CZ309696B6 - Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006 - Google Patents
Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ309696B6 CZ309696B6 CZ2021-484A CZ2021484A CZ309696B6 CZ 309696 B6 CZ309696 B6 CZ 309696B6 CZ 2021484 A CZ2021484 A CZ 2021484A CZ 309696 B6 CZ309696 B6 CZ 309696B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- isopolar
- isosteric
- phosphonate
- cells
- cpg
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- KDWFDOFTPHDNJL-TUBOTVQJSA-N odn-2006 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=S)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(S)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H](C[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)[C@@H](O)C1 KDWFDOFTPHDNJL-TUBOTVQJSA-N 0.000 title description 18
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 title 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 18
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 8
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 8
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 claims description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 4
- 125000000847 cytosin-1-yl group Chemical group [*]N1C(=O)N=C(N([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 4
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 6
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 229940046168 CpG oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 5
- 102000008235 Toll-Like Receptor 9 Human genes 0.000 description 5
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 5
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N thiophenol Chemical compound SC1=CC=CC=C1 RMVRSNDYEFQCLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 4
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 210000005134 plasmacytoid dendritic cell Anatomy 0.000 description 4
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101100054570 Caenorhabditis elegans acn-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 ethylenediaminetetraacetic acid triethylamine 5-ethylthiotetrazole Chemical compound 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000017306 interleukin-6 production Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxolane Chemical group C1COCO1 WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 2,5-bis(3-dodecylthiophen-2-yl)thiophene Chemical compound C1=CSC(C=2SC(=CC=2)C2=C(C=CS2)CCCCCCCCCCCC)=C1CCCCCCCCCCCC GVZJRBAUSGYWJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 230000006051 NK cell activation Effects 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000011488 interferon-alpha production Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000007112 pro inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M sodium perchlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)(=O)=O BAZAXWOYCMUHIX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910001488 sodium perchlorate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940044655 toll-like receptor 9 agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Vynález se týká neizosterních izopolárních fosfonátových oligonukleotidů o sekvenci SEQ. ID. NO. 15’-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3’ obsahující ve všech čtyřech CpG motivech fosfonátové jednotky obecného vzorce 2, a jejich použití jako adjuvans ve vakcínách a při léčbě chronické lymfocytické leukemie.
Description
Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006
Oblast techniky
Vynález se týká možného zvýšení imunostimulačního účinku za použití syntetického oligodeoxynukleotidu (ODN) s motivem CpG. Syntetické CpG ODN jsou předmětem intenzivního výzkumu, neboť vyvolávají prozánětlivou reakci typu I a jsou proto úspěšně používány jako pomocné látky při aplikaci vakcín.
Dosavadní stav techniky
CpG oligodeoxynukleotidy (neboli CpG ODN) jsou krátké jednovláknové syntetické molekuly DNA, které obsahují různý počet sekvencí CpG (Cytosin-Guanin), kde „p“ označuje fosfodiesterovou vazbu mezi po sobě jdoucími 2‘-deoxynukleosidy, 2‘-deoxycytidinem a 2‘deoxyguanosinem. Oligodeoxynukleotidové sekvence obsahující motiv CpG s nemethylovanou nukleobazí cytosin jsou v bakteriální a virové DNA přítomny přibližně s 20 x vyšší frekvencí než v DNA obratlovců (Krieg et al., Nature, 374, 546, 1995). Patogenní DNA a také syntetické oligonukleotidy s CpG motivem jsou rozpoznávány receptorem TLR9 (toll like receptor 9), což vede k indukci řady imunitních odpovědí (Krug et al., Eur. J. Immunol. 2154, 31, 2001).
