JP2002536344A - 抗腫瘍免疫を発生させるためのカチオン性脂質の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 カチオン性分子：生物活性分子の複合体を用いる、抗腫瘍免疫応答を発生させる方法が提供される。一の態様において、抗腫瘍免疫応答は防護性で記憶を基礎とする応答である。当該複合体は単独で、処方中の活性成分として、又はアジュバントとして投与し得る。本発明はまた、カチオン性分子：生物活性分子の複合体を哺乳類の細胞又は外来腫瘍細胞に暴露することによる処置の間に、存在する腫瘍細胞に対する免疫刺激性応答を発生させる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 本発明は、腫瘍増殖を抑制し、かつ腫瘍再発に対する防御免疫を発生させるた
めの新規方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の炎症性応答を調節しかつ特異
的免疫刺激応答を発生させるための方法と組成物とに関する。

【０００２】 脂質介在性の遺伝子送達は、遺伝子治療の最も広く研究される分野の１つとな
っている。カチオン性分子（本明細書において、カチオン性脂質、カチオン性ポ
リマー、およびカチオン性両新媒性化合物と定義する）は、生物活性分子の効率
的な細胞内送達について特に有望であることが証明されている。カチオン性分子
は、生理学的ｐＨでまたはその近辺で陽性に荷電されることができる極性基を有
する。この性質は、分子が多くの型の生物活性分子（例えば、ＤＮＡのような陰
性に荷電したポリヌクレオチドを含む）と、如何に反応するかを規定するのに重
要であると、当該分野で理解されている。

【０００３】 生物活性分子の細胞内送達に有用であるとされているカチオン性脂質化合物の
例は、そのような応用に適するものとすることが当該分野で理解されているカチ
オン性脂質の性質の考察とともに、多くの文献に記載されている。文献中のいく
つかの例の開示内容は、具体的に参照することにより本明細書に組み込まれる（
エパンド（Epand）らの米国特許第５，２８３，１８５号；フェルグナー（Felgn
er）らの米国特許第５，２６４，６１８号；ゲベエフ（Gebeyehu）らの米国特許
第５，３３４，７６１号；およびリー（Lee, E.R.）ら、Hum. Gene Ther. 7: 17
01-1717（1996））。

【０００４】 別のクラスの活性の増強したカチオン性脂質が、例えばシーゲル（Siegel）ら
の米国特許第５，７４７，４７１号；ハリス（Harris）らの米国特許第５，６５
０，０９６号；およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／０２１９１号（１９９８年１月２２
日公開）に記載されており、これらの開示内容は、参照することにより本明細書
に組み込まれる。これらの特許はまた、本発明の実施に関係するカチオン性脂質
の調製、特徴および性質を開示している。

【０００５】 さらに、いくつかの発行済み米国特許（その開示内容は参照することにより本
明細書に組み込まれる）は、哺乳動物の細胞にポリヌクレオチドを送達するのに
カチオン性脂質が有用であることを記載している（ブリガム（Brigham）らの米
国特許第５，６７６，９５４号、およびフェルグナー（Felgner）らの米国特許
第５，７０３，０５５号）。

【０００６】 しかし、脂質遺伝子の送達に関連する炎症性応答が認識されている。例えば肺
へのカチオン性脂質介在遺伝子移動は、気管支肺胞洗浄液中の白血球（主に好中
球）の流入と、例えばインターロイキン６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ
−ａ）、およびインターフェロンｇ（ＴＮＦ−ｇ）のような炎症性サイトカイン
のレベルの上昇を特徴とする容量依存性の肺炎症を誘導する。カチオン性脂質：
ＤＮＡ複合体の個々の成分で処理した肺切片の組織学的分析は、カチオン性脂質
が、観察された炎症のメディエーターであることを示唆する。

【０００７】 さらにＣＦ被験者をエーロゾル化リポソーム単独またはカチオン性脂質：ＤＮ
Ａ複合体を投与した臨床試験の結果は、細菌由来のプラスミドＤＮＡもまた炎症
性であるかも知れないことを示した。カチオン性脂質：ｐＤＮＡで治療した患者
のそれぞれは、約２４時間にわたってインフルエンザのような症状（発熱、筋肉
痛、および約１５％のＦＥＶの低下を含む）を示した。これらの症状はリポソー
ム対照で治療した患者では観察されなかった。この応答のひとつの可能な説明は
、細菌由来のｐＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の存在に関連す
る。クリーク（Krieg）ら、Nature 374: 546-549（1995）; クリンマン（Klinma
n）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2879-2883（1996）; サトウ（Sato）
ら、Science 273: 352-354（1996）を参照されたい。

【０００８】 非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドからなるゲノムの短い領域は、ＣｐＧモチー
フのＣｐＧ島（CpG islands）として知られている。非メチル化ＣｐＧジヌクレ
オチドは、脊椎動物ＤＮＡと比較して細菌由来のプラスミドＤＮＡ中にはるかに
高頻度で存在し、時に細菌と脊椎動物ＤＮＡとの間のわずかな構造の差として性
状解析されている。例えば、真核生物起源のＤＮＡと比較して、細菌のゲノムＤ
ＮＡは、２０倍高頻度のジヌクレオチド配列ＣｐＧを含有する。さらに、８０％
のシトシンがメチル化されている真核生物ＤＮＡとは異なり、原核生物起源のも
のは比較的メチル化されていない。これらの差は、脊椎動物の免疫系が細菌起源
のＤＮＡを認識しかつこれに応答することを可能にするといわれている。この点
で、ゲノム性細菌ＤＮＡの真核生物宿主への投与は、強力な免疫刺激応答を誘発
することができることが証明されている。例えば、クリーク（Krieg）ら、Trend
s Microbiol. 4: 73-76（1995）; バラス（Balla）ら、J. Immunol. 157: 1840-
1845（1996）; スパルワッサー（Sparwasser）ら、Eur. J. Immunol. 27: 1671-
1679（1997）を参照されたい。

【０００９】 その結果、細菌および合成ジヌクレオチドのＣｐＧモチーフには多くの用途が
ある。ＣｐＧモチーフの存在は、いくつかの免疫細胞（Ｂ細胞、単核細胞、樹状
細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー細胞を含む）を活性化すると考
えられている。ＣｐＧモチーフはまた、感染に対する防御性免疫応答の活性化、
ワクチンの増強、癌細胞に対する免疫系の活性化、およびアレルギー反応の無害
な反応への転換にも使用することができる。ウールドリッジ（Wooldridge）ら、
Blood 89: 2994-2998（1997）を参照されたい。

【００１０】 ＣｐＧモチーフの体系的分析は、ＣｐＧモチーフ５’−ＲＲＣＧＹＹ−３’を
有する配列は、これらの応答の誘導に特に強力であることを示した。この作用は
、ＣｐＧメチラーゼであらかじめメチル化したＲＲＣＧＹＹ配列を有する細菌の
ゲノムＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドの投与の免疫刺激性が有意に低かっ
たことを示す実験により、ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態の結果であ
ることが証明された。

【００１１】 遺伝子移動実験で使用されるプラスミドＤＮＡは、通常細菌から単離されるた
め、かつこれはまた宿主中で増殖するための細菌配列も有するため、これは高い
頻度で非メチル化ＣｐＧ配列を含有する。従ってＣｐＧモチーフの存在は、遺伝
子治療における生物活性分子の多くの型の有効な導入には有害である。例えばＢ
ＡＬＦ中のＣｐＧモチーフによるサイトカインのレベルの上昇の発生は、治療用
タンパク質が発現されるという結果を有する。いくつかのウイルスプロモーター
（例えば、遺伝子送達ベクターで一般的に使用されるＣＭＶプロモーター）は、
そのようなサイトカインによる抑制を受ける。さらに、すでに慢性の炎症を起こ
した易感染性気道を示す患者の炎症または肺機能のさらなる低下は、安全性リス
クの上昇を示す。

【００１２】 ｐＤＮＡ上のＣｐＧモチーフの存在はまた、トランスフェクトされた単核細胞
または注入されたＢＡＬＢ／ｃマウス中の強固なTヘルパー１型応答を刺激する
ことができることが証明されている。肺への遺伝子の送達について特に関係する
のは、免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有する細菌ゲノムＤＮＡまたはオリゴヌク
レオチドは、気道中で急性の炎症性応答を誘発することができ、特に下気道中で
炎症を引き起こし、細胞数と、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびマクロ
ファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−２）のレベルの上昇を引き起こすことがで
きるという証明であった。シュワルツ（Schwartz）ら、J. Clin. Invest. 100:
68-73（1997）。ＣｐＧジヌクレオチドによる同様のサイトカインプロフィール
の活性化はまた、げっ歯類樹状細胞（スパルワッサー（Sparwasser）ら、Eur. J
. Immunol. 28: 2045-2054（1998））、マクロファージ（リプフォルト（Lipfor
d）ら、Eur. J. Immunol. 27: 2340-2344（1997））、単核細胞（サトウ（Sato
）ら、Science 273: 352-354（1995））、およびＮＫ細胞（コウデリ（Cowdery
）ら、J. Immunol. 156: 4370-4575（1996））に報告されている。最近の研究は
また、カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２−３−ジオレイルオキシ）プ
ロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）とｐＤＮＡとの間で
形成された複合体が、処理した動物のＢＡＬＦ中のサイトカインと細胞レベルを
上昇させたことを報告した。フリーマーク（Friemark）ら、J. Immunol. 160: 4
580-4586（1998）を参照されたい。

