JP2006257102A

JP2006257102A - 抗レトロウイルス免疫原、調製および使用

Info

Publication number: JP2006257102A
Application number: JP2006161682A
Authority: JP
Inventors: Jean-Francois Zagury; ザグリージャン−フランソワ; Jay Rappaport; ラッパポートジャイ; Miguel Carcagno; カーカグノミグエル
Original assignee: Biovacs Inc
Current assignee: Biovacs Inc
Priority date: 1997-12-26
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2006-09-28
Also published as: EP1042363B1; AU1568499A; US7022326B1; BR9814473A; EP1042363A1; AU1939799A; CY1106152T1; MXPA00006263A; PT1042363E; EP1041888A4; WO1999033346A1; EP1041888A1; DK1042363T3; ATE412006T1; CA2316811A1; FR2773156B1; JP2001527029A; FR2773156A1; DE69840152D1; WO1999033872A1

Abstract

【課題】本発明は、抗レトロウイルスに使用のための、新規なカルボキシメチル化トキソイド、およびこれらトキソイドの新規な簡単かつ効果的な生産方法を提供すること。
【解決手段】カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメントあるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメントであって、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２からなる群から選択されるウイルスに由来し、ＴａｔまたはＮｅｆであるか、あるいはＴａｔまたはＮｅｆに由来する、タンパク質またはフラグメント。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、レトロウイルス感染の処置および予防における使用のための、カルボキシメチル化されるレトロウイルス調節タンパク質またはそれらのフラグメント、あるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメントに関する。

（発明の背景）
ＡＩＤＳは、ＨＩＶ−１ウイルスにより誘導される。ＨＩＶ−１は、感染したＣＤ４（＋）Ｔ細胞を直接的に殺すだけでなく、未感染のＴ細胞の免疫抑制を誘導する。２つの免疫抑制タンパク質、インターフェロンαおよび細胞外Ｔａｔは、このプロセスを媒介する。

インターフェロンは、広い範囲の生物学的活性（例えば、抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性）を発揮することが公知である。当業者に理解されるように、インターフェロンは、種々の型の哺乳動物細胞からの排泄物として産生される、低分子量のポリペプチドである。その特性、化学的性質および調製方法は、広範に研究され、そして実証されてきた。現在、３つの主要な型のヒトインターフェロンが知られ、それぞれは、最初の産生株細胞および適用された誘導物質に従って区別される。それらは、インターフェロンα（白血球）、β（線維芽細胞）およびγ（免疫）である。

インターフェロンαは、組換えＤＮＡ技術により産生された最初のサイトカインの中の１つであり、炎症性疾患、ウイルス疾患、および悪性疾患のような状態における、治療的価値を有することが示されている。

ＨＩＶ−１ウイルスは、いくつかのタンパク質から構成される。これらのタンパク質の中で、ＴａｔおよびＮｅｆタンパク質は、ウイルス周期内で最も早期に産生される。以前に述べられたように、細胞外Ｔａｔタンパク質は、免疫抑制活性を有する。Ｔａｔタンパク質はまた、ＨＩＶ遺伝子発現の効率的な活性化因子である。

Ｔａｔの転写作用をブロックするような遺伝子的アプローチのように、Ｔａｔタンパク質の効果に対して戦うために、いくつかのアプローチが提案された。臨床試験をアンチセンスＲＮＡ（Ｈｙｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．）を用いて実施し、そしてインビトロ実験において、Ｔａｔの転写作用をブロックするためにＴＡＲ領域（ＲＮＡ中のＴａｔ結合部位）のＲＮＡを使用するリボザイムの可能性が示された。Ｔａｔの転写効果を阻害する、いくつかの薬理学的分子もまた記載されてきた。これら全ての方法は、Ｔａｔ転写活性をブロックすることによって、ウイルスの複製をブロックすることが意図された。

免疫学的方法もまた、提案されてきた。特許文献１は、特定の免疫化のために、タンパク質分解、化学合成、または遺伝子組換えにより得られる、レトロウイルスタンパク質ポリペプチド（ネイティブＴａｔタンパク質を含む）の利用を報告する。これらのレトロウイルスタンパク質ポリペプチドは、レトロウイルス複製および細胞障害活性を防御するための免疫原（特に、Ｔａｔのようなレトロウイルスタンパク質に罹患するリンパ球および神経細胞に対する）として使用される。しかし、ネイティブなタンパク質またはそれらのフラグメントの毒性は、免疫化のためのそれらの利用を防止する。

特許文献２は、非感染細胞による細胞外Ｔａｔタンパク質の取り込みをブロックするこ
とにより、ＨＩＶ−１の複製をブロックする免疫原として、ＨＩＶ−１ネイティブＴａｔタンパク質、欠失／置換を含むそのタンパク質またはポリペプチドのフラグメントの利用を報告する。特許文献２に報告された化合物の免疫原性が記載されたにもかかわらず、ネイティブＴａｔタンパク質の毒性効果、それにより誘導される免疫学的障害、および記載の免疫原での免疫化による中和抗体の非存在のような、特定の懸念も残っている。従って、ネイティブＴａｔタンパク質の全ての有害な効果を消失し、そしてまた、細胞性および／または体液性の免疫学的応答を誘導し得る、新規なＴａｔ不活性化免疫原の開発が必要である。

特許文献３は、ネイティブＴａｔタンパク質に対する免疫学的応答を誘導し、かつその免疫抑制効果を防御または修復し得る免疫原として、Ｔａｔトキソイドおよびレトロウイルス調節タンパク質の利用を報告する。これらのトキソイド（不活性化されているが免疫原性である産物）は、ネイティブなタンパク質またはこのタンパク質に由来するセグメントのホルムアルデヒドでの化学的処置により調製されてきた。しかし、アルデヒドでの不活性化は、容易に再現可能でない。工業生産のためには、特に不活性化の手順に関して、定期的な結果が必要である。定常構造および明確な産物もまた、好ましい。理想的な産物はまた、優れた安定期を有するべきである。
ＷＯ−Ａ−９１／１８４５４明細書ＷＯ−Ａ−９５／３１９９９明細書ＷＯ−Ａ−９６／２７３８９明細書

