JP5775673B2 - Ｉｌ−２含有ｈｖｊ−ｅベクター及びそれを含む脳腫瘍治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子を封入したＨＶＪ−Ｅベクターを含む医薬組成物及び脳腫瘍治療剤に関し、より具体的には、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクターを含み、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制する医薬組成物及び脳腫瘍治療剤に関する。

悪性グリオーマは成人における最も一般的な種類の原発性脳腫瘍であり、ヒト癌の最も破壊的な形態のひとつを構成する。手術、放射線治療、及び化学療法を含む集学的治療の進歩にも関わらず、悪性グリオーマの予後は、依然として極度に悪いままである。特に、神経膠芽腫（最も悪性度の高い種類の悪性グリオーマ）を有する患者は、生存期間中央値が１５ヶ月未満である。悪性グリオーマのびまん性浸潤性により、全ての腫瘍細胞を除去することは一般的には不可能であり、したがって生存率は、術後治療が、浸潤している腫瘍細胞（正常脳組織に浸潤する）を除去することができるか否かに依存している。放射線治療や化学療法などの現在の術後治療の効果は、悪性グリオーマの根本的な進行を改変することにおいて限定的である。したがって、別の治療手段が緊急に必要とされており、それは浸潤している腫瘍細胞を標的とすることができなければならない。

別の治療手段の１つとして、腫瘍細胞に対する免疫反応を誘導することが挙げられる。リンパ排出の欠如、血液脳関門（ＢＢＢ）による末梢循環からの隔離、及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原の低い発現等から、脳は免疫学的に特異な組織であると伝統的にみなされてきた。しかし、最近の研究により、中枢神経系（ＣＮＳ）における求心性及び遠心性免疫経路の両方が存在していることが明らかになりつつある。病的状態下では、ＭＨＣ抗原の発現は、ミクログリア細胞、星状膠細胞、内皮細胞、周皮細胞において誘導され得、このことはそれらの細胞がＣＮＳにおいて抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能することを示唆する。免疫細胞を含む脳脊髄液の深頸リンパ節への効率的な排出が存在し、Ｔ細胞は、リンパ節で活性化されると、無傷のＢＢＢを通じて脳へ速やかに移行し、局所のＡＰＣによって提示される標的抗原と遭遇すると再び刺激される。かくして、免疫治療手段を脳腫瘍の治療において使用することが可能となる。しかし、現在までの報告では、レギュラトリーＴ細胞（Ｔｒｅｇ）（エフェクターＴ細胞の活性化及び増殖を強く阻害する）の発生頻度が増加することが報告されており（非特許文献１及び２）、グリオーマに対する有望な免疫治療を開発するためには、腫瘍により引き起こされる免疫抑制を克服すること、及び存在する抗腫瘍免疫反応を促進することが必要である。

本発明者らは以前、不活性化センダイウイルス由来センダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）が、直接的腫瘍内注射の後、腫瘍を有するマウスにおいて、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化などの強い抗腫瘍免疫反応を誘導することを報告した（非特許文献３及び４）。本発明者らはまた、ＨＶＪ−Ｅが成熟樹状細胞（ＤＣ）からのＩＬ−６分泌を通じてＴｒｅｇ媒介免疫抑制を阻害することも報告している（非特許文献３）。ＨＶＪ−Ｅはもともと送達ベクターとして開発され（非特許文献７〜９）、遺伝子、ｓｉＲＮＡ、タンパク質、及び抗癌剤等を包含し得、それらをインビトロ及びインビボの両方で細胞へと送達し得る（非特許文献７、１０、及び１１；特許文献１〜３）。実際、悪性メラノーマの治療においてＨＶＪ−Ｅの実用化のための試験が行われている。

しかしながら、ＨＶＪ−Ｅによって誘導される抗腫瘍免疫反応では、エフェクターＴ細胞の活性化が間接的であり数段階の反応を必要とする（非特許文献４）ため、効果的な免疫反応を促進するためには、ＨＶＪ−Ｅの複数回の注射が必要となる（非特許文献３〜６）。

一方、悪性グリオーマに対する魅力的な手段の一つとして、サイトカイン遺伝子治療が試みられている。局所の免疫反応を促進し得るこの手段は、いくつかの免疫刺激サイトカイン（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＦＮ−β、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、及びインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）の遺伝子導入により為され、しばしば好ましい結果を伴うことが報告されている。しかし、それらの活性はＴｒｅｇによって抑制されるため、それにより腫瘍の進行が可能となる。

国際公開２００５／０９４８７８号公報 国際公開０１／５７２０４号公報 国際公開２００４／０３９４０６号公報

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本発明は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞といったエフェクターＴ細胞の活性化は促進しレギュラトリーＴ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化／増殖は抑制する様な、腫瘍、特に脳腫瘍に対する免疫療法を可能にする医薬組成物及び脳腫瘍治療剤、並びにそのためのベクターを提供することを目的とする。

本発明者らは、前記課題に鑑み、鋭意検討した結果、免疫刺激サイトカインとしてＩＬ−２を採用し、それをＨＶＪ−Ｅベクターを用いて投与した場合に、他のサイトカインを用いた場合よりも、悪性グリオーマに対して特に強い抗腫瘍効果を示すことを見出した。さらにこの効果が、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への著しい侵入の誘導、並びにＴｒｅｇ媒介免疫抑制の阻害に起因することを見出した。以上の知見を得て、本発明者らは本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクター。
［２］［１］に記載のベクターを有効成分として含む医薬組成物。
［３］脳腫瘍治療用である、［２］に記載の医薬組成物。
［４］ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制することを特徴とする、［３］に記載の医薬組成物。
［５］ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクターを含む脳腫瘍治療剤。
［６］ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制することを特徴とする、［５］に記載の治療剤。
［７］脳腫瘍摘出後に投与されることを特徴とする、［５］又は［６］に記載の治療剤。
［８］脳腫瘍内に投与されることを特徴とする、［５］又は［６］に記載の治療剤。
［９］脳腫瘍がグリオーマである、［５］〜［８］のいずれかに記載の治療剤。
［１０］ＩＬ−２がヒトＩＬ−２である、［５］〜［９］のいずれかに記載の治療剤。

本発明の、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクター、該ベクターを含む医薬組成物及び脳腫瘍治療剤は、脳腫瘍に対して強い抗腫瘍効果を示し、さらにＴｒｅｇの活性化を起こすことなくエフェクターＴ細胞の活性化を誘導することができる。したがって、本発明のベクター、医薬組成物及び脳腫瘍治療剤は、ヒトを含む哺乳動物における脳腫瘍の治療に好適に使用することができる。