【００１３】 （発明の概要） 本発明は、抗腫瘍細胞応答を刺激するために、カチオン性分子と生物活性分子
とを含む組成物の有効量を投与することにより、哺乳動物で抗癌作用を発生させ
る方法を提供する。ある好適な実施態様において、本組成物は、カチオン性脂質
：生物活性分子複合体を含んでなる。さらなる好適な実施態様において、生物活
性分子は、発現可能なｃＤＮＡ挿入体を有するかまたは有さない、免疫活性のあ
る核酸配列である。

【００１４】 さらなる好適な実施態様において、抗癌作用は、アポトーシス応答、抗血管形
成応答を含む抗腫瘍細胞応答、炎症性応答、体液性応答、細胞性応答、Ｔｈ１型
応答、またはＴｈ２型応答を含む免疫応答でもよい。

【００１５】 本発明の主題はまた、免疫応答を調節するための、カチオン性分子と生物活性
分子とを含む組成物の有効量を投与することにより、哺乳動物中の免疫応答を調
節する方法である。この組成物は、カチオン性脂質：生物活性分子複合体を含有
してもよく、生物活性分子は、発現可能なｃＤＮＡ挿入体を有するかまたは有さ
ない免疫活性のある核酸配列でもよい。好適な実施態様において、免疫応答は炎
症性応答、体液性応答、細胞性応答、Ｔｈ１型応答、またはＴｈ２型応答でもよ
い。

【００１６】 また本発明の実施には、抗腫瘍応答を発生させるための、カチオン性分子と生
物活性分子を含む組成物の有効量を腫瘍細胞に接触させることにより、哺乳動物
中で抗腫瘍応答を発生させる方法が含まれる。好適な実施態様において、抗腫瘍
応答は、長期の防御性免疫記憶を提供する防御性の抗腫瘍免疫応答である。この
組成物は、カチオン性脂質：生物活性分子複合体を含み、さらに好適な実施態様
において抗腫瘍応答は、全身性応答である。本発明の別の主題は、カチオン性脂
質と生物活性分子を含む組成物の有効量を、哺乳動物中の腫瘍細胞を含有する環
境に投与することにより、全身性免疫応答を発生させることである。

【００１７】 本発明の実施はまた、治療中の存在する腫瘍細胞に対する免疫応答を発生させ
るのに有効な組成物を提供する。本組成物は、カチオン性分子と生物活性分子と
を含む。好ましくは本発明の組成物は、カチオン性脂質：生物活性分子複合体を
含む。本発明は、炎症性応答および／または免疫応答を刺激するための、哺乳動
物へのこれらの組成物の送達を提供する。好適な実施態様において、本発明は、
細菌性プラスミドでもよい免疫活性のある核酸配列を含む組成物を送達すること
による、炎症性応答および／または免疫応答を刺激する方法を提供する。

【００１８】 本発明はさらに、生物活性分子を送達するための当該分野で公知の任意の方法
による、腫瘍細胞を含有するコンパートメント、または腫瘍細胞自体への、カチ
オン性分子：生物活性分子複合体の送達を提供する。

【００１９】 さらなる実施態様において本発明は、免疫活性のある核酸配列（これは、発現
可能なｃＤＮＡ挿入体を含有するかまたは含有しない）を含む生物活性分子を使
用して、治療中に存在する腫瘍細胞に対する炎症性応答または免疫応答を刺激す
るのに有効な組成物を提供する。すなわち上記の本発明は、導入遺伝子の発現を
必要としない。

【００２０】 別の態様において本発明は、炎症性、免疫、または抗腫瘍応答を刺激するカチ
オン性分子：生物活性分子複合体を含む医薬組成物を提供する。本組成物は、担
体、充填剤、増量剤、分散剤、クリーム剤、ゲル剤、溶剤および製剤用途で一般
的な他の賦形剤を含む医薬組成物中の活性成分でもよい。医薬組成物は、治療中
に存在する腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激するために、腫瘍細胞に送達される
か、または腫瘍細胞を含有する環境に送達される。

【００２１】 さらなる実施態様において本発明は、その作用を増強または助けるための別の
薬物または治療とともに使用されるアジュバントとしての、カチオン性分子：生
物活性分子複合体の使用を提供する。カチオン性脂質：生物活性分子複合体とと
もに使用される薬物または他の治療の例は、特に限定されないが、公知の腫瘍抗
原、手術、サイトカイン、または実質的に免疫応答を含む任意の治療がある。

【００２２】 本発明は、哺乳動物の細胞への生物活性分子の送達を実施するために当該分野
で使用されている任意の方法（特に限定されないが、エーロゾル化溶液の投与、
静脈内注射、または経口投与、非経口投与、腹腔内投与、鼻内投与、局所的投与
、または経粘膜投与がある）により、組成物を投与する方法を提供する。

【００２３】 本発明はまた、哺乳動物の細胞への生物活性分子の送達を実施するために当該
分野で使用されている１つ以上の脂質または他の担体と、１つ以上の生物活性分
子とを含む医薬組成物を提供し、ここで該組成物は、患者の細胞、組織または臓
器への、有効量のカチオン性分子：生物活性分子複合体の、細胞内送達を促進す
る。本発明の医薬組成物は、保存のための組成物の安定化；被験体の特異的組織
、細胞、膜または臓器の標的化；および／またはカチオン性分子：生物活性分子
複合体を送達の成功への寄与をする成分を含む、１つ以上の追加の生理学的に許
容される物質を含有するように調製される。

【００２４】 薬剤としての使用のために、本発明のカチオン性脂質：生物活性分子複合体は
、細胞へのカチオン性脂質：生物活性分子複合体の送達を促進するために、１つ
以上の追加のカチオン性脂質（当該分野で公知のものを含む）とともに、または
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）のような中性の
コリピッド（co-lipid）とともに調製される。

【００２５】 本発明のさらなる特徴と利点は、以下に記載され、ここから一部は明らかであ
るか、または本発明の実施により教示されるであろう。本発明の目的と他の利点
は、記載の説明と請求の範囲ならびに添付の図面の化合物と方法により実現達成
されるであろう。

【００２６】 （発明の詳細な説明） 本発明においてカチオン性脂質：生物活性分子複合体は、抗癌または抗腫瘍作
用を発生させるために使用され、好適な実施態様において抗腫瘍作用は、哺乳動
物で免疫応答または炎症応答を刺激または調節することにより発生する。複合体
は単独で投与され、製剤中の活性成分として、アジュバントとして、または他の
担体（例えば、カチオン性脂質を含む脂質、アデノウイルスを含むウイルスベク
ター）との組成物の一部として投与され、そして哺乳動物の細胞に生物活性分子
を送達するために当該分野で使用されている他の方法で使用される。

【００２７】 本発明の１つの主題において、細胞にカチオン性分子：生物活性分子複合体を
送達することによる免疫応答を刺激および／または調節する方法は、全身性免疫
応答を発生させることを目的とする。本発明は、炎症性応答および／または免疫
応答を刺激するための、哺乳動物細胞へのカチオン性分子：生物活性分子複合体
の送達を提供する。本発明はまた、カチオン性分子：生物活性分子複合体を哺乳
動物細胞または外来腫瘍細胞に暴露して、治療時に存在する腫瘍に対する免疫刺
激応答を発生させる方法を提供する。

【００２８】 カチオン性分子：生物活性分子複合体により刺激される免疫応答は、アポトー
シス応答、抗血管形成応答、炎症性応答、体液性応答、細胞性応答、Ｔｈ１もし
くはＴｈ２応答、炎症性応答としてサブ分類される他の任意の免疫応答、または
他の任意の免疫刺激応答または当該分野で公知の抗癌応答でもよい。さらにＣｐ
Ｇモチーフ、細菌由来もしくは合成プラスミドにより生成されることが知られて
いる他の任意の免疫応答は、本発明の実施範囲内である。好適な実施態様におい
て免疫応答は、長期の防御性免疫記憶を提供する防御性免疫応答である。

【００２９】 本発明の方法は好ましくは、カチオン性脂質：生物活性分子複合体を含む。カ
チオン性脂質と免疫活性のある核酸配列の両方の個々の投与後に、炎症性応答お
よび／または免疫応答が観察されているが、本発明の好適な応答は、カチオン性
脂質と生物活性分子をと含む組成物の投与により得られる。

【００３０】 本発明は、任意のカチオン性脂質化合物の使用を提供する。生物活性分子の担
体としてのカチオン性脂質の伝統的用途は、細胞への生物活性分子のトランスフ
ェクションを促進することである。遺伝子治療は、宿主中で標的細胞のトランス
フェクションが成功することを必要とする。それ自体実質的に有用なトランスフ
ェクションは一般に、発現可能なポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ
、またはｍＲＮＡ）または他の生物活性分子を、細胞に導入するプロセスとして
定義される。こうしてトランスフェクトされたコードするポリヌクレオチドの発
現の成功により、細胞内でタンパク質が産生される。本発明は、生物活性分子の
トランスフェクションまたは導入遺伝子の発現を必要としない。トランスフェク
ションまたは発現が有用で所望の場合もあるが、炎症性応答の刺激および／もし
くは調節または免疫応答もしくは抗癌応答の発生は、細胞へのカチオン性脂質：
生物活性分子複合体の送達が必要なだけである。

