ES2267199T3 - Nuevos inmunogenos anti-vih (toxoides), procedimientos de preparacion y aplicacion para la prevencion y para el tratamiento del sida. - Google Patents

Nuevos inmunogenos anti-vih (toxoides), procedimientos de preparacion y aplicacion para la prevencion y para el tratamiento del sida. Download PDF

Info

Publication number
ES2267199T3
ES2267199T3 ES98959984T ES98959984T ES2267199T3 ES 2267199 T3 ES2267199 T3 ES 2267199T3 ES 98959984 T ES98959984 T ES 98959984T ES 98959984 T ES98959984 T ES 98959984T ES 2267199 T3 ES2267199 T3 ES 2267199T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protein
fragment
tat
hiv
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98959984T
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Francois Zagury
Jay Rappaport
Miguel Carcagno
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Neovacs SA
Original Assignee
Neovacs SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neovacs SA filed Critical Neovacs SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2267199T3 publication Critical patent/ES2267199T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/826—Viruses

Abstract

Proteína o fragmento de proteína de 8 a 110 ácidos aminados, caracterizada porque son carboximetilados por reacción con el ácido idoacético y porque se trata de una proteína de regulación viral o fragmento de proteína de regulación viral.

Description

Nuevos inmunógenos anti-VIH (toxoides), procedimientos de preparación y aplicación para la prevención y para el tratamiento del SIDA.
El SIDA es inducido por la infección por el virus VIH-1. Este virus está compuesto por varias proteínas. Entre estas proteínas, la proteína Tat es, con la proteína Nef, la producida más precozmente en el ciclo viral.
Para luchar contra los efectos de la proteína Tat se han propuesto varias aproximaciones genéticas para bloquear la acción transcripcional de la proteína Tat. Así se han realizado unos ensayos clínicos con unos antisentido (sociedad Hybridon); experimentos in vitro han demostrado la practicabilidad de ribozimas o incluso de señuelos que utilizan el ARN de la zona TAR (lugar de unión de la proteína Tat con el ARNm).
También se han descrito moléculas farmacológicas inhibidoras del efecto transcripcional de la proteína Tat.
Todos estos métodos pretenden bloquear la replicación del virus bloqueando la acción transcripcional de la proteína Tat.
También se han propuesto desde hace tiempo métodos inmunológicos.
Para una inmunización específica contra la proteína Tat nativa el documento WO-A-91/18454 refiere la utilización de polipéptidos de proteínas retrovirales, incluyendo la proteína Tat nativa, obtenidas mediante cortes proteolíticos, síntesis química o recombinación genética, como inmunógenos para prevenir la replicación retroviral y la actividad citotóxica contra, en particular, los linfocitos y las células nerviosas ejercidas por la proteínas retrovirales entre las cuales en particular la proteína Tat. La toxicidad de la proteínas nativas o sus fragmentos impide de todas formas su utilización para una inmunización.
El documento WO-A-95/31999 refiere la utilización de la proteína Tat nativa del VIH-1, de fragmentos de dicha proteína o de polipéptidos con unas deleciones/sustituciones como inmunógenos con la finalidad de bloquear la replicación del VIH-1 bloqueando la captura de la proteína Tat extracelular por las células no infectadas. Pese a la inmunogenicidad descrita, teniendo en cuenta en particular los efectos tóxicos de la proteína nativa Tat, los desordenes inmunitarios que induce, y la ausencia de anticuerpos neutralizantes por la inmunización con los inmunógenos descritos en esta patente, es efectivamente necesario desarrollar nuevos inmunógenos Tat inactivados (que han perdido todos los efectos nocivos de la proteína Tat nativa) capaces de inducir una respuesta inmunitaria humoral y
celular.
El documento WO-A-96/27389 refiere la utilización de nuevos productos, unos toxoides de la proteína Tat y de proteínas reguladoras retrovirales como inmunógenos capaces de inducir una respuesta inmunitaria contra la proteína Tat nativa y prevenir ó reparar sus efectos inmunosupresores. Estos toxoides, que son unos productos inactivos pero inmunogénicos, han sido preparados mediante tratamiento químico con formaldehído de la proteína nativa o de unos segmentos derivados de esta proteína. Pero la inactivación con ayuda de un aldehído es delicada. Ahora bien, para una producción industrial, se necesitan resultados regulares, en particular para la inactivación. Las agencias sanitarias prefieren además unos productos que tengan una estructura constante y bien definida para autorizar su puesta en el mercado. Además, un producto ideal debería tener una buena estabilidad a lo largo del tiempo.
Por estas razones la presente solicitud tiene por objeto unos nuevos toxoides y un nuevo método simple y eficaz para fabricar estos toxoides en particular a partir de las proteínas de regulación del VIH-1 que contribuyen al efecto inmunosupresor del VIH-1.
La estrategia de los toxoides tiene grandes ventajas sobre las sustituciones/deleciones de ácidos aminados: las zonas de la proteína Tat nativa responsables de los efectos pleomorfos de la proteína Tat no están bien identificadas y es difícil predecir a priori las sustituciones/deleciones que aseguran una inocuidad total a la preparación. Por ejemplo la mutación del residuo C25 en G anula el efecto transactivador de la proteína Tat sin suprimir su efecto inmunosupresor. Por otra parte, las sustituciones/deleciones pueden alterar en gran manera la estructura de la molécula modificada con respecto a la molécula nativa (antígenos lineales y de conformación) y así impedir el desarrollo de una reacción inmunitaria eficaz contra la molécula nativa. Este último punto es particularmente importante para la generación de anticuerpos neutralizantes contra la proteína nativa.
Por lo tanto la presente solicitud tiene por objeto una proteína de regulación viral o un fragmento de 8 a 110 ácidos aminados de proteína de regulación viral caracterizados porque son carboximetilados, por reacción con ácido iodoacético o por reacción con la iodoacetamida.
En una condiciones preferidas de realización de la invención, la proteína o el fragmento indicados anteriormente provienen del virus VIH.1, VIH-2, HTLV-1 ó HTLV-2 y en particular del virus VIH-1 ó VIH-2.
En otras condiciones preferidas de realización de la invención, la proteína o fragmento indicado anteriormente es una proteína de regulación viral o un fragmento de proteína de regulación viral.
En otra condiciones preferidas de realización de la invención la proteína o fragmento indicado anteriormente proviene de la proteína TAT en particular del VIH-1.
La presente solicitud tiene también por objeto un procedimiento de preparación de una proteína o de un fragmento tal como los definidos anteriormente, caracterizado porque se somete dicha proteína de regulación viral o dicho fragmento a una carboximetilación, para obtener el compuesto esperado que se aísla.