本発明は、抗レトロウイルスに使用のための、新規なカルボキシメチル化トキソイド、およびこれらトキソイドの新規な簡単かつ効果的な生産方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメントあるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメント。
（項目２）前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２からなる群から選択されるウイルスに由来する、項目１に記載のタンパク質またはフラグメント。
（項目３）前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＴａｔまたはＮｅｆであるか、あるいはＴａｔまたはＮｅｆに由来する、項目２に記載のタンパク質またはフラグメント。
（項目４）前記タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質であるか、またはＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質に由来する、項目１に記載のタンパク質またはフラグメント。
（項目５）カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメントあるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメントを含有する、融合ペプチド。
（項目６）前記融合タンパク質が、いくつかのヒスチジンを含む、項目５に記載の融合ペプチド。
（項目７）薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも１つの項目１に記載のタンパク質またはフラグメントを含有する、薬学的組成物。
（項目８）薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも１つの項目２に記載のタンパク質またはフラグメントを含有する、薬学的組成物。
（項目９）薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも１つの項目３に記載のタン
パク質またはフラグメントを含有する、薬学的組成物。
（項目１０）免疫学的に受容可能なキャリアと共に、免疫原性に有効量の少なくとも１つの項目１に記載の前記タンパク質またはフラグメントを含有する、ワクチン組成物。
（項目１１）さらに以下：
（ａ）アジュバント；
（ｂ）抗レトロウイルス免疫原；または
（ｃ）それらの混合物
を含有する、項目１０に記載のワクチン組成物。
（項目１２）前記抗レトロウイルス免疫原（ｂ）が、ＨＩＶ−１由来のエンベロープタンパク質ＧＰ１６０またはそのフラグメント、ＨＩＶ−１由来の膜貫通タンパク質ＧＰ４１またはそのフラグメント、ウイルスカプシドｇａｇタンパク質またはｐｏｌタンパク質を含有する、項目１１に記載のワクチン組成物。
（項目１３）実質的に免疫原性であるが、実質的に非毒性なレトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントを得るためのプロセスであって、以下：
（ｄ）該タンパク質もしくはインターフェロンαまたはそれらのフラグメントを、カルボキシメチル化に供する工程；および
（ｅ）実質的に免疫原性であるが、実質的に非毒性なタンパク質もしくはインターフェロンαまたはそれらのフラグメントを得る工程
を含む、プロセス。
（項目１４）前記タンパク質またはそのフラグメントが、カルボキシメチル化の間、融合ペプチドの形態であって、ここで該融合ペプチドが、該タンパク質またはそのフラグメントの精製を助ける、項目１３に記載のプロセス。
（項目１５）前記融合ペプチドが切断される、項目１４に記載のプロセス。
（項目１６）前記融合ペプチドがいくつかのヒスチジンを含む、項目１４に記載のプロセス。
（項目１７）前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントが、組換えＤＮＡ技術または化学合成により得られる、項目１３に記載のプロセス。
（項目１８）前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントが精製される、項目１７に記載のプロセス。
（項目１９）前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントがアフィニティークロマトグラフィーにより精製される、項目１８に記載のプロセス。
（項目２０）前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメントが、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２からなる群から選択されるウイルスに由来する、項目１３に記載のプロセス
（項目２１）前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメントが、ＴａｔまたはＮｅｆであるか、あるいはＴａｔまたはＮｅｆに由来する、項目２０に記載のプロセス。
（項目２２）哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物に対して、項目１に記載の、少なくとも１つのレトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において免疫応答を誘導するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２３）哺乳動物において体液性応答を惹起する方法であって、該哺乳動物に対して、項目１に記載の、少なくとも１つのレトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において体液性応答を惹起するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２４）哺乳動物において細胞性応答を惹起する方法であって、該哺乳動物に対して、項目１に記載の、少なくとも１つのレトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において細胞性応答を惹起するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）哺乳動物において抗体を惹起する方法であって、該哺乳動物に対して、項目１に記載の、少なくとも１つのレトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において抗体を惹起するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。

（発明の要旨）
従って、本発明は、抗レトロウイルスに使用のための、新規なカルボキシメチル化トキソイド、およびこれらトキソイドの新規な簡単かつ効果的な生産方法を提供することを目的とする。これらのトキソイドは、ＨＩＶ−１調節タンパク質に、またはインターフェロンαに主に由来し、これら双方は、ＨＩＶ−１感染における免疫抑制効果に寄与する。これらの調節タンパク質の中で、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、およびＶｉｆを主に議論する。

トキソイド戦略は、アミノ酸の置換／欠失戦略に関して、非常に有利である。多型性のＴａｔ効果の原因となるネイティブＴａｔタンパク質の領域は、明確でなく、そして置換／欠失を予測して、調製物の全体的な無害性を保証すること困難である。

例えば、Ｔａｔタンパク質のアミノ酸位置２５でのＣ→Ｇの変異は、その免疫抑制効果を排除することなく、Ｔａｔの転写活性化因子の効果を破壊する。さらに、ネイティブな分子（直鎖状の抗原および高次構造の抗原）に関して、アミノ酸の置換／欠失は、その改変された分子の構造を強く変化させ得、従ってネイティブな分子に対する適切な免疫学的反応の発生を防止する。この最後の点は、特に重要である。なぜなら、ネイティブなタンパク質に対する中和抗体の生成が必要であるからである。

従って、本発明は、カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントに関する。

好ましい実施態様において、そのタンパク質またはそのフラグメントは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１またはＨＹＬＶ−２に由来し、そして好ましくはＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に由来する。そのタンパク質またはそのフラグメントは、レトロウイルス調節活性のタンパク質またはフラグメントである。ＨＩＶ−１ウイルス調節タンパク質は主に、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、およびＶｉｆである。

本発明の別の実施態様において、そのタンパク質またはそのフラグメントは、Ｔａｔタンパク質に由来し、好ましくはＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質に由来する。

本発明の別の局面において、カルボキシメチル化レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはカルボキシメチル化インターフェロンαまたはそのフラグメントが、治療処置において使用される。本発明の由来する医薬は、例えば、レトロウイルス感染の治療処置または予防処置において、一般的に、あるいは特にインターフェロンα過剰産生により引き起こされる有害な効果から、またはウイルス、好ましくはＨＩＶ−１由来の調節タンパク質により引き起こされる効果から、それらの有用性が見出される。

本発明のさらに別の局面において、本発明の免疫原性化合物を含む薬学的組成物またはワクチン組成物を提供する。その免疫原性化合物は、単独で投与され得るか、本発明の別
の免疫原性化合物と共に投与され得るか、および／またはアジュバントのような受容可能な薬学的キャリアと共に投与され得るか、または他のレトロウイルス免疫原と共に投与され得る。

本発明はまた、免疫原性であるが非毒性のレトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントの調製のためのプロセスであって、その調節ウイルスタンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントがカルボキシメチル化され、そして所望の場合、次いで、この化合物が単離される事実により特徴付けられる、プロセスに関する。

本発明の別の実施態様において、上記のプロセスの実施において、タンパク質またはそのフラグメントは、その精製を可能にする化合物と融合される。例えば、タンパク質またはそのフラグメントは、いくつかのヒスチジン、好ましくは４、５または６、あるいはそれ以上の直列のヒスチジンを含むペプチドフラグメントと融合され、そのペプチドフラグメントは、精製工程のためのアフィニティーカラムのニッケル結合樹脂への固定化を可能にする。好ましい実施態様において、このペプチドは、精製後切断される。

本発明の別の実施態様において、調節レトロウイルスタンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントは、組換えＤＮＡ技術、または生化学合成および精製により調製され得る。組換えＤＮＡ方法を使用した後、作製されたタンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントは、例えば、その調節タンパク質またはインターフェロンαまたはこれらのフラグメントの１つに対して惹起された抗体を使用する、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。アフィニティーカラムに対するリンカーとして機能する、融合ペプチドに融合されるタンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質はまた、合成され得る。

