PT91881A - Processo para a preparacao de novas proteinas e peptideos de hiv uteis no diagnostico, profilaxia ou terapia da sida - Google Patents

Description

REFERÊNCIA A UM PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

Isto é uma continuação em parte do nosso pedido de patente copendente NS. de Série 359.543, entregue em 1 de Junho de 1989, o qual é uma continuação em parte do nosso pedido de patente copendente NQ. de Série 252.949, entregue em 3 de Outubro de 1988, o qual é uma con tinuação em parte do nosso pedido de patente copendente Nõ. de Série 090.080 entregue em 27 de Agosto derl987.

FUNDAMENTO DO INVENTO O vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus linfotrópico para células T humanas III (HTLV-III), o vírus associado a linfadenopatias (LAV) ou o retrovírus associado à SIDA (ARV) tem sido identificado como a causa da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) (Popovic, M., M.G. Sarngadharan, E. Read e R.C. Gallo /19847 Science 224: 497-500). O vírus apresenta tropismo para a sub-série de linfócitos OK T4* (Klatzamann D., F. Barre-Sinouosi, M.T. Nugeyre, C. Dauget, E. Vilmex, C. Griscelli, F. Brun-Ve-zinet, D. Bouzioux, J.D. Gluckman, J.C. Chermann e L. Montag-nier /19847 Science 225: 59-63). Os anticorpos contra proteínas de HIV presentes nos soros da maior parte dos pacientes com AIDS e dos pacientes com complexo relacionado com AIDS (ARC) e em pessoas assintomáticas infectadas com o vírus (Sarngadharan, M.G., M. Popovic, L. Bruch, J. Schupbach e R. C. Gallo /1984/ Science 224: 506-508) tornaram possível o de-senvolvimanto de testes imnnológicos que detectam anticorpos contra estes antigénios. Estes testes são usados para limitar o alastramento do HIV através de transfusões sanguíneas atra- -4-

vés da identificação de amostras de sangue de pessoas infectadas com o vírus. Os testes de diagnóstico normalmente encontrados no comércio utilizam as proteínas de vírus inaçtivado e antigénios.

Além de permitir novas abordagens do diagnostico, o DNA recombinante dá grandes esperanças para o desenvolvimento de vacinas contra bactérias e vírus (Wilson, T. /19847 Bio/Technology 2: 29-39). Os organismos mais largamente empregues para expressar vacinas recombinantes têm sido E. coli, S. cerevisiae é células de mamífero em culturas. Por exemplo, vacinas de subunidades contra a febre efetosa (Kleid, D.G., D, Yansura, B. Small, D. Dowbenko, D,M. Moore, M.J. Brubman, P.D. Mckercher, D.O. Morgan, B.H. Robertson e H.L. Bacharach /19817 Science 214: 1125-1129) e malária (Young, J. F. , W.T. Hockmeyer, M. Groos, W. Ripley-Ballon, R.A. Wirtz, J. H. Trospex, R.L. Beaudoin, M.R. Hollingclale, L.M. Miller, C.L. Diggs e M. Rasenberg /19857 Science 228: 958-962) foram sintetizados em E. coli. Outros exemplos são o antigénio de superfície do vírus da hepatite B produzido emllevedura (Mc Aller, W.J., E.B. Buynak, R.Z. Maigetter, D.E. Wampler, W.J. Miller e M.R. Hilleman 0.9847 Nature 307: 178-180) e uma vacina para herpes produzida em células de mamífero (Berman, P. W., T. Gregory, D. Chase e L.A, Lasky /19847 Science 227: 1490-1492). O invólucro de HIV na sua totalidade ou em parte tem sido usado para imunizar animais. Os termos "proteína", "peptídeo" e"polipeptídeo" têm sido usados indiscriminadamente neste pedido de patente para se referirem a compostos químicos tendo mais de um aminoácido. 0 termo "composto" conforme aqui é usado refere-se a compostos químicos em geral. Assim, "composto" inclui proteína peptídeos e polipeptídeos. Também estão incluídos na categoria de "composto" os compostos de fusão em que os polipeptídeos estão combinados com fracções não polipeptídicas. Conforme é usado no presente invento, o termo "proteína natural do invólucro de HIV" refere-se às proteínas gpl60, gpl20 e gp41 apenas. Conforme é usado no presente pedido de patente, HIV refere-se a qualquer vírus HIV, incluindo HIV-1 e HIV-2.

Tanto a gpl20 nativa (Robey et al /1986/ Proc. Natl. Acad. Sei. 8_3: 7023-7027; Matthews et al /19867 Proc. Natl. Acad. Sei. 83: 9709-9713) e proteínas recom-binantes (Laskey et al. /19867 Science 233: 209-212; Putney et al /19867 Science 234: 1392-1395) induzem anticorpos que podem neutralizar HIV em culturas celulares. No entanto, todos estes imunogéníos induzem anticorpos que neutralizam apenas a variante virai da qual deriva a subunidade. Portante, seria vantajoso e original uma nova vacina capaz de proteger contra múltiplos variantes virais. É conhecido que HIV sofre variação da sequência de aminoácidos, particularmente no gene do invólucro (Starcich, B.R. /19867 Cell £5: 637-648; Hahn, B.H. et al /19867 Science 232: 1548-1553), Cerca de 100 variantes foram analisados por clonagem molecular e análise de reconhecimento com enzimas de restrição e vários destes foram analisados por sequenciação de nucleotídeos. Alguns destes são isolados deHIV conhecidos com RP (Popovic, M, et al. /19847 Science 224: 497-500), WMJ-1 (Hahn, B.H. et al. /19867 Science 232: 1548-1553), LAV (Wain-Habson, S. et al /19857 Cell 40: 9-17) e ARV-2 (San-chez-Pescador, R. et al /19857 Science 227: 484-492). Um aspecto deste invento é a definição da fraeção de HIV que compreende o principal domínio neutralizante. O domínio neutralizante principal está situado entre os resíduos da cisteína nos aminoácidos 296 e 331 do invólucro de HIV. A numeração dos aminoaci-dos segue a sequência publicada de HIV-IIIQ (Ratner, L. et al. /19857 Nature 313: 277-284). Sabe-se que este domínio é hiper-variável mas retem as propriedades antigénios e imunogénicas específicas de tipo relacionadas com a neutralização do vírus.

Um outro aspecto do presente invento é a descoberta de aminoácidos altamente conservados den- -6-

tro do domínio neutralizante principal. Se bem que tenham sido publicados certas sequências desta região (ver, por exemplo, Southwest Foundation for Biologicai Research, pedido de patente PCT publicada, Publicação NS. WO 87/02775; Genetic Systems Corporation, Published United Kingdom Application NS. GB 2196634 A; Stichting Central Diergeneeskundig Instituut, Pedido de Patente EPO Publicada NQ. 0311 219), a presença das regiões conservadas aqui descritas nunca-antes foram descritas. "Kits" de diagnóstico ou agentes terapêuticas usando proteínas virais isoladas a partir de células infectadas com vírus ou proteínas recombinantes conteriam apítopos específicos da variante virai a partir da qual foram isolados. Reagentès contendo proteínas de múltiplas variantes teriam a utilidade de serem mais largamente reactivos devidos a conterem uma maior diversidade de epítopos. Isto seria vantajoso no despiste de soro de paciente ou no tratamento terapêutico de pacientes.

Os peptídeos sintéticos podem ser vantajosos como ingredientes activo numa vacina, agente terapêutico ou reagente de diagnóstico devido à facilidade de produção e capacidade para modificar a sua estrutura e modo de apresentação.

Os peptídeos sintéticos têm sido usados com êxito na vacinação contra o vírus da febre afeetosa (Bittle ei: al., /1982/ Nature 298; 30-33); poliovírus (Emini et al. /19837 Nature 305: 699); hepatite B (Gerin et al /19837 Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 2365-2369); e gripe íShapira et al /19847 Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 2461-2465).

Nesta altura existe de facto a necessidade de desenvolver uma vacina contra SIDA. Tal vacina, com vantagem, seria eficaz na imunização de um hospedeiro contra as variantes do vírus da SIDA. -7

Breve sumário do invento 0 presente invento define a localização do principal domínio de neutralização do HIV e divulga métodos para usar este segmento da proteína do invólucro de HIV no desenvolvimento de reagentes para diagnóstico, terapêutica e profilaxia. Mais especificamente, o principal domínio de neutralização do HIV está situado entre os resíduos de cis-teína 296 e 331 da proteína do envólucro de HIV. A localização deste domínio está mostrada na Tabela 1. Se bem que seja conhecido a sequência de aminoácidos específica do principal domínio de neutralização como altamente variável entre as variantes, encontrámos peptídeos deste domínio que são invariávelmente capazes de induzir e/ou ligarem-se a anticorpos neutralizan-tes. Este resultado inesperado proporciona uma base para a pro-jecção de composições e estratégias para a prevenção, diagnóstico e tratamento da SIDA. A descobeta do principal domínio de neutralização (também conhecido como a "ansa") resultou de uma pesquisa exaustiva envolvendo muitas proteínas e peptídeos do invólucro de HIV derivados de muitas variantes de HIV. São aqui divulgadas proteínas e peptídeos capazes de induzirem e/ou ligarem-se a anticorpos neutralizantes. Estas novas proteínas e peptídeos de HIV, ou seus equivalentes, podem ser usados no diagnostico, profilaxia e/ou terapia da SIDA. Ainda, os peptídeos podem ser usados como imunogénios ou reagentes de despiste para gerar ou identificar anticorpos policlonais e raonoclo-nais que poderão ser úteis na profilaxia, diagnóstico e terapia da infecção por HIV.

Um outro aspecto do invento é a descoberta de regiões altamente conservadas dentro do principal domínio neutralizante. Esta descoberta foi bastante inesperada devido à conhecida variabilidade dos aminoácidos dentro deste segmento da proteína do invólucro de HIV. -8-

As proteínas e peptídeos do invento são aqui identificadas pelas suas sequências de aminoáci dos e pelo DNA que as codifica. Assim, elas podem ser preparadas por processos de sintese química conhecidos ou por meios de DNA recombinante.

Estes peptídeos, ou peptídeos tendo as propriedades antigénicas ou imunogénicas destes peptídeos podem ser usados, com vantagem, uma vacina, e.g. uma mistura de peptídeos, para induzir uma gama larga de anticorpos neutralizantes no hospedeiro. Ainda, estes peptídeos podem ser usados sequêncialmente, e.g. imunizando inicialmente com um equivalente peptídico do principal domínio de neutralização de uma variedade de HIV seguido de imunização com um ou mais dos peptídeos atrás. Anticorpos policlonais ou monoclonais que se ligam a estes peptídeos seriam vantajosos na profilaxia ou terapia contra o HIV, o agente causador da SIDA.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 mostra sequências que normalmente ocorrem no principal domínio de neutralização.

Figura 2 é um esquema da construção do gene de múltiplos epítopos.

Figura 3 descreve os passos na construção de um gene específico de múltiplos epítopos.

Figura 4 mostra as sequências de quatro oligómeros de cadeia simples sintetizado para a construção de um gene de múltiplos epítopos.

Descrição detalhada do invento £ aqui descrito um segmento da proteína do invólucro de HIV que induz e/ou liga-se com anticorpos neutralizantes. Esta propriedade única e altamente inesperada foi observada em cada variante de HIV que foi examinada. 0 segmento de interesse foi designado o "principal domínio de neutralização". 0 principal domínio de neutralização está der-limitado por resíduos císteina que ocorrem nas posições 296 e 381. Deve-se notar que estes mesmos resíduos de císteina foram descritas como começando em 302 em vez de 296 (Rusche, J.R. et al /19887 Proc. Natl. Acad, Sei. USA 85 (15): 3198-3202). Devido aos resíduos de cisteína estarem ligados através de ligações dissulfureto, o segmento entre os resíduos tendo a formar uma ansa. Portanto, o principal domínio de neutralização é também referido como a "ansa". O segmento da proteína do envólu-cro aqui identificado como o principal domínio de neutralização é conhecido como sendo altamente variável entre variantes de HIV. Assim, é surpreendente que, para cada variante, este segmento seja capaz de induzir e/ou ligar-se com anticorpos neutralizantes. O principal domínio de neutralização aqui identificado é um pequeno segmento da proteína do envóluçro de HIV. Este pequeno segmento pode ser combinado com outros aminoácidos,«caso se pretenda, com uma finalidade especifica. Todas estas proteínas são aqui reivindicados excepto sempre que tais proteínas constituam uma proteína natural do invólucro de HIV. Conforme aqui é usado o termo "proteína natural do invólucro" refere-se apenas a gpl60, gpl2Q e gp41.

Na Tabela 1 estão apresentados as sequências do principal domínio de neutralização para algumas das variantes testadas. A Tabela 9 contem uma lista completa

dos rpincipais domínios de neutralização.

Os aminoácidos podem ser referidos usando um sistema de abreviatura de três letras ou de uma letra. Segue-se uma lista dos aminoácidos comuns e suas abreviaturas. letra

Aminoáeido Símbolo de 3 ietras Simbdode 1

Alanine Ala A Arginine Arg R Asparagine Asn N Aspartic acid Asp D Asn and/or Asp Asx B Cysteine Cys C Glutamine Gin Q Glutamic acid Glu E Gin and/or Glu Glx Z Glycine Gly G Histidine His H Isoleucine Ile I Leucine Leu L Lysine Lys K Methionine Met M Phenylalanine Phe F Proline Pro P Serine Ser S Threonine Thr T Tiyptophan Trp W Tyrosine Tyr Y Valine Vai V

Segue-se uma lista de proteínas e peptídeos gue comprendem os principais domínios de neutralização ou seus segmentos. A. Proteínas recombinantes compreendendo um domínio de neutralização principal 1. Proteína de fusão de 10 kd do HIV, designada Sub 1. Na Tabela 2 está apresentada a sequência de aminoácidos da fracção HIV de Sub 1 na Tabela 2A está apresentada a sequência de DNA ’da fracção HIV de sub 1. A sequência de aminoácidos de sub 1 está apresentada na Tabela 2B e a sequência de DNA na tabela 2C. 2. Proteína fusão de 18 kd do HIV designada Sub 2. A sequência de aminoácidos da fracção HIV de Sub 2 está apresentada na Tabela 3 e a sequência de DNA da fracção HIV de sub 2 está apresentada na Tabela 3A. Toda a sequência de aminoácidos de Sub 2 está apresentada na Tabela 3B e toda a sequência de DNA na Tabela 3C. 3. Proteína de fusão de 27 kd do HIV designada PBlRp. A sequência de aminoácidos da fracção HIV do PBl^p está apresentada na tabela 4 e a sequência de DNA da fracção HIV de PBlRp está apresentado na Tabela 4A. Toda a sequência de aminoácidos e a sequência de DNA de PB1RF estão nas Tabelas 4B e 4C, respectivamente.

Proteína de fusão de 28 kd do HIV designada PBlMN* A sequência de aminoácidos da fracção HIV de está apresentada na Tabela 5 e a sequência de DNA da fracção HIV de PBl^ está apresentada na Tabe- 4 5. la 5A. Toda a sequência de aminoácidos e a sequên cia de DNA de PB1^N estão apresentadas nas Tabelas 5B e 5C, respectivamente.

Proteína de fusão de 26 kd do HIV designada PB^ A sequência de aminoácidos da fracção HIV de PBLgç está apresentada na Tabela 6 e a sequência de DNA da fracção HIV de PBlg^ está apresentada na Tabela 6A. Toda a sequência de aminoácidos e a sequência de DNA de PBlgc estão apresentadas na Tabela 6 e a sequência de DNA da fracção HIV de PBlgç está apresentada na Tabela 6A. Toda a sequência de aminoácidos e a sequência de DNA de pBlgC estão apresentadas nas Tabelas 6B e 6C respectivamente. 6. Proteína de fusão de 26 kd de HIV designada PB1WMJ2, a sequência de aminoácidos da fracção HIV de PB1WMJ2 está apresentada na Tabela 7 e a sequência de DNA da fracção HIV de PB1wmj2 está apresentada na Tabela 7A. Toda a sequência de aminoácidos e a sequência de DNA de PB1WMJ2 estão apresentadas nas Tabelas 7B e 7C, respectivamente. B. Peptídeos sintéticos compreendendo segmentos do principal domínio neutralizante de variantes de HIV. 0 aminoácido císteina entre parêntesis é adicionado com a finalidade de fazer a ligação cruzada a proteínas veículo. Também, sempre que os peptídeos tenham cisteínas nos extremos ou perto destes, estas cisteinas podem formar uma ponte dissulfureto, dando assim aos peptídeos uma configuração em ansa. Para muitos destes peptídeos que não possuem cisteínas nos extremos ou perto destes, podem ser adicionadas cisteinas caso se pretenda uma configuração tipo ansa. -13-

A configuração em ansa pode ser utilizada para aumentar as propriedades imunogénicas dos peptídeos. Outros aminoácidos entre parêntesis são espaçadores imunológicamente silenciosos.

Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg De Gin Arg Gly

Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr De Gly Lys De Gly (Cys) -14-

Peptideol36 do Isolado HIV-IIIB);

Leu Asn Gin Ser Vai Glu De Asn cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser De Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr Uc Gly Lys De Gly Asn Met PeotiderJ.39 i Ido í; solado HIV-RF) Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Thr Lys Gly Pro Gly Arg Vai Ile Tyr Ala Thr Gly Gin De De Gly (Cys) Peptide 141 ( Ido isolado HIV- WMJ2 ); Asn Asn Vai Arg Arg Ser Leu Ser De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Arg Thr Arg Glu De De Gly (Cys) Peptidaol42 ( do isolado HIV- •MN) ; Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn De De Gly (Cys) Peutideol43 ( Do i solado HIV- •SC) ; Asn Asn Thr Thr Arg Ser De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp De De Gly (Cys) Pemideol31 { do i solado HIV- •IIIB ); (Tyr) Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser De Arg Ile Gin Arg Gly Pemideol32 ( do isolado H'IV- IIIE »); Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr De Gly Lys De Gly Asn Met Arg Gin Ala His cys (Tyr) Pei)tidenl34 ( do isolado HIV- •IIIE >) Glu Arg Vai Ala Asp Leu Asn Gin Ser Vai Glu De Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser De

Peptide 339 (do isolado HIV-RF); De Thr Lys Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr (Cys) RP341 ido isolado HIV-SC); Leu Ser De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Arg (Cys) RP343(do isolado HIV-SC); De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr (Cys) RP60 (do isolado HIV-IIIB); De Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser De RP335 (do isolado HIV-IIIB; De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Cys) RP337 (do isolado HIV-IIIB); Lys Ser De Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Cys) RP77 (do isolado HIV-IIIB) Gly Pro Gly Arg Ala Phe RP83 (do isolado HIV-WMJ1); His De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Gly (Cys) RP79 i (do isolado 1 HIV-IIIB); Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Cys) RP57: De Asn Cys Thr Arg Pro Ala His Cys Asn De Ser RP55:

Ala

His Cys Asn De Ser -16

RP75A: (Ala Ala Ala Ala Ala Ala) Gly Pro Gly Arg (Ala Ala Ala Ala Ala Cys) RP56: Ile Asn Cys Thr Arg Pro RP59: De Gly Asp De Arg Gin Ala His Cys Asn De Ser RP342 (do isolado HIV r-MN) ; De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr (Cys) RP96 (re.l ar.innadn com HIV- -MN) / (Cys) Gly De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr (Cys) RP97 (relacionado com HIV-MN); (Ser Gly Gly) De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Gly Ser Cys) RP98 (relacionado com HIV-MN) (Cys Ser Gly Gly) De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Gly Gly Ser Cys) RP99 (relacionado com HIV-MN); (Cys Ser Gly Gly) De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Gly Gly Ser) RP100: (Ser Gly Gly) Thr Arg Lys Gly Ile His De Gly Pro Gly Ala De Tyr (Gly Gly Ser Cys) -17-

RP1Q2: (Ser Gly Gly) Thr Arg Lys Ser He Ser He Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Gly Gly Ser Cys) RP91 (fusão MN-Hepatite) Arg Ile His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg He Leu Thr Ile Pro Gin Ser Leu Asp (Çys) RP104: (Ser Gly Gly) He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (Gly Gly Ser Çys) RP106: (Ser Gly Gly) Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Gly Gly Ser Cys) RP108: (Ser Gly Gly) His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly (Gly Gly Ser Çys) RP70 ído isoladcHIV-MN): Ile Asn Çys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg He His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Asn He Ile Gly Thr He Arg Gin Ala His Çys Asn He Ser RP84 ^ isolado HIV-MN); lie His He Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Gly (Cys) RP144 (do isolsb 7887-31: Asn Asn Thr Ser Arg Gly Ile Arg Ile Gly Pro Gly Arg Ala Leu Ala Thr Glu Arg Ile Ile Gly (Çys) RP145 (do ísolado6587-7): Asn Asn Thr Arg Lys Gly He His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Thr Gly Asp He He Gly (Çys) -18-

RP146 (do isolado CC);

Asn Asn Thr Lys Lys Gly Ile Arg De Gly Pro Gly Arg Ala

Vai Tyr Thr Ala Arg Arg De De Gly (Cys) RP147 (do isolado KK261); Asn Asn Thr Arg Lys ôly De Vai Tyr Thr Arg His Lys De RP150 (do isolado ARV-2); Asn Asn Thr Arg Lys Ser De Phe His Thr Thr Gly Arg De

Tyr Vai Gly Ser Gly Arg Lys De Gly (Cys) Tyr De Gly Pro Gly Arg Ala De Gly (Cys) RP151 (do isolado NYS);

Asn Asn Thr Lys Lys Gly De Ala De Gly Pro Gly Arg Thr

Leu Tyr Ala Arg Glu Lys De De Gly (Cys) C. Peptideos híbridos contendo sequências de mais do que resina variante · - EPZ3 (dos isolackffV-™, HIV-RF):

Lys Ser Ile Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De

Tyr (Cys) RP74 (dosisoladoáHTV-ΙΠΒ, HIV-RF, HIV-MN, HIV-SC):

Arg De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala Lys

Ser De Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr (Cys) RP80 (dos isoladoHIV-ΙΙΙΒ, HIV-RF):

Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr Ala Thr (Cys) RP81 (íos Mados HIV-IIIB, HIV-RF, HIV-WMJ1, HIV-MN):

Arg De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Gly

Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr Ala Thr (Cys) -19-

RP82 '(dos isolados HIV-MN, HTV-WMJ1 ); Arg De His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Gly (Cys) RPS8 (dos isolados HIV- MN, HIV-SC); Ser Ile His De Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyi Thr Thr (Cys) RP137 (dos isolados HIV-IIIB,. HIV-RF); Asn Asn Thr Arg Lys Ser De Arg De Thr Lys Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr De Gly Lys De Gly (Cys) RP140 (dos isolados HIV- IIIB, ‘HIV-RF, HIV-MN, HIV-SC); Asn Asn Thr Arg Lys Ser De Thr Lys Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr De Gly Lys De Gly (Cys) Peptide 64 (dos isolados HIV-IIIB, . HIV- -RF, HIV-MN, HIV-SC); Arg De His De Gly Pro Gly Arg Ala De Phe Tyr Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De (Cys) Peptide 338 (dos isolados HIV-IIIB, HIV-RF); Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr (Cys) Peptide 138 (dos isolados HIV- •IIIB , HIV-RF); Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr Ala Thr Gly Lys De Gly (Cys) RP63 ('IIIfl-RF híbrido Arg De Gin Arg Gly Pro Gly Arg Vai De Tyr (Cys) D· Sequências de ; peptídeos miscelâneos RP41:

Gly Pro Gly Arg RP61:

Gly Pro Gly Arg (Ala Ala Ala Ala Ala Ala Çys) RP75: (Cys Ala Ala Ala Ala Ala) Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Ala Ala Ala Cys) RP111: Ile Gin Arg Gly Pro Gly Ile Gin Arg Gly Pro Gly (Çys) RP113: Gin Arg Gly Pro Gly Arg Gin Arg Gly Pro Gly Arg Gin Arg Gly Pro Gly Arg (Cys) RP114: Arg Gly Pro Gly Arg Gly Pro Gly Arg Gly Pro Gly Arg Gly Pro Gly Arg (Cys) RP116: Gly Pro Gly Arg Ala Phe Gly Pro Gly Arg Ala Phe Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Cys) RP120: Ser Ile Arg Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr (Çys) RP121c: (Cys) Gly Pro Gly Arg (Çys) RP122c: (Cys) Ile Gly Pro Gly Arg Ala (Cys) RP123c: (Cys) His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe (Cys) -21-

As proteínas e peptídeos que exemplificam o presente invento podem ser preparadas por processos de síntese bem conhecidos. Tais processos de DNA recombinante são aqui divulgados uma vez que eles foram, de facto, os processos inicialmente utilizando para se obter as novas proteínas e peptídeos do invento. No entanto, uma vez preparadas estas identidades e as suas moléculas sequenciadoras, é obvio para os .familiarizados com a área que o método preferido para os fazer seriam agora os meios de síntese química. Por exemplo, existem máquinas automáticas que podem fazer fácilmente proteínas e peptídeos dos tamanhos moleculares aqui descritos.