Según la invención, las proteínas o fragmentos que se comportan como unas toxinas sobre el sistema inmunitario, sean por ejemplo Tat o Nef son modificados por la carboximetilación. Esta modificación química conduce a unas nuevas proteínas o fragmentos que son inactivos biológicamente pero conservan su inmunogenicidad. En otros términos, estas proteínas o fragmentos que se comportan como toxinas sobre el sistema inmunitario son reconocidos por unos anticuerpos producidos contra las proteínas o fragmentos carboximetilados según la invención. Estas proteínas o fragmentos carboximetilados conservan unas propiedades inmunógenas suficientes para crear unos anticuerpos que neutralizan o bloquean dicha proteína nativa y al mismo tiempo han perdido al menos 90%, preferentemente al menos 95%, en particular al menos 99% de las propiedades biológicas tóxicas de dicha proteína nativa es decir sus bien conocidas propiedades biológicas habituales.
El compuesto inmunógeno carboximetilado según la invención puede estar constituido por la totalidad o por un fragmento de 8 a 110 ácidos aminados de la proteína de regulación y puede presentar, como es bien sabido por el experto en la materia, una o varias modificaciones en los ácidos aminados de esta proteína o fragmento tales como unas deleciones, sustituciones, adiciones, o funcionalizaciones tales como la acilación de ácidos aminados, en la medida en que estas modificaciones quedan en el marco citado anteriormente (ausencia de toxicidad, caracteres inmunológicos). Por ejemplo, en general el reemplazo de un residuo leucina por un residuo isoleucina no modifica dichas propiedades. Las modificaciones deben generalmente referirse a menos del 30% de los ácidos aminados, preferentemente a menos del 20% y muy particularmente a menos del 10%.
Un fragmento puede comprender de 8 a 110 ácidos aminados por ejemplo, preferentemente de 12 a 60 ácidos aminados y en particular de 12 a 40 ácidos aminados. Dicho fragmento puede también comprender del o de los lados C ó N terminal de 1 a 5 ácidos aminados suplementarios, es decir diferentes del segmento original. Un fragmento debe además comprender una cisteina al menos para poder ser objeto de la carboximetilación.
De forma general, en cuanto a lo que se refiere a la modificaciones, la homología o la similitud entre el inmunógeno modificado y la proteína o parte de la proteína nativa, así como las dimensiones del compuesto inmunógeno, así como las modalidades de utilización, o de acoplamiento del compuesto inmunógeno según la invención con una proteína inmunógena tal como el toxoide tetánico, se puede hacer en particular referencia al documento WO-A-86/06 414 o al documento EP-A-0.220.273 o también al documento PCT/US.86/00831, que son equivalentes, y cuyas enseñanzas son incorporadas aquí como referencia.
Los compuestos inmunógenos según la invención que derivan de proteínas de regulación serán llamadas a veces seguidamente en la parte experimental "toxoides virales".
En efecto, al igual que los toxoides bacterianos clásicos, están desprovistos de toxicidad propia, pero son capaces de todas formas de provocar una inmunización por administración a un individuo.
Con la finalidad de verificar que la proteína de regulación nativa es bien reconocida por unos anticuerpos dirigidos contra dicha proteína de regulación modificada, se puede por ejemplo verificar inmunológicamente por Elisa en presencia de anticuerpos específicos, la formación de complejos antígenos-anticuerpo como se verá seguidamente en la parte experimental.
Con la finalidad de determinar si las propiedades inmunógenas de la proteína de regulación han sido conservadas lo suficiente para crear unos anticuerpos que neutralizan dicha proteína nativa, se pueden, por ejemplo, inmunizar unos mamíferos (conejos, ratas, ratones) con ayuda de un compuesto inmunógeno según la invención y verificar que los anticuerpos producidos neutralizan las actividades tóxicas de la proteína Tat.
Con la finalidad de determinar si la proteína de regulación modificada ha perdido al menos 90% de sus propiedades biológicas tóxicas, se puede por ejemplo estudiar, con referencia a la proteína Tat, el efecto de la proteína Tat inactivada sobre la inmunosupresión de las células T o sobre la neoangiogénesis.
La inactivación de la proteína de regulación Tat es verificada por ejemplo por el "Tat Rescue Assay" que utiliza un mutante del HIV no infeccioso Tat deficiente cultivado sobre la descendencia celular HL-1 cuya replicación depende de un aporte exógeno de Tat nativa.
El compuesto inmunógeno según la invención puede derivar en particular de una cualquiera de las proteínas de regulación de los virus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ó HTLV-2 y en particular Nef, Rev y preferentemente Tat de los virus VIH-1 y VIH-2.
También se puede citar la proteína Tax del HTLV-1 o HLTV-2.
La presente solicitud tiene también por objeto un procedimiento de preparación de una proteína o de un fragmento tal como el definido anteriormente, caracterizado porque se somete dicha proteína de regulación viral o dicho fragmento a una carboximetilzación, por reacción con el ácido iodoacético o por reacción con la iodoacetamida, para obtener el compuesto esperado que si se desea se aísla.
La reacción de carboximetilación permite modificar los grupos tiol (grupo sulfidril) presentes a nivel de los residuos cisteina del encadenamiento de ácidos aminados. Estos grupos reaccionan con el ácido iodoacético o la iodoacetamida mediante una reacción de S-carboximetilzación ó S-carboxiamidometilación, respectivamente.
Por ejemplo, la proteína Tat posee 7 cisteinas. Estas cisteinas participan en la formación de puentes disulfuro inter. e intracadenas y contribuyen a la formación de unos oligómeros.
El producto de la reacción es en cada caso un residuo S-carboximetilcisteinil o S-carboximetilamidocisteinil.
La reacción de carboximetilación también se puede realizar con otros agentes químicos como el ácido perfórmico, el ácido 3-bromopropiónico, la etilenimina, el bromuro de (2-bromoetil) trimetilamonio, el 2-bromoetansulfonato, la 1,3-propansulfona etc..
En unas condiciones preferidas de realización del procedimiento descrito anteriormente, dicha proteína o dicho fragmento de partida se presenta en forma fusionada con un marcador (FP) cuando se le somete a la carboximetila-
ción.
Las proteínas o fragmentos de partida del procedimiento son unos productos conocidos, descritos en la literatura, por ejemplo para la Tat del VIH-1 por Frankel A.D. et al. (Cellular Uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus, Cell, 1988, 55:1189-93) o para la Nef del VIH-1, por Azad A.A. et al. (Large-scale production and characterization of recombinant human immunodeficiency virus type 1 Nef, J. Gen. Virol. 1994, 75: 651-55), o pueden ser preparados de manera convencional.
Se pueden en particular preparar las proteínas o fragmentos de partida mencionados anteriormente mediante:
1)
Síntesis por ingeniería genética o síntesis bioquímica;
2)
Purificación
Mediante la ingeniería genética, se pueden purificar las proteínas producidas por cromatografía de afinidad utilizando por ejemplo anticuerpos dirigidos contra la proteína o uno de sus segmentos; se puede también sintetizar la proteína fusionada con un marcador (FP) que servirá para el enganchado a una columna de afinidad.
En otras condiciones preferidas de realización del procedimiento descrito anteriormente, cuando la proteína o fragmento está fusionada con un marcador (FP), es sometida a:
-
una concentración, por ejemplo, por ultrafiltración;
-
un desalado, por ejemplo, por gel filtración;
-
un tratamiento con bromuro de cianógeno o la enteroquinasa para escindir la proteína de fusión y liberar así la proteína o fragmento;
-
una concentración y diafiltración;
-
una cromatografía por intercambio catiónico;
-
una concentración por ultrafiltración, seguida por una filtración sobre gel de exclusión.
La reacción al bromuro de cianógeno anterior permite escindir los tioéteres. La acción del bromuro de cianógeno sobre las moléculas polipeptídicas es selectiva realizando una escisión a nivel de los residuos de metionina existentes. Esta reacción desemboca en la formación de 2 fragmentos polipéptidos por residuo de metionina. Esta reacción puede ser ventajosamente emparejada con la reacción de carboximetilación descrita anteriormente pero no es necesaria para la inactivación.
En otras condiciones preferidas de realización del procedimiento descrito anteriormente, se prepara la proteína o el fragmento esperado(a) acoplado(a) a un compuesto que permite su purificación, por ejemplo a un fragmento peptídico que contenga varias histidinas, preferencia en secuencia continua de 4,5 en particular 6 histidinas o más que permitan la fijación a una columna de Nickel. En la medida en que la presencia de este compuesto no induce ninguna toxicidad y no modifica desfavorablemente la inmunogenicidad de la proteína o del fragmento, no es necesario escindirlo después de la purificación. De todas formas, en unas condiciones de realización preferidas, se escinde este compuesto para eliminarlo.
Los compuestos objeto de la presente invención poseen propiedades farmacológicas muy interesantes. Son inactivos biológicamente respecto a las funciones que ejercen habitualmente como los efectos inmunosupresores, los efectos transactivadores del promotor del VIH-1, o los efectos oxidativos para la Tat.
Son inmunógenos en el ratón pero también en el hombre. Permiten en particular la inducción de una respuesta inmunitaria humoral con anticuerpos neutralizantes y una respuesta inmunitaria celular.
Estas propiedades son ilustradas seguidamente en la parte experimental. Justifican la utilización de las proteínas o fragmentos descritos anteriormente así como de sus sales de adición con los ácidos farmacéuticamente aceptables, a título de medicamento.
Es por ello que la invención tiene también por objeto una proteína o un fragmento carboximetilado mencionado anteriormente, para su utilización en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal, es decir a título de medicamento.
Los medicamentos según la presente invención encuentran su uso por ejemplo en el tratamiento tanto curativo como preventivo de los efectos nocivos provocados por una sobreproducción de una proteína de regulación de un virus, en particular de un retrovirus VIH-1, VIH-2, HTLV-1 ó HTLV-2.
Las proteínas Tat y Nef tienen unas zonas relativamente bien conservadas. De todas formas, en caso necesario, se podrá inmunizar el mismo sujeto con unos toxoides preparados a partir de las cepas variables, en particular para adaptarse a las variantes geográficas de la epidemia.
Los compuestos inmunógenos según la invención pueden ser utilizados como sigue:
Se administra a un paciente un compuesto inmunógeno según la invención, por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular, en cantidad suficiente para ser eficaz en al plano terapéutico, a un sujeto que tenga necesidad de un tratamiento de este tipo. La dosis administrada puede ir desde por ejemplo 50 a 1000 \mug por vía intramuscular en forma de emulsión e/h, una vez al mes durante tres meses, y después periódicamente en función del nivel de anticuerpos séricos inducidos, por ejemplo cada 2-6 meses.
A título de medicamentos, las proteínas o fragmentos carboximetilados descritos anteriormente pueden por lo tanto ser incorporados en unas composiciones farmacéuticas destinadas a ser administradas por vía oral y en particular parenteral.
Una composición según la invención puede ser administrada por cualquier vía convencional en uso en el marco de las vacunaciones, en particular por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía oral. La administración puede tener lugar en una dosis única o repetida una o varias veces después de un cierto intervalo de tiempo.
La invención tiene también por objeto las composiciones farmacéuticas que contienen a título de principio activo al menos uno de los compuestos citados anteriormente.
En estas composiciones, el principio activo está ventajosamente presente en unas dosis fisiológicamente eficaces; las composiciones citadas anteriormente contienen en particular una dosis inmunógena eficaz de al menos un de los principios activos mencionados. El compuesto inmunógeno puede ser acondicionado solo o mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como un adyuvante.
Estas composiciones farmacéuticas pueden ser, en particular líquidas y presentarse en formas farmacéuticas de uso corriente en la medicina humana para las vacunas, como por ejemplo preparaciones inyectables en particular en forma de emulsión; son preparadas según los métodos usuales. El o los principios activos pueden ser incorporados a unos excipientes empleados habitualmente en estas composiciones farmacéuticas, tales como los vehículos acuosos, el fosfato de calcio, el alumbre.
La invención tiene en particular por objeto a título de composiciones farmacéuticas.
a)
Una composición farmacéutica que comprende a título de agente preventivo o curativo un toxoide viral o un fragmento o análogo de proteína de regulación, en particular de Tat, según la invención.
b)
Una composición farmacéutica que comprende a título de agente preventivo o curativo unos anticuerpos anti-Tat producidos a partir de unos organismos inmunizados contra dicha proteína o sus fragmentos F(ab')2 o Fab, según la invención.
La presente invención tiene también por objeto un procedimiento de preparación de la una composición descrita anteriormente, caracterizado porque se mezcla, según unos métodos conocidos en sí mismos, el o los principios activos con unos excipientes aceptables, en particular farmacéuticamente aceptables.
\newpage
Además, la invención tiene por objeto un kit que comprende una composición farmacéutica en forma de vacuna que además del principio activo (por ejemplo Tat-toxoide o sus derivados o anticuerpos anti-Tat) puede comprender un adyuvante y/ó otro inmunógeno de propiedades antirretrovirus.
Se puede citar por ejemplo como otro inmunógeno la proteína de envoltura GP 160, en particular la glicoproteina transmembranaria GP 10 del VIH-1 o sus fragmentos conocidos en el estado de la técnica, la proteína Gag de la cápside viral, o incluso la proteína Pol.
La invención tiene finalmente por objeto la utilización de una proteína o un fragmento carboximetilado mencionado anteriormente, para la obtención de un medicamento destinado a una utilización como inmunógeno.
Los ejemplos siguientes ilustran la presente solicitud.
La figura 1 representa los resultados de la evaluación de los efectos de la Tat nativa comparados con los del producto del ejemplo 1 sobre la proliferación del linfocitos normales estimulados por un antígeno de recuerdo.
Preparación A
Se cultivan 2 ml de la bacteria depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos de París el 26 de Diciembre de 1997 con la referencia nº I-1964 que es una bacteria de E. Coli en la que se ha insertado por transfección un plásmido recombinante que contiene un gen codificante para un polipéptido que comprende un fragmento constituido por 6 histidinas, asociado al gen de la proteína Tat, en 400 ml de un medio de cultivo de base (extracto de levadura 5 g/l, triptona 1 g/l, cloruro de sodio 1 g/l) y 40 ml de una solución 1(CaCl_{2}2H_{2}O: 0,175 g/i, MgSO_{4}7H_{2}O: 5,9 g/l, glucosa: 6 g/l). Así se incuba el cultivo a 30ºC durante 10 horas a 250 rpm.
A la prefermentación indicada anteriormente sigue una fermentación en unas condiciones análogas, manteniendo el nivel de oxígeno disuelto a un nivel del 70% de la saturación por regulación de la agitación. Cuando la densidad óptica medida a 650 nm alcanza el valor 6, se añaden 100 ml de una solución estéril al 3,75% de IPTG (isopropilo \beta-d-tiogalactopiranosido) en agua desionizada. Al mismo tiempo, se suplementa el medio con una solución estéril de extracto de levadura al 25%. Entonces se añade una solución que comprende MgSO_{4}7H_{2}O: 5,9 g/l, glucosa: 300 g/l, (NH_{4})_{2}SO_{4}: 106 g/l, oligoelementos, manteniendo la concentración de glucosa más allá de 2 g/l. Se recoge entonces la masa bacteriana 4 horas después de la introducción del IPTG. Se procede a una diafiltración contra un tampón tris 0,1 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, ditrioteitol 1 Mm, pH 8,0, por filtración a contracorriente (umbral 0,3 \mum).
Tres litros del producto bruto indicado anteriormente son lisados mediante 4 pasadas a una sobrepresión de 500 bares. El lisado es entonces centrifugado durante 15 mn a 4ºC y 5000 rpm. Se añade entonces al sobrenadante una cantidad suficiente de urea para obtener una solución 8 M y se ajusta el pH a 8.
Se procede entonces a una purificación por cromatografía de afinidad sobre una columna de nickel-NTA agarosa (Qiagen) equilibrada previamente con 600 ml de tampón A (uréa 8 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, tris-HCl 0,1 M, DTT 1 Mm, pH 8,0). Una vez cargada, la columna ha sido lavada con 250 ml de tampón A. Se eluye entonces la proteína utilizando un gradiente discontinuo para obtener la proteína fusionada que se espera.
Se concentra la solución obtenida de esta manera sobre una membrana Amicon con un umbral de corte de 3000 daltons para obtener una concentración final de 10 mg/ml. Así se obtiene un eluido bruto que contiene la proteína recombinante fusionada del VIH-1 Tat que se espera.
Se ha producido así una proteína de fusión Tat fusionada genéticamente con un fragmento peptídico rico en histidinas que permite su enganchado al nickel con vistas a una purificación.
El eluato así obtenido será sometido a la reacción de carboximetilación.
Ejemplo 1
Preparación del toxoide Tat
Fase A
Carboximetilación
Se añade una solución de la proteína TAT fusionada con un fragmento peptídico rico en histidina preparada con la preparación 1 descrita anteriormente para obtener las siguientes concentraciones: Urea 8 M, Tris HCl 0,3 M, Ditrioteitol 10 Mm, pH 8,4.
Bajo una atmósfera inerte, se añaden 2,6 g de ácido iodoacético a 100 ml de la solución anterior. Esta solución es incubada a 37ºC a resguardo de la luz y bajo una atmósfera inerte durante 90 mn. La reacción es bloqueada por la adición de 1 ml de \beta-mercaptoetanol al 98% y la incubación prosigue durante 60 minutos en las mismas condiciones.
La solución resultante de la etapa anterior es concentrada con ayuda de un concentrador Amicon (Cat#8400) sobre membrana YM3/(umbral de 3000 D) hasta una concentración de 10 mg/ml.
Entonces se la desala mediante su paso por una columna Cellufine GH25 (MATREX) equilibrada con ayuda de 300 ml de una solución de urea 4 M, 0,1 M HCl.
Fase B
Purificaciones
El eluato es entonces ultrafiltrado y tratado con bromuro de cianógeno para escindir a nivel de la metionina la parte amino terminal del producto carboximetilado. Se añade bromuro de cianógeno en exceso bajo atmósfera inerte, en una proporción de 50 moles de bromuro de cianógeno por mol de metionina. Esta solución es conservada en un recipiente cerrado durante 24 horas a 37ºC. El exceso de bromuro de cianógeno es eliminado por evaporación a presión reducida.
La solución obtenida es entonces concentrada, diafiltrada contra tampón ácido acético-acetato de sodio 0,05 M, pH 5 utilizando un diafiltrador Amicon provisto de una membrana YM3 (umbral 3000 KD). La cantidad de producto inactivo obtenido en solución es del orden de 450 mg.
Esta solución es filtrada en una columna intercambiadora de iones SP-Sepharose FF equilibrada previamente con 200 ml de tampón A y el producto es eluido por un gradiente de NaCl.
El eluato es concentrado de nuevo por diafiltración en el mismo sistema Amicon, y la fracción obtenida es purificada por gelfiltración en columna de Sephacryl S (Pharmacia) equilibrada con tampón fosfato pH 7,4. El producto final es filtrado sobre una membrana de 0,22 \mum y almacenado a 4º hasta su utilización.
Este producto ha sido sometido a los análisis que a continuación se indican, y a sido objeto de test farmacológicos.
Análisis
-
Cantidad total de producto inactivado dosificado por el test de Bradford: 150 mg.
-
Electroforesis sobre gel de poliacrilamida Sulfododecilsulfato-PAGE, coloración plata (Phast System, Pharmacia, gel homogéneo al 20%): banda única con un peso molecular compatible con el esperado. No se han detectado otras bandas con unos pesos superiores o inferiores.
-
Electroforesis por gradiente isoeléctrico (Phast System, Pharmacia, GEL IEF 3-9): una sola banda visible.
-
Western Blot (Phast System, Pharmacia, anticuerpo monoclonal del hibridoma 5G11): se observa una sola banda y ausencia de material agregado o degradado.
-
Actividad biológica (inducción del gen CAT en la descendencia HELA-HIV-1-LTRCAT): no se ha detectado ninguna actividad.
-
Secuenciado de la parte N-terminal utilizando la técnica estándar de secuenciado de Edman con un secuenciador Applied Biosystems (modelo 477 A): los 20 primeros ácidos aminados obtenidos coinciden con la secuencia esperada E-P-V-D-P-R-L-E-P-W-K-H-P-G-S-Q-P-K-T-A
-
Endotoxinas (test LAL según el protocolo USP XXIII): menos de 0,5 unidades de endotoxinas por mg de proteína.
-
Esterilidad (según el protocolo USP XXIII): responde a las normas.
-
Medición del grado de sustitución: utilizando un reactivo de Ellman para determinar los grupos sulfidrilo libres en comparación con una curva estándar que mide las cisteinas. Comparando la Tat nativa con la Tat carboximetilada, se ha encontrado que únicamente 0,03% de las cisteinas permanecían activas en la Tat carboximetilada, es decir 1 cisteina activa por 3300 cisteinas inactivas. Un simple cálculo muestra que para tener una molécula Tat con 7 cisteinas activas, en estas condiciones, se necesitarían varios kg de proteína Tat. La inactivación es por lo tanto casi total.
Ejemplo 2
Preparación del toxoide Nef
Para el clonado, se utilizan unos iniciadores Nef para obtener el gen Nef por RT-PCR a partir del ARN de células infectadas por el VIH-1. Seguidamente se utiliza el mismo plásmido con el mismo segmento fusógeno rico en lisina que permite el enganchado sobre la columna de Nickel. El protocolo de producción y purificación es entonces el mismo que en el ejemplo 1 pero el corte se realiza por acción de la enteroquinasa y no del bromuro de cianógeno.
Los resultados de los análisis son similares a los obtenidos con la proteína Tat.
Ejemplo 3
Preparación del toxoide IFN\alpha
Esta vez el plásmido no utiliza una proteína de fusión. La proteína es producida tal cual por ingeniería genética sin segmento fusógeno, y es purificada utilizando una columna de cromatografía a la que son enganchados unos anticuerpos monoclonales anti-IFN\alpha. Una vez eluida, la proteína es inmediatamente inactivada según el mismo protocolo que el descrito en el ejemplo 1.
Los resultados de los análisis son idénticos a los obtenidos con la proteína Tat con un test biológico que muestra una actividad antiviral (virus VSV sobre células MDBK) nula: la inactivación biológica es total.
Estudio farmacológico 1) Ausencia de efecto inmunosupresor del toxoide Tat
Existe un test simple que muestra el efecto inmunosupresor de la proteína Tat nativa. Se incuban unas células de la sangre periférica (PBMCs) son incubadas en un medio sin suero con proteína Tat nativa o Tat toxoide a unas concentraciones que varían de 0 a 10 mg/ml. Después de 2 horas de contacto, se añade suero a la concentración final del 10% y las células son estimuladas de la forma habitual por Staphylococcus Enterotoxine B (SEB) o por un antígeno de recuerdo Protein Purified Derived (PPD). La proliferación es evaluada después de 3 días (SEB) o 5 días (PPD).
Se ve que la proliferación es disminuida de forma dosis dependiente por la Tat nativa mientras que no lo es por el toxoide.
En la figura 1, las 4 barras de la izquierda corresponden a la Tat nativa y las 4 barras de la derecha corresponden al compuesto del ejemplo 1 (Tat toxoide). Las cifras de las abcisas son las concentraciones del producto en \mug/ml, respectivamente 0,1,3, 10 \mug/ml. Las ordenadas precisan la proliferación de las células T en porcentaje. El control corresponde a una concentración de Tat utilizada igual a 0. Se ve que la Tat nativa inhibe la proliferación celular mientras que el compuesto del ejemplo 1 no tiene efecto.
2) Inmunogenicidad del toxoide Tat en el ratón.- producción de anticuerpos neutralizantes
Se ha utilizado Tat toxoide preparado según el ejemplo 1 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el utilizado clásicamente: Se inyecta por vía intramuscular (im) a los ratones 100 \mul de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 \mug de producto el día 0 con un recuerdo de adyuvante incompleto de Freund de 5 \mug los días 21 y 35. El suero de los ratones es extraído los días -2, 28 y 40 y los anticuerpos anti-Tat medidos por ELISA sobre unas placas sensibilizadas con la proteína Tat recombinante nativa (no tratada químicamente) o con compuesto del ejemplo 1. Los sueros han sido ensayados a una dilución al 1/1000. Los resultados obtenidos expresados en densidad óptica sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se presentan en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
Tat nativa Tat toxoide
Ratón 1 J-2 0,3 0,3
J-28 1,6 1,5
J-40 2 2,1
Ratón 2 J-2 0,2 0,3
J-28 1,9 1,8
J-40 2,2 2,2
Ratón 3 J-2 0,4 0,4
J-28 1,7 1,5
J-40 1,9 2,2
(Continuación)
Tat nativa Tat toxoide
Ratón 4 J-2 0,2 0,2
J-28 0,3 0,2
J-40 0,3 0,3
Ratón 5 J-2 0,4 0,4
J-28 0,4 0,3
J-40 0,3 0,3
Ratón 6 J-2 0,3 0,3
J-28 0,4 0,3
J-40 0,3 0,3
Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el toxoide producen unos anticuerpos que reconocen de la misma manera la proteína nativa y el toxoide.
Estos anticuerpos son además neutralizantes. Esto ha sido establecido con la ayuda de 2 test diferentes:
El test de inactivación de la proteína Tat. Se añade a unas células en cultivo de la descendencia HELA-HIV-1-LTR-CAT, que son transfectadas de manera estable con un plásmido que contiene el Long Terminal Repeat (LTR) del VIH-1 como promotor del gen Chloranfenicol Acetil Transferasa (CAT), de la proteína Tat nativa o del toxoide Tat, o de la proteína Tat nativa preincubada 1 hora con suero (dilución 1/50) de ratones (J 0 o J 40), inmunizado o no inmunizado. La proteína Tat nativa a 5 \mug/ml penetra en las células y va a desarrollar su función de transactivador sobre el LTR del VIH-1 e inducir la expresión de la proteína CAT. Después de 48 H, las células son lisadas y la cantidad de proteína CAT presente es medida por un test ELISA (Boehringer). Los resultados están expresados en densidad óptica:
Nº del ratón/día DO (medida de proteína CAT)
Tat nativa 1,4
TaT toxoide 0,2
Tat nativa + suero de ratón 2/J 0 1,5
Tat nativa + suero de ratón 6/J 0 1,3
Tat nativa + suero de ratón 2/J 40 0,3
Tat nativa + suero de ratón 6/J 40 1,4
Estos resultados muestran que el suero de ratón inmunizado (ratón 2) contiene unos anticuerpos que neutralizan la proteína Tat nativa, lo que no es el caso para el suero de un ratón no inmunizado.
Así mismo, si se utilizan los anticuerpos producidos por los ratones inmunizados con el toxoide en el test de inmunosupresión descrito en el estudio farmacológico 1) anterior (dilución 1/50), se bloquea el efecto inmunosupresor de la proteína Tat nativa.
Todos estos casos muestran que el compuesto del ejemplo 1 es inmunógeno y permite inducir una respuesta inmunitaria que neutraliza la proteína nativa.
3) Inmunogenicidad del toxoide IFN\alpha en el ratón, producción de anticuerpos neutralizantes
Se ha utilizado toxoide IFN\alpha preparado según el ejemplo 3 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el utilizado clásicamente: los ratones son inyectados (en im) con 100 \mul de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 \mug de producto al día 0 con un recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 \mug los días 21, y 35, 45. El suero de los ratones es extraído los días –2, 28 y 50 y analizado por ELISA sobre unas placas sensibilizadas con proteína IFN\alpha recombinante nativa (no tratada químicamente) o con toxoide. Los sueros han sido ensayados a una dilución al 1/1000. Los resultados obtenidos en densidad óptica sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se presentan en la siguiente tabla:
IFN\alpha nativa IFN\alpha toxoide
Ratón 1 J-2 0,3 0,3
J-28 1 0,9
J-50 2,1 2,1
Ratón 2 J-2 0,2 0,3
J-28 1,2 1,1
J-50 1,9 2
Ratón 3 J-2 0,4 0,4
J-28 0,8 0,9
J-50 2 2,1
Ratón 4 J-2 0,1 0,1
J-28 0,2 0,2
J-50 0,1 0,1
Ratón 5 J-2 0,2 0,2
J-28 0,2 0,2
J-50 0,2 0,3
Ratón 6 J-2 0,3 0,3
J-28 0,2 0,3
J-40 0,3 0,3
Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el toxoide producen unos anticuerpos que reconocen de la misma manera la proteína nativa y el toxoide. Por otra parte esto confirma la inocuidad de la inmunización por el toxoide IFN\alpha puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
Además estos anticuerpos son neutralizantes. Esto ha sido establecido por el test clásico de virus VSV sobre las células MDBK. Normalmente añadiendo de 1 a 10 unidades de interferón, las células se vuelven resistentes a la lisis por el virus VSV. Incubando la IFN\alpha nativa con el suero del ratón 1 ó 4 (J 0, J 50) diluidos al 1/50, se observa la lisis únicamente cuando la IFN\alpha nativa ha sido preincubada con el suero del ratón 1 de J 50.
Este ejemplo muestra que el compuesto del ejemplo 3 es inmunógeno, con formación de anticuerpos neutralizantes.
4) Inmunogenicidad del toxoide Nef en el ratón
Se ha utilizado Nef toxoide preparado según el ejemplo 2 para inmunizar unos ratones. El protocolo de inmunización es el utilizado clásicamente: se inyectan por vía im a los ratones 100 \mul de emulsión (1:1) en adyuvante completo de Freund que contiene 20 \mug de producto al día 0 con un recuerdo en adyuvante incompleto de Freund de 5 \mug en los días 21, y 35. El suero de los ratones es extraído los días –2, 28 y 40 y analizado por ELISA sobre unas placas sensibilizadas con proteína Nef recombinante nativa (no tratada químicamente) o con el toxoide del ejemplo 2. Los sueros han sido ensayados a una dilución al 1/1000. Los resultados obtenidos expresados en densidad óptica sobre 3 ratones inmunizados (1 a 3) y 3 ratones no inmunizados (4 a 6) se presentan en la siguiente tabla:
\newpage
Nef nativa Nef toxoide
Ratón 1 J-2 0,1 0,1
J-28 1 0,9
J-50 2,1 2,1
Ratón 2 J-2 0,1 0,1
J-28 1,5 1,4
J-50 1,9 2
Ratón 3 J-2 0,1 0,1
J-28 0,8 0,9
J-50 1,6 1,6
Ratón 4 J-2 0,1 0,1
J-28 0,1 0,1
J-50 0,1 0,1
Ratón 5 J-2 0,1 0,1
J-28 0,1 0,1
J-50 0,1 0,1
Ratón 6 J-2 0,1 0,1
J-28 0,1 0,1
J-40 0,1 0,1
Estos resultados muestran que los ratones inmunizados por el toxoide del ejemplo 2 producen unos anticuerpos que reconocen de la misma manera la proteína nativa y el toxoide. Por otra parte esto confirma la inocuidad de la inmunización por el toxoide Nef puesto que los ratones han tolerado muy bien la inmunización.
5) Efecto de los anticuerpos de los ratones inmunizados por los toxoides Tat y IFN\alpha sobre la infección por VIH-1 in vitro
Se ha desarrollado un test de inmunosupresión inducida por la infección VIH-1 in vitro. Este test es realizado de la siguiente forma:
Se infectan unas células de la sangre periférica (PBMCs) de un sujeto sano con una cepa de VIH-1 linfotrópico (HIV-HTLVIIIB). Después de realizar una estimulación por fitohemaglutinina (PHA) y un cultivo durante 6 días en presencia de interleucina-2, las células son irradiadas. Las células irradiadas son supresivas puesto que son capaces de inhibir la proliferación de PBMCs autólogas estimuladas por unos antígenos como el SEB o el PPD. Este efecto inmunosupresor no va unido a un virus residual después de la irradiación puesto que los tests de dosificación de la transcriptasa inversa o del antígeno p24 en los sobrenadantes son negativos. Si se realiza una preparación de células sin virus (control), irradiadas de la misma manera 6 días después de la estimulación por PHA, y se añaden a unas células autólogas estimuladas por SEB o PPD no se observa ninguna inhibición de la proliferación. El efecto inhibidor es debido al virus VIH-1.
J F Zagury et al., (Cell Pharmacol AIDS Sciences, 1996, Vol. 3, p. 97-103, A critical role of the Tat and IFN\alpha in the HIV-1 induced immunosuppression leading to AIDS) describe que la génesis de estas células supresivas depende a la vez del IFN\alpha y de la proteína Tat puesto que unos anticuerpos que neutralizan estas 2 proteínas inhiben la formación de las células supresivas. Cuando en una experiencia de este tipo, se han añadido simultáneamente los sueros (diluidos al 1/50) de los ratones inmunizados con los productos descritos en los ejemplos 1 y 3 (Tat toxoide y IFN\alpha toxoide), estos sueros bloquean la generación de células supresoras. Este no es el caso con los sueros de ratones no inmunizados (control negativo) o con los sueros tomados antes de la inmunización. Si se utiliza suero de ratones inmunizados con la Tat toxoide únicamente, no se bloquea la inmunosupresión. Por el contrario, cuando se utiliza suero de ratones inmunizados con el toxoide IFN\alpha, la inhibición de la supresión es del 70%. Si se combinan los 2 sueros anti-Tat y anti-IFN\alpha, se bloquea completamente la génesis de las células supresoras. Se han obtenido estos resultados utilizando diversos lotes de virus, en particular unos aislados primarios. Esto demuestra que los anticuerpos anti-Tat, obtenidos con solo un toxoide, pueden de todas formas tener una reactividad cruzada.
Estos resultados descritos por J F Zagury et al. (Cell Pharmacol AIDS Sciences, 1996, Vol. 3, P. 97-103, A critical role of the Tat and IFN\alpha in the HIV-1 induced immunossuppression leading to AIDS) confirman el efecto inhibidor combinado de la Tat y de la IFN\alpha respecto al estado inmunosupresor en los pacientes en la fase SIDA. Se confirman además la función iniciadora de la Tat y la función determinante de la IFN\alpha en esta inmunosupresión (ver publicación D. Zagury et al. (IFN and Tat involvement in the immunossuppresion of uninfected T cells and C-C chemokine decline in AIDS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, en prensa). Los resultados de estos trabajos muestran la necesidad de luchar contra la proteína Tat extracelular por inducción de una respuesta anticuerpo neutralizante interviniendo, si es posible, desde la producción de la Tat por inducción de una respuesta inmunitaria celular.
6) Inmunogenicidad e inocuidad de los toxoides Tat y IFN\alpha combinados o no en el hombre. Compatibilidad con las quimioterapias
Las tablas 1, 2 y 3 describen los resultados obtenidos durante un ensayo de fase 1 utilizando los toxoides de los ejemplos 1 y 3 en emulsión 50-50 con ISA 51 (SEPPIC): volumen de 1 ml que contiene 100 \mug de un agente activo según la invención. Las respuestas a la IFN\alpha toxoide (datos no representados aquí) son similares a las ya descritas en las publicaciones de Gringeri et al. en JAIDS 1994, Vol. 7, 978-988 y 1996, Vol. 13, 55-67 sobre un toxoide realizado por formolación.
Tabla 1: descripción de los pacientes incluidos en el ensayo de fase 1
Tabla 2: parámetros biológicos en los tiempos iniciales y finales (en general sobre 6 meses).
Tabla 3: análisis de la respuesta específica anti-Tat
TABLA 1 Demografía de pacientes inmunizados contra la Tat del HIV-1, edad en el momento de la seroconversión y tratamiento antirretroviral
Código Edad Sexo Factor de Edad en el momento Tratamiento Inmunización
riesgo de la seroconversión antiviral anti-IFN\alpha
Con proteinasa
1 25 M Hemofilia 12 O O O
2 39 M Hemofilia 26 N N N
3 33 F Compañero sexual 26 O O O
4 38 M Hemofilia 23 N N O
5 25 M Hemofilia 12 N N N
6 31 M Hemofilia 19 O N N
7 19 M Hemofilia 7 N N O
8 35 M Hemofilia 22 O N O
9 26 M Hemofilia 15 N N N
10 38 M Hemofilia 26 N N N
11 26 M Hemofilia 14 O O N
12 33 M Hemofilia 20 O O N
13 40 F Compañero sexual 36 N N N
14 26 F Compañero sexual 20 N N O
TABLA 2 Recuento de las células CD4 en valor absoluto, viremia plasmática VIH-1 y antigemia en 14 pacientes seropositivos inmunizados con los productos de los ejemplos 1 ó 3 
\vskip1.000000\baselineskip
Código Seguimiento Recuento de las células Virémie VIH-1 Antígenos
en meses CD4 en células/mm^{3} anti-VIH
Antes Después Basal Después Basal Después
1 8 284(28,4%) 345(34,5%) 5,75 5,71 11 4.
2 8 453(16,8%) 534(18,4%) 2,06 2,15 32 3.
3 12 227(28,4%) 345(34,5%) 0,35 <0,005 17 4.
4 3 287(22,1%) 252(21,0%) 0,49 0,70 3 3.
5 5 282(28,2%) 319(22,8%) 3,34 0,91 4 4.
6 9 224(11,8%) 294(12,8%) 5,23 3,90 3 3.
7 3 313(24,1%) 443(23,3%) 5,39 5,55 4 4.
8 4 275(30,6%) 314(31,4%) 4,12 3,18 5 4.
9 6 274 (8,3%) 386(9,9%) 5,08 5,74 4 5.
10 8 295(22,7%) 372(26,6%) 4,02 3,9 5 4.
11 4 219(16,9%) 235(23,5%) 4,01 <1 8 3.
12 12 272(20,9%) 340(30,9%) 4,74 2,30 n.a. 4.
13 9 435(33,5%) 478(28,1%) 4,30 4,07 3 4.
14 3 257(13,5%) 274(13,7%) 2,05 2,90 3 3. 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 3 Inmunogenicidad de la inmunización anti-Tat del VIH-1 en los pacientes VIH-1 seropositivos
Código de Inmunización Respuesta Anticuerpos anti-Tatl Respuesta Respuesta
paciente Tipo (A/B) anti-Tatl (en unidades de HSR CMI
anticuerpos Densidad óptica)
Basal Pico
1 B 0 0,240 1,230 n.a. n.a.
2 A 0 0,104 1,526 n.a. POS
3 B 0 0,217 0,537 NEG NEG
4 B 0 0,214 1,063 POS n.a.
5 A 0 0,446 1,612 n.a. n.a.
6 A 0 0,213 0,664 NEG NEG
7 A 0 0,204 1,139 n.a. n.a.
8 B 0 0,104 1,045 POS POS
9 A 0 0,422 0,812 NEG n.a.
10 B 0 0,125 1,492 n.a. n.a.
11 A 0 0,252 0,682 NEG n.a.
12 A 0 0,410 2,219 POS POS
13 A 0 0,162 0,508 POS POS
14 B 0 0,120 2,012 n.a n.a
HSR: Hipersensibilidad retardada
CMI: Inmunidad con mediación celular

Claims (27)

1. Proteína o fragmento de proteína de 8 a 110 ácidos aminados, caracterizada porque son carboximetilados por reacción con el ácido idoacético y porque se trata de una proteína de regulación viral o fragmento de proteína de regulación viral.
2. Proteína o fragmento según la reivindicación 1, caracterizada porque el virus es el VIH-1 ó VIH-2.
3. Proteína o fragmento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque es una proteína de regulación viral o un fragmento de proteína de regulación viral.
4. Proteína o fragmento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque proviene de Tat.
5. Procedimiento de preparación de una proteína o de un fragmento tal como el definido a la reivindicación 1, caracterizado porque se somete dicha proteína o dicho fragmento a una carboximetilación por reacción con el ácido iodoacético, para obtener el compuesto esperado que se aísla.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha proteína o dicho fragmento se presenta en forma fusionada con un marcador (FP) durante la carboximetilación.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque el marcador es escindido después de la purificación.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el marcador comprende un compuesto peptídico que comprende varias histidinas.
9. Proteína o fragmento según la reivindicación 1, para su utilización en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal.
10. Proteína o fragmento de 8 a 110 ácidos aminados de la proteína Tat del VIH-1 carboximetilada por reacción con el ácido iodoacético para su utilización en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o ani-
mal.
11. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene a título de principio activo una al menos de las proteínas o fragmentos carboximetilados tales como los definidos en la reivindicación 1, así como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene a título de principio activo una al menos de las proteínas o fragmentos tales como los definidos en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 así como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Vacuna, caracterizada porque contiene a título de principio activo una al menos de las proteínas o fragmentos tales como las definidas en una de las reivindicaciones 1 a 4.
14. Proteína, caracterizada porque se obtiene por carboxiamidometilación por reacción con la iodoacetamida y porque se trata de una proteína de regulación viral.
15. Proteína según la reivindicación 14, caracterizada porque el virus es el VIH-1 o el VIH-2.
16. Proteína según una de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizada porque consiste en la proteína Tat.
17. Procedimiento de preparación de una proteína según una de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque se somete dicha proteína a una carboxiamidometilación por reacción con la iodoacetamida, para obtener el compuesto esperado que se aísla.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína se presenta en forma fusionada con un marcador (FP) cuando tiene lugar la carboxiamidometilación.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque el marcador es escindido después de la purificación.
20. Procedimiento según una de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado porque el marcador comprende un compuesto peptídico que comprende varias histidinas.
21. Fragmento de proteína de 8 a 110 ácidos aminados, caracterizado porque se obtiene por carboxiamidometilación por reacción con la iodoacetamida, porque se trata de un fragmento de una proteína de regulación viral, que se presenta en forma fusionada con un marcador (FP) cuando tiene lugar la carboxiamidometilación.
22. Fragmento según la reivindicación 21, caracterizado porque el marcador comprende un compuesto peptídico que comprende varias histidinas.
23. Proteína o fragmento de proteína según una de las reivindicaciones 14 a 16 y 21 a 22, para su utilización en un método de tratamiento terapéutico del cuerpo humano o animal.
24. Composición farmacéutica, caracterizada porque contiene a título de principio activo al menos una proteína o un fragmento de proteína tales como los definidos en una de las reivindicaciones 14 a 16 y 21 a 22, así como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
25. Vacuna, caracterizada porque contiene a título de principio activo al menos una proteína o fragmento de proteína tales como los definidos en una de las reivindicaciones 14 a 16 y 21 a 22.
26. Vacuna según la reivindicación 25, caracterizada porque comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. Vacuna según la reivindicación 26, caracterizada porque el excipiente farmacéuticamente aceptable consiste en un adyuvante.
ES98959984T 1997-12-26 1998-12-14 Nuevos inmunogenos anti-vih (toxoides), procedimientos de preparacion y aplicacion para la prevencion y para el tratamiento del sida. Expired - Lifetime ES2267199T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9716589 1997-12-26
FR9716589A FR2773156B1 (fr) 1997-12-26 1997-12-26 Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2267199T3 true ES2267199T3 (es) 2007-03-01

Family

ID=9515202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98959984T Expired - Lifetime ES2267199T3 (es) 1997-12-26 1998-12-14 Nuevos inmunogenos anti-vih (toxoides), procedimientos de preparacion y aplicacion para la prevencion y para el tratamiento del sida.

Country Status (16)

Country Link
US (2) US6420141B1 (es)
EP (3) EP1042363B1 (es)
JP (2) JP2001527029A (es)
AR (1) AR014946A1 (es)
AT (2) ATE330970T1 (es)
AU (2) AU1568499A (es)
BR (1) BR9814473A (es)
CA (1) CA2316811A1 (es)
CY (1) CY1106152T1 (es)
DE (2) DE69835031T2 (es)
DK (1) DK1042363T3 (es)
ES (1) ES2267199T3 (es)
FR (1) FR2773156B1 (es)
MX (1) MXPA00006263A (es)
PT (1) PT1042363E (es)
WO (2) WO1999033872A1 (es)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2773156B1 (fr) 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida
FR2781158B1 (fr) 1998-07-15 2002-12-13 Vacs Internat Nouvelles proteines modifiees immunogenes non immunosuppressives, leur procede de preparation et leurs applications
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
FR2792639B1 (fr) 1999-04-26 2003-06-06 Neovacs Nouveaux immunogenes anti-vih (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida
US20050226890A1 (en) * 1999-08-12 2005-10-13 Cohen David I Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same
CN1326873C (zh) * 2000-01-31 2007-07-18 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 用于hiv预防或治疗性免疫的疫苗
WO2005090392A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Inist Inc. Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same
NO314587B1 (no) * 2000-09-04 2003-04-14 Bionor Immuno As HIV regulatoriske- og hjelpepeptider, antigener, vaksinepreparater, immunoassay testsett og en metode for påvisning av antistoffer fremkaltav HIV
EP2412242A3 (en) 2001-07-05 2012-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
FR2828404B1 (fr) * 2001-08-10 2005-07-15 Neovacs Superimmunogene composite a usage vaccinal bifonctionnel pour le traitement des maladies associees a un desordre tissulaire stromal
WO2003054006A2 (en) * 2001-12-11 2003-07-03 Aventis Pasteur Mutated hiv tat
WO2003097675A1 (en) * 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Fusion protein of hiv regulatory/accessory proteins
US20040115830A1 (en) * 2002-09-25 2004-06-17 Igor Touzov Components for nano-scale Reactor
FR2862306B1 (fr) 2003-11-17 2008-05-30 Aventis Pasteur Composition vaccinale
US7927580B2 (en) * 2004-03-16 2011-04-19 Nanirx, Inc. Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use
AR054822A1 (es) 2005-07-07 2007-07-18 Sanofi Pasteur Emulsion inmuno adyuvante
US8168165B2 (en) * 2008-12-23 2012-05-01 Abbott Laboratories Alkylated interleukin-18 compositions
CN102405057B (zh) 2009-03-23 2016-05-25 那尼尔科斯治疗公司 用免疫刺激性Hiv Tat衍生物多肽治疗癌症
EP3187585A1 (en) 2010-03-25 2017-07-05 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
PL2691530T3 (pl) 2011-06-10 2019-02-28 Oregon Health & Science University Glikoproteiny i rekombinowane wektory CMV
US20130189754A1 (en) 2011-09-12 2013-07-25 International Aids Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
ES2631608T3 (es) 2012-06-27 2017-09-01 International Aids Vaccine Initiative Variante de la glicoproteína Env del VIH-1
US20150065381A1 (en) 2013-09-05 2015-03-05 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel hiv-1 immunogens
WO2015051245A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Pin Pharma, Inc. Immunostimulatory hiv tat derivative polypeptides for use in cancer treatment
EP2873423B1 (en) 2013-10-07 2017-05-31 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
KR20170042605A (ko) * 2014-08-18 2017-04-19 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 알킬화된 인플루엔자 백신
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
FR3057438B1 (fr) 2016-10-14 2020-10-02 Univ Limoges Procede d'elicitation d'une plante au moyen d'extraits de champignons macroscopiques comestibles

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4258029A (en) 1979-04-23 1981-03-24 Connaught Laboratories Limited Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
DE3650175T3 (de) * 1985-04-29 2007-09-06 Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules Synthetische antigene zum nachweis von aids.
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
WO1991018454A1 (en) * 1990-05-18 1991-11-28 Centre National De La Recherche Scientifique Compositions capable of blocking cytotoxicity of viral regulatory proteins and neurotoxic symptoms associated with retroviral infection
WO1994015634A1 (en) * 1992-12-30 1994-07-21 Matthias Rath Tat and rev oligopeptides in hiv treatment
WO1995031999A1 (en) 1994-05-23 1995-11-30 Immunogiology Research Institute, Inc. Compositions of transactivating proteins of human immunodeficiency virus
WO1996027389A1 (fr) * 1995-03-08 1996-09-12 Neovacs Immunogenes denues de toxicite derivant d'une proteine de regulation retrovirale, anticorps, procede de preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant
US6200575B1 (en) * 1996-03-07 2001-03-13 Neovacs Non-toxic immunogens derived from a retroviral regulatory protein antibodies preparation process and pharmaceutical compositions comprising them
FR2773156B1 (fr) 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida

Also Published As

Publication number Publication date
EP1042363B1 (fr) 2006-06-21
AU1568499A (en) 1999-07-19
US7022326B1 (en) 2006-04-04
BR9814473A (pt) 2001-10-23
EP1042363A1 (fr) 2000-10-11
AU1939799A (en) 1999-07-19
CY1106152T1 (el) 2011-06-08
MXPA00006263A (es) 2003-07-14
PT1042363E (pt) 2006-11-30
EP1041888A4 (en) 2000-10-18
WO1999033346A1 (en) 1999-07-08
EP1041888A1 (en) 2000-10-11
DK1042363T3 (da) 2006-10-30
ATE412006T1 (de) 2008-11-15
CA2316811A1 (en) 1999-07-08
FR2773156B1 (fr) 2000-03-31
JP2001527029A (ja) 2001-12-25
FR2773156A1 (fr) 1999-07-02
DE69840152D1 (de) 2008-12-04
WO1999033872A1 (fr) 1999-07-08
ATE330970T1 (de) 2006-07-15
JP2006257102A (ja) 2006-09-28
EP1975173A1 (en) 2008-10-01
DE69835031T2 (de) 2007-01-18
DE69835031D1 (de) 2006-08-03
AR014946A1 (es) 2001-04-11
EP1041888B1 (en) 2008-10-22
US6420141B1 (en) 2002-07-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2267199T3 (es) Nuevos inmunogenos anti-vih (toxoides), procedimientos de preparacion y aplicacion para la prevencion y para el tratamiento del sida.
AU1568400A (en) Intervertebral disc prosthesis
Nara et al. Persistent infection of chimpanzees with human immunodeficiency virus: serological responses and properties of reisolated viruses
Haigwood et al. Importance of hypervariable regions of HIV-1 gp120 in the generation of virus neutralizing antibodies
JP3587538B2 (ja) Ｈｉｖ−１ のインヒビターとしての合成ポリペプチド
US7504479B2 (en) Use of immunogenic immunosuppressive and/or angiogenic proteins which have been rendered inactive, process for their preparation and pharmaceutical or vaccinal uses
Palker et al. Mapping of homologous, amino-terminal neutralizing regions of human T-cell lymphotropic virus type I and II gp46 envelope glycoproteins
PT91881A (pt) Processo para a preparacao de novas proteinas e peptideos de hiv uteis no diagnostico, profilaxia ou terapia da sida
US6132721A (en) Non-Toxic immunogens derived from a retroviral regulatory protein, antibodies, preparation method therefor, and pharmaceutical compositions containing same
Fast et al. Human trials of experimental AIDS vaccines
HU214439B (hu) Eljárás HIV-fertőzések kezelésére alkalmas monoklonális antitestek és peptidek, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények és vakcinák előállítására
ES2231178T3 (es) Vacunaanti.
CA2304125A1 (en) Attenuated vif dna immunization cassettes for genetic vaccines
US6200575B1 (en) Non-toxic immunogens derived from a retroviral regulatory protein antibodies preparation process and pharmaceutical compositions comprising them
Earl et al. Isolate-and group-specific immune responses to the envelope protein of human immunodeficiency virus induced by a live recombinant vaccinia virus in macaques
ES2634144T3 (es) Vectores de transferencia lentivíricos defectuosos que no se integran para vacunas
WO1998041536A9 (en) Glycosylation deficient siv and hiv envelope glycoproteins
WO1998041536A1 (en) Glycosylation deficient siv and hiv envelope glycoproteins
KR100815888B1 (ko) Ｈｉｖ 보조 단백질을 암호화하는 ｄｎａ 백신
ES2150107T5 (es) Inmunogenos no toxicos que proceden de una proteina de regulacion retroviral, anticuerpos dirigidos contra estos inmunogenos, procedimiento para su preparacion y composiciones farmaceuticas que los contienen.
EP0328390B1 (en) Peptide treatment of refractory infectious diseases
US20090088378A1 (en) Long lasting inhibitors of viral infection
AU2007200141A1 (en) New anti-HIV immogens (Toxoids), preparation methods and use for preventing and treating Aids