Bylo již identifikováno několik základních typů CpG oligodeoxynukleotidů (typ A, typ B a typ C), které se liší sekvencí, sekundární strukturou a aktivitou vůči mononukleárním buňkám periferní krve (PBMC, peripheral blood mononuclear cells). Na rozdíl od typu A, který indukuje v pDC (plazmacytoidní dendritické buňky) syntézu IFN-alpha (interferon alfa) a nepřímo aktivuje NK buňky (natural killer, přirozené zabíječe), typ B účinně stimuluje signalizační dráhu NF-kB (nukleární faktor kappa-zesilovač lehkého řetězce aktivovaných B buněk), podporuje aktivaci DC i B buněk (B lymphocytů) a produkci IL-6 (interleukin-6) (Vollmer et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 195, 2009). Po aktivaci zvyšují DC i B buňky expresi hlavního histokompatibilního komplexu II (MHCII, major histocompatibility complex) i kostimulačních molekul (CD80, CD83 i CD86) (Hartmann et al., PNAS USA, 96, 9305, 1999). Typ C vykazuje znaky typu A i typu B, tj. indukci pDC, aktivaci B buněk i produkci IFN-alpha.
Přirozené fosfodiesterové CpG oligonukleotidy (Yu et al., BBRC, 297, 83 2002) a methylfosfonátové oligonukleotidy s jednou modifikací mimo CpG motiv (Yu et al., Bioorg. Med. Chem., 9, 2803 2001) jsou rovněž agonisty TLR9, avšak velmi účinnými agonisty jsou syntetické, plně fosforothioátové CpG oligonukleotidy (např. ODN2006) (Hartmann G. et al., Eur. J. Immunol. 33, 1633, 2003). Fosforothioátová modifikace CpG oligodeoxynukleotidu zvyšuje jejich nukleázovou stabilitu a transport do buněk, a tím i biologickou dostupnost. Přítomnost fosfodiesterové modifikace v CpG motivu u jinak plně fosforothioátových CpG oligodeoxynukleotidů pak dále zvyšuje jejich aktivitu (Pohar et al., Sci Rep. 7, 14598, 2017). ODN2006 je v různých fázích předklinických a klinických zkoušek, zejména jako adjuvans k vakcínám cíleným proti antraxu, hepatitidě B, malárii, chřipce, astmatu, HIV a různým typům nádorů (Scheiermann et al., Vaccine, 32, 6377, 2014). Dále je předmětem klinických zkoušek proti chronické lymfocytické leukemii (CLL) (Decker et al., Leukemia and Lymphoma, 42, 301, 2001; Dampmann et al., PLoS ONE 15, e0228674, 2020) a vykazuje silný adjuvantní efekt s vakcínou proti nádorům rakoviny prsu (Babaer et al., Cancers, 11, 672, 2019).
Na rozdíl od dokonale zmapovaných modifikací cytosinové a guaninové nukleobáze v CpG motivu a jejich vlivu na interakci s TLR9, (Putta at al., NAR, 34, 3231, 2006) (Kandimalla et al., PNAS USA, 102, 6925, 2005), nebyly dosud ani připraveny a ani jinak zkoumány izopolární fosfonátové modifikace fosfodiesterové internukleotidové vazby v CpG motivu CpG oligonukleotidů.
- 1 CZ 309696 B6
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou neizosterní izopolární fosfonátové oligonukleotidy
5’-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3’ (vzorec 1, SEQ. ID. NO. 1), obsahující ve všech čtyřech CpG motivech fosfonátové jednotky obecného vzorce
kde R1 je -P(0)(OH)2, R2 je -H, a C je cytosin-l-yl (2a), anebo R1 je -H, R2 je -P(O)(0H)2 a C je cytosin-l-yl(2b).
Předmětem vynálezu je také neizosterní izopolární fosfonátový oligonukleotid o vzorci 1:
5’-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3’, který ve všech čtyřech polohách obsahuje CpG motiv
(3), kde G je nukleobáze guanin a C je, jak uvedeno výše, označený jako ON-678A.
Předmětem vynálezu je dále neizosterní izopolární fosfonátový oligonukleotid o vzorci 1:
5’-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3’, který ve všech čtyřech polohách obsahuje CpG motiv
(4),
-2 CZ 309696 B6 kde G je nukleobáze guanin a C je, jak uvedeno výše, označený jako ON-695C.
