PT1009413E - Utilização de oligonucleótidos imumoestimulantes para a prevenção ou tratamento da asma. - Google Patents

Description

ΕΡ 1 009 413 /PT DESCRIÇÃO "Utilização de oligonucleótidos imunoestimulantes para a prevenção ou tratamento da asma"

DECLARAÇÃO DOS DIREITOS DO GOVERNO A presente invenção foi realizada com apoio do governo com a bolsa N.° AI37305, concedida pelo National institutes of Health. O governo poderá ter alguns direitos na presente invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos e composições de oligonucleótidos para utilização na redução ou supressão da inflamação mediada por oligonucleótidos num tecido do hospedeiro e na modulação da capacidade de resposta imunitária do hospedeiro a um antigénio.

HISTÓRIA DA ARTE RELACIONADA

Nos vertebrados, a adesão de células endoteliais por granulócitos (eosinófilos, basófilos, neutrófilos e mastócitos) é seguida pela libertação de mediadores inflamatórios, tais como leucotrienos, proteina básica principal e histamina. Em indivíduos susceptíveis a inflamação resultante pode danificar tecidos hospedeiros afectados. A condição inflamatória patológica mais comum é a asma, que se caracteriza por uma infiltração acentuada de eosinófilos nas vias aéreas respiratórias, seguida de dano tecidular induzido por inflamação. Outras condições inflamatórias patológicas associadas com a infiltração de granulócitos em tecidos afectados incluem polipose nasal, rinite alérgica, conjuntivite alérgica, dermatite atópica, fascite eosinofílica, síndrome eosinofílica idiopática e hipersensibilidade basofílica cutânea, bem como inflamação e fibrose resultantes da produção aumentada de citóquinas estimulantes de granulócitos, tais como interleucina (lL)-5 e alguns interferões (INF). 2

ΕΡ 1 009 413 /PT Ο tratamento de rotina destas condições é tipicamente dirigido para a inibição da actividade de mediadores inflamatórios libertados após adesão de granulócitos aos endotélios (e.g., fornecendo uma composição de corticóides aos tecidos afectados). Quando a identidade de um antigénio indutor de inflamação é conhecida, pode-se obter alguma protecção imunitária contra uma nova provocação com antigénio, através de imunização. No entanto, embora eficaz em estimular a produção de anticorpos neutralizantes, a imunização canónica não estimula eficazmente uma imunidade celular a longo prazo. Além disso, a imunização com antigénio estimula a produção de IL-4 e IL-5 pelo hospedeiro. A IL-5 encoraja a adesão de granulócitos aos endotélios, enquanto que a IL-4 induz a alteração de imunoglobulinas para o isotipo igE com o risco de anafilaxia. O WO98/18810, publicado em 7 de Maio de 1998, refere-se a moléculas de ácido nucleico imunoestimulantes contendo um dinucleótido CpG não metilado e sua utilização.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se meios para suprimir rapidamente a inflamação estimulada por antigénios num hospedeiro mamífero, por supressão da infiltração de granulócitos num tecido hospedeiro. A invenção também se refere a meios isentos de imunização para proporcionar protecção a um hospedeiro mamífero sensibilizado com antigénio contra uma provocação subsequente, sem o risco de anafilaxia. Em particular, a presente invenção proporciona a utilização de um oligonucleótido imunoestimulante (ISS-ODN) na preparação de um medicamento para o tratamento de asma num mamífero, sem o co-fornecimento de um antigénio imunizante, em que o mamífero é sensibilizado a um antigénio estimulante de asma e em que o ISS-ODN compreende a sequência 5'-citosina-guanina-3 ', em que o ISS-ODN é administrado ao tecido respiratório, intranasalmente, via inalação ou via insuflação.

Surpreendentemente, o ISS-ODN tem propriedades anti-inflamatórias além das suas propriedades imunoestimulantes. Os ISS-ODN são portanto úteis no tratamento e prevenção da inflamação associada com a infiltração de granulócitos no 3

ΕΡ 1 009 413 /PT tecido estimulada por antigénio, tal como ocorre nas vias respiratórias dos asmáticos durante um ataque de asma. Com vantagem, o fornecimento de ISS-ODN de acordo com a invenção suprime a infiltração de granulócitos no tecido estimulada por antigénio, mesmo antes do ISS-ODN afectar a resposta imunitária do hospedeiro ao antigénio. Assim, a invenção refere-se a um método independente do antigénio para reduzir a inflamação estimulada por antigénio, suprimindo a adesão celular, evitando assim a libertação de mediadores inflamatórios que seriam estimulados através da ligação de granulócitos a células endoteliais.

Um exemplo do controlo da asma é quando se fornecem ISS-ODN ao tecido pulmonar intranasalmente. Nos asmáticos, a infiltração de eosinófilos no tecido pulmonar ocorre essencialmente durante a fase tardia de uma resposta alérgica a um alergénio respiratório. A imunoterapia canónica pode modular a resposta imunitária do hospedeiro ao alergénio e eventualmente conduzir a corrente de eosinófilos para as vias aéreas do hospedeiro. No entanto, a prática da invenção suprime a infiltração de eosinófilos nas vias aéreas do hospedeiro muito antes do sistema imunitário do hospedeiro responder ao alergénio respiratório, proporcionando desse modo uma forma de protecção contra o estreitamento da via aérea e dano do tecido respiratório que caracterizam um ataque de asma agudo.

Também se descreve aqui um meio para mudar uma resposta imunitária celular presente do hospedeiro a um antigénio, afastando-se de um fenótipo Th2 e mudando para um fenótipo Thl. Para este fim, os ISS-ODN são fornecidos por qualquer via através da qual os tecidos do hospedeiro sensibilizado com antigénio serão contactados com os ISS-ODN. Os ISS-ODN administrados deste modo reforçam quer a resposta imunitária humoral (anticorpos), quer celular (tipo Thl) do hospedeiro. Ao contrário da imunoterapia canónica, a imunidade é estimulada por este método da invenção, mesmo quando não é introduzido no hospedeiro nenhum antigénio adicional. Assim, a utilização do método para reforçar a capacidade de resposta imunitária de um hospedeiro a uma provocação subsequente com um antigénio sensibilizador sem imunização, evita o risco de anafilaxia induzida por imunização, suprime a produção de igE 4

ΕΡ 1 009 413 /PT em resposta à provocação com antigénio e elimina a necessidade de identificar o antigénio sensibilizador para utilizar na imunização. Uma utilização especialmente vantajosa para isto é o tratamento de respostas alérgicas localizadas, em tecidos alvo através dos quais os alergénios entram no corpo, tal como a pele e mucosa. A supressão do fenótipo Th2 como aqui descrito também é um auxilio útil à imunoterapia canónica para reduzir a produção de IL-4 e IL-5 estimulada por antigénio. Assim, os ISS-ODN podem ser fornecidos a um hospedeiro para suprimir o fenótipo Th2 associado com imunização convencional com antigénios (e.g., para vacinação ou imunoterapia de alergia). A alteração para um fenótipo Thl aqui descrita é acompanhada por uma secreção aumentada de iFNa, β e γ, bem como de IL-12 e IL-18. Cada uma destas citóquinas aumenta as defesas imunitárias do hospedeiro contra patogénios intracelulares, tais como vírus. A angiogénese também é aumentada no fenótipo Thl (ostensivamente por estimulação com IL-12).

Proporcionam-se composições farmaceuticamente aceitáveis de ISS-ODN para utilização na prática dos métodos da invenção. Os ISS-ODN da invenção incluem oligonucleótidos de ADN ou ARN que são enriquecidos com dinucleótidos CpG, incluindo os que são constituídos pela estrutura primária 5'-Purina-Purina-[C]-[G]-Pirimidina-Pirimidina-3'.

Quando adequado para a via de terapia contemplada, os ISS-ODN podem ser administrados com outros agentes anti-inflamatórios ou imunoterapêuticos. Assim, uma composição particularmente útil para utilização na prática do método da invenção é uma em que um agente anti-inflamatório (e.g., um glucocorticóide) ou agente imunoterapêutico (e.g., um antigénio, citóquina ou adjuvante) é misturado com, ou conjugado com um ISS-ODN.

Os ISS-ODN também podem ser fornecidos na forma de um kit compreendendo ISS-ODN e quaisquer medicamentos adicionais, bem como um dispositivo para fornecimento dos ISS-ODN a um tecido 5

ΕΡ 1 009 413 /PT hospedeiro e reagentes para determinar o efeito biológico dos ISS-ODN no hospedeiro tratado.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1 é um esquema que resume aspectos do sistema imunitário de mamífero. A FIGURA 2 é um gráfico de dados que confirma uma alteração de um fenótipo Th2 para um fenótipo Thl (tal como medido pela produção de IgG2A) em ratinhos tratados com um ISS-ODN 3 dias antes da provocação com antigénio.

As FIGURAS 3a e 3b são gráficos de dados que confirmam a indução de um fenótipo Th2 (tal como medido por produção de IgGl) em ratinhos tratados com um ISS-ODN mutante, inactivo, 3 dias antes da provocação com antigénio. A FIGURA 4 é um gráfico de dados que confirma a supressão associada com Thl de IgE específica do antigénio em ratinhos tratados com ISS-ODN sensibilizados com antigénio, (pCMV-LacZ, um plasmídeo contendo duas cópias do ISS-ODN DY1018) em comparação com ratinhos sensibilizados com antigénio (controlo). A FIGURA 5 é um gráfico de dados que confirma a supressão da secreção de IL-4 por ISS-ODN em comparação com um controlo. A FIGURA 6 é um gráfico de dados que confirma a supressão da secreção de IL-5 por ISS-ODN em comparação com um controlo. A FIGURA 7 é um gráfico de dados que confirma a supressão da secreção de IL-10 por ISS-ODN em comparação com um controlo. A FIGURA 8 é um gráfico de dados que confirma a estimulação da secreção de lNF-γ por ISS-ODN, em comparação com um controlo.

