CN111629751A

CN111629751A - 广泛保护性灭活流感病毒疫苗

Info

Publication number: CN111629751A
Application number: CN201980009484.7A
Authority: CN
Inventors: J·K·陶本伯格; L·M·施瓦茨曼
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-09-04
Also published as: US20210093711A1; US11369675B2; WO2019143955A1; EP3743107A1

Abstract

描述了包含多种灭活的甲型流感病毒的通用型流感病毒疫苗组合物。该组合物包含4种或更多种不同的甲型流感病毒，每种病毒具有不同的血凝素(HA)亚型。该疫苗组合物例如可用于引发对流感病毒的免疫反应，以使受试者对季节性流感病毒免疫，和/或通过作为大流行前疫苗来减轻未来的大流行。

Description

广泛保护性灭活流感病毒疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年1月22日提交的美国临时申请第62/620,051号的权益，该申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及包含灭活的低致病性流感病毒株的混合物的组合物，以及它们引发针对季节性流感的广泛反应性免疫反应和抑制人畜共患性(zoonotic)流感大流行的用途。

背景技术

流感病毒是正粘病毒家族(Orthomyxoviridae family)的成员。有三种类型的流感病毒，分别称为甲型、乙型和丙型流感。甲型流感病毒不仅感染人，还感染许多禽类和哺乳动物，并按其表面蛋白、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的亚型分类。甲型流感病毒颗粒包含分段的负义RNA基因组，其编码以下蛋白质：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质(M1)、质子离子通道蛋白(M2)、核蛋白(NP)、聚合酶碱性蛋白1(PB1)、PB1-F2、聚合酶碱性蛋白2(PB2)、聚合酶酸性蛋白(PA)、PA-X、非结构蛋白1(NS1)和非结构蛋白2(NS2)。HA、NA、M1和M2蛋白是膜相关蛋白，而NP、PB1、PB2、PA是核衣壳相关蛋白，PB1-F2、NS2和PA-X蛋白是非结构蛋白。HA和NA蛋白是包膜糖蛋白，并且是病毒中和及保护性免疫力的主要免疫显性表位的来源，其中HA负责病毒的附着和病毒颗粒向细胞内的渗透，NA负责病毒的释放。

流感的公共卫生负担很大，在美国每年平均有200,000例以上的住院治疗，并且，在美国每年因季节性流感导致的死亡从3,000例到80,000例不等。在大流行的年份，这些总数会极大地增长。1918年，在有史以来最严重的流感大流行中，美国有675,000人死亡，全球有多达5千万至1亿人死亡。此外，HA和NA亚型(大多数人对其没有任何免疫力)的新型流感可会在动物(例如禽类和猪)中出现并传播给人。可能引起人畜共患性疾病的爆发，从而导致大流行。例如，适应于人的猪H1N1病毒引发了2009年的大流行。禽类-适应病毒株H5N1、H9N2、H7N9、H10N8和H6N1全部引发人感染，通常具有显著的致死率。

自2009年大流行以来，已观察到H5N1、H7N9、H3N2以及最近的H6N1和H10N8的人畜共患性感染，加重了对广泛反应性或通用型疫苗方法的需要，该方法延伸超出针对确定的循环季节性变体的保护，这通过作为大流行前(pre-pandemic)疫苗来帮助预防或减轻未来的大流行。减毒活疫苗是有问题的，因为它们被过度减毒并且具有严格的使用准则。此外，不能使用在季节性病毒株中不存在的表达血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)亚型的活病毒，因为有与野生型病毒重配的风险。因此，需要一种能产生保护性免疫反应而不需要使用减毒活病毒的广泛反应性疫苗。通用型流感疫苗方法面临的主要困难是不同的HA和NA亚型的抗原变异性。通用型疫苗可以作为大流行前疫苗，提供针对人畜共患性流感感染的保护，并提供针对季节性流感病毒株的保护，或两者。

发明内容

本文描述了通用型流感病毒疫苗组合物，其包含低致病性、灭活流感病毒的混合物。该组合物包含4种或更多种不同的甲型流感病毒，每种病毒具有不同的血凝素(HA)亚型，并且每种病毒是一价的(例如，每种病毒仅具有一种HA亚型)。该疫苗组合物例如可用于引发对流感病毒的免疫反应或使受试者对季节性流感病毒免疫。所公开的流感病毒组合物还可用作大流行前疫苗以预防或减轻未来的人畜共患性流感大流行。

提供了组合物，其包含：第一甲型流感病毒，其具有第一亚型的HA；第二甲型流感病毒，其具有第二亚型的HA；第三甲型流感病毒，其具有第三亚型的HA；并且第四甲型流感病毒，其具有第四亚型的HA，其中4种不同的甲型流感病毒是灭活的。在一些实施方式中，该组合物进一步包含第五、第六、第七和/或第八灭活的甲型流感病毒，每种病毒具有不同的HA亚型。在一些实例中，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或第八流感病毒具有选自以下中任一种的HA亚型：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。在一些实例中，病毒是化学灭活的。组合物中的每种病毒仅具有单一HA亚型(例如，是一价的)。

还提供了容器，诸如注射器或小瓶，其包含本文公开的组合物。还提供了包含所公开的容器的试剂盒。

进一步提供了通过施用治疗有效量的所公开的组合物在受试者中引发对流感病毒的免疫反应的方法。还提供了通过施用治疗有效量的所公开的组合物使受试者对流感病毒免疫的方法。在一些实例中，所获得的免疫反应为异源亚型的(heterosubtypic)，即，实现了对施用给受试者的组合物中不存在的流感亚型的免疫保护(例如，施用分别携带H1、H3、H5和H7HA亚型(其可为化学灭活的)的流感病毒的组合物，并且实现了针对流感H2、H4、H6和/或H10)亚型的免疫反应或保护)。

通过以下参考附图进行的详细描述，本公开的前述和其他目的和特征将变得更加显而易见。

附图说明

图1的图显示了用PBS(阴性对照)、四价流感病毒样颗粒(VLP)疫苗或β-丙内酯(BPL)-灭活全病毒四价流感疫苗接种的小鼠的倒数血凝抑制(reciprocalhemagglutination inhibition,HAI)滴度。显示了针对H1N1、H3N8、H5N1和H7N3的滴度。两种疫苗均包括来自H1、H3、H5和H7流感的HA。

图2A是显示了用BPL-灭活的、低致病性禽流感病毒混合物给小鼠疫苗接种的时间表的示意图。小鼠分别鼻内(IN)或肌内(IM)接种了4种不同的BPL-灭活流感病毒的混合物，每种病毒分别表达不同的禽类HA(H1、H3、H5或H7)。小鼠在初次免疫后3周(21天)进行加强免疫，并在6周(50天)用多种不同亚型的流感病毒攻击。

图2B是显示经H6N1、H7N1、H10N1或H10N7流感病毒攻击的疫苗接种小鼠的存活率的一系列图表。所有经IN或IM疫苗接种的小鼠均在每种流感病毒攻击下存活，而空白疫苗接种的(mock-vaccinated)小鼠在攻击后6-8天死亡。

图3包括两个血凝素(HA)亚型的树状图，显示四价疫苗1(含HA亚型H1、H3、H5和H7)和四价疫苗2(含HA亚型H2、H4、H9和H10)的组合物。

图4A-4E是显示空白疫苗接种、用四价(H2/H4/H9/H10)BPL-灭活流感病毒疫苗进行IN疫苗接种或IM疫苗接种并且用异型病毒H1N1(图4A)，H6N1(图4B)，H7N1(图4C)和H15N1(图4D)或同型病毒H10N1(图4E)攻击的小鼠的存活率的一系列图表。

图5A是一对图表，显示了在将用BPL-灭活的四价(H1/H3/H5/H7)流感病毒疫苗进行IN或IM疫苗接种的雪貂用病原株A/Port Chalmers/1971(H3N2)(左)或A/swine/Iowa/1931(H1N1)(右)攻击后五天的鼻滴度。

图5B示出了如图5A中所述进行疫苗接种和攻击的雪貂的肺病理。

具体实施方式

I.缩写

BPL β-丙内酯

HA 血凝素

HAI 血凝抑制

HAU 血凝单位

IAV 甲型流感病毒

IBV 乙型流感病毒

ICV 丙型流感病毒

IM 肌内

IN 鼻内

NA 神经氨酸酶

NI 神经氨酸酶抑制

NP 核蛋白质

NS 非结构性

RBC 红细胞

RDE 受体破坏酶

RT 室温

VLP 病毒样颗粒

WHO 世界卫生组织

II.术语和方法

除非另外指明，技术术语根据常规用法使用。分子生物学中的常用术语的定义可在以下文献中找到：Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of MolecularBiology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了有利于审阅本公开的各种实施方式，提供了以下对特定术语的解释：