図１は、皮内腫瘍モデルにおける種々のサイトカイン遺伝子を含むＨＶＪ−Ｅの腫瘍内注射を介した腫瘍増殖阻害を示すグラフである。ｐＶＡＸ−ｍＧＭ−ＣＳＦ含有ＨＶＪ−Ｅ（ＧＭ−ＣＳＦ）、ｐＶＡＸ−ｍＩＦＮ−β含有ＨＶＪ−Ｅ（ＩＦＮβ）、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ（ＩＬ−２）、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−１２含有ＨＶＪ−Ｅ（ＩＬ−１２）、ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ（Ｌｕｃ）又はＰＢＳを、３回（腫瘍移植後５、８、及び１１日）腫瘍内に注射した。皮内ＲＳＶ−Ｍ腫瘍増殖をグラフとして表した。全てのデータを、平均＋ＳＥＭとして示した（各治療群につきｎ＝５）。 図２は、頭蓋内腫瘍におけるＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療の治療効果を示すグラフである。腫瘍移植７日後に、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／Ｌｕｃ）又はＰＢＳを用いて、頭蓋内腫瘍を治療した（図２ａ，ｂ）。同様にして、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶ（ＭＳＣＶ／ｍＩＬ−２）又はＰＢＳを用いて、頭蓋内腫瘍を治療した（図２ｃ）。図２ａは、治療７日後の、各治療群における腫瘍体積を評価した結果を示す。各治療群について平均腫瘍体積＋ＳＥＭ（各治療群につきｎ＝５）を示す。＊Ｐ＜０．０５。図２ｂは、各治療群のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。４０日間にわたり生存率を評価した（各治療群につきｎ＝５）。図２ｃは、カプラン・マイヤー生存曲線を示す。３１日間にわたり生存率を評価した（各治療群につきｎ＝５）。 図３ａは、腫瘍床内への免疫細胞侵入の免疫組織化学解析の結果を示す図である。ＨＶＪ−Ｅを使用したＩＬ−２遺伝子治療後の頭蓋内腫瘍における免疫反応の結果を反映している。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２を含むＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、ｐＶＡＸ−Ｌｕｃを含むＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／Ｌｕｃ）又はＰＢＳを用いて腫瘍内（注射）の治療を施したマウスから、治療７日後に脳を採取し、切片を作製した。連続切片について、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、樹状細胞又はＮＫ細胞を観察した。ＣＤ４＋Ｔ細胞についてはＣＤ４の発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＣＤ８ａの発現を、ＴｒｅｇについてはＦｏｘｐ３の発現を、樹状細胞についてはＣＤ１１ｃの発現を、そしてＮＫ細胞についてはインテグリンα２の発現を免疫組織染色により確認した。 図３ｂは、腫瘍床内への免疫細胞侵入の免疫組織化学解析の結果を示す図である。頭蓋内腫瘍における、ＨＶＪ−Ｅベクター又はレトロウイルスベクターを使用するＩＬ−２遺伝子治療による免疫反応の結果を反映している。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２を含むＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、ｍＩＬ−２を保持するＭＳＣＶベクター（ＭＳＣＶ／ｍＩＬ−２）又はＰＢＳを用いた腫瘍内注射により治療したマウスから、治療７日後に脳を採取し、切片を作製した。連続切片について、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＴｒｅｇを観察した。ＣＤ４＋Ｔ細胞についてはＣＤ４の発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＣＤ８ａの発現を、ＴｒｅｇについてはＦｏｘｐ３の発現を免疫組織染色により確認した。 図４ａは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量された、頭蓋内腫瘍における各免疫細胞に特異的な遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療後の頭蓋内腫瘍における結果を示す。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２を含むＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、ｐＶＡＸ−Ｌｕｃを含むＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／Ｌｕｃ）又はＰＢＳを用いて治療した頭蓋内腫瘍を、治療７日後に採取し、全ＲＮＡを抽出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞についてはＣＤ４のｍＲＮＡ発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＣＤ８ａのｍＲＮＡ発現を、及びＴｒｅｇについてはＦｏｘｐ３のｍＲＮＡ発現を、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。内部標準としてはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を用いた。三連の試料からの平均値＋ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５。 図４ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量された、頭蓋内腫瘍における各免疫細胞に特異的な遺伝子のｍＲＮＡ発現量を示すグラフである。頭蓋内腫瘍における、ＨＶＪ−Ｅベクター又はレトロウイルスベクターを使用するＩＬ−２遺伝子治療による免疫反応の結果を反映している。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２を含むＨＶＪ−Ｅ（ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、ｍＩＬ−２を保持するＭＳＣＶベクター（ＭＳＣＶ／ｍＩＬ−２）又はＰＢＳを用いて治療した頭蓋内腫瘍を、治療７日後に採取し、全ＲＮＡを抽出した。ＣＤ４＋Ｔ細胞についてはＣＤ４のｍＲＮＡ発現を、ＣＤ８＋Ｔ細胞についてはＣＤ８ａのｍＲＮＡ発現を、及びＴｒｅｇについてはＦｏｘｐ３のｍＲＮＡ発現を、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。内部標準としてはＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を用いた。三連の試料からの平均値＋ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５。 図５は、腫瘍除去後の腔内投与による、ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療の延命効果を示す。図５ａにおいては、ｐＶＡＸ−ＥＧＦＰを含むＨＶＪ−Ｅを、腫瘍除去直後に手術腔内へ投与した。上パネル内の囲み部分を拡大して、下パネルに示す。図５ｂは、８日目に、腫瘍除去後にｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２を含むＨＶＪ−Ｅの投与（Ｒｅｍｏｖａｌ＋ＨＶＪ−Ｅ／ｍＩＬ−２）、腫瘍除去後にｐＶＡＸ−Ｌｕｃを含むＨＶＪ−Ｅの投与（Ｒｅｍｏｖａｌ＋ＨＶＪ−Ｅ／Ｌｕｃ）、若しくは腫瘍除去のみにより（Ｒｅｍｏｖａｌ）治療したマウス、又は治療していない（ＰＢＳ）マウスの、カプラン・マイヤー生存曲線を示す。生存率を７０日間にわたり評価した（無治療群についてｎ＝４、他の治療群についてｎ＝５）。

文中で特に断らない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を持つ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及した全ての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して使用され得る刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。

