JP2017525766A - アルキル化インフルエンザワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、１つ以上のアルキル化システイン残基を含むヘマグルチニンに基づく改良型インフルエンザワクチンを提供する。特に、本発明は、アルキル化剤で処理したヘマグルチニンを含有するインフルエンザワクチンおよびその製造方法を提供する。本発明が提供する本発明のインフルエンザワクチンは、貯蔵に際しても一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによる測定力価を保持する優れた性能を有する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年８月１８日に出願された米国仮出願第６２／０３８，７５３号の優先権を主張し、当該出願の全体を参照として本明細書において援用する。

流行性および新型インフルエンザは毎年発生し、世界中で深刻な罹患および死亡の原因となっている。インフルエンザウイルスは、２つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）からなる高度に多形性の粒子である。ＨＡは、宿主細胞へのウイルスの付着、およびウイルスが細胞内へ浸透する際のウイルス‐細胞膜間の融合を媒介する。したがって、インフルエンザワクチンは、通常、疾患株に適合した有効量のＨＡを含み、疾患株に対する中和抗体の産生を誘導する。

一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイは、インフルエンザワクチン中のヘマグルチニン（ＨＡ）含量を測定するために用いられ、１９７８年以来、食品医薬品局によって米国内での使用を認可されたインフルエンザウイルスワクチンの力価を測定する目的で使用されている。具体的には、ＳＲＩＤは、特異的抗ＨＡ抗体を用いてインフルエンザワクチン中のＨＡ含量を測定する。ワクチン試料を、株特異的抗血清を含有する寒天プレート上に塗布する。通常、プレートを湿室内にて室温下でインキュベートし、抗原が拡散できるようにする。抗原と抗体との反応は、沈降ゾーンを生成する（沈降輪の形態で）。ワクチン試料中のＨＡ含量は、試料の環径を、濃度既知の参照用ＨＡタンパク質の環径と比較することによって定量できる。前記ＨＡ含量に基づいて、検査したワクチンの力価を得ることができる。

本発明は、とりわけ、貯蔵に際してもＳＲＩＤ測定による力価を保持する性能に優れた改良型インフルエンザワクチンを提供する。本発明は、ＨＡ抗原をアルキル化剤（例えば、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ））に曝すと、貯蔵後におけるＳＲＩＤ測定によるＨＡ力価の喪失が有意に低減するという驚くべき発見に部分的に基づく。例えば、実施例の節に記載するように、本発明者らは、いくつかのＩＯＡＭ処理したＨＡ抗原に関して、ＳＲＩＤアッセイによって測定した力価が、６ヶ月の貯蔵の後にもわずかに約１〜５％の喪失しか示さなかったことを実証した。特定の理論に拘泥するわけではないが、ＨＡ力価の経時的な喪失に関しての予想されるメカニズムは、分子間システイン結合の形成であると考えられる。これらの共有結合は、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔによる前処理時のＨＡロゼットマクロ構造の解離を妨げ、それによってゲルマトリックスを介しての移動を制限し、結果として抗血清との相互作用を減少させる。アルキル化剤による処理は、ＨＡ抗原の反応性システイン基のアルキル化をもたらし、分子間ジスルフィド結合の形成を防止する。結果として、本発明が提供するアルキル化ＨＡ抗原は、貯蔵後におけるＳＲＩＤ測定による力価をより良好に保持し得る。ＳＲＩＤは、インフルエンザワクチンに対して最も一般的に使用されるＨＡ力価の測定方法であり、ＦＤＡおよび他の主要な保健医療当局に現在受け入れられている唯一の試験法であることから、本発明により、必要とされる力価をワクチンの耐用期間中に保持可能なワクチンを製造することが可能になる。

一態様では、本発明は、１つ以上のアルキル化システイン残基を含むヘマグルチニンを含むインフルエンザワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンは、１〜５、１〜４、１〜３、２〜５、２〜４、２〜３、３〜５、３〜４、または４〜５個のアルキル化システイン残基を含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンは、１、２、３、４、または５個のアルキル化システイン残基を含む。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニン中に存在する全システイン残基の約１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、１〜２０％または１〜１０％が、１つ以上のアルキル化システイン残基で構成される。いくつかの実施形態では、ヘマグルチニンに存在する全システイン残基の約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％が、１つ以上のアルキル化システイン残基で構成される。いくつかの実施形態では、実質的に全ての遊離システイン残基がアルキル化される。いくつかの実施形態では、アルキル化システイン残基はメチル化システイン残基を含む。いくつかの実施形態において、ヘマグルチニンは、非特異的なアルキル化および／または遍在性のメチル化を有さない。いくつかの実施形態において、アルキル化システイン残基は、質量分析によって決定する。

別の態様では、本発明は、アルキル化剤で処理したヘマグルチニンを含むインフルエンザワクチンを提供する。本明細書で使用する場合、本発明に適したアルキル化剤は、システインスルフヒドリル基をアルキル化できる任意の化合物であってもよい。いくつかの実施形態において、アルキル化剤は、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）、ヨード酢酸、２‐ブロモアセトアミド、グルタチオンブロモアセトアミド、ブロモ酢酸、１，３‐プロパンスルトン、メチルメタンチオスルホン酸、メトキシカルボニルメチルジスルフィド、マレアミド、マレイミド‐ＰＥＧ、ビニルピリジン、Ｎ‐エチルマレイミド、トシルアセトアミド、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）である。

様々な実施形態において、本発明に適したヘマグルチニンは、カリフォルニアもしくはソロモン株に存在するＨ１タンパク質、ブリスベン、フロリダ、オハイオ、江蘇もしくは香港株に存在するＢタンパク質、および／または、あるいはビクトリア、パース、ブリスタンもしくはウィスコンシン株に存在するＨ３タンパク質である。

いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、スプリットインフルエンザウイルスワクチンである。いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、遺伝子組換えインフルエンザワクチンである。いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、卵ベースのインフルエンザワクチンである。いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ウイルス細胞、真菌もしくは藻類、または合成細胞において産生する。いくつかの実施形態では、適切な動物細胞として、昆虫細胞、哺乳類細胞、ならびに、発育鶏卵、ニワトリ胚細胞、およびアヒル細胞株などの鳥類細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、１価、２価、３価または４価のインフルエンザワクチンである。

いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、１〜３０℃の温度範囲で約６ヶ月貯蔵した場合に、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイで測定する力価の約９０％以上（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）を保持する。

いくつかの実施形態では、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、アルキル化剤を実質的に含まない。

さらに別の態様において、本発明は、精製ヘマグルチニン抗原またはヘマグルチニン含有ウイルス粒子をアルキル化剤で処理する工程を含むヘマグルチニンのアルキル化方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に適したヘマグルチニン含有ウイルス粒子はスプリットウイルスである。いくつかの実施形態では、本発明に適した精製ヘマグルチニン抗原は、精製した表面抗原である。いくつかの実施形態では、本発明に適した精製ヘマグルチニン抗原は、精製組換えヘマグルチニンタンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明に適したヘマグルチニンは、カリフォルニアもしくはソロモン株に存在するＨ１タンパク質、ブリスベン、フロリダ、オハイオ、江蘇もしくは香港株に存在するＢタンパク質、またはビクトリア、パース、ブリスタンもしくはウィスコンシン株に存在するＨ３タンパク質から選択される。

さらに別の態様では、本発明は、卵ベースまたは細胞培養ベースの産生系により産生したインフルエンザウイルスから得られるウイルス粒子をアルキル化剤で処理する工程を含むインフルエンザワクチンの製造方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明に適したウイルス粒子は、インフルエンザウイルスを分解することによって得られる。

さらなる態様において、本発明は、インフルエンザワクチンの製造方法を提供し、前記方法は、卵ベースまたは細胞培養ベースの産生系からインフルエンザウイルスを採集し、インフルエンザウイルスを分解（スプリット）し、スプリットインフルエンザウイルスをアルキル化剤で処理し、処理したスプリットインフルエンザウイルスを不活化することを含む。

様々な実施形態において、前記分解工程は、インフルエンザウイルスを界面活性剤で処理する工程を含む。いくつかの実施形態では、適切な界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）（親水性ポリエチレン鎖を有する非イオン性界面活性剤）、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノールエトキシレート、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、および／またはデオキシコール酸ナトリウムから選択される。いくつかの実施形態では、界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ‐１０１、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）７２０および／またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐２００）である。

いくつかの実施形態において、適切なアルキル化剤は、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）、ヨード酢酸、２‐ブロモアセトアミド、グルタチオンブロモアセトアミド、ブロモ酢酸、１，３‐プロパンスルトン、メチルメタンチオスルホン酸、メトキシカルボニルメチルジスルフィド 、マレアミド、マレイミド‐ＰＥＧ、ビニルピリジン、Ｎ‐エチルマレイミド、トシルアセトアミド、およびそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、適切なアルキル化剤は、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）である。

いくつかの実施形態では、本発明に適したインフルエンザウイルスは、卵ベースの産生系により産生する。いくつかの実施形態では、適切なインフルエンザウイルスは、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ウイルス細胞、真菌または藻類において産生する。いくつかの実施形態において、適切な動物細胞として、昆虫細胞、哺乳類細胞、ならびに、発育鶏卵、ニワトリ胚細胞、およびアヒル細胞株などの鳥類細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

いくつかの実施形態において、前記処理工程は、１〜３０℃の範囲の温度で、本明細書に記載の精製ヘマグルチニン抗原、ヘマグルチニン含有ウイルス粒子、ウイルス粒子、またはスプリットインフルエンザウイルスをアルキル化剤とともにインキュベートする工程を含む。いくつかの実施形態において、適切な温度は室温である。いくつかの実施形態では、適切な温度範囲は、１〜５℃、２〜８℃、５〜１０℃、１０〜１５℃、１５〜２０℃、２０〜２５℃、または２５〜３０℃である。

いくつかの実施形態では、前記処理工程は、本明細書に記載の精製ヘマグルチニン抗原、ヘマグルチニン含有ウイルス粒子、ウイルス粒子、またはスプリットインフルエンザウイルスを、アルキル化剤とともに、約２４時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、１．５時間、１時間、５０分間、４０分間、３０分間、２０分間、または１０分間の時間にわたってインキュベートすることを含む。

いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、ヘマグルチニン（ＨＡ）‐システイン濃度に対して約１倍モル過剰の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、ヘマグルチニン（ＨＡ）‐システイン濃度に対して約１倍〜１００倍、５倍〜８５倍、１倍〜５０倍、または５倍〜５０倍モル過剰の濃度範囲で存在する。

いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１ｍＭ〜１Ｍ、１ｍＭ〜５００ｍＭ、１ｍＭ〜４００ｍＭ、１ｍＭ〜３００ｍＭ、１ｍＭ〜２００ｍＭ、または１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲で存在する。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、または５００ｍＭの濃度で存在する。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１μｇ／ｍｌ〜１，０００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で存在する。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理する工程は、ヘマグルチニンの１つ以上のシステイン残基のアルキル化をもたらす。いくつかの実施形態において、アルキル化剤で処理する工程は、１〜５、１〜４、１〜３、２〜５、２〜４、２〜３、３〜５、３〜４、または４〜５個のシステイン残基のアルキル化をもたらす。いくつかの実施形態において、アルキル化剤で処理する工程は、１、２、３、４、または５個のシステイン残基のアルキル化をもたらす。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理する工程は、ヘマグルチニン中に存在する全システイン残基の約１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、または１〜２０％のアルキル化をもたらす。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理する工程は、ヘマグルチニンを提示するシステイン残基全体の約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のアルキル化をもたらす。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理する工程は、ヘマグルチニンに存在する実質的に全ての遊離システイン残基のアルキル化をもたらす。いくつかの実施形態では、アルキル化剤による処理は、非特異的なアルキル化をもたらさない。いくつかの実施形態では、アルキル化剤による処理は、遍在性のメチル化をもたらさない。

様々な実施形態において、アルキル化剤によって処理することにより、同一のインフルエンザワクチンをアルキル化剤で処理しない場合と比較して、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）法によって測定するインフルエンザワクチンの力価の喪失は減少する。

いくつかの実施形態では、アルキル化剤によって処理することにより、インフルエンザワクチンを３０日間１〜３０℃で貯蔵した場合に、ＳＲＩＤ測定による力価の喪失は約５０％以下（例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％以下）であった。

いくつかの実施形態において、アルキル化剤で処理する工程は、インフルエンザウイルスを不活化する工程の前に実施する。別の実施形態では、アルキル化剤で処理する工程は、インフルエンザウイルスを不活化する工程と同時に実施する。

いくつかの実施形態において、不活化工程は、インフルエンザウイルスを紫外線または化学的不活化剤で処理する工程を含む。いくつかの実施形態では、不活化工程は、インフルエンザウイルスを、β‐プロピオラクトン、デオキシコール酸ナトリウムおよび／またはホルマリンから選択される化学的不活化剤で処理することを含む。特定の実施形態では、不活化工程は、インフルエンザウイルスをホルマリンで処理する工程を含む。

いくつかの実施形態において、本発明による方法は、アルキル化剤を除去する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、アルキル化剤をダイアフィルトレーションによって除去する。いくつかの実施形態では、アルキル化剤を化学的不活化剤と共に除去する。

とりわけ、本発明は、本明細書に記載の方法に従って製造するインフルエンザワクチンを提供する。様々な実施形態において、本発明が提供するインフルエンザワクチンは、１価、２価、３価または４価のインフルエンザワクチンである。様々な実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンは、単一用量、複数用量、成人用量または小児用量のワクチンとして提供することができる。いくつかの実施形態では、各個別用量を、バイアル、小児用注射器などのシリンジ、または他のタイプの容器内に存在させてもよい。様々な実施形態において、本発明のインフルエンザワクチンを、皮内、筋肉内、皮下、静脈内、および他の投与方式のために製剤化してもよい。さらなる投薬、製剤、投与経路を、本明細書の例えば「免疫原性ワクチン組成物」の節に記載する。

本明細書で使用する、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定する「力価」または「安定性」は、それぞれ「見なし力価」または「見なし安定性」を包含する。

本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲において明らかである。しかしながら、これらの詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示すものの、それらは例示としてのみ与えられ、制限するものではないことは理解すべきである。本発明の範囲内における様々な変更および修正は、当業者に明らかなものとなる。