佐剂：非特异性地增强对抗原(例如，流感病毒抗原)的免疫反应的物质或媒介物。佐剂可与本文公开的组合物，例如，本文提供的一部分药用流感病毒疫苗组合物一起使用。佐剂可包含其上吸附了抗原的矿物(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；或其中抗原溶液在矿物油中乳化的油包水乳液(例如，弗氏不完全佐剂)，有时包括杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(如包含CpG基序的那些)也可用作佐剂(例如，参见美国专利6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，诸如共刺激分子。示例性的生物佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。在一个实例中，佐剂是一种或多种toll样受体(toll-like receptor,TLR)激动剂，诸如以下的激动剂：TLR1/2(其可为合成配体)(例如，Pam3Cys)，TLR2(例如，CFA、Pam2Cys)，TLR3(例如，polyI:C、poly A:U)，TLR4(例如，MPLA、脂质A和LPS)，TLR5(例如，鞭毛蛋白)，TLR7(例如，嘎德莫特(gardiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)、洛索立宾(loxoribine)、

)，TLR7/8(例如，R0848)，TLR8(例如，咪唑并喹啉、ssPolyU、3M-012)，TLR9(例如，ODN 1826(B型)、ODN 2216(A型)、CpG寡核苷酸)，和/或TLR11/12(例如，抑制蛋白(profilin))。在一个实例中，佐剂是脂质A，诸如来自沙门氏菌血清型Minnesota Re 595的单磷酰脂质A(MPL)(例如，Sigma Aldrich Catalog#L6895)。

施用：如本文所用，对受试者施用组合物(如包含流感病毒组合物的那些)表示将组合物给予、应用于受试者或使组合物与受试者接触。施用可通过多种途径中的任一种实现，诸如，例如，肌内、鼻内、肺、局部、口腔、皮下、腹膜内、静脉、鞘内、直肠、阴道和皮内。

抗体：B淋巴样细胞产生的具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗体是通过特定抗原(免疫原，诸如流感病毒HA和NA)在人或其他动物中诱发的。抗体的特征是与抗原以某种可证明的方式发生特异性反应，抗体和抗原相对于彼此定义。“引发抗体反应”是指抗原或其他分子诱导抗体产生的能力。

抗原或免疫原：能够刺激动物体内抗体或T细胞反应产生的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定的体液免疫或细胞免疫的产物，包括由异源免疫原诱导的那些反应。

β-丙内酯(BPL)：内酯家族的有机化合物，带有4元环。BPL是用于疫苗的感染剂(包括病毒)的化学灭活剂。该化学物质是与包括核酸和蛋白质在内的许多亲核试剂反应的烷基化剂。BPL处理可诱导DNA中的缺口和核酸与蛋白质之间的交联。BPL抑制流感病毒融合(Bonnafous et al.,Biochim Biophys Acta 1838(1Pt B):355-363,2013)。BPL的化学式为C₃H₄O₂。BPL也称为氧杂环丁烷-2-酮，3-羟基丙酸内酯，丙内酯，β-丙内酯和2-氧杂环丁酮。

血凝素(HA)：流感病毒表面糖蛋白。HA介导病毒颗粒与宿主细胞的结合以及随后的病毒进入宿主细胞。HA还会引起红细胞凝集。HA(连同NA)是两种主要的流感病毒抗原决定簇之一。

异源亚型免疫反应：由甲型流感病毒感染或免疫引起的免疫反应，其提供针对具有另一种HA或NA亚型的流感病毒感染的保护。

免疫反应：免疫系统的细胞如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞(polymorphonucleocyte)对诸如抗原或疫苗(诸如流感病毒疫苗)的刺激物的反应。免疫反应可包括参与宿主防御反应的任何身体细胞，包括例如分泌干扰素或细胞因子的上皮细胞。免疫反应包括但不限于先天性免疫反应或炎症。如本文所用，保护性免疫反应是指保护受试者免于感染(预防感染或预防与感染有关的疾病的发展)的免疫反应。测量免疫反应的方法包括，例如，测量淋巴细胞(如B或T细胞)的增殖和/或活性、细胞因子或趋化因子的分泌、炎症、抗体产生等。本文提供了其他实例。

免疫：使受试者(如哺乳动物)被保护免于感染性疾病(例如，流感)，诸如通过疫苗接种。

灭活的：在本公开的上下文中，“灭活的”病毒是已被改变到无法在宿主或宿主细胞中建立感染的程度的病毒。可使用例如化学品、热、pH改变和/或辐照(如紫外线或伽马辐照)来灭活病毒。灭活病毒也称为“杀死的”。“化学灭活的”病毒是使用化学方法(如用BPL、甲醛、戊二醛、2,2'-二硫代二吡啶或二乙烯亚胺(binary ethylene imine)处理)灭活病毒。有关病毒疫苗灭活方法的综述，参见Delrue et al.(Expert Rev Vaccines 11(6):695-719,2012)。

流感病毒：属于正粘病毒科的分段负链RNA病毒。流感病毒是有包膜的病毒。有三种类型的流感病毒：甲型、乙型和丙型。

甲型流感病毒(IAV)：分段的负义单链RNA病毒，其具有编码11种蛋白质的八个RNA链段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA和NA)，所述11中蛋白质包括RNA-指导的RNA聚合酶蛋白质(PB2、PB1和PA)、核蛋白质(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(亚单位HA1和HA2)、基质蛋白质(M1和M2)和非结构性蛋白质(NS1和NS2)。该病毒易于通过错误蛋白聚合酶和片段重配快速进化。甲型流感的宿主范围非常多样，包括人、禽类(例如，鸡和水禽类)、马、海洋哺乳动物、猪、蝙蝠、小鼠、雪貂、猫、虎、豹和狗。感染甲型流感的动物经常充当流感病毒的储库，并且一些亚型已显示可跨越人的物种屏障。

甲型流感病毒可根据编码表面糖蛋白(即，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA))的两个基因的抗原区域中的等位基因变异而被分为多个亚型，该表面糖蛋白是病毒附着和细胞释放所需的。目前有18种不同的甲型流感病毒HA抗原亚型(H1至H18)和11种不同的甲型流感病毒NA抗原亚型(N1至N11)。H1-H16和N1-N9可在野生禽类宿主中发现，并且可能对人类构成大流行威胁。H17-H18和N10-N11已在蝙蝠宿主中描述，目前尚未被认为对人类构成大流行威胁。

甲型流感的具体实例包括但不限于：H1N1(如1918H1N1)、H1N2、H1N7、H2N2(如1957H2N2)、H2N1、H3N1、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N1、H10N7、H10N8、H11N1、H11N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一个实例中，甲型流感包括已知在人类中循环的那些，诸如H1N1、H1N2、H3N2、H7N9和H5N1。

在动物中，大多数甲型流感病毒引起哺乳动物的呼吸道和/或禽类的消化道的自限性局部感染。然而，高致病性甲型流感病毒株如H5N1导致家禽全身感染，死亡率可能高达100％。2009年，H1N1流感是人类流感的最常见原因。在2009年出现了一种猪源的H1N1新病毒株，并且被世界卫生组织宣布为大流行。该病毒株被称为“猪流感”。H1N1甲型流感病毒还导致了1918年的西班牙流感大流行，1976年的Fort Dix爆发和1977-1978年的俄罗斯流感大流行。

乙型流感病毒(IBV)：负义单链RNA病毒，其具有八个RNA链段。IBV具有编码11种蛋白质的八个RNA链段(PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1和NS1)，所述11种蛋白质包括RNA-指导的RNA聚合酶蛋白质(PB1、PB2和PA)、核蛋白质(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素(亚单位HA1和HA2)、基质蛋白(M1)、非结构性蛋白质(NS1和NS2)和离子通道蛋白质(NB和BM2)。该病毒与甲型流感相比较不易于进化，但其突变足以导致无法获得持久的免疫力。乙型流感的宿主范围比甲型流感更窄，仅知其感染人类和海豹。乙型流感病毒不分为亚型，但可被进一步细分为谱系和病毒株。乙型流感的具体实例包括但不限于：B/Yamagata、B/Victoria、B/Shanghai/361/2002和B/Hong Kong/330/2001。

丙型流感病毒(ICV)：负义单链RNA病毒，其具有编码9种蛋白质的7个RNA链段。ICV是正粘病毒科的属种。ICV感染人类和猪，通常仅引发轻微症状，但可能是严重的并引起局部流行。与IAV和IBV不同，ICV没有HA和NA蛋白。相反，ICV表达一种被称为血凝素-酯酶融合体的单一糖蛋白(HEF)。

分离的：“分离的”生物组分(如核酸、蛋白质或病毒)已与其他生物组分(如细胞碎片或者其他蛋白质或核酸)基本分离或从其中纯化出来。已被“分离的”生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。该术语还涵盖重组核酸、蛋白质、病毒以及化学合成的核酸或肽。

神经氨酸酶(NA)：流感病毒膜糖蛋白。NA通过将末端唾液酸残基从感染细胞表面上的糖类部分上裂解下来而参与病毒HA的细胞受体的破坏。NA还可将唾液酸残基从病毒蛋白质上裂解下来，预防病毒的聚集。NA(与HA一起)是两个主要的流感病毒抗原决定簇之一。