本発明は、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクター（本明細書中、便宜上ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクターとも称する）を提供する。ＨＶＪ−Ｅベクターは、センダイウイルス（Hemagglutinating Virus of Japan、以下ＨＶＪともいう）由来のウイルスエンベロープベクターである。ここでウイルスエンベロープとは、ウイルスからＲＮＡ又はＤＮＡを不活性化したウイルス外被膜であり、ウイルスの複製能が消失されているため、通常は遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド等を封入してトランスフェクション用のベクターとして安全に利用される。本発明におけるウイルスエンベロープは、リポソームの形態であっても、リポソーム以外の形態であってもよいが、好ましくはリポソーム以外の形態である。

ＨＶＪは、マウス肺炎ウイルスの一つである。ＨＶＪとして具体的には、例えばＶＲ−１０５、ＶＲ−９０７等が挙げられるが、ＶＲ−１０５パラインフルエンザ１センダイ／５２、Ｚ株が好ましい。これらのＨＶＪはAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；マナサス、ＶＡ）から購入することができる。またＨＶＪ−Ｅベクターの調製のために使用されるＨＶＪは、野生型ウイルスであっても、組み換え型ウイルスであっても良い。

ウイルスエンベロープベクターについてより詳しくは、例えば特開２００１−２８６２８２号公報（ＷＯ０１／５７２０４号公報）、特開２００２−０６５２７８号公報、ＷＯ０３／０１４３３８号公報等に記載されており、具体的には例えば特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８などに従って調製することができる。

本発明に用いられるウイルスエンベロープとして、不活化ウイルスを用いてもよい。不活化ウイルスは、ウイルスゲノムを不活化処理することにより得ることができる。不活化処理としては、例えばＵＶ処理やアルキル化処理を挙げることができる。このウイルスゲノムの不活化処理により、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡが、ウイルスエンベロープ内で変性または断片化されてその活性を喪失し、ウイルスとしての複製能が失われる。

本発明は、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＨＶＪ−Ｅベクターに封入したベクターに関する。ＩＬ−２（インターロイキン２）は、サイトカインの一種であり、主に活性化されたＴ細胞によって分泌され、ＣＴＬやＮＫ細胞などの免疫細胞の増殖及び活性化に関与するタンパク質である。ＩＬ−２は、エフェクターＴ細胞の顕著な増殖を誘導し、活性化することができることが知られており（Glick RP, Lichtor T, de Zoeten E, Deshmukh P, Cohen EP. Neurosurgery. 1999 Oct;45(4):867-74.、Nakamura K, Ito Y, Kawano Y, Kurozumi K, Kobune M, Tsuda H, et al. Gene Ther. 2004 Jul;11(14):1155-64.、Iwadate Y, Inoue M, Saegusa T, Tokusumi Y, Kinoh H, Hasegawa M, et al. Clin Cancer Res. 2005 May 15;11(10):3821-7.）、抗腫瘍治療への使用に適している。

本発明におけるＩＬ−２は、哺乳動物由来の任意のＩＬ−２であるが、投与される動物種に由来するＩＬ−２が好ましく選択される。ヒトへの臨床応用に鑑みた場合、ヒトのＩＬ−２を用いることが好ましい。ＩＬ−２としては、具体的には、ヒトＩＬ−２（アクセション番号：ＡＡＡ５９１４０．１）、マウスＩＬ−２（アクセション番号：ＡＡＩ１６８７４．１）などが挙げられる。本発明で使用するＩＬ−２は前述のものに限定されず、前記配列を有するＩＬ−２と実質的に同じ作用を有するタンパク質である限り、本明細書中のＩＬ−２に包含される。すなわち、免疫細胞の増殖及び活性化に関する機能を保持する限り、そのアミノ酸配列において、１〜数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１又は２個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するものであってもよい。これらのＩＬ−２は公知の方法によって調製することができる。例えば前述のアミノ酸配列に基づき化学合成によって調製することもできる。あるいは後述のＩＬ−２をコードする遺伝子を用いて組換えＤＮＡ技術によりインビトロで生産することにより取得することもできる。また、商業的に入手可能なものもある。

本発明で使用するＩＬ−２をコードする遺伝子（ＩＬ−２遺伝子とも言う）とは、前記ＩＬ−２をコードするポリヌクレオチドを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれであっても良いが、好ましくはＤＮＡである。ＩＬ−２遺伝子としては、具体的には、ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子（例えばアクセション番号：Ｍ２２００５．１）、マウスＩＬ−２（本明細書においてｍＩＬ−２と言うこともある）をコードする遺伝子（例えばアクセション番号：ＢＣ１１６８７３．１）などが挙げられる。これらの配列情報に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲプライマーとして用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、ＩＬ−２のｃＤＮＡをクローニングすることができる。これらのクローニングは、例えばMolecular Cloning 2nd Edit., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)などの基本書に従い、当業者であれば容易に実施することができる。本発明で使用するＩＬ−２遺伝子は、前述の配列を有するものに限定されず、発現されるタンパク質が、ＩＬ−２と実質的に同じ作用、即ち、免疫細胞の増殖及び活性化に関する機能を保持する限り、本発明においてＩＬ−２遺伝子として使用できる。即ち、１）前記ｃＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、２）前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列において、１〜数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１又は２個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであってもよい。

前記の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、前記の塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd Edit., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ(sodium chloride/sodium citrate)中４５℃でのハイブリダイゼーション反応の後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中６５℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
このような前記１）及び２）のＤＮＡは、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Molecular Cloning等の基本書を参考にして実施することができる。

ＩＬ−２遺伝子は、標的部位にて発現し得る形態でＨＶＪ−Ｅベクターに封入される。この目的のために、ＩＬ−２遺伝子は適切な遺伝子導入ベクターに連結された形でＨＶＪ−Ｅベクターに封入される。導入されたＩＬ−２遺伝子が生体内において発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及びポリＡ付加シグナル、並びに翻訳に必要なリボゾーム結合部位など）と作動可能に連結される。
遺伝子導入に用いられるベクターとしては、連結されたＩＬ−２をコードする遺伝子が発現可能なものであれば任意のものでよく、例えば、プラスミドが挙げられる。該プラスミドは、動物細胞、特に腫瘍細胞内で導入遺伝子が発現可能なものであれば特に限定されないがｐＶＡＸ１（インビトロゲン）、ｐＣＤＮＡ３．１（インビトロゲン）等が好ましく用いられる。外来遺伝子が生体内において発現するための適切な調節配列は、いずれも当分野でよく知られており、様々なものが用いられている。