Nos processo de DNA recombinante para fazer algumas das proteínas e peptídeos do invento foi usado um vector de expressão plasmídeo designado pREV2.2. Este plasmídeo foi inicialmente construido a partir de um plasmídeo pBGl. 0 plasmídeo pBGl está depositado no hospedeiro E. coli MS371 no Northerm Regional Research Labor atory (NRRL, U.S, Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA). Está na colecção permanente deste depositário. E. coli MS371 (pBGl), NRR1 B-15904, foi depositada em 1 de Novembro de 1984. E. coli MS371, NRRl B-15129 está agora disponível ao público. 0 plasmídeo pREV2.2 foi depositado no hospedeiro E. coli JM 103 NRRL em 30 de Julho de 1986. E. coli JM103 (pREV2.2) recebeu o número de acesso NRRL B-18091 NRRL B-15904 e NRRL B-18091 estarão disponíveis, sem restrições ao público quando os fragmentos de uma patente que os divulga.

Outras estirpes de E. coli, aqui divulgadas, foram depositadas como se segue. E. coli SG20251, NRRL B-15918 foi depositada em 12 de Dezembro de 1984. -22-

E. coli CAGÍ629 (pKHl) , NRRL B-18095 foi depositada em 30 de Julho de 1986.

Este último depósito pode estar sujeito a técnicas convencionais para separar o plasmídeo da célula hospedeira e portanto usa o hospedeiro E. coli CAG629 conforme aqui é descrito.

As presentes culturas foram depositadas em condições que asseguram que o acesso às culturas estará disponível durante a pendência do pedido de patente que se divulga a alguém determinado pelo Commissioner of Patents and Trademarks que se lhes deve referir como 37 CFR 1.14 e 35 USO 122. Os depósitos estão disponíveis de acordo com os requesitos das leis para patentes estrangeiras em países onde as contrapartes do presente pedido, ou seus derivados tenham sido requeridas. No entanto, deverá entender-se que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para prati -car o presente invento em prejuízo dos direitos de patente cedidos por acção governamental.

Ainda, os presentes depósitos de cultura serão guardados e tornados disponíveis ao público de acordo com o disposto no Budapest Treaty for the Deposit of Microorganisms, i.e., serão guardados com todo o cuidado nece£ sário para os manter viáveis e não contaminados durante um período de pelo menos cinco anos após o pedido mais recente para o fornecimento de uma amostra dos depósitos e em qualquer dos casos durante um período de pelo menos 30 (trinta) anos após a data de depósito ou durante a vida obrigatória d® qualquer patente que possa sair divulgando as culturas. O depositante agradece o dever de substituir os depósitos caso o depositário seja incapaz de fornecer uma amostra quando necessário devido ao estado dos depósitos. Todas as restrições sobre a disponiM lidade ao público dos depósitos das presente culturas serão irrevogávelmente removidos quando do pagamento de uma patente -23-

que os divulgue.

As novas proteínas e peptideos de HIV do presente invento podem ser expressas em Saccharomyces certvisiae usando plasmídeos contendo o promotor induzível da galactoes deste organismo (Broach, J.R., y. Li, L.C. Wu e M. Jayaram /1983/ em Experimental Manipulation of Gene Expres-sion, p.83, ed. M. Inouye, Academic Press). Estes plasmídeos são designados YEpSl e YEp52 (Broach, J.R. et al /1983/) e con têm a origem de replicaçao de E. coli, o gene da ^-lactamase, o gene LEU2 de levedura, a origem de replicaçao de 2 pm e o locus REP3 do circulo 2pm. A expressão do gene recombinate é conduzida pelo promotor do gene GAL10 de levedura.

Podem ser usados promotores de levedura tais como galactose e álcool-desidrogenase (Bennetzen, J.L. e B.D. Hall /1982/ J. Biol. Chem. 257:3018; Ammerer, G. Α9837 em Methods in Enzymology Vol.101, pág. 192), fosfoglice rato-cinase (Derynck, R., R.A. Hitzeman, P.W, Gray, D.V. Goed-del /1983J? em Experimental Manipulation of Gene Expression, p.247, ed. M. inouye, Academic Press), triosfosfato-isomerase (Abber, T.e G. Kawasaki /1982j j. Molec. and Applied Genet. 1:419) ou enolase (Innes, M.A. et al /1985/ Science 226:21).

Os genes aqui divulgados podem ser expressos em células de macaco. Quando os genes codificados destas proteínas são clonados num dos plasmídeos como des: crito em Okayama e Berg (Okayama, H. e P. Berg /19831/ Molec. and Cell. Biol. 3:280) e referencias nele indluídas ou células C05 transformadas com estes plasmídeos, a síntese de proteínas do HIV pode ser detectada imunológieamente.

Podem ser usados outros sistemas de expressão de genes/Produção de proteínas em células de mamíferos. São exemplos de outros destes sistemas e sistema de expressão do vírus da vacina (Moss, B. 1985/ Immunology Today -24-

6:243; Chakrabasti. S. K. , Brechling,.B, Moss /1985/ Molec. and Cell, Biol. 5:3403) e os vectores derivados de retrovírus nurinos (Mulligan, R.C. /19837 em Experimental Maçipulation of Gene Expression, p.155 ed. M. Inouye, Academic Press).

As proteínas e peptídeos de HIV do presente invento podem sintetizadas quimicamente por técnicos de sintese de peptideos em fase sólida tais como BOC e BMOC (Mervifield, R,B. /19637 J. Amer, Chem. Soc. 85:2149; Chang, C. e J. Meienhofer /11787 Int. J. Peptide Protein Res, 11:246).

Tal como é bem conhecido na área, a sequência de aminoácidos de uma proteína é determinada pela sequência de nucleotideos do DNA. Devido à redundância do códi^ go genético, i.e., mais do que um tripleto de nucleotideos codificador (codão) pode ser usado para a maior parte dos aminoá eidos usados para fazer proteínas, diferentes sequências de nucleotideos podem codificar um aminoácido particular. Assim,

o código genético pode ser descrito como se segue: Penilalanina (Fen) TTK Histidina (His) CAK Leucina (Leu) XTY Glutamina (Glu) CAJ Isoleucina (Xle) ATM Asperagina (asn) AAK Metionina (Met) ATG Lisina (Lis) AAJ Valina (Vai) GTL Acido aspártica (asp) GAK Serina (Ser) QRS Acido glutânico (Glu) GAJ Prolina (Pro) CCL Cisteina (Cis) TGK Treonina (Tre) ACL Triptofano (Trp) TGG Alanina (Ala) GCL Arginina (Arg) WGZ Tirosina (Tir) TAK Dlicina (Gli) GGL Sinal de terminação TAJ Sinal de terminação TGA

Chave: Cada tripleto de desoxinucleotídeos de 3 letras corresponde a um trinucleotídeo de mRNA, tendo um extremo 51 na esquerda e um extremo 3' na direita. -25-

-X . Λ '. Γ

Todas as sequências de DNA aqui apresentadas são as da cadeia cuja sequência corresponde à sequência do mRNA, com timidina substituída por uracilo. As letras descrevem as bases purinas ou pirimidinas formadoras da sequência de desoxinucleotídeos. A = adenina G - guanina C = citosina T = timina

X a T ou C se Y fôr A ou G

X * C ou Y fôr C ou T

Y = A, G, CouTseX fôr C

Y » A ou G se X fôr T

W » C ou A se Z fôr A ou G

W * c se Z fôr C ou T

Z =* A, G, C ou T se W fôr C

Z * A ou G se W fôr A QR* TC se S fôr A, G, C ou T; como alternativa QR » AG se S fôr T ou C.

J * A ou G

K * T ou C L « A, T, C ou G M a A, C OU T. 0 que foi dito mostra que as novas sequências de aminoácidos das proteínas e peptídeos de HIV do presente invento podem ser preparados através de outras sequências de nucleotídeos além das quais divulgadas. Sequências de nucleotídeos funcionalmente equivalentes codificadoras -26-

das novas sequências de aminoácidos destas proteínas e peptí-deos de HIV ou seus fragmentos tendo actividade antigénica ou imunogénica de HIV ou terapêutica podem ser preparadas por processos ou síntese conhecidos. Assim, o presente invento inclui tais sequências de nucleotídeos funcionalmente equivalentes.

Assim, o âmbito do presente invento inclui não só as sequências de nucleotídeos específicos aqui descritos como tamlSém sequências semelhantes codificadoras de proteínas ou fragmentos de proteínas tendo capacidade comparável para induzir a formação de e/ou ligação de anticorpos específicos de HIV possuindo as propriedades de neutralização do vírus. 0 termo "equivalente" está a ser usado na sua aplicação normal em patentes significando uma sequência de nucleotídeos que desenpenha um papel substancialmente idêntico ao da sequência ou nucleotídeos aqui identificados para produzir moléculas com substancialmente semelhante actividade antigénica ou imunogénica de HIV ou terapêutica essencialmente no mesmo tipo de hospedeiro. Estão dentro desta definição subfragmentos que possuem actividade antigénica ou imunogénica de HIV ou terapêutica.

Conforme foi divulgado atrás está dentro dos conhecimentos dos familiarizados com a engenharia genética como usar as sequências de nucleotídeos codificadores de actividade antigénica ou imunogénica de HIV ou terapêutica do presente invento para produzir proteínas de HIV via processos microbiano®, A fusão das sequências num vector de expressão e transformação ou transfecção de hospedeiros, eucarióticos (células de levedura ou de mamífeor) ou procarióticas (células bacterianas), são processos bem estabelecidos usados na produção de outras proteínas bem conhecidas, eg., insulina, inter-ferões, hormana de crescimento humana, IL-1, IL-2 e similares. Processo semelhantes suas modificações óbvias podem ser empre- gues para preparar proteínas ou peptídeos de HIV por meios microbianos ou tecnologia de cultura de tecidos de acordo com o presente invento.

As sequências de nucleotídeos aqui divulgadas podem ser preparadas por uma "máquina de genes" por processos bem conhecidos. Isto é possível devido à divulgação da sequência de nucleotídeos.

As enzimas de restrição descritas podem ser adquiridas à Bethesda Research laboratories Gaithers-burg, M.D. ou New England Biolabs, Beverly, M.A. As enzimas são usados de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

Os vários métodos empregues na preparação dos plasmídeos e transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos. Estes processos estão todos descritos em Maniatis, T., E.F. Fritsche e J. Sambrook (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labora-tory New York. Assim, está dentro do conhecimento dos familiarizados com a engenharia genética extrair DNA de células microbianas, fazer digestões com enzimas de restrição, electrofore-se de fragmentos de DNA, colocar caudas em plasmídeos, e empa-Iha-los, inserir DNA, ligar DNA, transformar células, e.g. células E. coli, preparar DNA de plasmídeo, electroforese de proteínas e sequências DNA.

Os ensaios imunoquímicos que empregam proteínas ou peptídeos de HIV do invento podem tomar uma variedade de formas. Um tipo preferido é um ensaio em fase líquida em que o antigénio de HIV e a amostra a ser testada são misturadas e deixadas formar complexos imunes em solução os quais são então detectados por uma variedade de métodos.

Um outro tipo preferido é um ensaio imunométrico em fase sólida. Nos ensaios em fase sólida uma proteína ou peptídeos de HIV é imobilizado numa fase sólida para formar um antigénio- -28-

-imunoadsorvente. 0 imunoadsorvente é incubado com a amostra a ser testada. Após um período de incubação adequado, o imunoadsorvente é separado da amostra e o anticorpo marcado anti--Igls humana é usado para detectar o anticorpo humano anti--HIV ligado ao imunoadsorvente. A quantidade da marca associada ao imunoadsorvente pode ser comparada com testemunhas positivas e negativas para testar a presença ou ausência de anticorpo anti-HIV. 0 imunoadsorvente pode ser preparado por adsorção ou acoplamento de uma proteína ou peptídeo purificado de HIV a uma fase sólida. Podem ser usadas várias fases sólidas, como sejam esferas de vidro, polistireno, poli-propileno, dextrano ou outro material. Outras fases sólidas adequadas incluem tubos ou placas formadas a partir destes materiais ou revestidos com eles.

As proteínas ou peptídeos de HIV podem ser ligadas covalentemente ou não covalentemente à fase sólida por técnicas tais como ligação covalente através de uma ligação amida ou éster ou adsorção. Após a proteína ou peptí-déo de HIV estar fixada à fase sólida, a fase sólida pode ser revestida com uma proteína animal, e.g. 3% de gelatina de peixe. Isto proporciona uma proteína bloqueadora que reduz a adsorção não específica à superfície imunoadsorvente. 0 imunoadsorvente é então incubado com a amostra a ser testada quanto ao anticorpo anti-HIV.

No despista de sangue usa-se o plasma sanguíneo ou soro. O pla£ ma ou soro é diluído com plasma ou soro animal normal. O plasma ou soro diluente deriva da mesma espécie animal normal. 0 plasma ou soro diluente deriva da mesma espécie animal que é a fonte do anticorpo anfi-IgG humana. O anticorpo anti-IgG humana preferido é o anticorpo de cabras anti-IgG humana. Assim no formato preferido, o diluente será soro ou plasma de cabra*

As condições de incubação, e.g. pH e temperatura e a duração da incubação não são criciais. Estes parâmetros podem ser optimizados por experimentação de rotina. Geralmente, a incubação decorrerá durante 1-2 horas, a cerca de 45sc num tampão de pH 7-8.

Após incubação, o imunoadsorvente e a amostra são separados. A separação pode ser conseguida por qualquer técnica de separação convencional como seja sedimentação ou centrifugação. 0 imunoadsorvente deve então ser lavado para eliminar qualquer substância interferente. 0 imunoadsorvente é incubado com o anticorpo marcado (marcador) anti-IgG humano para detectar o anticorpo humano a ele ligado. Geralmente o imunòasorvente é incubado com uma solução do anticorpo marcado anti-IgG humana o qual uma pequena quantidade (cerca de 1%) do soro ou pias ma da espécie animal que serve como fonte do anticorpo anti--IgG humana. 0 anticorpo anti-IgG humana pode ser obtido a partir de qualquer fonte animal. No entanto, é preferido o anticorpo de cabra anti-IgG humana. O anticorpo anti-IgG humana pode ser um anticorpo contra o fragmento Fc da IgG humana, por exemplo anticorpo de cabra anti-Fc de IgG humana. 0 anticorpo anti-IgG humano ou anti-Fc de IgG humana pode ser marcado com um material radio- 125 activo como seja I; marcado com uma marca óptica, como seja um material fluorescente; ou marcada com uma enzima tal como peroxidase de rábula silvestre. 0 anticorpo anti-humano pode também ser biotinilado e avidina usada para detectar a sua ligação ao imunoadsorvente.

Após incubação com o anticorpo mar cado, o imunoadsorvente é separada da solução e a marca associada ao imunoadsorvente é avaliada. Dependendo da escolha da marca, a avaliação pode ser feita por uma variedade de métodos. A marca pode ser detectada com um contador gama se a marca for -30-

ura material fluorescente. No caso de uma enzima, a detecção da marca pode ser feita colorimetricamente empregando um substrato da enzima. A quantidade de marca associada ao imunoadsorvente é comparado com testemunhas positivas e negativas de modo a determinar a presença de anticorpos anti--HIV. As testemunhas são geralmente analisadas simultâneamente com a amostra a ser testada. Uma testemunha positiva é um soro contendo anticorpo contra HIV; uma testemunha negativa é um soro de indivíduos saudáveis que não contem anticorpo contra HIV.

Por conveniência e normalização, os reagentes para efectuar o ensaio imunométrico podem ser mon tados em "kits" de ensaio. Por exemplo, um "kit" para o despiste de sangue, pode incluir: (a) um imunoadsorvente, e.g. uma esfera de polistire-no revestida com uma proteína ou peptídeo de HIV; (b) um diluente para a amostra de soro ou plasma, e.g., soro ou plasma normal de cabra; (c) um anticorpo anti-lgG humana, e,g, anticorpo de cabra anti-lgG humana em solução aquosa tampona-da contendo aproximadamente 1% de soro ou plasma de cabra; (d) uma testemunha positiva, e.g. soro contendo anticorpo contra pelo menos uma das novas proteínas ou peptídeos de HIV; e (e) uma testemunha negativa; e.g,, soro reunido ou indivíduos saudáveis que não contêm anticorpo contra pelo menos uma das novas proteínas ou peptídeos de HIV. -31-

Se a marca.fôr uma enzima, um elemento adicional do "kit" pode ser o substrato da enzima.

Um outro tipo de ensaio para anticorpos anti-HIV é um ensaio de antigénios em sanduiche. Neste ensaio uma proteína ou peptídeo marcado de HIV é usado em vez do anticorpo anti-lgG humana para detectar anticorpo anti--HIV ligado ao imunoadsorvente. 0 ensaio baseia-se em princípio na bivalência das ^moléculas de anticorpo. Um sítio de ligação do anticorpo liga-se ao antigénio fixado à fase sólida; o segundo está disponível para ligação ao antigénio marcado. 0 processo do ensaio ê essencialmente o mesmo descrito para o ensaio imunométrico exceptuando que após incubação com a amostra, o imunoadsorvente é incubado com uma solução de proteína ou peptídeo marca de HIV. As proteínas ou peptídeos de HIV podem ser marcados com radioisótopo, uma enzima, etc., para este tipo de ensaio,

Num terceiro formato, a proteína bacteriana, proteína A, que se liga ao segmento Fc de uma molécula de IgG sem interferir com a interacção antigénio-anti-corpo pode ser usada como traçador marcado para detectar anticorpo anti-HIV aâsorvido ao imunoadsorvente. A proteína A pode ser fácilmente marcada com um radioisótàpo, enzima ou outras espécies detectáveis.

Os ensaios imunoquímicos que empregam uma proteína ou peptídeo de HIV têm sido várias vantagens relativamente aos que empregam um vírus completo (ou destruído). Os ensaios baseados numa proteína ou peptídeo de HIV aleviarão a preocupação acerca das quantidades cada vez maiores de vírus infeccioso e da variabilidade inerente associada à cultura de células e produção de vírus. Ainda, os ensaios auxiliarão a minimizar o modo de construir SIDA pelos técnicos em hospitaá.3, clinicas e bancos de sangue que efectuam o teste.

Os ensaios imunoquímicos que empregam proteínas recombinantes do envólucro derivados de várias variantes virais. Têm vantagens adicionais relativamente às proteínas de uma única variante de HIV. Os ensaios que incluem sequências de proteína de várias variantes são provável-mente mais precisos na detecção de anticorpos na população humana infectada com várias variantes de HIV, Também o ensaio imuno-sorvente em fase sólida com enzima (ELISA) utilizando diferentes proteínas variantes de HIV permitiria a determinação de serotipos predominantes em diferentes áreas geográficas. Esta determinação não foi possível até agora uma vez que nenhum "kit" de detecção de anticorpos disponível utiliza mais de uma variante de HIV.

Uma outra utilização de proteínas recombinantes de variantes de HIV é induzir anti-soros específicos das variantes em animais de laboratório. Este anti-soro proporcionaria um reagente para identificar qual a variante virai que infectou um individuo. Normalmente, a "tipagem dos vírus" pode apenas ser feita por clonagem e sequenciação de genes virais. A ligação do soro específica da variante a um isolado virai de um paciente proporcionaria um meio de detecção rápida normalmente não disponível. Por exemplo, os soros induzidos contra proteínas designadas ΡΒ1ΙΙΙβ, PBlRp, PB1MN, PBlgc e pBl|jMj2 Podem ser usados para a despiste de isolados virais de pacientes para determinar qual a variante de HIV com o que o isolado clínico apresenta mais semelhanças. Este "despiste" pode ser feito por uma variedade de técnicas de ligação de anticorpo-antigénio conhecidos.

Vacinas compreendendo uma ou mais das proteínas ou peptídeos de HIV, aqui divulgados, e suas variantes tendo propriedades antigénicas, podem ser preparadas por processos conhecidos. Por exemplo, tais vacinas podem ser preparadas na forma injectável, e.g. soluções ou suspensões líquidas. Também podem ser preparadas formas sólidas para solução ou suspensão num líquido antes da injecção. -33-

Facultativamente, a preparação também pode ser emulsionada. 0 ingrediente ou ingredientes antigénicos activos podem ser misturados com excipientes que são farmacêuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. São exemplos de tais excipientes água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, etanol ou similares e suas combinações..Em adição, como se pretenda, a vacina pode conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes do pH ou adjuvantes tais como hidróxido de alumínio ou muranil-dipeptídeo ou suas variações. No caso de peptí-deos, o acoplamento a moléculas maiores tais como KLH algumas vezes aumenta a imunogenicidade. Convencionalmente as vacinas são administradas parenteralmente, por injecção, por exemplo por via subcutânea ou intramuscular. Formulações adicionais adequadas a outros modos de administração incluem supositórios e, nalguns casos, formulações.orais. Para os supositórios, os ligantes tradicionais e veículos incluem, por exemplo, pollal-calenoglicóis ou triglicéridos. Os supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo na gama entre cerca de 0,5¾ e cerca de 10%, de preferência cerca de 1 a cerca de 2%. As formulações orais podem incluir os excipientes normalmente empregues, tais, como por exemplo, mani-tol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e similares. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas formulação de libertação controlada ou pós e contêm entre cerca de 10% e cerca de 95% de ingrediente activo, de preferência entre cerca de 25% e cerca de 70%.

Os compostos podem ser formulados na vacina como formas neutras ou sais. Sais farmacêuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amina livres do peptídeo) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácido clorídrico ou fosfórico ou com ácidos orgânicos tais como acético, oxáliço, tartárico, mandélico e similares. Os sais formados com os grupos carbonilo livres podem também ser derivados de bases inor- -34-

gânicos tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio, ou férricos e com bases orgânicos tais como isopropilamino, trimetilamina, x-etilaminoetanol, histidina, procarina e similares. Uma composição de vacina pode incluir peptídeos contendo epítopos de células T auxiliares em combinação com fragmentos de proteína contendo o principal domínio de neutralização. Vários destes epítopos foram mapeados dentro do envólucro de HIV e estas regiões observou-se estimularem a proliferação e libertação de linfocinas pelos linfóci-tos. Colocando estes epítopos em simultâneo numa vacina poderá resultar na estimulação das respostas imunes humoral e celular .

Como alternativa, uma composição de vacina pode incluir um composto que funcione para aumentar a resposta imune em geral. Um destes compostos é a interleu-quina-2 (IL-2) que foi descrita como aumentando a imunogenici-dade por estimulação generalizada do sistema imune (Nunberg et al. /19887 Em New Chemical and Genetic Approaches to Vacci-nation, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). IL-2 pode ser acoplada com um peptídeo ou proteína de HIV compreendendo o PND para aumentar a eficácia da vacinação.