爆发：如本文所用，流感病毒“爆发”是指指定年份中来自单个国家或地区的一系列病毒分离株。

药学上可接受的媒介物：可用于本公开中的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)描述了适合用于药物递送一种或多种治疗组合物，诸如本文公开的一种或多种流感病毒组合物，以及其他药剂的组合物和制剂。

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理学状况已经开始发展之后改善该疾病或病理学状况的迹象或症状的治疗性干预。“改善”是指降低疾病的迹象或症状的数量或严重性。

纯化的：术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，其意图用作相对术语。因此，例如，纯化的蛋白质、病毒、核酸或其他化合物是与天然相关蛋白质和其他污染物全部或部分分离的物质。在一些实施方式中，术语“基本纯化的”是指蛋白质、病毒、核酸或其他活性化合物，其已从细胞、细胞培养基或其他粗制剂中分离并且进行分馏以去除初始制剂的多种组分如蛋白质、细胞碎片和其他组分。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物如非人灵长类动物的类别。在一个实例中，受试者是可被流感病毒感染者，诸如人，禽类(例如，鸡、火鸡)、马、猪、蝙蝠、小鼠、雪貂、猫、虎、豹、海豹和狗。如本文所用，“未成年人受试者”是21岁以下的人受试者；“成年人受试者”是21岁或更大的人受试者。

治疗有效量：特定药剂的量，其足以在用该药剂治疗的受试者中实现所需效果。例如，其可为可用于在受试者中引发免疫反应和/或用于预防流感病毒引起的感染或疾病的流感病毒组合物的量。在一个实例中，治疗有效量的流感病毒组合物是足以在受试者中提高对流感病毒(如甲型流感、乙型流感或二者)引起的感染的抵抗力、预防、改善和/或治疗流感病毒(如甲型流感，乙型流感或二者)引起的感染而又不会引起实质的细胞毒性作用的量。用于在受试者中提高对感染的抵抗力、预防、改善和/或治疗感染的流感病毒组合物的有效量将取决于，例如，所治疗的受试者、治疗组合物的施用方式和其他因素。

疫苗：能够刺激免疫反应的免疫原性材料的制剂，其被施用以预防、改善或治疗疾病如感染性疾病。免疫原性物质可以包括本文公开的流感病毒组合物。疫苗可引发预防性(防备性)和治疗性反应。施用方法因疫苗而异，但可包含接种、摄食、鼻内、肌内或其他形式的施用。疫苗可与佐剂一起施用以增强免疫反应。

除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。单数形式的“一/一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指示词。除非上下文另有明确说明，否则“包含A或B”是指包括A或B或A和B。应进一步理解，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且提供用于说明。尽管与本文所述的那些相似或相同的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但合适的方法和材料描述如下。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括术语的解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅用于说明，并非旨在限制。

III.介绍

甲型流感病毒感染是主要的全球公共卫生问题。根据世界卫生组织(WHO)，每年的流行病导致大约300-500万严重病例和多达500,000例死亡。其中人被来源于动物的流感病毒如禽流感H5N1或H7N9病毒株感染的人畜共患性爆发可导致极高的病死率，也带来了新的大流行流感病毒株发展的重大风险。流感大流行的影响力各有不同，但1918年的流感大流行导致全球至少5,000万人死亡，而且很可能是源自禽流感病毒。1957和1968年的大流行也具有源自禽流感的表面蛋白质基因。与一些感染性疾病不同，由于病因甲型流感病毒通过野生禽类胃肠道的隐性感染被维持下来，因此流感无法根除。基于表面血凝素(HA)分子的16种亚型之一与9种神经氨酸酶(NA)亚型之一的组合的表达，这些禽类病毒形成144种可能的亚型。人类对其缺乏免疫力的具有新型HA(和/或NA)的宿主适应性人畜共患性甲型流感病毒在人类中的出现是大流行的原因。目前的预防流感的公众卫生策略是基于每年针对特定的循环病毒株开发新疫苗。该方法是不够的，其部分原因是新疫苗的年度生产和大规模运输成本高昂，但主要还是因为这些年度疫苗只针对目标循环病毒，因此它们不能预防具有新HA亚型的新大流行病毒的出现。

为解决这一问题，本公开描述了针对在野生禽类中维持的所有甲型流感病毒亚型对动物进行免疫的多价疫苗。PCT公开WO 2015/195218描述了这样的一项研究，其中，将表达4种不同的低致病性(low path)禽类HAs(H1、H3、H5、H7)的非感染性病毒样颗粒(VLP)的混合物经鼻内递送给实验动物，该混合物诱导对多种甲型流感病毒亚型(包括1918H1N1病毒、高致病性禽类H5N1和禽类H7N9病毒)的广泛反应性免疫。该VLP混合物还提供了针对具有未在疫苗中出现的HA亚型的病毒(1957H2N2病毒，以及禽类H6、H10、H11和H15病毒)的交叉保护。在亚型间10倍致死剂量攻击后，用VLP混合物进行的疫苗接种不能提供灭菌免疫；但是，该疫苗混合物确实可以预防严重病例并保护动物免于死亡。

本公开描述了用β-丙内酯(BPL)灭活的、由多种(如4、6或8种)不同的低致病性禽类亚型组成的全病毒疫苗进行疫苗接种。BPL-灭活流感病毒混合物当经鼻内或肌内施用时，提供了非常广泛的保护和对致死攻击的异源亚型保护，例如与具有相同HA的VLP混合物相比。

VLP制造当前很昂贵，而全病毒灭活的疫苗的制造则更为经济，并且无需开发新的制造方法。此外，由于疫苗由灭活的全病毒组成，此类疫苗将不像活减毒疫苗那样容易重配。灭活的全病毒疫苗还能促进产生针对HA头部和茎部区域、NA和M2e表面蛋白质以及针对灭活病毒疫苗中其他病毒蛋白质的T-细胞表位的抗体反应。

IV.实施方式概述

描述了包括多种灭活的甲型流感病毒的通用型流感病毒疫苗组合物。该组合物包括4种或更多种不同的甲型流感病毒(如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种不同的甲型流感病毒)，每种病毒具有不同的HA亚型，并且其中每种病毒是一价的(例如，仅具有单一HA亚型，诸如仅H1或仅H5，而不是H1和H5)。该组合物例如可用于引发对流感病毒的免疫反应，使受试者对季节性流感病毒免疫，和/或通过作为大流行前疫苗减轻未来的大流行。在一些实例中，该组合物引发了针对在该组合物中不存在的流感病毒亚型的免疫反应，即，提供了异源亚型免疫反应。例如，如果该组合物包含具有亚型H1、H3、H5和H7的流感病毒，异源亚型免疫反应可针对流感病毒H2、H4、H6、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16。类似地，如果该组合物包含具有亚型H2、H4、H9和H10的流感病毒，异源亚型免疫反应可针对流感病毒H1、H3、H5、H6、H7、H8、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16。

公开了组合物，其包含第一甲型流感病毒，其包含第一亚型的HA；第二甲型流感病毒，其包含第二亚型的HA；第三甲型流感病毒，其包含第三亚型的HA；并且第四甲型流感病毒，其包含第四亚型的HA，其中该至少4种不同的甲型流感病毒是灭活的。

在一些实施方式中，至少一种甲型流感病毒是低致病性禽流感病毒。在特定实例中，至少两种，至少三种或全部4种甲型流感病毒是低致病性禽流感病毒。

在一些实施方式中，第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少一种选自H3、H4、H7、H10、H14和H15。在一些实例中，第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少两种选自H3、H4、H7、H10、H14和H15。

在一些实施方式中，第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少一种选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。在一些实例中，第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少两种选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。

在一些实施方式中，第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少一种选自H3、H4、H7、H10、H14和H15；并且第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少一种选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。在一些实例中，第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少两种选自H3、H4、H7、H10、H14和H15；并且第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少两种选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。

在一些实例中，第一、第二、第三和第四HA亚分别型是H1、H3、H5和H7(参见图3，四价疫苗1)。在具体的非限制性实例中，H1病毒是A/mallard/Ohio/265/1987(H1N9)，H3病毒是A/pintail/Ohio/339/1987(H3N8)，H5病毒是A/mallard/Maryland/802/2007(H5N1)，和/或H7病毒是A/Environment/Maryland/261/2006(H7N3)。在其他实例中，第一、第二、第三和第四HA亚型是H2、H4、H9和H10(参见图3，四价疫苗2)。在具体的非限制性实例中，H2病毒是A/green-winged teal/Ohio/175/1986(H2N1)，H4病毒是A/green-winged teal/Ohio/344/1986(H4N2)，H9病毒是A/Mallard/Maryland/798/2007(H9N1)，和/或H10病毒是A/Mallard/Ohio/99/1989(H10N7)。

在一些实施方式中，组合物进一步包含第五甲型流感病毒，其包含第五亚型的HA，其中该第五甲型流感病毒是灭活的。在一些实例中，组合物进一步包含第六甲型流感病毒，其包含第六亚型的HA，其中该第六甲型流感病毒是灭活的。在一些实例中，组合物进一步包含第七甲型流感病毒，其包含第七亚型的HA，其中该第七甲型流感病毒是灭活的。在一些实例中，组合物进一步包含第八甲型流感病毒，其包含第八亚型的HA，其中第八甲型流感病毒是灭活的。