Předmětem vynálezu je také použití neizosterních izopolárních fosfonátových oligonukleotidů o vzorci 1 jako adjuvans ve vakcínách, především vakcínách cílených proti anthraxu, hepatitidě B, malárii, chřipce, astmatu, HIV a různým typům nádorů, např. nádorům rakoviny prsu, a při léčbě chronické lymfocytické leukemie.
V klinicky testovaném ODN2006 jsou všechny internukleotidové vazby fosforothioátové (nemůstková P=S vazba), s centrem chirality na atomu fosforu, což umožňuje vznik řady diastereoizomerních oligonukleotidů. Přítomnost P=S seskupení ve čtyřech CpG motivech oligonukleotidu ODN2006 tedy dává vznik 2Λ4, tj. 16 „CpG“ diastereoizomerům, které se mohou lišit jak afinitou, tak i mírou aktivace receptoru TLR9.
Naproti tomu zde předkládané fosfonátové oligonukleotidy o sekvenci 1, označené jako ON695C a ON-678A, obsahují ve všech čtyřech CpG motivech fosfoesterovou-etherovou vazbu bez chirality na atomu fosforu v důsledku přítomnosti nemůstkové P=O vazby. Navíc přítomnost anelovaného dioxolanového kruhu v 2'-deoxycytidylátové jednotce rigidizuje konfiguraci fosfonátové intenukleotidové vazby v CpG motivech ON-695C a ON-678A, což vede k jejich částečné preorganizaci, která je výhodnější pro interakci s receptorem TLR9. Výhodou je i absolutní stabilita P-C vazby vůči působení nukleáz.
V reportérovém testu NF-kB (viz příklad 4) bylo prokázáno, že účinná stimulace signální dráhy NF-kB (EC50 = 482 nmol.l-1, relativní maximum křivky „dávka-odezva“ max = 1) pomocí ODN2006 byla významně zvýšena použitím z něj odvozených oligonukleotidů ON-695C a ON678A. Obě uvedené sloučeniny účinně stimulovaly reportérovou buněčnou linii HEK-Blue™ hTLR9 při nižších koncentracích a dosahovaly i vyššího maxima (EC50ON-695C = 15 nmol.l-1, max = 2,20; EC50ON-678a = 112 nmol.l-1, max = 2,41), viz tab. 2.
Oligonukleotidy ON-695C i ON-678A jsou v porovnání s ODN2006 rovněž účinnějšími stimulanty B buněk (EC50ON-695C = 12 nmol.l-1, resp. EC50ON-678A = 17 nmol.l-1 vs EC50ODN2006 = 33 nmol.l-1) i produkce IL-6 buňkami PBMC. Oligonukleotid ON-695C také aktivoval cDC i NK buňky v nižších koncentracích v porovnání s mateřskou sloučeninou ODN2006 (viz tab. 2).
Objasnění výkresů
Obrázek 1A, B je HPLC profil, který znázorňuje stabilitu ON-695C (1A) a ON-695A (1B) v lidské plasmě. Obr. 1C je HPLC profil, který znázorňuje stabilitu ODN2006 v lidské plasmě.