このようなＩＬ−２又はベクターに連結されたＩＬ−２をコードする遺伝子は、適切な界面活性剤（例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸又はその塩、コール酸又はその塩、オクチルグルコシド、ドデシールマルトシド、など）の存在下で、ＨＶＪ−Ｅとインキュベートすることにより、ＨＶＪ−Ｅに封入することができる。具体的には国際公開ＷＯ０１／５７２０４号公報などに記載の方法を用いて、あるいはそれに準じた方法によって実施することができる。
例えば、ＩＬ−２又はＩＬ−２遺伝子のＨＶＪ−Ｅへの封入は、ＩＬ−２又はＩＬ−２遺伝子を緩衝液に溶解し、界面活性剤の存在下にＨＶＪ−Ｅと混合することによって簡便に行うことができる。ＩＬ−２遺伝子を封入する場合にはＨＶＪ−Ｅとの混合前に硫酸プロタミンで処理しておくことも好ましい。

本発明は、ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクターを有効成分として含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物に含められるＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクターは、前記したものと同様なものが用いられる。ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクター及び該ベクターを含む医薬組成物は、ＩＬ−２の有する免疫刺激活性、免疫細胞の腫瘍内への侵入を促進する作用等の種々の生理活性に加え、ＨＶＪ−Ｅベクターが有する抗腫瘍活性、Ｔｒｅｇの腫瘍内への侵入を抑制する作用を併せ持つことから、抗腫瘍免疫において優れた効果を発揮することができる。従って、該医薬組成物には、ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクター以外に、抗腫瘍免疫に有利な他の成分が添加され得る。抗腫瘍免疫に有利な他の成分としては、抗腫瘍作用を有する活性成分、製剤化に必要な／あるいは望ましい非活性成分が挙げられる。

活性成分としては、化学療法剤や免疫促進剤等が挙げられる。化学療法剤は、抗腫瘍作用を有する限り特に限定されず、具体的には例えば、ブレオマイシン類、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン（ダウノルビシン）、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ミトキサントロン等のアントラキノン（アントラサイクリン）系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、イリノテカン等のカンプトテシン類、シスプラチン類、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びその誘導体、ビラルビシン、ダカルバジン及びそれらの薬理学的に許容される塩などが挙げられる。免疫促進剤は、免疫作用を高める作用を有する限り特に限定されず、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むタンパク質などが挙げられる。

非活性成分としては、製剤上の必要に応じて添加される成分であり、適宜の薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などが挙げられる。賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが、結合剤としては、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、トレハロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが、滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが、溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが、崩壊剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが、溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが、懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが、等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが、安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のアミノ酸類などが、無痛化剤としては、ブドウ糖、グルコン酸カルシウム、塩酸プロカインなどが、防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが、抗酸化剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸などが、矯味矯臭剤としては、医薬分野において通常に使用される甘味料、香料などが、着色剤としては、医薬分野において通常に使用される着色料が挙げられる。

本発明の医薬組成物の投与形態・剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、軟膏、スプレー剤などが挙げられる。好ましくは非経口投与、さらに好ましくは注射剤である。

ヒト以外の動物としては、家畜、家禽類のほか、実験動物が含まれる。前記医薬組成物の投与量は、対象患者の年齢・体重・病態、投与方法、投与部位、対象疾患などによっても異なるが、成人当たりの１日量として、ＩＬ−２を封入した場合であれば、１腫瘍箇所当たり、ＩＬ-２を常法で封入したＨＶＪ-Ｅを、1×１０^６以上、好ましくは１×１０^７〜１０^１１粒子、例えば１〜１０×１０^９粒子を投与すればよく、単回投与でもよく、また複数回投与してもよい。またＨＶＪ−Ｅとして通常は、４０〜４００，０００ＨＡＵを、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵを、さらに好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵを投与する。

一態様において、本発明の医薬組成物は脳腫瘍治療用である。本発明において脳腫瘍とは、頭蓋内組織に発生する腫瘍を意味し、例えば、グリオーマ及び髄芽腫などの神経上皮由来腫瘍、髄膜腫、神経鞘腫、先天性腫瘍、その他の腫瘍などが挙げられる。本発明の組成物は、これらの腫瘍を治療するために使用され、腫瘍の増殖を抑制し得、又は腫瘍の大きさを縮小させ得る。
本明細書中、「治療」とは、対象とする脳腫瘍に対して、その腫瘍の進行を遅らせるか、またはその腫瘍組織を縮小もしくは消失させることをいう。すなわち、腫瘍細胞を完全にまたは一部を殺傷することのほか、腫瘍細胞の増殖を完全にまたは部分的に抑制または遅らせることも包含する。

一態様において、本発明の医薬組成物は、エフェクターＴ細胞であるＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制することを特徴とする。

抗腫瘍免疫において、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とも言う）及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞とも言う）が非常に重要な役割を果たしていることが知られている。また、抗腫瘍免疫においては、レギュラトリーＴ細胞の割合が上昇すると、続いて起こる抗腫瘍免疫作用が抑制されることが報告されている(Casares N.et al.,J Immunol.2003 Dec 1;171(11):5931-9.、Takahashi T. et al.,Int Immunol.1998 Dec;10(12):1969-80.)。ＨＶＪ−Ｅは、後述の実施例において示すように、レギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制する効果を有する。このようなＨＶＪ−Ｅの効果は、前記のような効果を有するＩＬ−２の存在下でも影響を受けず、むしろＨＶＪ−ＥとＩＬ−２の使用を組み合わせることで、相乗効果が得られる。そのため本発明の医薬組成物は抗腫瘍免疫において非常に有用である。

さらに本発明は、ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクターを含む脳腫瘍治療剤を提供する。脳腫瘍治療剤とは、脳腫瘍の治療において用いられる剤である。該脳腫瘍治療剤に含められるＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクターは、前記したものと同様なものが用いられる。ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクターを含む脳腫瘍治療剤は、ＩＬ−２の有する免疫刺激活性、免疫細胞の腫瘍内への侵入を促進する作用等の種々の生理活性に加え、ＨＶＪ−Ｅベクターが有する抗腫瘍活性、Ｔｒｅｇの腫瘍内への侵入を抑制する作用を併せ持つことから、抗腫瘍免疫において優れた効果を発揮することができ、後述の実施例にて示されるように、脳腫瘍に対して優れた抗腫瘍免疫活性を有する。ここで脳腫瘍とは、頭蓋内組織に発生する腫瘍を意味し、例えば、グリオーマ及び髄芽腫などの神経上皮由来腫瘍、髄膜腫、神経鞘腫、先天性腫瘍、その他の腫瘍などが挙げられる。本発明の脳腫瘍治療剤は、このような種々の脳腫瘍を標的とし得るが、好ましい標的はグリオーマである。
本発明の脳腫瘍治療剤には、ＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅベクター以外に、脳腫瘍の治療に有利な他の成分が含まれていても、あるいは製剤化に必要な／あるいは望ましい非活性成分が含まれていてもよい。活性成分及び非活性成分としては、前記本発明の医薬組成物に含められるものと同様なものが用いられる。