A FIGURA 9 é um gráfico de dados que demonstra uma alteração para um fenótipo Thl mediada por ISS-ODN (como indicado pelos níveis de IFNy) em animais tratados com ISS-ODN 6

ΕΡ 1 009 413 /PT antes da provocação com antigénio (barras com asterisco) ou após a provocação com o antigénio. A FIGURA 10 é um gráfico de dados que demonstra um reforço da capacidade de resposta imunitária mediada por ISS-ODN (como indicado por aumentos na proliferação de linfócitos CD4+) em animais tratados com ISS-ODN antes da provocação com antigénio (barras com asterisco), ou após a provocação com antigénio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. Métodos anti-inflamatórios e imunoterapêuticos da invenção 1. Efeitos terapêuticos dos métodos da invenção

Ao fornecer ISS-ODN a um hospedeiro sensibilizado com antigénio; i.e., um mamífero cujo sistema imunitário foi imunizado para responder a uma provocação com um antigénio sensibilizador, o ISS-ODN pode ser utilizado no tratamento da inflamação e reforço da capacidade de resposta imunitária do hospedeiro com um fenótipo Thl contra um antigénio sensibilizador. Para os fins desta descrição, "antigénio sensibilizador" refere-se a uma proteína, péptido, glicoproteína, lípido ou polissacárido imunogénico, exógeno. Para referência, é anexado como FIGURA 1 um esquema que resume aspectos da imunidade de mamíferos contra antigénios. O efeito anti-inflamatório do ISS-ODN é útil para suprimir o início de, e para reduzir a inflamação mediada por granulócitos aguda, num hospedeiro sensibilizado com antigénio. Especificamente, o tratamento de um hospedeiro sensibilizado com antigénio (imunizado) antes de uma provocação subsequente com antigénio suprime a infiltração de tecido do hospedeiro por granulócitos (em especial eosinófilos e basófilos), estimulada por antigénio. De um modo semelhante, o tratamento de um hospedeiro sensibilizado com antigénio no, ou após provocação com antigénio reduz a infiltração de tecido do hospedeiro por granulócitos, estimulada por antigénio. Com vantagem, o impacto anti-inflamatório do ISS-ODN fornecido de acordo com a invenção é rápido, tendo efeito mesmo antes de ser esperado que o ISS-ODN tenha um impacto na capacidade de 7

ΕΡ 1 009 413 /PT resposta do hospedeiro ao antigénio sensibilizador. A invenção proporciona assim ao hospedeiro uma protecção quase imediata contra o dano tecidular da inflamação mediada por granulócitos.

Por exemplo, como se pode ver pelos dados no Exemplo II, os modelos animais de asma alérgica sensibilizados com antigénio, tratados com ISS-ODN sem provocação concorrente com antigénio tiveram uma redução tão elevada quanto 90% da infiltração de eosinófilos no tecido respiratório, em comparação com animais de controlo e animais tratados apenas com um mutante de ISS-ODN inactivo. De forma significativa, obteve-se uma redução da infiltração de eosinófilos em ratinhos previamente provocados, ou supressão da infiltração de eosinófilos em ratinhos imunizados, não provocados, no espaço de tão pouco quanto 24 horas após o fornecimento de ISS-ODN. O efeito do ISS-ODN na infiltração de eosinófilos é assim independente da resposta imunitária do hospedeiro que se desenvolve mais tarde ao antigénio sensibilizador. Sendo independentes do antigénio, os ISS-ODN podem ser utilizados como supressores de inflamação antes da provocação com antigénio, ou durante um período em que está presente o risco de provocação com antigénio (e.g., durante uma época de alergia) . De relevância, como se pode ver nos Exemplos IV e VI, os ISS-ODN podem ser utilizados de acordo com a invenção para prevenir a inflamação ou uma resposta imunitária aquando de uma provocação subsequente com antigénio, num hospedeiro imunizado com antigénio, bem como para reduzir a inflamação ou outras respostas imunitárias estimuladas pelo antigénio, após provocação com antigénio.

Embora a invenção não se limite a nenhum mecanismo de acção, é provável que a actividade anti-inflamatória dos ISS-ODN seja pelo menos em parte uma consequência da supressão de IL-5. No entanto, a supressão da acumulação de granulócitos no tecido do hospedeiro é conseguida mais rapidamente (no espaço de 24 horas) do que é esperado para a activação imunitária de linfócitos que segregam citóquinas. Assim, também é possível que os ISS-ODN administrados de acordo com a invenção interfiram fisicamente com a adesão de granulócitos a endotélios, talvez bloqueando os receptores endoteliais de VCAM-1, o seu ligando eosinofílico (VLA-4) ou por lise dos 8 ΕΡ 1 009 413 /PT granulócitos. Seja qual for o mecanismo, a supressão de ISS-ODN da acumulação de granulócitos de acordo com a invenção parece ser independente da estimulação por ISS-ODN do sistema imunitário do hospedeiro. O efeito imunoterapêutico dos ISS-ODN produz uma resposta imunitária do tipo vacina à provocação com um antigénio sensibilizador, sem exposição concorrente do hospedeiro ao antigénio. A estimulação imunitária conseguida é comparável à estimulação imunitária que ocorre na vacinação de um hospedeiro com um antigénio sensibilizador. Assim, os ISS-ODN proporcionam meios para imunizar um hospedeiro contra um antigénio sensibilizador sem provocação deliberada com antigénio.

Com vantagem, a resposta imunitária estimulada por ISS-ODN difere de uma resposta de imunização na medida em que a última se desenvolve num fenótipo Th2, enquanto que a primeira se desenvolve num fenótipo Thl. A este respeito é útil recordar que os linfócitos CD4+ geralmente se enquadram num de dois subconjuntos diferentes; i.e., as células Thl e Th2. As células Thl segregam essencialmente IL-2, IFNy e TNFp (sendo que os dois últimos medeiam a activação de macrófagos e hipersensibilidade do tipo retardado) enquanto que as células Th2 segregam essencialmente IL-4 (que estimula a produção de anticorpos IgE), IL-5 (que estimula a infiltração de granulócitos nos tecidos), IL-6 e IL-10. Estes subconjuntos de CD4+ exercem uma influência negativa um no outro; i.e., a secreção de linfóquinas Thl inibe a secreção de linfóquinas Th2 e vice-versa.

Os factores que se pensa que favorecem a activação de Thl assemelham-se aos induzidos por infecção virai e incluem patogénios intracelulares, exposição a IFN-β, IFN-α, IFNy, IL-12 e IL-18 e exposição a doses baixas de antigénio. As respostas imunitárias do tipo Thl também predominam na doença auto-imune. Os factores que se pensa que favorecem a activação de Th2 incluem exposição a IL-4 e IL-10, actividade de APC na parte de linfócitos B e doses elevadas de antigénio. As células Thl activas (iFNy) aumentam a imunidade celular e têm portanto um valor particular na resposta a infecções intracelulares, enquanto que as células Th2 activas aumentam a 9

ΕΡ 1 009 413 /PT produção de anticorpos e são portanto importantes na resposta a infecções extracelulares (com o risco de fenómenos anafilácticos associados com a produção de anticorpos IgE estimulada por il-4) . Assim, a capacidade de mudar as respostas imunitárias do hospedeiro de Thl para o repertório

Th2 e vice-versa tem um significado clinico substancial para controlar a imunidade do hospedeiro contra a provocação com antigénio (e.g., em condições infecciosas e alérgicas).

Para esse fim, os ISS-ODN mudam a resposta imunitária do hospedeiro a um antigénio sensibilizador para um fenótipo Thl (Exemplo IV) . Consequentemente, a secreção de IL-4, IL-5 e IL-10 estimulada por antigénio/associada a Th2 (Exemplo VI), a infiltração de granulócitos em tecido sensibilizado por antigénio estimulada por IL-5 (Exemplos II e III) e a produção de IgE estimulada por IL-4 (Exemplo V) são suprimidas, reduzindo desse modo o risco do hospedeiro de inflamação alérgica prolongada e minimizando o risco de anafilaxia induzida pelo antigénio.

Embora a invenção não seja limitada por nenhum mecanismo de acção particular, pode-se conceber que os ISS-ODN facilitam a incorporação de antigénio exógeno por células que apresentam antigénio, para apresentação através das vias de processamento de MHC de classe I do hospedeiro. Seja qual for o mecanismo de acção, a utilização de ISS-ODN para reforçar a capacidade de resposta imunitária do hospedeiro a um antigénio sensibilizador e mudar a resposta imunitária para um fenótipo Thl, evita o risco de anafilaxia induzida por imunização, suprime a produção de IgE em resposta a um antigénio sensibilizador e elimina a necessidade de identificar o antigénio sensibilizador para utilização na imunização.

Em relação à invenção, a "redução de inflamação" mediada por ISS-ODN (num hospedeiro imunizado, provocado com antigénio), "prevenção da inflamação" (num hospedeiro imunizado antes da provocação com antigénio) e "reforço da capacidade de resposta imunitária num fenótipo Thl" num hospedeiro tratado com ISS-ODN são evidenciados por qualquer um dos fenómenos seguintes: (1) uma redução nos níveis de IL-4 medidos antes e após a provocação com antigénio; ou detecção de níveis inferiores 10

ΕΡ 1 009 413 /PT (ou mesmo ausentes) de IL-4 num hospedeiro tratado, em comparação com um controlo imunizado com antigénio, ou imunizado e provocado; (2) um aumento nos níveis de IL-12, IL-18 e/ou IFN (α, β ou γ) antes e após a provocação com antigénio; ou detecção de níveis mais elevados de IL-12, IL-18 e/ou IFN (α, β ou γ) num hospedeiro tratado com ISS-ODN, em comparação com um controlo imunizado com antigénio, ou imunizado e provocado; (3) produção de anticorpo IgG2a num hospedeiro tratado; ou (4) uma redução nos níveis de IgE específico de antigénio, tal como medido antes e depois da provocação com antigénio; ou detecção de níveis inferiores (ou mesmo ausentes) de IgE específico de antigénio num hospedeiro tratado com ISS-ODN, em comparação com um controlo imunizado com antigénio ou imunizado e provocado.

Além disso, em relação à redução e prevenção de inflamação em particular, indícios particularmente significativos da eficácia do método da invenção num hospedeiro tratado são: (5) uma redução na contagem de granulócitos (e.g., de eosinófilos ou basófilos, dependendo do tipo de célula que está mais envolvido na condição que afecta o hospedeiro) no infiltrado inflamatório de um tecido hospedeiro afectado, tal como medido num hospedeiro provocado com antigénio antes e após a administração de ISS-ODN, ou detecção de níveis inferiores (ou mesmo ausentes) de contagens de eosinófilos ou basófilos num hospedeiro tratado, em comparação com um controlo imunizado com antigénio, ou imunizado e provocado.