本発明の別の実施態様において、哺乳動物における（体液性および／または細胞性の両方含む）免疫応答を誘導する方法を提供し、その方法は、少なくとも１つのカルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質、またはインターフェロンα、またはそれらのフラグメントを含む薬学的組成物あるいはワクチン組成物を、受容可能な薬学的キャリアと共に、免疫応答を誘導するのに十分な量で投与する工程を含む。

本発明のさらに別の実施態様において、哺乳動物において抗体を惹起する方法が提供され、その方法は、少なくとも１つのカルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質、またはインターフェロンα、またはそれらのフラグメントを含む薬学的組成物あるいはワクチン組成物を、受容可能な薬学的キャリアと共に、哺乳動物において抗体を惹起するのに十分な量で投与する方法を含む。

抗レトロウイルスに使用のための、新規なカルボキシメチル化トキソイド、およびこれらトキソイドの新規な簡単かつ効果的な生産方法が提供される。

（発明の詳細な説明）
本発明に従って、免疫系に対し毒素のようにふるまうタンパク質またはフラグメント（例えば、過剰生成されるインターフェロンα、ＴａｔまたはＮｅｆ）は、カルボキシメチル化により改変される。この化学的改変は、生物学的に不活性であるがそれらの免疫原性を保持する新規のタンパク質またはフラグメント（トキソイド）をもたらす。免疫系において毒素のようにふるまうネイティブのタンパク質またはフラグメントは、特許請求の範
囲のカルボキシメチル化されたタンパク質またはフラグメントに対して惹起される抗体によって認識される。このカルボキシメチル化タンパク質もしくはフラグメントは、中和抗体を産生するためか、またはネイティブタンパク質をブロックするために十分な免疫原性特性を保持し、そして同時にこのネイティブのタンパク質もしくはフラグメントの生物学的毒性性質の少なくとも９０％〜約９５％、または９９％でさえも、損失する。

本発明に従うカルボキシメチル化免疫原性化合物は、調節タンパク質全体またはそのフラグメントを含み得る。さらに、この化合物は、当業者に公知のように、改変がその化合物を毒性および活性な免疫原性特性のないままにする限り、このタンパク質またはフラグメントのアミノ酸の１つ以上の改変（例えば、欠失、置換、付加、またはアミノ酸のアシル化のような機能化）を含み得る。例えば、ロイシン残基のイソロイシン残基による置換は、これらの特性を改変しない。一般には、この改変は、３０％未満のアミノ酸、好ましくは２０%未満、より好ましくは、１０％未満のアミノ酸を含むべきである。

どのアミノ酸の変化が機能に有意な悪影響を有するようであるかに関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「ＤｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇｔｈｅＭｅｓｓａｇｅｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＴｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に見出され得る。

本発明のフラグメントを得るために、それぞれのタンパク質は消化され得る。これらのタンパク質は、当該分野において公知のように、エンドペプチターゼまたはプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン）のような酵素、あるいは臭化シアンのような化学薬剤を用いて消化され得る。

一般には、本発明に従うフラグメントは、免疫原性を保持し、そして毒性を避けるのに必要な長さと同じくらいの長さであり得る。例えば、本発明のペプチドフラグメントは、８〜１１０アミノ酸を有し得、好ましくは１２〜６０アミノ酸、または１２〜４０アミノ酸でさえも有し得る。このようなフラグメントはまた、本来のセグメントに隣接するアミノ酸とは異なる、Ｃ末端またはＮ末端における１つ以上の、最も好ましくは１〜５の追加のアミノ酸を有し得る。フラグメントはまた、少なくとも１つのカルボキシメチル化されるべきシステインを有さなくてはならない。さらに、改変、改変された免疫原とタンパク質もしくはその一部分との間の相同性または類似性、および免疫原性化合物の大きさ、そしてまた、本発明に従う免疫原性化合物の利用または結合に関する全ての方法は、破傷風トキソイドのような別の免疫原性タンパク質の参照によって解明され得る（ＷＯ−Ａ−８６／０６４１４またはＥＰ−Ａ−０２２０２７３またはＰＣＴ／ＵＳ８６／００８３１でさえも、この開示物は、本明細書中で参考として援用される）。

調節タンパク質由来の、本発明に従う免疫原性化合物は、実験の節において「ウイルストキソイド」と名づけられる。事実、先行技術の慣用的な細菌性トキソイドとして、本発明の化合物は、それら自体の毒素を欠乏する、しかしそれにもかかわらず、生物体へ投与する場合、免疫応答を誘発し得る。

ネイティブの調節タンパク質が、カルボキシメチル化された調節タンパク質またはフラグメントに対して惹起される抗体によって良好に認識されることを確認するために、ネイティブのタンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡ法によって免疫学的にアッセイされ得る。このアッセイは、当該分野において公知のようにおよび実験の節で見られるように、本発明のカルボキシメチル化ポリペプチドまたはオリゴペプチドに対して惹起される特異的な抗体の存在下において実行され、そしてＡｇ−Ａｂ複合体形成が決定される。例えば、競合免疫アッセイまたはサンドイッチ免疫アッセイが使用され得る。

調節タンパク質の免疫特性が、ネイティブのタンパク質に対して中和化抗体を産生するために十分保存／保持されているかどうかを測定するために、哺乳動物（ウサギ、ラット、マウス）は、本発明に従う免疫原性カルボキシメチル化化合物の補助で免疫化され得る。続いて、実験の節で実証されるように、産生された抗体が毒性のネイティブタンパク質の活性を中和するかどうかを確認し得る。

カルボキシメチル化調節タンパク質が、その毒性生物学的特性の少なくとも９０％を損失したかどうかを決定するために、Ｔａｔの場合、Ｔ細胞の免疫抑制、または新脈管形成における不活性化Ｔａｔの効果が研究され得る。

調節タンパク質Ｔａｔの不活性化は、例えば、複製がネイティブＴａｔの外部供給に依存するＨＬ−１細胞株で培養したＴａｔ欠損ＨＩＶ非感染変異体を使用したＴａｔレスキューアッセイによって、確認される。

本発明の免疫原性化合物は、好ましくはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−２ウイルスのいずれかの調節タンパク質由来、より好ましくはＮｅｆ、ＲｅｖまたはＶｐｒ由来、そして最も好ましくはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ウイルス由来のＴａｔ由来であり得る。

本発明の免疫原性化合物はまた、ＨＴＬＶ−１ウイルスまたはＨＴＬＶ−２ウイルスのＴａｘタンパク質由来であり得る。

インターフェロンαは、容易に利用可能である。例えば、ネイティブのヒトインターフェロンαは、全血液、新生児線維芽細胞、リンパ芽球腫および種々の白血病細胞株から単離される白血球を含むいくつかの細胞供給源から精製される。組換えインターフェロンαについて使用される利用可能な精製手法の総説について、Ｔ．Ｌ．ＮａｇａｂｈｕｓｈａｎおよびＰ．Ｐ．Ｔｒｏｔｔａ，Ｕｌｍａｎｎ’ｓＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＡ１４，ＶＣＨ：３７２（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＦｅｄｅｒａｌＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＧｅｒｍａｎｙ１９８９）を参照のこと。