本発明の脳腫瘍治療剤の投与に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、溶解補助剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
抗酸化剤、等張化剤、懸濁剤、安定化剤、溶解補助剤及び防腐剤としては、前記、本発明の医薬組成物に含められてもよい成分として例示されたものが、それぞれ挙げられる。緩衝液としては、例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）等を適宜選択し使用できるが、ｐＨが６〜９の緩衝液が好ましい。制菌剤としては、オキソリン酸、オルメトプリム、トリメトプリム、サルファ剤、ホスホマイシン、ペニシリン系抗菌剤、セファロスポリン系抗菌剤、バンコマイシン、テトラサイクリン系抗菌剤、リファンピシン、フルオロキノン系抗菌剤などが挙げられ、増粘剤としてはアラビアゴム、リピオドール、ポリアクリル酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。

本発明の脳腫瘍治療剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容可能な担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。

本発明の脳腫瘍治療剤の投与量及び投与回数は、前記、本発明の医薬組成物、特に脳腫瘍治療用の医薬組成物と同様であり、治療対象の年齢・体重・病態、投与方法などによっても異なるが、例えば、通常、１腫瘍箇所当たり、ＩＬ−２を常法で封入したＨＶＪ−Ｅを、1×１０^６以上、好ましくは１×１０^７〜１０^１１粒子、例えば１〜１０×１０^９粒子を投与すればよく、単回投与でもよく、また複数回投与してもよい。

また本発明の一態様において、本脳腫瘍治療剤は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制することを特徴とするが、これに関しては前記の本発明の医薬組成物に関する説明を適用することができる。

一態様において、本発明の脳腫瘍治療剤は、脳腫瘍摘出後に投与されることを特徴とする。手術による腫瘍の摘出は、腫瘍の治療における一般的な手段である。脳腫瘍を含む全ての臓器腫瘍に対して手術が可能であるが、脳腫瘍においては、腫瘍の発生部位によっては、麻痺などの後遺症が生じる恐れから手術することができない場合や、腫瘍と正常組織の境界が不明瞭なため、全摘出が困難である場合もあり得る。本発明の脳腫瘍治療剤は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進することから、腫瘍摘出後の投与により、残存する腫瘍を治療することができる。

投与方法としては、適切な緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など）に懸濁した本発明の脳腫瘍治療剤を、手術腔へ注射により投与する方法、手術腔に挿入したオンマヤ槽（脳室カテーテルに連結して、髄液を一時的に貯留させるドーム型をしたシリコン製の貯留槽）を通じて投与する方法などが挙げられる。オンマヤ槽の使用は、該治療剤の複数回投与を可能にするため好ましい。

別の態様において、本発明の脳腫瘍治療剤は、脳腫瘍内に投与されることを特徴とする。これは前記のような腫瘍摘出手術を行なうことのできない状況下において特に有効である。この場合、該治療剤は、注射によって腫瘍内に投与され得るが、これに限定されない。

以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。

（細胞株及びマウス）
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス由来のＳｃｈｍｉｔｔ−Ｒｕｐｐｉｎラウス肉腫ウイルス誘導悪性星状細胞腫細胞株、ＲＳＶ−Ｍ細胞は、文献（Kumanishi, T., Ikuta, F., and Yamamoto, T. Brain tumors induced by Rous sarcoma virus, Schmidt-Ruppin strain III. Morphology of brain tumors induced in adult mice. J Natl Cancer Inst. 1973 Jan;50(1):95-109.)に記載のとおり作製し維持した。レトロウイルスを作製するために使用したＧ３Ｔ−ｈｉヒト胎児腎臓由来細胞株はタカラバイオ株式会社（滋賀、日本）から購入した。これらの細胞株は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Biowest、ニュアイエ、フランス）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液）（ナカライテスク株式会社）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ナカライテスク株式会社）中で維持した。細胞は、９５％空気及び５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、３７℃にてインキュベートした。５〜６週齢のメスＣ３Ｈ／ＨｅＮＪｃｌマウスは日本クレア株式会社（東京、日本）から購入し、温度制御された無菌室内で維持した。全ての動物は、承認されたプロトコール及び大阪大学の動物委員会の指針に従って扱った。

（統計学的解析）
生存期間については、カプラン・マイヤー法を用いて統計学的解析を行った。生存分布に関する有意差はログランク検定により評価した。他の実験については、統計学的解析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、及びそれに続いてＴｕｋｅｙのｐｏｓｔ ｈｏｃテストを行うことにより行った。Ｐ＜０．０５を統計的に有意なものと考えた。

実施例１
本実施例に、ＩＬ−２遺伝子等を封入したＨＶＪ−Ｅの調製について説明する。
ＨＶＪ−Ｅに封入するプラスミドＤＮＡは、以下のように構築した。
ｐＶＡＸ−ｍＧＭ−ＣＳＦは、ｐＯＲＦ−ｍＧＭＣＳＦ ｖ．２１（InvivoGen、サンディエゴ、ＣＡ）からのｍＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を、ｐＶＡＸ１（３．０ｋｂ）（Invitrogen、カールスバッド、ＣＡ）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐＶＡＸ−ｍＩＦＮ−βは、ｐＯＲＦ−ｍＩＦＮｂ ｖ．１１（InvivoGen）からのｍＩＦＮ−β遺伝子を、ｐＶＡＸ１のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２は、ｐＯＲＦ−ｍＩＬ−２（InvivoGen）からのｍＩＬ−２遺伝子を、ｐＶＡＸ１のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−１２は、生物学的に活性な一本鎖マウスＩＬ−１２（ｓｃｍＩＬ−１２）遺伝子（最初の２２アミノ酸を欠失させたｐ３５サブユニットに、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３リンカーを介して結合させたｐ４０サブユニットを含む）（Nat Biotechnol. 1997 Jan;15(1):35-40）を、ｐＶＡＸ１のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐＶＡＸ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＧＬ３（ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ）は、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Promega、マディソン、ＷＩ）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片をｐＶＡＸ１へと挿入することにより作製した。ｐＶＡＸ−Ｌｕｃは、実験中、陰性対照ベクターとして使用した。ｐＶＡＸ−ＥＧＦＰは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech、パロアルト、ＣＡ）からのＥＧＦＰ遺伝子を、ｐＶＡＸ１のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位にクローニングすることにより構築した。

上記プラスミドＤＮＡを以下の方法により、ＨＶＪ−Ｅに封入した。
ＨＶＪ（ＶＲ−１０５パラインフルエンザ１センダイ／５２、Ｚ株）は、Mol Ther. 2002 Aug;6(2):219-26に記載した通り、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；マナサス、ＶＡ）から購入し、生後１０から１４日の鶏卵の漿尿液中で増殖させ、遠心により精製し、ＵＶ照射（９９ｍＪ／ｃｍ^２）により不活性化した。不活性化ウイルスは複製することはできないが、ウイルス融合能は保持している。一定分量の不活性化ＨＶＪ（３×１０^１０粒子）を４℃にて１５分間遠心（１８，５００×ｇ）し、その後ウイルスのペレットを１５μｌ硫酸プロタミン（１ｍｇ／ｍｌ）中に懸濁し、氷上で１５分間インキュベートした。次いで、ウイルス懸濁液を、３％ツイーン８０（終濃度０．２％）と共に、上記プラスミドＤＮＡ（２００μｇ）と混合した。混合物を４℃にて５分間遠心（１８，５００×ｇ）した。界面活性剤及び封入されなかったＤＮＡを除去するために、ペレットを１ｍｌ平衡塩類溶液（ＢＳＳ；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び５．４ｍＭ ＫＣｌ）で洗浄した後、ｐＤＮＡ含有ＨＶＪ−Ｅベクターを４０μｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁した。

なお、実施例３及び４において対照として使用したレトロウイルスベクターは、以下のように調製した。
ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（Clontech、パロアルト、ＣＡ）をゲートウェイベクター、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ−ＨｐａＩ−Ｇａｔｅｗａｙへ変換した。ｍＩＬ−２の完全なオープンリーディングフレームをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）へとサブクローニングした。次いで、エントリークローンを、ＬＲクローナーゼを用いて、デスティネーションベクター、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ−ＨｐａＩ−Ｇａｔｅｗａｙと組換えさせた。その結果得られたプラスミドをｐＭＳＣＶｐｕｒｏ−ｍＩＬ２と呼ぶ。ｍＩＬ−２含有レトロウイルスを作製するために、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞を、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Roche、インディアナポリス、ＩＮ）を使用して、ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ−ｍＩＬ−２、ｐＧＰ、及びｐＥ−ａｍｐｈｏ（タカラバイオ株式会社）でコトランスフェクションした。トランスフェクトした細胞を２４時間培養した後、トランスフェクション培地を１０％ＦＢＳを含む新鮮ＤＭＥＭで置換した。２４時間後、パッケージされたレトロウイルス粒子を含む馴化培養液を集め、０．４５μｍフィルターに通した。

実施例２
本実施例に、ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療が、皮内腫瘍モデルにおいて、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−β、又はＩＬ−１２を使用する場合よりも強く腫瘍増殖を阻害することを説明する。

最初に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２の中から、ＨＶＪ−Ｅを使用する免疫遺伝子治療に最も適したサイトカインを決定するために、皮内腫瘍モデルにおいて、ＨＶＪ−Ｅにより導入されるこれらのサイトカインの抗腫瘍効果を直接比較した。
５〜６週齢のメスＣ３Ｈ／ＨｅＮＪｃｌマウスをイソフルランの吸入により麻酔した。生存可能な５×１０^６ＲＳＶ−Ｍ細胞を１００μｌ ＰＢＳに再懸濁し、マウスの背中の皮内空間へと注射した。腫瘍が直径およそ６〜８ｍｍまで増殖したとき（移植５日後）、マウスを無作為に６治療群へと分け、治療効果を調べた。腫瘍移植５、８、及び１１日後に、１００μｌ（６×１０^９粒子）のｐＶＡＸ−ｍＧＭ−ＣＳＦ含有ＨＶＪ−Ｅ、ｐＶＡＸ−ｍＩＦＮ−β含有ＨＶＪ−Ｅ、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−１２含有ＨＶＪ−Ｅ、若しくは陰性対照ベクターとしてｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ、又は１００μｌのＰＢＳを腫瘍内へ注射した。腫瘍サイズを週２回、ノギスを用いて測定し、腫瘍体積を以下の式に従って計算した：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長さ×（幅）^２／２。

それらの群の中で、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いた治療において最も劇的な腫瘍増殖阻害が見られた（図１）。さらに、完全な反応を示すマウスの割合を比較した場合、ＨＶＪ−Ｅに封入された治療遺伝子に依存して顕著な差異が現れた。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いた治療後には７０％の腫瘍が消失し、一方ＰＢＳ又はｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅを用いた治療後には腫瘍の消失は見られず、ｐＶＡＸ−ｍＩＦＮ−β含有ＨＶＪ−Ｅ、ｐＶＡＸ−ｍＧＭ−ＣＳＦ含有ＨＶＪ−Ｅ、及びｐＶＡＸ−ｍＩＬ−１２含有ＨＶＪ−Ｅを用いた治療後には、それぞれ２０％、３０％、及び４０％の腫瘍が消失したのみであった。ＨＶＪ−Ｅを使用する免疫遺伝子治療のためのＩＬ−２が有用であることが示された。

実施例３
本実施例に、ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療が、頭蓋内グリオーマ異種移植片に対して抗腫瘍効果を示すことを説明する。
ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療が脳内のグリオーマに対して抗腫瘍活性を示すか否かを、頭蓋内ＲＳＶ−Ｍ腫瘍モデルを用いて調べた。
５〜６週齢のメスＣ３Ｈ／ＨｅＮＪｃｌマウスをペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、マウス用定位固定装置（ＳＲ−５Ｍ、ナリシゲ、東京、日本）に設置した。頭皮切開後、正中線の３ｍｍ横、ブレグマの４ｍｍ後ろに穿頭孔を開けた。次いで４μｌ ＰＢＳ中の５×１０^５個のＲＳＶ−Ｍ細胞を、２６ゲージ針を装着した無菌ハミルトンシリンジを使用して皮質表面の下、２ｍｍの深さに３分間かけて定位的に注射した。針はさらに２分間その場所に残し、その後ゆっくりと引き抜いた。腫瘍を移植したマウスを、無作為に３治療群（各５マウス）に分け、治療効果を調べた。移植７日後、４μｌ（３×１０^９粒子）のｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ、４μｌのｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ、又は４μｌのＰＢＳの注射によりマウスを治療した。これらは、定位固定枠上の同じ座標を使用して腫瘍部位へと注射した。いずれのマウスについても体重減少などの、毒性の兆候は見られなかった。治療から７日後、マウスを安楽死させ、４%パラホルムアルデヒドを用いて経心的に潅流した。脳組織を一晩、後固定し、Tissue-Tek OCT Compound（サクラファインテック、東京、日本）中に包埋し、ドライアイス中で凍結し、次いでクライオスタット（ライカマイクロシステムズ ＡＧ、ヴェッツラー、ドイツ)を用いて１０μｍの冠状切片に薄切した。切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、次いでおよその腫瘍体積を、次の式に従って計算した：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径×（短径）^２／２。長径及び短径は、各腫瘍の最大面積を示す冠状切片において測定した。