図面は単に説明を目的とするものであり、制限することを意図するものではない。

異なる株由来データに基づく、ＳＲＩＤによる力価喪失率とＨＡ内の遊離 チオールとの相関を図示する例示的なデータを示す。 バイオインフォマティクス解析によって、システイン残基がＨＡ株において高度に保存されていることを示す例示的なデータを示す。 ＨＡロゼット形成に起因するＨＡ力価喪失へのシステインの関与を図示する例示的な模式図を示す。 様々なＧＲＡＳ賦形剤、還元剤、およびアルキル化剤２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）を添加した後のＨＡ力価喪失を図示する例示的なデータを示す。 ＨＡをアルキル化剤で処理することによりＨＡ力価喪失が低減する、その背景にある例示的な構造メカニズムを示す。 特定の株においてＩＯＡＭ添加の順序が重要である可能性を図示する例示的なデータを示す。 インフルエンザワクチン製造用の例示的なプロセスを示す。 ＨＡ力価の安定化に対するＩＯＡＭ濃度の影響を図示する例示的なデータを示す。 ＩＯＡＭ処理した試料の例示的なアミノ酸分析結果を示す。Ｄ群では試料中にＩＯＡＭが残存していたが、Ｇ群ではＩＯＡＭが除去されていた。 ＩＯＡＭ処理したインフルエンザワクチン中の遊離システイン濃度を、未処理の試料と比較した例示的な定量結果を示す。 ＩＯＡＭ処理したインフルエンザワクチン中の遊離システイン濃度を、未処理の試料と比較した例示的な定量結果を示す。 ＩＯＡＭ処理したワクチン試料の６ヶ月間でのＨＡ安定性に関する結果を図示する例示的データを示す。 ＩＯＡＭ処理したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンが、ＩＯＡＭ処理しない対照ワクチンと比較して、マウスモデルにおいて少なくとも同等の免疫原性を全般的に示したことを図示する例示的なデータを示す。 ＩＯＡＭ処理したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンが、ＴＩＶ‐ＨＤプロセスでＩＯＡＭを用いずに調製したＨＡ抗原に類似したＨＡＩアッセイ力価のＡＵＣ反応を全般的に示したことを図示する例示的なデータを示す。

定義
本発明の理解をより容易なものとするために、最初にいくつかの用語を以下で定義する。以下の用語および他の用語に関するさらなる定義は、本明細書の随所において明示する。

アジュバント：本明細書中で使用する場合、用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を非特異的に高める物質またはビヒクルを指す。アジュバントは、抗原を吸着する無機物（ミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸塩）の懸濁液、または、抗原溶液をミネラルオイル（例えば、フロイント不完全アジュバント）中に乳化させ、時には死滅させたマイコバクテリアを含有させて（フロイント完全アジュバント）抗原性をさらに高めた油中水型エマルジョンを含むことができる。免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むもの）もアジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、第６，２０７，６４６号、第６，２１４，８０６号、第６，２１８，３７１号、第６，２３９，１１６号、第６，３３９，０６８号、第６，４０６，７０５号、および第６，４２９，１９９号を参照）。アジュバントは、共刺激分子のような生物学的分子も含む。生物学的アジュバントの例として、ＩＬ‐２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ、Ｇ‐ＣＳＦ、ＬＦＡ‐３、ＣＤ７２、Ｂ７‐１、Ｂ７‐２、ＯＸ‐４０Ｌおよび４１ＢＢＬが挙げられる。

投与：本明細書中で使用する場合、組成物を対象に「投与」するとは、組成物を対象に与える、塗布する、または接触をもたらすことを意味する。投与は、例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、くも膜下腔内および皮内などの多くの経路のいずれかによって行うことができる。

およそ（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）または約（ａｂｏｕｔ）：本明細書中で使用する場合、関心対象の１つ以上の値に付記する「およそ（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載する基準値に類似する値を指す。ある実施形態では、「およそ（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、記載の値のいずれかの方向（より大きいまたはより小さい方向）に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に収まるような範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

アルキル化剤：本明細書中で使用する場合、用語「アルキル化剤」は、ある分子から別の分子へアルキル基を転移できる任意の化学物質または非化学物質を指す。アルキル基は、アルキルカルボカチオン、カルバニオン、フリーラジカル、カルビン、およびメチル基を含むことができる。アルキル化は、その最も単純な形態であるメチル化、すなわち炭素基１個のみの転移を包含し得る。いくつかの実施形態において、用語「アルキル化剤」は、メチル化剤を含む。

動物：本明細書中で使用する場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある実施形態では、非ヒト動物は哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物として、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫類が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、および／またはクローン体であってもよい。

抗体：本明細書中で使用する場合、用語「抗体」は、特定のアミノ酸配列を有するＢリンパ球細胞によって産生する免疫グロブリン分子を指す。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトまたは他の動物において特異的抗原（免疫原）によって誘発される。抗体は、いくつかの実証可能な方式で抗原と特異的に反応することを特徴とし、抗体と抗原はそれぞれ他方との関係において規定される。「抗体応答を誘発する」とは、抗原または他の分子が抗体の産生を誘導する能力を指す。いくつかの実施形態では、用語「抗体」は、ＳＲＩＤアッセイなどのインビトロアッセイで使用する任意の組換え抗体を指し、前記抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドを含む。そのような抗体は、インタクトな免疫グロブリン、または免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥフラグメントの形態でそれぞれ存在してもよい。抗体フラグメントの例として、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

抗原：本明細書中で使用する場合、用語「抗原」は、動物に注入または吸収させる組成物を含有し、動物体内において抗体産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、特異的な液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。これには、異種免疫原によって誘導される免疫産物が含まれる。開示する組成物および方法のいくつかの実施形態において、インフルエンザＨＡタンパク質は抗原である。

改変：本明細書中で使用する場合、用語「改変」とは、人工的にアミノ酸配列を改変したポリペプチドを指す。例えば、改変したＨＡポリペプチドは、天然のインフルエンザ分離株中に見出されるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ＨＡポリペプチドは、ＮＣＢＩデータベースに含まれるＨＡポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。

Ｈ１ポリペプチド：本明細書中で使用する「Ｈ１ポリペプチド」は、そのアミノ酸配列中に、Ｈ１を特徴づけるとともにＨ１を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも１つの配列要素を含むＨＡポリペプチドである。

Ｈ３ポリペプチド：本明細書中で使用する「Ｈ３ポリペプチド」は、そのアミノ酸配列中に、Ｈ３を特徴づけるとともにＨ３を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも１つの配列要素を含むＨＡポリペプチドである。

Ｈ５ポリペプチド：本明細書中で使用する「Ｈ５ポリペプチド」は、そのアミノ酸配列中に、Ｈ５を特徴づけるとともにＨ５を他のＨＡサブタイプと区別する少なくとも１つの配列要素を含むＨＡポリペプチドである。

ヘマグルチニン（ＨＡ）：本明細書中で使用する場合、用語「ヘマグルチニン」、「ヘマグルチニンポリペプチド」または「ヘマグルチニンタンパク質」は、天然型または改変を含む組換え型ヘマグルチニンを指す。インフルエンザ分離株由来の多種多様なＨＡ配列が当該分野で公知である。実際、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）は、本出願の出願時点において、少なくとも９７９６種類のＨＡ配列を含むデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/）を保有している。このデータベースを参照する当業者は、ＨＡポリペプチド全般に特徴的な配列および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６ポリペプチド、または、例えば鳥類、ラクダ、イヌ、ネコ、シベット、エンビロンメント（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ストーンマーティン（ｓｔｏｎｅ ｍａｒｔｉｎ）、ブタ、トラ、クジラなどの特定の宿主の感染を媒介するＨＡ）に特徴的な配列を容易に同定することができる。

免疫応答：本明細書で使用する用語「免疫応答」は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージまたは多核球などの免疫系細胞の、抗原またはワクチンなどの刺激に対する応答を指す。免疫応答は、例えば、インターフェロンまたはサイトカインを分泌する上皮細胞などの、生体防御応答に関与する体内の任意の細胞を含み得る。免疫応答としては、自然免疫応答または炎症が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。本明細書中で使用する場合、防御免疫応答は、対象を感染から保護する（感染を予防するか、または感染に関連する疾患の発症を予防する）免疫応答を指す。免疫応答を測定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、リンパ球（Ｂ細胞またはＴ細胞など）の増殖および／または活性、サイトカインまたはケモカインの分泌、炎症、抗体産生などを測定することを含む。

免疫原：本明細書中で使用する場合、用語「免疫原」は、動物に注入または吸収させる組成物を含有し、適切な条件下で、動物体内における抗体産生またはＴ細胞応答などの免疫応答を刺激することができる化合物、組成物または物質を指す。本明細書中で使用する場合、「免疫原性組成物」は、免疫原（ＨＡポリペプチドなど）を含む組成物である。本明細書中で使用する場合、「免疫する」とは、ワクチン接種などによって対象に感染症からの保護を与えることを意味する。

インビトロ：本明細書中で使用する場合、用語「インビトロ」は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば試験管または反応容器中、細胞培養中などで生じる事象を指す。

インビボ：本明細書中で使用する場合、用語「インビボ」は、多細胞生物、例えばヒトおよび非ヒト動物体内で起こる事象を指す。細胞ベースの系においては、この用語は、（例えば、インビトロの系とは対照的に）生細胞内で起こる事象を指すために使用してもよい。

インフルエンザウイルス：本明細書で使用する場合、用語「インフルエンザウイルス」は、オルトミクソウイルス科に属する分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスを指す。インフルエンザウイルスには、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型の３タイプが存在する。インフルエンザＡ型ウイルスは、ヒト、ウマ、海洋哺乳類、ブタ、フェレット、およびニワトリなどの様々な鳥類および哺乳類に感染する。動物においては、インフルエンザＡ型ウイルスは、その多くが呼吸器および腸管に対して軽度の限局性感染を引き起こす。しかしながら、Ｈ５Ｎ１などの高病原性インフルエンザＡ株は、家禽類への全身感染を引き起こし、その死亡率は１００％に達する。２００９年においては、ヒトインフルエンザ発症の最も主要な原因はＨ１Ｎ１型インフルエンザであった。２００９年にブタ起源の新型インフルエンザＨ１Ｎ１が出現し、世界保健機関（ＷＨＯ）はパンデミックを宣言した。この株は「ブタインフルエンザ」と呼称された。Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルスは、１９１８年のスペイン風邪のパンデミック、１９７６年のフォートディックスのアウトブレイク、１９７７〜１９７８年のソ連風邪のパンデミックの原因ともなった。

インフルエンザワクチン：本明細書中で使用する場合、用語「インフルエンザワクチン」は、インフルエンザウイルス感染などの疾患の予防、改善または治療のために投与し、免疫応答を刺激できる免疫原性物質の調製物を指す。免疫原性物質としては、例えば、弱毒化もしくは死滅させた微生物（弱毒ウイルスなど）、または抗原性タンパク質、それらに由来するペプチドもしくはＤＮＡ、またはそのような免疫原性物質の任意の組換体が挙げられる。

分離：本明細書中で使用する場合、用語「分離」は、（ｉ）初期生成時に（天然もしくは実験的な設定下で）関連する成分の少なくともいくつかから分離させるか、または（ｉｉ）人工的に生成する薬剤または実体を指す。分離した薬剤または実体は、初期時の関連する他の成分に対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％ 少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれを上回る量で存在する。いくつかの実施形態において、分離した薬剤は、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の純度である。

アウトブレイク：本明細書中で使用する場合、インフルエンザウイルスの「アウトブレイク」とは、特定の年における単一の国に由来するウイルス分離株の集団を指す。

薬学的に許容可能なビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容可能な担体（ビヒクル）は、公知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）には、１つ以上の治療用組成物、例えば１つ以上のインフルエンザワクチンと追加の医薬品を医学的に送達するのに適した組成物および製剤が記載されている。一般に、担体の性質は、採用する特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容可能な流体を含む注射液を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル剤）の場合、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与する医薬組成物は、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤などの少量の非毒性の補助物質、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。

組換体：本明細書中で使用する場合、用語「組換体」は、天然に存在しない配列を有するか、または離れた２つの別個の配列部分の人工的な組合せによって作製する配列を有する組換え核酸もしくはタンパク質を指す。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成、またはより一般的には、単離した核酸部分の人為的操作、例えば遺伝子工学技術によって達成する。

組換えインフルエンザワクチン：本明細書中で使用する場合、用語「組換えインフルエンザワクチン」は、逆遺伝学的方法を用いて作製したインフルエンザワクチンを指し、ウイルス様粒子、ならびにＤＮＡおよびウイルスベクターに基づくワクチンを含むが、必ずしもこれらに限定するものではない。

ＳＲＩＤアッセイ：本明細書中で使用する場合、用語「ＳＲＩＤ」（一元放射免疫拡散）アッセイは、試料中のＨＡ抗原の量を定量するためのプロトコールを指す。一般に、ＳＲＩＤアッセイは、界面活性剤で可溶化したウイルスを配置したウェルの周囲に沈殿する抗原／抗体の量を測定し、Ａ型／カリフォルニア／０７／２００９のような公式標準抗原と比較することによりＨＡ濃度を決定することができる。具体的には、所定量のポリクローナル抗体を含有するアガロース溶液を、３〜４ｍｍの穴があけられた薄いゲル層中にプレーティングする。ＨＡ標準抗原の希釈物を、濃度未知のＨＡ試料とともにウェルに入れる。ゲルをインキュベートし、得られた沈降環を、ゲルのクーマシーブルー染色により可視化する。インフルエンザワクチンのＨＡ力価を計算するために、環径を測定し、標準曲線と比較する。

対象：本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、生きている多細胞脊椎動物を指し、このカテゴリーは、ヒト、および非ヒト霊長類のような非ヒト哺乳類の両方を含む。

実質的に：本明細書中で使用する場合、用語「実質的に」は、総量の８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より大きい量を指す。

ワクチン接種：本明細書中で使用する場合、用語「ワクチン接種」は、例えば病原体に対して免疫応答を起こすことを意図した組成物を投与することを指す。本発明の目的のために、ワクチン接種は、病原体への曝露の前、曝露中、および／または曝露の後に投与することができる。いくつかの実施形態では、病原体への曝露の前、曝露中、および／または曝露の直後に投与することができる。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、適切に間隔を空けた複数回のワクチン接種組成物の投与を含む。