从生物系统上来说，有两组主要的甲型流感病毒HA：组1包含H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16，并且组2包含H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型(参见图3)。在本文公开的组合物的一些实施方式中，组合物包含至少一种具有组1的HA的甲型流感病毒和至少一种具有组2的HA的甲型流感病毒。在特定实例中，组合物中的半数病毒(如2、3或4种病毒)具有组1的HA，且半数病毒(如2、3或4种病毒)具有组2的HA。

在一些实施方式中，第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或第八HA亚型是H1、H2、H3、H4、H5、H7、H9和H10(例如，图3中的四价疫苗1和2的组合)。在具体的非限制性实例中，H1病毒是A/mallard/Ohio/265/1987(H1N9)，H3病毒A/pintail/Ohio/339/1987(H3N8)，H5病毒是A/mallard/Maryland/802/2007(H5N1)，H7病毒是A/Environment/Maryland/261/2006(H7N3)，H2病毒是A/green-winged teal/Ohio/175/1986(H2N1)，H4病毒是A/green-winged teal/Ohio/344/1986(H4N2)，H9病毒是A/Mallard/Maryland/798/2007(H9N1)，和/或H10病毒是A/Mallard/Ohio/99/1989(H10N7)。

所公开的组合物的甲型流感病毒是灭活的。病毒可使用本领域已知的任何手段灭活。在一些实施方式中，甲型流感病毒是化学灭活的。在一些实例中，甲型流感病毒用β-丙内酯(BPL)化学灭活。在其他实例中，甲型流感病毒用甲醛化学灭活。在其他实例中，甲型流感病毒用戊二醛、2,2'-二硫代二吡啶或二乙烯亚胺化学灭活。在其他实施方式中，甲型流感病毒用热灭活。在其他的实施方式中，甲型流感病毒用辐照灭活。在一些实例中，甲型流感病毒用紫外线或γ辐照灭活。

在一些实施方式中，组合物进一步包含药学上可接受的载体、佐剂或二者。

在一些实施方式中，组合物被配制为用于鼻内施用。在其他实施方式中，组合物被配制为用于肌内施用。

还提供了包含本文公开的组合物的容器。在一些实施方式中，容器是注射器。在一些实例中，注射器包括针头。注射器中的柱塞可具有阻挡器以预防柱塞在抽吸过程中被意外地移除。一次性注射器通常包含单一剂量的疫苗。注射器可具有尖端盖以在附接针头之前密封尖端。在非限制性实例中，尖端盖可由橡胶如丁基橡胶制成。

在其他实施方式中，容器是小瓶。在一些实例中，小瓶由玻璃制成，如无色玻璃，例如硼硅酸盐。在其他实例中，小瓶由塑料制成。小瓶可包含阻挡器，如橡胶阻挡器，或盖子，如适于使注射器插入的盖子。在一些实例中，小瓶包括单一剂量的组合物。在其他实例中，小瓶包括多剂量的组合物，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多剂量的组合物。通常，小瓶在加入组合物之前灭菌。

还提供了包含本文所公开的容器的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括小瓶(如包含组合物的小瓶)、注射器(例如，空注射器或包含组合物的注射器)、针头或其任何组合。组合物可在悬浮液中，诸如在PBS或其他药学上可接受的载体中。可替代地，组合物可为干燥或粉末形式，诸如冻干或冷冻干燥的，其随后由最终用户重构(例如用PBS或其他药学上可接受的载体)。试剂盒中的容器可包含佐剂，或佐剂可在试剂盒中的单独容器中。在一些实例中，容器可包含药学上可接受的载体如PBS，或药学上可接受的载体如PBS可在单独容器中(例如，如果组合物为冷冻干燥或冻干的)。在一些实例中，试剂盒中的容器进一步包括一种或多种稳定剂。在一些实例中，试剂盒还包括允许将组合物施用给受试者的器件。此类器件的实例包括注射器或注射器雾化器(例如

鼻腔药物递送器件，诸如得自LifeMedicals Supplier,Sunrise,FL的那些)。试剂盒可与包含疫苗细节(诸如施用说明和/或疫苗内病毒的细节)的说明书一起包装(例如，在同一盒子中)。

进一步提供了通过将治疗有效量的本文公开的组合物施用给受试者在受试者中引发对流感病毒的免疫反应的方法。还提供了通过将治疗有效量的本文公开的组合物施用给受试者使受试者对流感病毒免疫的方法。在一些实施方式中，组合物肌内施用。在其他实施方式中，组合物鼻内施用。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物或禽类。在其他实施方式中，受试者是人。

本文公开的组合物可用于儿童和成年人的治疗(如疫苗接种)。目前建议在从6月龄起的未成年人和成年人受试者中均使用流感疫苗。因此，在一些实施方式中，人是成年人受试者。在其他实施方式中，人是未成年人受试者。因此，人受试者的年龄可能不到1岁(如至少六个月、至少七个月、至少八个月、至少9个月、至少10个月或至少11个月)、1-5岁(如至少1岁、至少2岁、至少3岁或至少4岁)、5-15岁、15-21岁、21-55岁、55-65岁或至少65岁。在特定的非限制性实例中，患者是老年患者，如至少65岁的患者。在一些实例中，受试者是住院患者、医护人员、武装部队成员、军事人员、孕妇、慢性病患者、免疫缺陷患者、以前服用过抗病毒化合物的患者、鸡蛋过敏的人或出国旅行的人。

V.组合物

本文提供了包含至少4种(如至少5种、至少6种、至少7种或至少8种)不同的低致病性禽流感病毒的组合物。组合物中的每种病毒包含不同的HA亚型。在一些实施方式中，半数病毒(如病毒中的2、3或4种)具有组1的HA亚型(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16)，且半数病毒(如病毒中的2、3或4种)具有组2的HA亚型(H3、H4、H7、H10、H14和H15)。组合物中的所有病毒是灭活的，诸如化学灭活的，例如用BPL化学灭活的。具有可用于所公开的组合物中的亚型H1-H16的代表性(非限制性)的流感病毒株如表1所示。

表1.用于生产灭活流感病毒疫苗混合物的HA基因来源

可用于所公开的组合物中的具有H1-H16中任何的其他示例性的(非限制性)病毒株如表2所示。

表2：示例性的流感病毒

A.组合物的示例性组分

本文提供的包含灭活流感病毒的组合物可包含其他药剂。在一些实例中，灭活流感病毒存在于药学上可接受的载体中，如盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、芝麻油、乙醇及其组合。载体和组合物可以是无菌的。组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物还可以包含常规的药用辅料，如，例如，调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末。在一个实例中，组合物是液体，或者冻干或冷冻干燥的粉末。组合物可用传统的粘合剂和载体如甘油三酸酯配制为栓剂。口服制剂可以包含标准载体，如药品级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。

在一些实例中，包含灭活流感病毒的组合物包括药学上可接受的载体和佐剂，如粘膜佐剂，例如CpG寡脱氧核苷酸、Flt3配体和单磷酸甲酰A(MLA)中的一种或多种。在一个实例中，佐剂包括MLA，如临床级制剂，例如

(3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A)佐剂。

B.用于粘膜施用的制剂

本文提供的包含灭活流感病毒的组合物可被配制用于粘膜疫苗接种，诸如鼻内施用。粘膜疫苗接种可通过多种途径实现，包括口腔、鼻内、肺部、直肠和阴道。在特定实例中，其通过鼻内施用实现。因此，在一些实例中，所公开的组合物被配制用于鼻内施用。

例如，所公开的组合物可包含一种或多种生物可降解的、粘膜粘附的聚合物载体。可包括聚合物如聚乳酸-共-乙交酯(PLGA)、壳聚糖、藻酸盐和卡波普(carbopol)。亲水性聚合物，如藻酸盐和卡波普，通过形成氢键吸收到粘液中，从而延长了鼻腔停留时间，并且因此可以被包含在所公开的的组合物中。

在一个实例中，组合物包括藻酸钠，它是线性共聚物并由1-4连接的β-d-甘露糖醛酸和1-4连接的α-l-古洛糖醛酸残基组成。在一些实例中，组合物包括卡波普(一种交联的聚丙烯酸聚合物)，例如与淀粉组合。在一些实例中，组合物包括壳聚糖，一种无毒的线性多糖，其可以通过几丁质脱乙酰化制备。在一个实例中，壳聚糖为壳聚糖纳米颗粒的形式，如N-三甲基壳聚糖(TMC)基纳米颗粒。

在一个实例中，组合物被配制成用于鼻腔注射的微粒递送系统。在一个实例中，包含灭活流感病毒的组合物可包含脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)和/或聚合物颗粒如病毒颗粒。在一个实例中，脂质体经过表面修饰(例如，用乙二醇壳聚糖或寡甘露糖包被的)。在一个实例中，脂质体是膜融合的(fusogenic)或阳离子膜融合的。