【００３１】 カチオン性分子は、生理的ｐＨまたはその近辺で陽性に荷電することができる
極性基を有する。この性質は、カチオン性脂質が多くの型の生物活性分子(例え
ば、ＤＮＡのような陰性に荷電したポリヌクレオチドを含む）とどのように相互
作用するかを規定するのに重要であることが当該分野で公知である。好適な実施
態様において本発明は、細胞、組織、臓器、血管系、または体腔への生物活性分
子の移動を促進するのに有用な、任意のカチオン性脂質およびこれを含有する組
成物の使用を提供する。本発明の実施において多くの好適なカチオン性脂質は、
米国特許第５，７４７，４７１号＆５，６５０，０９６号およびＰＣＴ公報ＷＯ
９８／０２１９１号に記載されている。カチオン性脂質化合物以外に、これらの
特許は、無数の好適なコリピッド（co-lipid）、生物活性分子、調製物、方法、
投与法、および投与量を開示する。本発明の実施に有用な代表的なカチオン性脂
質は： および、米国特許第５，７４７，４７１号、第５，６５０，０９６号およびＰＣ
Ｔ公報ＷＯ９８／０２１９１号に記載のようなものを含む、当該分野で公知の他
の脂質である。

【００３２】 生物活性分子は、好ましくは免疫活性のある核酸配列であり、これは、発現不
可能なまたは発現可能なＤＮＡ挿入体を含むプラスミドでもよい。しかし、本発
明の実施に含まれる生物活性分子は、本発明の方法を使用して炎症性応答および
／または免疫応答を刺激するために、細胞に送達することができる任意の代表的
な生物活性分子を含み、例えば：細菌配列を含むオリゴヌクレオチド；ゲノムＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡ、およびｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド；リボゾームＲＮＡ
；アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム；発現挿入体の無いナル（null）
ベクター；および低分子量生物活性分子（例えば、ホルモンや抗生物質）を含む
。

【００３３】 免疫活性のある核酸配列は、細菌、合成または脊椎動物由来でもよい。しかし
多くの応用において、細菌または合成由来の配列が好ましく、さらに好ましくは
、ＣｐＧモチーフを含有する配列であり、さらに好ましくはＣｐＧモチーフを高
頻度に含有する配列である。Ｂ細胞、単核細胞、樹状細胞、マクロファージ、お
よびナチュラルキラー細胞を含むいくつかの免疫細胞を活性化すると考えられて
いる細菌および合成起源のＣｐＧモチーフは、本発明の実施範囲内にある。さら
に、感染に対する防御性免疫応答を活性化、ワクチンを増強、および癌細胞に対
して免疫系を活性化するのに使用することができるＣｐＧモチーフは、本発明の
範囲内である。

【００３４】 本発明の別の主題において、ＣｐＧモチーフを有する生物活性分子は、カチオ
ン性分子：生物活性分子複合体が宿主細胞に送達されると、治療時に存在する腫
瘍に対する免疫応答または抗腫瘍応答を刺激する。本発明はまた、カチオン性脂
質を使用してＣｐＧモチーフを有する免疫活性のある核酸配列を送達することに
より、炎症性応答および／または免疫応答を刺激する方法を提供する。

【００３５】 本発明の範囲内において抗腫瘍作用は、腫瘍細胞をカチオン性脂質：生物活性
分子複合体に暴露することにより発生する。抗腫瘍細胞応答は、好ましくはＴｈ
１型応答、Ｔｈ２型応答、炎症性応答、抗血管形成応答、プロアポトーシス応答
、または当該分野で公知の他の任意の抗癌応答でもよい。好適な実施態様におい
て、カチオン性脂質：生物活性分子複合体は、腫瘍細胞に対する長期の適応性免
疫応答を刺激する。

【００３６】 本発明はまた、長期の適応性免疫刺激応答を発生するために、かつ腫瘍細胞の
増殖を抑制または阻害するために、腫瘍細胞へのカチオン性分子：生物活性分子
複合体の直接投与を提供し、これは腹腔内、胸腔、血液コンパートメント、また
は他の任意の体のコンパートメントへの投与を含む。投与は、注射、静脈内投与
、滴注投与、吸入、または当業者に適切であると考えられる他の任意の投与法（
血管を介する全身性投与を含む）による。

【００３７】 本発明の別の主題は、標的物質を取り込むか、または細胞、組織、臓器、血管
を標的とするカチオン性分子を腫瘍細胞の領域中で使用して、腫瘍細胞を標的化
することによる、哺乳動物中で免疫応答を刺激する方法を提供する。

【００３８】 本発明の方法により発生する免疫応答または抗腫瘍作用は、局在化作用でもよ
く、または好適な実施態様において、特異的免疫応答は全身性応答でもよい。さ
らに好ましくは、発生する特異的局在化または全身性免疫応答は、カチオン性分
子：生物活性分子複合体に暴露される腫瘍細胞の型、および／または腫瘍細胞に
暴露される生物活性分子またはカチオン性分子の型により決定される。

【００３９】 本発明の実施内において、生物活性分子は、発現可能なｃＤＮＡ挿入体を含有
するかまたは含有しない免疫活性のある核酸配列でもよい。従って本発明の方法
は、導入遺伝子の発現を必要としない。本発明の主題はまた、免疫応答、炎症性
応答、または治療応答を発生させるための、組成物中の発現可能な発現可能な生
物活性分子の使用を含むかまたは組成物の一部として投与される。本発明の実施
において、本発明の方法と組成物は、生物活性分子のトランスフェクションと発
現を介して追加の治療的利点を与える。

【００４０】 また本発明の実施には、炎症性応答を調節することを目的とする、カチオン性
分子：生物活性分子複合体を含む組成物の投与が含まれる。この調節は、カチオ
ン性分子：生物活性分子複合体の送達または生物活性分子の発現に応答してもよ
く、および／または調節は、例えばプラスミドのセグメントを使用して、複合体
またはトランスフェクションされた生物活性分子により制御されてもよい。

【００４１】 他の脂質（コリピッド（co-lipid）を含む） カチオン性分子組成物の安定性、送達、およびトランスフェクション増強能力
は、そのような調製物に、追加の少量の１つ以上の誘導体化ポリエチレングリコ
ール化合物を加えることにより実質的に改良されることが確定している。そのよ
うな性能の増強は、保存と操作（液体（懸濁）型を含む）に対するカチオン性脂
質調製物の安定性により測定する時、かつ生物活性分子（特にポリヌクレオチド
）を含有するそのような調製物のエーロゾル送達中の安定性により測定する時、
特に明らかである。

【００４２】 本発明の実施においてポリエチレングリコールの誘導体は、カチオン性分子調
製物の一部でもよい。複合体は、種々のＰＥＧ誘導体を使用して調製され、すべ
てのＰＥＧ誘導体はある最小のカチオン性脂質：ＰＥＧ誘導体比で、安定な均一
な複合体を形成することができる。本発明者らは理論に拘泥されないが、ＰＥＧ
誘導体は、カチオン性脂質調製物を安定化することができ、生物活性分子への調
製物の送達、トランスフェクション性および親和性を増強することができる。Ｐ
ＥＧとＰＥＧ誘導体の使用は、より高率の生物活性分子（特にＤＮＡ）を脂質に
使用することを可能にする。以下の文献（具体的に、参照することにより本明細
書に組み込まれる）は、ＰＥＧ誘導体の使用についてのより多くの情報を含む：
シモン Ｊ．イーストマン（Simon J. Eastman）ら, Human Gene Therapy 8: 76
5-773（1997）;およびシモン Ｊ．イーストマン（Simon J. Eastman）ら、Huma
n Gene Therapy 8: 313-322（1997）。本発明の実施に有用なポリエチレングリ
コールの誘導体は、ポリエチレングリコールポリマーに結合した疎水性基とのＰ
ＥＧポリマー誘導体を含む。

【００４３】 医薬用途には、本発明のカチオン性分子：生物分子複合体は、１つ以上の追加
のカチオン性脂質（当該分野で公知のものを含む）、または中性のコリピッド（
co-lipid）（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（「ＤＯＰ
Ｅ」））とともに調製されて、宿主細胞への複合体の送達を促進する。中性のコ
リピッド（co-lipid）の使用は随意である。調製物に依存して、コリピッド（co
-lipid）を含めると、送達またはトランスフェクション能力が顕著に増強される
。代表的な中性のコリピッド（co-lipid）には、ジオレオイルホスファチジルエ
タノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、ジフタノイルホスファチジルエタノールアミ
ン、リソ−ホスファチジルエタノールアミン、他のホスファチジルエタノールア
ミン、ホスファチジルコリン、リソ−ホスファチジルコリン、およびコレステロ
ールがある。「ＤＯＰＥ」の使用におけるように、本発明の実施においてジフタ
ノイルホスファチジルエタノールアミンの使用が特に好ましい。

【００４４】 他の担体および送達ビヒクル 本発明はまた、哺乳動物の細胞への生物活性分子の送達を行うのに当該分野で
使用されている１つ以上の脂質または他の担体、および１つ以上の生物活性分子
を含む組成物を提供し、ここで該組成物は、有効量の生物活性分子または脂質複
合体の送達を促進する。多くの方法と送達ビヒクルが本発明の実施内にあり、ウ
イルスベクター；リポソーム内に封入されたＤＮＡ、脂質送達ビヒクルがあり、
裸のＤＮＡは、哺乳動物の細胞にＤＮＡを送達するのに使用されている。今日ま
でインビトロ、エクスビボ、およびインビボでのＤＮＡの送達は、上記方法の多
くの使用して証明されている。

【００４５】 本発明の組成物に含まれる他の担体または送達ビヒクルには、ウイルスベクタ
ー、アデノウイルス、レトロウイルス、および非ウイルスと非タンパク質性ベク
ターがあり、または生物活性分子の送達を促進することが当該分野で公知である
他の代替アプローチがある。もちろん当業者は、本発明の所望の性質または活性
、企図される添加により障害されないかまたは実質的に障害されないように、追
加の担体または送達ビヒクルおよび／またはその濃度を選択するように注意する
であろう。

【００４６】 組成物の調製とその投与 本発明の医薬組成物は、保存のために組成物を安定化する、標的特異的組織、
細胞、膜または臓器を標的とする、および／またはカチオン性脂質：生物活性分
子複合体への細胞内送達の成功に寄与する、１つ以上の追加の生理学的に許容さ
れる物質を含有するように調製される。

【００４７】 本発明は、治療上有効量のカチオン性分子：生物活性分子複合体の送達を促進
する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、カチオン性分子：生物活性分子複合
体、脂質または非脂質担体、他の生物活性分子、またはカチオン性分子：生物活
性分子複合体の送達を促進する他の公知の添加物を含有してもよい。

【００４８】 本発明の医薬組成物は、無数の細胞、組織および臓器（例えば、胃粘膜、心臓
、肺、および固形腫瘍）；間隙および体のコンパートメント（例えば腹腔、胸腔
、血液コンパートメント）；および血管系と血液細胞への、カチオン性分子：生
物活性分子複合体の送達を促進する。さらに本発明の組成物は、インビトロで維
持された細胞（例えば、組織培養物）への、カチオン性分子：生物活性分子複合
体の送達を促進する。

【００４９】 本発明のカチオン性脂質種、ＰＥＧ誘導体、コリピッド（co-lipid）および他
の担体と送達ビヒクルは混合されて、その結果、カチオン性脂質またはＰＥＧ誘
導体、コリピッド（co-lipid）または担体を組合せて使用して、標的細胞および
／またはそのサブ細胞コンパートメントへのカチオン性脂質：生物活性分子複合
体の送達を促進する。本発明のカチオン性脂質は、そのような使用のために、当
該分野で公知の脂質と混合することもできる。さらに標的化物質を、哺乳動物細
胞にカチオン性脂質：生物活性分子複合体を送達するカチオン性脂質、ＰＥＧ誘
導体、およびコリピッド（co-lipid）または他の脂質もしくは非脂質調製物に結
合の任意の組合せに結合してもよい。

【００５０】 カチオン性分子：生物活性分子複合体はまた、他の薬剤またはその効力を上昇
させるかもしくは助ける治療法と組合せることができるアジュバントとして使用
してもよい。例えば、カチオン性分子：生物活性分子複合体は、既知の腫瘍抗原
（特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、またはｃＤＮＡを含む）ととも
に投与してもよい。カチオン性分子：生物活性分子複合体はまた、すべての腫瘍
抗原を含有する腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解物などとともに投与してもよい。こ
れは、自己（治療されている患者由来）の腫瘍細胞であるかまたは同種（同じ腫
瘍型由来）の腫瘍細胞でもよい。

【００５１】 本発明の医薬組成物の投与量は、生物活性分子およびカチオン性分子：生物活
性分子複合体の半減期、生物活性分子とカチオン性分子：生物活性分子複合体の
力価、他の送達ビヒクルに半減期、カチオン性分子：生物活性分子複合体または
送達ビヒクル（存在するなら）もしくはその分解産物の有害作用、投与経路、患
者の状態などの要因に依存して変化するであろう。当業者は、そのような要因を
決定することができる。

【００５２】 本発明の組成物の非常に正確な投与量を提供するのに、種々の投与法が使用さ
れる。そのような調製物は、静脈内投与、経口投与、非経口投与、局所的投与、
経粘膜投与、または患者の体腔に注射により投与されるか、または生分解性物質
を含有する除放性調製物を使用して、または追加のミセル、ゲルおよびリポソー
ムを使用するオンサイト送達（onsite delivery）により、投与することができ
る。噴霧器具、粉末吸入器、乾燥粉末調製物、エーロゾル化溶液、またはそのよ
うな調製物を投与するために使用される他の代表的方法を使用して、そのような
調製物を投与することができる。本発明は、生物活性分子を哺乳動物の細胞に送
達するために、当該分野で使用されている任意の方法により複合体を投与する方
法を提供する。

【００５３】 さらに、本発明の治療的におよび薬剤学的に許容される組成物を含む組成物は
、一般に賦形剤（例えば、炭水化物である乳糖、トレハロース、ショ糖、マンニ
トール、麦芽糖、またはガラクトース、および無機または有機塩）とともに調製
され、そのような賦形剤の存在下で使用前に凍結乾燥（そして次に再水和）され
る。この複合体は、担体、充填剤、増量剤、賦形剤、分散剤、クリーム剤、ゲル
剤、溶剤および他の薬剤学分野で一般的な賦形剤を含む医薬組成物中の活性成分
でもよい。

【００５４】 本発明の各複合体の最適化された調製物の条件は、薬剤分野の当業者が決定す
ることができる。特定の調製物について特定の賦形剤の最適濃度の選択は、実験
により行われるが、当業者はかかる各調製物について決定することができる。

【００５５】 本発明を以下の例によりさらに明らかにするが、これらの例は発明を例証する
ことを意図するものであり、それを制限しない。

【００５６】 （実施例） 以下の例は本発明の実施の代表例である。例１ プラスミドＤＮＡの構成及び精製 レポーター遺伝子生成物であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（ＣＡＴ）をコードするプラスミドベクターｐＣＦ１−ＣＡＴの構成及び特
徴は以前に記述されている。ヨウ（Yew）ら著、Hum.Gene Ther. 8:575-584(1997
)を参照されたい。ｐＣＦ１−ＣＡＴは、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝
子（ＣＭＶ）由来の強力なプロモーター、一のイントロン、ウシ成長ホルモンポ
リアデニル化シグナル配列、一のｐＵＣ複製起点、及びカナマイシンへの耐性を
与えるアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。ｐＣＦ
１−ナル（null）はＣＡＴのためのｃＤＮＡが欠失されていることを除いてｐＣ
Ｆ１−ＣＡＴと相似体である。ｐＣＦＡ−２９９−ＣＡＴは、ｐＣＦＡ−ＣＡＴ
（ＣＭＶへの小さいポリリンカー５’の付加を除いてｐＣＦ１−ＣＡＴと同一で
ある）をＰｍｅＩ（ポリリンカー中）及びＢｇＩＩ（ＣＭＶ中）で消化し、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ断片でブラントエンドとし、次いで複製することに
より構成された。これは、ＣＭＶプロモーターのヌクレオチド−５２２から−３
００の欠失を与えた。

【００５７】 クイックチェンジ部位特異的変異誘発（QuickChange Site-Directed Mutagene
sis）キット（ストラタジーン（Stratagene））を用いて、製造者によるプロト
コールに従って、部位特異的変異誘発を行った。一つ改変したことは、オリゴヌ
クレオチドの複数のセットを同時に用いて、一の反応で３又はそれ以上の部位の
突然変異誘発を可能としたことである。突然変異は、広範囲にわたるＤＮＡ配列
決定及び制限酵素地図作成により確認され、プラスミドの完全性についてチェッ
クした。ｐＣＦＡ−２９９−１０Ｍ−ＣＡＴは、ＣｐＧモチーフをヌクレオチド
８８、１１８、１４１及び２２４で欠失されたもの（番号は、示した以外は、Ｃ
ｐＧジヌクレオチド内のＣ残基を表し、ｐＣＦ１−ＣＡＴの配列に基づく；図５
を参照されたい）であり、ヌクレオチド４１０、５６４、１４９７（ＧからＡ）
、１８８７、２４１９、２６００、２６９６、３４７３、４３９４（ＧからＡ）
及び４５５１における１０の点突然変異を有する。

【００５８】 本質的に、以前に記述された通りに、プラスミドDNAを細菌醗酵により調製し
、限外濾過及び連続カラムクロマトグラフィーにより精製した。リー（Lee）ら
著、Hum.Gene Ther. 7:1701-1717(1996)；スケール（Scheule）ら、Hum.Gene Th
er.8:689-707(1997)を参照されたい。精製された調製物は、５以下のエンドトキ
シン単位／ｍｇ ｐＤＮＡ（クロモゲンＬＡＬアッセイ（バイオウィッテイカー
（BioWhittaker）により測定された通り）、１０μｇ以下のタンパク質／ｍｇ
ｐＤＮＡ（マイクロＢＣＡアッセイ（ピアース（Pierce）により測定された通り
）、及び１０μｇ以下の細菌染色体ＤＮＡ／ｍｇ ｐＤＮＡ（ドット−ブロット
アッセイにより測定された通り）を含む。これらはまた、検出可能なＲＮＡを本
質的に含まず、１．８から２．０の間の分光光度Ａ_260/280比を示した。

【００５９】例２ ｐＤＮＡのインビトロメチル化 プラスミドＤＮＡを、１ｘ ＮＥＢバッファー２［５０ｍＭのＮａＣｌ、１０
ｍＭのＴｄｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのジチオト
レイトール］、１６０μＭのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、１−３ｍｇ
のｐＤＮＡ、及び１μｇのｐＤＮＡあたり１ＵのＳｓｓＩメチラーゼ（ニューイ
ングランドバイオラボ（New England Biolabs））を含有する５ｍｌの反応中で
、インビトロでメチル化した。混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。
４時間のインキュベーションの後、ＩＳＯμＭの濃度まで、さらなるＳＡＭを添
加した。ｐＤＮＡの模擬処理（mock treatment）においては、ＳｓｓＩメチラー
ゼのみが省略された同一の手順が用いられた。メチル化されたｐＤＮＡ及び模擬
的に処理されたｐＤＮＡをミリポアプロバインドカラム（Millipore Probind co
lumn）を通じて遠心分離し、エタノール沈殿させ、そして７０％（ｖ／ｖ）のエ
タノールで洗った。ｐＤＮＡを水中に再懸濁し、約３ｍｇ／ｍｌの最終的な濃度
とした。ｐＤＮＡのＳｓｓＩ−媒介メチル化の効果を試験する実験において、模
擬−メチル化したｐＤＮＡを対照として常に用いた。

【００６０】 ｐＤＮＡのメチル化の程度を、処置したｐＤＮＡの０．２−０．５ｇを１０Ｕ
のＢｓｔＵ Ｉ又はＨｐａ ＩＩで１時間消化し、次いでアガロースゲル電気泳
動により分析することにより評価した。メチル化されたｐＤＮＡはＢｓｔＵ Ｉ
及びＨｐａ ＩＩによる消化から保護されたが、一方、メチル化されていないか
、又は部分的にしかメチル化されていないｐＤＮＡは開裂した。ゲル分析により
、メチル化ｐＤＮＡはＢｓｔＵ Ｉ又はＨｐａ ＩＩによる消化のいずれかから
も完全に保護された。

【００６１】 これらの研究において用いられたプラスミドは高度に精製され、主にスーパー
コイルの形態を含み、1以下のエンドトキシン単位／ｍｇプラスミドを含み、バ
イオバーデン（bioburden）アッセイによる測定により、感染性の汚染物質を含
んでいなかった。肺炎症におけるプラスミドＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドの
メチル化の役割を評価するため、精製したｐＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｓｓｓ Ｉ
メチラーゼを用いてインビトロでメチル化するか、又は模擬メチル化した（mo
ck methylated）。当該酵素はすべてのＣＧジヌクレオチド内のシトシン残基（
Ｃ５）をメチル化する。メチル化の程度は、修飾プラスミドのＢｓｔＵ Ｉ又は
Ｈｐａ ＩＩ（但しＭｓｐ Ｉではない）による消化の受け易さをモニタリング
することにより評価した。Ｓｓｓ Ｉ−メチル化した、しかし模擬メチル化した
ものでないプラスミドはＢｓｔＵ Ｉ及びＨｐａ ＩＩを用いた消化から完全に
保護された。ｐＣＦ１−ＣＡＴのメチル化によりまた、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺
内への鼻内投与後、約５倍の発現レベルの減少を与えた（図６）。

【００６２】 マウスＢＡＬＦ中のサイトカインレベルを、酵素結合イムノソルベントアッセ
イ（ELISA）キットを用いて製造者により特定された通りに定量した。ＩＦＮ−
γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ１−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０及びＩＬ−６ ＥＬＩＳ
Ａキットはゲンザイムコーポレーション（Genzyme Corporation）からのもので
あり、一方、ｍＫＣ、ＭＩＰ−２及びＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキットはＲ＆Ｄ
システムズからのものであり、そして、ロイコトリエンＢ４ ＥＬＩＳＡキット
はパースペクティブ ダイアグノスチックス（Perspective Diagnostics）から
のものであった。

【００６３】 肺組織の加工及びCAT酵素活性の評価のための手順は、何処か他に既述されて
いる。リー（Lee）ら著、Hum.Gene Ther.7:1701-1717（1996）;ヨウ（Yew）ら、
Hum.Gene Ther.8:575-84（1997）を参照されたい。

【００６４】例３ カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体のマウスへの鼻滴注 カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体は、以前に記載された通り（リーら、Hum.Ge
ne Ther.7:1701-1717（1996））、図の凡例に示した通り、最終的な濃度が、０
．６：１．２：３．６ ｍＭ（ＧＬ−６７：ＤＯＰＥ：ｐＤＮＡ）又は０．３：
０．６：１．８ｍＭまで、同容量のＧＬ−６７：ＤＯＰＥ（１：２）とｐＤＮＡ
とを混合することにより形成された。ＤＮＡの濃度はヌクレオチドにより、３３
０ダルトンの平均ヌクレオチド分子量を用いて表される。既述されている通りに
、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１００μｌの複合体を鼻滴注した。スケール（Scheule
）ら、Hum.Gene Ther.8:689-707（1997）を参照されたい。動物を死亡させて、
それらの肺を、滴注後２４時間の時点でホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗
った。回収したＢＡＬＦを１，５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、得られた上澄
みを取り除き、続くサイトカイン分析のため−８０℃で冷凍した。細胞数及び細
胞の種類の顕微鏡による決定のため、細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁した。

【００６５】例４ メチル化又は非メチル化ｐＤＮＡを有しているカチオン性脂質：ｐＤＮＡ
複合体の投与後の気管支肺胞洗浄液の組成 Ｓｓｓ Ｉ−メチル化（ｍ）ｐＤＮＡ又は非メチル化ｐＤＮＡをカチオン性脂
質ＧＬ−６７と複合体化し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻内注入した。マウスの別々
のグループに、（ｍ）ｐＤＮＡ又は非メチル化ｐＤＮＡを単独で、又はビヒクル
と注入し、それらの気管支肺胞洗浄液を処置から２４時間後に分析のために回収
した。

【００６６】 ｐＤＮＡのメチル化が肺における炎症反応に影響したかどうかを決定するため
、注入後２４時間におけるＢＡＬＦ中の幾つかの異なるサイトカインのレベルを
計測した。ＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴを投与されたものと比較しＧＬ
−６７：ｐＣＦ１−ＣＡＴを受けたマウスのＢＡＬＦにおいては、顕著により高
いレベルにあるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、及びそれより少ない程度だがより高い
レベルのＩＬ−６が見出された（図１）。カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の注
入後、齧歯類ＫＣのレベルもまた上昇したが、ＧＬ−６７に複合体化したメチル
化若しくは非メチル化のｐＤＮＡのいずれかにより誘起されたサイトカインのレ
ベルには有意な違いはなかった。それに対し、ＧＬ−６７単独、（ｍ）ｐＣＦＩ
−ＣＡＴ単独又は非メチル化ｐＣＦＩ−ＣＡＴ単独を注入した後は、これら４種
のサイトカインは低レベルであった（図１）。しかしながら、複合体化したｐＤ
ＮＡの場合に比べ、遊離のｐＤＮＡで処理した動物のＢＡＬＦにおいてＴＮＦ−
α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６のレベルは低かったものの、これらのサイトカイン
のレベルは、遊離の非メチル化ｐＤＮＡ単独を受けたグループにおいて、（ｍ）
ｐＣＦ１−ＣＡＴを投与したグループよりも、一定不変に高いレベルであった。
サイトカインＩＬ−１０、ロイコトリエンＢ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、Ｍ
ＩＰ−２、及びＧＭ−ＣＳＦもまたアッセイしたが、それぞれの場合、レベルが
低く、処理していない（ナイーブの）動物において得られるレベルと区別がつか
ない。これらの結果は、非メチル化ｐＤＮＡが肺において炎症性であり、この応
答がｐＤＮＡがＧＬ−６７との複合体として存在しているときに悪化することを
示している。さらに、ＧＬ−６７：ｐＣＦ１−ＣＡＴ複合体の肺への投与により
誘起されるサイトカインのうち、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−６の一部は
、主として非メチル化ｐＤＮＡの存在によるものであった。カチオン性脂質ＧＬ
−６７は、ＧＬ−６７がｐＤＮＡと共奏的に働いてそのレベルが上がるとみられ
るＫＣの場合を除いて、ＢＡＬＦにおけるサイトカイン誘起に対して目立った貢
献をしなかった。

【００６７】 また、ＧＬ−６７：ｐＣＦ１−ＣＡＴにより誘発される炎症応答の特徴を、処
置された動物のＢＡＬＦにおいて回収された細胞の総数及び差別的な計数により
評価した。ＧＬ−６７：ｐＤＮＡを注入したマウスのＢＡＬＦにおいて、ＧＬ−
６７単独又はｐＤＮＡ単独を受けたマウスと比較して、多形核（ＰＭＮ）白血球
の数の上昇があった（図２Ａ）。ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ複合体におけるｐＤＮＡ
のメチル化状態は、全体的な細胞数には影響しなかった。しかしながら、（ｍ）
ｐＣＦ１−ＣＡＴ単独を投与した動物（４つの別々の実験）では、ｐＣＦ１−Ｃ
ＡＴを受けたものと比較して、一貫してＰＭＮ白血球の総数においてわずかな減
少がみられた。異なる細胞種の分析により、ＧＬ−６７：ｐＣＦ１−ＣＡＴを受
けたマウスにおいて、ＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴを受けたマウスと比
べ、好中球の割合の上昇が観られた（図２Ｂ）。この上昇は、（ｍ）ｐＣＦ１−
ＣＡＴ単独の場合との比較において、ｐＣＦ１−ＣＡＴ単独を滴注した場合にも
観られた。これらのデータは一緒に、細胞流入における誘導がカチオン性脂質及
びｐＤＮＡの両方により媒介されたことを示していた。しかしながら、メチル化
ｐＤＮＡよりもむしろ非メチル化ｐＤＮＡの肺内への投与は、ＢＡＬＦにおける
ＰＭＮ白血球、特に好中球の数の増加を与えた。

【００６８】 ｐＣＦ１−ＣＡＴは、細菌タンパク質であるＣＡＴレポーター酵素を高レベル
で発現するため、サイトカイン応答が外来タンパク質の発現によるものであると
いう可能性があった。したがって、同じプラスミド骨格を含んでいるがいかなる
導入遺伝子をも含まないプラスミドベクター（ｐＣＦ１−ナル（null））を用い
て実験を繰り返した。ＧＬ−６７と複合体化したメチル化又は非メチル化ｐＣＦ
１−ナルの投与後のサイトカイン誘導プロフィールは、ｐＣＦ１−ＣＡＴで得ら
れたものと本質的に同一であった。これは、細菌ＣＡＴの発現ではなく、プラス
ミドＤＮＡそれ自体が観察されたサイトカイン誘導の原因になることを確証した
。