As vacinas são administradas de modo compatível com a formulação de dosagem em quantidades tais que sejam terapêuticamente eficazes e imunogénicas. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, da capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos e do gene de protecção pretendido. As quantidades precisas do ingrediente activo que é necessário administrar depende da avaliação do médico e são específicos para cada indivíduo. No entanto, gamas de dosagem adequadas sao da ordem de várias centenas de microgramas de ingrediente activo por indivíduo. Os regimes adequados para a administração inicial e os reforços são também variáveis, mas tipicamente uma administração inicial é seguida de uma injecção subsequente ou outra administração com um intervalo de uma ou duas semanas. -35-

É conhecido - que o HIV sofre variação da sequência de aminoácidos, particularmente no gene do invólucro (Starcich, B.R. /1986J Cell 45: 637-648; Hahn, B.H. et al /19867 Science 232: 1548-1553). Cerca de 100 variantes foram analisados por clonagem molecular e análise de reconhecimento com enzimas de restrição e vários destes foram analisados por sequenciação de nucleotídeos. Alguns destes são os isolados HIV conhecidos? como RF (Popovic, M. et al /1981J Science 224: 497-500), WHJ-1 (Halm, B.H. et al /Ί98&7 Science 232: 1548-1553), LAV (Wain-Hobson, S. et al /19857 Cell 40: 9-17) e ARV-2 (Sanchez-Pescador, R. et al /19857' Science 227: 484-492. Os peptídeos de HIV para proteger contra infecções por diferentes isolados de HIV. Ainda, pode-se fazer uma preparação da vacina usando mais do que um fragmento de proteína do envólucro correspondendo o principal domínio de neutralização de mais do que um isolado de HIV para proporcionar imunidade e portanto conferir melhor protecção contra SIDA. Como alternativa, a preparação de vacina pode ser feita usando um único fragmento de proteína que compreende um arranjo em tandem dos princípios epitopos de neutralização de mais do que um isolado de HliV. Através da identificação do principal domínio de neutralização do HIV, esta região do polipeptídeo pode ser usada para formular reagentes importantes de vacinas, diaçf nosticos e terapêutico.

Os anticorpos contra os peptídeos recombinantes aqui descritos são úteis como reagentes terapêuticos e profiláctivos. A geração de anticorpos policlonais ou monoclonais capazes de neutralizar uma variedade de variantes de HIV poderá ser usado para reduzir a incidência de ínfecção acidental e tratar pessoas infectadas com HIV que estão imuno-comprometidas. Em adição, os regimes de imunização podem induzir soros policlonais capazes de neutralizarem várias variantes de HIV; A capacidade para neutralizar múltiplos variantes de HIV é designada de um modo geral como anticorpo neutrali-zante. Num sentido lato o anticorpo neutralizante pode neutralizar duas ou mais variantes ou todas as variantes de HIV. -36-

Portanto, uma mistura de anticorpos neutralizantes larga que neutraliza diferentes grupos de variantes de HIV será útil no diagnóstico,-profilaxia e terapia de SIDA. É surpreendentemente e vantajoso guera imunização com peptídeos de cinco variantes de HIV dê origem a soros capazes de neutralizarem mais do que estas cinco variantes de HIV quando a imunização com dois não o consegue. 0 Exemplo 22 mostra que a imunização com cinco peptídeos induz soros neutralizantes com uma larga gama de actividade.

Os soros neutralizantes com uma larga gama de actividade podem também ser obtidos se várias sequências da região hipervariá-vel das diversas variantes de HIV forem apresentadas como um único peptídico sintético. Em adição, pode-se incluir estes soros neutralizantes com uma larga gama de actividade por re--imunização dos animais sensibilizados com RP136 ou proteínas equivalentes com peptídeos contendo apenas os aminoácidos conservados dentro desta região hipervariável. Estes regimes de imunização seriam úteis para a vacinação e indução de anticorpos úteis como agentes terapêuticos. A imunoglobulina polivalente para usar na imunização passiva pode ser preparada por imunização de cavalos ou juntando soro humano e fraccionando o componente com IgG do plasma ou do soro,. Linhas celulares produtoras de anticorpo monoclonal humano ou de ratinho podem ser preparados por transformação convencional e tecnologia de hibrido-mas (Methods in Enzymology Vol. 121, Secções I e II £l9SÇ>J e ds. J.J. Langose e H.V. Vunakís, Academic Press). 0 anticorpo monoclonal contra HIV pode ser preparado de acordo com os processos descritos por Matsushita et al. (Matsushita et al £Í983J Journal of Virology 62(6): 2107-2114). Uma vez que a maior parte dos anticorpos monoclonais são produzidos em espécies que não a humana, eles são muitas vezes imunogénicos para os humanos. Para usar com êxito estes anticorpos monoclonais no tratamento de humanos, pode ser necessário criar uma molécula de anticorpo quimérico onde a fracção de polipeptídeo envolvida -37-

na ligação do ligando (a região variável> deriva de uma espécie e a fracção envolvida na estabilidade estrutural e outras funções biológicas (a região constante) deriva de um anticorpo humano. Os métodos para a produção de anticorpos quiméricos em que o domínio variável deriva de um hospedeiro e o domínio constante deriva de um segundo hospedeiro, são bem conhecidos dos famialiarizados com a matéria. Ver, por exemplo, Neuberger et al„, Publicação WO N2. 86/01533, prioridade 9/3/84; Morrison et al., Publicação EP Nõ, 0 173 494, prioridades 8/27/84. Um método alternativo, em que um anticorpo é produzido substituindo as regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de região variável com as CDRs de uma imunoglobulina da especificidade antigénica pretendida, foi descrito por Winter (Publicação GB NS. 2.188 638, prioridade 3/27/86). Os monoclonais mu-rinos podem ser tornados compatíveis com a utilização terapêutica através da produção de um anticorpo contendo uma fracção Fc humana (Morrison,.S.L, /19897 Science 229; 1202-1207). Os processos estabelecidos permitiram a construção, expressão e purificação de tal anticorpo monoclonal híbrido. Os regimes de administração terapêutica de imunoglobulina foram anterior-mente usados para uma série de doenças infecciosas.

Tal como aqui é usado o termo "anticorpo" pretende incluir anticorpos monoclonais ou poli-clonais, anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos tendo a actividade imunológica do anticorpo completo. Também incluídos no termo "anticorpoV estão os anticorpos quiméricos tendo as regiões variáveis e as regiões constante de diferentes espécies hospedeiras ou aqueles em que apenas as CDRs são substituídas.

Para o tratamento da infecção por HIV, as composições compreendendo anticorpos podem ser administrados a um indivíduo ou animal necessitado de tratamento.

Como alternativa, os antigénios de HIV aqui descritos podem ser administrados para estimular a resposta imune do próprio paciente. Quando do tratamento com um antigénio de HIV, pode -38-

ser administrado um único antigénio ouy de preferência um an-tigênio ou mistura de antigénios de larga neutralização. Tais composições estão descritos detalhadamente nos exemplos que se seguem. A capacidade para modificar pep-tídeos feitos por sintese orgânica pode ser vantajosa para o uso em diagnóstico, terapia e profilaxia ao melhorar a eficácia da imobilização, aumentar a estabilidade da proteína, aumentar a imunogenicidade, alterar a imunogenicidade, reduzir a toxicidade ou permitir a ocorrência simultânea de várias modificações, Por exemplo os peptídeos podem ser modificados para aumentar ou dominar a carga global por modificação dos grupos amina ou carboxilo (carbamilação) trifluoroacetilação ou succinilação de grupos amina; acetilação de grupos carbo-nilo). Os peptídeos podem ser tornados mais estáveis por exemplo através da inclusão de D-aminoácidos ou circularização do peptídeo. 0 estado de redução aos peptídeos pode ser alterado por exemplo através de sulfonação de grupos cistinilo. Os peptídeos podem também ser modificados covalentemente ou não co-valentemente com materiais não proteicos tais como lípidos ou açucares para aumentar a imunogenicidade ou solubilidade. O polietilenoglicol pode ser usado para aumentar a solubilidade. 0 presente invento todas estas modificações químicas das proteínas e peptídeos aqui divulgados desde que a proteína e/ou peptídeos modificados retenham substancialmente todas as propriedades antigénicas/imunogénicas do composto parental.

Os peptídeos podem também ser modificados de modo a conter propriedades antigénicas de mais do que uma variante virai. Isto foi feito por exemplo com o virus da febre afetosa. 0 vírus da febre afetosa é semelhante ao HIV por existirem múltiplos variantes e a imunização com uma variante não conduzir à protecção contra outras variantes. A utilidade real dos peptídeos como imunogénios é demons- trada ao reduzir imunidade contra mais^do que uma variante por modificação, do peptídeo de modo a este possuir propriedades de ambas as variantes naturais. Quando tal variante modificada foi usada para imunizar os animais a testar, estes ficaram protegidos contra o vírus da febre afetosa estirpe AIO e A12 (Brown, F. em Vírus Vaccines, ed. G. Dreesman, J. Bronson, R. Kennedy, pág. 49-54 /19857).

Os peptídeos ou proteínas de HIV contendo um epítopo PND podem também ser acoplados a uma partícula virai não relacionada ou nula incorporados, num vírus replicativo, ou outro microorganismo de modo a aumentar a imu-nogenicidade. 0 epítopo HIV pode ser genética ou quimicamente ligado à partícula virai ou microorganismo ou a uma fracção ou componente imunogénico. Os epítopos antigénios foram ligados a proteínas virais ou partículas virais para aumentar a resposta imune. Por exemplo a proteína VP6 da cápside de rota-vírus foi usada como proteína veículo imunológico para um epítopo de interesse na forma monomérica ou como oligómeros de VP6 na forma de partículas (Publicação EP ΝΩ. 0.259.149). De modo semelhante Evans et al. (1989, Nature 339:385) constituíram quimeras da proteína da cápside de poliovírus e um epítopo d gp41 de HIV para aumentar a imunogenicidade do epítopo de HIV. Determinantes antigénicos estranhos também foram expressos e apresentados por células bacterianas. Uma estirpe de Salmonella expressando um gene clonado da flagelina de Salmo-nella, no qual foi inserido um epítopo da toxina da cólera ou de antigénio de superfície da hepatite B, foi descrito como indotora de respostas celulares e humorais aos epítopos inseridos (Newton, et al. /19897 Science 244: 70-72; e Wu et al C1989J Proc. Natl. Acad. Sei. 86: 4726-4730). 0 Exemplo 18 mostra que um peptídeo contendo sequências de aminoácido das duas variantes de HIV pode bloquear a actividade de neutralização de anti-soros neutralizantes específicos dos dois vírus. Isto sugere que uma peptídeo ou proteína contendo sequências de dois ou mais va- \ riantes de HIV pode induzir uma resposta imune eficaz contra duas ou mais variantes de HIV. 0 Exemplo 19 mostra que a imunização com proteínas do envólucro d dois isolados de HIV induz uma resposta imune capaz de neutralizar dois isolados de HIV. Isto sugere que a co-imunização com proteínas de duas ou mais variantes de HIV pode induzir uma resposta imune eficaz contra duas ou mais variantes de HIV.

Seguem-se exemplos que ilustram o processo do invento, incluindo a melhor maneira de o realizar. Estes exemplos não devem ser pensados como limitantes. Todas as proporções dos solventes nas misturas são por volume excepto se de outro modo for dito. EXEMPLO 1

Construção do plasmídeo pREV2.2 O vector da expressão plasmídeo pREV2.2 foi construído a partir do plasmídeo pBGl. O plasmídeo pBGl pode ser isolado a partir do seu hospedeiro E. coli por métodos bem conhecidos, e.g., usando processos de clarificação dos lisados por gradientes de densidade isopicnicos e similares. Tal como pBGl, pREV2.2 expressa genes inseridos a seguir ao promotor de E. coli. As diferenças entre pBGl e pREV2.2 são as seguintes: 1. pREV2.2 não possui uma proteína de replicação do pias mídeo (rop) funcional. -41-

2. pREV2.2 tem o terminador de transcrição do trpA inserido no sítio AatlI. Esta sequência assegura a terminação da transcrição de genes com um nível de expressão elexado. 3. pREV2.2 possui genes que conferem resistência à ampi-cilina e clorofenicol, enquanto que pBGl proporciona resistência apenas à ampicilina. 4. pREV2.2 contem uma sequência codificadora de sítios para várias endonucleases de restrição.

Os processos que se seguem foram usados para fazer cada uma das quatro alterações atrás referidas: la. 5 jig do plasmídeo pBGl foram cortados com Ndel, que dá dois fragmentos de aproximadamente 2160 e 3440 pares de bases. lb. 0,1 pg de DNA da mistura de digestão, após inactiva-ção da Ndel, foi tratado com DNA-ligase de T4 em condições que favorecem a ligação intramolecular (200 jil de volume de reacção usando condições normalizadas de reacção com DNA-ligase de T4 £New Englad Biolabs, Beverly, MA7)· A ligação intramolecular do fragmento de 3440 pares de bases deu um plasmídeo resistente à ampicilina. A mistura de ligação foi usada para trans formar a estirpe recipiente E. coli JM103 (adquirida à New England Biolabs) e os clones resistentes à ampicilina foram seleccionados por processos convencionais. lc. O plasmídeo produto, pBGl^N, em que foi eliminado o fragmento Ndel de 2160 pares de bases do pBGl, foi seleccionado preparando o plasmídeo a partir de cio- -42-

nes resistentes à ampicilina e determinando os padrões de digestão com as enzimas de restrição Ndel e Sall (fragmentos produzidos de aproximadamente 1790 a 1650). Esta delecção inactiva o gene rop que controla a replicação do plasmídeo. 2a. 5 pg de pBGl N foi então digerido com EcoRI e Bell e o fragmento maior de aproximadamente 2455 pares de bases foi isolado. 2b. Prepara-se um fragmento sintético de DNA de cadeia dupla segundo o processo de Itakura et al (Itakura, K., J. J. Rosit e R.B. Wallace /1984J7 Ann. Rev. Bio-chem. 53: 323-356 e referências nele inclusas) com a seguinte estrutura: 5' GATCAAGCTTCTGCAGTCGACGCAT'

3' TTCGAAGACGTCAGCTGCGTACGCC GCGGATCCGGTACCCGGGAGCTCG3' TAGGCCATGGGCCCTCGAGCTTAA 5'

Este fragmento tem extremos coesivos Bell e EcoRI e contem sequências de reconhecimento para várias endonucleases de restrição. 2c. 0,1 pg do fragmento EcoRl-Bcll de 2455 pares de ba ses e 0,01 ]ig do fragmento sintético foram ligados em DNA-ligase de T4 e foram transformadas células competentes da estirpe JM103. As células portadoras do plasmídeo recombinante, onde o fragmento sintético foi inserido em pBGl^N entre os sítios BcLI e EcoRI, foram seleccionados por digestão do plasmídeo com Hpal e EcoRI. Os fragmentos de diagnostico são de aproximadamente 2355 e 200 pares de bases. Este plasmídeo é designado pREVl. -43-

2d. 5 pg de pREVl foram digeridos com Aatll, o qual cli va num único sítio. 2e. Sintetizaram-se os seguintes fragmentos de cadeia dupla:

5' CGGTACCAGCCCGCCTAATG

3' TGCAGCCATGGTCGGGCGGA AGCGGGCTTTTTTTTGACGT3' TTACTCGCCCGAAAAAAAAC 5'

Este fragmento tem extremos coesivos Aatll e contem uma sequência de terminação de transcrição TrpA 2f. 0,1 pg de pREVl digerido com AaTII foi ligado com 0,01 pg do fragmento sintético num volume de 20 pl usando DNA-ligase de T4. 2g. Células da estirpe JM103, tornados competentes, foram transformadas e seleccionadas os clones resistentes à ampicilina 2h. Usando uma dupla digestão com as enzimas de restrição Kpml e EcoRI do plasmídeo isolado a partir de colónias seleccionadas, isolou-se uma célula contendo a construção correcta. Os tamanhos dos fragmentos Kpml e EcoRI gerados são de aproximadamente 2475 e 80 pares de bases. Este plasmídeo é designado pREVlTT ercontem o terminador da transcrição TrpA. 3a. 5 pg de pREVITT, preparado como descrito atrás (por meios convencionais) foram clivados com Ndel e Xmnl e isolado o fragmento com aproximadamente 850 pares de bases. -44- 3b. 5 pg do plasmídeo pBR325 (BRL, Gaithersburg, MD), o qual contem os genes que conferem resistências ao cloranfenicol assim como à ampicilina e à te-traciclina, foram clivados com Bell e os extremos tornados cerses com polimerase Klenow e desoxinu-cleotídeos. Após inactivação da enzima, a mistura foi tratada com Ndel e isolado o fragmento com aproximadamente 3185 pares de bases. Este fragmento contem os genes da resistência ao clorofenicol e à ampicilina e a origem da replicação. 3c. 0,1 pg do fragmento Ndel-Xmnl de pREVlTT e o frag mento Ndel do pBR325 foram ligados em 20 pl com DNA-ligase de T4 e a mistura usada para transformar células competentes da estirpe JM103. Selec-cionaram-se células resistentes à ampicilina e ao clorofenicol. 3d. Usando duplas digestões com EcoRI e Ndel do plasmídeo de clones seleccionados, seleccionou-se um plasmídeo que deu fragmentos de tamanhos aproximados 2480, 1145 e 410 pares de bases. Este foi designado plasmídeo pREVlTT/chl e possui genes para resistência à ampicilina e ao cloranfenicol. 4a. Sintetizou-se o seguinte fragmento de cadeia dupla: MluI EcoRI Ciai BamHI Sall HindIII Smal 5' CGAACGCGTGGCCGATATCATCGATGG- ATCCGTCGACAAGCTTCCCGGGAGCT 3' 3' GCTTGCGCACCGGCTATAGTAGCTAC- CTAGGCA GCTGTTCGA A GGGCCC 5'

Este fragmento, com um extremo cerne e um extremo coesivo SstI contêm sequências de reconhecimento para vári is sítios de enzimas de restrição. 4b. 5 pg de pREVlTT/chl foram clivados com NruI (a qual cliva a cerca de 20 nucleotídeos do sítio Bell) e SsTI (a qual cliva dentro do sítio de clonagem múltiplo). O fragmento maior, aproximadamente 3990 pares de bases, foi isolado a partir de um gel de agarose. 4c. 0,1 pg do fragmento Nrul-Sstl do pREVlTT/chl e 0,01 jig do fragmento sintético foram tratados com DNA-li-gase de T4 num volume de 20 ul. 4d. Esta mistura foi usada para transformar a estirpe JM1Q3 e foram seleccionados os clones resistentes à ampicilina, 4e. O plasmídeo já foi purificado a partir de vários clones e despistado por digestão com MluI ou Ciai. Os clones recombinantes com o novo sítio de clonagem múltipla darão um fragmento quando digeridos coro qualquer uma destas enzimas, uma vez que cada uma delas cliva o plasmídeo apenas num sítio. 4f. A sequência do sítio de clonagem múltipla foi verificada. Isto foi feito cortando o plasmídeo com Hpal e PvuII e isolando o fragmento de 1395 pares de bases, clonando-o no sítio Smal de mpl8 e sequenciando-o por sequênciação de didesoxinucleotídeos usando métodos convencionais, 4g. Este plasmídeo foi designado pREV2.2. EXEMPLO 2

Construção do vector de expressão bacteriano pREV2.1 0 plasmídeo pREV2.1 foi construído usando o plasmídeo pREV2,2 e um oligonucleotídeo sintético. 0 plasmídeo resultante foi usado para construir pPBl-Subl e pPBl-Sub2.

Segue-se um exemplo de como construir pREV2.1: 1. 0 plasmídeo pREV2.2 foi clivado com as enzimas de restrição NruI e BamHI e o fragmento de 4 kb foi isolado a partir de um gel de agarose. 2. Sintetizou-se o seguinte oligonucleotídeo de cadeia dupla: 5' CGAACGCGTGGTCCGATATCATCGATG 3' 3' GCTTGCGCACCAGGCTATAGTAGCTACCTAG 5 * 3. Os fragmentos de 1 e 2 são ligados em 20 μΐ usando DNA-ligase de T4, usados para transformar células competentes de E. coli e isolados as colónias resistentes ao cloranfenicol. 4. Foram identificados clones de plasmídeos que contêm o oligonucleotídeo de 2 abrangendo a região do sítio NruI até ao sítio BamHI e recreando estes dois sítios de restrição.. Este plasmídeo é designado pREV2.1. EXEMPLO 3

Construção e expressão do plasmídeo pPBl-Subl 0 plasmídeo pPBl-Subl, que contem aproximadamente 165 pares de bases (pb) de DNA codificando essencialmente o gene env de HIV desde o sítio PvuII até ao sítio Dral e a partir do qual é sintetizada uma proteína de fusão de aproximadamente 12 kd contendo esta fracção da pro-teina gpl20 do envólucro, pode ser constituído como se segue; 1. Corte do plasmídeo pPBlIIIB com MluI e Dral.e isolamento do fragmento de aproximadamente 165 pb. 2. Corte do plasmídeo pREV2.1 com MluI e Smal e isolamento do fragmento grande, de aproximadamente 4 kd, a partir de um gel de agarose. 3. Ligação do fragmento preparado em 2. com o fragmento de pREV2.1 num volume de 20 yil usando DNA-ligase de T4, usando a mistura de ligação para transformar células competentes estirpe CAG629 e seleccionando transformantes resistentes à ampicilina. 4. Selecção de tais transformantes, através dos padrões de restrição, que possuem o fragmento de gpl20 clo-nado na orientação correcta para gerar uma proteína de fusão. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo recombinante é cultivada em meio a 2% contendo 50 pg/ml de ampicilina e o complemento total de proteínas celulares é sujeito a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida, uma proteína de aproximadamente 12 kd pode ser visualizada por coloração com azul Coomassie ou por análise de transferências Western usando como sonda soros seleccionados de indivíduos 48-

infectados com HIV. EXEMPLO 4

Purificação da proteína recombinante contendo sequências do envolucro de HIV presentes no plasmídeo pPBl-Subl 1. Crescimento das células: As células foram cultivadas num volume de 10 litros num fermentador Cnemap (Cha-mopec, Woodburg, NY) em meio a 2% (2% de extracto de levedura, bacto-triptona, casaminoácidos /Oifco, De-troit, Ml7, 0,2% de potássio monobósico, 0,2% de potássio dibásico e 0,2% de sodio dibásico). A temperatura de fermentação foi de 30SC, o pH foi de 6,8 e forneceu-se ar a 1 vvm. Fez-se a selecção do plasmídeo adicionando cloranfenicol e 20 jag/ml. A produção típica de células (peso molecular) foi de 30 g/1. 2. Lise celular: 50 g, peso molhado, de células de E. coli contendo a proteína de fusão recombinante do en-vólucro de HIV foram resuspensos num volume final de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 8,0, potássio-ácido etil-enodiaminotetracético (KEDTA) 5mM, ditiotreitol (DTT) 5mM, B-mercaptoetanol 15mM, 0,5% de TRITON™ X-100 (Pharmacia, Piscataway, NY) e fluoreto de fenilmetil-sulfonilo (PMSF) 5mM. A suspensão foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando

TM um BEAD-BEATER (Biosfec Products, Barthesville, OK) contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,1- Λν . * . -Λ , -0,15 mm. A lise foi feita durante 6 min à temperatura ambiente com intervalos de 1 min. O líquido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5 ha 20000 x g. O sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspenso em 100 ml de ureia 8M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT, β-mercaptoetanol 15mM, 5mM PMSF e IraM KEDTA, 0 sedimento foi solubilizado usando um homogenizado Polytrons e centrifugado a 20000 x g durante 2 h.