包含灭活流感病毒的组合物还可包含一种或多种细菌来源的脂肽或其合成衍生物。脂质部分的实例包括三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)、二棕榈酰-S-甘油半胱氨酸(Pam2Cys)、单/多链棕榈酸和脂氨基酸(LAAs)。

包含灭活流感病毒的组合物还可包括一种或多种佐剂，例如粘膜佐剂，如CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、Flt3配体和单磷酰基脂质A(MLA)中的一种或多种。在一个实例中，佐剂包括临床等级的MLA制剂，例如

(3-O-脱酰基4'-单磷酰脂质A)佐剂。

V.刺激免疫反应的方法

在本文中提供了使用所公开的包含灭活流感病毒的组合物的方法。在一个实例中，该方法包括在受试者中引发针对流感病毒(如甲型流感、乙型流感或二者)的广泛的反应性免疫反应。在另一实例中，该方法包括在受试者中使该受试者对流感病毒(如甲型流感、乙型流感或二者)免疫或对该受试者进行针对流感病毒(如甲型流感、乙型流感或二者)的疫苗接种。

例如，所公开的灭活流感病毒可以刺激广泛反应性的免疫反应，从而保护施用了该灭活流感病毒组合物的受试者以免受多种甲型流感病毒(和/或乙型流感病毒)导致的严重疾病或死亡，而无需在攻击病毒株与疫苗组成之间进行匹配。本文显示，在灭活流感病毒组合物不含与攻击病毒株相同的HA亚型的情况下(例如，攻击病毒株为H6N1、H10N1或H10N7，但组合物不含任何亚型H6或H10的病毒)实现了广泛的交叉保护(即，异源亚型保护)。因此，所公开的灭活流感病毒组合物可用作大流行前疫苗。

因此，在一些实例中，使用所公开的组合物引发的免疫反应是针对以下中一种或多种(如至少2种、至少3种、至少4种或至少5种)：H1N1、H1N2、H1N7、H2N1、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N1、H10N7、H10N8、H11N1、H11N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一些实例中，免疫反应是针对H1N1、H1N2、H3N2、H7N9和H5N1中的一种或多种。在一些实例中，这种免疫针对以下中的一种或多种(如至少2种、至少3种、至少4种或至少5种)的攻击提供保护(如预防感染或预防与感染相关的疾病的发展)：H1N1、H1N2、H1N7、H2N1、H2N2、H3N1、H3N2、H3N8、H4N8、H5N1、H5N2、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N5、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N1、H10N7、H10N8、H11N1、H11N6、H12N5、H13N6和H14N5。在一些实例中，这种免疫针对H1N1、H1N2、H3N2、H7N9和H5N1中的一种或多种的攻击提供保护(例如，预防感染或预防与感染相关的疾病的发展)。在一个实例中，本文公开的灭活流感病毒组合物可用作引发针对H1N1和/或H3N2流感病毒的保护性免疫反应的流感疫苗。

在一些实例中，免疫反应或免疫是用表达与实现至少一种免疫反应或保护的HA亚型不同的HA亚型的灭活流感病毒的混合物进行的。例如，如果对受试者施用表达H2、H3、H5和H7的灭活病毒的混合物，则可实现对H1流感病毒如H1N1的至少一种免疫反应或免疫。例如，如果对受试者施用表达H1、H3、H5和H7的灭活病毒的混合物，则可实现对以下中的一种或多种的至少一种免疫反应或免疫：H2、H4、H6、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16流感病毒。

在一些实施方式中，所公开的包含灭活流感病毒的组合物使用任何合适的施用途径施用，诸如，鼻内或肌内。在一些实施方式中，包含灭活流感病毒的组合物包括药学上可接受的载体和/或佐剂。例如，药学上可接受的载体可为盐水，诸如无菌PBS pH 7.2-pH7.4。例如，佐剂可为免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)、Flt3配体，和单磷酰脂质A(MLA)中的一种或多种。

所公开的组合物可用于在受试者中刺激或引发对流感病毒(如甲型流感、乙型流感或二者)的免疫反应。在一些实例中，该方法包括对受试者施用治疗有效量的本文提供的包含灭活流感病毒的组合物，从而在受试者中引发对流感病毒的免疫反应。确定是否已刺激或引发免疫反应的方法是已知的，并且在本文中提供了一些实例。在一些实例中，如果观察到疾病减轻(如体重减轻变少、症状减轻或肺病理减轻)、病毒滴度减少和/或保护免于死亡，则实现了阳性免疫反应或免疫。因此，在一些实例中，所公开的方法和/或组合物使体重减轻减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％(例如在攻击后6-15天内)，例如与未接受该流感病毒组合物的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物使流感感染的症状减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，例如与未接受该组合物的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物使因流感感染所致的肺病理减少了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，例如与未接受该组合物的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物使肺病毒滴度减少了至少50％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍，例如与未接受该组合物的等同受试者相比。在一些实例中，所公开的方法和/或组合物使随后的病毒攻击后的生存率提高了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％或至少94％，例如与未接受该组合物的等同受试者相比。在一些实例中，使用所公开的组合物实现的免疫反应优于使用等同VLP所实现的免疫反应。因此，在一些实例中，所公开的组合物与等同VLP相比具有改进的刺激或引发免疫反应的能力。

所公开的组合物可用于对受试者针对流感病毒进行免疫或疫苗接种，如哺乳动物受试者或禽类受试者。在一些实例中，该方法包括给受试者施用治疗有效量的本文提供的包含灭活流感病毒的组合物，从而使受试者对流感病毒免疫。在一些实例中，如果观察到疾病减轻(例如，体重减轻减少、症状减少、肺病理减轻)、病毒滴度减少和/或保护免于死亡，则实现了阳性免疫反应或免疫。

可施用所公开的灭活流感病毒组合物的受试者的实例包括能被(或被)流感感染的受试者。此类受试者的实例包括但不限于，哺乳动物和禽类受试者，诸如人、猪、鸡、火鸡、马、狗和猫。人受试者可为成年人(包括老年人)或未成年人受试者。

在引发免疫反应或使受试者免疫的方法的一些实施方式中，对受试者施用(如鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约1至约25μg。在特定实例中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约1至约5μg，组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约5至约20μg，或组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约10至约15μg。在一个具体的非限制性实例中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约1.5μg或15μg。然而，本领域技术人员能够确定施用给受试者的灭活病毒的治疗有效量(例如针对H1N1流感病毒感染提供保护的量)。

A.施用方法

可以通过通常用于将病毒引入到受试者中的任一种途径将所公开的包含灭活流感病毒的组合物施用给受试者。施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、肠胃外、静脉内、皮下、粘膜、阴道、直肠、鼻内、吸入或口服。肠胃外施用如皮下、静脉内或肌内施用通常通过注射实现。注射剂可以按常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮液，适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者作为乳液。注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒、片剂等制成。施用可以是全身性或局部的。

施用给受试者的包含灭活流感病毒的组合物与至少一种药学上可接受的载体一起施用。药学上可接受的载体可部分通过所施用的特定组合物以及通过用于施用组合物的具体方法来确定。因此，有多种本公开的药物组合物的合适制剂。药学上可接受的载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、芝麻油、乙醇及其组合。组合物还可以包含常规的药用辅料，例如，调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等。载体和组合物可以是无菌的，且制剂适合于施用方式。组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉剂。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

一些组合物可潜在地作为通过与无机酸和有机酸反应或通过与无机碱或有机碱反应形成的药学上可接受的酸或碱加成盐施用，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸，所述有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸，所述无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，所述有机碱例如单-、二-、三烷基和芳基胺以及取代的乙醇胺。

在特定实例中，本文提供的组合物被配制用于粘膜疫苗接种，诸如口服、鼻内、肺、直肠和阴道。在特定实例中，这是由鼻内施用来实现的。例如，所公开的组合物可包含一种或多种生物可降解的、粘膜粘附的聚合物载体。可包括聚合物如聚乳酸-共-乙交酯(PLGA)，壳聚糖(例如以壳聚糖纳米颗粒的形式，如N-三甲基壳聚糖(TMC)的纳米颗粒)，藻酸盐(如藻酸钠)和卡必醇。在一个实例中，组合物包括一种或多种亲水性聚合物，如藻酸钠或卡波普。在一个实例中，组合物包括卡波普，例如与淀粉结合。在一个实例中，组合物被配制为用于鼻腔施用的微粒递送系统。因此，包含灭活流感病毒的组合物可包含脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)、和/或聚合物颗粒如病毒颗粒。包含灭活流感病毒的组合物还可包含一种或多种细菌来源的脂肽或其合成衍生物，如Pam3Cys，(Pam2Cys，单/多链棕榈酸和脂氨基酸(LAA)。组合物还可包含一种或多种佐剂，如CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)、Flt3配体和单磷酰脂质A(MLA)中的一种或多种。在一个实例中，佐剂包括临床级别的MLA制剂，例如