Exemplos de métodos para determinar estes valores estão descritos em maior detalhe nos Exemplos. 2. Métodos e vias para administração de ISS-ODN a um hospedeiro

Os ISS-ODN da invenção são administrados a um hospedeiro no tecido respiratório, intranasalmente, por inalação ou por insuflação. No entanto, os peritos na arte terão em conta que os métodos e vias localizadas que dirigem os ISS-ODN para o 11

ΕΡ 1 009 413 /PT tecido sensibilizado com antigénio serão preferidos na maioria das circunstâncias às vias de administração sistémicas, quer para um efeito terapêutico imediato, quer para evitar a degradação do oligonucleótido in vivo. O ponto de entrada para muitos antigénios exógenos num hospedeiro é através da pele ou mucosa. Os peritos na arte clinica estão familiarizados com, ou podem facilmente determinar os meios para fornecer drogas à pele e mucosa. Para revisão, no entanto, descrevem-se a seguir resumidamente exemplos de métodos e vias para o fornecimento de drogas, úteis na invenção.

Os meios de administração intranasal são particularmente úteis na inflamação respiratória, em particular na inflamação mediada por antigénios transmitidos a partir das vias nasais para a traqueia e bronquiolos. Estes meios incluem inalação de suspensões de aerossóis ou insuflação das composições de polinucleótidos da invenção. Os dispositivos nebulizadores adequados para fornecimento de composições de polinucleótidos à mucosa nasal, traqueia e bronquiolos são bem conhecidos na arte e não serão portanto descritos aqui em detalhe. Para uma revisão geral sobre o fornecimento de drogas intranasalmente, os peritos na arte poderão se desejado consultar Chien, Novel Drug Delivery Systems, Cap. 5 (Mareei Dekker, 1992).

3. Parâmetros de doseamento para ISS-ODN

Uma vantagem particular dos ISS-ODN da invenção é a sua capacidade para exercer actividade anti-inflamatória e imunoterapêutica, mesmo em dosagens relativamente pequenas. Embora a dosagem utilizada varie dependendo dos objectivos clínicos a ser alcançados, uma gama de dosagens adequada é uma que proporciona até cerca de 1-1000 pg de ISS-ODN/ml de transportador numa única dosagem. Tendo em conta os ensinamentos proporcionados por esta descrição, os peritos na arte clínica estarão familiarizados com, ou poderão facilmente determinar os parâmetros adequados para administração de ISS-ODN de acordo com a invenção. A este respeito, deve referir-se que a actividade anti-inflamatória e imunoterapêutica dos ISS-ODN na invenção é 12

ΕΡ 1 009 413 /PT essencialmente dependente da dose. Assim, para aumentar a potência dos ISS-ODN num valor de dois, cada dose individual é duplicada em termos de concentração. Clinicamente, poderá ser aconselhável administrar os ISS-ODN numa dosagem baixa (e.g., cerca de 1 pg/ml a cerca de 50 pg/ml), em seguida aumentar a dosagem como necessário para se obter o objectivo terapêutico desejado. Alternativamente, pode considerar-se uma dosagem alvo de ISS-ODN como sendo cerca de 1-10 μΜ numa amostra de sangue de hospedeiro retirada nas primeiras 24-48 horas após a administração de ISS-ODN. Com base em estudos actuais, pensa-se que os ISS-ODN têm pouca ou nenhuma toxicidade a estes níveis de dosagem.

B. Composições anti-inflamatórias de ISS-ODN

1. Estrutura dos ISS-ODN

Funcionalmente, os ISS-ODN aumentam as respostas imunitárias celulares e humorais num hospedeiro, em particular a proliferação de linfócitos e a libertação de citóquinas (incluindo IFN) pelos monócitos e células assassinas naturais (NK) do hospedeiro. A imunoestimulação por ISS-ODN sintéticos in vivo ocorre contactando os linfócitos do hospedeiro com, por exemplo, oligonucleótidos ISS-ODN, conjugados de oligonucleótidos ISS-ODN e vectores de expressão recombinantes contendo ISS (dados referentes à actividade de conjugados de ISS-ODN e vectores de ISS-ODN são apresentados nos pedidos de patente US co-pendentes e de atribuição comum com os Nos de série 60/028118 e 08/593554; sendo aqui incorporados dados dos mesmos para referência, para demonstrar a actividade imunoestimulante de ISS-ODN in vivo). Assim, apesar dos ISS-ODN microbianos nativos estimularem o sistema imunitário do hospedeiro a responder à infecção, os análogos sintéticos destes ISS-ODN são terapeuticamente úteis para modular a resposta imunitária do hospedeiro, não só contra antigénios microbianos, mas também contra antigénios de tumor, alergénios e outras substâncias.

Estruturalmente, os ISS-ODN são oligonucleótidos não codificantes com dimensão de hexâmero ou superior que podem incluir pelo menos um motivo CpG não metilado. A posição relativa de cada sequência de CpG no ISS-ODN com actividade 13

ΕΡ 1 009 413 /PT imunoestimulante nalgumas espécies de mamíferos (e.g., roedores) é 5'-CG-3' (i.e., a C está na posição 5' em relação à G na posição 3') . Muitos ISS-ODN conhecidos flanqueiam o motivo CpG com pelo menos dois nucleótidos de purina (e.g., GA ou AA) e pelo menos dois nucleótidos de pirimidina (5'-Purina-Purina-[C]-[G]-Pirimidina-Pirimidina-3'). Pensa-se que os ISS-ODN que contêm o motivo CpG estimulam a proliferação de linfócitos B (veja-se, e.g., Krieg, et al., Nature, 374:546-549, 1995). A estrutura nuclear de hexâmero dos ISS-ODN anteriores pode ser flanqueada a montante e/ou a jusante por qualquer número ou composição de nucleótidos ou nucleósidos. No entanto, os ISS-ODN são pelo menos hexâmeros de comprimento, e de preferência têm entre 6 e 200 unidades em comprimento, para aumentar a incorporação dos ISS-ODN nos tecidos alvo. Os peritos na arte estarão familiarizados com, ou podem facilmente identificar sequências de nucleótidos descritas de ISS-ODN conhecidos. Para facilidade de referência a este respeito, as seguintes fontes são especialmente úteis:

Yamamoto, et al., Microbiol.Immunol., 36:983 (1992)

Bailas, et al., J. Immunol., 157:1840 (1996)

Klinman, et al., J.Immunol., 158:3635 (1997)

Sato, et al., Science, 273:352 (1996)

Cada um destes artigos é aqui incorporado para referência a fim de ilustrar o nível de conhecimento na arte em relação à composição de nucleótidos de ISS-ODN.

Em particular, os ISS-ODN úteis na invenção incluem os que têm as seguintes sequências de nucleótidos hexaméricas: 1. ISS-ODN com dinucleótidos "CpG"; e, 2. substituições de Inosina e/ou uracilo para nucleótidos nas sequências de hexâmero anteriores para utilização como ISS-ODN de ARN.

Por exemplo, os ISS-ODN baseados em ADN úteis na invenção incluem os que têm as seguintes sequências de nucleótidos hexaméricas: 14

ΕΡ 1 009 413 /PT AACGTT, AGCGTC, GACGTT, GGCGTT, AACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT, TTCGAA, GGCGTT e AACGCC (respectivamente, SEQ. ID. N.os 1-18).

Os ISS-ODN podem ser adn de cadeia simples ou cadeia dupla, ARN de cadeia simples ou cadeia dupla e/ou oligonucleósidos. Os ISS-ODN podem ou não incluir regiões palindrómicas. Quando presente, um palindroma pode estender-se apenas a um motivo CpG, se presente, na sequência hexamérica nuclear, ou pode incluir mais da sequência de hexâmero, bem como sequências de nucleótido flanqueadoras.

As bases de nucleótido do ISS-ODN que flanqueiam o motivo CpG do hexâmero nuclear e/ou constituem as sequências de nucleótido flanqueadoras podem ser quaisquer bases que ocorrem naturalmente, ou bases não naturais, sintéticas (e.g., TCAG ou, em ARN, UACGI). Os oligonucleósidos podem ser incorporados na região interna e/ou nos terminais do ISS-ODN utilizando técnicas convencionais para utilização como pontos de ligação para outros compostos (e.g., péptidos). A base(s), porção de glicido, grupos fosfato e terminais do ISS-ODN podem também ser modificados de qualquer modo conhecido pelos peritos na arte para construir um ISS-ODN com propriedades desejadas além da actividade do ISS-ODN descrita. Por exemplo, as porções de glicido podem ser ligadas a bases de nucleótido de ISS-ODN em qualquer configuração estereoquimica.

Adicionalmente, as modificações do grupo fosfato do esqueleto (e.g., ligações internucleótidos metilfosfonato, fosforotioato, fosforoamidato e fosforoditioato) podem conferir actividade antimicrobiana aos ISS-ODN e aumentar a sua estabilidade in vivo, tornando-os particularmente úteis em aplicações terapêuticas. Uma modificação particularmente útil do grupo fosfato é a conversão nas formas fosforotioato ou fosforoditioato dos oligonucleótidos ISS-ODN. Além das suas propriedades potencialmente antimicrobianas, os fosforotioatos e fosforoditioatos são mais resistentes à degradação in vivo do que os seus oligonucleótidos equivalentes não modificados, tornando os ISS-ODN da invenção mais disponíveis para o hospedeiro. 15

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2. Síntese, e pesquisa, de ISS-ODN

Os ISS-ODN podem ser sintetizados utilizando técnicas e equipamento de síntese de ácidos nucleicos que são bem conhecidos na arte. Para referência a este respeito, veja-se, e.g. Ausubel, et ai., Current Protocols in Molecular Biology, Caps. 2 e 4 (Wiley Interscience, 1989); Maniatis, et ai.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab., Nova Iorque, 1982); patente U.S. N.° 4458066 e patente U.S. N.° 4650675. Estas referências são aqui incorporadas como referência, com o único fim de demonstrar o conhecimento na arte no que se refere à produção de oligonucleótidos sintéticos. Uma vez que os ISS-ODN são não codificantes, não há a preocupação de manter uma fase de leitura aberta durante a síntese.

Os ISS-ODN podem ser incorporados num vector de fornecimento, tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus ou retrovírus, que pode por sua vez codificar para polipéptidos terapeuticamente benéficos, tais como citóquinas, hormonas e antigénios. A incorporação de ISS-ODN nestes vectores não afecta de forma adversa a sua actividade.