ヒトインターフェロンαは、いくつかの異なる遺伝子ファミリー由来である。２４種より多くが、これまでに遺伝子およびタンパク質配列データから同定されている。大部分の種が、２３アミノ酸残基のシグナルペプチド配列および１６６アミノ酸残基の成熟アミノ酸配列を有する（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２９０：２０−２６（１９８１）；Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ，Ｃ．およびＷｅｂｅｒ，Ｈ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：２５１−３００（１９８６）；Ｚｏｏｎ，Ｋ．Ｃ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ９：１−１２（１９８７））。

本発明における使用のための他の開始タンパク質またはフラグメントは、Ｆｒａｎｋｅｌ，Ａ．Ｄ．ら、（ＣｅｌｌｕｌａｒｕｐｔａｋｅｏｆｔｈｅＴａｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ，Ｃｅｌｌ５５：１１８９−１１９３（１９８８））の文献に記載の公知の産物、または、ＨＩＶ−１ＮｅｆについてはＡｚａｄ，Ａ．Ａ．ら、（Ｌａｒｇｅｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１Ｎｅｆ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６５１−５５（１９９４））に記載の公知の産物のいずれかであるか、あるいは従来の方法で調製され得る。

特に、上記のタンパク質またはフラグメントは、以下：
（ａ）組換えＤＮＡ技術による合成または生物学的合成；および
（ｂ）精製
によって調製され得る。

組換えＤＮＡ法の使用の後、生成されたタンパク質もしくはそのフラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントは、例えば、タンパク質もしくはインターフェロンα、またはそれらのフラグメントの一つに対して惹起される抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。本発明のタンパク質、またはそのフラグメント、ならびにアフィニティーカラムでリンカーとして作用することにより精製工程で補助する融合ペプチド（例えば、ヒスチジンリッチオリゴペプチド）を含む融合タンパク質（ＦＰ）はまた、合成され得る。カルボキシメチル化レトロウイルス調節タンパク質もしくはそのフラグメント、またはインターフェロンαタンパク質もしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質は、本発明の別の実施態様である。

このタンパク質またはそのフラグメントが融合され、融合ペプチドとなる上記の手順についての別の実施態様において、この融合タンパク質は、以下：
例えば限外濾過法による濃縮工程；
例えばゲル濾過法による脱塩工程；
融合タンパク質を切断し、そしてそのタンパク質またはフラグメントを放出する、臭化シアン処理またはエンテロキナーゼ消化；
濃縮およびダイアフィルトレーション工程；
陽イオン交換クロマトグラフィー工程、および
限外濾過工程、続いて排除ゲル濾過によるによる濃縮工程、
に供され得る。

上記の臭化シアン反応は、チオエーテル切断し得る。ポリペプチド分子にわたる臭化シアン作用は、存在するメチオニン残基のレベルでの切断の実行において、選択的である。この反応は、メチオニン残基あたり２つのポリペプチドフラグメントの形成を生じる。この反応物は、記載のカルボキシメチル化反応物に有利に組み合せられ得るが、不活性化するためには必要ではない。

本発明はまた、免疫原性であるが毒性をもたないレトロウイルス調節タンパク質もしくはそのフラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントの調製についてのプロセスに関し、調節ウイルスタンパク質もしくはそのフラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントがカルボキシメチル化される事実により特徴付けられ、次いでこの化合物は、所望される場合、単離される。

このカルボキシメチル化反応は、アミノ酸鎖のシステイン（スルヒドリル基）に存在するチオール基を改変し得る。これらの基は、それぞれ、Ｓ−カルボキシメチル化またはＳ−カルボキシアミドメチル化におけるヨード酢酸またはヨードアセトアミドと反応する。各々の場合の反応産物は、Ｓ−カルボキシルメチルシステイニルまたはＳ−カルボキシメチルアミドシステイニル残基である。一般に、チオール基の少なくとも１つは、カルボキシルメチル化反応により改変されるべきである。本発明の化合物を得るためには、実質的な免疫原性を保持し、実質的な毒性を回避するために必要である程度の多くのチオール基が、カルボキシルメチル化によって改変されるべきである。

Ｔａｔタンパク質の場合、７つのシステイン残基が存在する。これらのシステイン残基は、鎖内または鎖間のジスルフィド架橋形成に関与し、そしてオリゴマーの形成に寄与する。ヒト、ウシ、マウスおよびラットのインターフェロンαファミリーは、ジスルフィド
架橋に関与する４つの保存的システインを含む（例えば、Ｓｐａｎｊａａｒｄ，Ｒ．Ａ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２４９：１８６−８８（１９８９）を参照のこと）。

このカルボキシメチル化反応はまた、他の化学試薬（例えば、過ギ酸、３−ブロモプロピオン酸、エチレンイミン、２−ブロモエチルトリメチルアンモニウムブロミド、２−ブロモエタンスルホネート、１，３−プロパンスルホン、ならびに当業者に周知の他の試薬（例えば、Ｍｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．およびＦｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ，ＣｈｅｍｉｃａｌＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ（１９７１）を参照のこと）を用いて実施され得る。

本発明の別の実施態様において、上記の免疫原性化合物を調製するプロセスの実施において、タンパク質またはそのフラグメントは、精製を可能にする化合物と結合される。例えば、そのタンパク質またはそのフラグメントは、いくつかのヒスチジンを含むペプチドフラグメント、好ましくは４、５もしくは６、もしくはより多くのヒスチジンをタンデムに含むペプチドフラグメントと融合され、そして精製工程のアフィニティーカラムのニッケル結合樹脂へ固定させる。好ましい実施態様において、このオリゴペプチドは、精製の後切断される。

このヒスチジンリッチペプチドの存在が全く毒性を誘導せず、および／またはこのタンパク質（またはフラグメント）の免疫原性を不利に改変しない場合、精製後のその切断は必要ではない。しかし、好ましい条件下で、この化合物は、それを除去するために切断される。

本発明の化合物、ならびに薬学的に受容可能なそれらの塩および酸は、有意な薬理的特性を有する。それらは、通常発揮する機能（例えば、免疫抑制効果、ＨＩＶ−１プロモータートランス活性化効果、Ｔａｔ酸化効果、ＭＤＢＫ系に対する抗水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）効果、またはインターフェロンαの免疫抑制効果）に関して生物学的に不活性である。

本発明の化合物は、マウスおよびヒトにおいて免疫原性である。それらは、中和化抗体を用いる液性免疫応答、ならびに細胞性免疫応答の誘導を誘発する。

従って、この発明はまた、ヒトまたは動物を含む治療上の処置における利用のための（すなわち、薬剤のように）、カルボキシメチル化タンパク質もしくはそのフラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントに関する。