野生型：当該技術分野で理解されているように、用語「野生型」は、自然界に見出されるような通常の形態のタンパク質または核酸を一般に指す。例えば、野生型ＨＡポリペプチドは、インフルエンザウイルスの天然分離株中に見出される。様々な異なる野生型ＨＡ配列を、ＮＣＢＩインフルエンザウイルス配列データベースに見出すことができる（ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLUから入手可能）。

詳細な説明
本発明は、とりわけ、１つ以上のアルキル化システイン残基を含むヘマグルチニンに基づく改良型インフルエンザワクチンを提供する。特に、本発明は、アルキル化剤で処理したヘマグルチニンを含有するインフルエンザワクチンおよびその製造方法を提供する。本発明が提供する本発明のインフルエンザワクチンは、貯蔵に際しても一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによる測定力価を保持する優れた性能を有する。
本発明の様々な態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。サブセクションの使用は、本発明を制限することを意図するものではない。各サブセクションは、本発明の任意の態様に適用してもよい。本出願において、「ｏｒ」の使用は、他に特段の記載がない限り、「ａｎｄ／ｏｒ」を意味する。

インフルエンザワクチン
本発明は、任意のインフルエンザワクチンに適用可能である。一般に、インフルエンザウイルスは、抗原の違いによってＡ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。インフルエンザウイルスＡ型は、例えば、Ａ型／北京／３５３／８９のように、サブタイプまたはタイプ、地理的起源、菌株番号、および分離した年を含む命名法によって記述する。少なくとも１８種のサブタイプのＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１８）および１１種のサブタイプのＮＡ（Ｎ１〜Ｎ１１）が存在する。Ｈ１〜Ｈ３およびＮ１〜Ｎ２などのいくつかのサブタイプは、ヒトにおいて一般的に認められる（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｗｅｂｓｔｅｒ，“Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．，１０９１‐１１５２（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９０））。

ＨＡに対する抗体は、ウイルスを中和し、インフルエンザによる感染に対する自然免疫の基礎を形成する（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ｅｄ．Ｒｏｎａｌｄ Ｗ．Ｅｌｌｉｓ，ｐｐ．１２９‐１５０（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ‐Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ．１９９２））。インフルエンザワクチンは、通常、中和抗体を誘発するのに適した有効量のＨＡを含有する。

インフルエンザＨＡ特異的中和ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の存在は、感染および病気に対する耐性と関連している（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９２）。不活化した全ウイルスまたは部分的に精製した（スプリットサブユニットの）インフルエンザワクチンを、各株のＨＡ量に対して標定する。認可されたインフルエンザワクチンの多くは、インフルエンザＡ型の２種のサブタイプウイルス（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）ならびに１種のインフルエンザＢ型のサブタイプウイルスに由来し、ホルマリンで不活化した全ウイルスまたは化学的に分解したサブユニット調製物を含む。

いくつかの実施形態では、インフルエンザＡ型およびＢ型ワクチンの種ウイルスは、鶏卵の尿膜腔液中に高力価で蓄積する天然起源の株である。あるいは、インフルエンザＡ型成分用の株は、適合する表面抗原遺伝子を有するリアソータントなウイルスである。リアソータントなウイルスとは、ウイルスゲノムのセグメント化により、各親株の特徴を有するウイルスである。２つ以上のインフルエンザウイルス株が細胞に感染すると、これらのウイルスセグメントは混合し、両方の親株由来の様々な種類の遺伝子を含む子孫ウイルス粒子が生成する。

本発明は、Ａ型、Ｂ型またはＣ型の任意のインフルエンザ株の様々なワクチンに適用してもよい。特に、本発明は、過去に存在したもの、現在に存在するもの、将来発生するものを含め、ヒトへの感染が可能な任意のＡ型、Ｂ型またはＣ型インフルエンザ株の様々なワクチンに適用してもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、異なる株のワクチンを含む様々なインフルエンザワクチンに適用してもよく、例として、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、およびＨ１８が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。いくつかの実施形態において、本発明の実施形態は、パンデミックまたは風土病菌株の様々なインフルエンザワクチンに適用することができ、例として、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ９、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１７Ｎ１０、およびＨ１８Ｎ１１が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

非限定的な例として、本発明は、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／アイルランド／１３７８／８３（Ｈ５Ｎ８）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／６３（Ｈ７Ｎ３）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／６６（Ｈ６Ｎ２）、Ａ株／シチメンチョウ／イングランド／６９（Ｈ７Ｎ２）、Ａ株／シチメンチョウ／スコットランド／７０（Ｈ６Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／Ｎ２８／７３（Ｈ５Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／１１０／７７（Ｈ６Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／６４７／７７（Ｈ１Ｎ１）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／オンタリオ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／１９９／７９（Ｈ７Ｎ７）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／オンタリオ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／アイルランド／１３７８／８５（Ｈ５Ｎ８）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／５０‐９２／９１（Ｈ５Ｎ１）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６８（Ｈ５Ｎ９）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／マサチューセッツ／６５（Ｈ６Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／オレゴン／７１（Ｈ７Ｎ３）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／オンタリオ／６２２８／６７（Ｈ８Ｎ４）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６６（Ｈ９Ｎ２）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／イングランド／６４７／７７（Ｈ１Ｎ１）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／ドイツ／３／９１、シチメンチョウインフルエンザウイルスＡ株／シチメンチョウ／ミネソタ／８３３／８０（Ｈ４Ｎ２）ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／インドネシア／０３（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ＦＰＶ／ロストック／１９３４、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／テキサス／２９８３１３／０４、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／テキサス／１６７２８０‐４‐／０２、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／香港／２２０／９７、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／イタリア／８／９８、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ビクトリア州／７／６（Ｈ７Ｎ７）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ドイツ／７９（Ｈ７Ｎ７）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／スコットランド／５９（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ペンシルバニア／１３７０／８３（Ｈ５Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ケレタロ‐１９／９５（Ｈ５Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ケレタロ‐２０／９５（Ｈ５Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／香港／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／イタリア／１４８７／９７（Ｈ５Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ライプツィヒ／７９（Ｈ７Ｎ７）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ビクトリア／１８５（Ｈ７Ｎ７）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ビクトリア／９２（Ｈ７Ｎ３）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／クイーンズランド／９５株（Ｈ７Ｎ３）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／パキスタン／１３６９／９５（Ｈ７Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／パキスタニ（Ｐａｋｉｓｔａｎｉ）４４７‐４／９５（Ｈ７Ｎ３）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／香港／Ｇ９／９７（Ｈ９Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ナコーン・パトム／タイ／ＣＵ‐Ｋ２／２００４（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／香港／３１．２／２００２（Ｈ５Ｎ１１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ベトナム／Ｃ５８／０４（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ベトナム／３８／２００４（Ｈ５Ｎ１）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／アラバマ／７３９５／７５（Ｈ４Ｎ８）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／４９（Ｈ１０Ｎ７）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／北京／１／９４（Ｈ９Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／香港／Ｇ２３／９７（Ｈ９Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／ペンシルバニア／８１２５／８３（Ｈ５Ｎ２）、ニワトリインフルエンザウイルスＡ株／ニワトリ／香港／９７（Ｈ５Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／安陽／ＡＶＬ‐１／０１、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／ニューヨーク／１７５４２‐４／８６（Ｈ９Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／アルバータ／２８／７６（Ｈ４Ｎ６）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／南昌／４‐１６５／２０００（Ｈ４Ｎ６）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／ドイツ／４９（Ｈ１０Ｎ７）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／ブラックダック／オーストラリア／７０２／７８（Ｈ３Ｎ８）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／ベトナム／１１／２００４（Ｈ５Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／香港／１９６／７７（Ｈ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／ウィスコンシン／１９３８／８０（Ｈ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／バイエルン／２／７７（Ｈ１Ｎ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／バイエルン／１／７７（Ｈ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／オーストラリア／７４９／８０（Ｈ１Ｎ１）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／香港／Ｙ２８０／９７（Ｈ９Ｎ２）、アヒルインフルエンザウイルスＡ株／アヒル／アルバータ／３５／７６Ｈ１Ｎ１）（例えばＡｕｓｔｉｎ ｅｔａ！．，１９９０参照）トリインフルエンザウイルスＡ株／マガモ／グリエフ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ５）、トリインフルエンザウイルスＡ株／マガモ／ＰＡ／１０２１８／８４（Ｈ５Ｎ２）、トリインフルエンザウイルスＡ株／マガモ／アストラハン／２４４／８２（Ｈ１４Ｎ６）、ガチョウインフルエンザウイルスＡ株／ガチョウ／広東／１／９６、ガチョウインフルエンザウイルスＡ株／ガチョウ／ライプツィヒ／１３７‐８／７９（Ｈ７Ｎ７）、ガチョウインフルエンザウイルスＡ株／ガチョウ／香港／Ｗ２２２／９７（Ｈ６Ｎ７）、ガチョウインフルエンザウイルスＡ株／ガチョウ／ライプツィヒ／１８７‐７／７９（Ｈ７Ｎ７）、ガチョウインフルエンザウイルスＡ株／ガチョウ／ライプツィヒ／１９２‐７／７９（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルスＡ株／Ｅｎｖ／香港／４３７‐４／９９、トリインフルエンザウイルスＡ株／Ｅｎｖ／香港／４３７‐６／９９、トリインフルエンザウイルスＡ株／Ｅｎｖ／香港／４３ ７‐８／９９、トリインフルエンザウイルスＡ株／Ｅｎｖ／香港／４３７‐１０／９９、トリインフルエンザウイルスＡ株／家禽ペストウイルス株／オランダ／２７（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルスＡ株／家禽ペストウイルス株／ドブソン／２７（Ｈ７Ｎ７）（例えばＨｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔａ！．，２００１参照）トリインフルエンザウイルスＡ株／家禽ペストウイルス株／ロストック／３４（Ｈ７Ｎ１）、トリインフルエンザウイルスＡ株／家禽ペストウイルス株／エジプト／４５（Ｈ７Ｎ１）、トリインフルエンザウイルスＡ株／家禽ペストウイルス株／ウェーブリッジ（Ｈ７Ｎ７）、トリインフルエンザウイルスＡ株／アジサシ／南アフリカ／６１（Ｈ５Ｎ３）、トリインフルエンザウイルスＡ株／アジサシ／オーストラリア／Ｇ７０Ｃ／７５（Ｈ１１Ｎ９）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ウズラ／ベトナム／３６／０４（Ｈ５Ｎ１）、トリインフルエンザウイルスＡ株／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、トリインフルエンザウイルスＡ株／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ハクチョウ／イタリア／１７９／０６（Ｈ５Ｎ１）、トリインフルエンザウイルスＡ株／香港／１５６／９７（Ａ／香港／１５６／９７）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ウズラ／香港／Ｇ１／９７（Ｈ９Ｎ２）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ウズラ／香港／ＡＦ１５７／９３（Ｈ９Ｎ２）、トリインフルエンザウイルスＡ株／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ミズナギドリ／西オーストラリア／２５７６／７９（Ｈ１５Ｎ９）、トリインフルエンザウイルスＡ株／ミズナギドリ／オーストラリア／７２（Ｈ６Ｎ５）、トリインフルエンザウイルスＡ株／香港／２１２／０３、トリインフルエンザウイルスＡ株／イングランド／３２１／７７（Ｈ３Ｎ２）、トリ由来トリＨ５Ｎ１型インフルエンザウイルスのトリパンデミックインフルエンザＡ型ウイルス、トリＨ７Ｎ１インフルエンザ株、トリＨ９Ｎ２インフルエンザウイルス、ならびにトリインフルエンザウイルス低温馴化（ｃａ）および温度感受性（ｔｓ）マスタードナー株Ａ型／レニングラード／１３４／１７／５７（Ｈ２Ｎ２）などのインフルエンザ株に適用してもよく、それらの開示を参照として援用するが、必ずしもこれらに限定するものではない。本発明の方法に使用してもよい他のインフルエンザ株としては、ウマインフルエンザウイルス（Ａ型／ウマ２型（Ｈ３Ｎ８）、ニューマーケット１／９３）、ウマ２型インフルエンザウイルス（ＥＩＶ、サブタイプＨ３Ｎ８）、ウマ２型インフルエンザウイルス、Ａ型／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ベルリン／２／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンブリッジ／１／６３（Ｈ７Ｎ７）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／９８、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ ８１）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／１／８１（Ｅｑ／Ｋｙ）ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマケンタッキー／１／８１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／１２７７／９０（Ｅｑ／Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／２／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／７９（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／８１、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ケンタッキー／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／ケンタッキー／９５（Ｈ３Ｎ８）およびウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／ケンタッキー／９８、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ニューマーケット／１／７７、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ニューマーケット／５／０３、ウマインフルエンザ
ウイルス株Ａ型／ウマ２型（Ｈ３Ｎ８）、ニューマーケット１／９３、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／ニューマーケット１／９３、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ニューマーケット／２／９３、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ニューマーケット／７９（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ニューマーケット／１／７７（Ｈ７Ｎ７）およびウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／ニューマーケット‐２／９３、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／マイアミ／６３（Ｈ３Ｎ８）、Ａ型／ウマ１型（プラハ株）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型（マイアミ）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ１型／プラハ／５６（Ｐｒ／５６）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／サフォーク／８９（Ｓｕｆ／８９）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／サセックス／８９（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／サセックス／８９、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ２型／サスカトゥーン／９０、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／マイアミ／１／６３（Ｈ３Ｎ８）、Ａ型／愛知／２／６８（Ｈ３Ｎ２）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／東京／２／７１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ラプラタ／１／８８、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／吉林／１／８９（Ｅｑ／吉林）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／アラスカ／１／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／サスカトゥーン／１／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ローマ／５／９１（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ラプラタ／１／９３（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／ラプラタ／１／９３（ＬＰ／９３）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／オランダ／１／９５（Ｈ３Ｎ８）、ウマインフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／オランダ／２／９５（Ｈ３Ｎ８）、ヒトインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ３Ｎ２）分離株、ヒトインフルエンザウイルスＡ型／メンフィス／１／７１（Ｈ３Ｎ２）、ヒトインフルエンザウイルスＡ型／南昌／９３３／９５（Ｈ３Ｎ２）ウイルス、ヒトインフルエンザウイルスＡ型／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、ヒトインフルエンザウイルスＡ型／シンガポール／５７（Ｈ２Ｎ２）ウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＡ型／香港／２１３／０３、インフルエンザウイルス株Ａ型／香港／４８３／９７株、インフルエンザウイルス株Ａ型／タイ／Ｓ（ＫＫ‐４９４）／２００４（Ｈ５Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型 ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）ウイルス株（Ｈ１Ｎ１サブタイプ）、インフルエンザウイルス株Ａ型／愛知／２／６８（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株ＡＩ型 アナーバー／６／６０ 低温馴化ウイルス株、インフルエンザウイルス株Ａ型／北京 ３２／９２（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／シャーロッツビル／３１／９５（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／川崎／８６（Ｈ１Ｎ１）ウイルス株、インフルエンザウイルス株Ａ型／韓国／８２株（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／レニングラード／１３４／５７株、インフルエンザウイルス株Ａ型／ＮＷＳ／３３（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ＰＲ ８／３４株、インフルエンザウイルス株Ａ型／プエルトリコ（ＰＲ）／８／３４、インフルエンザウイルス株Ａ型／プエルトリコ／８‐シナイ山、インフルエンザウイルス株Ａ型／山東 ９／９３（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／シンガポール６／８６（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／テキサス３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）ウイルス株、インフルエンザウイルス株Ａ型／テキサス／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ウドン／７２ウイルス感染、インフルエンザウイルスＡ型／ビクトリア／３／７５（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルスＡ型／バージニア／８８（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルスＡ型／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスＡ型／ＷＳＮ／３３、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＢ型／アナーバー１／８６、インフルエンザウイルスＢ型／ハルビン／７／９４、インフルエンザウイルスＢ型／香港／５／７２、インフルエンザウイルスＢ型／リー／４０、インフルエンザウイルスＢ型ナマガタ（Ｎａｍａｇａｔａ）１６／８８、インフルエンザウイルスＢ型／山形グループ、インフルエンザウイルスＢナマナシ（Ｎａｍａｎａｓｈｉ）／１６６／９８、インフルエンザウイルスＣ型、インフルエンザウイルス株Ａ型／ウマ／２／キルデア／８９、インフルエンザウイルスＢ型／パナマ４５／９０、低温馴化温度感受性（ｃａ／ｔｓ）ロシア型インフルエンザＡ型生ワクチン、ブタＨ１およびＨ３インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザＡウイルス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタインフルエンザウイルスＡ型／ブタ／ドイツ ２／８１、ブタインフルエンザウイルスＡ型／ブタ／ドイツ ８５３３／９１、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１２５／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１３６／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／６３／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１６４／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１６６／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１６８／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／２３５／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／２３８／９７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／４５７／９８（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／４５８／９８（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／４６４／９８（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／インディアナ／１７２６／８８（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／インディアナ／９Ｋ０３５／９９（Ｈ１Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ネブラスカ／１／９２（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ケベック／９１（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ケベック／８１（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ニュージャージー／１１／７６（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／愛媛／１／８０（Ｈ１Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／イングランド／２８３９０２／９３（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／イングランド／１９５８５２／９２（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ドイツ／８５３３／９１（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ドイツ／２／８１（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ネブラスカ／２０９／９８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ型／ブタ／アイオワ／５３３／９９（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／アイオワ／５６９／９９（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ミネソタ／５９３／９９（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／アイオワ／８５４８‐１／９８（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ミネソタ／９０８８‐２／９８（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／テキサス／４１９９‐２／９８（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／オンタリオ／４１８４８／９７（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ノースカロライナ／３５９２２／９８（Ｈ３Ｎ２）、Ａ型／ブタ／コロラド／１／７７（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／香港／３／７６（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／香港／１３／７７（Ｈ３Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／長崎／１／９０（Ｈ１Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／長崎／１／８９（Ｈ１Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１９１５／８８（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／アイオワ／１７６７２／８８（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／テネシー／２４／７７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／オンタリオ／２／８１（Ｈ Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／ウィスコンシン／１／６７（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／イタリア／１５２１／９８（Ｈ１Ｎ２）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／イタリア／８３９／８９（Ｈ１Ｎ１）、ブタインフルエンザウイルス株Ａ型／ブタ／香港／１２６／８２（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／アイダホ／４／９５（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ヨハネスブルグ／３３／９４（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／バンコク／１／７９（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ウドン／７２（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／北海道／２／９２（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／タイ／ＫＡＮ‐１／０４、インフルエンザウイルス株Ａ型／イングランド／１／５３、インフルエンザウイルス株Ａ型／ベトナム／３０４６／２００４（Ｈ５Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／トラ／タイ／ＳＰＢ‐１（Ｈ５Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／日本／３０５／５７（Ｈ２Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／足立／２／５７（Ｈ２Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ラクダ／モンゴル／８２（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ＲＩ／５／５７（Ｈ２Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／クジラ／メイン／１／８４（Ｈ１３Ｎ９）、インフルエンザウイルス株Ａ型／台湾／１／８６（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／バイエルン／７／９５（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ＵＳＳＲ／９０／７７（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株Ａ型／武漢／３５９／９５（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／香港／５／８３（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／メンフィス／８／８８（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／北京／３３７／８９（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／上海／６／９０（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／秋田／１／９４（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／秋田／１１／９５（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／メンフィス／６／９０（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／ウドン／３０７／７２（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、インフルエンザウイルス株Ａ型／オハイオ／４／８３（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザウイルス株メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）由来細胞株、マウス適応型インフルエンザウイルス株Ａ型／貴州／５４／８９（Ｈ３Ｎ２サブタイプ）、マウス適応型インフルエンザウイルスＡ型／ＰＲ／８／３４（Ａ型／ＰＲ８）、マウス適応型インフルエンザウイルスＢ型／茨城／２／８５、ロシア弱毒インフルエンザ生ワクチンドナー株Ａ型／レニングラード／１３
４／１７／５７、Ａ型／レニングラード／１３４／４７／５７、Ｂ型／ＵＳＳＲ／６０／６９、ならびにＡ型／上海／２／２０１３ Ｈ７Ｎ９が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

本発明は、あらゆるタイプのインフルエンザワクチンに適用することができ、例として、スプリットウイルスのような不活化インフルエンザウイルスに基づくワクチンおよび／または組換えワクチンが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。本発明は、様々なワクチンの製造システムから製造したインフルエンザワクチンに対しても適用することができ、例えば卵ベース、植物ベース、および細胞培養ベースのワクチンが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。卵ベースのインフルエンザワクチンを作製するために、病原体フリーの卵に種ウイルスを接種する。種ウイルスは、天然型ウイルスまたは組換え型ウイルスであってもよい。尿膜腔液からウイルスを採取した後、ＨＡ抗原を下記のようにアルキル化剤で処理することができる。

細胞培養ベースのワクチンとして、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ウイルス細胞、真菌または藻類、または合成細胞から産生するワクチンを挙げてもよい。本発明に適した動物細胞としては、昆虫細胞、哺乳類細胞、および鳥類細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。インフルエンザワクチンの製造に適した昆虫細胞の例として、ＳＦ細胞、イモムシ細胞、チョウ細胞、ガ細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、ショウジョウバエ細胞、Ｓ２細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞（ライフテクノロジーズ社）、ツマジロクサヨトウ細胞、イラクサギンウワバ細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、およびＴｒｉｃｈｏｐｌａｓｉａ ｎｉ細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。インフルエンザワクチンの製造に適した哺乳類細胞の例として、ＭＲＣ‐５細胞、ＷＩ‐３８細胞、ＣＶ‐１細胞、ＣＯＳ細胞、ＬＬＣ‐ＭＫ２細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＡＰ（登録商標）細胞（ＣＥＶＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＥＢｘ細胞、サル腎細胞、形質転換ヒト細胞株、およびＰｅｒ．Ｃ６細胞が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。インフルエンザワクチンの製造に適した鳥類細胞の例として、胚発育卵、ニワトリ胚細胞、ＥＢ６６（Ｖａｌｎｅｖａ社）、ＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ（Ｐｒｏｂｉｏｇｅｎ社）などのアヒル細胞株が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。インフルエンザワクチンの製造に適した植物細胞の例として、タバコおよびトウモロコシが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。インフルエンザワクチンの製造に適した酵母株の例として、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。インフルエンザワクチンを製造するのに適した藻類株の例として、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ種およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

さらに、インフルエンザワクチンは、植物などの生物全体において産生してもよく、植物としては例えばタバコ植物全体が挙げられるが、必ずしもこれに限定するものではない。

本発明によるインフルエンザワクチンは、１価または多価であってもよい。例えば、本発明によるインフルエンザワクチンは、２価、３価、または４価であってもよい。

インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）のアルキル化
本発明によれば、本明細書中に記載する様々なインフルエンザ株由来のヘマグルチニン（ＨＡ）を、アルキル化剤で処理するか、またはアルキル化剤に曝露してもよい。本明細書で使用する場合、用語「アルキル化剤」は、ある分子から別の分子へアルキル基を転移できる任意の化学物質または非化学物質を指す。アルキル基の例として、アルキルカルボカチオン、カルバニオン、フリーラジカル、カルビンおよびメチル基を挙げてもよい。いくつかの実施形態において、アルキル化は、メチル化、すなわち炭素基１個のみの転移を包含する。したがって、いくつかの実施形態において、用語「アルキル化剤」は、メチル化剤を含む。ＨＡの処理は、遊離システイン残基（すなわち、遊離スルフヒドリル基を有するシステイン残基）などの反応性システイン基のアルキル化またはメチル化をもたらすと考えられる。特定の理論に拘泥するわけではないが、貯蔵中にインフルエンザＨＡは、通常、ロゼット構造を形成すると考えられ、ＳＲＩＤアッセイの際にこれをｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔによる前処理によって破壊し、ＨＡ抗原の拡散および抗血清との相互作用を促進して沈降環を形成させる必要がある。経時的なＳＲＩＤ測定によるＨＡの見なし力価の喪失に対しての予想されるメカニズムは、近位システイン残基間に分子間共有システイン結合が形成し、それがＳＲＩＤアッセイの標準的な前処理中におけるｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔによるロゼット構造の破壊を妨げ、その結果としてゲルマトリックス内でのロゼットマクロ構造の移動が制限され、抗血清との相互作用が低下するというものである。反応性システイン基のアルキル化またはメチル化は、分子間ジスルフィド結合の形成を妨げ、それによりＳＲＩＤアッセイ中のＨＡ抗原の拡散および抗血清との相互作用を促進する。

ヘマグルチニン（ＨＡ）
インフルエンザＨＡは、インフルエンザウイルスの表面に見出される糖タンパク質である。ＨＡは２つの機能を有する：１）シアル酸含有受容体への結合を介した標的脊椎動物細胞の認識、および２）宿主エンドソーム膜へのウイルス膜の融合による標的細胞へのウイルスゲノムの侵入。インフルエンザＨＡはウイルス粒子の三量体である。インフルエンザＨＡは、ウイルスの感染後に細胞内においてＨＡ０として合成され、細胞性プロテアーゼによって塩基性切断部位で切断され、成熟型のＨＡ１およびＨＡ２となる。これは、この表面タンパク質が適切に機能するために必要であり、また、ウイルスのライフサイクルにとっても必要である。Ｍ２タンパク質は、イオンチャネルタンパク質である。ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２タンパク質は、宿主細胞の細胞膜に由来するウイルスエンベロープ中に存在する。

１８種の公知のＨＡサブタイプが存在する。アミノ酸配列の同一性および結晶構造の比較に基づいて、ＨＡサブタイプは２つの主要な群および４つのより小規模なクレードに分類される。異なるＨＡサブタイプは強いアミノ酸配列同一性を必ずしも共有しないが、異なるＨＡサブタイプの全体的な立体構造は互いに類似しており、分類目的に用いることができるいくつかの微妙な相違点を有する。例えば、中心のα‐ヘリックスに関連する膜遠位側サブドメインの特定の配向は、ＨＡサブタイプを決定するために一般的に使用される一つの構造的特徴である（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：２８７；参考として本明細書に援用する）。ＨＡは、Ｈ１〜Ｈ１８と呼ばれる１８種のサブタイプのうちの１種のホモ三量体として膜中に存在する。これらのサブタイプのうちの３つ（Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３）のみが、これまでにヒト感染に適合するようになっている。

適切なＨＡは、天然型または改変型ＨＡを含む任意の組換え体ＨＡであってよい。適切なＨＡは、野生型の天然由来配列または改変したアミノ酸配列を有し得る。インフルエンザ分離株由来の多種多様なＨＡ配列が当該分野で公知である。実際、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）は、９，５００種以上のＨＡ配列を含むデータベースを保有している（ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/fluから入手可能）。このデータベースを参照する当業者は、ＨＡポリペプチド全般に特徴的な配列および／または特定のＨＡポリペプチド（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６ポリペプチド、または、例えば鳥類、ラクダ、イヌ、ネコ、シベット、エンビロンメント（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、ウマ、ヒト、ヒョウ、ミンク、マウス、アザラシ、ストーンマーティン（ｓｔｏｎｅ ｍａｒｔｉｎ）、ブタ、トラ、クジラなどの特定の宿主の感染を媒介するＨＡ）に特徴的な配列を容易に同定することができる。

本発明に適したＨＡの非限定的な例として、カリフォルニアまたはソロモン株（限定するものではないが、例えばカリフォルニア／０７／２００９株もしくはソロモン諸島／０３／２００６株など）から分離したＨ１タンパク質、ブリスベン、フロリダ、オハイオ、江蘇もしくは香港株（限定するものではないが、例えばブリスベン／６０／２００８株、フロリダ／０４／２００６株、オハイオ／０１／２００５株、江蘇／１０／２００３株もしくは香港／３３０／２００１株など）から分離したＢタンパク質、またはビクトリア、パース、ブリスベンもしくはウィスコンシン株から分離したＨ３タンパク質（限定するものではないが、例えばビクトリア／３６１／２０１１株、パース／１６／２００９株、ブリスベン／１６／２００７株もしくはＡ型／ウィスコンシン／６７／０５株など）が挙げられる。

本発明のアルキル化剤で処理するのに適したＨＡは、任意の形態で存在してもよい。例として、ＨＡは、例えば紫外線または化学物質によって不活化したインフルエンザウイルスのような、不活化インフルエンザウイルスの形態で存在してもよい。インフルエンザウイルスの不活化に適した化学物質としては、ホルマリン、β‐プロピオラクトン、デオキシコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒド、および界面活性剤が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。したがって、不活化インフルエンザウイルスは、不活化した全ウイルスまたはスプリットウイルス（スプリットウイルス粒子とも呼ぶ）であってもよい。スプリットウイルスを作製するために、ウイルス全体を、通常、界面活性剤で破壊し、ウイルス膜を可溶化する。分解に使用する化学物質としては、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、特にＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ‐１０１、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）７２０および／またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐２００）、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノールエトキシレート、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびデオキシコール酸ナトリウムなどの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

いくつかの実施形態では、本発明に適したＨＡは、精製または部分的に精製してもよい。例えば、ＨＡは、表面抗原を精製、または標準的な組換え技術を用いて産生したＨＡポリペプチドを精製もしくは分離した形態であってもよい。いくつかの実施形態では、精製ＨＡ抗原を生成するために、沈降速度の違いに基づいて表面タンパク質からウイルスの内部サブウイルスコアを分離する。

アルキル化剤
インフルエンザＨＡを安定化するために様々なアルキル化剤を使用してもよい。一般的に、アルキル化は、メチル基を含めたアルキル基をある分子から別の分子へと転移させる。本発明に従って、アルキル化剤は、アルキル基（メチル基も含まれる）を、インフルエンザＨＡ中に存在するシステイン残基の遊離チオールへ転移させる。アルキル基は、アルキルカルボカチオン、フリーラジカル、カルバニオンまたはカルベン（またはそれらの同等物）として転移させてもよい。

したがって、本発明に適したアルキル化剤は、システインスルフヒドリル基をアルキル化できる任意の化合物であってもよい。本発明に適したアルキル化剤の例として、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）、ヨード酢酸、２‐ブロモアセトアミド、グルタチオンブロモアセトアミド、ブロモ酢酸、１，３‐プロパンスルトン、メチルメタンチオスルホン酸、メトキシカルボニルメチルジスルフィド、マレアミド 、マレイミド‐ＰＥＧ、ビニルピリジン、ｎ‐エチルマレミド（ｎ‐ｅｔｈｙｌｍａｌｅｍｉｄｅ）（ＮＥＭ）、トシルアセトアミド、およびそれらの任意の組合せが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。いくつかの実施形態において、本発明に適したアルキル化剤は、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）である。

ヘマグルチニンのアルキル化
実施例の節に記載するように、本出願の発明者らは、遊離チオールの経時的喪失がＳＲＩＤ測定によるＨＡ力価の喪失と強く相関することを発見した。図１参照。本発明者らはまた、２０００〜２０１２年のＷＨＯ推奨のインフルエンザ株のバイオインフォマティクス解析により、システイン残基が高度に保存されていることを発見した。図２参照。Ｈ１およびＢ株では、ＨＡの保存領域に１６個のシステイン残基が存在し、一方、Ｈ３株においては、１８個のシステイン残基がやはり保存領域に存在する。一般的には、図２に示すように、これらの残基のほとんどはジスルフィド結合として存在する。しかしながら、３〜５個（サブタイプによって異なる）は、特に膜貫通領域および細胞質領域において、不対合であることが認められる。不対システイン残基の一部または全部は、発現中にアセチル化する可能性がある。しかしながら、ウイルス不活化、特に界面活性剤を用いるウイルス分解のプロセスにより、アセチル化システイン残基が不適切に反応して、例えば近傍の他の遊離システイン残基と望ましくない結合を形成することがある。さらに、ワクチン製造プロセス中に使用する他の方法によってもまた、アセチル化システイン残基が不適切に反応性になる可能性がある。製造プロセス中にジスルフィド結合の還元が起こり、もともと対合していたシステイン残基までもが反応性になることもあり得る。このように、インフルエンザＨＡは、一般的には、株のタイプに応じて、最大５つの遊離システイン残基を含む。具体的には、インフルエンザＨＡは、１、２、３、４、または５個の遊離システイン残基を含み得る。しかしながら、いくつかの状況下では、インフルエンザＨＡは、株のタイプに応じて、最大１６または１８個の遊離システイン残基を含み得る。具体的には、インフルエンザＨＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個の遊離システイン残基を含み得る。

ＨＡ抗原は、インフルエンザワクチン製造プロセス中の任意の時点でアルキル化することができる。つまり、インフルエンザワクチン製造プロセス中の任意の時点でアルキル化剤を加え、ＨＡ抗原を安定化することができる。卵ベースのインフルエンザウイルスでは、通常、卵から尿膜腔液を除去してウイルスを採取する。流体を遠心分離し、細胞破片を除去する。続いて、ウイルス全体の浄化、濃縮および不活化を行う。カラムクロマトグラフィーまたは密度勾配下でのゾーン遠心分離などの方法により、ウイルスを精製する。いくつかの実施形態では、次いで化学物質または薬剤による不活化を行う。不活化に使用する化学物質としては、ホルムアルデヒド、デオキシコール酸ナトリウム、β‐プロピオラクトンおよびホルマリンが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。さらに、ウイルスは紫外線で不活化することもできる。スプリットウイルスまたはサブユニットワクチンを生成するために、ウイルス全体を界面活性剤で破壊してウイルス膜を可溶化する。分解に使用する適切な化学物質としては、オクチルフェノールエトキシレート（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００）、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノールエトキシレート、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびデオキシコール酸ナトリウムなどの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。スプリットウイルスワクチンにおいて、界面活性剤を選択および使用することにより、確実にサブウイルスコア自体を分解できる。サブユニットワクチンについては、沈降速度の違いに基づいて表面タンパク質からウイルスの内部サブウイルスコアを分離する。

いくつかの実施形態では、不活化／スプリットウイルスをさらに精製し、次いでリン酸ナトリウム緩衝生理食塩水に懸濁する。一般的には、ダイアフィルトレーションを使用して、界面活性剤および他の媒体または化学成分を生産物から除去し、最後に滅菌濾過工程を行って処理を終え、１価バルク溶液を得る。

アルキル化剤は、上流のインフルエンザウイルス産生および処理、採集、分解、濃縮、清澄、不活化、ダイアフィルトレーションおよび／または製剤化の前、最中または後に添加してもよい。

いくつかの実施形態では、ウイルスを分解した後にアルキル化剤を添加する。アルキル化剤（例えば、ＩＯＡＭ）処理の工程を組み込んだ例示的なスキームを図７に示す。

一般的には、ＨＡのアルキル化は、ＨＡをアルキル化剤とともに一定時間、所定温度でインキュベートすることによって行うことができる。いくつかの実施形態では、ＨＡおよびアルキル化剤を、約３７℃か、またはそれ未満の温度（例えば、約３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、もしくは５℃か、またはそれ未満）でインキュベートする。いくつかの実施形態において、ＨＡおよびアルキル化剤を、約０〜５℃、２〜８℃、５〜１０℃、１０〜１５℃、１５〜２０℃、２０〜２５℃、２５〜３０℃、または３０〜３７℃の範囲でインキュベートする。いくつかの実施形態では、ＨＡおよびアルキル化剤を室温（周囲温度とも呼ばれる）でインキュベートする。いくつかの実施形態において、ＨＡおよびアルキル化剤を貯蔵温度（例えば、約０〜５℃、約２〜８℃、または約０〜１０℃）でインキュベートする。

ＨＡおよびアルキル化剤は、任意の期間インキュベートしてもよい。いくつかの実施形態において、ＨＡおよびアルキル化剤を、最大で約２４時間、約２０時間、約１８時間、約１６時間、約１４時間、約１２時間、約１０時間、約８時間、約６時間、約４時間、約２時間、約１．５時間、約１時間、約５０分間、約４０分間、約３０分間、約２０分間、約１０分間、または約５分間インキュベートする。いくつかの実施形態において、ＨＡおよびアルキル化剤を、少なくとも約１分、約５分、約１０分、約３０分、約１時間、約１．５時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１４時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、または約２４時間インキュベートする。いくつかの実施形態において、ＨＡおよびアルキル化剤を、約０〜２時間、約０〜１．５時間、約０〜１時間、約０．１〜５．０時間、約０．１〜４時間、約０．１〜３時間、約０．１〜２時間、約０．１〜１時間、約０．１〜０．５時間、約０．５〜３時間、または約０．５〜２時間インキュベートする。

ＨＡおよびアルキル化剤は、相対濃度の範囲内で存在してもよい。例えば、アルキル化剤は、ＨＡ‐システイン濃度に対して１倍モル過剰を上回る濃度（例えばＨＡ‐システイン濃度に対して、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍モル過剰）で存在してもよい。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、ＨＡ‐システイン濃度に対して、１倍〜１００倍、１倍〜９０倍、１倍〜８５倍、１倍〜７５倍、１倍〜５０倍、５倍〜８５倍、５倍〜８０倍、 ５倍〜７５倍、５倍〜５０倍、５倍〜４０倍、５倍〜３０倍、５倍〜２０倍、または５倍〜１０倍モル過剰で存在してもよい。

いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１ｍＭ〜１Ｍ、１ｍＭ〜９００ｍＭ、１ｍＭ〜８００ｍＭ、１ｍＭ〜７００ｍＭ、１ｍＭ〜６００ｍＭ、１ｍＭ〜５００ｍＭ、１ｍＭ〜４００ｍＭ、１ｍＭ〜３００ｍＭ、１ｍＭ〜２００ｍＭ、１ｍＭ〜１００ｍＭ、１ｍＭ〜５０ｍＭ、５ｍＭ〜１Ｍ、１０ｍＭ〜９００ｍＭ、２０ｍＭ〜８００ｍＭ、３０ｍＭ〜７００ｍＭ、４０ｍＭ〜６００ｍＭ、５０ｍＭ〜５００ｍＭ、６０ｍＭ〜４００ｍＭ、７０ｍＭ〜３００ｍＭ、８０ｍＭ〜２００ｍＭ、９０ｍＭ〜１００ｍＭ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ、１０ｍＭ〜１００ｍＭ、１０ｍＭ〜５００ｍＭ、５０ｍＭ〜１０００ｍＭ、１００ｍＭ〜９００ｍＭ、２００ｍＭ〜８００ｍＭ、または３００ｍＭ〜７００ｍＭの範囲の濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１μｇ／ｍｌ〜１，０００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜９００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜７００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、または５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ〜１，０００μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ〜９００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ〜７００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、または９０μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、アルキル化剤は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ 、１２ｍＭ。 １３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、もしくは５００ｍＭか、またはそれより高い濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態において、アルキル化剤は、約１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、６μｇ／ｍｌ、７μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、９μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１１μｇ／ｍｌ、１２μｇ／ｍｌ、１３μｇ／ｍｌ、１４μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、もしくは５００μｇ／ｍｌ、またはそれより高い濃度で存在してもよい。

いくつかの実施形態では、処理したワクチン組成物からアルキル化剤を除去し、最終原体がアルキル化剤を実質的に含まないようにする。任意の方法を用いてアルキル化剤を除去してもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフィルトレーションによってアルキル化剤を除去する。アルキル化剤の分子量に応じて、適切なカットオフサイズを有するフィルターを使用してもよい。

一般的には、ダイアフィルトレーションは、上流プロセスに由来する界面活性剤および他の培地成分または化学化合物を除去し、ＨＡ抗原を精製および／または濃縮するために使用する。いくつかの実施形態では、不活化工程（例えば、図７）に続いてダイアフィルトレーション工程を実施する。一般的には、ダイアフィルトレーション前の不活化工程中に、不活化剤（例えば、ホルマリン、β‐プロピオラクトン、デオキシコール酸ナトリウム、またはホルムアルデヒド）を添加する。いくつかの実施形態では、不活化工程中に添加した不活化剤とともにアルキル化剤を除去し、このことによってプロセス効率を保証する。したがって、いくつかのそのような実施形態では、不活化剤（例えば、ホルマリン、β‐プロピオラクトン、デオキシコール酸ナトリウムまたはホルムアルデヒド）の添加の前または添加と同時にアルキル化剤を添加する。いくつかの実施形態では、不活化剤（例えば、ホルマリン、β‐プロピオラクトン、デオキシコール酸ナトリウム、またはホルムアルデヒド）添加の約３０分、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、または６時間前にアルキル化剤を加える。

本発明の方法により、ＨＡ抗原のアルキル化を様々なレベルで達成することができる。一般に、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理すると、ＨＡの１つ以上のシステイン残基がアルキル化する。いくつかの実施形態において、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理すると、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２個のシステイン残基のアルキル化が生じる。特定の実施形態において、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理すると、１、２、３、４、または５個のシステイン残基がアルキル化する。出発時のＨＡ抗原中の遊離システイン残基の数に応じて、いくつかの実施形態では、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理することによって最大１６または１８個までのシステイン残基をアルキル化することができる。より具体的には、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理することにより、最大５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のシステイン残基をアルキル化することができる。いくつかの実施形態では、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理すると、約１〜１００％、１〜９０％、１〜８０％、１〜７０％、１〜６０％、１〜５０％、１〜４０％ １〜３０％、１〜２０％、または１〜１０％のシステイン残基がアルキル化する。いくつかの実施形態において、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理すると、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上のシステイン残基がアルキル化する。いくつかの実施形態では、ＨＡ抗原をアルキル化剤で処理すると、実質的に全ての遊離システイン残基がアルキル化する。様々な実施形態において、本発明によるアルキル化剤でＨＡ抗原を処理しても、非特異的なアルキル化は生じない。上記のように、本明細書で使用するアルキル化は、メチル化を包含する。いくつかの実施形態において、本発明のアルキル化剤でＨＡ抗原を処理しても、遍在性のメチル化は生じない。