Seznam zkratek:
ACN acetonitril
Ac2O acetanhydrid
CD80, CD83, CD86 kostimulační molekuly
CLL chronická lymfocytická leukemie
DC dendritické buňky
DCA kyselina dichloroctová
DCM dichlormethan cDC konvenční dendritické buňky pDC plazmacytoidní dendritické buňky
DDTT 3-(dimethylamino-methyliden)amino)-3H-1,2,4-dithiazol-3-thion
DMF dimethylformamid
DNAPac PA100 kolona pro vysoce účinnou chromatografii oligonukleotidů od firmy ThermoFisher
- 3 CZ 309696 B6
| EDTA Et3N ETT FBS | ethylendiaminotetraoetová kyselina triethylamin 5-ethylthiotetrazol fetální hovězí sérum |
FC pufr pufr pro značení vzorků pro průtokovou cytometrii
MALDI TOF hmotnostní spektrometrie (matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace)
| MeIm MHCII Mop NEP-Cl PBMC PBS PhSH RPMI 1640 THF v/v | 1-methylimidazol MHC glykoprotein II. třídy 4-methoxy- N-oxido-2-pikolyl 2-chloro-5,5-dimethyl-1,3,2-dioxafosforinan-2-oxid mononukleární buňky z periferní krve fosfátem pufrovaný solný roztok thiofenol růstové médium vyvinuté v Roswell Park Memorial Institute tetrahydrofuran objem/objem |
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Syntéza fosfonátových CpG oligonukleotidů
Oligonukleotidy ON-695C a ON-678A byly syntetizovány podle protokolu uvedeného v tab. 1 od 3'-konce k 5'-konci na porézním skle (Long Chain Alkyl Amine Controlled Pore Glass, LCAA-CPG) modifikovaným 5-O-dimethoxytrityl-l-(thymin-1-yl)-β - D-ribofuranos-3-O ylsukcinátem (36 pmol/g), vycházeje z 30 mg nosiče (kapacita 1 pmol) pro každou syntézu provedenou na automatickém DNA/RNA syntetizátoru GenSyn (Vývojové dílny UOCHB). Přirozené nukleotidové jednotky byly zaváděny klasickou fosforamiditovou metodou s využitím komerčních deoxynukleosidfosforamiditů (ChemGenes). Zavedení fosfonátových nukleotidových jednotek s využitím fosfonátových S- a R- monomerů (Páv et al., OBC, 15, 701, 2017) a (Endová et al., Tetrahedron, 54, 1151, 1998) bylo provedeno moderní fosfotriesterovou metodou. Připravené oligonukleotidy ON-695C a ON-678A byly charakterizovány MALDI TOF. Pro ON-695C vypočteno: 7 744 Da; nalezeno: 7 746 Da. Pro ON-678A vypočteno: 7 744 Da; nalezeno: 7 747 Da.
Tab. 1 Syntetické cykly pro přípravu fosfonátových CpG-oligonukleotidů ON-695C a ON-678A
- 4 CZ 309696 B6
| Fosíbramiditový kondenzační cyklus komerčních nukleosidfbsforamiditii | |||
| Operace | Činidlo | Objem (ml) | Čas (s) |
| 1. Dctritylacc | 3% DCA v DCM | 3,0 | 135 |
| 2. Kondenzace | 0.1 mol.I'1 nukleosidfosToramidil v ACN | 0,1 | 600 |
| 0,25 mol.V1 ΕΤΊ v ACN | 0,1 | ||
| 3, SuHurizace | 0.1 mol.r'- DDTT v pyridinu | 0.2 | 180 |
| 4. Blokování | AciO/pyridinTHE 1:1:8 | o.l | 150 |
| 1-Mehn/Tl JF 1:9 | 0.1 | ||
| Konec fosforamiditového cyklu | |||
| Fosfntriesterový kondenzační cyklus S- a /ř-mononieru | |||
| Operace | Činidlo | Objem (ml) | Čas (s) |
| 1. Dctritylacc | 3% DCA v DCM | 3 | 135 |
| 2. Kondenzace | 0,1 mol.I’1 A- nebo /?-motiomer v pyridin/ACN l :1 | OJ | 600 |
| 0,3 mol.I’1 NHP-Cl vpyridin/ACN 1:9 | OJ | ||
| 3, Blokováni | Ac/J/pyridin/TllE 1:1:8 | 0,1 | 150 |
| 1 -Mclm/THE 1:9 | OJ | ||
| Konec fosfotriesterověho cyklu | |||
| Koncové postsyntctické operace | |||
| 1. Dcalkylacc Mop skupin | PhSILEhN-DMF (23:32:45) | 0,5 | 16 h |
| 2. Odštěpeni a odchráněni | Plynný amoniak 0,7 bar. 20 °C | - | 16 h |
| 3. kmexová chromatogmfie na koloně DNAPac PA 100 (Dionex) 10x250 mm | 0.02 mol.Č —* 0.5 mol.I1 NaCIOj/60 min v 0.050 mokl’1 TR1S-HC1 pufr (pil 7.5) s 10 % (v/v) ACN; 3 ml.min1; 80 °C | ||
| 4. Odsolcní na koloně Luna Cl 8 (10 pm) 4x30 mm | 0.05 mol.I-1 octan amonný—»90% vodný McOII/20 min, 2 nil.min20 °C | ||
| 5. Adjustace | Lyofilizace z IIPLC vody |
-5 CZ 309696 B6
Příklad 2: Stabilita ON-695C a ON-678A v lidské plasmě ve srovnání s ODN2006
Roztok CpG-oligonukleotidu (1 nmol) v 0,05 mol.l-1 TRIS-HC1 pufru (50 μΐ) pH 7.5 s 0,01 mol.l-1 síranem hořečnatým byl inkubován 20 hodin s lidskou plasmou (50 μl) při 37 °C. Za těchto podmínek ukázala IE HPLC analýza úplnou nukleázovou stabilitu jak ODN2006 (obr. 1C), tak i fosfonátových oligonukleotidů ON-695C a ON-678A (obr. 1A a obr. 1B).