Cromatografia CM: O dialisado foi aplicado numa coluna de 100 ml (2,5 cm x 20 cm) contendo CM FAST FLOW SEPHAROSE (Pharmacia) equilibrada em ureia 8M, ácido 4-(2-hidroxietil-l-piperazina) etano-sul-fónico (HEPES) lOmM, pH 6,5, ]8-mercaptoetanol 15mM, e lmM KEDTA à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 200 ml de tampão de equilíbrio e a proteína eluida com um gradiente linear de 1,0 litro de 0-0,4M NaCl. A proteína de HIV (12kd) eluiu a apro-ximadamente 0,2M NaCl conforme detectado por elec-troforese em gel de SDS-poliacrilamida. obteve-se posterior purificação reunindo fracções contendo Sub-1 e aplicando--as numa coluna de filtração com gel S-200 (Pharmacia) equilibrada no mesmo tampão da coluna anterior. -50-

EXEMPLO 5

Construção e expressão do plasmídeo pEBl-Sub2 O plasmídeo pPB-1 Sub2 que contem aproximadamente 320 pb de DNA codificando essencialmente o gene eno de HIV desde o sítio PouII até ao sítio Seal, e a partir do qual se sintetizou uma proteína de fusão de aproxi-madamente 18 kd contendo esta fraeção da proteína do envólu-cro gpl20, pode ser construído como se segue: 1. Corte do plasmídeo ρΡΒΙ^^ com MluI e Seal e isolamento do fragmento de aproximadamente 320 pb. 2. Corte do plasmídeo pREV2„l com MLUI e Smal e isolamento do fragmento grande de aproximadamente 4kd, a partir de um gel de agarose. 3. Ligação do fragmento preparado em 2. com o fragmento de pREV2.1 num volume de 20 pl usando DNA-ligase de T4, transformação da estirpe de células competentes SG20251 com a mistura de ligação e selecção dos transformanteS resistentes à ampicilina. 4. Selecção de tais transformantes, através de padrões de restrição adequados, que tenham o fragmento de gpl20 clonado na orientação correcta para gerar uma proteína de fusão. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo rec©mbinante é cultivada em meio a 256 contendo 50 jig/ml de ampicilina e o complemento total de proteínas celulares sujeito a electroforese num gel de SDS-poliacrilamlda, uma proteína com aproximadamente 18kd pode ser visualizada por coloração com azul Coomassie ou por análise de transferências Western usando como sonda soro seleccionado de indi- 51- 51-

víduos infectados cora HIV. EXEMPLO 6

Purificação de proteína recorabinante contendo sequências do envólucro de HIV do plasmideo pP31-Sub2. 1. Crescimento das células: As células foram cultivadas num volume de 10 litros num fermentador Chemap em meio a 2%. A temperatura de fermentação foi de 37SC, o pH foi de 6»8 e introdusiu-se ar a 1 vvm. A selec-ção de plasmídeos foi conseguida cora 20 jjg/ml de clorofenicol. A produção celular típica (peso molhado) foi de 30 g/1. 2. Lise celular: 50 g, peso celular molhado, de E, coli contendo a proteina de fusão recombinante do envólucro de HIV foram resuspensos num volume final de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM KEDTA, 5mM DTT,

TM jB-mercaptoetanol 15mM 0,5% TRITON X-10S e 5mM PMSF. A suspensão foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando TM um BEAD-BEATER contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,l-0,15mm. A lise foi feita durante 6 min à temperatura ambiente em intervalos de 1 min. O líquido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5 h a 20Q00xg. O sobrenadante foi removido e o sedimento resuspenso em 100 ml de guanidina-hi-drocloreto 6M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT, jB-mer-captoetanol 15mM, 5mM PMSF e lmM KEDTA. O sedimento -52-

foi solubilizado usando um homogenizador Polytron e centrifugado a 20000xg durante 2h. 0 sobrenadante (90 ml) foi diali-sado contra 4 litros de ureia 8M, formato de sódio 20mM, pH 4,0, lmM EDTA, e p-mercaptoetanol 15mM. O tempo de duração de cada diálise foi de 8 h ou mais com três mudas de tampão. Usou-se o tubo de diálise Spectraphor (S1P, McGraw Park, IL) com um PM de exclusão de 3,5 kd.

Cromatografia CM: O dialisado foi aplicado numa coluna de 100 ml (2,5 cm x 20 cm) contendo CM FAST TM FLOW SEPHAROSE (Pharmacia) equilibrada em ureia 8M, formato de sódio 20mM pH 4,0, p-mercaptoetanol 15mM e lmM Na EDTA à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 200 ml de tampão de equilibrio e a proteína eluída com um gradiente linear de 1,0 litro de 0-0,4 M NaCl. A proteína de HIV (18kd) eluiu a aproximadamente 0,2M NaCl conforme detecta-do por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida.

Posterior purificação foi conseguida reunindo fracções contendo Sub2 e aplicando--as numa coluna de filtração de gel S-200 (Pharmacia) equilibrada no mesmo tampão da coluna anterior. -53-

EXEMPLO 7

Peptxdeos sintéticos A sintese de peptxdeos pode ser feita por uma variedade de processos estabelecidos, por exemplos, sínteses automatizadas de peptxdeos. Os peptxdeos foram montados por síntese em fase sólida em esferas de polistireno interligados começando no extremo carbonilo e adicionando ami-noácidos passo por passa (Merrifield, R.B. /19637 S. Am. Chem. Soc. 85i2149). Cada síntese foi efectuada num sintetizador de peptxdeos automático (Applied Biosystems 430-A) usando química t-BOC convencional. Os aminoácidos foram acopladas como anidridos simétricos altamente reactivos formados imediatamente antes de usar. Para minimizar as dificuldades de acoplagem usou-se dimetilformamida como agente de acoplamento. O ensaio quantitativo com ninidrlna foi usado para medir a eficácia de acoplamento após adição de cada aminoácido (Sarin, V.K., S.B. H. Kent, J.P. Tam, R.B. Merrifield /19817 Anal. Biochem. 117: 147 (1981)):

Todos os peptxdeos foram desprotegidos e clivados do suporte de polistireno usando uma clivagem HP alternativa. A resina contendo peptídeo foi ressuspen-sa numa mistura de ácido trifluoroacético, ácido trifluorome-tano-sulfónico e captadores de tiol orgânico (Tam, J.P., W.F. Heath, R.B. Merrifield /1986/ J. Am. Chem. Soc. 108: 5242). O peptídeo solúvel foi purificado com éter etílico e após remoção do éter, ressuspenso em carbonato de sódio 200mM, guanidi-na-HCl 3M. Os peptídeos brutos foram purificados por cromato-grafia em fase reversa numa coluna semi-preparativa C^g Vidac de 1,0 cm x 25 cm. Os tampões empregues foram; (A) 0,1% ácido trifluoroacético em í^O e (B) 0,1% de ácido trifluoroacético em 80% acetonitrilo 20% E^O. Utilizou-se a eluição com gradiente para eluir o peptídeo ligado e as fracções colhidas foram -54- analisadas para identificar o produto puro. A identidade dos peptídeos foi confirmada por análise de aminoácidos após hidrólise com HC1 6N. A síntese inclui a adição de aminoácidos terminais não homologos de HIV com fins de marcação, ligação cruzada de estruturas do peptídeo. Estes aminoácidos não HIV estão indicados entre parêntesis. 0 produto de síntese pode ser ainda purificado por uma série de técnicas de separação, por exemplo, cromatografado de permuta iónica. EXEMPLO 8

Construção e expressão do plasmídeo pPBlRp 0 plasmídeo pPBlRp que contem aproximadamente 565 pb de DNA codificando essencialmente o gene eno de HIVRI desde o sítio PouII até ao sítio BglII e a partir do qual foi sintetizador uma proteína de fusão de 27 kd contendo esta fracção da proteína do involucro de gpl20 pode ser constituído como se segue: 1. Síntese do fragmento de DNA na Tabela 4A. 2. Corte do plasmídeo pREV2.2 com EcoRI e BamHI e isolamento do fragmento grande, aproximadamente 4 kd de um gel de agarose. 3. Ligação do fragmento preparado em 1. com o fragmento pREV2.2 num volume de 20 yil usando DNA-liga-se de T4, transformação de células competentes da -55- estirpe CAG 629 com a mistura de ligação e selecção dos transformantes resistentes à ampicilina. 4. Selecção de tais transformantes, através de padrões de restrição adequados, que possuem o fragmento gp 120 clonado na orientação correcta para gerar uma proteína de fusão. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo recombinante é cultivada a 322C em meio a 2% contendo 50 jig/ml de ampicilina e o complemento total de proteínas celulares sujeito a electrofore-se num gel de SDS-poliacrilamida, pode-se observar uma proteína de aproximadamente 27kd por coloração com azul coomassie ou por análise de tranferências western usando como sonda soros seleccionados de animais infectados com HIV. EXEMPLO 9

Purificação de proteína recombinante contendo sequências do envólucro de HIV do plasmídeo pPBl^p 1. Crescimento das célulasí As células foram cultivadas num volume de 10 litros num fermentador Chemap em meio a 2%. A temperatura de fermentação foi de 30QC, o pH foi de 6,8 e o ar for introduzido a 100 m. A selecção de plasmídeos foi conseguida com 20 pg/ml de clorofenilcol, A produção celular típica molhada foi de 30 g/1. 2. Lise celular: 50 g, peso molhado de células, de E. coli contendo a proteína de fusão recombinante do invólucro de HIV foram ressuspensos num volume final

de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 3,0, 5mM KEDTA, 5mM rnu DTT, B-morcaptoetanol 15mM, 0,5% TRITON X-100 e 5mM PMSF. Adicionou-se 300 mg de lisozima e incubou--se a suspensão durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando TM um BEAD-BEATER contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,1-0,15 mm. A lise foi feita durante 6 min a temperatura ambiente em intervalos de 1 min. O líquido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5 h a 20000xg. O sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspenso em 100 ml de ureia 8M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT, B-mercaptoetanol 15mM 5mM PMSF e lmM KEDTA, O sedimento foi solubilizado usando um homogenizador Polytron e centrifugado a 200QGxg durante 2 h. O sobrenadante (90 ml) foi diali-sado contra 4 litros de ureia 8M, 20mM HEPES, pH 6,5 lmM EDTA e B-mercaptoetanol 15mM. De cada vez a diá-lise foi feita durante 8 h ou mais com três mudas de tampão. Usou-se tubo de diálise Spectrophor com um pm de exclusão de 3,5 kd,

Cromatografia CM; O dialisado foi aplicado numa coluna de 100 ml (2,5 cm x 20 cm) cheia com CM FAST FLOW SEPHAROSEa equilibrada em ureia 8M, lOmM HEPES pH 6,5, B-mercaptoetanol 15mM e lmM NaEDTA à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 200 ml de tampão de aquilibrio e a proteína eluida com um gradiente linear de 1,0 litro de 0-0,4M NaCl, A proteína de HIV (26kd) eluiu a aproximadamente 0,2M NaCl conforme testado por electroforese em gel de SDS-po-liacrilamida.

Posterior purificação foi conseguida reunindo as fracções contendo PBlRp e aplican-do-os numa coluna de filtração com gel S-300 equilibrada no mesmo tampão da coluna anterior. EXEMPLO 10

Construção e expressão do plastnídeo pPBl^ O plasmídeo pPBlMN que contem aproximadamente 600 pb de DNA codificando essencialmente o gene eno de HIV^ desde o sítio BglII até ao sítio BglII e a partir do qual se sintetizou uma proteína de fusão de aproximadamente 28kd contendo esta fracção da proteína do invólucro de gpl20, pode ser construido como se segue:

1. Síntese do fragmento de DNA na Tabela 5A

2. Corte do plasmídeo pREV2.2 com BamHI 3. Ligação do fragmento preparado em 1 com o fragmento de pREV2.2 num volume de 20 μΐ usando DNA-ligase de T4, transformação de células competentes de estirpe CAG 629 com a mistura resultante e selecção dos trans formantes resistentes à ampicilina. 4. Selecção de tais transformantes, através de padrões de restrição adequados, que possuem o fragmento de gpl20 clonado na orientação correcta para gerar uma proteína de fusão. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo recombinante é cultivada a 32£C em meio a 58- 58-

2% contendo 50 jig/ml de ampicilina e o complemento total de proteínas celulares sujeito a electrofore-se num gel de SDS-poliacrilamida, pode-se observar uma proteína de aproximadamente 28 kd por coloração com azul Coomassie ou por análise de transferência Western usando como soros seleccionados de indivíduos infectados com HIV. EXEMPLO 11

Purificação de proteína recombinante contendo sequências do invólucro de HIV do plasmídeo ρΡΒΙ^ 1. Crescimento das células: Cultivaram-se células num volume de 10 mitras num ferraentador Cheraap em 2% de meio. A temperatura de -fermentação foi de 302C, o pH foi de 6,8 e introduziu-se ar a 1 vvm. A selecção de plasmídeos foi feito com 20 jig/ml de cloranfeni-col. A produção típica (peso molhado) de células foi de 30 g/1.

Lise celular: 50 g, peso molhado de células, de E. coli. contendo a proteína de fusão recombinante do invólucro de HIV foram ressuspensos num volume final de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM KEDTA, 5mM ΦΜ / DTT, p-mercaptoetanol 15mM, 0,5% TRITON X-100 e 5mM PMSF. Adicionou-se 300 mg de lisozina e a suspensão foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando

rpM um BEAD-BEATER contendo um volume igual de esferas -59-

de vidro de 0,1-0,15 mm. A lisè'foi feita durante 6 min à temperatura ambiente em intervalos de 1 min. O líquido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5h a 20000xg. O sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspenso em 100 ml de ureia 8M, 2QmM Tris-Cl pH 8,0, 5mM DTT, p-mercaptoetanol 15 mM PMSF e lmM KEDTA. O sedimento foi solubilizado usando um homogenizador Polytron e centrifugado a 20000xg durante 2 h. O sobrenadante (90 ml) foi diali-sado contra 4 litros de ureia 8M, 20mM HEPES, pH 6,5, lmM EDTA e p-mercaptoetanol 15mM. De cada vez a diálise decorreu durante 8 h ou mais com três mudas de tampão. Usou-se tubo de diálise Sepectraphor com um PM de exclusão de 3,5 kd.

Cromatografia CM: O dialisado foi aplicado numa coluna de 100 ml (2,5 x 20 cm) cheia com CM FAST FLOW

•TM SEPHAROSE e equilibrada em ureia 8M, lOmM HEPES pH 6,5, p-mercaptoetanol 15mM e lmM KEDTA â temperatura. A coluna foi lavada com 200 ml de tampão de equilíbrio e a proteína eiuída com um gradiente linear de 1,0 litro de 0-0,4M NaCl, A proteína de HIV (28 Kd) eluiu a aproximadamente 0,2M NaCl conforme testado por electroforese em gel de SDS-poliacrila-rnida.

Conseguiu-se posterior purificação reunindo as fracções contendo PB1MN e aplicando-as numa coluna de filtração com gel S-3Q0 equilibrada no mesmo tampão da coluna anterior. -60-

EXSMPLO 12

Construção e expressão do plasmídeo pPBlgc O plasmídeo pPBlgc que contem aproximadamente 570 pb de DMA codificando essencialmente o gene eno de desde o sítio PouII até ao sítio BglXI, e a partir da qual é sintetizada uma proteína de fusão de aproximadamente 26kd contendo esta fracção da proteína do invólucro de gpl2G, pode ser construída como se segue: 1. Síntese de fragmento de DNA na Tabela 6A. 2. Corte do plasmídeo pREV2.2 com EcoRI e BamHI e isoladamente do fragmento grande, aproximadamente 4kd, do gel de agarose. 3» Ligação do fragmento preparado em 1, com o fragmento do pREV2„2 num volume de 20 P1 usando DNA-ligase de T4, transformação de células competente da estirpe CAG 629 com a mistura de ligação resultante e selec-çao dos transformantes resistentes à ampicilina. 4. Selecção de tais transformantes, através de padrões de restrição adequados, que possuem o fragmento de gpl20 clonado na orientação correcta para dar origem a uma proteína de fusão. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo recombinante é cultivada a 322C em meio a 2% contendo 50 pg/ml de ampicilina e o complemento total de proteínas celulares sujeito a electro-forese num gel de SDS-poliacrilatnida, pode-se observar uma proteína de aproximadamente 26 kd por coloração com azul Comassie ou por análise de transferência Western usando como sonda soros seleccionados de in- -61- divíduos infectados com HIV. EXEMPLO 13

Purificação de proteína recombinante contendo sequência do invólucro de HIV do plasmídeo pPB. 1. Crescimento das células: As células foram cultivadas num volume de 10 litros num fermentador Chemap em meio a 2%. A temperatura de fermentação foi de 30QC, o pH foi de 6,8 e introduziu-se ar a 1 vvm. A selecção de plasmídeos foi conseguida com 20 jjg/ml de cloranfenicol. A produção celular típica (peso molhado) foi de 30 g/1. 2. Lise cèlular: 50 g, peso molhado de células, de E. coli contendo a proteína de fusão recombinante do envólucro derHIV foram ressuspensos num volume final

de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM KEDTA, 5mM mu DTT, p-mercaptoetanol 15mM, 0,5% TRITON X-100 e 5mM PMSF. Adiciona-se 300 mg de lisozina e incuba-se a suspensão durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando TN um BEAD-íBEATER contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,1-0,15 mm. A lise foi feita durante 6 min à temperatura ambiente em intervalos de 1 min. 0 liquido foi separado das esferas e centrifu-gado durante 2,5 h a 20000xg. O sobrenadante foi removido e o seddimento foi ressuspenso em 100 ml de ureia 8M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT, p-mercapto- -62-

etanol 15mM, 5mMPMSP e lmM KEDTA. O sedimento foi so lubilizado usando um homogenizador Polytron e centrjL fugado a 20000xg durante 2 horas»

O sobrenadante (90 ml) foi diali sado contra 4 litros de ureia 8M, 20 mM AEPES, pH 6,5, lmM EDTA e B-mercaptoetanol 155mM e lmM KEDTA à temperatura ambiente, 0 dialisado foi aplicado numa coluna de 100 ml (2,5 cm x 20 cm) cheia com CM PAST ΦΜ FLOW SEPHAROSE equilibrado em ureia 8M, lOmM HEPES pH 6,5, B-mercapt©etanol e lmM KEDTA à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 200 ml de tampão de equilíbrio e a proteína eluida com um gradiente li -near de 1,0 litro de 0-0,4M Nall. A proteína de HIV (26 kd) eluiu a aproximadamente 0,2M NaCl conforme testado por electroforese em gel de SDS-poliacrilami-da.

Posterior purificação foi conse -guida reunindo as fracções contendo PBlgc e aplican -do-as numa coluna de filtração com gel S-300 no mesmo tampão da coluna anterior. EXEMPLO 14

Construção e expressão do plasmideo pPBlWMJ2 0 plasmideo pPBlWMJ2, que contem aproximadamente 560 pb de DNA codificando essencialmente o ge ne env de HIVWMJ2 e a partir do qual se sintetizou uma proteí na de fusão recombinante de aproximadamente 26 Kd contendo es ta fracção da proteína do invólucro gpl20, pode ser construi- -63-

do como se segue: 1. Síntese do fragmento de DNA na Tabela 7A. 2. Corte do plasmídeo pREV2,2 com Eco RV e BamHI e isolamento do fragmento grande, aproximadamente 4kd, a partir de um gel de agarox. 3. Ligação do fragmento preparado em 1 com o fragmento pRÈV2.2 num volume de 20 ul usando DNA-ligase de T4, transformação de células competentes da estirpe CAG 629 com a mistura de ligação e selecção dos transfor-mantes resistentes à ampicilina. 4. Selecção de tais transformantes, através dos padrões de restricção adequados, que possuam o fragmento de gpl20 clonado na orientação correcta para gerar uma proteína de fusão. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo recombinante é cultivada a 32SC em meio a 2% contendo 55ug/ml de ampicilina e o complemento to tal de proteínas celulares sujeito a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida, uma proteína de aproximadamente 26Kd pode ser visualizada por coloração com azul coomassie ou por análise de transferências Western usando como sonda soros seleccionados de indivíduos infectados com HIV. EXEMPLO 15

Purificação de proteína recombinante contendo sequências do invólucro de HIV PLASMÍDEO pPBl^j^ -64-

X. Crescimento das células: As células foram cultivadas num volume de 10 litros num fermentador Chemap em meio a 256. A temperatura de fermentação foi de 302C, o pH de 6,8 e o ar foi introduzido a 1 vvm. A selec-ção de plasmídeos foi conseguida por 20 pg/ml de cloranfenicol. A produção típica de células (peso molhado) foi de 30 g/1. 2. Lise celular: 50 g, peso molhado de células, de E.

Coli contendo a proteína de fusão recombinante do invólucro de HIV, foram ressuspensos num volume final de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM KEDTA, 5mM DTT jB-mercaptoetanol, 0,556 de TRITON™ X-100 e 5mM PMSP. Adicionou-se 300 mg de lisozima e a suspensão foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente.

Este meterial foi lisado usando TM um BEAD-BEATER contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,1-0,15 mm. A lise foi feita durante 6 min à temperatura ambiente em intervalos de 1 min. O líquido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5 h a 200Q0xg. 0 sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspenso em 100 ml de ureia 8M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT, p-mercaptoetanol 15mM e 5mM PMSP. Adicionou-se 300 mg de lisozina e a suspensão foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando TM um BEAD-BEATER contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,1-0,15 mm. A lise foi feita durante 6 min à temperatura ambiente em intervalos de 1 min. 0 líquido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5 h a 20000xg. O sobrenadante foi removido e o sedimento foi ressuspenso em 100 ml de ureia 8M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT, p-mercaptoetanol 15mM, 5mM PMSP e lmM KEDTA. O sedimento foi solubilizado

usando um homogenizador Polytron e centrifugado a 20000xg durante 2 h. 0 sobrenadante (90 ml) doi dialí-sado contra 4 litros de ureia 8Mf 20mM HEPES, pH 6,5, lmM EDTA e p-mercaptoetanol 15mM. A diálise foi feita durante 8 h ou mais com três mudas de tampão, Usou-se tubo de diálise Spectraphor com um PM de exclusão de 3,5 kd.

Cromatografia CM: O dialisado foi apliâado numa coluna de 100 ml (2,5 cm x 20 cm) cheia com CM FAST FLOW SEPHAROSE^ equilibrada em ureia 8M, 10mM HEPES pH 6,5, jB-mercaptoetanol 15mM e lmM Na EDTA à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 200 ml de tampão de equilíbrio e a proteína eluida com um gradiente linear de 1,0 litro de 0-0,4M NaCl. A proteína de HIV (26 kd) eluiu a aproximadamente 0,2M NaCl conforme testado por electroforese em gel de SDS-poliacri-lamida.

Conseguiu-se posterior purificação reunindo as fracções contendo PBl^^ e aplicando-se numa coluna de filtração de gel S-300 equilibrada ao mesmo tampão da coluna anterior. EXEMPLO 16

Inibição da fusão celular A fusão in vitro de células infec tadas com HIV com células T positivas para T4 foi medida na presença e ausência de soro imune. Este é um ensaio bem conhecido (Putney et al /19867 Science 234: 1392-1395). Células cronicamente infectada a células são infectadas (1:15) foram misturadas e incubadas durante 24 h. Contaram-se os focos de células fundidas (células gigantes) (geralmente cerca de 60). Quando as células foram misturadas adicionou-se uma diluição de um soro imune, por exemplo soro contra todo o invólucro de HIV (gp 160) ou contra uma proteína ou peptídeo do invento. Um decréscimo de 90% nas células gigantes após 24 h indica que o soro imune pode bloquear a fusão. Este ensaio pode ser feito com células infectadas com várias estirpes de vírus, por exemplo, HIV0 e HIVRF. EXEMPLO 17

Fusão de células com competição

Usando o ensaio descrito no Exemplo 16, pode-se determinar se as proteínas ou peptídeos contêm um epítopo reconhecido polos anticorpos que são responsáveis pela inibição da fusão celular. Por exemplo, a inibição da fusão de células infectadas com HlVjjjg pelo anti-soro contra a proteína PBl-IIIB do pedido anterior é descrito pela adição da proteína ΡΒ1-ΙΙΙβ a 50 pg/ml. Usando anti-soro contra ΡΒ1-ΙΙΙβ e adicionado qualquer uma das proteínas ou peptídeos, por exemplo, Sub 2, Sub 1, CNBR1, peptídeo 135 ou peptídeo 136 a 5 jug/ ml bloqueia totalmente a actividade do anti-soro contra PB1.

Em adição, o anti-soro contra PBl-RF que é capaz de neutralizar HIV-RF pode ser bloqueado nesta actividade pelo peptídeo 139. Um peptídeo contendo apenas a fracção central do peptídeo 139, e.g. peptídeo 339, pode também bloquear a actividade de inibição da fusão do anti-soro contra PBl-RF. Isto, pela primeira vez, localiza os aminoácidos críticos necessários para induzir neutralização, ou bloquear o anticorpo inibidor da fusão contra uma sequência de dez aminoácidos (e.g. peptídeo 339). EXEMPLO 18

Co-imunização de PBl-III^ e PB1RF O anti-soro de um animal imunizado com duas proteínas PB1 dos isolados HIVTTTT1 e foi ca- paz de bloquear a fusão celular de células infectadas com HIV Illb e HIVRF. Isto demonstra que a co-imunização com proteínas separadas contendo sequências do invólucro de dois isolados de HIV induz uma resposta imune capaz de neutralizar ambos os isolados. Esta nova propriedade das proteínas pequenas ou peptídeos bloqueadores de soro imune não foi anteriormente descrita.

Algumas das proteínas e peptídeos do presente invento contêm todo o epítopo para a indução de resposta imune humoral que neutraliza ã ihfecção por HIV e bloqueia a fusão de células infectadas por HIV. Isto é mostrado por estas proteínas e peptídeos que competem com estas ac-tividades do soro de animais imunizados com todo o envólucro de HIV. Mais especificamente, as proteínas e peptídeos que podem competir com as actividades de soros anti-gpl60 ou anti--PBl são Sub2, Sub 1, CNBrl, peptídeo 135 e peptídeo 136.

As proteínas e peptídeos do invento podem também ser usados para estimular uma resposta pro-filiferativa de linfócitos em humanos infectados com hiv. Isto estimularia então o sistema imune para responder ao HIV em tais individuos. EXEMPLO 19

Construção e expressão do plasmídeo pPBlIIID O plasmídeo pPBl que contem apro-ximadamente 540 pb de DNA codificado essencialmente o gene eno de HIV desde o sítio PouII até ao sítio BglII e a partir do qual foi sintetizado uma proteína de fusão de aproximadamente 26 kd contendo esta fracção da proteína do invólucro gpl20 pode ser constrido como se segue: 1. Síntese do DNA com a sequência mostrada na Tabela 8: Estes fragmentos de DNA pode ser sintetizado por métodos convencionais e codifica uma fracção de gp 120. Possui um extremo cerse no extremo 5' e um extremo que se ligará a uma extremidade BamHI no extremo 3'. -69

2. Corte de 5 jig do plasmídeo pREV2'„2 com EcoRI e BamHI e isolamento do fragmento grande, aproximadamente 4kd, de um gel de agarose. 3. Ligação de 0,1 pg do fragmento na tabela 8 com 0,l}ig do fragmento de pREV2.2 num volume de 20 jil usando DNA-ligase de T4, transformação de células competentes da estirpe SG20251 com a mistura de ligação e selecção dos transformantes resistentes à ampicilina. 4. Usando o padrão de restrição AhalII do plasmídeo purificado, selecção de células portadoras do plasmídeo recombinante com o fragmento sintetizado na orientação em que o extremo cerse do fragmento ligado ao extremo EcoRV de REV2.2 e os extremos pertuberantes BamHI se ligam uns aos outros. A digestão com AhalII do plasmídeo correcto dá fragmentos com comprimento de aproximadamente 1210, 1020, 750, 690, 500, 340 e 20 pares de bases. Quando a estirpe portadora deste plasmídeo recombinante é cultivado em meio a 2% contendo 50 pg/ ml de ampicilina e o complemento total de proteínas celulares é sujeito a electroforese num gel de SDS--poliacrilamida, pode-se observar uma proteína de aproximadamente 26 kd por coloração com azul Coomassie ou por análise de transferências Western usando como sonda, soros seleccionados de indivíduos infectados com AIDS, ARC ou HIV. -70-

EXEMPLO 20

Purificação de proteína recombinante contendo sequências do invólucro de HIV do plasmídeo ρΡΒΙ^^ 1. Crescimento das células: As células foram cultivadas num volume de 10 litros num fermentador Chemap em meio a 2%, A temperatura de fermentação foi de 372C, o pH foi de 6,8 e o ar foi introduzido a lvvm. A selecção do plasmídeo foi conseguida com 50 pg/ml de ampicilina e 20 jig/ml de cloranfenicol. A produção celular típica (peso molhado) foi de 30 g/1. 2. Lise celular; 50 g, peso molhado de células; E. coli contendo a proteína de fusão recombinante do envólucro de HIV, foram ressuspensos num volume final de 100 ml em 50mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM KEDTA, 5mM DTT, B-mercap- ΦΜ toetanol 15mM, 0,5% de TRITON x-100 e 5mM PMSP. Adicionaram-se 300 mg de lisozima e a suspensão foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente.

Este material foi lisado usando um BEAD-BEATER (BiospeC Products, Barthesville, DK) contendo um volume igual de esferas de vidro de 0,1--0,15 mm. A lise foi feita durante 6 min a temperatura ambiente em intervalos de 1 min. O líguido foi separado das esferas e centrifugado durante 2,5 h a 20Q00xg, O sobrenadante foi removido e o sedimento ressuspenso em 100 ml de guanidina-hidrocloreto 6M, 20mM Tris-HCl pH 8,0, 5mM DTT; p-mercaptoetanol 15mM, 5mM PMSP e ImM KEDTA. O sedimento foi solubilizado usando um ho-mogenizador "Polytron" e centrifugado a 20000xg durante 2 h. -71 0 sobrenadante (90 ml) foi diali-sado contra 4 litros de ureia 8M, 20mM Tris-HCl, pH 8,0, lmM EDTA e ρ-mercaptoetanol 15mM. A diálise foi feita durante 8 h ou mais com três mudas de tampão. Usou-se tubo de diálise Spectraphor (S/P; McGrow Park, I L) com um PM de exclusão de 3,5 kd. 3. Cromatografia CM: O dialisado foi aplicado numa coluna de 550 ml (5 cm x 28 cm) cheia com CM FAST FLOW SEPHAROSE equilibrada em ureia 8M, fosfato de potás sio lOmM pH 7,0, jB-mercaptoetanol 15mM e lmM KEDTA à temperatura ambiente. A coluna foi lavada com 2 litro de tampão de equilíbrio e a proteína eluida com um gradiente linear de 5,0 litros de 0-0,4 M NaCl. A pro teína de HIV (26 kd) eluiu a aproximadamente 0,2 M NaCl conforme testado por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. EXEMPLO 21

Imunização com dois ou mais peptideos para se obter anti-soros com uma larga gama de neutralização

Cinco peptideos, i.e.., peptideos 135, peptídeo 139, peptídeo 141, peptídeo 142 e peptídeo 143, foram individualmente ligados a proteínas veículo e usadas para imunizar cabras. Cada peptídeo é capaz de induzir neutraliza :ão específica de tipo quando usado in·-.ividualmente como imunogénio. Os peptideos sintéticos foram ligados através de uma ligação sulfidrilo a hemiziamina de lapa (kLH) usando suc-cinimidil-4-(n-maleimidometil)ciclo-hexano 1-carboxilato (Pier-

ce). A proporção de peptídeo para kLH foi de 1:2 por peso 200 jig de cada peptídeo ligado foi usado na mistura de imunização (um total de 1 mg de 5 peptídeos, 2 m de KLH). Este método de ligação ou de imunização é apenas um exemplo e não pretende ser limitativo. Após quatro imunizações, o soro imune foi testado quanto à neutralização destes cinco isolados de HIV assim com o de outros isolados diferentes. O soro imune bloqueou a fusão de células infectadas com qualquer um dos cinco isolados de onde derivaram as sequências peptídicas. Em adição, o soro neutralizou outras variantes não usadas na imunização

Soros neutralizados com activida-de igualmente larga podem ser obtidos por variações deste imu-nogénio. Por exemplo, usando mais do que cinco peptídeos tendo a sequência de aminoácidos derivada do principal domínio de neutralização de mais de cinco variantes. Como alternativa, pode também ser usado um único peptídeo (e.g. peptídeo 64 ou peptídeo 74) contendo segmentos homólogos de diversas variantes de HIV pode ser também usado para induzir um anticorpo neutralizante com uma larga gama de actividade. EXEMPLO 22

Imunização sequenciada com dois peptídeos como método de indução de soros neutralizantes com uma gama larga de actividade

Um prot colo de imunização capaz de induzir anticorpos neutralizantes com uma gama larga de actividade podem tomar a forma de imunização inicial com um peptídeo ou proteína antigénicamente equivalente ao principal do-

mínio de neutralização ou seus segmentos. A imunização inicial é seguida de uma segunda imunização. A imunização inicial pode ser feita por exemplo com o peptídeo 135, peptídeo 139, peptí-deo 141, peptídeo 142 ou peptídeo 143, com subsequente imunização por exemplo com um ou mais dos seguintes peptídeos: 0 método é imunizar com uma proteína ou"peptídeo e depois fazer o impulsionamento da resposta imune contra uma sub-série definida do imunogénio original. Este método de imunização pode ser útili na metodologia de vacinas e também na obtenção de anticorpos policlonais ou mono-clonais neutralizantes com uma larga gama de actividade com fins terapêuticos. EXEMPLO 23

Identificação de segmentos críticos do principal domínio de neutralização -74-

Certos segmentos do principal domínio de neutralização são capazes de induzir as respostas antigénicas e imunogénicas que estão associadas do principal domínio de neutralização como um todo. Por exemplo, uma região do principal domínio de neutralização conhecida como a "ponta da ansa" mostrou-se capaz de induzir e/ou ligar-se a anticorpos neutralizantes. Bstas capacidade é observada para o "pico da ansa" de uma variedade de variantes de HIV. A ponta da ansa compreende um segmento de três aminoácidos que é altamente conservado entre as variantes de HIV, juntamente com vários aminoácidos que ocorrem de ambos os lados dos três aminoácidos conservados. Os três aminoácidos conservados os quais são Gli, Pro, Gli, geralmente ocorrem aproximadamente nas posições 311, 312 e 313 da proteína do envólucro de HIV. A "ponta da ansa" compreende o segmento Gli Pro Gli juntamente com os 2 a 8 aminoácidos que delimitam um ou ambos os lados deste segmento em qualquer variante de HIV. Os aminoácidos que delimitam o segmento conservado podem ser quaisquer dos 20 aminoácidos naturais em qual -quer ordem. Se bem que a sequência de aminoácidos do principal domínio de neutralização varie entre diferentes isolados de HIV-1, a conservação em posições particulares, por exemplo na ponta da ansa, sugere que certos aminoácidos nestas posições são necessários às funções do vírus. EXEMPLO 24

Sequência do principal domínio de neutralização (PNDs) de iso-lados de HIV-1 seleccionados ao acaso -75-

Obtiveram-se sequências dos principais domínios de netralização (PNDs) de isolados de campo ao acaso de modo a determinar o grau de heterogeneidade dentro desta região da proteína do invólucro. Linfócitos do sangue periférico (PBLs) de dadores infectados com HIV-1 selecciona-dos ao acaso foram cocultivados com PBLs) de dadores infectados ou os vários isolados virais forani adoptados a linhas celulares CD4. Extraiu-se DNA destas células infectadas e uma região de 240 pares de bases codificadora do PND foi amplificado por reacção de cadeias com polimerase usando iniciadores oligonucleotídicos que hibridam com regiões conservadas usando iniciadores oligonucleotídicos que hibridam com regiões conservadas delimitantes. Este produto foi clonado em pUC19 e a sequência do PND de um ou mais clones de cada isolado original forma determinadas. Devido à heterogeneidade da população virai dentro de um indivíduo infectado quando duas ou mais sequências foram obtidas a partir de uma reacção PCR, estas sequências por vezes diferirem.

Os resultados obtidos a partir de aproximadamente 100 indivíduos (alguns infectados com uma população heterogénea de vírus) foram avaliadas juntamente com a informação da sequência de HIV anteriormente obtida. A Tabela 9 mostra 138 sequências PND de isolados de HIV. Estas sequências indicam que, apesar da conhecida e frequentemente citada variabilidade da sequência de aminoácidos da proteína do invólucro de HIV, existe de facto um elevado grau de conservação na região PND imunológicamente crítica, particularmente na região do centro do PND. Especificamente, a sequência GLI--Pro-Gli na "ponta da ansa" ocorre em cerca de 90% dos variantes. Ainda, outros aminoácidos em certas posições de cada um dos lados de G-P-G são também..altamente conservados. A tabela 10 mostra a frequência de ocorrência dos vários aminoácidos em cada posição no PND. Além da conservação muito forte das glicinas delimitadas da prolina central, existe forte conservação em várias outras posições (e.g., R em X^2» p em Xll' G em Y^, R em e A em Y^g).

Na Tabela 11 está apresentada uma comparação da frequência relativa de variações de um segmento de 17 aminoácidos centrados à volta da sequência G-P-G. Nesta tabela, a sequência que reflete os aminoácidos que ocorrem mais frequentemente em cada posição está apresentada em primeiro lugar. Os traços indicam identidade com a sequência con-sensus. As restantes sequências estão ordenadas de 2 a 138, de acordo com a sua homologia relativamente à sequência consensus Assim, as sequências no topo da tabela apresentam maior homologia com a sequência consensus. As sequências para o fundo da tabela apresentam menos homologia. Por exemplo, as sequências de aminoácidos dos isolados IIIg e LAV-BRU ocorrem nas posições 92 e 93, respectivamente, nesta tabela. Isto indica que estes isolados têm apenas homologia limitada com a sequência consensus. A presente investigação mostra que os vírus HIV tais como IIIB e LAV-BRU tendo o dipeptídeo Gln-Arg (Q-R) à esquerda da sequência Gli-Pro-Gli são relativamente invulgares. Ao contrário, a sequência tipo MN nesta região (*.. I Η I G P G ...) é a mais comum, A presente investigação mostra que os principais domínios de neutralização de outras variantes normalmente estudadas compreendem sequências relativamente invulgares .

Se bem que o presente invento inclua descoberta de certas regiões altamente conservadas no principal domínio de neutralização, existe algum grau de variabilidade nesta região entre os vários isolados. Esta variabilidade inclui amino-ácidos que "faltam" ou que "estão a mais em certos pontos na sequência. Certamente os aminoácidos que "faltam" ou que "estão a mais" podem causar dificuldade na elaboração das tabelas que mostram as sequências. No entanto, estes aminoácidos que "faltam" ou " estão a mais" colocam dificuldades em termos de localização de regiões alt mente conservadas que são críticas para o presente invento. A Tabela 9 mostra uma representação das 138 sequências PND. A Tabela 11 -77-

usa uma representação ligeiramente diferente para mostrar as mesmas sequências PND. A discussão da conservação da sequência pode provávelmente ser melhor visualizar por referência à representação mostrada na Tabela 11. No entanto, deve-se notar que a existência de mais do que um meio de representar estas sequências não comprometem a capacidade dos familiarizados com a matéria em localizarem as sequências ou as regiões conservadas .

Com a descoberta de sequências de aminoácidos que ocorrem com maior frequência, é possível, pela primeira vez desenvolver composições profiláticas ou terapêuticas que possam induzir e/ou ligar-se a anticorpos neu-tralizantes contra uma larga gama de variantes de HIV. A fórmula generalizada para tal composição pode ser como se segue: axGzGyb onde x é 0 a 13 aminoácidos de comprimento; y é 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e ZéP, A, S, QouL;e a ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; a ou b individualmente pode compreender qualquer um dos seguintes; císteinas, uma proteína ou outra fracção capaz de aumentar a imunogenici-dade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal, um peptídeo capaz de estimular células T ou um estimulante da resposta imune em geral.

Posterior análise dos padrões de sequências comuns revela certos padrões específicos que são muito comuns entre isolados de HIV. Na tabela 12 e Figura 1 estão apresentados exemplos destas sequências comuns. Estes padrões comuns, que são conhecidos apenas como resultado de

pesquisa e descobertas aqui descritas, podem ser usadas para fazer composições farmacêuticas e de diagnóstico que podem ser usados com uma larga gama de isolados do HIV. Isto, certamente pode ser de importância crítica, dado o largo número de variantes de HIV de que agora se conhece a existência. A Tabela 12 é uma compilação das padrões de sequências comuns que ocorrem na região do topo da ansa. Por exemplo, aproximadamente 60% dos isolados de HIV con têm a sequência central lalGPGR (a representa vários resíduos diferentes), aproximadamente 50% contêm a sequência IGPGRA e aproximadamente 40% contem GPGRÃF. Quando um resíduo His está presente na posição a em lalGPGR, esta sequência ocorre em aproximadamente 30% dos isolados de HIV. Uma composição de vacina compreendendo uma mistura de peptídeos tendo a sequência lalGPGR em que todos as possíveis substituições de a estão presentes, é capaz de induzir anticorpos que neutralizam uma grande parte de variantes de HIV. De preferência, para usar como imunogénios, os peptídeos são ligados a proteínas veículo ou adjuvantes como descrito no Exemplo 21.

Como se mostra na Figura 1, os padrões de sequências mais comuns são também aparentes dentro do segmento de 17 aminoácidos. As sequências que foram isoladas 4 ou mais vezes estão em evidência. Estas sequências que ocorrem mais frequentamente podem ser usados para formular vacinas que induzem uma resposta neutralizante alargada. Por exem pio, uma mistura potencial deverá conter peptídeos de cada um dos íoif© grupos representados. Como alternativas, as sequências peptídicas podem estar presentes como um põlipeptídeo híbrido contendo o principal domínio de neutralização de dois ou mais destes grupos. De preferência, tal mistura conterá peptídeos que serão capazes de induzir anticorpos que neutralizam pelo menos 70% e ainda mais preferido 90% das variantes de HIV.

Os antigénios do presente invento podem ser identificados pela sua capacidade para induzir anti- -79-

corpos que se ligam a certas sequências de aminoácidos. Por exemplo, compostos antigénicos particularmente vantajosos induzirão anticorpos que se ligam a sequências comuns de aminoácidos tais como G-P-G-R-A-F, I-G-P-G-R-Ã-F, I-G-P-G-R-A, I--a-I-G-P-G-R, I-a-I-G-P-G-R-A e I-a-XGP-G-R-A-F, onde a é qualquer um de 20 aminoácidos.

De Tabela 10 pode-se ver que um polipeptídeo representando a ocorrência de aminoácidos em todas as variantes pode ser representado como se segue: X13X12X: nx: 10X 9X8‘ XyX 6X5 x4x 3X2 xíg z Gy2y3y4y5y6y7y8y9yl'0ylly12 y13y14y15y16y17' em que χ1 é X, R, M, IQR, V, L, K, ?, ; s. G, Y, SRG, ou YQR; χ2 é H, R, Y, Τ, S, P, F, N, A, K, G, ou V; *3 é 1’ L, M, T, V, E, G, F, ou y; X4 é R, s, G, H, A, K, ou não presente; Xg é K, R, I, N, Q, A, IR a RQa 1 ou nao presente; x6 é R, K, s, Ia p, Q, E, G, ou t; x? é T, K, v, I, A, Ra p, ou E; xg é N, NV , Y , Kl, I, T, DK, ou ι K; x9 é N, s, K, E, Ya D, I ou Q; *10 é s , Y , s , D A G , ou H « 9 X11 é p * 9 X12 ® R , I , ou K • f *13 T| I, M ou A J z é P, A, Q, s, ou yx é R. K, Q, G, s, ou . T; y2 é A, v, N, R, K, T, s, F-a P, ou W; -80-

y3 é p, I, v, L, w, Y, G, s, ou T; y4 é y. V, H, L, F, s, I, T, M, R, VH, ou PT; y5 é t, A, v, Q, H. i, S, Y, ou não presente; y6 é T, R, I, Q, A, M, ou não presente; 1η é G, E, K, R, T, &, Q, A, Η, N, P, ou i não presente y8 é R, Q, E, K, D, N, A, G, S, I, ou não presente; y9 é I, v, R, N, G, ou não presente; *10 I, 1 Γ, ’ v, K, m, : R, E > s, E, Q, A, ou não presente; *11 é 6 , R , E . κ , H , ou não presente; *12 é D , N , I , R , τ , s , ou não presente; *13 é I , M , ME, L, ou não presente; *14 é R , G , κ , S , E , ou não presente; *15 é Q , K , OU R ♦ l *16 é A J e *17 é H , Y , R , ou Q «

Anticorpos monoclonais e/ou poli-clonais com larga actividade de neutralização podem ser gerados usando as sequências polipeptídicas que mais frequentemente ocorrem para usar em composições profilácticas ou terapêuticas, As sequências que mais frequentemente ocorrem aqui descritas podem ser usadas como os outros peptídeos descritos neste.pedido. Por exemplo, estes peptídeos podem ser modificados para proporcionarem estimulação de linfócitos T, estimulação imune em geral, para aumentar a imunogenicidade ou solubilidade ou para reduzir a toxicidade. Os peptídeos podem também ser modificados através da adição de resíduos de cisteína adicional (ais) ou por conjungação a uma proteína veículo adjuvante espaçador,e/ou ligante. Os peptídeos podem ser fundidos com outros epítopos de HIV para produzir um polipeptídeo de multi-epítopos que poderá ser útil com um número mesmo ainda maior -81-

de variantes de HIV, Também, os peptídeos podem ser circulari-zados por ligação entre os resíduos de císteina. Os resíduos de cisteína usados para fazer tais peptídeos circularizados poderão ser os resíduos císteina naturais nos extremos do principal domínio de neutralização, ou os resíduos cisteína podem ser adicionados aos extremos,terminais aos peptídeos.

Em adição as composiçSes de vacinas podem incluir peptídeos contendo epítopos de células T auxiliares ("helper") em combinação com fragmentos proteicos contendo o principal domínio de neutralização. Vários destes epítopos foram mapeados dentro do envólucro de HIV e encontrou--se que estas regiões estimulam a proliferação e libertação de linfoquinas pelos linfócitos. A colocação de ambos os epítopos numa vacina pode resultar na estimulação das respostas imunes humoral e celular. EXEMPLO 25

Construção e clonagem de genes de múltiplos epítopos

Pode-se construir genes sintéticos que codificam proteínas compreendendo os epítopos neutralizan-tes de mais de um isolado de HIV. 0 gene sintético aqui exemplificado compreende um arranjo em tandem de sequências de DNA codificadores de epítopos neutralizantes de isolados de HIV IIIB, RF, SC, MN e WMJl. Cada domínio codificador de epítopos dentro do gene foi projectado para codificar os 11 aminoácidos centradas na sequência comum Gli-Pro-Gli na ponta da ansa para cada um dos isolados. Assim, o gene de multiploe epítopos continha 5 regiões codificadores diferentes, cada uma das quais -82-

codifiçando um epítopo de neutralização de um isolado diferente. Para esta construção particular, o epítopo que foi escolhido para cada um dos S isolados consistiu na sequência Gli--Pro-Gli juntamente com os 4 aminoácidos de cada um dos laços da sequência Gli-Pro-Gli de cada um dos 5 isolados. Neste gene de múltiplos epítopos poderão ser incluidos domínios codificadores de outros epítopos de neutralização destes isolados. Também podem ser usados genes codificadores de epítopos de neutralização de outros isolados.

Construiram-se genes de tal modo que os domínios foram ligados por sequências de DNA codificadoras de resíduos de glicina. A composição ou comprimento da sequência de ligação pode variar mas de preferência é uma sequência que ela própria não é imunogénica. A sequência de DNA do gene sintético aqui descrito foi projectada de tal modo que tais sítios de restrição foram codificados em ambos os extremos do fragmento para facilitar a clonagem no vector ou, como alternativa, para permitir a construção de gene de múltiplos epítopos mais longos por ligação de 2 ou mais genes mais curtos (Figura 2). Em adição, um resíduo de metiomina foi codificado no extremo 5' do gene para facilitar a clivagem quando produzido como parte de uma proteína de fusão. A Figura 3, descreve os passos na construção do gene de múltiplos epítopos aqui descrito. A sequência de aminoácidos codificada por este gene está apresentada na Tabela 13. As fracções desta sequência de aminoácidos que correspondem a cada um dos 5 isolados estão identificados na Tabela 13.

Primeiro construiram-se subfrag-mentos de cadeia dupla de todo o gene começando com oligómeros sintéticos de cadeia simples destinados a codificar epítopos de neutralização em tendem e ligando as sequências de aminoácidos. Pode ser usado qualquer número de subfragmentos, Nesta experiência o gene foi dividido em duas fracções, mas podem ser -83- usados três, quatro ou mais fracções. Síntetizaram-se quatro oligómeros de cadeia simples entre 67 e 68 nucleotídeos de comprimento (HEO-1, HEO-2, HEO-3 e HEO-4) (Figura 3). Os oligómeros foram projectados aos pares (HEO-1 e 2; HEO-3 e 4) como cadeias opostas e adjacentes dos subfragmentos de cadeia dupla tendo 10 (HEO-1 + 2) ou (HEO-3 + 4) bases de sobreposição complementar. Os oligómeros de cada par foram misturados e aquecidos a 652C curante 5 minutos, depois incubados a 379C durante 1 hora para emparelhar.