【００６９】例５ 非メチル化ｐＤＮＡのレベルとサイトカインのレベルの間の用量−依存性
関係 肺へ投与された非メチル化ｐＤＮＡの量と誘導されるサイトカインのレベルの
間に用量−依存関係があるかどうか決定するために、ＧＬ−６７と複合体化する
前に（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴを異なる割合でｐＣＦ１−ＣＡＴと混合した。ＧＬ
−６７の用量及び送達されたヌクレオチドの総量は一定のままだった。この実験
においては、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びｍＫＣに加え、ＭＩＰ−２
及びＩＬ−１２をアッセイした。複合体中の非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴの割合
が増加したのに伴い、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１２のレベ
ルにおいて相当する増加があった（図３）。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１
２により、サイトカインレベルの刺激された増加は、メチル化：非メチル化ｐＤ
ＮＡの比が１：２である時に最大であった。この用量−依存関係により、ＢＡＬ
ＦにおけるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１２の誘導が、未メチ
ルｐＤＮＡの存在への直接の応答であるという提案が支持された。この傾向は、
ＫＣ又はＭＩＰ−２については観察されず、上記観察において一貫していた（図
３）。

【００７０】例６ カチオン性脂質：メチル化ｐＤＮＡ複合体の投与後の肺における組織病理
学的変化 カチオン性脂質単独、ｐＤＮＡ単独、又はカチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の
いずれかの投与の後のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺内での組織病理学的変化も調べた
。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：ｐ
ＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７単独、（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ｐＣＦ１−ＣＡＴ
、または水（ビヒクル対照）を鼻内注入した。注入の２日後にマウスを殺し、肺
を盲目的な方法で組織病理学的検査のために加工した。

【００７１】 組織病理学 ２％のパラホルムアルデヒド及び０．２％のグルタルアルデヒドを含む、Ｈ₂
Ｏ圧力により３０ｃｍでの膨張により肺を固定した。代表的なサンプルを各肺葉
から採り、グリコールメタクリレート中に埋め込み、区画し、ヘマトキシリン及
びエオジンにより染色した。肺における組織病理学を盲目的なやり方で評価し、
０から４までのスケールを用いて客観的に格付けした（スコア０は異常な発見が
なかったことを示し、スコア４は強い侵入を伴う激しい変化を反映する）。スケ
ール（Scheule）ら、Hum,.Gene Ther.8：689-707（1997）を参照されたい。

【００７２】 ＧＬ−６７：ｐＤＮＡ複合体を受けたマウスにおいて、肺胞炎症の複数病巣領
域が観られた。肺炎症の程度を、０から４までのスケールであって、正常な肺か
らみて、０が異常がない場合を示し、１が最小の変化を表し、２がわずかな変化
を示し、３が中程度の変化を示し、そして４が激しい変化を示す当該スケール、
を用いて格付けした。ＧＬ−６７：ｐＤＮＡを受けた肺の炎症スコアは、ＧＬ−
６７：（ｍ）ｐＤＮＡ複合体を受けた肺と比べて顕著な違いはなかった。ＧＬ−
６７単独を受けた肺は、脂質：ｐＤＮＡ複合体を受けた肺よりもわずかに低くス
コア付けされたが、最小の炎症はｐＤＮＡ又は（ｍ）ｐＤＮＡ単独のいずれかを
受けた肺において観られた。これらの結果は、ｐＤＮＡ上の非メチル化ＣｐＧモ
チーフの存在が、カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の投与後の肺に観られる組織
病理学的変化に全体としては影響しないことを示した。さらに、複合体の投与後
に観られた組織学的変化の大部分はカチオン性脂質成分によって媒介された。

【００７３】例７ ｐＣＦ１−ＣＡＴ内の免疫刺激性ＣｐＧモチーフの突然変異の効果 ｐＣＦ１−ＣＡＴ中に存在する非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドのサブセット
はサイトカイン応答の大部分の原因のようなので、これらの特定のＣｐＧモチー
フの排除は誘導のレベルを減じるはずである。ｐＣＦ１−ＣＡＴ中には５’−Ｒ
ＲＣＧＹＹ−３なる配列を有する１７のモチーフが存在し、これらは以前にＣｐ
Ｇモチーフが最も免疫刺激性であると発見された配列関係である（図５）。これ
らのモチーフのうち１４個を欠失又は部位特異的変異誘発のいずれかにより排除
した。ＣＭＶプロモーター内に位置している４つのＣｐＧモチーフ（ヌクレオチ
ド位置８８、１１８、１４１及び２２４における）を上流のエンハンサー領域の
部分を含む４００ｂｐの断片の欠失により取り除いて、ｐＣＦＡ−２９９−ＣＡ
Ｔ（図５）を作成した。１３個の残りのモチーフのうち１０個（位置４１０、５
６４、１４９７、１８８７、２４１９、２６００、２６９６、３４７３、４３９
４及び４５５１における）を部位特異的変異誘発を用いて修飾し、ｐＣＦＡ−２
９９−１０Ｍ−ＣＡＴ（図５）を作成した。ＣＡＴのコード配列内の一のモチー
フ（ヌクレオチド１４９７）及びカナマイシン耐性遺伝子内の一のモチーフ（ヌ
クレオチド４３９４）を除いて、各場合において、各モチーフ中のシトシン残基
をチミジン残基へと変異させた。これらの二つの例外のモチーフでは、それぞれ
のタンパク質のコード配列を維持するため、ＣｐＧジヌクレオチドのグアニジン
残基をアデノシン残基へと変えた。

【００７４】 プラスミドｐＣＦ１−ＣＡＴ、（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ｐＣＦＡ−２９９−
ＣＡＴ、及びｐＣＦＡ−２９９−１０Ｍ−ＣＡＴをカチオン性脂質ＧＬ−６７と
複合化し、次いでＢＡＬＢ／ｃマウスへと鼻内注入した。注入から２４時間後、
サイトカイン分析のためにＢＡＬＦを回収し、ＣＡＴアッセイのために肺も回収
した。先を切ったＣＭＶプロモーターを含有するｐＣＦＡ−２９９−ＣＡＴから
の発現は、ｐＣＦ１−ＣＡＴの発現の約三分の一であった。ｐＣＦＡ−２９９−
１０Ｍ−ＣＡＴからの発現は、ｐＣＦＡ−２９９−ＣＡＴと等しいものであり、
これは１０の点突然変異の導入が導入遺伝子発現に影響しないことを示している
（図６）。前と同様、非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴを受けたマウスのＢＡＬＦ中
には、高レベルのＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１２が存在した
（図７）。しかしながら、これらのサイトカインと同等に高いレベルが、ｐＣＦ
Ａ−２９９−ＣＡＴ及びｐＣＦＡ−２９９−１０Ｍ−ＣＡＴにも観られた。した
がって、プラスミド内のＣｐＧモチーフ含有量の削減は、肺におけるサイトカイ
ンレベルを上昇させるというその能力を削減しなかった。これは、所望の炎症応
答を刺激するためには、コンセンサス（共通）な５’−ＲＲＣＧＹＹ−３’を有
しているものに加えて、その他の免疫刺激性モチーフが必要であることを示唆し
ている。

【００７５】例８ カチオン性脂質：生物学的に活性な分子複合体の腫瘍成長に対する効果 Ｂ１６メラノーマ皮下モデル Ｂ１６／Ｆ１０細胞（５ｘ１０⁴）をＣ５７／ＢＬ６マウス（８／グループ）
に皮下的に移植し、それらがいずれかの寸法において３−４ｍｍになるまで１２
日まで成長させた。幾つかの非毒性デオキシアデノシン相似体の高度に毒性のア
デニン相似体への転換を触媒するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）
遺伝子、又はｂ−ｇａｌ遺伝子（対照）のいずれかを有する脂質：ｐＤＮＡ複合
体を、第１日と第３日に腫瘍に注射した。第２−７日に動物にプロドラッグ（フ
ルダラ（Fludara））を腹腔内投与した。処置していない動物に比較して、複合
体で処置した動物において腫瘍の成長は、導入遺伝子に関わらず、６０％まで阻
害された。言いかえれば、腫瘍成長の阻害は、対照導入遺伝子の腹腔内注射によ
ってですら達成されたのである。

【００７６】 Ｂ１６メラノーマの肺転移モデル−肺転移 第０日に、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおいて、１ｘ１０⁵のＢ１６／Ｆ１０細胞
を腹腔内注射した。第５及び１０日に、マウスをＧＬ６７：ｐＣＦＡ−ナル複合
体の静脈内注射（１００μｌ）により処置した。第１４日にマウスを死亡させ、
肺を切り取り、フェケット溶液（Fekete’s solution）中に固定し、置いた。肺
転移の数を数えた。処置していない動物は２６±４（平均±ＳＥＭ）の転移を有
し、一方、ＧＬ６７：ｐＣＦＡ−ナルで処置したグループは９．５±２．５の転
移を有していた。これは、このモデルにおける発現導入遺伝子の不在下での脂質
：ｐＤＮＡ複合体の有意な（ｐ＝０．０７）効果を示している。

【００７７】 Ｂ１６メラノーマの肺転移モデル−生き残り 第０日にＢ１６／Ｆ１０細胞をＣ５７／ＢＬ６マウスに静脈内注射した。第５
、１０、１５及び１８日に、一のマウスのグループをＧＬ６７：ｐＣＦＡ−ナル
複合体の静脈内注射により処置した。生き残りについて、全てのマウスを追跡し
た。処置していないグループの生き残りのメジアンは２７±１．５日であり、一
方、ＧＬ６７：ｐＣＦＡ−ナル複合体で処置したグループの生き残りのメジアン
は３４±１日を示し、統計的に有意（ｐ＝０．００１９；ログランク（Logrank
））であった。