Podmínky IE HPLC analýzy:
Kolona: DNAPac PA100 (Dionex) 4,6 x 250 mm, eluce: 0^0,3 mol.l-1 NaClO4/30 min v 0,05 mol.l-1 TRIS-HC1 (pH 7,5) s 10 % (v/v) ACN; 1 ml/min; 80 °C, detekce: UV260 nm.
Příklad 3: Aktivace PBMC buněk a produkce cytokinů
PBMC buňky byly izolované pomocí centrifugace na Ficoll-Paque PLUS (17144003, Cytiva) z „buffy coatu“ zdravých dárců. 1 milion PBMC buněk/jamku byl nasazen do U-96 jamkových destiček (734-2228, VWR) v 75 μl kompletního RPMI1640 média (10% FBS, 100 U/ml penicilinu a 100 μg/ml streptomycinu). Bylo přidáno 75 μl 2x koncentrovaných látek v médiu (finální koncentrace látek byla 5; 1; 0,2; 0,04; 0,008 a 0,0016 μΜ). Data byla měřena v dubletu a byla porovnána s nestimulovanou skupinou, kde místo látek bylo přidáno médium. Po 16 h a 48 h byly destičky centrifugovány (200 x g, 5 min.), bylo odebráno 50 μl supernatantu a v něm byla stanovena hladina cytokinů (IFN α, IFN γ. IL-6 a TNF α) metodou luminex (ProcartaPlex Human Basic Kit EPX010-10420-901, IL-6 simplex kit FPX01 A-10213-901. TNFα simplex kit EPX01A-10223-901, IFNα simplex kit EPX01A-l0216-901, IFNγ simplex kit 10228-901; Invitrogen) podle doporučení výrobce na přístroji MAGPIX (Millipore). Aktivace konvenčních DC (cDC), B i NK buněk byla analyzována po 48 h. Buněčné pelety (po 48 h) byly promyty PBS a mrtvé buňky byly značené pomocí „Zombie NIR Fixable Viability kit“ (kat. č. 423106, Biolegend). Značené PBMC byly promyty FC pufrem (PBS s 0,5 % hovězího sérového albuminu a 2 mM EDTA), centrifugovány (200 x g, 5 min) a pelety byly resuspendované v koktejlu níže uvedených protilátek ředěných 1/100 v FC pufru. Po 20 minutové inkubaci (tma, teplota místnosti) byly vzorky promyty přídavkem 150 μl FC pufru na jamku a analyzovány na cytometru BD LSRFortessa.
Průměry naměřených koncentrací cytokinů odečtené z kalibrační křivky (luminex) nebo hodnoty geometrického průměru intenzity fluorescence (cytometrie) vybraných populací a odpovídajících protilátek (znaků) byly vyneseny pro jednotlivé koncentrace testovaných látek v programu GraphPad Prism (verze 8.4.3). Data byla proložena křivkou pomocí čtyřparametrické nelineární robustní regrese. Z této křivky „dávka-odezva“ byla odečtena hodnota EC50 a její maximum.