３治療群の間の腫瘍体積の差異を図２ａに示す。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療したマウスにおいては腫瘍増殖は大幅に抑制されたのに対し、他の治療群においては比較的大きな腫瘍が観察された（Ｐ＜０．０５）。
また、同様に治療したマウスの生存率を、腫瘍移植後４０日間記録した。３治療群のカプラン・マイヤー生存曲線を図２ｂに示す。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療したマウスの生存期間は、他の治療群と比較して有意に延長された（Ｐ＜０．０５）。

さらに、同様の方法により、ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療の効果を、ＨＶＪ−Ｅを使用しないＩＬ−２遺伝子治療の効果と比較した。腫瘍細胞を移植して７日後、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクター、又はＰＢＳを腫瘍部位内に注射し、その後、３１日間にわたって生存率を記録した。３治療群のカプラン・マイヤー生存曲線を図２ｃに示す。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療したマウスの生存期間は、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクターと比較しても有意に延長された（Ｐ＜０．０５）。

実施例４
本実施例に、ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療が、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を増加させる一方、レギュラトリーＴ細胞の増殖を抑制することを説明する。

ＨＶＪ−Ｅを使用するＩＬ−２遺伝子治療の抗腫瘍活性の潜在的機序を理解するために、頭蓋内ＲＳＶ−Ｍ腫瘍モデルにおいて、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ、ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ、又はＰＢＳを用いて実施例３と同様に治療を行い、治療の７日後に免疫組織化学的染色を実施した。各治療群中の１マウスを治療の７日後に安楽死させた。連続冠状切片を実施例３のように得、切片を３０分間、８０%メタノール中０．３％Ｈ_２Ｏ_２中でクエンチした。次いで切片をVectastain Elite ABC kit（Vector Laboratories、バーリンゲーム、ＣＡ)を使用して処理した後、３，３’−ジアミノベンジジン（ペルオキシダーゼ用ＤＡＢ基質キット；Vector Laboratories）により処理した。続いて切片を、ブラウンジアミノベンジジン反応を有するVectastain Elite ABC kitを使用して、ＣＤ４（ラット抗マウスＣＤ４、１：２５；BD Pharmingen、サンディエゴ、ＣＡ）、ＣＤ８ａ（ラット抗マウスＣＤ８ａ、１：２５；BD Pharmingen）、ＴｒｅｇマーカーＦｏｘｐ３（ラット抗マウスＦｏｘｐ３、１：２５；Biolegend、サンディエゴ、ＣＡ）、樹状細胞（ＤＣ）マーカーＣＤ１１ｃ（マウス抗マウスＣＤ１１ｃ、１：２５；Abcam、ケンブリッジ、ＵＫ）、又はＮＫ細胞マーカーインテグリンα２（マウス抗マウスインテグリンα２、１：２５；Santa Cruz Biotechnology、サンタクルーズ、ＣＡ）に対する一次抗体中でインキュベートした。

染色結果を図３ａに示す。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍由来の切片においては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の顕著な侵入が見られたのに対して、ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ又はＰＢＳを用いて治療した腫瘍においてはわずかな侵入がみられたのみだった。ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍では、ＰＢＳを用いて治療した腫瘍と比較して、Ｔｒｅｇの侵入は減少した。一方、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍におけるＴｒｅｇの侵入は、ＰＢＳを用いて治療した腫瘍よりもわずかに増加した。ＤＣの侵入については、３治療群の中で明らかな差異は見られなかった。ＮＫ細胞の侵入は、ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した場合、大幅に増加した。

さらに、免疫細胞の侵入を定量的に評価するために、治療の７日後、３治療群からの腫瘍における免疫細胞のｍＲＮＡ発現を測定した。全ＲＮＡは、摘出した頭蓋内腫瘍から、RNeasy Mini Kit（キアゲン、東京、日本）を使用して製造者の使用説明書に従って抽出した。５μｇの全ＲＮＡを、SuperScriptIII First-Strand synthesis system for qRT-PCR（Invitrogen）を使用して逆転写した。ＣＤ４、ＣＤ８ａ、インテグリンαＸ（ＣＤ１１ｃ）、インテグリンα２、Ｆｏｘｐ３、及びＧＡＰＤＨ遺伝子（内部標準）に特異的なプローブ及びプライマー対は、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティー、ＣＡ）から購入した。リアルタイムＰＣＲを実施し、生成物を、ＳＤＳ２．２ソフトウェアを使用するABI PRISM 7900HT Sequence Detection System（アプライドバイオシステムズ）により分析した。トランス遺伝子の発現をＧＡＰＤＨに対して標準化した。

定量結果を図４ａに示す。ＣＤ４及びＣＤ８の発現は、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍において、他の治療群と比較して有意に増加した（Ｐ＜０．０５）。ｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍において、Ｆｏｘｐ３発現は減少する傾向が見られたが、この差異は統計的に有意ではなかった。同様に、ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍のインテグリンα２発現が増加する傾向についても、差異は統計的に有意ではなかった。

このように、ＩＬ−２遺伝子の導入により、エフェクターＴ細胞の顕著な増殖が誘導された。しかし現在では、ＩＬ−２は、エフェクターＴ細胞を増殖及び活性化させる機能の他に、Ｔｒｅｇを増加させ維持する機能を有することが理解されている（Malek TR, Bayer AL. Nat Rev Immunol. 2004 Sep;4(9):665-74、Furtado GC, Curotto de Lafaille MA, Kutchukhidze N, Lafaille JJ. J Exp Med. 2002 Sep 16;196(6):851-7.）。ＩＬ−２遺伝子治療用ベクターとして使用する場合に、ＨＶＪ−ＥがエフェクターＴ細胞のＴｒｅｇ媒介免疫抑制を阻害し得るか否かを評価するために、免疫細胞の腫瘍内への侵入について、レトロウイルスベクターを使用するＩＬ−２遺伝子治療との比較を行なった。頭蓋内ＲＳＶ−Ｍ腫瘍モデルにおいて、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクター、又はＰＢＳを用いて実施例３と同様に治療を行い、治療の７日後に、３治療群からの脳切片について、腫瘍に侵入している免疫細胞の免疫組織化学的染色を実施した。