本発明由来の薬剤は、例えば、インターフェロンαの過剰生成によって、またはウイルス（主にＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１もしくはＨＴＬＶ−２のようなレトロウイルス）由来の調節タンパク質の効果によって誘発される有害な効果の治癒的処置または予防処置において、有用性を見出す。

本発明における使用のためのレトロウイルスの調節タンパク質（例えば、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、Ｖｐｒ、およびＶｉｆ）は、比較的よく保存された領域を有する。特定の場合において、主に流行の地理的改変体に適応するために、同じ被験体が可変性株由来のトキソイドで免疫化され得る。

本発明に従った化合物は、ワクチン領域においての使用における任意の従来の経路（例えば、皮下、筋内、静脈内または経口）により投与され得る。投与は、単回用量または特定の期間の後の１回以上の反復用量としてであり得る。

本発明の免疫原性化合物は、以下のように使用され得る：本発明の免疫原性化合物は、皮下経路または筋内経路を介して、このタイプの処置を必要とする被験体における治療スケジュールの有効性について十分な量で、患者に投与される。投与される用量は、３ヶ月の間毎月、次いで誘導された血清抗体に従って定期的に（すなわち、２〜６ヶ月おきに）、エマルジョン形態（ｏ／ｈ）で筋内経路により５０〜１０００μｇの範囲であり得る。

薬物として、このタンパク質またはカルボキシメチル化されたフラグメントは、筋内経路、静脈内経路、皮内経路のために、および経口経路のためにでさえ設計された薬学的組成物にこのようにして組み込まれ得る。

本発明はまた、少なくとも１つの、活性成分として言及された成分を含む薬学的組成物に関する。これらの組成物において、活性成分は生理学的な有効用量で有利に存在する；この組成物は、少なくとも１つの活性成分の効果的な免疫原性用量を含む。免疫原性化合物は単独、または受容可能な薬学的賦形剤（例えば、アジュバント）と混合されて投与され得る。

これらの薬学的組成物は液状であり得、そしてワクチンについてのヒト薬物（例えば、エマルジョン形態での注射可能な調製物）において、現在使用される薬学的形態で存在する。それらは当該分野において公知の通常の方法により調整される。活性成分は、薬学的組成物において通常使用される賦形剤（例えば、水性ビヒクル、リン酸カルシウム、およびアルミニウムなど）に組み込まれ得る。

本発明のワクチンはまた、カプセル、溶液、経口投与のための懸濁液もしくはエリキシル、または滅菌の溶液形態（例えば、溶液もしくは懸濁液）のような形態で使用され得る。任意の非活性キャリア（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、またはタンパク質フラグメントもしくはペプチドまたは複合ワクチン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｖａｃｃｉｎｅ）が、適切な可溶性特性を有するような任意のキャリア）が好ましくは使用される。このワクチンは、単回用量調製物の形態、または大量のワクチン接種プログラムについて使用され得る複数回用量のフラスコの中に存在し得る。ワクチンを調製および使用する方法については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，Ｏｓｏｌ（編）（１９８０）；およびＮｅｗＴｒｅｎｄｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎＶａｃｃｉｎｅｓ，Ｖｏｌｌｅｒら（編）、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰａｒｋＰｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９７８）に、参考が記載される。

本発明のワクチンは、タンパク質特異的抗体の産生を増強するアジュバントをさらに含み得る。そのようなアジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、ステアリルチロシン（ＳＴ、米国特許第４，２５８，０２９号を参照のこと）、ＭＤＰとして公知のジペプチド、サポニン（米国特許第５，０５７，５４０号を参照のこと）、水酸化アルミニウム、およびリンパ性サイトカインのような種々の油性処方物を含むが、それらに限定されない。

フロイントアジュバントは、免疫原性物質と混合された鉱油および水のエマルジョンである。フロイントアジュバントは強力であるが、それは通常ヒトに投与されない。代わりに、ミョウバン（水酸化アルニミウム）アジュバントまたはＳＴが、ヒトへの投与について使用され得る。タンパク質フラグメントもしくはペプチドワクチンまたはそれらの複合ワクチンは、水酸化アルミニウム上に吸着され得、そこから、注射後に徐々に放出される。このワクチンはまた、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号に従って、リポソーム内にカプセル化され得る。

本発明はまた、薬学的組成物について、以下に関連する：
（ａ）予防薬剤もしくは治療薬剤、ウイルス性トキソイドまたはそれらのフラグメントとして含む、好ましくはＴａｔ由来の、本発明に従った薬学的組成物；
または
（ｂ）予防薬剤もしくは治療薬剤、抗−Ｔａｔ抗体、Ｆ（ａｂ’’）２またはＦａｂとして含む、カルボキシメチル化されたタンパク質またはそれらのフラグメントに対して免疫化された生物により産生される、本発明に従った薬学的組成物。

本発明はまた、公知の方法に従って、活性成分を受容可能な賦形剤（これは、薬学的に受容可能）と混合することにより特徴付けられる、上記の薬学的組成物を調製するための工程に関する。

さらに、本発明は、ワクチン組成物（活性成分（例えば、Ｔａｔ、Ｎｅｆ、もしくはインターフェロンαトキソイド、またはそれらの混合物、あるいは誘導体または抗−Ｔａｔ抗体）に加えて、さらに抗レトロウイルス特性を保有する別の免疫原をさらに含み得る）に関する。

例えば、他の免疫原は、エンベロープタンパク質ＧＰ１６０、ＨＩＶ−１由来の膜貫通タンパク質ＧＰ４１、もしくは当該分野において公知であるそれらのフラグメント、ウイルス性カプシドｇａｇタンパク質、またはｐｏｌタンパク質さえも含む。

本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を誘導する方法（体液性応答および／または細胞性応答の両方を含む）、少なくとも１つのカルボキシメチル化されたレトロウイルスの調節タンパク質、もしくはインターフェロンαまたはそれらのフラグメントを有する薬学的組成物あるいはワクチン組成物を、免疫応答を誘導するのに十分な量で、受容可能な薬学的キャリアと共に投与する工程を包含する方法に関する。

本発明はまた、哺乳動物において抗体を惹起する方法を包含し、この方法は、受容可能な薬学的キャリアと共に、哺乳動物において抗体を惹起するのに十分な量で、少なくとも１つのカルボキシメチル化されたレトロウイルスの調節タンパク質、もしくはインターフェロンαまたはそれらのフラグメントを有する薬学的組成物あるいはワクチン組成物を投与する工程を包含する。

さて、本発明を一般的に記載してきたが、同じことは、例示のために提供される以下の実施例の参照を通して、より容易に理解される。そしてこの実施例は、特に明記されないかぎり、本発明を限定することを意図されない。