Konvenční DC (cDC) byly definovány jako jednobuněčná živá populace CD3-CD14-CD19HLA-DR+CD11 c+ buněk a B buňky jako CD3-CD14-CD19+ populace. Pro analýzu byly použity tyto protilátky: anti-CD3-BV605 (BD, kat. č. 563219), anti-CD14-BV605 (BD, kat. č. 564054), anti-CD19-BUV395 (BD, kat. č. 563549), anti-HLA-DR-PE-CF594 (BD, kat. č. 562331), anti-CD11c-BB515 (BD, kat. č. 564491), anti-CD86-APC (kat. č. MHCD8605, ThermoFisher), anti-CD69-V450 (kat. č. 560740, BD). Pro odlišení živých buněk bylo použito barvení pomocí „Zombie NIR Fixable Viability kit“ (kat. č. 423106, Biolegend). Cytometrické údaje byly zaznamenány na přístroji BD I.SRFortessa Uvedené hodnoty jsou výsledkem nejméně tří nezávislých experimentů. Kultivace PBMC buněk probíhala v U-96 jamkové desce, 1 mil. PBMC/jamku/100 až 200 μl po dobu 48 h, v kompletním mediu RPMI 1640 s 10% FBS a přídavkem streptomycinu/penicilinu.
ODN2006 stimuloval PBMC k produkci IL-6 (EC50 = 34 nmol.l-1 relativní maximum křivky max = 1, průměrná hodnota = 19,3 ng.ml-1), aktivoval konvenční DC buňky (cDC) (EC50 = 31 nmol.l-1), B buňky (EC50 = 33 nmol.l-1) i NK buňky (EC50 = 48 nmol.l-1). Aktivace cDC a B buněk byla stanovena průtokovou cytometrií pomocí exprese kostimulační molekuly CD86, pro
- 6 CZ 309696 B6 posouzení aktivace B a NK buněk byl použit aktivační znak CD69. Oligonukleotidy ON-695C i ON-678A jsou v porovnání s ODN2006 účinnějšími stimulanty B buněk (EC5oON'695C = 12 nmol.l-1, resp. EC5oON 678A =17 nmol.l-1 vs ECso0™2006 = 34 nmol.l-1) i produkce IL-6 buňkami PBMC (relativní maximum křivky „dávka-odezva“ max = 1,8 resp. 1,4 vs 1, viz tab. 2). Oligonukleotid ON-695C rovněž aktivoval eDC i NK buňky v nižších koncentracích v porovnaní s mateřskou sloučeninou ODN2006 (EC5oON-695C = 6 nmol.l-1 vs ECso0™2006 = 31 nmol.l-1 při aktivaci EC5oON-695C =15 nmol.l-1 vs ECso0™2006 = 44 nmol.l-1 při aktivaci NK buněk), viz tab. 2.
Tab. 2 Struktura jednotky cytidylátu v CpG motivu oligonukleotidů a jejich biologická charakteristika
| ODN2006 C Ο (R.S)I.S ΗΟ'Ρ'''' | ON-678A „ c OJSLO Lo HO | OH-695C £ OqRj,o LO HO'P'· | ||||
| ECjo [nM] | max [AU] | EC50 [nM] | max [AU] | EC% [nM] | max [AU] | |
| ΝΙ'-κΒ rep. esej | 482 | 1 | 112 | 2.41 | 15 | 2,20 |
| IFN alpha | 17 | 1 | 15 | 0,94 | 24 | 3,65 |
| IL-6 | 34 | 1 | 34 | 1.39 | 20 | 1,81 |
| II’N gamma | 80 | 1 | 41 | 1,05 | 16 | 1,01 |
| aktivace B buněk | 33 | 1 | 17 | 0,90 | 12 | 0,87 |
| aktivace eDC | 31 | 1 | 31 | 0,88 | 6 | 0,82 |
| aktivace NK buněk | 44 | 1 | 48 | 0,84 | 15 | 0,87 |
Příklad 4: Účinná stimulace signální dráhy NF-kB