染色結果を図３ｂに示す。ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクターを用いて治療した腫瘍由来の切片においてＴｒｅｇの著しい侵入が見られたが、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍における侵入はより少なかった。さらに、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクターを用いて治療した腫瘍においてＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の深い侵入が検出されたが、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍においてはさらにより顕著な侵入が見られた。

治療７日後の、３治療群からの腫瘍における免疫細胞のｍＲＮＡ発現も測定した（図４ｂ）。ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍におけるＦｏｘｐ３発現は、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクターを用いて治療した腫瘍と比較して有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。また、ＣＤ４及びＣＤ８の発現は、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅを用いて治療した腫瘍において、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクターを用いて治療した腫瘍と比較して有意に増加したが（Ｐ＜０．０５）、ｍＩＬ−２含有ＭＳＣＶベクターを用いて治療した腫瘍のＣＤ４及びＣＤ８の発現は、ＰＢＳを用いて治療した腫瘍よりも増加した（Ｐ＜０．０５）。したがって、ＩＬ−２遺伝子治療に使用するＨＶＪ−ＥベクターはＴｒｅｇ増加を阻害し、その結果エフェクターＴ細胞の増殖を促進することが明らかとなった。

実施例５
本実施例に、腫瘍摘出後の腔内へのｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅの投与が、残存腫瘍に対して抗腫瘍効果を示すことを説明する。
実際の臨床治療を再現した状況において、ＨＶＪ−Ｅベクターを使用するＩＬ−２遺伝子治療の抗腫瘍効果を評価するために、マウスにおけるグリオーマの腫瘍摘出モデルを開発した。
まず、皮質表面の近くに移植した腫瘍塊を摘出するのに適した時期を決定するために、周囲の正常脳組織への腫瘍細胞浸潤の程度を経時的に評価した。腫瘍を移植したマウスからの脳切片を、移植４、６、及び８日後に調べた場合、８日後には腫瘍塊の周囲において正常脳組織へと浸潤している腫瘍細胞が見られたが、４及び６日後には腫瘍は比較的明確な境界を持って存在しており、周囲の正常脳組織へと浸潤している腫瘍細胞も見られなかった。したがって、腫瘍細胞植え付けの８日後に腫瘍摘出を実施することを決定し、以下のように腫瘍の移植、摘出、及び治療を行った。

５〜６週齢のメスＣ３Ｈ／ＨｅＮＪｃｌマウスをペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔し、マウス用定位固定装置（ＳＲ−５Ｍ、ナリシゲ）に設置した。頭皮切開後、ハンドドリルを使用して、頭骨頭頂部において開頭術を施した。次いで２μｌ ＰＢＳ中の２×１０^５個のＲＳＶ−Ｍ細胞を、２６ゲージ針を装着した無菌ハミルトンシリンジを使用して、３分間かけて皮質表面近くに注射した。針はさらに２分間その場所に残し、その後ゆっくりと引き抜いた。腫瘍を植え付けたマウスを、無作為に４治療群に分け、治療効果を調べた。植え付けの８日後、無治療群以外について、顕微鏡下手術により腫瘍塊を肉眼的に完全に摘出した。摘出は、手術腔の外周全てについて正常脳組織が見えるまで続行した。摘出後、４μｌ（３×１０^９粒子）のｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅ、４μｌのｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅ、又は４μｌのＰＢＳを、手術腔内へと投与した。

この治療方法によるＨＶＪ−Ｅの腔内投与によって、残存する浸潤腫瘍細胞へと遺伝子が送達され得ることを確認するために、ｐＶＡＸ−ＥＧＦＰ含有ＨＶＪ−Ｅを、腫瘍摘出直後に手術腔へと投与した。投与の２４時間後に、マウスを安楽死させ、実施例３と同様に冠状切片を得た。切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、次いでNikon Eclipse TE300倒立顕微鏡（Nikon Instruments；メルビル、NY）を使用して、光学像及び蛍光像を記録した。図５ａに示すように、残存する腫瘍細胞におけるＧＦＰの発現が検出され、腔内投与によるトランスフェクションの実現可能性を確認した。

次いで、腫瘍摘出後のｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅの投与、摘出後のｐＶＡＸ−Ｌｕｃ含有ＨＶＪ−Ｅの投与、若しくは腫瘍摘出のみにより治療したマウス、又は治療しないマウスの生存率を、移植後７０日間にわたり測定した。４治療群のカプラン・マイヤー生存曲線を図５ｂに示す。摘出後のｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２含有ＨＶＪ−Ｅの投与により治療したマウスの生存期間は、他の治療群と比較して有意に延長された（Ｐ＜０．０５）。

本発明の、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクターは、本発明の医薬組成物及び脳腫瘍治療剤の調製に使用することができる。該医薬組成物及び該脳腫瘍治療剤は、脳腫瘍に対して強い抗腫瘍効果を示すことから、ヒトを含む哺乳動物の種々の脳腫瘍の治療において新たな治療手段となり得る。

Claims (9)

1. 脳腫瘍治療用である、ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクターを有効成分として含む医薬組成物。
2. ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制することを特徴とする、請求項１記載の医薬組成物。
3. ＩＬ−２又はＩＬ−２をコードする遺伝子をＩＬ−２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクターを含む脳腫瘍治療剤。
4. ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の腫瘍内への侵入を促進し、且つレギュラトリーＴ細胞の腫瘍内への侵入を抑制することを特徴とする、請求項３記載の治療剤。
5. 脳腫瘍摘出後に投与されることを特徴とする、請求項３又は４記載の治療剤。
6. 脳腫瘍内に投与されることを特徴とする、請求項３又は４に記載の治療剤。
7. 脳腫瘍がグリオーマである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
8. ＩＬ−２がヒトＩＬ−２である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の治療剤。
9. 脳腫瘍治療用である、ＩＬ−１２をコードする遺伝子をＩＬ−１２を発現し得る形態で封入したＨＶＪ−Ｅベクターを有効成分として含む医薬組成物。