（実験手順）
（調製Ａ）
形質転換により組み込まれた組換えプラスミド（Ｔａｔ遺伝子と関連する６−ヒスチジンポリペプチドをコードする遺伝子フラグメントを順に含む）を含有するＥ．ｃｏｌｉ細菌株Ｎｏ．Ｉ−１９６４（１９９７年１２月２６日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｎａｔｉｏｎａｌｅｄｅｃｕｌｔｕｒｅｓｄｅｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓｄｅＰａｒｉｓに寄託された）を、以下のように培養した：
２ｍｌのこの株の接種材料を、４００ｍＬの基本培養培地（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１ｇ／Ｌのトリプトン、１ｇ／ＬのＮａＣｌ）および４０ｍＬの溶液♯１（ＣａＣｌ2２Ｈ2Ｏ：０．１７５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ；５．９ｇ／Ｌ、グルコース：６ｇ／Ｌ）中で、２５０ｒｐｍで３０℃で１０時間インキュベートした。

上記された前発酵工程に続いて発酵し、コントロールを振盪することによって７０％飽和より低く溶解酸素レベルを維持する。６５０ｎｍで測定される光学密度がＯ．Ｄ．＝６．０の値に到達した時点で、脱イオン水中の３．７５％ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）滅菌溶液の１００ｍＬを添加した。同時に、培地を滅菌２５％酵母抽出物溶液で補給した。８．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4７Ｈ2Ｏ；３００ｇ／Ｌのグルコースおよび１０６ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4を含む溶液をまた、グルコース濃度を約２ｇ／Ｌま
たはそれを超える濃度に維持するために添加した。細菌集団をＩＰＴＧ添加の４時間後に回収した。濾過工程を、０．１ＭＴｒｉｓ；０．１ＭＮａＨ2ＰＯ4、１ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ８．０）の緩衝溶液に対して、向流濾過（０．３μｍ孔）により実施した。

３リットルの細菌粗抽出物を、フレンチプレスを通じて５００バール圧で４回通過後に溶解した。次いで、この溶解産物を５０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心した。次いで、固形尿素を最終濃度８Ｍまで上清液体に添加し、そしてｐＨを８に調整した。次いで、アフィニティ−クロマトグラフィーを、６００ｍＬの緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、０．１ＭＮａＨ2ＰＯ4、０．１ＭＴｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、ｐＨ８）で予め平衡化されたＮｉ−アガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上で実施した。

ロードした後、カラムを２５０ｍＬの緩衝液Ａでリンスし、そして期待される融合タンパク質を得るために溶出を非連続勾配で実施した。

そのようにして得られた溶液を、最終１０ｍｇ／ｍＬの濃度を得るために３，０００ダルトンの分子量切り捨てを伴うＡｍｉｃｏｎメンブレン上で濃縮した。粗溶出画分は、期待通りＨＩＶ−１Ｔａｔの組換え融合タンパク質を含んだ。

ヒスチジン−富化ペプチドをコードするフラグメントに遺伝的に融合されたＴａｔからなる融合タンパク質（これは、精製工程についてＮｉ−結合樹脂への結合を可能にする）をこのようにして得た。次いで、この溶出画分をカルボキシメチル化反応に供した。

（実施例１）
（Ｔａｔトキソイド調製）
（ステージＡ：カルボキシメチル化）
上記のように調製されるＴａｔタンパク質／ヒスチジン−富化ペプチド融合タンパク質を、８Ｍ尿素、０．３ＭＴｒｉｓＨＣｌ、１０ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ８．４）に取り入れるか、またはこれに調整する。

ヨード酢酸（２．６ｇ）を、１００ｍＬの上記の溶液に、非活性大気（ｉｎｅｒｔａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）下で添加する。この溶液を、暗黒下および非活性大気下で９０分間３７℃でインキュベートする。反応を１ｍＬの９８％ β−メルカプトエタノールを添加することによりブロックし、そしてこの溶液を８０分間、上記と同じ条件下でインキュベートする。

前記工程由来の溶液を、ＹＭ３メンブレン（３，０００Ｄ限界孔（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ
ｐｏｒｅ））上でＡｍｉｃｏｎ濃縮器（カタログ番号８４００）により、濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。

脱塩を、３００ｍＬの４Ｍ尿素および０．１ＭＨＣｌで平衡化されたＣｅｌｌｕｆｉｎｅＧＨ２５カラム（ＭＡＴＲＥＸ）で実施した。

（ステージＢ：精製）
次いで、溶出画分を限界濾過し、そしてカルボキシメチル化された産物からメチオニン位置でアミノ末端を切断するためにブロモシアンで処理した。ブロモシアンを、非活性大気下で、メチオニン１モル当たり約５０モルのＣＮＢｒの比率で、過剰に添加する。この溶液を密閉されたフラスコ中に２４時間、３７℃で貯蔵／保存する。過剰のＣＮＢｒを減圧下で蒸発させる。

次いで、このように得られた溶液を濃縮し、ＹＭ３（３０００Ｄ限界孔）メンブレンを有するダイアフィルターＡｍｉｃｏｎを使用することによって、酢酸／酢酸ナトリウム０．０５Ｍ緩衝溶液（ｐＨ５）に対してダイアフィルトレーションする。溶液中で得られた非活性産物の量は、約４５０ｍｇである。

この溶液を、２００ｍＬの緩衝液Ａで予め平衡化されたイオン交換ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムを通して濾過し、そしてその産物をＮａＣｌ勾配で溶出した。

溶出した画分を、再度同じＡｍｉｃｏｎシステムでのダイアフィルトレーションにより濃縮し、そして得られた画分を、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化されたＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムでのゲル濾過により精製した。この最終産物を０．２２μｍメンブレンを通して濾過し、そして使用まで４℃で保存した。

この産物を、以下に記載される分析および薬理学試験に供した。

（分析）
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試験により決定されるような非活性産物の総量：１５０ｍｇ。

ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、銀染色。（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、同質ゲル２０％アクリルアミド）：期待分子量の固有のバンド；より低いまたはより高い分子量値の、他のバンドは全く検出されない。

等電点勾配による電気泳動（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＧＥＬＩＥＦ３−０）：単一の明白なバンドが観察された。

ウエスタンブロット（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ハイブリドーマ５Ｇ１１由来のモノクローナル抗体：単一バンドが観察され、そして凝集物質または分解物質は、全く観察されなかった。

生物学的活性（細胞株ＨｅＬａＨＩＶ−１−ＬＴＲＣＡＴにおけるＣＡＴ遺伝子の誘導）：検出可能な活性は全く観察されなかった。

ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（４７７Ａモデル）シークエンサーでの標準エドマン技術によるＮ末端領域の配列決定：得られた最初の２０のアミノ酸は、期待される配列に一致した：
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−
Ｔｈｒ−Ａｌａ
（配列番号１）。

内毒素（ＵＳＰＸＸＩＩＩプロトコールに従ったＬＡＬ試験）：タンパク質１ｍｇあたり０．５未満の内毒素単位が観察された。

無菌性（ＵＳＰＸＸＩＩＩプロトコールに従う）：満たされた規格。

置換程度の測定：標準曲線の投薬システインとの比較により、遊離スルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を決定するためにエルマン試薬を使用した。；ネイティブＴａｔをカルボキシメチル化されたＴａｔと比較することにより、０．０３％のシステインのみがカルボキシメチル化されたＴａｔにおいて活性を残存し、３３３０の不活性システインあたり１つの活性システインを生じた。