000 HEK-BIue™ hTLR9 buněk/jamku bylo nasazeno do 96 jamkových destiček („half area“, 675180, Greiner bio-one) pokrytých poly-D-lysinem v 100 μΐ kompletního DMEM média (10% FBS, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu). Po 16 h bylo medium odsáno, přidáno 30 μΐ nového média a 30 μΐ 2x koncentrovaných látek v médiu (finální koncentrace látek byla 5; 1; 0,2; 0,04; 0,008 a 0,0016 pmol.l-1). Data byla měřena v dubletu/tripletu a byla porovnána s nestimulovanou skupinou, kde místo látek bylo přidáno medium. Po 16 h byly destičky centrifugovány (200 x g, 5 min.), bylo odebráno 20 μΐ supernatantu a v něm byla stanovena aktivita alkalické fosfatázy která je pod kontrolou promotoru pro IFN-/Í, spojeného s pěti vaznými místy pro NF-κΒ i AP-1. Pro stanovení fosfatázy byl použit substrát Quanti-blue (repqbs, Invivogen) podle doporučení výrobce. 180 μΐ substrátu bylo přidáno k 20 μΐ odebraného supernatantu a po 15 až 45 min byla změřena absorbance při 630 nm (Tecan Spark). Průměry naměřených absorbanci byly vyneseny pro jednotlivé koncentrace látek v programu GraphPad Prism (verze 8.4.3) a byly proloženy křivkou pomocí čtyřparametrické nelineární robustní regrese. Z této křivky „dávka-odezva“ byla odečtena hodnota EC50 a její maximum.
Bylo prokázáno, že účinná stimulace signální dráhy NF-κΒ (EC50 = 482 nmol.l-1, relativní maximum křivky „dávka-odezva“ max = 1) pomocí ODN2006 byla významně zvýšena použitím z něj odvozených oligonukleotidů ON-695C a ON-678A. Obě uvedené sloučeniny účinně stimulovaly reportérovou buněčnou linii HEK-BIue™ hTLR9 při nižších koncentracích a dosahovaly i vyššího maxima (EC5oON-695C = 15 nmol.l-1, max = 2,20; EC5oON-678A = 112 nmol.l-1, max = 2,41).
Průmyslová využitelnost
Předmětný vynález se týká možného zvýšení imunostimulačního účinku za použití syntetického 5 oligodeoxynukleotidu (ODN) s motivem CpG. Zde představené syntetické CpG ODN mohou být použity jako účinné pomocné látky při aplikaci vakcín, zejména jako silná a stabilní adjuvans ve vakcínách cílených proti antraxu, hepatitidě B, malárii, chřipce, astmatu, HIV a různým typům nádorů.
Claims (6)
1. Neizosterní izopolární fosfonátové oligonukleotidy o vzorci 1,
5’-d(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)-3 ’ (1), SEQ. ID. NO. 1, obsahující ve všech čtyřech CpG motivech fosfonátové jednotky obecného vzorce 2,
kde R1 je -P(O)(OH)2, R2 je -H, a C je cytosin-1-yl, anebo R1 je -H, R2 je -P(O)(OH)2 a C je cytosin-1 -yl.
2. Neizosterní izopolární fosfonátový oligonukleotid podle nároku 1, který ve všech čtyřech polohách obsahuje CpG motiv 3
(3).
kde G je nukleobáze guanin a C je, jak uvedeno v nároku 1.
3. Neizosterní izopolární fosfonátový oligonukleotid podle nároku 1, který ve všech čtyřech polohách obsahuje CpG motiv 4,
0,^0
(4), kde G je nukleobáze guanin a C je, jak uvedeno v nároku 1.
-9CZ 309696 B6
4. Použití neizosterních izopolárních fosfonátovových oligonukleotidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 jako adjuvans.
5. Použití neizosterních izopolárních fosfonátovových oligonukleotidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 jako adjuvans ve vakcínách cíleným proti antraxu, hepatitidě B, malárii, chřipce, 5 astmatu, HIV a různým typům nádorů, s výhodou nádorům rakoviny prsu, a při léčbě chronické lymfocytické leukemie.