Após emparelhamento, as cadeias complementares de cada par foram completadas ("preenchidas") usando Sequenase (U.S„ Biochem) e os quatro trifosfatos de de-soxinucleotídeos. Esta reacção foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente, aquecida a 652C durante 3 minutos e depois incubado durante mais uma hora a 37SC com Sequenase fresca. Os fragmentos de cadeia dupla de 141 (HEO-1+2) e 126 (HEO-3+4) pares de bases foram gerados representados subfra -gmentos adjacentes do gene de múltiplos epítopos. HEO-1+2 compreende as sequências codificadores de 3 epítopos mais aminoá-cidos adaptadores adjacentes; HEO-3+4 estende-se desde o quarto epítopo até ao fim do gene.

Após a reacção de preenchimento, as amostras foram extraídas com fenol/clorofórraio e precipitadas com etanol por processos convencionais. Os DNAs de cadeia dupla resultantes foram digeridos com HindIII (HEO-1+2) ou Saci(HEO-3+4) e purificado num gel de 3% de agarose NuSieve.

Os fragmentos purificados foram ligados com pUClO digerido com HindIII + Saci (New England Biolabs) numa ligação de 3 componentes e usados para transformar células E.coli. JM105, A pre sença de um fragmento de 256 pares de bases em pUC19 codifi -cando o gene de múltiplos epítopos completo, foi confirmado por análise de restrição e sequençiação de DNA, 0 plasmídeo resultante foi designado PUC/MEP-1. -84-

A inserção ΜΕΡ-1 foi removida de PUC/MEP-1 e reclonada em pREv2.1 digerido com HindIII + Saci para um elevado nível de expressão de uma proteína de fusão constituída por uma fracção condutora do gene BG de E.coli fundida com a proteína de múltiplos epítopos. 0 plasmídeo resultante, designado pMEP-1-8342, foi usado para transformar E.coli estirpe SG20251 e a proteína de fracção de múltiplos epítopos de l?,9kd foi identificada por coloração com azul coomassie ou análise de transferências Western usando uma sonda seleccionada de anti-soros contra peptideos da ponta da an-sa de cada um dos 5 isolados de HIV. A proteína de fusão pode ser usada intacta ou, como alternativa, a fracção condutora pode ser clivada com brometo de cianogénio que cliva no lado cabonilo de resíduos de metionina. A sequência de aminoácidos da proteína de fusão está apresentada na Tabela 13A. 0 peptídeo de múltiplos epítopos pode ser purificado a partir de células recombinantes por métodos descritos atrás.

Podem ser construídos outros genes sintéticos que codificam epítopos de neutralização em tandem de qualquer número de diferentes isolados de HIV usando o pro cesso descrito atrás. Em adição podem ser feitas variações ao processo descrito as quais estão incluídas no presente invento, Por exemplo, podem variar e pode haver variação no comprimento de epítopos individuais dentro de um único gene. Ainda, o número de epítopos de neutralização dentro de um gene de mújL tiplos epítopos pode variar e a composição ou o comprimento das sequências de aminoácidos dos apítopos ou as sequências de ligação podem variar relativamente ao exemplo que aqui foi descrito.

Deve-se entender que os exemplos e realização aqui descritos têm apenas fins ilustrativos na matéria e que várias modificações ou alterações poderão ser sugeridas pelos entendidos na matéria e devem ser incluídos no espirito deste pedido de patente e no âmbito das reivindica -ções apensas.

Este trabalho foi suportado em parte pelo contrato número NOl-AI-62558 concedida a Repligen Corporation pelo National Institute of Allergy and Infections Disease (NIAID). P) 295 474 516 759 χ m

= m OJ 1 4 s _ CO -J UJ > < Λ V C4 CM z o T 2 • > O» li. IO >- o “3 2 “0 2 co O Q O Q -1 < > s co 5 -J CO z N 5 5 N _J O ϋ ffi X |u CJ U o u u o u ϋ O o u u u u o a 1 1 >4 1 1 ' I X *! 1 1 1 1 i 1 ' 1 1 1 1 1 σ tf • 1 tf tf 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Bi • 1 1 1 1 i 1 1 1 1 s H H H H H H H H H H H H tf x O H Q H O α o 1 1 1 n tf o 1 1 1 1 1 1 I I 1 1 ' 1 tf H 1 1 > 1 H tf 1 1 ri ri 1 X M M H H H H H H M H M M H M H w tf tf α z O tf u tf M M M 0· tf M M M tf 8 tf tf tf M H (4 tf H 14 tf tf (3 O (3 g g H H tf o H «< ·< 1 1 << K 1 1 1 I 1 GO > >4 >4 tf tf tf >« >4 tf tf tf tf tf tf tf ffl tf H i ri 1 ri ri X * 1 ·< > > 1 α > f» > (ti σ tf α α tf U 1 tf 1 1 ri ri o tf tf H H H h H H H H H H H ri ri H CO c· H tf ffl α Μ >4 < tf ffl tf tf tf ti h tf X H 1 ri H H > > 1 ri tf «3 GO o o α O O tf 03 1 « X H tf GO σ tf 1 tf tf tf 1 O tf tf α σ tf 1 b 1 tf > H tf > 1 H ► * 1 X 1 1 1 1 2 Q H tf tf X X « O tf σ X tf o O >< tf o tf > tf h 1 < tf EI U o u u u u u u u U u u U u O °l

TABELA

O X ffl

U- Z E Z O ffl CM -Ϊs < E > <

CMu. CO

in >- Z

co N n -3s5 -j UI > Φ N -4 m 4T 04 ϋ ϋ -1 O O < O o m £

TABELA 2

LeuAsriGlnBerVslGluIleAsnCysThrArâProAsnAsnAsnThrArãLys

SerlleArÊlleGlnArâGlyproGlsArsAlaPheValThrlleGlyLysIIe

GlyAynMetArâGlnAlaHisCysAsnlleSerArSAlsLysTrpAsnAsnThr

TABELA 2A

CTGAACCAATCTGTAGAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAA

AGTATCCGTATGCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATA ggaaatatgagacaagcacattgtaacattagtagagcaaaatggaataacacttt

TABELA 2B

MetLeuArâProValGluThrProThrAráGluIleLysLysLeuAspGlyLeu TrpAlaPheSerLeuAspArsGluArâValAlaAspLeuAsnGlnSerVslGlu X1eAsnCysTh rA rsProAsnAsnAsnThrArãLysSe ri1eArsI1eGlnA râ GlyProGIyArSAIaPheVaiThrlleGlyLysXleGlyAsnMetAráGlnAla HisCysA.sr;IIeSerArâAlaLysTrpAsnAsriThrLeuGlyAlaAráIleLeu G1 u A s * GI u A r £ A ?. a S e r

TABELA 2C

A ! G , ·. AGGTC^ i G > AuAAACCCCAA^u.CG i GAAA i CAAAAAACTGGACGGCCTG TuGGGATTGAGTCTGGATuGCGAACGCGTGGCCBATCTGAAGCAATCTGTAGAA attaattgtacaagacccaacaacaatacaagaaaaagtatccgtatccagaga

GGACGABGGAGAGCATiTGTTACAATAGGAAAAATAGGAAATATBAGACAAGCA cattgtaacattagiagagcaaaatggaataacactttgggagctcgaattctt

6AA3ACGAAAGGGCCiCG

88-

TABELA 3

LeuAsnGlnSerVslGluIleAsnCysThrAráProAsnAsnAsnThrArãLys SerlleArSlleGlnArÊGlyProGlyArsAlsPheyalThrlleGlyLysIIe GlyAsnHetAráGlnAlaHisCysAsnlleSerArsAlaLysTrpAsriAsnThr LeuLysGlriIleAspSerLysLeuArSGluGlriPheGlyAsnAsnLysThrlle IlePheLysGlnSerSerGlyGlyAspProGluIleVslThrHisSerPheAsn CysGlyGlyGluPhePheTyrCysAsnSerThrGlnLeuPheAsnSe r

TABELA 3A

CTGAACCAATCTGTAGAAATTAATTGT ACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAA AGTATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTTACAATAGGAAAAATA GGAAATATGAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATAACACT TTAAAACAGATA6ATAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGAAATAATAAAACAATA ATCTTTAAGCAGTCCTCAGGAGGGGACCCAGAAATTGTAACGCACAGTT7TAAT TGTGGAGGGGAA7TTTTCTACTGTAA77CAACACAAC7GT77 AATAGT

TABELA 3B

MetLeuArâProValGluThrProThrArâGluIleLysLysLeuAspGlyLeu TrpAlôPhESerLeuAspArâGluAraVslAlsAspLeuAsnGlnSerValGlu IleAsriCysThrAraProAsnAsnAsnThrArâLysSerlleArálleGlnArS GlyProGlyArâAlsPheUalThrlleGlyLysIleGlyAsriMetAraGlnAla HisCysAsnlleSerAraAlaLysT rpAsnAsnThrLeuLysGlnl1eAspSer LysLeuArSGluGlnPheGlyAsriAsnLysThr I lellePheLysGlnSerSer GlyGlyAspProGluIleValThrHisSerPheAsnCysGlyGlyGluPhePhe TyrCysAsnSerThrGlnLeuPheAsnSerGlySerSerAsnSer

TABELA 3C

ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTGGACGGCCTG

TGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAACGCGTG6CCGATCTGAACCAATCTGTAGAA attaattgtacaagaeccaacaacaatacaagaaaaagtatccgtatccagaga ggaccabbbagagcatttgttacaataggaaaaataggaaatatgagacaagca

GATTGTAAGATTAC-T AG AGCAAAATGG AATAACACTTTAAAACAGATAGATAGC A A ATT AAGAGhACAhTTTBGAAAT AATAAAACAATAATCTTTAAGCAGTCCTCA GGAGG5GACCCAGAAATTGTAACGCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTC

TACTGTAATTCAACACAACTGTTTAATAGTGGGAGCTCGAATTCT

TABELA 4

LsuAsnMlsSerValGlnlleAsnCysThrArsFroAsnAsnAsnThrArsLys

GerlIeThrLysGlyProGlyArâUalIlETyrAlsThrGlyGinlleliaGly

AspIIeArsLysAiaHisCysAsnLsuSer-ArsAlaGInTrpAsriAsnThrLeu

LysulnValVsiThrLysLeuArÊGluGlnPheAspAsnLysThrlleVslPhe

ThrSerSerSsrGiyGlyAspProGluIlsUaiLsuHisSerPheAsnCysGly

GlyGluPhePheTyrCysAsnThrThrGlnLeijPheAsnSerThrTrpAsnSer

ThrGluGlySerAsnAsnThrGlyGlyAsnAsPThrlieThrLeuProCysArá

IleLysGlnlleUslAsnHetTrpGlriGluVslGlyLysAlsMetTyrAIsPro

PrcIleSerGlyGlnlleLysCasIleSerAsnlleThrBiyLeuLeuLeuThr

ArãAspGlyGlyGluAspThrThrAsnThrThr

TABELA 4A

CTGAATGCATCTGTACAAATTAATTGTACAAGACCCAACAACAATACAAGAAAA

GACTTACGTAGACATGTTTAATTAACATGTTCTGGGTTGTTGTTATGTTCTTTT

AGTATAACTAAGGGACCAGGGAGAGTAATTTATGGAAGnGGACAAATAATAGGA

TChTATTuATTCCC7GGTGCCTCTCAT7AhhTACu7TG7GCTG7TTATTATCCT

GA7A7AAGAAAAGCACA77G7AACC77AG7AuAGGAGAA7GGAA7 AACAC777A C7A7A77C7777CG7G7hACA77GGAA7CA7C7CG7G~7ACC77A7757GAAAT

AAAGAGG7AG77AGAAAA77AAGABAAGAA777GAGAA7AAAAGAA7AG7C77T 777G7GGA7GAA7G7777AA77C7C77G i > AAAC7G77A7T7TG77AiCAGAAA

;ACAG7i77AA77G7GGA ACG7CA7CC7CAGGAGGGGAGCCAGAAA-i57aC" 7Í3GAG7AGGAG7GC7CCCC7G5G7'

AA^A7oAAGiu7CAAAA í iAAuAwCT

GGGGAA77777C7AC7G7AA7ACAACACAAC7G777AA7AG7AG77GGAA7AG7 CCCC77AAAAAGA7GACA77 A7G77G7G~7 GACAAA77 A7CA7GAACC77 A7CA

AC7GAAGGGTCAAA7AACAC7GGAGGAAA7GACAGAA7GAGAC7CCCA7GCAGA 7GAC77CCCAG777AT7G7GACC7GC777ACTG7G77AG7G7GAGGG7ACG7C7

A7AAAACAAA77G7 AAACATG7GBCAGGAAG7AGGAAAAGCAATG7 A7GCCCCT 7 AT7T7G77T AACA777GTACACCGTCC7TCA7CC777TCG7TACAT ACGBGGA

CCCA7CAG7GGACAAATTAAATGTA7ATCAAA7 A77ACAGGGC7ACTATT AACA GGG7 AG7CACC7GTT7 AAT77 ACA7A7 AG77T A7AA7G7CCCGA7GA7 AA77GT

AGAGA7GGGGG7GAAGA7ACAAC7AA7AC7ACAGA

7C7C7ACCCCCACT7C7A7G7TGA77A7GA7G7C7G7AG -91-

TABELA-4B

MetLeuArâProyalGluThrProThrAráGluIleLtísLasLeuAspGlaLeu TrpAlaPheSerLeuAspArâGluArãValAlaAspLsuAsnAlaSerValGln IleAsnCasThrAráProAsnAsnAsnThrAráLasSerlleThrLasGlaPro GlaAráVslIleTyrAlsThrGlaGlnllelleGlaAspIleArSLasAlsHis CasAsnLeuSerArãAlBGlnTrpAsnAsnThrLeuLasGlnVslValThrLas LeuA rdGluGlnPheAspAsnLasThrl1eUslPheThrSerSerSerGlaGla AspProGluIleUslLeuHisSerPheAsnCysGlyGlaGluPhePheT arCas AsnThrThrGlnLeuPheAsnSerThrT rpAsrsSerThrGluGlySerAsnAsn ThrGlaGlaAsnA5pThrIleThrLeuProCysArÊll9LysGlnIleUalA.5n MetTrpGlriGluValGlyLasAlaMetTyrAlaProProIleSerGlyGlnlle LysCasIleSerA.snlleThrGlaLeuLeuLeuThrArÊAspGlaGiyGiuAsp ThrThrAsnThrThrGluIleArâArãGlnAlaSerAráGluLeuGluPheLeu LasThrLasGlaProArâAspThrProIlePhelleGla -92-

TABELA 4C

ATGTTACGTCCTGT AGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTGGACGGCCTB tgggcattcagtctggatcgcgaacgcgtggccgatctgaatgcatctgtacaa

ATTAATTGTACAA6ACCCAACAACAATACAAGAAAAAGTATAACTAAGGGACCA gggagagtaatttatgcaacaggacaaataataggagatataagaaaagcacat

TGTAACCTTAGTAGAGCACAATGGAATAACACTTTAAAACAGGT AGTTACAAAA TT AAGAGAACAATTTGACAATAAAACAAT agtctttacgtcatcctcaggaggg GACCCAGAAATTGTACTTCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTCT ACTGT AATACAACACAACTGTTTAATAGTACTTGGAATAGTACTGAAGGGTCAAATAAC ACTGGAGGAAATGACACAATCACACTCCCATGCAGAATAAAACAAATTGT AAAC ATGTGGCAGGAAGTAGGAAAABCAATGT ATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATT AAATGTATATCAAATATTACAGBGCTACTAT7AACAAGAGATGGGGGTGAAGAT ACAACTAATACT ACAGAGATCCGTCGACAAGCTTCCCGGGAGCTGGAATTCTTG

AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACTCCT ATTTT7 ATAGGT

TABELA 5

GluHsriF^neThrAspAsnAlsL^sThrllelieVsinisLeuAsnGiu SeryalGlnlleAsnCysThrAráP roAsnTyrftsnLysArsLtísArSHeHis -IeulyF‘roBlyAr2Al3F'heTbTThrThrLysAsnIIeIl5GltíThrIl9Ar3 GinAlsHisBysAsnlleSerA^SAlaLysTrpAsnAspThrLeuArsGlnlIs V e 1S e r L a s L e u L y 5 G1 ij G1 η P h ε L =· s A 3 n L a s T h r 11 e 'ν' B i P h e A s ri G1 η Ξ e r SerGlyultíAspProGluIleUsIfietHisSerPheA. 5nCy5GlyG2tíGl'jF'he PheTyrCysAsnThrSerF'roLe'.iF'heAsnSerThrCysLysIleLy5GinIle IleAsnMetTrpGlnGluUslGiyLysAlsHetTyrAlaF' TOproIleGluGly GinlleArsiCysoerSerAsnlieThrGlyLeuLeuLeuThrAráAspGiyGly LysAspThrAspThrAsriAspThr

TABELA 5A

GATCTGAAhATTTCACAGAChATGCTAAAACChTAATAGTACACCTGAATGAA ACTTTTAAAGTGTCiG7TACGA77TTBGTATTATCATGTGGACTTACTT 7C7G7ACAAA77AA77G7AGAAGACGGAAG7ACAA7AAAAGAAAmAGGA7ACA7

AGACA75777AA77AACA7G_7C73uG77GA7G77A7777C77T77CC7A7G7A A i AGGACCAGBGAGABCAi . i A7AGAAGAAAAAA7AiAA7AGGAACTAιAAGA 7A7CC7GG7CGC7C7C57AAAAiA7G77G777777A7h77A7CC77BA7A77G7 GAAGGACA77G7AACA . AG i AGAGCAAAA7GGAA7GACAC777AAGACAGA7A G77GG7G7AAGA77G7AFi_CA7C7CGii77ACG77AC757GAAA77C7G7C7A7

G77AGCAAA77AAAAGAAGAA777AAGAA7AAAACAA7AG7C777AA7GAA7CC GAA7GG177AA7777G77G ;AAA,iC,iA7777u77A7CAGAAA77Au77AGG

iGAGGAGGGGACCCAuAAA 7G7AAGGAGAG7777AA77G7GGAGGGGAA i 77 huTGC7GCCC7GGG7G~77 h AC A > > ACG7B7CAAAA77AACACC7CCCC77AAA

77C7AC7G7AA7ACA7CAGGAG7G777AA7AG7AC77GCAAAA7AAAACAAA77 AAGh7GACA77A7G7AG"'GG7GACAAh_7A7CA7GAACG7777 A7777G777 A A A7AAACA7GTGGCAGGAAG7AGGAAAAGGAA7G7A7GCCCC7CCCAT7GAAuGA 7 A777G7 ACACC67CC77CA7CC7777CG77ACA7 ACGGGGAGGGTAAC7TCC7

CAAATTAGA7GT7CATCAAA7A77ACAGGGCTAC7ATTAACAAGAGATGGTGGT

G777AA7C7ACAAG7AG777A7AATG7CCCGA7GA7AA77G77C7CTACCACCA

AAGGACACGGACACGAACGACACCGA 77CC7G7GCC7G7GC77GC7G7GGC7CTAG -94-

.·> TABELA 5Β

MetLeuArâProVslGluThrFroThrArâGluIleLysLysLeuAspGlyLeu TrpAl3PheSerLeuAspArâGluAráValAlaAsPlZ.eIieAspGlySçrGlu AsnPheThrAspAsnAlaLysThrllelleUelHisLeuAsnGluSerValGln IleAsnCysThrArdProAsnTyrAsnLysArsLysArs:! IsHisIleGlyPro GlyArâAlaPheTyrThrThrLysAsnllelleGlyThrlIeAráGlnAlaHis CysAsnlleSerArsAlaLysTrpAsnAspThrLeuArsGlnlleValSerLys LeuLysGluGlnPheLysAsnLysThrlleVaiPheAsnGlnSerSerGlyGly AspProGluIleValHetHisSerPheAanCysGlyGlyGluPhePheTyrCys AsriThrSerProLeuPheAsnSerThrCysLysIleLysElnll&IleAsnMet T rpGlriGluValGlyLysAlsfietTyrAlsProProIleGluGlyGlnlleAr^ CysSerSerAsnIleThrGlyLeuLeuLeuThrAráAspGlyGlyLysAapThr AspThrAsnAspThrGluIleArâAráGlnAlsSerAráGluLeuGluPheLeu LysThrLysGlyProAráAspThrProllePhelleGly 95-

TABELA 5C

ATGTT ACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGT6AAATCAAAAAACTGGACGGCCTG TGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAACGCGTGGCCGATATCATCGATGGATCTGAA AATTTCACAGACAATGCTAAAACCATAATAGTACACCTGAATGAATCTGTACAA ATTAATTGTACAAGACCCAACTACAATAAAAGAAAAAGGATACATATAGGACCA GGGAGAGCATTTT ATACAACAAAAAATAT AATAGGAACTAT AAGACAAGCACAT TGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATGACACTTTAAGACAGATAGTTAGCAAA TTAAAAGAACAATTTAAGAATAAAACAATAGTCTTTAATCAATCCTCAGGAGGG GACCCAGAAATTGTAATGCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTCTACTGT AATACATCACCACTGTTTAATAGT ACTTGCAAAATAAAACAAAT7ATAAACATG TGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGT ATGCCCCTCCCATTGAAGGACAAATTAGA TGTTCATCAAAT ATTACAGGGCT ACT ATTAACAAGAGATGGTG6T AAGGACACG GACACGAACGACACCGAGATCCGTCGACAAGCTTCCCGGGAGCTGGAATTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACTCCT ATTTTT ATAGGT TABELA 6

LsuLtísGluAlBysiGluIleHsnCysThrArâFroAsriHsriH.snThrThrHrs

SerlIeHisIleGlyPrcGlyArsAlõPheTsrAlaThrGLyAsPllellEGr-v

AsPlleArâGlriAlsHisCysAsnlleSerAraAisLysTrpAsriAsnTnrLsij

LysGinlleValIi eLysLeuArSAspGinPheGIuAsnLysThrILellePhe AsnArãSerSerGlyGiyAspProGluIleUalMetHisSerPheAsnCysGly GlyGluPhePheTyrCysAsnSerThrGlnLeuPheSerSerThrT rpAsnGly ThrGluGlySepAsriAsrnhrGlyGlyAsnAspThrlleThrLeijProCysArá IleLysGluIlelleAsnfietTrpGlnGluUalGlyLysAls.le^TyrAlaPro ProIleLysGlyulnValLysCysSerSerAsnlleThrGlyLsuLeuLeuThr AraAspGlyGlyAsnSe rLysAsnGlySerLysAsnlhr

TABELA 6A

CiGAAAGAAGCTGTAGAAAiTmATTGTACAAGGCCCAACAACAAiACAACAAGA GACTTTCTTCGACATCT7TAATTAACATGTTCCGGGTTGTTGTTATGTTGTTCT

AGTATACATATAGGACCAGGGAGAGCATT7TATGCAACAGGAGACATAATAGGA

TCATATGThTATCCTGGTCCCTCTCGTAAAATACGTTGTCCTCTGTATTATCCT

GATATAAGACAAGCACATTGTAACATTAGTAGAGCAAAATGGAATAACACTT7A C7AT ATTCTGTTCGTGTAACATTGT AATCA7CTCGTTTTAGC77 A7TGTGAAAT AAACAGA7AG77A7AAAA77AABAGACCAA777GAGAA7AAAACAA7AA7C777

777G7C7A7CAA7A7777AA77C7C7GG77AAAC7C77A7777G77A77AGAAA

AA7CGA7CC7CAGGAGGAGACCCAGAAA77G7AA7GCACAG7777AA77G7GGA 77AGC7AGBAG7CC7CC7C7GGG7CT77AACA77ACG7G7CAAAA77AACAGG7

GGGGAA77777CiAC7GiAA77CAACACAACiGι i7AG i AG.AG: iGoAAiu G 7 CGCC77AAAAAGA7GACA77AAG7767G77DACAAA7CA7GA7GAAGG77AGCA AG7GAAGGG7CAAA7AACAC7GGAGGAAA7GACACAA7CAGGG7GGGA7GGAGA 7GAC77CCCAG777 A77G7GACCTCC777 AC7G7GT7 AG7GGGAuGG7ACG7C7 A7AAAAGAAA77A7AAACA7G7GGCAGGAAG7AGGAAAAGGAA7G7A7GCCCC7

7A7777C777AA7A777G7ACACCGTCC77CATCC7TT7CG77ACA7AGGGGGA CCCA7CAAAGGACAAG77AAA7GTTCA7CAAA7A77ACAGGGC7BC7A7TAACA GGGT AGTTTCC7G77CAA777 ACAAG7 AG777 A7AATGTCCCGACGA7AA77G7

AGAGATGG7GG7AA7AGCAAGAA7GG7AGCAAGAA7ACAGA 7C7G7ACCACCA77 A7CG77C77 ACCA7CG77C77 A7G7C7C7AG -97- -97-

TABELA 6B ÍíetLeuArSProValGluThrP roThrArâGluIleLasLasLeuAspGlyLeu TrpAlaPheSerLeuAspArâGluArÊValAlsAspLeuLasGluAlaVslGlu IleAsnCysThrArâPraAsnAsnAsnThrThrArâSerlleHisIleGlaPro GlyArâAlsPheTarAl3ThrGlyAspIlsIleGlyAsPl.leAr2GlriAl3His CysAsnlleSerArâAlsLysTrpAsnAsnThrLeuLysGlnlleVslIleLys LeuArâAspGlnPheGluAsnLasThrllellePheAsnArsSerSerulyGly AspProGluIleVslHetHisSer-PheAsnCysGlyGlyGluPhsPheTyrCys AsnSerThrGlnLeuF'heSerSerThrTrpA5nGlyThrGluGly3erAsnAsn ThrGlyGlyAsnAspThrlleThrLeuProCysArâlleLysGluIlelleAsn MetTrpGlnGluUalGlyLysAlsHetTyrAlsProProIleLysGlyGlnUal LasCasSerSerAsnlleThrGlyLeuLeuLeuThrArâAspGlyGlyAsnSer LasAsnGlaSerLasAsnThrGluIlsArsArâGlnAlsSerArâGluLeuGlu PheLeuLysThrLysGlaP roArsAsp-ThrProIlePhelleGly -98-

TABELA '6C

ATGTTACGTCCTGT AGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAAC7GGAC3GCCTG TGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAACGCGTGGCCGATCTGAAAGAAGCTG7AGAA ATTAATTGT ACAAGGCCCAACAACAAT ACAACAAGAAGTAT ACATATAG3ACCA GGGAGAGCATTTTATGCAACA6GAGACATAATAGGAGATAT AAGACAAGCACAT TGT AACATTAGT AGAGCAAAATGGAATAACACTTT AAAACAGATAGTTATAAAA TT AAGAGACCAATTTGAGAATAAAACAATAATCTTTAATCGATCCTCAGGAGGA GACCCAGAAATTGTAATGCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTCTACTGT AATTCAACACAACTGTTTAGTAGTACTTGGAATGGTACTGAAGGGTCAAATAAC ACTGGAGGAAATGACACAATCACCCTCCCATGCA6AATAAAAGAAATTATAAAC ATGTGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGT ATGCCCCTCCCATCAAAGGACAAGTT AAATGTTCATCAAATATTACAGG6CTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGC AAGAATGGTAGCAAGAATACAGAGATCCGTCGACAAGCTTCCCGGGAGCTGGAA TTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACTCCT ATTTTT ATAGGT TABELA 7

LeuHsnGIuSerVBlGluIIeHsriCssTnrArâProTsrAsnHsnVB^ArâHrá SerLeuSerlieGlyproGlyA~sAlsPheArá7hrArãGluIleIleGIaIle ZleArsGlriAlsHisCiísAsnlleSerArsHlBLisTrpAsriHsrÍTnrLsuLiO

GinlleVslGlijLysLeuArâGluGInPheLysAsriLasThrGleVõiPheAsn

HisSerSerGltíGiaAsPProGluIleValThrHisSerPheAsnCasGlyGla

GluPhePheTarCasAsnSerThrGlnLeuPheAsnSerThrTrpAsnGlaThr

AspIleLasGlaAspAsnLasAsnSerThrLeuIleThrLeuProCasAvalle

LasGlriIlelleAsriMetTrpGiriGlaUalGlaLasAisMetTyrAlsPpoPro

IleGlriGlaGlnlleArSCasSerSerAsnllelhrGiaLsuLeuLeuThrArâ

AspGlaGlaAsnSerSerSerArMGlu

TABELA 7A ctgaatgaatctgtagaaattaattgtacaagagcctacaacaatgtaagaaga

GACTTACTTAGACATCTTT AAT7AACATGTTCTGGGATGTTGTT ACATTCT7CT agtctatctataggaccagggagagcatttcgtacaagagaaataataggaatt

7CAGA7AGA7A7CC7G37CCC7C7CG7AAAGCA7G77C7C777A77A7CC77AA

A7AAGACAAGCACA77G7AACA77AG7AGAGCAAAA7GGAA7AACAC777AAAA 7A77C7G77CG7G7AACA77G7AA7CA7C7CG7777AGC77A77G7GAAA7777

CAGA7AG77GAGAAA77AAGAGAACAA777AAGAA7AAAAGAA7AG7G7i7AA7 G7C7A7CAAC7C777AA77C7C77G77AAA77C77h7777G77A7CAGhAA77A

CA77GC7CAGGAGGGGACCCAGAAA77G7AAGGCACAG7777AAιiGiGGAGGG G7AAGGAG7CC7CCCC7GGG7C777AACA77GCG7G7GAAAA77AACAGC7GCC

GAA77777CiAC7G7AA77CAACACAAC7GT77AA7AG7AC77GGAA7GG7AC7 C77AAAAAGA7GACA77AAG77G7G77GACAAA77A7CA7GAACC77ACCA7GA

GACA77AAAGGAGA7AA7AAAAA7AGCACAC7CA7CACAC7CCCA7GGAGAA7A C7G7AA777CC7C7A77A77777A7CG7G7GAG7A57G75AuGG7ACG7C77A7

A A A C A A A 77 A 7 A A A C A 7 G 7 G G C A G G G A GiAGGCAAAGGAA7G7A7GGCCC7CCC T77G777AA7A777G7ACACCG7CCC7CAiCGG777GG77ACA7ACGGGGAGGG A7CCAAGGACAAA77AGA7G77CA7CAAA7A77ACAGGGC7GC7 A77 AACAAGA 7AGG77CC7GT77AA7CT ACAAG7AG777 A7AA7G7CGCGACGA7AATTG7TC7

GA7GG7GG7AA7AGCAGCAGCAGGGAAGA C7ACCACCA77 A7CG7CG7CG7CCC77C7C7 AG 100

TABELA 7B

MetLeuArâProV3lGluThrProThrArâGluIleLysLbsLeuAsp61aLeu TrpAlaPheSerLeuAspAráGluArsyalAlaAspLeuAsnGluSerValGlu IleAsnCysThrArâProTarAsnAsnVBlArãAráSerLeuSerlleGlyprc! GlyAráAlaPheAráThrArâGluIlelleGlyllelleArSGlnAlBHisCys AsnlleSerATâAlaLbsTrpAsnAsnThrLeuLysGlnlleUslGluLysLeu AráGluGlnPheLysAsnLysThrlleVslPheAsnHisSerSerGlyGlyAsp ProGluIleVslThrHisSerPheAsnCysGlyGlyGluPhePheTyrCysAsn Se rThrGlnLeuPheAsnSerThrTrpAsnGlyThrAspIleLysGlyAspAeh LasAsnSerThrLeuI 1 eThrLeuProCasArâlleLysGlnl lelleAsnMet T rpGlnGlyValGlyLysAlsMetTyrAlsProProIleGlnGlyGlnlleAra CasSe rSerAsnlleThrGlyLeuLeuLeuThrAraAspGlyGlyAsnSe rSer Se rAráGluGluIleArâAráGlnAlsSerAráGluLeuGluPheLeuLysTh r LysGluProArâAspThrProIlePhelleGly

TABELA 7C A7G77ACG7CC7G7AGAAACCCCAACCCG7GAAA7CAAAAAAC7GGACGGCC7G TGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAACGCGTGGCCGATCTGAATGAATCTG7AGAA A77AA77G7ACAAGACCC7ACAACAA7G7AAGAAGAAG7C7A7C7A7AGGACCA GGGAGAGCA777CG7ACAAGAGAAA7AA7AGGAAT7A7AAGACAAGCACA77G7 AACA77AG7AGAGCAAAA7GGAA7AACAC777AAAACAGA7AG77GAGAAA77A AGAGAACAA777AAGAA7AAAACAA7AG7C777AA7CA77CC7CAGGAGGGGAC CCAGAAA77G7AACGCACAG777TAA77G7GGAGGGGAA7777TC7AC757AA7 7CAACACAAC7G777AA7AG7AC77GGAA7GG7AC7GACA77AAAGGAGA7AA7 AAAAA7AGCACAC7CA7CACAC7CCCA7GCAGAA7AAAACAAA77A7AAACA7G 7GGCAGGGAG7AGGCAAAGCAA7G7A7GCCCC7CCCA7CCAAGGACAAA77AGA 7G77CA7CAAA7A77ACAGGGC7GC7A77 AACAAGAGA7GG7G67AA7AGCAGC AGCAGDGAAGAGA7CCG7CGACAAGC77CCCGGGAGC7GGAA77C77GAAGACG AAAGGGCC7CG7GA7AC7CC7A77777A7AGG7 TABELA 8

5' CTGAACCAATCTGTAG.AAATTAATTGTACAAGACCCAAC GACTTGGTTAGACATCTTTAATTAACATGTTCTGGGTTG

AACAATACAAGAAAAAGTATCCGTATCCAGAGAGGACCAGGGAGAGCATTTGTT

TTGTTATGTTCTTTTTCATAGGCATAGGTCTCTCCTGGTCCCTCTCGTAAACAA

AC AAT AG G AAAAATAGG AAAT AT GAGACAAG CACATT GTAACATTAGTAGAG CA TGTTATCCTTTTTATCCTTTATACTCTGTTCGTGTAACATTGTAATCATCTCGT

AAATGGAATAACACTTTAAAACAGATAGATAGCAAATTAAGAGAACAATTTGGA

TTTACCTTATTGTGAAATTTTGTCTATCTATCGTTTAATTCTCTTGTTAAACCT

AATAATAAAA CAATAAT CTTTAA GCAGTCCTCAGGAGGGGACCCA GAAAT T G TA TTATTATTTTGTTATTAGAAATTCGTCAGGAGTCCTCCCCTGGGTCTTTAACAT

A'CGCACAGTTTTAATTGTGGAGGGGAATTTTTCTACTGTAATTCAACACAACTG

TGCGTGTCAAAATTAACACCTCCCCTTAAAAAGATGACATTAAGTTGTGTTGAC

TTTAATAGTACTTGGTTTAATAGTACTTGGAGTACTAAAGGGTCAAATAACACT

AAATTATCATGAACCAAATTATCATGAACCTCATGATTTCCCAGTTTATTGTGA

GAAGGAAGTGACACAATCACCCTCCCATGCAGAATAAAACAAATTATAAACATG

CTTCCTTCACTGTGTTAGTGGGAGGGTACGTCTTATTTTGTTTAATATTTGTAC

TGGCAGGAAGTAGGAAAAGCAATGTATGCCCCTCCCATCAGTGGACAAATTAGA

ACCGTCCTTCATCCTTTTCGTTACATACGGGGAGGGTAGTCACCTGTTTAATCT

TGTTCATCAAATATTACAGGGCTGCTATTAACAAGAGATGGTGGTAATAGCAAC

ACAAGTAGTTTATAATGTCCCGACGATAATTGTTCTCTACCACCATTATCGTTG

AATGAGTCCGA

TTACTCAGGCTCTAG 3' 103

-A-A TABELA 9

r*· Τ' Λ ^ Ej£í X ” ' V 1 J- ''mr τ»t>ρτ mnrr viNr mv x x i\K η τ ττ t Axax /-•rn/ip λ τ* *? r \jr Γ νϊΛΛί 1 mm^nirTrin *r J. XU^'V* \JFv -L P P T P f* J\yrtyv- ΜΝ rmnnvr.rM τγπ V v- x Kr i* i i* t\i\K RIHI GPGRAFY mmv>TT τ p-m-r X X Kl* xxcix RQAHC ΕΕ1-708-1 rmnnmnt mp ri v iKrHltW x KK RIKI p #-· r» τ 'XJ Γ 1 mm/^/PTT-r-/—p-r A A S-3 ^ V aCI\X KW4-4-1 nmn "ιΜντντ mr> r> x ΐ'».Γ» RIHI λ nrrv τ, TV jryr*hf i mw/-/P*r“^/^PT r, rr τ 11 p :.KaK\- — Ττ Ί unj rmn m p mm mm t-i XJ\J\ τη ·*· »▼ ^ Λ ΧΠΧ ^ ·| 'jrr uanr x t mr·' ^ η ^ P T A X x altl/li RQAKC VMJ3 p m γ-. ’ΜΤΤ' » m ρ •--l\f J<U1 ΛΓ.Α τ. -r · τ — i\xn- m » fir V? Γ \jr ΑΛΓ 1 rr» γτγττγπ-1 \UÍY X XL7JX X pp·» τ τ r> K yAflu C > τ Εηυ *— m r·· nttir»i m»-> r* . iivrjuiw^ X Λ.Γν ^ — r*— > r—-r •í r ^γ.λΓ α mmr-- A íUCjXJA^Í.'! 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Díj-j — 3 CTRFNNN iKK GIRa 'jPGRa v i TARRIIGDI RQAHC AFL30-5-3 CTRFNNN TRK GIRI GPGRAIY ATARIIGDI RQAHC KV? 3-3-2 CIRFNNN TRK RIGI GFGRAIL QQ ENIGE-I RQAHC JG2 CTRPNNN TRK ΞΙΝΙ GFGRAFY ATGQIIGNI RQAHC EE3· 5-2 :mrfiíi:;: TRK C INI /— T-} > T 1.· w r OKAJJ 1 τ — λ " RQAHC AFL30-1-3 KTRFNNN TSR GIRI GFGRAIL ATERIIGDI RQAHC ArL30-3-1 CTRFNNN mm ;θΓ. G_j\_i jrGRftlu ATERIIGDI RQAHC -«‘Τ.Τ'Λ ^ O CTRFNNK TSR GIRI GFGRAIL ATERIIGDI RQAHC EE5-3-3 KTRFNNN TSR GIRI GFGRAIL ATERIIGDI RQAHC EE5-G-3 CTRFNNK m r· r> X GIRI GFGRAIL ATERIIGDI RQAKC EE5-10-3 CTRPNNN m r> X ΟΛ GIRI GFGRAIL ATERIIGDI K QAHC ΞΕ5-Ι1-3 CTRPNNN TSR GIRI GFGRAIL » m *“» r> ~ r* ^ n * ΕΚ* u RQAHC EE7-24-3 CTRPNNN TSR GIRI GFGRAIL ATERIIGDI RQAHC KW4-3-1 CTRPNNN TKR GIRI GPGRAVY ÃTDRIIGDI RQAHC KW4-2-2 CTRPNNN TKR GIRI GFGRAVM QQTRIIGDI RQAHC WH4 2 5 XXXXNNN TRR SISI GPGRALY TTGAIIGSI RQAXX WH718 XXXXXXX ΧΞΚ SISI GFGRAnY QQEEVIGDI XXXXX WH244 XXXXNNKIKIR RIKI GPGRPFY TTK IGDI RQAYC ΕΞ3-G ~ 2 CTRPNNN TRK GIHI GFGRTFY ATGAIIGDI RQAHC EE6-3-1 CTRPNNN TKK GIKI GFGRKWY TRTKIIC-DI RQAKC DDS-1 CTRPNNN TRR SIKI GFGRWSVKTTGEIVGDI RQAHC TM5-11-1 CTRPNNN TQK RITI GPGRVFY TTGKIVGDI RQAHC ΕΞ5-10-5 CTRPNNN TRK GIFI GPGRNIY TTGNIIGDI RKAHC ΕΞ5-11-1 CTRPNNN TRK GIFI GPGRNIY TTGNIIGDI RKAHC EE5-14-1 CTRPNNN TRK GIFI GPGRNIY TTGNIIGDI RKAHC KW2-6-1 CTRPNNN TRK GIFI GPGRNIY TTGNIIGDI RKAHC BD5-1 XXXXNNN TRA RLSI GPGRSFY ATRNIVGDI RQAHC TM 4-7-3 CIRFNNN TRK AM SI GPGRKLY TRNKIIGDI RQAHC NY5 CTRPNNN TKK GIAI r> mm -%r ur aK x jj x AREKIIGDI RQAHC AFL30-11-1 CTRFNEN TKK SLYI GFGRRFH VTKAITGDI RQAHC AFL30-12-1 CTRPNEN TKR 3LYI GPGRRFH VTKAITGDI RQAHC KW4-12-1 CTRPSNN TKQ SLYI GPGRRFH VTKAITGDI' RQAHC KW4-12-2 CTRPSNN TKR SLYI GFGRRFH VTKAITGDI RQAHC KW4-7-1 CTRPNNN TRK GIHM GFGRAFY TQENI GDI RQARC Zn 4-7-2 CTRPNNN TRK GIHM GFGRAFY TQENI GDI RQAHC KW3-6-1 CIRPNNI TRR SMSM GPGRAFV ATRQIIGDI RKAHC IIIB íbkio; CTRPNNN TRK SIRIQRGFGRAFV TIGK IGNM RQAHC LAV-BRU CTRPNNN TRK SIKIQRGPGRAFV TIGK IGNM RQAHC EE5-10-1 CTRPNNN TRK SIRIQRGFGRAFV TIGK IXNM RQAKC EE7-3-3 CTRPNNN TRK SIRIQRGFGRAFV TIGK IGNM RQAKC EE7-6-2 CTRPNNN TRK SIRIQRGFGRAFV TIGK IGNM RQAKC KW2-1-3 CTRFNNN TRK RIRIQRGPGRAFV TIGK IGNMEEQAHC EE3-6-1 CTRPNNN TRK RIRIQRGPGRAFV TIGK IGNM RQAHC EE7-15-2 CTRFNNN TRK RIRIQRGPGRAFV TIGK IRNM RQAHC EE5-3-I CTRFNNN TRK RIRIQRGPGRAFV TIGK IRNM RQAHC mi t a - a r, - v: ^ CTRPNNN TRK KIVSRGGPGRAFV TIGK IRNM RQAKC i: vv 3 - G - 2 CTRFNNN TRR GIRV GPGRAVY STDKIIGDI RQAKC Γ.Ε ’ ''TM3-8- 1 CTRPNNN TRK F.ITK GFGRVIY ATGQIIGDI RKAHC CTRPNNN TRK r Tmr Jiil\ GFGRVIY ATGQII5DI RKAHC — — n ^ “» CTRPNNH TEK RITE GFGRVLY TTGRIIGDI RRAKC CDC451 CTRFNNK TRK RVTL GPGRVWY TTGEILGNI RQAHC TM3-?-4 CTRFNNN TRK RVTM GPGRVnY TTGEIVGDI RQAKC EE1-70G-i λγππ r»»T»r»r U ΑΛ.Γ X* iSl* TRK RI TM v?r urK.V X X TTGQIIGNI RQAHC EE1- ' 0 G — <L CTRFNNN TRK RI TM GPGRVYY TAGQIIGNI RQAHC BF.VA CTRFNNN TRK RI TM GFGP.VYY TTGQIIGDI RRAKC

TABELA 9 (cont.) ) KW2-1-2 CTRFNNN TRK η τ mw ivx αΓΙ it\rv <jr v x X TT3QIIGNI RQAHC ΕΞ1-317- X C7RPNNM TRK GIHI GPGT FY TTGEIIGDI RQAKC SF170 CTRPHNN Hir·» rr x r*i\ ('rmr gpgqafy ATGEIIGDI r» /-» » *r«-· *\y/n 1 V-. iru"? _ A— "> p» % t» »-fc » TRK TfTr»»' 1\ .4. ·*%.·, GPGKNIY GPGKVFY T7ENIIGDI RKAKC 1-3 CTRFG3DK *» r· ^ ▼> ▼ y *3 *.J\x. AKGGITG QAKC ΞΕ3-8-I - * η n «.rvrvi . xk: nmt TRK 3I?M GPGKAFY ATGEIIGDI *» r\ \ μ r- í\yn,n^- KW4-8-1 -mn r> TRK SI PM ^FGKAir l «^rrTS/·^ r· ·** r" r· « 4 JL/XiNJUà nn» nr *v yAilU ~rr- * n -) I\ rr “* C _/ m τί ^ μ»·* · A Γ. f A'»!»!· T F. F. 7 ' T M GPuKnfi % *-» Í-S ^ ·1Λ Ι\^ηΠ ο TM4-14-1 — mi-, — » T-* T- » ^ a r*r :mi* í * -> n λΛ.Ι\. — — -l · f vJxI\ V t-\ /* í· * m* f vyΓ \JOn x l mu nr ^ » n*T * ΛΓ >2 X XAL.’ -l. SQAHC _ o — T .__Rr TEX ESYQRGPGGAFV «·*·^»/~rr "r»TV/ A χνΛ χ^ι*»ι*ϊ -ί r* ^ · » <* Λ^ΛΩ^ LAV-MAL CTRPGIíIí m r> r> X PwIN. GIHF o· r vj^v^z-vxj a TTGIVIGDI η *-» \ τ / r· λι\Α ι U EE1-317- 2 CTRPNKK IRK RITR r· \JIS. V J- X * —» ">· — í— ^ Ai.uyx^vJ^ ηττ'ΠΓ j\ fs-rxll v- ΞΕ1-707- X CTRPNNíí -r ·-> rr ΧΓ.Λ r*t *r m Λ.Χ X Λ. GPGKVIY > mp τ *r r* r> τ A x Gyiiai;i RKAHC 3F 33 — mi-» r*>TVT»T x i\.r Itm« η η n n "rmr Kx. X O GPGKVLY TTGEIIGDI RKAYC "£7-21-3 <— m τ·> *r>r»T rp T-ι r> RI KI GPRRAFY x x vj-Sc v luKx RQAQC TM4-14 - 2TRFNNY A KR /-*-*- t»« \ r ϋΐΛ V EFGKÀII ATKKIIEIíI KKAKY -ΚΓ7-6-1 — —— /— * rr ” ..ΛΓ V7l*r» m^l· *-< x ÍS.A\. * C "" RPERAFFTQ7GDVIGDI RQAHC "DD'1-1 — mr» τ·»>τ%τ*τ •w x Κ.Γ í«i*n TRK SIRI /·*<— ri * \PAVTIW1.- 1 * <ri » τ-* τ ^" >*· r- ~” Λ X Λΐ\ X X^JXJ X RQAHC AFL30-5- * X omn n»r»n> U * i\í 1V4VAV TRK SIRI GAGRAxi * mrn ττγ·''· Λ X X X V7 XX x. n r»i τ τ r rw^/Vll w —»«»··* *-\ 1 1 CiL· ! ~*«L~X mr* v» x Knvmi TRK SIRY GAGRAIY ATARIIGDI *tn» 'jr· ΙΝ,^ΛΓίν- *Τ*\β A Ί _ *"» inf^j λ CIRFIíNK mvri ΑΛΛ » r^rr ΛΧ X X /— /-m— r> » τ· rj rrrfnr-s rj ^ T f+ ^ X x iuKxx<JiJX RQAKC TM 4-13-3 CTRPNKN TKR > » ·. r τ· ΑΧ X X GQGRAIH mirmn τυτητ X X υΚίΛϋϋί RQAHC TM3-7-1 XIRFNNN TRK r· »^γ»τ ^x i v GSGRAVY TRDKIMGDI ηΛ» Π/" Pw ’^,/ΛΓΐ V- AFL30-9- T X CIRPWNN TRK GIYV n nnT· TT^r^r \jroirrUS. · x TRHKIIGDI RQAHC * -*·* n o λ; ±j .j U 3 — cirfnnk mr·, rr XIV IS. — — VX 1 * jt o GRRV*i nu * ^^ ^^ τ X XVy/ΛΧ x\JL/X RQAHC » > τ-—'T -r -ΙΛ v £i J_| X CARPYQN mr» r\ xis-V RTF I r· τ 4-. i-N <- r y sjruvj’^ J ix 1 friTT^TN rri r *· — X X KJaO x. x. /— r> » η r r i u 1 x — m—i r-i - j. J\.r Χ/Γ*Ι\.ΧΧΓν^ 3Tr I ΛΤ ("Λ1 f W vusyyAii x mm r? Trrn· X *Λ XXv^iX- ·· -* » /> Γν.ν,^Λ X V Z6 CTRPYKN TRQ oTr x GLGQALY γγ«ττ*τ> /" r» rrtrr τ A iI\ur.iÍS.xX r· t-\ % tj r ν,ϊ^λΠ'. 106 x TABELA 10