簡単な計算は、これらの条件下で７つの活性なシステインを有する単一のＴａｔ分子を得るためにはは、数キログラムのＴａｔタンパク質を有する必要があることを示す。この不活化は、ほぼ完全であった。

（実施例２）
（Ｎｅｆトキソイドの調製）
クローニングによるＮｅｆトキソイドの調製のために、Ｎｅｆ配列由来のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＨＩＶ−１感染細胞からＮｅｆｃＤＮＡを得た。ヒスチジンリッチな遺伝子セグメントを含む、実施例１において使用されたものと同一のプラスミド（これは、Ｎｉ−カラムへの連結を可能にする）を、使用した。従って、この産生プロトコルおよび精製は、切断がＣＮＢｒの代わりにエンテロキナーゼ消化によって行われることを除いて、実施例１に記載されたものと同じである。得られた結果は、Ｔａｔタンパク質について得られた結果と類似していた。

（実施例３）
（ＩＦＮα−トキソイドの調製）
この場合において、プラスミドは、融合タンパク質をコードしない。インターフェロンαタンパク質を、ヒスチジンリッチなペプチドをコードする遺伝子フラグメントを使用せずに、組換えＤＮＡ方法論によって直接産生した。αインターフェロンを、抗インターフェロンαモノクローナル抗体を付着したカラムアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。

溶出後、タンパク質を、実施例１に記載されたものと同じプロトコルに従って、即時に不活化した。

分析からの結果は、Ｔａｔタンパク質について得られた結果と同じであった。非抗ウイルス活性（ＭＤＢＫ細胞上のＶＳＶ）を示す生物学的試験を使用して、生物学的不活化が完全であることを結論付けた。

（実施例４）
（薬理学的研究：Ｔａｔの免疫抑制効果の非存在）
ネイティブのＴａｔタンパク質の免疫抑制効果を示す簡単な試験が存在する。末梢血細胞（ＰＢＭＣ）を、０〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度のネイティブのＴａｔタンパク質またはトキソイドＴａｔタンパク質とともに、血清を含まない培地中でインキュベートした。２時間後、血清を添加して１０％の最終濃度にし、そして細胞をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いて、または記憶抗原「ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｅｄＤｅｒｉｖｅｄ」（ＰＰＤ）によって刺激した。ＳＥＢについては３日後、またはＰＰＤについては５日後に、増殖を評価した。

増殖の減少は、ネイティブのＴａｔタンパク質について、用量依存性の様式で観察されたが、減少は、トキソイドについては観察されなかった。

図１において、左側の棒グラフはネイティブのＴａｔに対応し、そして右側の棒グラフは、実施例１の化合物（Ｔａｔトキソイド）に対応する。横軸において、生成物濃度が、μｇ／ｍＬで、０、１、３、および１０として表される。縦軸において、Ｔ細胞の増殖の百分率が示される。コントロールは、０μｇ／ｍＬのＴａｔ濃度に対応する。この結果は、ネイティブのＴａｔは細胞性の増殖を阻害したが、実施例１の化合物は効果的でなかったことを示す。

（実施例５）
（マウスにおけるＴａｔトキソイドの免疫原性、中和抗体の産生）
Ｔａｔトキソイドを、マウスの免疫化のために、実施例１のように調製した。免疫プロトコルは、古典的に使用されるものである：
完全フロイントアジュバント（１００μＬ）を有する、２０μｇの生成物を含むトキソイドのエマルジョン（１：１）を、０日目に、筋内経路によってマウスに注射した。

不完全フロイントアジュバント（５μｇ）中の記憶抗原を、２１日目、および３５日目に注射した。マウス血清を−２、２８および４０日目に抽出し、そして抗Ｔａｔ抗体を、ネイティブの（化学的に処理していない）Ｔａｔタンパク質または実施例１の化合物で感作したプレート上でＥＬＩＳＡによって評価した。血清を、１：１０００希釈液で試験した。得られた結果を、３匹の免疫されたマウス（１〜３）および３匹の免疫されていないマウス（４〜６）について、光学密度（ＯＤ）単位で表し、以下の表に示す：

これらの結果は、トキソイド免疫したマウスが、同様の様式でネイティブのタンパク質およびトキソイドを認識する抗体を産生したことを示す。

これらの抗体はまた、中和していた。この事実は、２つの異なる試験によって証明された。

Ｔａｔタンパク質の不活化試験：ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）（これは、ＬＴＲプロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする）を含むプラスミドで安定にトランスフェクトした、ＨｅＬａ−ＨＩＶ１−ＬＴＲ−ＣＡＴ細胞株の培養物に、免疫されたマウスまたは免疫されていないマウス（０日目または４０日目）由来の血清（１：５０希釈）とともに１時間プレインキュベートした、ネイティブのＴａｔタンパク質またはトキソイドＴａｔタンパク質を供給した。ネイティブのＴａｔタンパク質（５μｇ／ｍＬ）は細胞に侵入し、そしてＨＩＶ−１由来のＬＴＲに対するこのトランス活性化の効果を及ぼして、ＣＡＴタンパク質発現を誘導した。

４８時間後、細胞を溶解し、そしてＣＡＴタンパク質の量を、ＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）試験によって決定した。結果を、ＯＤ単位で表す：

これらの結果は、免疫化されたマウス血清（マウス２０；２）が、ネイティブのタンパク質についての中和抗体を含んだことを示す。これは、免疫されていないマウス血清の場合にはあてはまらない。

さらに、上記の免疫抑制試験においてトキソイド免疫されたマウスによって産生された抗体が薬理学的実験（１：５０希釈）で使用される場合、ネイティブのＴａｔタンパク質の免疫抑制効果は、ブロックされた。

これらの結果は全て、実施例１の化合物が免疫原性であり、そしてネイティブのタンパク質を中和する免疫応答を誘導することを示す。

（実施例６）
（マウスにおけるＩＦＮαトキソイドの免疫原性、中和抗体の産生）
実施例３において調製されたＩＦＮαトキソイドを、マウス免疫のために使用した。免疫プロトコルは、古典的に使用されるものである：マウスに、２０μｇの産生物を含む完全フロイントアジュバントとの１００μＬのエマルジョン（１：１）を０日目に筋肉内に注射し、そして不完全フロイントアジュバント（５μｇ）中の記憶抗原を、２１日目、３５日目、および４５日目に注射した。マウス血清を−２、２８および５０日目に抽出し、そして化学的に処理していない組換えネイティブのＩＦＮαか、またはトキソイドのいずれかで感作されたプレート上でＥＬＩＳＡによって分析した。

血清を、１：１０００希釈液で試験した。３匹の免疫されたマウス（１〜３）および３匹の免疫されていないマウス（４〜６）について、ＯＤ単位で表した結果を、以下の表に示す：