6. Použití neizosterních izopolárních fosfonátovových oligonukleotidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 jako adjuvans při léčbě chronické lymfocytické leukémie.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-484A CZ309696B6 (cs) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2021-484A CZ309696B6 (cs) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2021484A3 CZ2021484A3 (cs) | 2023-05-03 |
| CZ309696B6 true CZ309696B6 (cs) | 2023-08-02 |
Family
ID=86144567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2021-484A CZ309696B6 (cs) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ309696B6 (cs) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110087014A1 (en) * | 2008-04-24 | 2011-04-14 | Girindus America, Inc. | Process for the manufacture of oligonucleotides |
| EP2360252A1 (en) * | 1996-10-30 | 2011-08-24 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules comprising GTCGTT motifs |
| US20190209604A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-11 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotides, compositions and methods thereof |
-
2021
- 2021-10-20 CZ CZ2021-484A patent/CZ309696B6/cs unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2360252A1 (en) * | 1996-10-30 | 2011-08-24 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules comprising GTCGTT motifs |
| US20110087014A1 (en) * | 2008-04-24 | 2011-04-14 | Girindus America, Inc. | Process for the manufacture of oligonucleotides |
| US20190209604A1 (en) * | 2016-06-03 | 2019-07-11 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotides, compositions and methods thereof |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| LÁŠEK, TOMÁŠ, ET AL.: "Synthesis of phosphonate derivatives of 2´-deoxy-2´-fluorotetradialdose D-nucleosides a tetradialdose D-nucleosides", TETRAHEDRON, vol. 89, no. 5, 16 April 2021 (2021-04-16), pages 132159, XP093059670, ISSN: 0040-4020, DOI: 10.1016/j.tet.2021.132159 * |
| LIBOSKA, RADEK, ET AL.: "Chiral phosphonate internucleotide linkage: A promising modification for chimeric oligonucleotides?", NUCLEIC ACIDS SYMPOSIUM SERIES, no. 52, pages 317 - 318, ISSN: 0261-3166 * |
| TOČÍK, ZDENĚK, ET AL.: "Novel isosteric, isopolar phosphonate analogs of oligonucleotides: preparation and properties", BIOLPOLYMERS, vol. 83, no. 4, pages 400 - 413, XP071105777, ISSN: 0006-3525, DOI: 10.1002/bip.20571 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2021484A3 (cs) | 2023-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2056845B1 (en) | Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides | |
| KR101126030B1 (ko) | 사이토킨 및/또는 화학치료제 또는 방사선 치료와 연계하여면역자극 올리고누클레오티드 및/또는 이뮤노머 화합물을이용하여 면역계를 공동 상승 자극시키는 방법 | |
| US10196638B2 (en) | 5′ triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof | |
| AU775185B2 (en) | Immunostimulatory nucleic acid molecules | |
| KR100969727B1 (ko) | 면역자극 핵산 | |
| US7223741B2 (en) | Immunostimulatory nucleic acid molecules | |
| KR20090057468A (ko) | 톨-유사 수용체(ｔｌｒ) 리간드 및 항바이러스제의 조성물 | |
| JP5753382B2 (ja) | 修飾されたオリゴリン酸基を含有する免疫賦活オリゴリボヌクレオチドアナログ | |
| Jurk et al. | C-Class CpG ODN: sequence requirements and characterization of immunostimulatory activities on mRNA level | |
| EP1937812A2 (en) | Methods and compositions for treating immune disorders | |
| EP2123757B1 (en) | 5` triphosphate oligonucleotide with blunt end and uses thereof | |
| Vollmer et al. | Modulation of CpG oligodeoxynucleotide-mediated immune stimulation by locked nucleic acid (LNA) | |
| KR20100068422A (ko) | 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체 | |
| JP2011502979A5 (cs) | ||
| KR101346716B1 (ko) | 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 기능상동체, 이들을 함유한 조성물 및 b세포 종양의 치료방법 | |
| CZ309696B6 (cs) | Neizosterní izopolární fosfonátové analogy fosforothioátového CpG oligonukleotidu ODN2006 | |
| Vollmer et al. | Impact of modifications of heterocyclic bases in CpG dinucleotides on their immune-modulatory activity |