【００７８】 Ｂ１６メラノーマの肺転移モデル−生き残り 上記の生き残り実験の繰り返しにおいて、マウスを０．５：２ ｍＭ（低用量
）又は２：２ ｍＭ（高用量）のいずれかのＧＬ６７：ｐＣＦＡ−ナル複合体で
静脈内処置した。処置により、両方のグループについて、生き残りのメジアンが
２６．８±０．６日であった対照グループ、つまり処理していない動物グループ
と比較して、生き残りのメジアンの増加が得られた。高用量及び低用量のグルー
プは、それぞれ、３１．６±１．５及び３４．４±１．２日の生き残りのメジア
ンを有し、ｐの値がそれぞれ＜０．０１及び＜０．０００１であり、対照とは有
意に異なっていた。

【００７９】 Ｎｕｔｕ／フィッシャー（Fischer）ラット卵巣癌モデル 卵巣上皮癌細胞Ｎｕｔｕ１９はフィッシャー（Fischer）344ラットについて同
系である。ローズ（Rose）G.S.ら、Am J Obstet Gynecol 175：593-599（1996）
を参照されたい。第０日に、１ｍｌ中１ｘ１０⁶の腫瘍細胞をＦ３４４ラットの
腹腔内へと接種した。第３、６及び９日に動物のグループ（１０の動物／グルー
プ）を２ｍｌの食塩水又は対照ベクターであるＧＬ６７：ｐＣＦ１ｂｇａｌ（０
．５：２のモル比）のいずれかで処置した。食塩水で処置したグループは生き残
りのメジアン９２日までを有したが、複合体で処置したグループは生き残りのメ
ジアン１５６日までを有していた。これらのデータは、対照ベクターの複数回投
与により生じる、生き残りに対する有意な効果を示す。

【００８０】 卵巣癌のＭＯＴモデル マウス卵巣奇形腫（ＭＯＴ）モデル（フェケット（Fekete），E.ら、Cancer R
es.12：438-443（1952））において、腫瘍細胞をＣ３Ｈｅ／ＦｅＪマウス（１０
のマウス／グループ）の腹腔内に移植した。３回にわたって、マウスを食塩水又
はＧＬ６７：ｐＮｕｌｌ複合体（食塩水中）を腹腔内へと注入することにより処
置した。ｐＮｕｌｌベクターは、発現可能なｃＤＮＡインサートを有しないｐＣ
ＦＡ骨格である。

【００８１】 以下に示す通り、全ての食塩水処置動物は死に；長期の生き残りはなかった。
しかしながら、腫瘍を有する動物がＧＬ６７：ｐＮｕｌｌ複合体で処置された場
合、長期生き残りの割合は０から７０％の範囲にあり、それはカチオン性脂質：
ＤＮＡの比に依存した。重要なこととして、これらの長期生き残りがＭＯＴ腫瘍
細胞により再チャレンジされた場合、このチャレンジを退けた動物の割合もまた
０から７０％の範囲にあった。この結果は、全身に及ぶという性質の、処方依存
性の防護的、かつ記憶に基づく免疫反応の発生を示唆する。

【００８２】

【００８３】 例９ 腫瘍抑制剤としてのカチオン性脂質：細菌ゲノムＤＮＡ ＡＢ１２ 中皮腫モデル ＡＢ１２は齧歯類中皮腫細胞系である。第０日にＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＡＢ
１２中皮腫細胞を腹腔内接種した。第６、１０及び１４日の３つの時点において
、マウスの各グループに、以下の処方のいずれか一つを腹腔内投与した： グループＡ：５０μｇの細菌ゲノムＤＮＡ（〜４ｋｂ断片へと切断された） グループＢ：１００μｇの細菌ゲノムＤＮＡ（〜４ｋｂ断片へと切断された） グループＣ：２００μｇの細菌ゲノムＤＮＡ（〜４ｋｂ断片へと切断された） グループＤ：１００μｇの、１：４のモル比（ＧＬ６７：ＤＮＡ）でカチオン
性脂質ＧＬ６７と複合体化した細菌ゲノムＤＮＡ（〜４ｋｂ断片に切断された）
；及び グループＥ：食塩水。

【００８４】 腫瘍細胞接種後２０日までには、対照グループ（グループＥ）には生き残った
マウスがいなくなった。しかしながら、結果により細菌ゲノムＤＮＡの用量依存
性の生き残り優位性が例証された。グループＢのマウスは第３４日目まで生き残
り、一方、グループＣからのマウスは第４７日目まで生き残った。第６０日目に
、グループＣのマウスの約１２％が依然生存していた。

【００８５】 最も驚くべきことに、カチオン性脂質ＧＬ６７と複合体化した細菌ゲノムＤＮ
Ａで処置したマウスに対し有意な生き残り強化があった。腫瘍細胞接種後第６０
日目において、この複合体で処理したマウスの１００％が依然として生存してい
た。

【００８６】 卵巣癌のＯＶＣＡラットモデル また、カチオン性脂質ＧＬ６７と複合体化した細菌ゲノムＤＮＡの投与により
、卵巣癌のＯＶＣＡラットモデルにおいても有効性が例証された。第０日におい
てラットの各グループは腫瘍細胞の腹腔内接種を受けた。腫瘍細胞の接種に次い
で、第６、１０、１４、及び１８日において以下の処方のいずれか一つの腹腔内
投与を受けた： グループＡ：細菌ゲノムＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ） グループＢ：ＧＬ６７：ＤＮＡのモル比１：４で、カチオン性脂質ＧＬ６７と
複合体化した細菌ゲノムＤＮＡ（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ） グループＣ：食塩水。

【００８７】 結果により、対照グループに比べての、ＧＬ６７：ＤＮＡ複合体で処置したラ
ットのグループの生き残りの優位性を例証した。例えば、食塩水で処置されたラ
ットの３０％以下しか腫瘍細胞接種後第２５日に生存していなかったが、細菌ゲ
ノムＤＮＡで処置したラットの約３０％が第２６日を過ぎても生き残った。しか
しながら、カチオン性脂質と複合体化した細菌ゲノムＤＮＡで処置されたラット
は、腫瘍細胞接種後４５日において７０％以上の生き残り率を有していた。この
データは、治療効果がマウスの腫瘍モデルに限定されないことを例証している。

【００８８】 Ｍ３メラノーマモデル 第０日に、Ｍ３メラノーマ細胞でマウスを腹腔内接種した。Ｍ３腫瘍細胞の接
種の後、第６，１１，１４及び１８日にマウスを、ナルベクター（発現可能なイ
ンサートを有しないベクター）に複合体化したカチオン性脂質ＧＬ６７である、
ＧＬ６７：ｐＮｕｌｌ複合体で処置するか、又は処置を行わずに放置（対照）し
た。処置を行わなかった対照動物のすべては第４０日までに死亡したが、ＧＬ６
７：ｐＮｕｌｌ複合体で処置した動物の８５％以上は第６８日においても生存し
ていた。

【００８９】 第６８日において、生き残っている動物をＭ３腫瘍細胞で皮下的に再チャレン
ジした。並行して、処置していない（ナイーブ）動物グループにもまた同一の細
胞によりチャレンジした。ナイーブグループ中の全ての動物は、第１０５日まで
に死亡したが、一方、ＧＬ６７：ｐＮｕｌｌ複合体により元々処置されていた動
物の約４０％は、最初の腹腔内腫瘍細胞によるチャレンジのみでなく、第二の皮
下的なチャレンジにも生き残った。これらの結果は、防護的な、記憶に基づく免
疫反応の発生を示唆する。

【００９０】 この驚くべき有効性が脂質：ＤＮＡ複合体の成分では達成されず、完全な複合
体によってのみ達成されることを例証するため、Ｍ３メラノーマモデルをまた使
用した。第０日におけるＭ３腫瘍細胞の腹腔内接種の後、第５、１０、１４及び
１８日において、マウスのグループをＧＬ６７：ｐＮｕｌｌ複合体（脂質：ｐＮ
ｕｌｌ）、等量のＧＬ６７（脂質単独）、等量のｐＮｕｌｌ ＤＮＡ（ｐＮｕｌ
ｌベクター単独）のいずれかで処置又は、処置しなかった。

【００９１】 ＧＬ６７単独は、腫瘍細胞接種から５０日経過後約３５％のマウスの生存を有
するという、幾らかの利益を示したが、ｐＮｕｌｌ ＤＮＡ単独で処置された又
は対照のマウスは４８日を経過して１匹も生き残らなかった。しかしながら、顕
著な保護がＧＬ６７：ｐＮｕｌｌ複合体での処置から得られ、そこでは全ての動
物が少なくとも５０日まで生存した。これらの結果は、メラノーマの腹腔内モデ
ルにおける有効性を例証するだけでなく、この有効性が脂質：ＤＮＡ複合体の個
々の成分によっては達成されるものではないこともまた示している。この顕著な
有効性は完全な複合体によってのみ観られる。

【００９２】 当業者にとっては、本発明の組成物及び方法において、種々の改変及びバリエ
ーションが本発明の精神及び範囲から離れることなく作られることが明らかであ
ろう。したがって、本記載が、本発明の改変及びバリエーションが以下の特許請
求の範囲とその均等物の範囲内にあることを条件に、当該本発明の改変及びバリ
エーションをカバーすることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 メチル化または非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴと複合体を形成したＧＬ−６７を
滴注した後のマウスＢＡＬＦのサイトカイン分析。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの
群に、１００μｌのＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：ｐＣＦ
１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７単独、（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ま
たはビヒクル（ナイーブ）を、鼻内滴注した。滴注後２４時間にＢＡＬＦを採取
し、ＥＬＩＳＡ測定法を使用して、種々のサイトカインのレベルを測定した。（
ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴとは、ＳｓｓＩメチラーゼでメチル化したｐＣＦ１−ＣＡ
Ｔを意味する。

【図２】 カチオン性脂質：ｐＤＮＡ複合体の投与後のＢＡＬＦ中の好中球の総細胞数（
図２Ａ）と割合（図２Ｂ）。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、１００μｌのＧ
Ｌ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６
７単独、（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ｐＣＦ１−ＣＡＴ、またはビヒクルを、鼻内
滴注した。滴注後２４時間にＢＡＬＦを採取し、総細胞数と異なる型の細胞とを
計測した。（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴとは、ＳｓｓＩメチラーゼでメチル化したｐ
ＣＨ−ＣＡＴを意味し、ＰＭＮとは多形核白血球を意味する。

【図３】 メチル化および非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴの混合物と複合体を形成したＧＬ
−６７の滴注後のマウスＢＡＬＦのサイトカイン分析。ＳｓｓＩメチル化ｐＣＦ
１−ＣＡＴを非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴと、０：３、１：２、２：１または３
：０［（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ：ｐＣＦ１−ＣＡＴ］の比で混合し、次にＧＬ−
６７と複合体を形成させて、最終濃度を０．３：１．８ＭＭ（ＧＬ−６７：ｐＤ
ＮＡ）とした。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、１００μｌのＧＬ−６７：ｐ
ＤＮＡ複合体とを滴注し、滴注の２４時間後、サイトカイン測定法のためにＢＡ
ＬＦを採取した。未処理（ナイーブ）の動物はビヒクルで処理した。（ｍ）は、
メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴを意味し、（ｕｎ）は非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴを
意味する。

【図４】 メチル化または非メチル化ｐＣＦ１−ＣＡＴと複合体を形成したＧＬ−６７の
投与後のＢＡＬＢ／ｃマウスの肺切片の組織病理学的分析。ＢＡＬＢ／ｃマウス
に１００μｌのＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：ｐＣＦ１−
ＣＡＴ、ＧＬ−６７単独、（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ｐＣＦ１−ＣＡＴ、または
ビヒクルを、鼻内滴注した。滴注後２日にマウスを屠殺し、ブラインドで（盲目
的なやり方で）組織学的観察のために肺を処理した。肺の炎症を０〜４のスケー
ルで等級をつけ、０は、正常の肺と比較して変化無し、１は最小の変化、２はわ
ずかな変化、３は中程度の変化、そして４は激しい変化を示す。（ｍ）ｐＣＦ１
−ＣＡＴは、ＳｓｓＩメチラーゼでメチル化したｐＣＦ１−ＣＡＴを意味する。

【図５】 ｐＣＦ１−ＣＡＴ中に存在するＣｐＧモチーフ。配列５’−ＲＲＣＧＹＹ−３
’を有するモチーフを示す。かっこ内の数字は、シトシン残基のヌクレオチド位
置を示す。図は以下の略語を使用する：ＫａｎＲ、カナマイシンの遺伝子；ＣＭ
Ｖプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター；ＣＡＴ、クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼのｃＤＮＡ；ＢＧＨポリＡ、ウシ成長ホルモ
ンのポリアデニル化配列。

【図６】 ｐＣＦ１−ＣＡＴのメチル化または突然変異誘発後のＣＡＴ発現の相対的レベ
ル。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、１００μｌのＧＬ−６７：ｐＣＦ１−Ｃ
ＡＴ、ＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：ｐＣＦＡ−２９９−
ＣＡＴ、またはＧＬ−６７：ｐＣＦＡ−２９９−１０Ｍ−ＣＡＴを、鼻内滴注し
た。ｐＣＦＡ−２９９−ＣＡＴは、ＣＭＶプロモーターとｐＣＦＡ−２９９−１
０Ｍ−ＣＡＴの部分的欠失（配列モチーフＲＲＣＧＹＹを有するＣｐＧ部位の追
加の１０突然変異）を含む。（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴは、ＳｓｓＩメチラーゼで
メチル化したｐＣＦ１−ＣＡＴを意味する。滴注後２日に、ＣＡＴ分析のために
肺を採取した。

【図７】 ｐＣＦ１−ＣＡＴと複合体を形成したＧＬ−６７と、数が減少したＣｐＧモチ
ーフを含有するｐＣＦ１−ＣＡＴの修飾型との滴注後のマウスＢＡＬＦのサイト
カイン分析。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、１００μｌのＧＬ−６７：ｐＣ
Ｆ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡＴ、ＧＬ−６７：ｐＣＦＡ−
２９９−ＣＡＴ、またはＧＬ−６７：ｐＣＦＡ−２９９−１０Ｍ−ＣＡＴを、鼻
内滴注した。滴注の２４時間後にＢＡＬＦを採取し、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、
ＩＬ−６、およびＩＬ−１２のＥＬＩＳＡ測定を行った。（ｍ）ｐＣＦ１−ＣＡ
Ｔは、ＳｓｓＩメチラーゼでメチル化したｐＣＦ１−ＣＡＴを意味する。ｐＣＦ
Ａ−２９９−ＣＡＴは、ＣＭＶプロモーターとｐＣＦＡ−２９９−１０Ｍ−ＣＡ
Ｔの部分的欠失（配列モチーフＲＲＣＧＹＹを有するＣｐＧ部位の追加の１０突
然変異）を含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 37/00 37/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 イユー、ネルソン、エス アメリカ合衆国 マサチューセッツ、ウエ スト アップトン、 ロックデール ヒル サークル 25 (72)発明者 ミッズン、リー カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ビクトリア、クアミチャン ストリート 1936 (72)発明者 カドヒム、サラム、アブドウル カナダ国 ブリティッシュ コロンビア、 ビクトリア、イアスキン レーン 14、ユ ニット 66 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 EA04 GA13 HA17 4C076 AA24 AA95 BB01 BB13 BB21 BB25 CC04 CC26 CC27 DD70 EE59 FF32 FF34 FF63 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA02 MA05 MA13 MA52 MA56 MA59 MA66 NA13 NA14 ZB09 ZB11 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BC30 CA12 MA05 MA13 MA52 MA56 MA59 MA66 NA13 NA14 ZB09 ZB11 ZB21 ZB26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物に複合体を含む組成物を投与する工程を含んでなる
   、哺乳動物で抗腫瘍細胞免疫応答を発生させる方法であって、該複合体は： カチオン性分子と、発現可能なｃＤＮＡ挿入体を持たない免疫活性のある核酸
   配列とを含んでなり、該組成物は、抗腫瘍細胞免疫応答を刺激するのに有効な量
   で投与される、上記方法。
2. 【請求項２】 免疫活性のある核酸配列は、細菌由来のプラスミドである、
   請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 細菌由来のプラスミドはＣｐＧの豊富なモチーフを含む、請
   求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 投与工程は、腫瘍内投与または腫瘍を含有する体腔コンパー
   トメントへの投与により行われる、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 投与工程は、エーロゾル化、静脈内注射、経口投与、腹腔内
   投与、鼻内投与、局所的投与、および経粘膜投与から選択される、請求項１に記
   載の方法。
6. 【請求項６】 抗腫瘍細胞応答は全身性応答である、請求項１に記載の方法
   。
7. 【請求項７】 複合体を含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含んでなる
   哺乳動物で防御性抗腫瘍細胞免疫応答を発生させる方法であって、 該複合体は、カチオン性分子と免疫活性のある核酸配列とを含み、該複合体は
   、抗腫瘍細胞免疫応答を刺激するのに有効な量で提供され、該投与は、防御性抗
   腫瘍細胞免疫応答を刺激することを目的とする、上記方法。
8. 【請求項８】 免疫活性のある核酸配列は、該哺乳動物中で生物活性のある
   ペプチドの転写または翻訳をすることができない、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 免疫活性のある核酸配列は細菌由来である、請求項７に記載
   の方法。
10. 【請求項１０】 免疫活性のある核酸配列はプラスミドである、請求項７に
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 免疫活性のある核酸配列はゲノムの細菌ＤＮＡである、請
    求項７に記載の方法。
12. 【請求項１２】 免疫活性のある核酸配列は断片である、請求項７に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 免疫活性のある核酸配列はＣｐＧの豊富なモチーフを含む
    、請求項７に記載の方法。
14. 【請求項１４】 投与は、腫瘍内投与、または腫瘍を含有する体腔コンパー
    トメントへの投与により行われる、請求項７に記載の方法。
15. 【請求項１５】 投与工程は、エーロゾル化、静脈内注射、経口投与、腹腔
    内投与、鼻内投与、局所的投与、および経粘膜投与から選択される、請求項７に
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 防御性抗腫瘍細胞応答は全身性応答である、請求項７に記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 アジュバントの投与を含む腫瘍抗原の効力を上昇させる方
    法であって、該アジュバントは、カチオン性分子：免疫活性のある核酸配列複合
    体を含み、該免疫活性のある核酸配列は発現可能なｃＤＮＡ挿入体を持たない、
    上記方法。
18. 【請求項１８】 カチオン性分子と、発現可能なｃＤＮＡ挿入体を持たない
    免疫活性のある核酸配列とを含んでなる、哺乳動物で防御性抗腫瘍細胞免疫応答
    を発生させるための組成物。
19. 【請求項１９】 カチオン性分子は である、請求項１８に記載の組成物。
20. 【請求項２０】 哺乳動物で抗腫瘍細胞免疫応答を発生させる方法であって
    、 と、発現可能なｃＤＮＡ挿入体を持たない免疫活性のある核酸配列とを、含んで
    なる組成物を、抗腫瘍細胞免疫応答を刺激するのに有効な量で、該哺乳動物に投
    与する工程を含んでなる、上記方法。