Alternativamente, os ISS-ODN podem ser isolados de espécies microbianas (em especial micobactérias) utilizando técnicas bem conhecidas na arte, tais como hibridação de ácidos nucleicos. De preferência, estes ISS-ODN isolados serão purificados até um estado substancialmente puro; i.e., para serem isentos de contaminantes endógenos, tais como lipopolissacáridos. Os ISS-ODN isolados como parte de um polinucleótido maior podem ser reduzidos até ao tamanho desejado por técnicas bem conhecidas na arte, tal como por digestão com endonucleases. Os peritos na arte estarão familiarizados com, ou podem facilmente determinar, técnicas adequadas para o isolamento, purificação e digestão de polinucleótidos para obter ISS-ODN de utilidade potencial na invenção. A confirmação de que um oligonucleótido particular tem as propriedades de um ISS-ODN útil na invenção pode ser obtida avaliando se o ISS-ODN afecta a secreção de citóquinas e a produção de anticorpos do isotipo igG, como descrito na 16

ΕΡ 1 009 413 /PT secção A.I, acima. Os detalhes das técnicas in vitro úteis para fazer esta avaliação são dados nos exemplos; os peritos na arte também conhecerão, ou podem facilmente determinar outros métodos para medir a secreção de citóquinas e produção de anticorpos com os parâmetros aqui ensinados.

As técnicas para produzir modificações do qrupo fosfato em oligonucleótidos são conhecidas na arte e não necessitam de uma explicação detalhada. Para revisão de uma técnica deste tipo útil, prepara-se um intermediário de triéster de fosfato para o produto de oligonucleótido alvo e oxida-se no triéster de fosfato que ocorre naturalmente, com iodo aquoso, ou com outros agentes, tais como aminas anidras. Os fosforamidatos de oligonucleótido resultantes podem ser tratados com enxofre para se obterem fosforotioatos. A mesma técnica geral (excepto o passo de tratamento com enxofre) pode ser aplicada para se obterem metilfosfoamiditos a partir de metilfosfonatos. Para mais detalhes no que se refere a técnicas de modificação do grupo fosfato, os peritos na arte poderão consultar se desejado as patentes U.S. Nos 4425732; 4458066; 5218103 e 5453496, bem como Tetrahedron Lett. em 21:4149 (1995), 7:5575 (1986) , 25:1437 (1984) e Journal Am. Chem Soc.r 93:6657 (1987) , cujas descrições ilustram o nivel padrão de conhecimento na arte referente à preparação destes compostos.

Pode-se utilizar um sistema de dispersão coloidal para o fornecimento dirigido do ISS-ODN a um tecido inflamado. Os sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, pérolas, e sistemas baseados em lipidos, incluindo emulsões de óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. O sistema coloidal preferido da presente invenção é um lipossoma.

Os lipossomas são vesículas de membrana artificiais que são úteis como veículos de fornecimento in vitro e in vivo. Verificou-se que vesículas unilamelares grandes (LUV), que têm tamanhos na gama de 0,2-4,0 pm podem encapsular uma percentagem substancial de um tampão aquoso contendo macromoléculas grandes. O ARN, ADN e viriões intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser fornecidos a células numa forma biologicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sei., 6:77, 1981). Além das células de mamífero, os 17

ΕΡ 1 009 413 /PT lipossomas têm sido utilizados para fornecer polinucleótidos a células de plantas, leveduras e insectos. De modo a que um lipossoma seja um veiculo eficiente de transferência de genes, deverão estar presentes as seguintes caracteristicas: (1) encapsulação de genes que codificam para polinucleótidos de sentido inverso com uma eficiência elevada, não comprometendo ao mesmo tempo a sua actividade biológica; (2) ligação preferencial e substancial a uma célula alvo, em comparação com células não alvo; (3) fornecimento do conteúdo aquoso da vesícula ao citoplasma da célula alvo, com uma eficácia elevada; e (4) expressão precisa e eficaz da informação genética (Mannino, et ai., Biotechniques, 6:682, 1988). A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolípidos, em particular fosfolípidos de temperatura de transição de fases elevada, normalmente em combinação com esteróides, em especial colesterol. Também se podem utilizar outros fosfolípidos ou outros lípidos. As caracteristicas físicas dos lipossomas dependem do pH, força iónica e da presença de catiões bivalentes.

Exemplos de lípidos úteis na produção de lipossomas incluem compostos de fosfatidilo, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos e gangliósidos. São particularmente úteis os diacilfosfatidilgliceróis, em que a porção de lípido contém de 14-18 átomos de carbono, em particular de 16-18 átomos de carbono e é saturada. Exemplos de fosfolípidos incluem fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e diestearoilfosfatidilcolina de ovo. O direccionamento de lipossomas para um alvo pode ser classificado com base em factores anatómicos e mecanísticos. A classificação anatómica baseia-se no nível de selectividade, por exemplo, específico de órgão, específico de células e específico de organelos. O direccionamento para um alvo mecanístico pode ser distinguido com base no facto de ser passivo ou activo. O direccionamento para um alvo passivo utiliza a tendência natural dos lipossomas se distribuírem nas células do sistema retículo endotelial (RES) em órgãos que contêm capilares sinusoidais. O direccionamento para um alvo 18

ΕΡ 1 009 413 /PT activo, por outro lado, envolve a alteração do lipossoma por acoplamento do lipossoma a um ligando específico, tal como um anticorpo monoclonal, glícido, glicolípido ou proteína, ou por alteração da composição ou tamanho do lipossoma de modo a se conseguir direccionar para órgãos e tipos de células que não os sítios de localização que ocorrem naturalmente. A superfície do sistema de fornecimento direccionado para um alvo pode ser modificada numa variedade de formas. No caso de um sistema de fornecimento direccionado lipossómico, podem-se incorporar grupos de lípidos na bicamada lipídica do lipossoma para manter o ligando de direccionamento para um alvo em associação estável com a bicamada lipossómica. Podem-se utilizar vários grupos de ligação bem conhecidos para ligar as cadeias de lípido ao ligando alvo (veja-se, e.g., Yanagawa, et al., Nuc. Acids Symp. Ser., 19:189 (1988); Grabarek, et al., Anal. Biochem., 185:131 (1990); Staros, et al., Anal. Biochem., 156:220 (1986) e Boujrad, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:5728 (1993), cujas descrições são aqui incorporadas como referência, apenas para ilustrar o nível padrão de conhecimento na arte, no que se refere à conjugação de oligonucleótidos a lípidos). O fornecimento direccionado de ISS-ODN também pode ser conseguido por conjugação do ISS-ODN a uma superfície de vectores de expressão recombinantes virais e não virais, a um antigénio ou outro ligando, a um anticorpo monoclonal ou a qualquer molécula que tem a especificidade de ligação desejada.

Exemplos de outros parceiros conjugados úteis incluem qualquer antigénio imunogénico (incluindo alergénios, partículas virais vivas e atenuadas e antigénios de tumor), péptidos para direccionamento a um alvo (tais como ligandos de receptores, anticorpos e fragmentos de anticorpo, hormonas e enzimas), antigénios não peptídicos (acoplados através de uma ligação peptídica, tais como lípidos, polissacáridos, glicoproteínas, gangliósidos e semelhantes) e citóquinas, incluindo interleucinas, interferões, eritropoietina, factor de necrose de tumor e factores estimulantes de colónias). Estes parceiros conjugados podem ser preparados de acordo com técnicas convencionais (e.g., síntese de péptidos) e muitos estão disponíveis comercialmente. 19

ΕΡ 1 009 413 /PT OS peritos na arte também estarão familiarizados com, ou podem facilmente determinar, métodos úteis para preparar conjugados de oligonucleótido-péptido. A conjugação pode ser realizada em qualquer dos terminais do ISS-ODN, ou numa base modificada de forma adequada numa posição interna (e.g., uma citosina ou uracilo). Para referência, são conhecidos métodos para conjugar oligonucleótidos a proteínas e a porções de oligossacárido de Ig (veja-se, e.g., 0'Shannessy, et al., J. Applied Biochem., 7:347 (1985), cuja descrição ilustra o nível padrão de conhecimento na arte referente à conjugação de oligonucleótidos). Outra referência útil é Kessler: "Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acids", in Kricka (ed.), Nonisotopic DNA Probe Techniques (Acad. Press, 1992)).

Em resumo, exemplos de métodos de conjugação adequados, conhecidos, incluem: conjugação por ligação 3' através de química de suporte sólido (veja-se, e.g., Haralambidis, et al., Nuc. Acids Res.r 18:493 (1990) e Haralambidis, et al.,

Nuc. Acids Res., 18:501 (1990) [síntese em suporte sólido do parceiro peptídico]; Zuckermann, et al., Nuc. Acids Res., 15:5305 (1987), Corey, et al., Science, 238:1401 (1987) e

Nelson, et al., Nuc. Acids Res., 17:1781 (1989) [síntese em suporte sólido do parceiro de oligonucleótido]). As ligações de grupos amino-amino podem ser realizadas como descrito em Benoit, et al., Neuromethods, 6:43 (1987), enquanto que as ligações do grupo tiolcarboxilo podem ser realizadas como descrito em Sinah, et al., Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach (IRL Press, 1991). Nestes últimos métodos, o parceiro de oligonucleótido é sintetizado num suporte sólido e um grupo ligante compreendendo uma amina protegida, grupo tiol ou carboxilo oposto ao fosforamidito é ligado de forma covalente ao 5'-hidroxilo (veja-se e.g., patentes U.S. Nos. 4849513; 5015733; 5118800 e 5118802). A ligação do parceiro oligonucleótido a um péptido pode também ser feita via incorporação de um braço ligante (e.g., grupo amina ou carboxilo) a uma base de citosina ou uracilo modificada (veja-se, e.g., Ruth, 4o congresso anual de pesquisa de ADN recombínante em 123). Também se podem utilizar ligações de afinidade {e.g., biotina-estreptavidina) (veja-se, e.g., Roget, et al., Nuc. Acids Res., 17:7643 (1989)). 20

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Também são conhecidos métodos para ligar oligonucleótidos a lipidos e incluem a sintese de conjugados oligo-fosfolipidos (veja-se, e.g., Yanagawa, et al., Nuc. Acids Symp. Ser., 19:189 (1988)), sintese de conjugados oligo-ácidos gordos (veja-se, e.g., Grabarek, et al., Anal. Biochem., 185:131 (1990)) e conjugados oligo-esterol (veja-se, e.g., Boujrad, et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 90:5728 (1993)).