アルキル化レベルを測定する方法は、当該技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルキル化レベルを、遊離システイン残基の減少度によって測定する。アルキル化レベルまたは遊離システイン残基の減少度を測定する例示的な方法を実施例の節に記載する。様々な追加の方法が当該技術分野において公知であり、それらを、本発明を実施するために使用することができる。例えば、非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）は、タンパク質の質量およびジスルフィド架橋結合の大きな変化を検出することができる。質量分析法を使用して、タンパク質の質量の変化を検出することによって、アルキル化レベルを決定してもよい。質量分析とペプチドマッピングを組み合わせて用い、特定のシステイン残基のアルキル化を特徴付けてもよい。例えば、ＨＡタンパク質を最初に１つ以上の酵素で消化し、一次配列中の切断部位に基づいたペプチドの特定のセットを生成してもよい。これらのペプチドを、次に、質量分析法（すなわち、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）により直接に、またはクロマトグラフィー分離の後に（すなわち、液体クロマトグラフィー‐マススペクトロメトリー、ＬＣ‐ＭＳにより）、分析することができる。ペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）の変化はアルキル化の指標となり得る（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００６；４０：７９０‐７９８）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアルキル化レベルを、アミノ酸分析を用いたシステインの定量によって決定してもよい。

ＳＲＩＤを用いたＨＡ抗原力価の測定および免疫原性
ＳＲＩＤアッセイは、インフルエンザワクチン中のＨＡ含量を測定するために使用され、また、１９７８年以来、食品医薬品局によって米国内での使用を認可されたインフルエンザウイルスワクチンの力価を測定する目的で使用されている。具体的には、ＳＲＩＤは、特異的抗ＨＡ抗体を用いてインフルエンザワクチン中のＨＡ含量を測定する。例として、界面活性剤で可溶化したワクチンの試料を、例えば、株特異的抗血清を含む３〜４ｍｍの穴を開けた薄いゲル層を有するアガロースプレート上に塗布する。標準ＨＡ抗原の希釈物を、抗原濃度未知の試料とともにウェルに入れる。通常、プレートを湿室内にて室温下でインキュベートし、抗原が拡散できるようにする。抗原と抗体との反応により、沈降ゾーンが生成する（沈降輪の形態で）。いくつかの実施形態では、得られる抗原‐抗体の沈降輪を、クーマシーブルー染色で増強する。ワクチン試料中のＨＡ含量は、試料の環径を濃度既知の参照用ＨＡ抗原の直径と比較することによって定量することができる。試験したワクチンの力価は、ＨＡ含量に基づいて得ることができる。いくつかの実施形態では、ＳＲＩＤアッセイによる測定力価を、見なし力価または見なし安定性とも呼ぶ。

本発明は、ＳＲＩＤ測定による力価の喪失を低減するインフルエンザワクチンを提供する。いくつかの実施形態において、本発明によるアルキル化剤での処理は、アルキル化剤の処理を加えないことを除いて他の点で同一のインフルエンザワクチンと比較して、ＳＲＩＤによって測定するインフルエンザワクチンの見なし力価の喪失を低減する。例えば、本発明によるアルキル化剤での処理は、アルキル化剤の処理を加えないことを除いて他の点で同一のインフルエンザワクチンと比較して、インフルエンザワクチンのＳＲＩＤ測定による力価のみなし喪失の、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍または５倍の低減をもたらしてもよい。

したがって、本発明によるアルキル化剤で処理した、またはアルキル化剤に曝したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンは、標準的な条件下での短期間または長期間の貯蔵後に、優れた安定性および有意な力価喪失の低減を示すことを特徴とする。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理した、またはアルキル化剤に曝したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンは、標準的な条件下での短期間または長期間の貯蔵後に、ＳＲＩＤ測定による約５０％以下（例えば、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％以下）の見なし力価の喪失を示す。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理した、またはアルキル化剤に曝したＨＡ抗原を含むインフルエンザワクチンは、標準的な条件下での短期間または長期間の貯蔵後に、ＳＲＩＤ測定による約１０％以下（例えば、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％以下）の見なし力価の喪失を示す。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理した、またはアルキル化剤に曝したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンは、標準的な条件下での短期間または長期間の貯蔵後に、ＳＲＩＤ測定による約１％以下（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％以下）の見なし力価の喪失を示す。いくつかの実施形態では、アルキル化剤で処理した、またはアルキル化剤に曝したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンは、標準的な条件下での短期間または長期間の貯蔵後に、ＳＲＩＤ測定による見なし力価の喪失を実質的に示さない。様々な実施形態において、ＨＡの見なし力価の喪失を、標準的な条件下での短期間の貯蔵後に測定してもよい。標準的な条件下での短期間の貯蔵は、例えば、１〜３０℃、１〜２５℃、１〜２０℃、１〜１５℃、１〜１０℃、１〜５℃、２〜１０℃、２〜８℃、２〜６℃、２〜４℃、１０〜３０℃、１０〜２５℃、１０〜２０℃、１５〜２５℃、１５〜２０℃、２０〜２５℃、または室温において、最長３０日、６０日、または９０日間にわたって貯蔵することを含む。様々な実施形態において、ＨＡの見なし力価の喪失を、標準的な条件下での長期間の貯蔵後に測定してもよい。標準的な条件下での長期間の貯蔵は、例えば、１〜３０℃、１〜２５℃、１〜２０℃、１〜１５℃、１〜１０℃、１〜５℃、２〜１０℃、２〜８℃、２〜６℃、２〜４℃、１０〜３０℃、１０〜２５℃、１０〜２０℃、１５〜２５℃、１５〜２０℃、２０〜２５℃、または室温において、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１．５年、２年、２．５年、３年、３．５年、４年、４．５年または５年より長期にわたって貯蔵することを含む。

本発明によるアルキル化剤で処理した、またはアルキル化剤に曝したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンは、さらなる特徴として、アルキル化剤で処理しない、またはアルキル化剤に曝さないことを除いて他の点で同一のインフルエンザワクチンと比較して、少なくとも同等の免疫原性および向上したＳＲＩＤ測定による力価を有すると考えられる。免疫原性を測定するための様々な方法が当該分野で公知であり、本発明を実施するために使用することができる。例えば、ＨＡ抗原の免疫原性は、インビトロアッセイ（ＥＬＩＳＡおよびＴ細胞アッセイが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない）によって試験してもよい。いくつかの実施形態では、ＨＡ抗原の免疫原性は、動物の対象にＨＡ抗原を投与し、インビボで中和抗体応答を誘発する能力を測定することによって試験してもよい。ＨＡ抗原の免疫原性を試験するための動物モデルとしては、マウス、ラット、フェレット、ブタ、トリ、コウモリ、および非ヒト霊長類が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。いくつかの実施形態では、ＨＡ抗原の免疫原性を、ヒト患者にＨＡ抗原を投与することによって試験してもよい。

免疫原性ワクチン組成物
本発明によるアルキル化ＨＡ抗原は、製剤化してインフルエンザワクチンの免疫原性組成物を形成することができる。アルキル化ＨＡ抗原は、単独で製剤化してもよく、または、同種もしくは異種インフルエンザ株由来の他の安定化もしくは非安定化インフルエンザ抗原と組み合わせて製剤化してもよい。したがって、本発明の免疫原性組成物は、１価または多価（例えば、２価、３価、または４価）であってもよい。

本発明の免疫原性組成物は、追加の物質、例えばワクチンの有効性を高めるためのアジュバント、および、必ずしも限定するものではないが、湿潤剤もしくは乳化剤、または緩衝剤を含む薬学的に許容可能な担体を含有することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，（ｅｄ．）１９８０）。

適切なアジュバントとしては、ミネラル塩（ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮａ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＨ（ＳＯ_４）_２、シリカ、アルミニウム、Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、カオリン、または炭素など）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）を含むかまたは含まないポリヌクレオチド（例えば、Ｃｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｈ．ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．７１（３）：５３８‐４４；Ａｈｍａｄ‐Ｎｅｊａｄ，Ｐ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２（７）：１９５８‐６８に記載されるようなＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩＣまたはポリＡＵ酸、ＣｐＧを有するかまたは有さないポリアルギニン（当該技術分野ではＩＣ３１としても公知である。Ｓｃｈｅｌｌａｃｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３４ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｌｉｎｇｎａｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０（２９‐３０）：３４９８‐５０８参照）、ＪｕｖａＶａｘ（商標）（米国特許第６，６９３，０８６号）、特定の天然物質（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワックスＤ、Ｃｏｒｎｙｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、またはＢｒｕｃｅｌｌａ属ファミリーに見出される物質）、フラジェリン（Ｔｏｌｌ様受容体５リガンド、ＭｃＳｏｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（７）：３９１４‐９参照）、ＱＳ２１、ＱＳ１７、およびＱＳ７のようなサポニン（米国特許第５，０５７，５４０号、第５，６５０，３９８号、第６，５２４，５８４号、第６，６４５，４９５号）、モノホスホリルリピドＡ、特に３‐脱‐Ｏ‐アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ‐ＭＰＬ）、イミキモド（当該技術分野においてＩＱＭとしても公知であり、Ａｌｄａｒａ（登録商標）として市販、米国特許第４，６８９，３３８号、５，２３８，９４４号、Ｚｕｂｅｒ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ（２００４）２２（１３‐１４）：１７９１‐８）、ＣＣＲ５阻害剤ＣＭＰＤ１６７（Ｖｅａｚｅｙ，Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９８：１５５１‐１５６２参照）、およびスクアレンエマルジョン、すなわちＭＦ５９が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。

ヒトにおいて広範に使用されるアジュバントは、アルミニウムである。いくつかの実施形態において、適切なアジュバントはリン酸アルミニウムである。いくつかの実施形態では、適切なアジュバントは水酸化アルミニウムである。いくつかの実施形態では、適切なアジュバントは、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムとの組合せである。サポニンおよびその精製成分であるＱｕｉｌ Ａ、フロイント完全アジュバントならびに他のアジュバントは、通常、研究および獣医学用途に使用する。しかしながら、Ｇｏｏｄｍａｎ‐Ｓｎｉｔｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０‐４１５（１９９１）に記載され、参照として本明細書に援用するようなムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡなどのリン脂質複合体の化学的に定義した新規調製物、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７３９‐１７４４（１９９２）に記載され、本明細書に参照として援用するようなプロテオリポソーム中へのタンパク質のカプセル封入物、およびＮＯＶＡＳＯＭＥ（商標）脂質小胞（Ｍｉｃｒｏ Ｖｅｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ナシュア、ニューハンプシャー）のような脂質小胞中へのタンパク質のカプセル封入物もまた、ヒトへの投与に有用である。

一般的に、本発明の免疫原性ワクチン組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。一般的に、薬学的に許容可能な担体として、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。担体および組成物は滅菌することができ、製剤は投与方式に適合する。組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。滅菌生理食塩水またはゴマ油のような任意の一般的な医薬担体を使用できる。媒体はまた、浸透圧を調整するための薬学的に許容可能な塩、緩衝剤、防腐剤などのような従来の薬学的補助剤を含有することができる。本明細書で提供する組成物および方法と共に使用することができる他の媒体は、生理食塩水およびゴマ油である。

薬学的に許容可能な担体は、投与する特定の組成物、ならびに組成物を投与するために使用する特定の方法にある程度従って決定する。したがって、本発明の免疫原性組成物に適した様々な製剤が存在する。

本発明の免疫原性ワクチン組成物は、インフルエンザワクチンを対象に導入するために通常使用する任意の経路により対象に投与することができる。投与方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、膣内、直腸内、鼻腔内、吸入または経口が挙げられるが、必ずしもこれらに限定するものではない。皮下、静脈内または筋肉内投与のような非経口投与は、一般に注射によって行う。注射剤は、溶液もしくは懸濁液、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態、または乳濁液のいずれかの従来の形態で調製することができる。注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。投与は、全身性または局所性のいずれも可能である。

いくつかの実施形態では、免疫原性ワクチン組成物を、非経口（すなわち、筋肉内、皮内もしくは皮下）投与または鼻咽頭内（すなわち、鼻腔内）投与用に製剤化する。一般的には、非経口投与用製剤は、滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体は、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液を含み、これには生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補充液、電解質補充液（リンガーデキストロースに基づくものなど）などを含む。防腐剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなどを含有してもよい。

免疫原性組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容可能な酸または塩基付加塩として潜在的に投与してもよい。

投与は、単回または複数回の投与によって達成することができる。本開示の文脈において対象に投与する用量は、時間の経過とともに対象内で有効な治療応答を誘導するか、またはインフルエンザウイルス感染を阻害もしくは予防するのに十分な量である必要がある。必要となる用量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、治療対象の感染の重篤度、使用する特定の組成物およびその投与方式に応じて対象ごとに異なる。適切な用量は、当業者によって通例の実験のみを用いて決定することができる。

本発明の免疫原性組成物を適切に適用することにより、予防用ワクチン接種として疾患を予防したり、治療用ワクチン接種として疾患を治療したりすることができる。記載のヒトワクチンのみならず、本発明の組成物および方法を用いて動物株を免疫することができる。用語「動物」は、ヒトを含むすべての動物を意味する。動物の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、シチメンチョウ、アヒル、ニワトリなどが挙げられる。すべての脊椎動物の免疫系は同様に作用するため、記載する適用は全ての脊椎動物系において実施することができる。

本発明およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に規定する本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変更、置換および変形が可能であることを理解すべきである。

本発明は、以下の実施例を参照することにより、より深く理解される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。全ての引用文献を参照として本明細書に援用する。

実施例１：ＳＲＩＤ測定によるインフルエンザワクチン力価喪失の特徴付け
本実施例は、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）によって測定するインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）力価の低い安定特性の背後にあるメカニズムを特徴づけ、理解するために実施した実験を記載する。以下に示すように、本明細書に記載の実験は、ＳＲＩＤ測定による力価の喪失と、ＨＡ中の遊離チオールの減少との間の相関性を示した。

具体的には、本実施例は、ＨＡ抗原において認められる力価喪失に関与する因子を探索する。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）アッセイを行い、ＳＲＩＤがＨＡ力価の有意な喪失を示す同じ期間にわたって、全ＨＡ含量には減少が生じなかったことを実証した。このことを裏付けるために、ＳＲＩＤ分析の前に２‐メルカプトエタノール（ＢＭＥ）で処理した試料に対して観察を行った。これらの前処理した試料では、力価の喪失は観察されなかった。これらの結果は、ＳＲＩＤによって測定するＨＡ力価は経時的に低下するが、全体的なＨＡ含量は変化しないことを示している。これと同じ現象は、多価の医薬品でも観察された。

次に、遊離チオールの分析結果を時間に対して評価した。図１に示すように、経時的な遊離チオールシグナルの消失が、異なる株に基づく様々なインフルエンザワクチンにおけるＳＲＩＤによるＨＡ力価の喪失と良く相関することを見出した。これらの結果は、ＨＡの見なし力価の喪失のメカニズムに、ジスルフィド結合形成が関与していることを示唆している。

次に、すべてのインフルエンザ株のＨＡ抗原間で保存されている特徴について調べた。システインは、ＨＡ抗原中の遊離チオールの供給源である可能性が高い。ＨＡシステイン残基の存在および役割をよりよく理解するために、２０００〜２０１２年のＷＨＯ推奨のインフルエンザ株すべてのバイオインフォマティクス調査を実施した（図２参照）。本調査は、システイン残基がサブタイプ間で完全に保存されており、Ｈ１およびＢ株と比較してＨ３株のみに差異が認められたことを示した。Ｈ１およびＢ株では、保存領域において１６個のシステイン残基を同定し、一方、Ｈ３株では、保存領域において１８個のシステイン残基を同定した。これらの残基の大部分は既知の対合のジスルフィド結合として存在し、膜貫通領域および細胞質領域において３〜５残基（サブタイプにより異なる）のみが不対である。これらの残基はアセチル化し、したがって発現中にジスルフィド結合を形成できないと考えられるが、例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００を用いるウイルス分解のプロセスにより、それらが反応性となり、さらなるジスルフィド結合を形成する可能性がある。

特定の理論に拘泥するわけではないが、ＨＡ力価喪失におけるシステインの関与は、ＨＡロゼット形成におけるそれらの役割に関連すると考えられる。ＨＡロゼット形成は、膜貫通領域および細胞質領域の疎水性を介して起こる。ロゼット形態では、ＨＡモノマーは密接に接触し、分子間共有結合形成が起こりやすくなる。この情報に基づけば、経時的なＨＡ力価の喪失のメカニズムとして可能性が高いのは、分子間共有システイン結合が形成し、ＳＲＩＤ分析の標準的な前処理を行う際に、それがｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔによるロゼット構造の破壊を妨げ、その結果、ゲルマトリックス内でのロゼットマクロ構造の移動が制限され、抗血清との相互作用が低下するというものである。これを図３に示す。時間経過とともに、ＨＡ抗原中のシステイン残基は分子間結合を形成し、これらが共に作用してロゼット構造を固定化し、ＳＲＩＤゲル中のＨＡ抗原の移動を遅延させる。

実施例２：アルキル化剤による処理は、ＨＡの見なし力価の喪失を低減する
本実施例は、インフルエンザワクチンをアルキル化剤で処理することにより、ＳＲＩＤ測定によるＨＡ力価が安定化、すなわち喪失度が低減することを実証した。

実施例１に記載の機構的理解を踏まえ、様々なＧＲＡＳ（一般的に安全と認められる）賦形剤、いくつかの還元剤、および１つの汎用アルキル化／メチル化剤２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）を加えた薬剤物質の安定性試験を実施した。濾過後、Ａ型／カリフォルニアまたはＢ型／ブリスベン由来のＨＡ抗原を、それぞれ０．１ｍｇ／ｍＬのアルギニン、１０ｕＭのシステイン、１ｕＭのＤＴＴ、１００ｕＭのＤＴＴおよび１０００ｕＭのＩＯＡＭに曝し、次いでＳＲＩＤアッセイによって試験した。全体的な目的は、ＳＲＩＤ測定による力価の喪失を遅らせることであった。本研究の例示的な結果を図４に示す。驚くべきことに、ＩＯＡＭの添加のみがＨＡの見なし力価の喪失を安定化させた。

本研究で観察されたＨＡ力価の安定化は、分子間ジスルフィド結合形成を妨げる反応性システイン基のアルキル化によって引き起こされると考えられる。ヨウ素は優れた脱離基として作用し、反応性システインのＩＯＡＭへの求核攻撃の反応を起こしやすくする。例示的な機構を図５に示す。

実施例３：インフルエンザワクチン製造プロセスにおけるＩＯＡＭの添加点
本実施例は、製造プロセス中のＩＯＡＭのようなアルキル化剤の適切な添加点を同定し、安定化効果を最適化し、コストを削減し、臨床試験を容易にするために設計した実験をまとめたものである。

第一の開発研究は、１価の原体の製造プロセス中で、ＨＡをＩＯＡＭのようなアルキル化剤に曝す適切な添加点を特定することに焦点を当てた。初期の研究は、ＩＯＡＭを最終原体に直接添加することによって実施した。しかしながら、臨床で使用するためには、アルキル化剤の残留物を除去することが望ましい。ＩＯＡＭが低分子量であることを考慮すると、これはダイアフィルトレーションで達成可能である。しかしながら、プロセスに第二のダイアフィルトレーションを追加してロットの処理時間を長引かせることは避けることが望ましい。そのようなことから、既存のダイアフィルトレーションおよび濃縮工程の上流で添加することを目標とした。ホルマリンによる不活化と化学的には類似しているため、第一の選択肢は、プロセスの長さに影響を与えないように、ＩＯＡＭとホルマリンを同時に添加することであった。しかしながら、試料に対し、アルキル化および不活化を連続的に処理した場合に比べ、アルキル化および不活化を両方同時に処理した場合では、結果は異なっていた。

これらの結果を踏まえ、ＩＯＡＭ存在下でのインキュベーションをホルマリン添加の２時間前に組み込むようにプロセスを変更した。ＩＯＡＭ添加の順序がＡ株の力価に及ぼす影響を示す例示的な結果を図６に示す。

製造プロセス中に抗原をＩＯＡＭに曝すタイミングに応じて、ＨＡ抗原は異なるレベルの安定化を示し得る。アルキル化剤の添加をダイアフィルトレーションの上流で実施するのが理想的であり、こうすることにより、結果として生じる原体にアルキル化剤（例えば、ＩＯＡＭ）関連の残留物を残すことなく、残留物を一掃することができる。例示的なインフルエンザ製造プロセスを図７に示す。

実施例４：ＨＡ安定化のためのＩＯＡＭの最適濃度範囲
本実施例は、ＨＡ力価を安定化するためのＩＯＡＭの最適濃度範囲、特に、非特異的なアルキル化を許容することなくＨＡを安定化させるＩＯＡＭの濃度範囲を探索する。

これは、ＩＯＡＭ濃度範囲を選択し、それによって得られたＨＡ力価の安定性を評価し、次いで、調べた各濃度について、この情報とアミノ酸分析のオーバーレイとを相互参照することによって実施した。本研究では、ＩＯＡＭの濃度範囲を、ＩＯＡＭがＨＡ‐システインに対して５倍、５０倍および８５倍モル過剰となるように設定した。 図８に示すように、Ｂ型／ブリスベン株は、３つすべてのＩＯＡＭレベルで実質的に安定しており、視覚的傾向にもかかわらず、１４％のＳＲＩＤ変動性基準を超える差異は観察されなかった。Ａ型／ビクトリアの場合、本研究では５０倍レベルは試験しなかった。しかしながら、５倍と８５倍レベルとの間に差が認められ、より高い８５倍レベルにおいて力価の喪失はより少なかった。この結果は、ＨＡ力価を安定化するために広い濃度範囲でアルキル化剤を使用し得ることを示す。

次いで、ＩＯＡＭ処理後のアミノ酸アルキル化またはメチル化の状態を分析した。具体的には、試料を酸加水分解し、次いでＵＶ検出のためにプレカラム誘導体化法を用いたＲＰ‐ＨＰＬＣにより分離した。ＩＯＡＭ処理した試料の例示的なアミノ酸分析結果を図９に示す。明らかなように、ＩＯＡＭ処理試料のデータは対照試料と同様であり、遍在性のメチル化を示す新たなピークを全く含まなかった。残念なことに、本分析を通してシステイン残基は安定ではなく、したがってこれらの特定の加水分解状態を用いてアルキル化をモニターするのに十分なほど良好に回復していない。本アッセイのさらなる開発が、システイン残基をモニターし得る加水分解状態をもたらした。

実施例５：ＩＯＡＭ処理したインフルエンザワクチン中のシステインの定量
本実施例は、アルキル化剤（例えば、ＩＯＡＭ）で処理したインフルエンザワクチンが含有する遊離システインのレベルが、未処理対照に比べて低いことを示す。

具体的には、ＩＯＡＭ処理したＡ型／カリフォルニア株由来ＨＡ抗原の遊離システイン濃度を測定し、未処理対照と比較した。本アッセイにおいて、まず、タンパク質を真空および加熱（例えば、１５０℃）下で約１時間、酸加水分解に供して遊離アミノ酸に分解した。アミノ酸は、ウォーターズ社製ＡｃｃＱ‐Ｔａｇ Ｕｌｔｒａ誘導体化キットを使用して誘導体化した。次いで、誘導体をＲＰ‐ＨＰＬＣにより分離し、ＵＶ検出に基づいて定量した。例示的な結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＩＯＡＭ処理した試料は、未処理対照と比較しておよそ３０〜３５％の遊離システイン残基の減少を示した。このことは、ＩＯＡＭ処理したワクチン試料中で約３０〜３５％のシステイン残基がアルキル化されていることを示す。

同様の実験をＩＯＡＭ処理したＢ型／ブリスベンのワクチン試料を分析するために行った。例示的な結果を図１１に示す。Ａ型／カリフォルニア株と同様に、ＩＯＡＭ処理したＢ型／ブリスベンの試料は、未処理対照に比べて約３０〜３８％の遊離システインの減少を示した。このことは、ＩＯＡＭ処理したワクチン試料中で約３０〜３８％のシステイン残基がアルキル化されていることを同様に示している。

これらの実験において、Ａ型／カリフォルニアおよびＢ型／ブリスベンのグラフに示すＩＯＡＭ処理試料は、５０倍のＩＯＡＭ‐ＨＡ比を用いて調製した。

実施例６：ＩＯＡＭによる処理は長期安定性を改善する
本実施例は、アルキル化剤（例えば、ＩＯＡＭ）での処理がＳＲＩＤアッセイにおけるＨＡ抗原の長期安定性を有意に改善することを示す。

本研究のために５０倍のＩＯＡＭ濃度を選択した。本実験の６ヶ月ＨＡ安定性の結果の一例を図１２に示す。Ａ型／カリフォルニアおよびＢ型／ブリスベン両方の対照群と比較して、ＩＯＡＭ処理群は、ＳＲＩＤアッセイによる測定において有意により安定していた。このデータは、ＩＯＡＭ処理したＨＡ抗原が６ヶ月後に安定であり、ＳＲＩＤアッセイで測定する力価の喪失がおよそ１〜５％であることを示す。

ＩＯＡＭ処理した試料の免疫原性試験を、標準プロトコールに従ってマウスモデルを用いて行った。簡単に述べると、Ａ型／カリフォルニア／０７／２００９ ＮＹＭＣ Ｘ‐１７９ＡおよびＢ型／ブリスベン／６０／２００８（ＩＯＡＭ処理もしくは未処理）を含有する２４、１２、１０、３．０、１．０、０．３０、０．０３０μｇＨＡ／株（ＳＲＩＤ力価によって決定）の各２価製剤化バルク製剤、または希釈剤のみの対照を用いて、メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（ハーラン研究室）を免疫した。免疫物を、０日目および２１日目に、筋肉内投与経路（５０μｌ／尾部大腿筋）を介して、１００μｌの総容量で送達した。血液試料を、−２日目（採血前）、２１日目（追加免疫前）については後眼窩採血によって、および４２日目（追加免疫後）については心臓穿刺によって、採集した。血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイの力価測定のために、血清を分離し、−２０℃で貯蔵した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳソフトウェア社）を用いて統計解析を行った。別の実験では、Ａ型／カリフォルニア／０７／２００９ ＮＹＭＣ Ｘ‐１７９Ａ（Ａ／Ｃａｌ）、Ａ型／テキサス／５０／２０１２ Ｘ２２３Ａ（Ａ／Ｔｅｘ）、Ｂ型／ブリスベン／６０／２００８（Ｂ／Ｂｒｉｓ）およびＢ型／マサチューセッツ／０２／２０１２について、４価（ＱＩＶ）すべてもしくは３価（ＴＩＶ）インフルエンザ株（ＩＯＡＭ処理もしくは未処理）の組合せを含有する１２、６．０、３．０、１．５、０．７５、０．３８もしくは０．１９ｕｇＨＡ／株（ＳＲＩＤ力価アッセイによって決定）の各３価（ＴＩＶ）もしくは４価（ＱＩＶ）の製剤化バルク製剤、または希釈剤のみの対照を用いて、７〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールス・リバー社）を免疫した。同様に、筋肉内投与経路（５０μｌ／尾大腿筋）を介して、１００μｌの総容量で０日目および２１日目に免疫物を送達した。血液試料を、−２日目または−１日目（採血前）、２０日目（追加免疫前）については後眼窩採血によって、および３５日目（追加免疫後）については心臓穿刺によって、採集した。ＨＡＩ力価を測定するために、血清を分離し、−２０℃で貯蔵した。ＳＡＳ（登録商標）バージョン９．２ソフトウェア（ＳＡＳソフトウェア社）を用いて統計分析を行った。

例示的なデータを図１３に示す。明らかなように、ＩＯＡＭ処理したＨＡ抗原を含有するインフルエンザワクチンは、ＩＯＡＭ処理をしない対照ワクチンと比較して、全般的に少なくとも同等の免疫原性を示した。

ＩＯＡＭ処理したワクチン試料に関する追加の免疫学的および製品特徴付けの研究も実施することができる。例えば、ＬＣ／ＭＳペプチドマッピング法を用いて、影響を受けたアルキル化部位を同定する。さらに、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を使用して、ＩＯＡＭ処理試料と比較しての対照試料のエピトープ結合の調査を、保護に関連する抗体を用いて研究することができる。

実施例７：アルキル化処理は免疫原性に影響を与えない
本実施例は、アルキル化剤（例えば、ＩＯＡＭ）による処理が免疫原性に変化を与えないことを示す。ＨＡ抗原を含むインフルエンザワクチンのアルキル化の効果を、Ｂ型／ブリスベン／６０／２００８（Ｂ／Ｂｒｉｓ）およびＡ型／テキサス／５０／２０１２のマウスモデルで分析した。異なるＴｒｉｔｏｎ：ＨＡ比の製剤を、８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１５マウス／群）において試験した。用量（１００μＬ）を調製し、０日目（Ｄ（ｄａｙ）０）および２１日目に投与した。３５日目で血清を採取した。