(3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A)佐剂。

B.施用时机

所公开的包含4种或更多种灭活流感病毒的组合物以单一剂量或多个剂量(例如，增强剂)施用。在一些实例中，第一次施用后进行第二次施用。例如，第二次施用可用与所施用的包含灭活流感病毒的第一组合物相同或不同的包含灭活流感病毒的组合物进行。在特定实例中，第二次施用使用与所施用的包含灭活流感病毒的第一组合物相同的包含灭活流感病毒的组合物进行。在另一特定实例中，第二次施用使用与所施用的包含灭活流感病毒的第一组合物不同的包含灭活流感病毒的组合物进行。例如，如果包含灭活流感病毒的第一组合物包含第一HA亚型、第二HA亚型、第三HA亚型和第四HA亚型，包含灭活流感病毒的第二组合物可包含第五HA亚型、第六HA亚型、第七HA亚型和第八HA亚型，其中全部八种亚型均不同。

在一些实例中，包含4种或更多种灭活流感病毒的组合物以多个剂量施用，如2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量(如2-3个剂量)。在此类实例中，剂量之间的时间可为至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少6周、至少8周、至少12周、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年或至少10年，诸如1-4周、2-3周、1-6个月、2-4个月、1-10年或2-5年或其组合(如当有至少三次施用时，其中第一和第二剂量以及第二和第三剂量之间的时间可相同或不同)。

C.剂量

在本公开的上下文中，施用给受试者的剂量应当足以在受试者中随时间诱导有益的治疗反应，或者抑制或预防流感病毒感染。所需剂量可根据受试者的种类、年龄、体重和一般状况，待治疗的感染的严重程度，所用的具体组合物及其施用方式而因受试者而不同。本领域技术人员仅使用常规试验即可确定合适的剂量。

在一些实施方式中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约1至约100μg，诸如组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约1μg至约50μg、1μg至约25μg、1μg至约5μg、约5μg至约20μg或约10μg至约15μg。在一个具体的非限制性实例中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约15μg。在另一具体的非限制性实例中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约10μg。在一个具体的非限制性实例中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约20μg。在一个具体的非限制性实例中，对受试者施用(例如，鼻内或肌内)组合物中至少4种不同的灭活病毒的每种约1μg或2μg。

D.测量免疫反应的方法

确定本文所公开的包含灭活流感病毒的组合物能否或是否引发或刺激免疫反应(如实现成功免疫)的方法是本领域已知的。例如，参见Cottey et al.,in CurrentContents in Immunology 19.11.1-19.11.32,2001(通过引用并入本文)。尽管在本文中提供了示例性的测定，本公开不限于使用特定的测定。

在施用本文提供的灭活流感病毒组合物后，可以进行一种或多种测定以评估所得的免疫反应。在一些实例中，还在施用该组合物之前进行测定，以用作基线或对照。在施用该组合物之后从受试者收集样品，例如血液或血清样品。在一些实例中，样品在第一次施用之后至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或至少8周(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周)收集。随后的样品也可以获取，例如在后续施用之后。

1.血凝滴度测定(Hemagglutination Titer Assay)

可进行血凝滴度测定以测量或评价血凝单位(HAU)。该测定可用于评价病毒是否表达了功能性HA三聚体，并且还能用于定量病毒制剂中的HA蛋白质。血凝素滴度也用于定量用作攻击病毒的流感病毒的量，或例如用于定量被攻击动物的肺或呼吸道中存在的病毒的量。疫苗接种受试者与空白疫苗接种受试者相比可显示病毒滴度降低。

该测定可用于定量样品中病毒的量，诸如来自病毒攻击的受试者的肺样品，所述受试者预先施用了本文提供的包含灭活流感病毒的组合物。病毒原液被连续稀释(例如，1:4到1:4096的两倍稀释)，随后被添加到包含红细胞(RBC)的孔中。将RBC溶液(如0.75％至1％RBC)添加到孔中。随后将混合物于室温温育30分钟，这使得RBC沉降。随后分析样品的所得凝集模式，例如通过检验其中放置了样品的微量滴定孔。例如，在放置在其边缘的微量滴定板中，RBC对照孔中的RBC将流成特征的泪滴型(不存在流感病毒，因此无凝集)。包含流感病毒的孔将不同程度的凝集RBC。具有最大量病毒的孔将呈现浑浊，因为病毒交联了所有的红细胞，阻止其沉淀。接下来的孔中较少量的病毒可能导致部分凝集，但沉淀物不会像RBC对照孔中的沉淀物一样流成泪珠状。通常将终点确定为导致RBC完全凝集的病毒样品的最大稀释度。

可测定待滴定样品中的HAU数。HA滴度是显示RBC完全凝集的系列中最后一个孔的稀释度的倒数(例如，如果最后一个稀释度是1:640，则样品的滴度是640HA单位/5μl样品)。

2.血凝抑制(HAI)测定

在一个实例中，在施用本文提供的包含灭活流感病毒的组合物之后，进行血凝抑制(HAI)测定。流感病毒可凝集红细胞，一种称为血凝的过程，如上所述。在表面血凝素的特定抗体的存在下，血凝被阻断。这一现象提供了HAI测定的基础，该测定用于检测和定量血清中特定的抗病毒抗体。因此，HAI测量了阻断HA受体结合的抗体的存在(如通过RBC的血凝所评估的)。

在一个实例中，在37℃下用受体破坏酶(receptor destroying enzyme,RDE)处理待评价存在针对血凝素头部的抗体的血清过夜。次日，通过在56℃下温育1小时将RDE灭活。所用的测定板为96-孔无菌的未经组织培养处理的圆底微量滴定板。从B行到G行沿着板向下对每个样品进行两倍连续稀释。将50μl的病毒抗原(设定数量的HAU)的工作稀释液添加到微量滴定板的所有孔中，H行(RBC对照孔)和抗原对照孔除外。将板在室温温育30分钟。将50μl的1％RBC的PBS悬浮液添加到所有孔中，并将板在室温温育30至45分钟。分析微量滴定板以读取凝集模式。阴性对照孔(那些包含无抗流感抗体的正常血清的孔)将会出现浑浊，因为流感病毒已完全凝集RBC。只要有足够的抗流感抗体来抑制凝集，阳性对照孔(那些包含已知抗流感抗血清的孔)将具有外观类似于H行对照沉淀物的RBC沉淀物。随着血清稀释度增加，抗体的量将减少使得RBC凝集量的增加将变得明显。每个血清样品的血凝抑制(HAI)滴度是完全抑制RBC凝集的最大稀释度(即形成RBC沉淀的稀释系列中的最后一个孔)的倒数。每个样品的HAI滴度是其一式两份稀释系列的终点滴度的平均值。如果一式两份的滴度相差超过两倍稀释，则可以对该样品重复进行HAI滴定。

3.流感病毒中和测定

在一个实例中，在施用本文提供的组合物后，进行中和测定。在该测定中，将来自接受了本文提供的包含灭活流感病毒的组合物的受试者的血清样品稀释，添加流感病毒，并测定预防病毒生长所需的血清量。中和评估了抑制病毒复制的抗体的存在。针对HA茎部的抗体例如可中和病毒复制，但不会影响血凝，因为表位不在受体结合结构域的周围。结合到头部并抑制血凝的抗体通常是中和的。

在一些实例中，将血清样品在组织培养基(例如含有抗生素的DMEM/5％FBS)中，例如在96孔圆底经组织培养处理的微量滴定板中温育。血清样品被连续稀释，例如在微孔板的一式两份相邻孔中连续稀释(例如最初以1:10稀释到1:640的样品稀释度)。可以将先前滴定的流感病毒(任何亚型)稀释至包含1 TCID₅₀/50μl。将等量的工作储备病毒(例如约50TCID₅₀)添加到每个血清样品(包括系列稀释液)中，并在37℃下温育1小时。使用此规则，如果病毒的最终量在10至100 TCID₅₀之间，则可获得相同的中和滴度。温育后，将包含2.5x10⁵MDCK细胞/ml(或其他细胞)的组织培养基(例如含有抗生素的DMEM/5％FBS)添加到血清样品中(例如，添加到微量滴定板的所有孔中)。将其在加湿的37℃、5％CO₂培养箱中温育过夜。一些流感病毒在34°至35℃的温度性会生长得更好，因此在一些实例中使用了这些温度。移除培养基，并更换为包含胰蛋白酶(例如0.0002％)的组织培养基(例如含有抗生素的DMEM)，并将混合物在加湿的37℃、5％CO₂的培养箱中温育4天。随后，添加无菌的0.5％RBC/PBS溶液，并将混合物在4℃温育1小时，检查孔中是否存在凝集。特定血清样品的病毒中和滴度定义为其中两个孔均不显示RBC凝集的血清最高稀释度的倒数。

包含足够浓度的流感病毒中和抗体的样品(例如，在微孔中)将阻止病毒感染细胞，因此不会发生病毒繁殖。向这些孔中添加RBC将导致形成RBC沉淀。相反，没有抗流感抗体或具有低于中和浓度的抗流感抗体的样品(例如，在微孔中)在4天温育结束时将会存在流感病毒。添加到这些样品中的RBC将凝集。流感病毒使红细胞交联，抑制了它们在微孔中的沉降，因此这些孔呈现沉淀。