Cada uma das referências anteriores ilustra o nivel de conhecimento na arte em relação aos métodos de conjugação de oligonucleótidos. A co-administração de uma droga peptidica com um ISS-ODN de acordo com a invenção também pode ser conseguida por incorporação do ISS-ODN em cis ou em trans num vector de expressão recombinante (plasmideo, cosmideo, virus ou retrovirus) que codifica para qualquer proteína terapeuticamente benéfica que pode ser fornecida por um vector de expressão recombinante. Se é desejada a incorporação de um ISS-ODN num vector de expressão para utilização na prática da invenção, esta incorporação pode ser realizada utilizando técnicas convencionais que não necessitam ser explicadas em detalhe a um perito na arte. Para revisão, no entanto, os peritos na arte poderão consultar Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, supra.

Em resumo, a construção de vectores de expressão recombinantes (incluindo os que não codificam para nenhuma proteína e são utilizados como transportadores para ISS-ODN) utiliza técnicas de ligação convencionais. Para análise para confirmar as sequências correctas em vectores construídos, podem-se utilizar misturas de ligação para transformar uma célula hospedeira e seleccionar os transformantes bem sucedidos por resistência a antibiótico, quando adequado. Os vectores para os transformantes são preparados, analisados por restrição e/ou sequenciados, por exemplo pelo método de Messing, et al., (Nuclelc Acids Res., 9:309, 1981), o método de Maxam, et al., (Methods in Enzymology, 65:499, 1980), ou outros métodos adequados que serão conhecidos dos peritos na arte. A separação por tamanhos dos fragmentos clivados é realizada utilizando electroforese em gel convencional como 21

ΕΡ 1 009 413 /PT descrito, por exemplo, por Maniatis, et ai., (Molecular

Cloning, pp. 133-134, 1982) .

As células hospedeiras podem ser transformadas com vectores de expressão e cultivadas em meio nutriente convencional modificado como adequado para induzir promotores, seleccionar transformantes ou amplificar genes. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão evidentes para os peritos na arte.

Quando se utiliza um vector de expressão recombinante como transportador para o ISS-ODN da invenção, os plasmideos e cosmideos são particularmente preferidos pela sua falta de patogenicidade. No entanto, os plasmideos e cosmideos estão sujeitos a degradação in vivo mais rapidamente do que os virus e portanto podem não fornecer uma dosagem adequada de ISS-ODN para inibir substancialmente a actividade imunoestimulante de ISS-ODN exercida por um vector de terapia génica administrado sistemicamente. De entre as alternativas de vectores virais, os virus adeno-associados terão a vantagem de uma patogenicidade baixa. A capacidade relativamente baixa dos virus adeno-associados para inserção de genes estranhos não irá levantar nenhum problema neste contexto devido ao tamanho relativamente pequeno em que os ISS-ODN da invenção podem ser sintetizados.

Outros vectores virais que podem ser utilizados na invenção incluem adenovírus, virus adeno-associados, virus de herpes, virus vacinia ou virus de ARN, tais como retrovirus. Os vectores retrovirais são de preferência derivados de um murideo, ave ou retrovirus de VIH humano. Exemplos de vectores retrovirais em que se pode inserir um único gene estranho incluem, mas não se limitam a: virus de leucemia de murideo Moloney (MoMuLV), virus de sarcoma de murideo de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamário de murideo (MuMTV), e virus de sarcoma de Rous (RSV). Outros vectores retrovirais podem incorporar genes múltiplos. Todos estes vectores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador seleccionável, de modo a que as células transduzidas possam ser identificadas e produzidas. 22

ΕΡ 1 009 413 /PT

Uma vez que os retrovírus recombinantes são deficientes, eles necessitam de auxilio de modo a produzir partículas de vector infecciosas. Este auxílio pode ser proporcionado, por exemplo, utilizando linhas de células ajudantes que contêm plasmídeos que codificam para todos os genes estruturais do retrovírus sob o controlo de sequências reguladoras no LTR. Estes plasmídeos não possuem uma sequência de nucleótidos que permite que o mecanismo de empacotamento reconheça uma molécula transcrita de ARN para encapsidação. As linhas de células ajudantes que têm eliminações do sinal de empacotamento incluem, mas não se limitam a, Ψ2, PA317 e PAI2, por exemplo. Estas linhas celulares produzem viriões vazios, uma vez que nenhum genoma é empacotado. Se um vector retroviral é introduzido nestas células ajudantes em que o sinal de empacotamento está intacto, mas os genes estruturais são substituídos por outros genes de interesse, o vector pode ser empacotado e os viriões do vector produzidos.

Inserindo uma ou mais sequências de interesse no vector virai, juntamente com outro gene que codifica para o ligando de um receptor numa célula alvo específica, por exemplo, o vector pode ser tornado específico para o alvo. Os vectores retrovirais podem ser tornados específicos para o alvo por inserção, por exemplo, de um polinucleótido que codifica para um glícido, um glicolípido ou uma proteína. O direccionamento para um alvo preferido é conseguido utilizando um anticorpo para direccionar o vector retroviral. Os peritos na arte conhecerão, ou podem facilmente determinar sem experimentação excessiva, sequências de polinucleótido específicas que podem ser inseridas no genoma retroviral para permitir o fornecimento específico do alvo do vector retroviral que contém ISS-ODN.

C. Composições farmacêuticâs de ISS-ODN

Quando é para ser fornecido sem utilização de um vector ou outro sistema de fornecimento, o ISS-ODN será preparado numa composição farmaceuticamente aceitável. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis preferidos para utilização com o ISS-ODN da invenção podem incluir soluções, suspensões e emulsões aquosas e não aquosas, estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são o propilenoglicol, 23

ΕΡ 1 009 413 /PT polietilenoglicol, óleos vegetais, tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. Os transportadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, Ringer de dextrose, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixados. Os veículos intravenosos incluem reparadores de fluidos e nutrientes, reparadores de electrólitos (tais como os baseados em Ringer de dextrose) e semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. Uma composição de ISS-ODN também pode ser liofilizada utilizando meios bem conhecidos na arte, para reconstituição subsequente e utilização de acordo com a invenção.

Promotores de absorção, detergentes e irritantes químicos (e.g., agentes queritinolíticos) podem aumentar a transmissão de uma composição de ISS-ODN para um tecido alvo. Para referência respeitante aos princípios gerais de promotores de absorção e detergentes que foram utilizados com sucesso no fornecimento de drogas orgânicas e baseadas em péptidos a mucosas, veja-se Chien, Novel Drug Delivery Systems, Cap. 4 (Mareei Dekker, 1992).

Exemplos de promotores de absorção nasal adequados são apresentados em Chien, supra no Cap. 5, Tabelas 2 e 3; sendo preferidos agentes mais suaves. Agentes adequados para utilização no método da presente invenção para fornecimento mucoso/nasal também estão descritos em Chang, et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on Controlled Drug Delivery", Cap. 9 e Tabelas 3-4B do mesmo, (Mareei Dekker, 1992). Agentes adequados que são conhecidos por aumentar a absorção de drogas através da pele estão descritos em Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Cap. 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery" (Mareei Dekker, 1992), e noutras partes do texto.

Todas estas referências ilustram o nível de conhecimentos na arte referente a técnicas de fornecimento de drogas. 24

ΕΡ 1 009 413 /PT D. Kits para utilização na prática dos métodos da invenção

Para utilização nos métodos descritos acima, a invenção também proporciona kits. Estes kits podem incluir qualquer um ou todos os seguintes: ISS-ODN (conjugado ou não conjugado); um transportador farmaceuticamente aceitável (pode ser pré-misturado com o ISS-ODN) ou base de suspensão para reconstituir ISS-ODN liofilizados; medicamentos adicionais; um frasco estéril para cada ISS-ODN e medicamento adicional, ou um único frasco para suas misturas; dispositivo(s) para utilização no fornecimento de ISS-ODN a um hospedeiro; reagentes de teste para detectar indícios de que os efeitos anti-inflamatórios e/ou imunoestimulantes foram alcançados nos animais tratados e dispositivo de teste adequado. A seguir apresentam-se exemplos que ilustram a prática da invenção. Os exemplos são para fins de referência e não deverão ser entendidos como limitativos da invenção, a qual é definida pelas reivindicações anexas. Todas as abreviaturas e termos utilizados nos exemplos têm o significado normal e esperado, salvo indicação em contrário.

EXEMPLO I

MODELO DE MURÍDEO PARA A HIPER-REACTIVIDADE DAS VIAS AÉREAS NA ASMA ALÉRGICA

Ratinhos provocados com antigénio sensibilizador de diferentes estirpes servem de modelo à hiper-reactividade das vias aéreas observada na asma alérgica. As estirpes de murídeo adequadas para utilização na modelação da doença incluem ratinhos Balb/c (que são desviados geneticamente para o fenótipo Th2 e produzem concentrações aumentadas de IL-4 e IL-5 em resposta à provocação com antigénio a linfócitos CD4+), ratinhos C57BL/6 (que são deficientes em IL-5, para o estudo detalhado de dano tecidular induzido por IL-5 na asma) e ratinhos w/W (que são deficientes em mastócitos, para estudo detalhado da activação de mastócitos na asma).

Os ratinhos para modelo de doenças são convenientemente preparados por injecção intraperitoneal ou subcutânea de um antigénio sensibilizador modelo, ovalbumina ("OVA") num 25

ΕΡ 1 009 413 /PT transportador (e.g., solução salina estéril ou um transportador com adjuvante, tal como alúmen), seguido de provocação com antigénio na forma de aerossol. Por exemplo, os ratinhos podem ser imunizados com 25 pg de OVA por injecção subcutânea (com ou sem adjuvante) semanalmente, durante 4-6 semanas, em seguida provocados com 2 ou 3 administrações de OVA por aerossol semanalmente, a uma concentração de 50 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) fornecida a intervalos de 20 minutos, ou a uma concentração de 10 mg/ml de solução salina a 0,9% diariamente, durante cerca de uma semana (em três intervalos de 30 minutos, diariamente). Os dispositivos nebulizadores para utilização no fornecimento de aerossóis estão disponíveis da Aerotech II, CIS-US, Bedford, MA, com uma câmara nasal adaptada para as vias nasais de murídeo (e.g., uma câmara apenas de nariz da Intox Products, Albuquerque, NM) . Quando accionados por ar comprimido a uma taxa de 10 litros/min, os dispositivos descritos produzem partículas de aerossol com um diâmetro aerodinâmico médio de I, 4 pm.

Os ratinhos de controlo são de preferência parceiros de ninhada que são provocados com proteína-antigénio sem imunização prévia. Para mais detalhes a respeito deste modelo animal os peritos na arte poderão, se desejado, consultar

Foster, et al.r J. Exp. Med.r 195-201, 1995; e, Corry, et al., J. Exp. Med., 109-117, 1996.