インフルエンザウイルス中和抗体力価の測定のための機能的アッセイである血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイを用いて、インフルエンザウイルスワクチンの免疫原性を測定した。用量範囲にわたるＨＡＩアッセイ力価の曲線下面積（ＡＵＣ）を、各製剤に対してベイラー法を用いて計算した。図１４は、アルキル化ヘマグルチニンのＡＵＣ反応が、現在認可されている高用量３価不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ‐ＨＤ）に匹敵することを示す。Ｘ軸はＴｒｉｔｏｎ：ＨＡ比を表す。Ｙ軸は、各製剤の用量反応曲線から生成したＡＵＣ（曲線下面積）を表す。これらの結果は、アルキル化処理が免疫原性に影響を与えないことを示している。

均等物および範囲
当業者であれば、通常の実験を行うだけで、本明細書に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。本発明の範囲は上記の記載に制限されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。

特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの文言は、そうではないと示されない限り、または文脈から明らかでない限り、１つまたは１つ以上を意味する場合がある。したがって、例えば、「抗体（ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「細胞（ｔｈｅ ｃｅｌｌ）」への言及は、当業者に公知の１つまたは１つ以上の細胞への言及を含む。グループ構成要素の１つまたは１つ以上の構成要素間に「ｏｒ」を含む請求項または記載は、そうではないと示されない限り、または文脈から明らかでない限り、１つ、１つ以上、またはすべてのグループ構成要素が特定の製品またはプロセスに、存在し、用いられ、または関連することを満たすと見なされる。本発明は、ただ１つのグループ構成要素が、所与の製品またはプロセスに、存在し、用いられ、または関連する実施形態を含む。本発明は、グループの１つ以上またはすべての構成要素が、所与の製品またはプロセスに、存在し、用いられ、または関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、列挙した１つ以上の請求項からの１つ以上の限定、要素、句、説明用語などを別の請求項に導入する、すべての変形、組合せ、および置換を包含するものと理解すべきである。例えば、別の請求項に基づく任意の請求項は、同一の基本請求項に基づく任意の他の請求項に記載される１つ以上の制限を含むように変更することができる。さらに、請求項に組成物を列挙する場合、特段の記載がない限り、または矛盾もしくは不整合が生じることが当業者にとって明らかでない限り、それは本明細書に開示する目的のいずれかのための組成物の使用方法を含み、および本明細書に開示する方法のいずれかによる組成物の製造方法、または当業者に周知の他の方法を含むことを理解すべきである。

要素をリストとして、例えばマーカッシュグループ形式で提示する場合、要素の各サブグループも開示し、任意の要素（複数可）をグループから除去し得ることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むものと言及する場合、それは、本発明の特定の実施形態または本発明の態様が、そのような要素、特徴などからなるか、または本質的にそれらからなることを理解すべきである。簡潔にするために、本明細書において、これらの実施形態をかかる文言で特段に記載することはしていない。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非制限であることを意図しており、追加の要素または工程を含み得ることに留意すべきである。

範囲を指定する場合、それは端点を含むものとする。さらに、範囲として表す値は、そうではないと示されない限り、または文脈および当業者の理解により明らかでない限り、本発明の異なる実施形態における状態範囲内の任意の特定の値、または文脈上明確に指定されない限り、前記範囲の下限の１０分の１までの部分範囲を取り得ることを理解すべきである。

さらに、先行技術に含まれる本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のいずれか１つまたは１つ以上から明白に除外し得ることを理解すべきである。そのような実施形態は当業者に公知であるとみなされるため、除外について本明細書に明示的な記載がなくても除外してよい。本発明の組成物の任意の特定の実施形態は、先行技術の存在の有無に関わらず、任意の理由により、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。

上記および本明細書全体にわたって記載する刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供する。本明細書中のいかなるものも、先行開示が存在することを理由にそのような開示よりも先行する資格を有さないことを発明者が認めるものとして解釈すべきではない。

Claims (67)

1. １つ以上のアルキル化システイン残基を有するヘマグルチニンを含むインフルエンザワクチン。
2. 前記ヘマグルチニンが、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２個のアルキル化システイン残基を有する、請求項１に記載のインフルエンザワクチン。
3. 前記ヘマグルチニンが、１、２、３、４、または５個のアルキル化システイン残基を有する、請求項１または２に記載のインフルエンザワクチン。
4. 前記１つ以上のアルキル化システイン残基が、前記ヘマグルチニン中に存在する全システイン残基の約１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、１〜２０％または１〜１０％を構成する、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
5. 前記１つ以上のアルキル化システイン残基が、前記ヘマグルチニン中に存在する全システイン残基の約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％を構成する、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
6. 実質的に全ての遊離システイン残基がアルキル化されている、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
7. 前記アルキル化システイン残基がメチル化システイン残基を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
8. 前記ヘマグルチニンが非特異的なアルキル化および／または遍在性のメチル化を有さない、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
9. アルキル化システイン残基の数が質量分析によって決定される、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
10. アルキル化剤で処理したヘマグルチニンを含むインフルエンザワクチン。
11. 前記アルキル化剤が、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）、ヨード酢酸、２‐ブロモアセトアミド、グルタチオンブロモアセトアミド、ブロモ酢酸、１，３‐プロパンスルトン、メチルメタンチオスルホン酸、メトキシカルボニルメチルジスルフィド、マレアミド、マレイミド‐ＰＥＧ、ビニルピリジン、Ｎ‐エチルマレイミド、トシルアセトアミド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載のインフルエンザワクチン。
12. 前記アルキル化剤が２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）である、請求項１０または１１に記載のインフルエンザワクチン。
13. 前記ヘマグルチニンが、カリフォルニアもしくはソロモン株に存在するＨ１タンパク質、ブリスベン、フロリダ、オハイオ、江蘇もしくは香港株に存在するＢタンパク質、および／または、あるいはビクトリア、パース、ブリスタンもしくはウィスコンシン株に存在するＨ３タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
14. 前記ワクチンが、スプリットインフルエンザウイルスワクチンである、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
15. 組換えインフルエンザワクチンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
16. 卵ベースのインフルエンザワクチンである、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
17. 昆虫細胞、哺乳類細胞、酵母細胞、ウイルス細胞、真菌または藻類において産生される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
18. １価、２価、３価または４価のインフルエンザワクチンである、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
19. １〜３０℃の範囲の温度で約６ヶ月間貯蔵した場合に、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによる測定において少なくとも約９０％の力価を保持する、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
20. 前記アルキル化剤を実質的に含まない、先行請求項のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
21. 精製ヘマグルチニン抗原またはヘマグルチニン含有ウイルス粒子をアルキル化剤で処理する工程を含む、ヘマグルチニンのアルキル化方法。
22. 前記ヘマグルチニン含有ウイルス粒子がスプリットウイルスである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記精製ヘマグルチニン抗原が、精製した表面抗原である、請求項２１に記載の方法。
24. 前記精製ヘマグルチニン抗原が、精製した組換えヘマグルチニンタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
25. 前記ヘマグルチニンが、カリフォルニアもしくはソロモン株に存在するＨ１タンパク質、ブリスベン、フロリダ、オハイオ、江蘇もしくは香港株に存在するＢタンパク質、またはビクトリア、パース、ブリスタンもしくはウィスコンシン株に存在するＨ３タンパク質から選択される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 卵ベースまたは細胞培養ベースの産生系から産生したインフルエンザウイルスから得られたウイルス粒子をアルキル化剤で処理する工程を含む、インフルエンザワクチンの製造方法。
27. 前記ウイルス粒子を、前記インフルエンザウイルスを分解することによって取得する、請求項２６に記載の方法。
28. インフルエンザワクチンの製造方法であって、
    卵ベースまたは細胞培養ベースの産生系からインフルエンザウイルスを回収し、
    前記インフルエンザウイルスを分解し、
    前記スプリットインフルエンザウイルスをアルキル化剤で処理し、および、
    前記処理したスプリットインフルエンザウイルスを不活化する
    ことを含む、前記インフルエンザワクチンの製造方法。
29. 前記分解工程が、前記インフルエンザウイルスを界面活性剤で処理することを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、タウロデオキシコール酸ナトリウム、ノニルフェノールエトキシレート、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、および／またはデオキシコール酸ナトリウムから選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 前記アルキル化剤が、２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）、ヨード酢酸、２‐ブロモアセトアミド、グルタチオンブロモアセトアミド、ブロモ酢酸、１，３‐プロパンスルトン、メチルメタンチオスルホン酸、メトキシカルボニルメチルジスルフィド、マレアミド、マレイミド‐ＰＥＧ、ビニルピリジン、Ｎ‐エチルマレイミド、トシルアセトアミド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記アルキル化剤が２‐ヨードアセトアミド（ＩＯＡＭ）である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記インフルエンザウイルスを、卵ベースの産生系において産生する、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 前記インフルエンザウイルスを、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、ウイルス細胞、真菌もしくは藻類、または合成細胞で産生する、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記動物細胞が、昆虫細胞、哺乳類細胞および／または鳥類細胞から選択される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記処理工程が、前記精製ヘマグルチニン抗原、前記ヘマグルチニン含有ウイルス粒子、前記ウイルス粒子、または前記スプリットインフルエンザウイルスを、前記アルキル化剤とともに、１〜３０℃の範囲の温度でインキュベートすることを含む、請求項２１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記温度が室温である、請求項３６に記載の方法。
38. 前記温度が、１〜５℃、２〜８℃、５〜１０℃、１０〜１５℃、１５〜２０℃、２０〜２５℃、または２５〜３０℃の範囲である、請求項３６に記載の方法。
39. 前記処理工程が、前記精製ヘマグルチニン抗原、前記ヘマグルチニン含有ウイルス粒子、前記ウイルス粒子、または前記スプリットインフルエンザウイルスを、前記アルキル化剤とともに、最大約２４、２０、１８、１６、１４、１２、１０、８、６、４、２、１．５時間、１時間、５０分間、４０分間、３０分間、２０分間、または１０分間インキュベートすることを含む、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記アルキル化剤が、ヘマグルチニン（ＨＡ）‐システイン濃度に対して１倍モル過剰を超える濃度で存在する、請求項２１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記アルキル化剤が、ヘマグルチニン（ＨＡ）‐システイン濃度に対して、１倍〜１００倍、５倍〜８５倍、１倍〜５０倍、または５倍〜５０倍モル過剰の範囲の濃度で存在する、請求項２１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記アルキル化剤が、１ｍＭ〜１Ｍ、１ｍＭ〜５００ｍＭ、１ｍＭ〜４００ｍＭ、１ｍＭ〜３００ｍＭ、１ｍＭ〜２００ｍＭ、または１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲の濃度で存在する、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記アルキル化剤が、約１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、または５００ｍＭの濃度で存在する、請求項２１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記アルキル化剤が、１μｇ／ｍｌ〜１，０００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項２１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記アルキル化剤が、約１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記アルキル化剤で処理する工程が、ヘマグルチニンの１つ以上のシステイン残基のアルキル化をもたらす、請求項２１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記アルキル化剤で処理する工程が、１〜５、１〜４、１〜３または１〜２個のシステイン残基のアルキル化をもたらす、請求項２１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記アルキル化剤で処理する工程が、１、２、３、４、または５個のシステイン残基のアルキル化をもたらす、請求項２１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記アルキル化剤で処理する工程が、存在する全システイン残基の約１〜５０％、１〜４０％、１〜３０％、または１〜２０％のアルキル化をもたらす、請求項２１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 前記アルキル化剤で処理する工程が、存在する全システイン残基の約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％のアルキル化をもたらす、請求項２１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記アルキル化剤で処理する工程が、実質的に全ての遊離システイン残基のアルキル化をもたらす、請求項２１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記アルキル化剤による処理が非特異的なアルキル化をもたらさない、請求項２１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
53. 前記アルキル化剤による処理が遍在性のメチル化をもたらさない、請求項２１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記アルキル化剤による処理が、アルキル化剤の処理をしないことを除いて他の点で同一のインフルエンザワクチンと比較して、一元放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）によって測定するインフルエンザワクチンの力価の喪失を減少させる、請求項２１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記アルキル化剤による処理が、前記インフルエンザワクチンを１〜３０℃で３０日間貯蔵した場合に、ＳＲＩＤによって測定する力価の喪失を５０％以下に減少させる、請求項２１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
56. 前記アルキル化剤で処理する工程が、前記インフルエンザワクチンを１〜３０℃で３０日間貯蔵した場合に、ＳＲＩＤによって測定する力価の喪失を３０％以下に減少させる、請求項２１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記アルキル化剤で処理する工程が、前記インフルエンザワクチンを１〜３０℃で３０日間貯蔵した場合に、ＳＲＩＤによって測定する力価の喪失を１０％以下に減少させる、請求項２１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
58. 前記アルキル化剤で処理する工程を、前記インフルエンザウイルスを不活化する工程の前に実施する、請求項２１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
59. 前記アルキル化剤で処理する工程を、前記インフルエンザウイルスを不活化する工程と同時に実施する、請求項２１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
60. 前記不活化工程が、前記インフルエンザウイルスを、紫外線または化学的不活化剤で処理することを含む、請求項５８または５９に記載の方法。
61. 前記不活化工程が、前記インフルエンザウイルスを、β‐プロピオラクトン、デオキシコール酸ナトリウムおよび／またはホルマリンから選択される化学的不活化剤で処理することを含む、請求項６０に記載の方法。
62. 前記不活化工程が、前記インフルエンザウイルスをホルマリンで処理することを含む、請求項６１に記載の方法。
63. 前記アルキル化剤を除去する工程をさらに含む、請求項２１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
64. 前記アルキル化剤をダイアフィルトレーションによって除去する、請求項６３に記載の方法。
65. 前記アルキル化剤を前記化学的不活化剤とともに除去する、請求項６４に記載の方法。
66. 前記インフルエンザワクチンが、１価、２価、３価または４価のインフルエンザワクチンである、請求項２１〜６５のいずれか１項に記載の方法。
67. 請求項２１〜６６のいずれか１項に記載の方法に従って製造されるインフルエンザワクチン。

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