4.神经氨酸酶抑制(NI)抗体滴度测定

也可测定神经氨酸酶抑制(NI)抗体滴度。为测量NI抗体滴度，可生成包含合适的NA的重配病毒，例如通过使用基于质粒的反向遗传学(例如，参见Sandbulte et al.,Influenza Other Respir Viruses 3:233-40,2009)。合适的NA将是与被施用给受试者的病毒中存在的那些相同。可使用胎球蛋白作为NA底物进行NI测定(例如，参见Cate et al.,Vaccine 28:2076-9,2010，通过引用并入本文)。示例性的方法在下文中提供。

NI滴度是提供了至少50％的NA活性抑制的血清最大稀释度的倒数。预期使用本文公开的组合物将降低或者甚至消除接受灭活流感病毒组合物的受试者的攻击病毒滴度。例如，与未接受灭活流感病毒组合物的受试者(例如，空白疫苗接种者)相比，预期接受灭活流感病毒组合物的受试者肺中的病毒会少至少10倍、至少20倍、至少50倍、甚至100倍。

可在使用过氧化物酶标记的花生凝集素(PNA-PO)与脱唾液酸化胎球蛋白结合的酶联凝集素检验中确定NI抗体滴度。可通过在胎球蛋白包被的微量滴定板上温育纯化的全长NA的系列稀释液来测定NA活性。在室温温育30分钟后，洗涤板并添加PNA-PO。在室温温育一小时后，再次洗涤板，并添加过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺，并进行10分钟显色。停止显色，并测量板的OD450。确定对应于95％NA活性的稀释度。

可以从1:20的血清稀释度开始测量针对NA亚型的NI滴度，然后在96孔U型底组织培养板中进行2倍系列稀释。将对应于最大活性95％的NA加入稀释的血清中，并在室温温育30分钟，然后将血清/NA样品转移至胎球蛋白包被的微量滴定板中。将板在37℃下温育2小时，洗涤并加入PNA-PO。将板在室温再温育1小时，洗涤并加入过氧化物酶底物TMB。10分钟后停止显色，并测量板的OD450。NI滴度是抑制50％NA活性时的倒数稀释度(reciprocaldilution)。该测定的定量下限为20；低于20的滴度被认为是阴性的，并指定为10的值。在一些实例中，良好或阳性反应产生>30的值，而不良反应或无反应产生<20的值。

5.病毒肺滴度和病理

可以测定病毒的肺滴度和病理。将组织样品(例如肺样品(例如，充气的肺样品))固定(例如，在10％甲醛中固定24小时)，包埋(例如，在石蜡中)，切片(例如1至10μm，例如5μm)，并安装。

可使用适当的抗体(例如，可使用对用于攻击受试者的病毒具有特异性的多克隆抗体或单克隆抗体，也可以使用对不同流感病毒株具有交叉反应性的多克隆抗体或单克隆抗体)通过免疫组织化学来评价流感病毒的抗原分布。预期使用本文公开的组合物将降低或甚至消除接受灭活流感病毒组合物的受试者的病毒滴度。例如，与未接受灭活流感病毒组合物的受试者(例如，空白疫苗接种者)相比，预期接受灭活流感病毒组合物的受试者肺中的病毒会少至少10倍、至少20倍、至少50倍、甚至100倍。在另一个实例中，预期使用本文公开的组合物将在接受该组合物的受试者中减少或甚至消除流感感染的症状，例如支气管炎、细支气管炎、肺泡炎和/或肺水肿。例如，与未接受灭活流感病毒组合物的受试者(例如，空白疫苗接种者)相比，预期接受灭活流感病毒组合物的受试者的支气管炎、细支气管炎、肺泡炎和/或肺水肿会减少至少20％、至少50％、至少75％或至少90％(或这些症状严重性的这种降低)。

6.其他示例性测定

在一些实例中，评估受试者的呼吸道IgA和全身性IgG，T-细胞反应。这样的方法是常规的(例如，参见Gauger et al.,Methods Mol Biol.1161:303-12,2014；Larsen etal.,Vet Microbiol.74(1-2):117-31,2000；Steitz et al.,PLoS One.5(5):e10492,2010)。

在一些实例中，通过转录组学和细胞因子ELISA或其他细胞因子免疫测定法分析免疫反应。这种方法是常规的。

在一些实例中，通过微中和分析免疫反应。这样的方法是常规的(例如，参见Gauger et al.,Methods Mol Biol.1161:313-24,2014)。

在一些实例中，通过抗HA茎测定法分析免疫反应。这样的方法是常规的(例如，Wuet al.,PLoS One 7(8):e42363,2012)。

提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方式。这些实施例不应被解释为将本公开限制为所描述的特定特征或实施方式。

实施例

实施例1：作为通用型流感疫苗的化学灭活流感病毒混合物

该实施例描述了评价由BPL灭活的低致病性禽流感病毒亚型混合物组成的流感病毒疫苗的研究。第一疫苗混合物包括具有HA亚型H1、H3、H5和H7的流感病毒，且第二疫苗混合物包括具有HA亚型H2、H4、H9和H10的流感病毒(见图3)。测定中使用的流感病毒是一价的(例如，仅包括单一或单独的HA亚型。

将由4种不同的BPL灭活的全流感病毒组成的四价疫苗(A/mallard/Ohio/265/1987(H1N9)、A/pintail/Ohio/339/1987(H3N8)、A/mallard/Maryland/802/2007(H5N1)和A/Environment/Maryland/261/2006(H7N3))与病毒样颗粒(VLP)疫苗进行比较，所述VLP疫苗包含表达来自相同病毒的HA的VLP。图1显示了用四价流感VLP疫苗或用BPL灭活的全病毒四价流感病毒疫苗接种的小鼠的倒数HAI滴度。显示了针对H1N1、H3N8、H5N1和H7N3的滴度。结果表明，两种疫苗均可引起广泛的异源亚型免疫反应。

在小鼠中评估了BPL灭活的流感病毒疫苗针对流感病毒攻击提供保护的能力。用BPL灭活的疫苗肌内(IM)或鼻内(IN)接种小鼠，并在三周后加强(图2A)。首次免疫后50天，用H6N1、H7N1、H10N1或H10N7流感病毒对接种的小鼠进行攻击。如图2B所示，所有IN或IM疫苗接种的小鼠在每种流感病毒的攻击下均存活，而空白疫苗接种的小鼠在攻击后6-8天死亡。

进行另一项研究以评估由第二疫苗混合物引起的免疫反应，该第二疫苗混合物由4种不同的BPL灭活的全流感病毒组成(A/green-winged teal/Ohio/175/1986(H2N1)、A/green-winged teal/Ohio/344/1986(H4N2)、A/Mallard/Maryland/798/2007(H9N1)和A/Mallard/Ohio/99/1989(H10N7))。给小鼠接种H2/H4/H9/H10四价疫苗，并测定针对H1N1、H6N1、H7N1和H15N1的倒数HAI滴度。结果表明，H2/H4/H9/H10四价疫苗引发了广泛的异源亚型免疫反应。

在小鼠中还评估了BPL-灭活的H2/H4/H9/H10四价流感病毒疫苗针对流感病毒攻击提供保护的能力。小鼠进行空白疫苗接种或用H2/H4/H9/H10四价疫苗进行IM或IN接种，并在三周后加强。在第一次免疫之后50天用H1N1、H6N1、H7N1或H15N1流感病毒攻击疫苗接种小鼠。疫苗接种小鼠针对H1和H6攻击显示90％的存活(图4A和4B)，并且针对H7和H15攻击显示100％存活(图4C和4D)。疫苗接种(IN或IM)还赋予了针对同型病毒(H10N1)攻击的100％保护(图4E)。

为评价由八种不同的BPL-灭活的全流感病毒(A/mallard/Ohio/265/1987(H1N9)、A/pintail/Ohio/339/1987(H3N8)、A/mallard/Maryland/802/2007(H5N1)、A/Environment/Maryland/261/2006(H7N3)、A/green-winged teal/Ohio/175/1986(H2N1)、A/green-winged teal/Ohio/344/1986(H4N2)、A/Mallard/Maryland/798/2007(H9N1)和A/Mallard/Ohio/99/1989(H10N7))组成的疫苗混合物引发的免疫反应进行了额外的研究。用H1/H3/H5/H7/H2/H4/H9/H10八价疫苗对小鼠进行接种，并且测定针对H1N1、H3N8、H5N1和H7N3(和/或其他流感病毒)的倒数HAI滴度。预计八价疫苗将产生广泛的、异源亚型免疫反应。

在小鼠中评价BPL-灭活的H1/H3/H5/H7/H2/H4/H9/H10八价疫苗针对流感病毒攻击提供保护的能力。将小鼠用八价疫苗进行IM或IN接种，并在三周后加强。在第一次免疫之后用H2N2、H6N1、H11N1或H15N1流感病毒攻击疫苗接种小鼠。预计进行了IN或IM疫苗接种的小鼠将在每种流感病毒攻击下存活。

实施例2：在雪貂中测试灭活流感病毒疫苗

未被流感感染的(influenza

)纯种雪貂(Mustela putorius furo，雌性，6-12月龄)购自Marshall Farms(Sayre,PA,USA)。将雪貂成对饲养在包括Sani-chips实验动物垫料(Sani-chips Laboratory Animal Bedding)(P.J.Murphy Forest Products,Montville,NJ,USA)的不锈钢笼中(Shor-line,Kansas City,KS,USA)。向雪貂提供Teklad全球雪貂饮食(Teklad Global Ferret Diet)(Harlan Teklad,Madison,WI,USA)并随意饮水。

对雪貂进行空白疫苗接种或用四价疫苗进行IN或IM接种，该四价疫苗由4种不同的BPL灭活的全流感病毒组成：A/mallard/Ohio/265/1987(H1N9)、A/pintail/Ohio/339/1987(H3N8)、A/mallard/Maryland/802/2007(H5N1)和A/Environment/Maryland/261/2006(H7N3)。每个疫苗接种组中包括两只雪貂。在疫苗接种后4周用抗原性变体和致病性病毒株A/Port Chalmers/1971(H3N2)和A/swine/Iowa/1931(H1N1)攻击雪貂。疫苗接种雪貂对两种病毒株的攻击均提供了显著的保护。在两种情况下，与空白疫苗接种的动物相比，疫苗接种动物在第5天显示出病毒鼻腔洗出液滴度降低10³至10⁴log(图5A)，并且显示出明显更少的肺病理(图5B)。

在另一项实验中，用H2和H10流感病毒攻击接种了四价H1/H3/H5/H7疫苗的雪貂以评估疫苗接种雪貂中的异源亚型保护。确定了用四价疫苗进行接种的雪貂与空白疫苗接种的动物相比体重减轻更少。预计疫苗接种动物的肺和鼻腔洗出液样品中的病毒滴度也更低。

在其他研究中，在第0周对雪貂IN施用了两剂量的灭活流感病毒疫苗(如四价H1/H3/H5/H7、四价H2/H4/H9/H10或八价H1/H3/H5/H7/H2/H4/H9/H10)，然后在第3周用相同剂量加强。在疫苗接种方案期间，每周监测动物的不良事件，包括体重减轻、体温下降、活动减少、鼻涕、打喷嚏和腹泻。在接种疫苗之前，通过HAI测定确认动物对循环甲型和乙型流感病毒为血清阴性的。在每次疫苗接种后14至21天，通过前腔静脉从麻醉的雪貂收集血液，并将其转移到微量离心管中。将试管离心，除去血清，并在-80±5℃下冷冻。例如通过HAI血清抗体滴度分析血清的免疫反应。

在最终疫苗接种后的一到三周，分别用致死量(10xMLD₅₀)的多种致病性流感病毒对雪貂进行鼻内攻击，该致病性流感病毒包括1918H1N1、1957H2N2、1968H3N2和2009H1N1大流行病毒，高致病性H5N1、H7N9，以及H6N1禽流感病毒和其他相关攻击病毒。感染后，每天监测雪貂的体重减轻，疾病征象和感染后14天内的死亡。接种后每天记录每组的个体体重、疾病评分和死亡。接种后7天内每天将3ml PBS滴注到麻醉的雪貂的鼻孔中进行鼻腔洗涤。收集洗出液，并在-80℃下保存直至使用。也可以收集血清。

对雪貂的存活和疫苗诱导的免疫力进行评估，例如，通过血凝抑制、微中和和抗HA茎部测定以及神经氨酸酶抑制测定。还通过转录组学和细胞因子ELISA对疫苗接种动物的呼吸道IgA和全身性IgG、T细胞反应、病毒肺滴度和病理以及免疫反应进行评估。

预期灭活流感病毒混合物将保护雪貂免受所有这些病毒的攻击。

实施例3：人临床试验

在实验动物中选择最佳的广泛交叉反应性灭活流感病毒疫苗后，在人类志愿者中进行研究。在一些实例中，疫苗将包括适合人使用的佐剂。

将使用GMP方法(如四价H1/H3/H5/H7、四价H2/H4/H9/H10或八价H1/H3/H5/H7/H2/H4/H9/H10)产生包括灭活(如BPL-灭活)的全流感病毒的鼻内疫苗制剂，并施用到人鼻内。本领域技术人员将理解，可类似地检测本文提供的其他灭活流感病毒疫苗组合物。

简言之，将人用流感疫苗组合物进行鼻内疫苗接种。在约3-12周后(如3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周后)用相同混合物对该人进行加强。第二组人进行空白疫苗接种(例如，用生理盐水)。获取并储存血液和鼻样品。在研究过程中监测患者的任何不良事件。由于灭活疫苗无感染性，预期它们具有优异的安全性。

如果在I期试验中证明疫苗组合物是安全的，则使用NIH临床中心开发的人志愿者流感攻击模型进行II期功效试验(例如，参见Memoli et al.,Validation of a Wild-TypeInfluenza A Human Challenge Model:H1N1pdMIST,An A(H1N1)pdm09Dose Finding INDStudy)。对受试者进行健康状况筛查，并通过HAI测定针对2009年大流行H1N1病毒的低滴度(<1:10)进行筛查。筛选出的参加本研究的患者用灭活流感病毒疫苗(第1组)进行鼻内接种或给予生理盐水空白疫苗接种(第2组)。他们在第3周进行加强，然后在第6周通过HAI或其他测定来评估其血清学滴度，受试者用在攻击前HAI滴度<1:10的>60％受试者中经验证诱发流感疾病并排除(shedding)的病毒剂量进行攻击。通过对疫苗接种的血清学反应的发展、症状减轻、病毒滴度减少和/或病毒排除时间(duration of viral shedding)减少来评估疫苗效力。

鉴于可以应用本公开原理的许多可能的实施方式，应当认识到所示出的实施方式仅是本发明的示例，并且不应被视为对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附权利要求限定。因此，我们要求将所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明作为本发明。

Claims

1.组合物，包含：

第一甲型流感病毒，其包含第一亚型的血凝素(HA)；

第二甲型流感病毒，其包含第二亚型的HA；

第三甲型流感病毒，其包含第三亚型的HA；和

第四甲型流感病毒，其包含第四亚型的HA，

其中所述第一、第二、第三和第四甲型流感病毒是灭活的。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少一种选自H3、H4、H7、H10、H14和H15。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少两种选自H3、H4、H7、H10、H14和H15。

4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少一种选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四HA亚型中的至少两种选自H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四HA亚型是H1、H3、H5和H7。

7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三和第四HA亚型是H2、H4、H9和H10。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，进一步包含第五甲型流感病毒，其包含第五亚型的HA，其中所述第五甲型流感病毒是灭活的。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，进一步包含第六甲型流感病毒，其包含第六亚型的HA，其中所述第六甲型流感病毒是灭活的。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，进一步包含第七甲型流感病毒，其包含第七亚型的HA，其中所述第七甲型流感病毒是灭活的。

11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，进一步包含第八甲型流感病毒，其包含第八亚型的HA，其中所述第八甲型流感病毒是灭活的。

12.如权利要求8-11中任一项所述的组合物，其中所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和/或第八HA亚型选自H1、H2、H3、H4、H5、H7、H9和H10。

13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述甲型流感病毒是化学灭活的。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述甲型流感病毒是用β-丙内酯(BPL)化学灭活的。

15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，进一步包含药学上可接受的载体。

16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，进一步包含佐剂。

17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其被配制用于鼻内施用。

18.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其被配制用于肌内施用。

19.一种容器，包含如权利要求1-18中任一项所述的组合物。

20.如权利要求19所述的容器，其中所述容器是注射器或小瓶。

21.在受试者中引发对流感病毒的免疫反应的方法，包括对受试者施用治疗有效量的如权利要求1-18中任一项所述的组合物，从而在受试者中引发对流感病毒的免疫反应。

22.使受试者对流感病毒免疫的方法，包括对受试者施用治疗有效量的如权利要求1-18中任一项所述的组合物，从而使受试者对流感病毒免疫。

23.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述组合物肌内施用。

24.如权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述组合物鼻内施用。

25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物或禽类。

26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述的人是成年人受试者。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述的人是未成年人受试者。

29.如权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述方法提供异源亚型免疫反应。

30.如权利要求29所述的方法，其中：

所述第一、第二、第三和第四HA亚型是H1、H3、H5和H7，并且所述异源亚型免疫反应赋予针对流感H2、H4、H6和/或H10感染的至少部分保护；

所述第一、第二、第三和第四HA亚型是H2、H4、H9和H10，并且所述异源亚型免疫反应赋予针对流感H1、H3、H5、H6和/或H7感染的至少部分保护；

所述第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八HA亚型是H1、H2、H3、H4、H5、H7、H9和H10，并且所述异源亚型免疫反应赋予针对流感H6和/或H8感染的至少部分保护。

31.试剂盒，包含如权利要求19或权利要求20所述的容器。

32.如权利要求31所述的试剂盒，进一步包含所述组合物的施用说明和/或所述组合物的组分描述。