EXEMPLO II

REDUÇÃO DA ACUMULAÇÃO DE EOSINÓFILOS EM TECIDO PULMONAR NUM MODELO DE ASMA DE MURÍDEO POR ADMINISTRAÇÃO DE ISS-ODN

Prepararam-se ratinhos BALB/c de 6-10 semanas de idade como modelos de asma alérgica como descrito no Exemplo I (injecção subcutânea de OVA seguido de provocação com antigénio a uma concentração de 50 mg OVA/ml PBS) . Antes de cada inalação com OVA de acordo com este esquema, trataram-se conjuntos de 8 ratinhos cada, como descrito na tabela a seguir. Os ratinhos de controlo foram provocados com antigénio, mas os ratinhos "ingénuos" e não tratados, não foram provocados com antigénio. Todas as doses de ISS eram de 100 pg por administração. As doses de dexametasona (um anti- 26 ΕΡ 1 009 413 /PT inflamatório esteróide convencional utilizado no tratamento de asma) eram de 5 mg/kg/ratinho. As doses de imunização de antigénio eram de 25 μg de OVA adsorvido em alúmen, em 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). As doses de provocação de antigénio eram de 10 ml de 50 mg OVA/ml PBS. IN= intranasal; IP= intraperitoneal; SC= subcutâneo e N/A= não aplicável.

conjunto # Material recebido Via e altura 1 Ratinho ingénuo (sem antigénio) N/A 2 DY1018 (ISS-ODN) IN, 1 dia antes da primeira inalação 3 DY1018 IN, 1 dia antes da segunda inalação 4 DY1018 IN, com a segunda inalação 5 DY1018 IN, 2 dias após a segunda inalação 6 DY1018 IP, 1 dia antes da primeira inalação 7 DY1018 IP, 1 dia antes da segunda inalação 8 DY1018 IP, com a segunda inalação 9 DY1018 IP, 2 dias após a segunda inalação 10 DY1018 IT, 2 dias após a segunda inalação 11 DY1019 (M-ISS-ODN) IN, 2 dias após inalação 12 DY1019 IP, 2 dias após a segunda inalação 13 DY1019 IT, 2 dias após a segunda inalação 14 Dexametasona SC, 2 dias após a segunda inalação 15 Dexametasona SC, 7 dias após a segunda inalação 16 Ratinho de controlo (apenas antigénio) N/A O DY1018 tem a sequência de nucleótidos: 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEQ.ID.No. 19) com um esqueleto de fosfotioato 27

ΕΡ 1 009 413 /PT e o DY1019 tem a sequência de nucleótidos: 5'-TGACTGTGAAGGTTGGAGATGA-3' (SEQ.ID.No. 20) com um esqueleto de fosfotioato.

No dia 32, cada ratinho foi sangrado por corte na cauda (volume de aproximadamente 50 μΐ) numa solução 0,1 mM de PBS e EDTA. Os glóbulos vermelhos em solução foram Usados com NH4C1 150 mM e KHCO3 10 mM em dH20, em seguida corados (coloração Wright-Giesma). A lavagem do pulmão de cada ratinho foi obtida após sacrifício por canalização da traqueia e lavagem com 800 microlitros de PBS, em seguida o produto da lavagem foi corado. Obtiveram-se amostras de medula óssea de cada ratinho irrigando medula de fémur extraída com PBS. Os espécimes histológicos de tecido de pulmão e traqueia foram obtidos do lobo direito inferior do pulmão e traqueia. Os espécimes foram congelados, seccionados até uma espessura de 5 mícrones e corados com DAB peroxidase.

Os resultados estão expressos na tabela a seguir como percentagem de eosinófilos em comparação com os leucócitos totais (infiltrado inflamatório) em cada amostra, excepto para os resultados do "pulmão", que representam o número de eosinófilos por campo microscópico (avaliaram-se 5 campos seleccionados ao acaso para cada amostra). Em resumo, os ratinhos de controlo tinham uma média de 67% de eosinófilos em amostras de tecido de pulmão/traqueia, enquanto que os ratinhos que receberam o mutante de ISS-ODN (M-ISS-ODN; DY1019) tinham uma acumulação média de 52% e 88% (± 12%) de eosinófilos no tecido do pulmão após administração IP e IN, respectivamente. Os valores mais elevados para os ratinhos tratados com M-ISS-ODN após provocação com antigénio são muito provavelmente devido às propriedades imuno-inibitórias de DY1019 (veja-se o pedido de patente US co-pendente, de domínio público intitulado "Inibidores da actividade de sequência imunoestimulante de ADN Eyal Raz, inventor; apresentado em 6 de Junho de 1997 (N.° de série 60/048793)). Os conjuntos de ratinhos 7 e 8 servem portanto de modelo para um hospedeiro parcialmente imune com asma alérgica.

Em contraste notório, os ratinhos previamente tratados com o ISS-ODN DY1018 fornecido intranasalmente tinham menos de cerca de 10% de acumulação de eosinófilos no pulmão e traqueia 28

ΕΡ 1 009 413 /PT quando tratados após provocação com antigénio e apenas cerca de 19% de acumulação de eosinófilos quando tratados antes da provocação com antigénio. Estes valores representam uma redução de até 80% na acumulação de eosinófilos em comparação com os ratinhos de controlo e uma redução superior a 90% em comparação com ratinhos tratados com M-ISS-ODN (IN).

Os ratinhos tratados com IP ISS-ODN foram ainda mais longe, com uma acumulação de 6% de eosinófilos no pulmão e traqueia por tratamento antes e após a provocação com antigénio. Este valor representa uma redução de 86% na acumulação de eosinófilos, em comparação com os ratinhos de controlo e uma redução de 91% em comparação com os ratinhos tratados com M-ISS-ODN (IP).

Estes dados indicam que a acumulação de eosinófilos estimulada por IL-5 no tecido de pulmão, que caracteriza a fase tardia da asma alérgica, é inibida pelos métodos terapêuticos de ISS-ODN da invenção.

Conjunto # Medula óssea Lavagem bronqueoalveolar Sangue Tecido do pulmão e traqueia 1 (ingénuos) 3 + 2 0 2 ± 1 2 + 1 2 (ISS) 5 ± 1 10 ± 2 3 ± 1 8 ± 1 3 (ISS) 12 ± 1 17 ± 4 6 ± 2 19 ± 5 4 (ISS) 5 ± 1 3 ± 1 2 ± 1 6 ± 1 5(ISS) 8 ± 2 4 ± 3 3 ± 1 6 ± 4 6 (ISS) 10 ± 1 10 ± 1 4 ± 1 16 ± 4 7 (M-ISS) 13 ± 1 51 ± 3 10 ± 1 88 ± 12 8 (M-ISS) 13 ± 1 43 ± 1 10 ± 1 52 ± 14 9 (controlo) 3 ± 2 42 ± 4 14 ± 3 67 ± 5

EXEMPLO III

REDUÇÃO DA ACUMULAÇÃO DE EOSINÓFILOS NO TECIDO PULMONAR INDEPENDENTE DO ANTIGÉNIO

Para analisar se a supressão de eosinófilos demonstrada pelos dados no Exemplo II é dependente da estimulação imunitária por ISS-ODN, os ratinhos foram sensibilizados a OVA utilizando um adjuvante estimulante de Th2, convencional (alúmen), tratado com ISS-ODN ou um controlo e mediu-se a 29

ΕΡ 1 009 413 /PT supressão de eosinófilos antes de ser esperado que ocorresse a estimulação por ISS-ODN do sistema imunitário de ratinho.

Mais especificamente, imunizaram-se grupos de quatro ratinhos com 25 pg de OVA em 1 mg de alúmen por injecção subcutânea nos dias 1, 7, 14 e 21. É conhecido que este protocolo de imunização estimula uma resposta do tipo Th2 ao antigénio, em ratinhos. No dia 27, um grupo de animais recebeu 100 pg do ISS-ODN DY1018 descrito no Exemplo I, por administração intraperitoneal. Um grupo de controlo recebeu o mutante DY1019 M-ISS-ODN descrito no Exemplo I pela mesma via.

No dia 28, os animais em cada grupo receberam 10 mg OVA/ml de solução salina tamponada com fosfato por inalação durante 30 minutos. No dia 30, alguns dos animais em cada grupo receberam uma segunda injecção de ISS-ODN ou M-ISS-ODN e os animais que não foram tratados no dia 27, foram tratados com ISS-ODN ou M-ISS-ODN. A provocação por inalação com OVA foi repetida no dia 31 e os animais foram sacrificados para contagem de eosinófilos, no espaço de 24 horas.

Os resultados desta experiência são apresentados na tabela a seguir. Os animais que receberam dois tratamentos com ISS-ODN nos dias 27 e 30 tinham apenas 5,8% de eosinófilos na lavagem do fluido bronqueoalveolar (BALF) no dia 32, mesmo apesar da estimulação imunitária por ISS-ODN ser minima em tão pouco tempo após o tratamento. Mesmo após apenas um tratamento com ISS-ODN (no dia 30), a acumulação de eosinófilos no BALF de animais tratados era limitada a 10,3%. Pelo contrário, os animais de controlo tratados duas vezes com M-ISS-ODN tinham 42,3% de eosinófilos no BALF extraido.

Animais Tratados no dia 28 Sangue Medula óssea BALF ISS-ODN sim 1,9% ± 0,8 5,8% ± 2,5 5,8% ± 2,8 M-ISS-ODN sim 9,8% ± 2,1 13,0% ± 0,9 42,3% ± 3,5 ISS-ODN Não 3,5% ± 0,6 10,5% ± 1,4 10,3% ± 1,3

Estes dados estabelecem que a prática da invenção pode inibir a inflamação alérgica em animais e que a inibição pode ocorrer tão rapidamente quanto um dia após o tratamento. 30

ΕΡ 1 009 413 /PT

EXEMPLO IV

INDUÇÃO SELECTIVA DE UMA RESPOSTA Thl NUM HOSPEDEIRO APÓS ADMINISTRAÇÃO DE UM PLASMÍDEO CONTENDO ISS-ODN

Nos ratinhos, os anticorpos IgG 2A são marcadores serológicos para uma resposta imunitária do tipo Thl, enquanto que os anticorpos IgG 1 são indicativos de uma resposta imunitária do tipo Th2. As respostas de Th2 incluem a classe de anticorpos IgE associados a alergias; os antigénios de proteínas solúveis tendem a estimular respostas de Th2 relativamente fortes. Pelo contrário, as respostas de Thl são induzidas por ligação do antigénio a macrófagos e células dendríticas.

Para determinar qual a resposta, se existente, que seria produzida por ratinhos que receberam ISS-ODN de acordo com a invenção, nove grupos de ratinhos Balb/c foram imunizados com 10 pg de proteína β-galactosidase (conjugada com avidina; Sigma, St. Louis, MO) para produzir um fenótipo alérgico modelo e tratados como se segue:

Grupo de ratinho Tratamento com ISS-ODN 1 Nenhum (β-gal) 2 DY1018 (ISS-ODN) injectado com o antigénio 3 DY1018 injectado 72 h após o antigénio (mesmo sítio) 4 DY1019 (M-ISS-ODN) injectado com o antigénio 5 DY1019 injectado 72 h após o antigénio (mesmo sítio) A intervalos de 2 semanas, qualquer IgG 2a e IgG 1 contra β-galactosidase presente no soro de cada ratinho foi medido por teste imunossorvente com enzimas ligadas (utilizando anticorpos específicos para as subclasses IgG 1 e IgG 2A) em placas de microtítulo revestidas com a enzima.

Como se pode ver na FIGURA 2, apenas os ratinhos que receberam o ISS-ODN produziram títulos elevados de anticorpos IgG 2A, que aumentaram em número ao longo de um período de 12 semanas. Como se pode ver na FIGURA 3, a imunização dos ratinhos com o próprio antigénio ou com o ISS-ODN mutante induziu a produção de títulos de IgG 1 relativamente elevados. 31

ΕΡ 1 009 413 /PT

Os dados apresentados nas FIGURAS compreendem médias dos valores obtidos de cada grupo de ratinhos.

Estes dados indicam que uma resposta Thl selectiva é induzida por administração de um ISS-ODN de acordo com a invenção a um hospedeiro provocado com antigénio. Além disso, os dados indicam que a administração de ISS-ODN de acordo com a invenção desvia o sistema imunitário na direcção de um fenótipo Thl aquando da provocação com antigénio, mesmo quando os ISS-ODN são administrados antes da provocação com antigénio (neste caso, 72 horas antes da provocação).

EXEMPLO V

SUPRESSÃO DA RESPOSTA DE ANTICORPOS IgE CONTRA O ANTIGÉNIO POR IMUNIZAÇÃO COM POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM PARA O ANTIGÉNIO

Para demonstrar a supressão de IgE obtida por estimulação de uma resposta imunitária celular do tipo Thl em preferência a uma resposta imunitária celular do tipo Th2, imunizaram-se ratinhos Balb/c de cinco a oito semanas de idade com um de dois vectores de expressão recombinantes: pCMV-Lac-Z contendo ISS-ODN (que contém duas cópias de sequências de nucleótidos semelhantes ao ISS-ODN DY1018) ou um plasmídeo de controlo, pCMV-BL. Um terceiro grupo de ratinhos recebeu injecções de antigénio (β-galactosidase). O ADN plasmídico foi purificado e o seu teor de endotoxinas reduzido para 0,5-5 ng/1 mg ADN por extracção com TRITON X-114 (Sigma, St. Louis, MI). Antes da inoculação, o pDNA foi precipitado em etanol, lavado com etanol a 70% e dissolvido em solução salina normal isenta de pirogénio.

A imunização foi feita por injecção intradérmica de ADN plasmídico carregado em tinas separadas de um dispositivo de tinas múltiplas MONO-VACC® (Connaught Lab, Inc., Swiftwater, PA). Em resumo, os dispositivos de tina foram preparados após lavagem extensiva em DDW e ensopados durante a noite em SDS a 0,5% (dodecilsulfato de sódio), lavados mais uma vez em DDW, ensopados durante a noite em NaOH 0,1 N, lavados mais uma vez em DDW e secos a 37°C durante 8 horas. Pipetaram-se 6 μΐ de ADN plasmídico dissolvido em solução salina normal para as tinas do dispositivo de tinas, imediatamente antes de cada inoculação descrita a seguir. A quantidade total de pADN 32

ΕΡ 1 009 413 /PT carregado no dispositivo por inoculação era de 25 pg cada de pCMV-Lac-Z e pCMV-BL. Para fins de estimativa das doses efectivas, assumiu-se que menos de 10% da solução de pADN eram carregados no dispositivo de tinas e efectivamente introduzidos por injecção das tinas no tecido intradérmico.

Cada ratinho foi tratado 3 vezes com 2 inoculações de cada plasmideo num intervalo de uma semana injectado intradermicamente na base da cauda. Outro grupo de ratinhos recebeu uma única injecção intradérmica na base da cauda de 10 pg de proteína β-galactosidase (dissolvida em 50 pl de solução salina normal) em vez de pADN.

Para induzir uma resposta de anticorpos igE a uma provocação subsequente com antigénio sensibilizador, cada grupo de ratinhos foi injectado uma vez intraperitonealmente com 0,1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1 pg de antigénio (β-galactosidase; Calbiochem, San Diego, CA) e 3 mg de alúmen hidróxido de alumínio, como adjuvante (Pierce Chemical, Rockford, IL) 14 semanas após a imunização inicial. A IgE total foi determinada no soro de ratinhos 4 vezes ao longo das 4 semanas consecutivas subsequentes. A IgE foi detectada utilizando um radioimunoensaio de fase sólida (RAST) numa placa de polivinilo de 96 poços (uma modificação radioisotópica do procedimento ELISA descrito em Coligan, "Current Protocols In Immunology", Unidade 7.12.4, Vol. 1, Wiley & Sons, 1994), com a excepção de que se utilizaram anticorpos policlonais de cabra purificados para cadeias e de ratinho, em vez de anticorpos específicos para Fab humano. Para detectar IgE anti-Lac-Z, as placas foram revestidas com β-galactosidase (10 pg/ml). A concentração mais baixa de IgE mensurável pelo teste utilizado foi de 0,4 ng de IgE/ml.

Medindo especificamente a resposta anti-antigénio para cada grupo de ratinhos, como se pode ver na FIGURA 4, os níveis de IgE anti-Lac-Z nos ratinhos injectados com plasmideo contendo ISS-ODN eram consistentemente baixos, quer antes, quer após reforço (com uma média de cerca de 250 CPM em RAST), enquanto que os ratinhos injectados com proteína desenvolveram 33 ΕΡ 1 009 413 /PT níveis elevados de anti-Lac-Z, em particular após a primeira injecção de reforço de antigénio, quanto os níveis de anti-Lac-Z nos ratinhos aumentaram para uma média de cerca de 3000 CPM. Consistente com a aquisição de tolerância, os níveis de IgE anti-Lac-Z nos ratinhos injectados com proteína diminuíram ao longo do tempo, mas continuaram a aumentar nos ratinhos de controlo que não tinham recebido nenhuma imunização contra a β-galactosidase.

Estes dados mostram que os ratinhos injectados com plasmídeo contendo ISS-ODN desenvolveram uma resposta de Thl específica do antigénio para o produto de expressão do plasmídeo, com supressão concomitante da produção de IgE, enquanto que os ratinhos injectados com proteína adquiriram tolerância apenas após o desenvolvimento de níveis substancialmente mais elevados de anticorpos IgE específicos para o antigénio.

EXEMPLO VI

NÍVEIS DE IL-4, IL-5, IL-10 E INFy E PROLIFERAÇÃO DE LINFÓCITOS CD4+ EM RATINHOS, APÓS FORNECIMENTO DE ISS-ODN

Injectaram-se ratinhos BALB/c intravenosamente com 100 pg de DY1018, DY1019, ou um controlo de sequência ao acaso (DY1043), em seguida foram sacrificados 24 h mais tarde. Recolheram-se esplenócitos de cada ratinho.

Revestiram-se placas de microtítulo de 96 poços com anticorpo anti-CD3 (Pharmingen, La Jolla, CA) a uma concentração de 1 pg/ml de solução salina. O anticorpo anti-CD3 estimula as células T por fornecimento de um sinal químico que mimetiza os efeitos da ligação ao complexo receptor de células T (TCR). As placas foram lavadas e adicionaram-se esplenócitos a cada poço (4xl05/poço) num meio de RPMI 1640 com soro fetal de vitela a 10%. Os sobrenadantes foram obtidos nos dias 1, 2 e 3.

Os níveis de citóquinas Th2 (IL—4, IL-5 e IL-10) foram determinados nos sobrenadantes utilizando um kit comercial; os níveis de citóquinas Thl (INFy) foram determinados com um teste de anticorpo de murídeo anti-INFy (veja-se, e.g., 34

ΕΡ 1 009 413 /PT

Coligan, "Current Protocols in Immunology", Unidade 6.9.5., Vol. 1, Wiley & Sons, 1994). Níveis relativamente elevados de IL-4 e IL-10 com níveis baixos de INF-γ seriam esperados em ratinhos com um fenótipo Th2, enquanto que níveis relativamente baixos de IL-4 e IL-10 com níveis elevados de INF-γ seriam esperados em ratinhos com um fenótipo Thl. Níveis relativamente elevados de IL-5 caracterizam um meio pró-inflamatório, enquanto que o contrário é verdade para níveis relativamente baixos de IL-5.

Como se mostra nas FIGURAS 5 e 6, níveis de secreção de IL-4 e IL-10 estimulada por anti-CD3 em ratinhos tratados com DY1018 eram substancialmente menores do que nos ratinhos de controlo. Os níveis nos ratinhos DY1019 eram intermédios. Os níveis de IL-5 pró-inflamatório estavam reduzidos nos ratinhos tratados com DY1018 numa extensão comparável (FIGURA 7).

Os níveis de proliferação de células T em resposta à provocação com antigénios estavam muito reduzidos em ratinhos tratados com DY1018 (ISS-ODN), em comparação com ratinhos tratados com DY1019 (ISS-ODN mutante) e controlo. Esta supressão da proliferação de células T era reversível por administração de IL-2, demonstrando que a supressão era devida a anergia de Th2 nos ratinhos tratados com ISS-ODN (veja-se, Tabela a seguir).

Tratamento Controlo (CPM) ISS-ODN (CPM) M-ODN (CPM) OVA (50 pg/ml) 40680 ± 5495 15901 ± 4324 42187 ± 13012 OVA + IL-2 (1,5 ng/ml) 65654 ± 17681 42687 ± 6329 79546 ± 10016 OVA + IL-2 (15 ng/ml) 60805 ± 19181 57002 ± 10658 60293 ± 5442

Os níveis de secreção de IFN-γ estimulada por Thl estavam bastante aumentados nos ratinhos tratados com DY1018, mas estavam substancialmente reduzidos nos ratinhos tratados com DY 1019 (em comparação com o controlo), indicando estimulação de um meio tipo Th2 nos últimos ratinhos (FIGURA 8) . Outros dados demonstrando estes resultados são apresentados na tabela a seguir, "b/f" na tabela refere-se a antes; "Ia", "2a" e "cada" referem-se à administração do composto antes da Ia ou 2a provocação com antigénio. 35

ΕΡ 1 009 413 /PT

Com relevância, o tratamento de ratinhos antes da provocação com antigénio é ainda mais eficaz em mudar a resposta imunitária para um fenótipo Thl do que o tratamento após a provocação. Como se pode ver nas FIGURAS 9 e 10, os animais imunizados com antigénio (mas não provocados) injectados com ISS-ODN DY1019 72 horas antes da provocação com antigénio (com β-galactosidase) desenvolveram uma resposta imunitária do tipo Thl mais forte contra o antigénio do que os seus parceiros de ninhada tratados após provocação, ou parceiros de ninhada tratados antes da provocação com um oligonucleótido mutante, inactivo (DY1019), tal como medido por aumento na secreção de iFNy (FIGURA 9) e proliferação de linfócitos CD4+ (FIGURA 10).

Conjunto # IL-5(pg/ml) IFN-γ(pg/ml) 1 (ingénuos) < 20 < 20 2 (ISS) in b/f 1° 466 ± 40 246 ± 86 3 (ISS) in b/f 2o 531 ± 109 168 ± 22 4 (ISS) in com 2o 575 ± 90 98 ± 44 5 (ISS) in b/f cada 200 ± 66 443 ± 128 6 (ISS) ip; b/f 1° 190 ± 52 664 ± 61 7 (ISS) ip; b/f 2o 421 ± 102 252 ± 24 8 (ISS) ip; com 2o 629 ± 110 104 ± 15 9 (ISS) ip; b/f cada 121 ± 18 730 ± 99 10 (ISS) it; b/f cada 191 ± 49 610 ± 108 11 (M-ISS) in; b/f cada 795 ± 138 31 ± 22 12 (M-ISS) ip; b/f cada 820 ± 122 33 ± 33 13 (M-ISS) it; b/f cada 657 ± 52 102 ± 57 14(esteróide) sc; b/f cada 424 ± 90 < 20 15(esteróide) sc; diariamente 252 ± 96 < 20 16 (controlo) não tratado 750 ± 124 24 ± 21

Adicionalmente, o ISS-ODN administrado de acordo com a invenção suprimiu a libertação de citóquinas Th2 de células de ratinho sensibilizadas com Th2 (esplenócitos recolhidos de ratinhos imunizados com OVA, em seguida incubados durante 72 horas com 100 pg/ml OVA in vitro). O tratamento com ISS-ODN ocorreu ou 1 (-1), ou 3 (-3) dias antes do sacrifício. Estes dados são apresentados a seguir: 36

ΕΡ 1 009 413 /PT

Grupo IL-3 (pg/ml) IL-5 (pg/ml) IFNy (pg/ml) Controlo 1299 ± 89 657 ± 52 < 20 ISS-ODN (-1) 309 ± 26 112 ± 18 < 20 ISS-ODN (-3) 463 ± 48 144 ± 27 < 20 ISS-ODN (-1) 964 ± 81 508 ± 77 < 20

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

As SEQUÊNCIAS ID N.os 1 a 18 são representativas de sequências de nucleótidos hexaméricas de ISS-ODN. A SEQUÊNCIA ID N.° 19 é a sequência de nucleótidos completa de ISS-ODN DY1018. A SEQUÊNCIA ID N.° 20 é a sequência de nucleótidos completa de um mutante de ISS-ODN inactivo, DY1019.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: The Regents of the University of Califórnia

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODOS ISENTOS DE IMUNIZAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE INFLAMAÇÃO ESTIMULADA POR ANTIGÉNIOS NUM HOSPEDEIRO MAMÍFERO E DESVIO DA CAPACIDADE DE RESPOSTA IMUNITÁRIA DO HOSPEDEIRO AO ANTIGÉNIO PARA UM FENÓTIPO TH1 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 20 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Fish & Richardson, P.C. (B) RUA: 4225 Executive Square, Suite 1400 (C) CIDADE: La Jolla

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: US (F) CÓDIGO POSTAL: 92037 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows 95 (D) SOFTWARE: FastSEQ for Windows Versão 2.0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DE PEDIDO: PCT/US98/- - -- - (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: 37

ΕΡ 1 009 413 /PT (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: 08/927,120 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 05 Setembro 1997 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Stacy L. Taylor, (B) NÚMERO DE REGISTRO: 34,842 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 07340/054W01 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 619-678-5070 (B) TELEFAX: 619-678-5099 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: AACGTT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: AGCGTC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GACGTT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes 38

ΕΡ 1 009 413 /PT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: GGCGTT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: AACGTC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: AGCGTC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: GACGTC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: GGCGTC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear 39

ΕΡ 1 009 413 /PT (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: AACGCC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: AGCGCC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: GACGCC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: GGCGCC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: AGCGCT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear 40

ΕΡ 1 009 413 /PT (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14: GACGCT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15: GGCGCT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16: TTCGAA 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17: GGCGTT 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18: AACGCC 6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear 41

ΕΡ 1 009 413 /PT (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19: TGACTGTGAA CGTTCGAGAT GA 22 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: ambos (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos não codificantes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: TGACTGTGAA GGTTGGAGAT GA 22

Lisboa,

Claims (18)

1. ΕΡ 1 009 413 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um oligonucleótido imunoestimulante (ISS-ODN) na preparação de um medicamento para o tratamento de asma num mamífero, sem co-fornecimento de um antigénio imunizante, em que o mamífero é sensibilizado a um antigénio estimulante de asma e em que o ISS-ODN compreende a sequência 5'-citosina-guanina-3', em que o ISS-ODN é administrado ao tecido respiratório, intranasalmente, por inalação ou por insuflação.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 em que o referido ISS-ODN é fornecido por meio de um dispositivo nebulizador que fornece o referido ISS-ODN à mucosa nasal, à traqueia ou aos bronquíolos; ou intranasalmente ao tecido pulmonar.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ISS-ODN inclui uma sequência de nucleótidos hexamérica consistindo em 5'-purina-purina-C-G-pirimidina-pirimidina-3'.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a sequência de nucleótidos hexamérica consiste em AACGTT.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a sequência de nucleótidos hexamérica é seleccionada do grupo constituído por AACGCC, AACGTC, AGCGCC, AGCGCT, AGCGTC, GACGCC, GACGCT, GACGTC, GACGTT, GGCGCC, GGCGCT, GGCGTC e GGCGTT.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ISS-ODN tem pelo menos seis nucleótidos de comprimento.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ISS-ODN compreende a SEQ ID NO:19.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ISS-ODN está presente num vector de expressão recombinante contendo ISS. ΕΡ 1 009 413 /PT 2/2
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ISS-ODN tem entre 6 e 200 nucleótidos de comprimento.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o mamífero é um ser humano.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o ISS-ODN está ligado a um péptido, em que o referido péptido não é o antigénio para o qual o mamífero está sensibilizado e em que o péptido é seleccionado de entre uma porção para direccionamento a um alvo e uma citóquina.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o péptido é uma porção para direccionamento a um alvo.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o péptido é uma citóquina.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em que o ISS-ODN está ligado a um anticorpo.
15. 15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, compreendendo ainda administrar um agente imunoterapêutico. acordo com qualquer uma das compreendendo ainda administrar um
16. 16. Utilização de reivindicações 1 a 14, agente anti-inflamatório
17. 17. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que a acumulação de eosinófilos no tecido pulmonar está reduzida.
18. 18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a inflamação estimulada pelo antigénio estimulante de asma está reduzida. Lisboa, EP 1 009 413 /PT 1/11 z LL í Proteína Antigénio ff·ff f '

    FIGURA 1 EP 1 009 413 /PT 2/11 Cone. relativa de lgG2a de ratinho (U/ml) 2000000- 1500000- 1000000- 500000- Ratinho lgG2a Anti-O-gal

    D 2a semana 0 4a semana 6a semana 12a semana

    β-gal 1018 co-inj. 1019 co-inj. 1018' 1019’ FIGURA 2 EP 1 009 413 /PT 3/11 Cone. relativa de IgG de ratinho (U/ml) 5000000 Ratinho IgG Anti-G-gal □ 2a semana □ 4a semana M 6a semana 4000000- 3000000- 2000000- 1000000-

    1018 co-inj. 1019 co-inj. 1018* B 12a semana T

    1019* FIGURA 3a EP 1 009 413 /PT 4/11 Cone. relativa de lgG1 de ratinho (U/ml) 1500000 Ratinho lgG1 Anti-B-gal D 2a semana 0 4a semana 1000000- 500000- 0

    i FIGURA 3b 1019’ ΕΡ 1 009 413 /PT 5/11 Resposta de IgE anti-lacZ após reforço 4CC0 □ pCWV L3C-Z (Tyna) S çalacícsiiíasa 3 C3NT

    SEMANA FIGURA 4 EP 1 009 413 /PT 6/11 Produção de IL-4 em resposta a anti-CD3 pg/ml

    ! U Dia 1 j 1 Dia 2 ! □ Dia 3 ' FIGURA 5 ΕΡ 1 009 413 /PT 7/11

    <£> < Cd D (D ΕΡ 1 009 413 /PT 8/11 - CM o <0 ffi □ D Q B 0 □ co QO 43 C ro ro ro -t-J </) O Q. (Λ (D ι-Εroo QO 0 "O o iro o» ~O O CM ífc CO

    0 Q 9P sspepjun N- <cr DCD EP 1 009 413 /PT 9/11 pg/ml Produção de IFNg em resposta a anti-CD3 300000 -250000 · 200000 150000 --100000 50000 · 0 -- 1018 1019Pré-tratamento

    FIGURA 8 Ξ Dia 1 I Dia 2 Ξ Dia 3 I EP 1 009 413 /PT 10/11 Produção de IFN-γ específico do Ag IFN-γ médio (pg/ml)

    * os oligonucleótidos foram injectados 72 horas antes de p-gal no mesmo sítio FIGURA 9 ΕΡ 1 009 413 /PT 11/11 Proliferação de células CD4 específicas do Ag 10C00-*

    1013/Q-gal 1019/3-gai 1Q1S' 1019* CPM * os oligonucleótidos foram injectados 72 horas antes da injecção de J3-gal no mesmo sítio FIGURA 10