これらの結果は、トキソイド免疫されたマウスが、同様の様式でネイティブのタンパク質およびトキソイドを認識する抗体を産生したことを示す。さらに、マウスが、免疫を十分に寛容化するので、これらの結果は、トキソイド免疫の無毒性（ｉｎｎｏｃｕｉｔｙ）を確認する。

これらの抗体はまた、中和している。この事実は、古典的なＭＤＢＫ細胞上のＶＳＶ試験によって証明された。通常は、細胞は、ＩＦＮαの１〜１０単位の添加によってＶＳＶ溶解耐性になる。インキュベーションがネイティブのＩＦＮαに関して１：５０希釈でのマウス１または４（Ｄ０−Ｄ５０）の血清とともに実行された場合、溶解は、５０日目でのマウス１の血清とともにプレインキュベーションしたネイティブのＩＮＦαの場合においてのみ、観察された。

この実施例は、実施例３の化合物が、免疫原性であり、そしてネイティブのタンパク質を中和する抗体の産生を誘導することを示す。

（実施例７）
（マウスにおけるトキソイドＮｅｆ免疫原性）
実施例２において調製されるような、トキソイドＮｅｆを、マウス免疫のために使用した。古典的なプロトコルを使用した：完全フロイントアジュバント中で２０μｇの生成物を含む、１００μＬのＮｅｆトキソイドの（１：１）エマルジョンを、２１日目および３５日目に、マウスに筋肉内に感染させた。マウス血清を、−２，２８および４０日目に抽出し、そして化学的に処理していないネイティブの組換えＮｅｆか、または実施例２のＮｅｆトキソイドのいずれかで感作したプレートを用いるＥＬＩＳＡによって分析した。血清を、１：１０００希釈において試験した。得られた結果を、３匹の免疫されたマウス（１〜３）および３匹の免疫されていないマウス（４〜６）について、ＯＤ単位で表し、以下の表に示す：

これらの結果は、実施例２のＮｅｆトキソイドで免疫されたマウスが、同様の様式でネイティブのタンパク質およびトキソイドを認識する抗体を産生したことを示す。さらに、マウスが、免疫を十分に寛容化したので、これらの結果は、Ｎｅｆトキソイド免疫の無毒性を確認した。

（実施例８）
（ＨＩＶ−１によるインビトロ感染に対する、ＴａｔおよびＩＦＮαトキソイド免疫されたマウスの効果）
インビトロ誘導された免疫抑制の試験をまた、開発した。この試験は、以下の様式で実施された：
健常な被験体由来の末梢血細胞（ＰＢＭＣ）を、ＨＩＶ−１リンパ栄養（ＨＩＶ−ＨＴＬＶＩＩＩＢ）株によって感染させた。フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＰＨＡ）刺激、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下での６日間の培養後に、細胞を照射した。照射された細胞は抑制性であり、ＳＥＢまたはＰＰＤのような刺激抗原によって、ＰＢＭＣ増殖を阻害し得る。逆転写酵素またはｐ２４抗原アッセイが、上清液中で陰性であったために、この免疫抑制効果は、照射後に残存するウイルスにつながらなかった
。

ウイルスを含まないコントロール細胞の調製物が、ＰＨＡでの刺激の６日後、同様の様式で照射され、次いで、ＳＥＢまたはＰＰＤによって刺激された細胞に添加された場合、増殖の阻害は、少しも観察されなかった。この阻害効果は、ＨＩＶ−１ウイルスに起因した。Ｊ．Ｆ．Ｚａｇｕｒｙら（代理人の手書きの注記）ＡＩＤＳを導くＨＩＶ−１誘導免疫抑制におけるＴａｔおよびＩＦＮαの重要な役割（ＣｅｌｌＰｈａｒｍａｃｏｌ．ＡＩＤＳＳｃｉｅｎｃｅｓ３：９７〜１０３（１９９６））は、これらのタンパク質に対する中和抗体が抑制性細胞形成を阻害するために、この抑制細胞の発生が、ＩＦＮαおよびＴａｔタンパク質の両方に依存することを記載する。

ＴａｔおよびＩＦＮαトキソイド免疫されたマウスの血清（１：５０希釈）（実施例１および３）を添加した同様の実験において、これらは、抑制細胞の生成をブロックした。これは、免疫されていない（ネガティブコントロール）または予備免疫されたマウス血清に関してあてはまらなかった。Ｔａｔトキソイド免疫されたマウスの血清のみが使用された場合、この免疫抑制は、ブロックされなかった。対照的に、ＩＦＮαトキソイド免疫されたマウスの血清は、免疫抑制の７０％の阻害を生じる。

抗Ｔａｔ血清および抗ＩＦＮα血清の両方を組合わせる場合、抑制細胞の生成は、完全にブロックされた。これらの結果は、異なるウイルスバッチ、主に最初の単離物を使用することによって得られた。これは、１つのトキソイドで得られたＴａｔに対する抗体はまた、交差反応を示し得ることを示す。これらの結果（Ｊ．Ｆ．Ｚａｇｕｒｙら（前掲書中）（１９９６）に記載される）は、ＡＩＤＳ患者における免疫抑制状態に対する、組合されたＴａｔおよびＩＦＮαで免疫された血清の阻害効果を立証する。これらはまた、この免疫抑制におけるＴａｔの開始因子の役割およびＩＦＮαの決定因子の役割を確証する（Ｄ．Ｚａｇｕｒｙら、ＩＦＮａｎｄＴａｔｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅ
ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄＴｃｅｌｌｓ
ａｎｄＣ−Ｃ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｄｅｃｌｉｎｅｉｎＡＩＤＳＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８印刷中、を参照のこと）。

これらの研究の結果は、中和抗体応答を誘導することによって、可能であれば、細胞性免疫応答の誘導によるＴａｔの産生に対して作用することによって、細胞外Ｔａｔの効果を阻害する必要性を示す。

（実施例９）
（ヒトにおける、組み合わせるか、または組み合わせないＴａｔおよびＩＦＮαトキソイドの免疫原性ならびに無害性；化学療法との適合性）
表１、２、および３は、ＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ）：本発明による１００μｇの活性剤を含む１ｍＬ容量の５０：５０エマルジョンにおいて、実施例１および３のトキソイドを使用するフェーズ１臨床試験の間に得られた結果を記載する。ＩＦＮαトキソイドに対する応答（データは示していない）は、ホルマリン化（ｆｏｒｍｏｌｉｚａｔｉｏｎ）によって調製されたトキソイドに関して、Ｇｒｉｎｇｅｒｉら、Ｊ．ＡＩＤＳ７：９７８〜９８８（１９９４）および１３：５５〜６７（１９９６）の論文に既に記載された応答と同様であった。
表１：フェーズ１臨床試験において含まれる患者の説明。
表２：開始時および終了時（一般に６ヶ月）での生物学的パラメーター。
表３：抗Ｔａｔ特異的応答の分析。

図１は、正常リンパ球の増殖に対する、実施例１の産物の効果と比較した、ネイティブＴａｔの効果の結果を示している。

Claims

カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメントあるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメント。