen informador
Se quiso entonces probar el plásmido inhibidor pM8SV en un ensayo de gen informador adicional para IL-6, en el que la secuencia de DNA diana que media en la señal de IL-6 en el plásmido de gen informador no se corresponde perfectamente con la secuencia inhibidora de M8. Por lo tanto, se transfectaron células HepG2 con el plásmido pHPSVL, que contiene 841 pares de bases de la secuencia promotora del gen de la haptoglobina humana, flanqueadas por el promotor de SV40 y el gen de la luciferasa. En este plásmido está presente un sitio APRE procedente de la secuencia del promotor de haptoglobina (de acuerdo con Maeda et al., J. Biol. Chem., 260 (11), páginas 6.698-709, 10 de Junio de 1.985). Se ha mostrado previamente que este plásmido responde a IL-6 mediante un aumento de expresión de luciferasa de 6-8 veces (Serlupi Crescenzi et al., póster del 12th European Immunol. Meeting, Barcelona, 14-17 de Junio de 1.994).
En la Figura 8 se muestran los resultados de un experimento de transfecciones triplicadas. Después de la cotransfección del plásmido pHPSVL de gen informador con un exceso molar del plásmido portador de 50 veces, la inducibilidad por IL-6 dio lugar a una expresión de luciferasa aproximadamente 4 veces mayor con respecto al nivel basal. Por el contrario, la cotransfección con un exceso molar del plásmido inhibidor pM8SV de 50 veces anuló completamente la inducibilidad por IL-6. Por lo tanto, el plásmido inhibidor pM8SV era también capaz de inhibir la actividad IL-6 cuando se probaba un plásmido de gen informador, que respondía a IL-6, diferente de pM8SVL (por ejemplo, el plásmido informador pHPSVL).
Ejemplo 7 Prueba del plásmido inhibidor pM8SV en células T47D
El plásmido inhibidor pM8SV fue también probado en el ensayo de gen informador de pM8SVL usando células T47D de carcinoma humano de mama, en las que la transducción de la señal de IL-6 podría ser diferente que en las células de hepatoma. Como se mencionó previamente, el ensayo de gen informador para IL-6 con el plásmido de gen informador pM8SVL se lleva a cabo en esta línea celular aunque no está optimizado. Puesto que la sensibilidad del ensayo es algo menor con células T47D, las transfecciones fueron llevadas a cabo con 1 \mug del plásmido de gen informador positivo/10^{5} células, que es un nivel relativamente elevado de DNA plasmídico. Por lo tanto, en este experimento se observó inhibición inespecífica en presencia de plásmido portador o inhibidor en exceso, lo que da lugar a una mayor variabilidad de la inhibición específica de IL-6.
Los resultados se muestran en la Tabla 2. Se muestran las medias (MED) y desviaciones estándares (SD; del inglés, standard deviation) de transfecciones triplicadas de dos experimentos.
Se calculan los valores medios del nº de veces de aumento de inducción a partir de los valores originales de cada transfección. Se usaron 1 y 0,5 \mug de plásmido de gen informador en los experimentos 1 y 2, respectivamente, por 10^{5} células transfectadas.
En estos experimentos se llevaron a cabo transfecciones independientes de plásmido portador y plásmido inhibidor, usándose ambos plásmidos con el indicado exceso molar con respecto al plásmido informador.
Después de la transfección, las células fueron inducidas durante 18 horas con 1 ng de IL-6/ml. Los valores presentados de emisión de luz son cps integradas a lo largo de un periodo de 30 segundos. En estos experimentos, la inhibición específica de IL-6 fue evaluada comparando la inducción obtenida en presencia de plásmido inhibidor en exceso, con la inducción obtenida en presencia de la dosis correspondiente de plásmido portador.
Además, a causa de la inhibición inespecífica, el nivel basal de expresión de luciferasa estaba próximo al límite de cuantificación del ensayo. Los resultados, presentados en la Tabla 2 (véase el Experimento 1), mostraron que, después de transfecciones triplicadas, se obtenía una relevante inhibición específica de actividad IL-6 con un exceso molar de plásmido inhibidor pM8SV de 20 veces pero no con un exceso molar de 10 veces. No pudo probarse un exceso molar de plásmido inhibidor de 50 veces en este experimento a causa de que la inhibición inespecífica llegó a ser demasiado elevada.
Estos resultados no pudieron ser reproducidos en un experimento adicional cuando se usaron 0,5 \mug de DNA/10^{5} células (Tabla 2; véase el Experimento 2). La razón de esta falta de reproducibilidad puede ser la relativamente elevada variabilidad y la baja sensibilidad del ensayo de gen informador en T47D. Alternativamente, una selectividad diferencial de células diana podría explicar estos resultados.
Ejemplo 8 Definición de la secuencia de DNA inhibidora mínima
Con objeto de identificar la secuencia de DNA mínima que conserva la capacidad para inhibir la unión de factores de transcripción pertinentes para la inducibilidad de IL-6, puede usarse (de acuerdo con Ausubel) el planteamiento experimental del ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA; del inglés, electrophoretic mobility shift assay). Usando el ensayo de gen informador mencionado en el Ejemplo 3 y los ejemplos siguientes, puede desarrollarse una prueba para la inhibición funcional impartida por esta secuencia mínima. La secuencia de DNA mínima de la que se mostró que inhibe funcionalmente la actividad IL-6 en un ensayo de gen informador fue el fragmento BamH I-Hind III, de 350 bp, del plásmido inhibidor pM8SV, que contiene una repetición óctuple de una secuencia de DNA APRE y la secuencia del promotor precoz de SV40. Se sabe que esta última secuencia contiene sitios ligantes para factores de transcripción generales, tales como un sitio de tipo AP-1 (según comunicaron Zenke et al., EMBO J., 5 (2), páginas 387-97, 1.986) y una repetición séxtupla del sitio Sp-1 (según comunicaron Dynan et al., Cell, 35, páginas 79-87, 1.983). El fragmento BamH I-Hind III de DNA puede ser suprimido por sus extremos 5' y/o 3' por medios convencionales tales como PCR o tratamiento con nucleasas (de acuerdo con Ausubel) con objeto de que contenga, por ejemplo, dos secuencias APRE y sólo un único sitio ligante, o algunos sitios ligantes, para factores de transcripción específicos procedentes del promotor precoz de SV40. Las secuencias de DNA resultantes pueden ser usadas para pruebas de inhibición del ensayo de gen informador basado en pSVM8L, en células
HepG2.
Además, un fragmento de DNA mínimo que conserve la capacidad completa para inhibir funcionalmente la señal de IL-6 puede ser usado en el EMSA marcando este DNA con un ^{32}P-nucleótido a través de medios convencionales, tales como marcación terminal o reacciones de compleción de Klenow. El fragmento de DNA marcado resultante puede ser incubado con extractos nucleares de células HepG2 después de tratamiento con IL-6.
Pueden también coincubarse cantidades crecientes de una secuencia de DNA competidora, tal como cualquiera de los fragmentos de DNA no marcados que resultaban de las anteriormente mencionadas deleciones del fragmento BamH I-Hind III de DNA inhibidor. Después de la incubación, la mezcla puede ser desarrollada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante. La unión de factores de transcripción relevantes al fragmento de DNA marcado que se prueba vendrá revelada por un desplazamiento (retraso), en el gel, de la movilidad esperada para el DNA marcado no unido. La inhibición de esta unión en presencia de secuencias de DNA competidoras no marcadas vendrá revelada por la desaparición específica, en el gel, de las bandas desplazadas.
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(Tabla pasa a página siguiente)
1
TABLA 2 Ensayo de gen informador para IL-6 en T47D
2
(1) INFORMACIÓN GENERAL
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 6 JOHN GORSIRAWEG
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: CURAÇAO
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): NINGUNO
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: INHIBIDOR DE LA ACTIVIDAD IL-6
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: compatible con ordenador personal IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn, Licencia nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 356 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCTTCT GGGAATTCTG ATCCTTCTGG GAATTCTG 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGCCGCC TCGAGG 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCCTCGA GGCGGCCGCG GTAC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTACGCGTGC AGTATTGACC CTTCCTCCT 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCAGATCTA GCTCACTTCT CCCCCTTC 
\hfill
28

Claims (12)

1. Uso de una secuencia de nucleótidos en la fabricación de una composición farmacéutica útil en terapias para inhibir la acción de IL-6, en el que dicha secuencia de nucleótidos es capaz de inhibir la actividad IL-6 y comprende:
i) al menos una secuencia de nucleótidos que es un elemento APRE de fórmula general ZXMYKGKAA, en la que Z representa T o G o también puede estar ausente, X representa T o también puede estar ausente, M representa C o A, Y representa C o T, y K representa T o G,
conjuntamente con
ii) al menos una secuencia de nucleótidos que constituye un sitio ligante para factores de transcripción distinto del elemento APRE.
2. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que (i) es la secuencia de nucleótidos TTCTGGGAA.
3. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que (ii) es seleccionada del grupo que consiste en la caja TATA y los sitios ligantes para los siguiente factores de transcripción: AP-1, AP-2, HNF-1, SP-1, NF-6B, Oct-1, E-2 y SRF.
4. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el elemento APRE (i) está repetido al menos 2 veces.
5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en el que el elemento APRE está repetido de 3 a 10 veces.
6. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4 ó 5, en el que el elemento APRE está repetido 8 veces.
7. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia (i) comprende al menos dos elementos APRE diferentes.
8. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia (ii) comprende al menos dos secuencias oligonucleotídicas diferentes que constituyen un sitio ligante para factor de transcripción.
9. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que la secuencia (ii) es el promotor precoz de SV40.
10. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es como la presentada en la ID. SEC. Nº 1.
11. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia de nucleótidos está contenida en un vector plasmídico.
12. Un uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la composición farmacéutica es para tratar mielomas, enfermedades autoinmunes, pérdida ósea, hipercalcemia o enfermedades inflamatorias que incluyen artritis reumatoide, glomerulonefritis, soriasis y enfermedad de Castelman.
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