Hf

X >? r- οο

X C\

X

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107 ua TRKRIHICFCRJLTYTTC ΓΤΡ·;ι/το7λΐ, au&ABicase ;s ££1-181-1 •ioci: =fc xafttís : 12/3) «Μ I-----—------λ A .3/3». 2 πι*ιο·-ι .......... t 13/31 «*·«·: í «1/2· VII — 1------k— t MJ] **»----------« t o m-i-j —1— — ——— Z f2/21 c nu-*-: ---s------ Γ 13/31 z _--J—- —-—— Z a/l: Π1-Λ-1 ---4------------- : .:/!· 2 ííi-h-j ---j--- ... .. .... r i:. 3 Cf'?»·. ... —---— 7 2 / Ji CX6-4-1 S-—---——k— : .2/3· : .f, --1-------1-0 r i soi-t a .; / ' : 301-1 —5--- — —k-- a <:/» z cx:-jj0-: ---ς---...--- Z (3/31 í 9C -711-—-----k-- t ; »io-; l-U—---------Cf A .3/)· ; WHJIS i-u— — —rcr r Γ Wl-l-J ---— —j—» : .3/2 : 30«-: w-»-- — —|—x A <»/« 3 ATUO-*-! v-»-- — —«—x A li/Jl 0 on- v-ta-------*-x t ii/ll s on-*-: V-*..—--— t — R z t:/;· 0 B*-«-4 V-*------—»—X z ι;.·3. 3 ΠΙ-20-J V-h——---1—K Z ri/3: 0 »»v»a-vsp U14]( mu·----*— X **«-13-1 irui— — -—k— = lt/3· ATUO-4- 2 -C----l-A— A 14/61 W}-I*J 0 ----—V--- C 12/«·- TKJ-16-1 c · —V A 11/41» m-ι-: A—Ç — — —V-—- = li/ii* 1—6— — —V—— C (1/21 B6-1-J •x*c—· — —*~rr Z 12/31 »1-1-1 -l-C- - —V—ΑΛ A (3/l> mi-u-. -C--p_ - --- A (3/3· CI1-1-2 —J-·- — C (Í/3> Cf J-2-4 --J-»-------A-- : (3/3· *1331 X-f.p. - -A— C itirvcti EE1-311-1 --Ϊ-----A-ft C 13/3) U3-1-J — »-»·- — ........ C (1/21 «121 l-K- - -—Ai- C IMixaat) «4-3-2 —·»·*· — C (2/31 7214-11-1 — -T- —— —AXQ A «4/·» 73IS-13-1 —->---*W A <3/·1 _:c?^aAT SF« -----a__ t 1321 —- —ΓΑ-- F »1J7 V-MU- - -l-U t ---1- - -V-X C (3/3) _12223ÍE «4-ifr-l -X-C-l- - —V- C 13/3) m-i-i -X-fi-T- - —V·—I A (3/31 «P-1H -K-OI- — —v—tQ C 11/31 003-3 ·«*€-»· —- —V—A* A (3/71 ATUO-3-3 Ç-R- — -l-M A il/S) wj-»-: ——-C- — —11001 C 12/21 JCJ —-1-1---C-A— r Qi-i-l -l.M. — — e ti/2) juruo-i-3 -IK-I- - —ILA-L A (3/2) ATL30-3-1 •W->- - —ΠΑ-Ι A (1/1) W2-2-Í -IU-1- - -lu-t C |2/3» EXS-3-3 -ns-i- — —iu-i Z (1/31 EES-C-3 - — UA-Í C 11/2» BWM •3*0-*---IU-E C 11/3) m-n-3 -i*c-·---:u-f C 11/21 tn-24-3 -IK·»---ILA-C C (1/3) «4-1-1 -OC-I- — —V-A-D C (1/3) BM-1-2 -nc-i· — —vmoot Z (3/21 «1423 -U·!· — —L-- C f*lra«tl Mil· 13-1-3- - —*-<XE C l«ir»ctk _1223A M344 *:>-— — x C tttlrecr! ..... S3-4-3 - c —- -7—A— Z 11/3) B6-3-1 -R-C--- -X»—*7 C (1/31 »3-1 —AJ- -- -«JV1-T A (3/31 •^"5*5 -^-7- — -Vi .ii A (3/31 IEW0-S —c-r- — -IR- Z 11/3» ns-ii-i -C-I---hl-- Z (1/21 B4-14-: —C-r- — -x!— = (3/3l Bn-«-i —C-r- — -Ml— Z (1/2· Do»-; —A-L3- - -1—Α-Χ A 13/3· T1H-1-3 —-Aíli- - -XI— W A li/·) KTi -R-C-A----Γ.-ΑΜ F ATioo-u-: -«r.r- —- ·»-ιτν-κ A 13/3· AT-30-12-1 •wj:t- — -x-rv- A !2/i> »«-11-: -XC317- - -fc-JV-lt Z .1/3' BM-13-2 •asii· *— -t-iv-x ; 13/3» *"7·3 «4-1-Ϊ —c— — ——ot S (1/1' W«-i-í —----------£ Z (2/3· -9-3XTS — UM* -— -—VA- * z U/»1 U1--QI — ...V-;- F c* — —v-i- T B2-19-1 — —v-i- Z (1/3· BI· 3-3 xti-o» — —v-i- Z ll/Ji Dtl-k-2 xsr—ox — —v·:· : i:/j 10f3-S-3 x·:—c» — — w-i- : i;/2i EX3-»-. χ.).«ςι* — —v->- 7 (2/3· Π1-! 4-? WU—0* — —w-í- : ·ι/3· Π1-3-1 XX!—OR — V-:- z ι:/>· —5-13 » Γ «3-6-3 —«C-RV --- —V-l-3 : ií/2· _ w ——r* —· . v i - * - - A (6/6· V —í*:« — -v:-a— a Efl-ll·- Z (l/J· oco; ——-Y7L---—vv-——· r T4J-4-4 ·—«!----V»---- A J/J· rr:»’»*-: ----7· ... -vr---- : >:/ji £11-106- 7 ———TM---V7--A- Z l./JI MV* ··—·:· -ν'-— 2 *xi-)-2 -----7» — -</*-1X7 Z *l/2i —j*-? n:*i:i*i —-C— —- 7ΓΓ-5Ι 7 It ’3' -y·-'··· srn^· ---IC·----1--A- * ? »2-4-: - R-c-f» — i ; .:/2· 13 l-CI-l- -- XV—AX- * nj-·-; —1-f “---1—1- Z 12/JI «·-·-; --l-f» — 1--- C Ι1/Ϊ* »·-«-) —1-M — ···->- Z ll/J· 1*«·:«-: A-tC-IV - J-T--AÍ a *;/»· «2-2-1 xmstsx — e—v-i- S 11/31 UV-fUÍ —*c.—r — o-;--- f Etl -2J1-1 1-—-7X — KVt-A— C (2/1' Bl-101-2 1--—7*--KVJ-A-- C (1/3· irn »-»-TÍ--XV.---- f - ....... Axxc-av i— «·:;*·» tT’-*-; -tt·»- X-l---r-37 : u*j* x: : ---I-B— -A- —I-A-A a ·:/!· AFUrv-i-l A (1/1. Π1-21-. --S-XT -A- -I-A-A Z (1/31 τ*««-:ι-: -R*A-*· ·> — t*— A ««/%· 1K4M1-I -ΜΛ-7- -9- —I»— a ·;/*« --S-TV —V— u A 13/11 AT IV» 0-4-1 --C-»V -I- -XV--13 A |4/1· tfUí-t-l —<·» -i- -rv--xo A 11/·· ’-*ντι: —O-TR- -L- OtL---X * Jt; —ortp- -L- o-*.—7 F t* “OST*- -L- »-L— » -108- -108-

TABELA 12

PADRÕES DE SEQUÊNCIA COMUNS

IalGPGR 60 IalGPGR A 50 IalGPGRAF 32 IGPGRA 52 GPGRAF 40 IGPGRAF 35 IGPGRAaY 31 -109-

ΙΙΙΒ

MetThrArgIIeGInArgGIyProGIyArgAlaPheVal GlyGIyGlyGly -

RF

SerlleThrArgGlyProGlyArgValIleTyr GlyGIyGlyGly -

MN

ArglleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyr GlyGIyGlyGly -

SC

SerlleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyr GlyGIyGlyGly - WMJ1

HisIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyr GlyGIyGlyGly -

LeuSerIleCys -110-

TABELA 13A E.coli BG

MetLeuArgProValGluThrProThrArgGluIleLysLysLeuAspGlyLeuTrp -AlaPheSerLeuAspArgGluArgValValArgTyrHisArgTrpIleArgGlnAlaSer -

IIIB

MetThrArgIIeGInArgGlyProGlyArgAlaPheVal GlyGlyGlyGly -

RF

SerlleThrArgGlyProGlyArgValIleTyr GlyGlyGlyõly -

MN

ArgIIeHisIleGIyProGIyArgAIaPheTyr GlyGlyGlyGly -

SC

SerlleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyr GlyGlyGlyGly - WMJ1

HisIleHisIIeGlyProGIyArgAlaPheTyr GlyGlyGlyGly -LeuSerIleCys

Claims (17)

1. -111-

   REIVINDICAÇOES: lâ. - Processo para a produção de um composto possuindo a capacidade de se suscitar e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, caracterizado por se incorporar no referido composto uma sequência de aminoácidos que: a) é o domínio de neutralização principal de uma variante de HIV; b) é uma porção do domínio de neutralização principal de uma variante de HIV; ou c) é equivalente a um domínio de neutralização principal ou a uma sua porção.
2. 23. - Processo para a produção de um composto que não a proteína do invólucro do HIV que existe naturalmente, possuindo o referido composto a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, caracterizado por se incluir no referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV.
3. 33. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se modificar o.referido composto mediante a adição de uma ou mais das seguintes frac-ções; cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral.
4. 43. - Processo para a produção de um composto possuindo a capacidade de induzir e/ou de se li- -112- gar com anticorpos neutralizantes, caracterizado por se incorporar no referido composto essencialmente os aminoácidos compreendidos entre os resíduo de cisteína que ocorrem nas, ou à volta das, posições 296 a 331 da proteína do invólucro duma variante de HIV. 5â. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se produzir um composto possuindo a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes de HIV, tendo o referido composto a fórmula axGzGyb na qual jç tem um comprimento de 0 a 13 aminoácidos; £ tem um comprimento de 0 a 17 aminoácidos; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a ou b, individualmente, podem compreender qualquer um dos seguintes: cisteína uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio neutralizante principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 6â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido composto estar circularizado, -113-

   7â. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o referido composto compreender epítopos do domínio neutralizante principal de mais de uma variante de HIV. 8â. - Processo de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se produzir poli-peptídeo seleccionado do grupo constituído por (1) proteína de fusão de 10 Kd de HIV denominada Sub 1; (2) porção de proteína de HIV de Sub 1; (3) porção de proteína de HIV 18 Kd denominada Sub 2; (4) porção de proteína de HIV de Sub 2; (5) porção de proteína de HIV 27 Kd denominada PBlRp; (6) porção de proteína de HIV de PBl__· (7) porção de proteína de HIV 28 Kd denominada PB1MN; (8) porção de proteína de HIV de PBl^; (9) porção de proteína de HIV 26 Kd denominada PBlgc; (10) porção de proteína de HIV de PBlgc; (11) porção de proteína de HIV 26 Kd denominada (12) porção de proteína de HIV de PB1WMj2' (13) peptídeo IIIgíBHIO)-PND; (14) peptídeo RF-PND; (15) peptídeo MN-PND; (16) peptídeo SC-PND; (17) peptídeo WMJ-2-PND; (18) peptídeo LAV-MAL-PND; (19) peptídeo SF-2-PND; (20) peptídeo NY5-PND; -114- (21) peptídeo Z3-PND; (22) peptídeo WMJ1-PND; (23) peptídeo WMJ3-PND; (24) peptídeo Z6-PND; (25) peptídeo LAVELI-PND; (26) peptídeo CDC451-PND; (27) peptídeo CDC42-PND; (28) peptídeo BAL-PND; (29) peptídeo HXV-2-PND; (30) peptídeo 135; (31) peptídeo 136; (32) peptídeo 139; (33) peptídeo 141; (34) peptídeo 142; (35) peptídeo 143; (36) peptídeo 131; (37) peptídeo 132; (38) peptídeo 134; (39) peptídeo 339; (40) RP342 (WMJ2); (41) RP343 (SC); (42) RP60 (IIIn); 15 (43) RP335 (III_); 15 (44) RP337 (III )* 15 (45) RP77 (mB); (46) RP83 (WMJl); (47) RP79 (Illg); (48) RP57;

   -115- -115- ι (49) (50) (51) (52) (53) (54) (55) (56) (57) (58) (59) (60) (61) (62) (63) (64) (65) (66) (67) (68) (69) (70) (71) (72) (73) (74) (75) (76) RP55; RP75; RP56* RP59; RP73 (IIIb,RF); RP74 (III RP, MN, SC); RP80 (iiib,rf); RP81 (IIIB,RF,WMJ1,MN); RP82 (WMJl,MN); RP137(Illg,RF); RP140 (Illg,RF); peptídeo 64(HIV-IIIB/HIV-RF/HIV-MN/HIV-SC); peptídeo 338 (HIV-IIIg/HIV-RF); peptídeo 138; RP342; RP96; RP97; RP98; RP99; RP100; RP102; RP88; RP91; RP104; RP106; RP108; RP70; RP84; -116-

   (77) RP144; (78) RP145; (79) RP146; (80) RP147; (81) RP150; (82) RP151; (83) RP63; (84) RP41; (85) RP61; (86) RP75» (87) RPlll; (88) RP113; (89) RP114; (90) RP116; (91) RP120; (92) RP121c; (93) RP122c; (94) RP123c; e suas modificações químicas. 9ã, - Processo para a produção de sequência de DNA que codifica vim polipeptídeo que não a proteína do invólucro de HIV que ocorre naturalmente, possuindo o referido polipeptídeo a capacidade de suscitar e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, caracterizado por o referido polipeptídeo incluir o domínio neutralizante principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV 10â. - Processo para a produção de sequências de DNA de acordo com a reivindicação 9, caracte-rizado por o referido polipeptídeo ter a fórmula axGzGyb na qual x tem um comprimento de 0 a 13 aminoácidos; £ tem um comprimento de 0 a 17 aminoácidos; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b, individualmente, podem compreender qualquer um dos seguintes: cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. llâ. - Processo para a produção de uma composição capaz de suscitar e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes para uma ampla gama de variantes de HIV, caracterizado por se incluir na referida composição compreender um ou mais compostos possuindo a fórmula seguinte: axGzGyb na qual x tem um comprimento de 0 a 13 aminoácidos; £ tem um comprimento de 0 a 17 aminoácidos; e -118-

   zéP, A, S, Q ou L; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b, individualmente, podem compreender qualquer um dos seguintes; cisteina, uma proteína ou outra fracçao capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 12â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se seleccionar x des -119-

   x(0) = x nao está presente x(l) = Χχ x(2) = x2 Χχ x(3) s x3 x2 xx x(4) a X4 X3 X2 Χχ x(5) = x5 X4 X3 X2 Χχ x(6) s x* x5 X4 χ3 x2 Χχ x(7) = x7 X<5 x5 X4 X3 X2 Χχ x(8) S Xg X, Xg x5 X4 X3 X2 Χχ x(9) = X9 Xg X7 Xg X5 X4 X3 X2 Χχ x(10) = Χχο X9 Xg X7 Xé X5 X4 X3 x2 X1 x(ll) = XU xl0 19X8X7X6X5X4 x3 x2 X1 x(12) a Χχ2 Χχχ Χχο X9 Xg X7 X* *5 *4 x3 x2 X1 χ(13) Ξ Χχ3 X12 Χχχ Χχο Xo χ8 χ7 *6 χ5 ^ χ3 χ2 Χ1 ζ é Ρ, L, A, S, ou Q; e y é seleccionado de: y(0) = y não está presente y(i) Ξ yi y(2) = yx yi y(3) = yx y2 y3 y(4) = yi y2 y3 y4 y(5) s yi y2 y3 y4 y5 y(6) s yi y2 y3 y4 ys ye y(7) = yx yi y3 y4 ys ye yn y(8) = yi y2 ys y4 y5 y6 y7 ye y(9) * yx y2 y3 y4 ys y6 yi ys y9 y(io) * yi yi yz y4 y5 y* y7 ys y® y(ii) s yi yi yz y* ys ye yi ys y? y(12) s yi y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y(13) s yx y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 yo y(i4) a yx y2 y3 y4 ys ye yi ys yç y(i5) 2 yx y2 y3 y4 ys ye yi ys y9 y(i6) — yx y2 y3 y4 ys y6 yi ys y9 y(i7) = yx y2 y3 y4 ys y6 yi ys y9 yio yio yn yio yn yn yio yn yn y\z yio yn y« yis yn yio yn yn yi3 yu yxs yio yn y« yu y« yis yie yio yn yn yi3 yi4 yn yie yn -120-

   e na qual XI é I, R, M, IQR, V, L, K, F, S, G, Y, SRG.ouYQR; x2 é H, R, Y, T, S, P. F, N, A, K, G, cu V; x3 é I» L, Μ, T, V, E, G, F, ouY; X4 é R. S, G, Η, A, K, ou não está presente X5 é K, R I, N, Q, A, IR, RQ, ou não está presente X6 é R, K, S, I, P, Q, E, G, ouT; x7 é T, K. V, I, A, R, P, ouE; x8 é N, NV, Y, ΚΙ, I, T, DK, H, oufc X9 é N, S, K, E, Y, D, I,ou Q; x10 é N, Y, S, D, G,ou H; XII é P; X12 é R, 1. ou K; X13 é T, I, Mou A; yi é R, K, Q, G, S,ou T; y2é A, v, N, R, K, T, S, F, P,ou W; y3 é F, I, V, L, W, Y, G, S, ouT; y4 é Y, V, H, L, F, S, I, T, M, R, VH, ouFT; ys é T, A, V, Q, Η, I, S, Y, ou não está presente y6 é T, R, I, Q, A, M, ou não está presente y7 é G, E, K, R, T, D, Q, A, Η, N, P, ou não está presente Yb ® R. O, E, K, D, N, A, G, S, I, ou não está presente y9 é I, V, R, N, G, ou não está presente yioé I, T, V, K, M, R, L, S, E, Q. A, ou não está presente yn é G, R, E, K, H, ou não está presente y12 é D, N, I, R, T, Spu não está presente yJ3 é I, M, ME, L, ou não está presente yH é R, G, K, S, E, ou não está presente yis é Q, K, ouR; yi6 é A; e Λ7 é H, Y, R,ou Q.

   13â. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por X^ ser I; Z ser P; Y^ ser R; e Y2 ser A. 14â. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por ser I; X2 ser X; Z ser P; e ser R. 15a. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por z ser P Y1 ser R; Y2 ser a; Y3 ser F. 16â. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por X^ ser I; X2 ser H; Xj ser I;

   X4 ser R; X5 ser K; X6 ser r; X7 ser Tí Z ser e; Y1 ser R; Y2 ser A; Y3 ser P; Y4 ser y; Y5 ser T; Y6 ser T; Y7 ser G. 17â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se circularizar o referido composto. 18ã. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a e/ou b compreenderem um peptídeo de um domínio de neutralização principal do HIV. 19â. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a referida fracção capaz de intensificar a imunogenicida ser uma partícula virai, um microorganismo ou uma porção imunogénica deste. 20i. - Processo para a produção de composição profilática ou terapêutica caracterizado por se incluir na referida composição imunoglobulina, anticorpos mo- -123 noclonais e/ou anticorpos policlonais, gerados mediante a imunização de um animal adequadoJtal como um murganho, rato, cavalo, cabra, ser humano ou chimpanzé com um composto híbrido que compreende compostos em que os referidas polipeptídeos não são proteínas naturais do invólucro de HIV, possuindo os referidos polipeptídeos a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo os referidos polipeptídeos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 21â. - Processo para a produção de uma composição profiláctica ou terapêutica caracterizado por se incluir na referida composição anticorpos gerados por imunização de um animal ou ser humano com pelo menos um composto compreendendo um domínio de neutralização principal de uma variante de HIV e por, seguidamente, imunização do referido animal ou ser humano com (a) uma mistura compreendendo compostos, em que os referidos compostos não são proteínas naturais do invólucro de HIV possuindo os referidos compostos a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo os referidos compostos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV; ou (b) um composto híbrido compreendendo polipeptídeos, em que os referidos polipeptídeos não são proteínas do invólucro de HIV ocorrendo naturalmente, possuindo os referidos polipeptídeos a capacidade de induzir e/ou .de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo os referidos polipeptídeos o domínio de neutralizante principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 22â. - Processo para a produção de uma composição profiláctica ou terapêutica caracterizado por esta compreender um anticorpo obtido contra uma mistura compreendendo compostos, em que os referidos compostos não são proteínas do invólucro de HIV, mas possuem a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos, compreendendo cada um dos referidos compostos o domínio neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 23â. - Processo para a produção de uma composição profiláctica ou terapêutica, caracterizado por se induzir na referida composição um anticorpo obtido contra pelo menos um composto possuindo a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes de HIV, tendo o referido composto a fórmula axGxGyb na qual x tem um comprimento de 0 a 13 aminoácidos; £ tem um comprimento de 0 a 17 aminoácidos; e ZéP, A, S, Q ou L; e ou a, ou b mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b, individualmente, podem compreender qualquer um dos seguintes; cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a munogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 24â. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a e/ou b compreenderem um peptídeo de um domínio neutralizante principal de HIV 25â. - Anticorpo, caracterizado por ser obtido contra um composto, tendo esse composto ter a fórmula axGzGyb na qual x tem um comprimento de 0 a 13 aminoácidos; £ tem um comprimento de 0 a 17 aminoácidos; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos·, ou a, ou b, individualmente, podem compreender qualquer um dos seguintes: cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 26s. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por x ser seleccionado a partir de: -126

   x(0) ξ-χ não está presente x(l) = Xl x(2) = x2 xi x(3) s x3 x2 Xi x(4) B X4 x3 x2 Xi χ(5) = X5 X4 X3 X2 Xl χ(6) B X6 X5 X4 X3 x2 Xl x(7) = 17X6X5X4X5 x2 Xl x(8) =18X7X6X5X4 X3 X2 Xl x(9) =19X8X7X6X5X4X3 X2 Xl x(lO) = Xjo X9 *8 x7 Xó x5 X4 X3 x2 xi x(ll) = xu X10 X9 x8 X7 X6 X5 X4 X3 x2 X1 x(12) s x12 XU x10 X9 X8 χ7 X6 X5 X4 *3 X2 Xl *(13) = Xi3 *12 Xu *10 X9 *8 *7 *6 *5 X4 X3 x2 *1 2 is P, L, A, S, ou Q; e y é seleccionado de: y(0) = y não está presente y(!) Ξ yi y(2) = yi y2 y(3) ® yi y2 ys y(4) » yi Ίτ y3 y4 y(5) s yx y2 y3 y4 y5 y(6) Ξ yi yi yz y* ys y6 y(7) b yx y2 y3 y4 y5 y6 y7 y(8) = yi yz ys y4 ys y6 yi y& y(9) B yi y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y(io) = yi yz yz y4 ys y* yz ys y» yw y(ii) = yi yz y3 y4 ys yó yz ys yç yw yn y(12) B yx y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 yio yn yn y(i3) = yi y2 yz Y4 ys ys yz ye y9 yio yn yn y« y(i4) b yi y2 y3 y4 ys yó yz ye y9 yio yn yn yn yw y(i5) = yi y2 y3 y4 ys yó yz ye y? yio yn yn yn yi4 yis y(i6) = yi yz yz y4 ys yó yz ys y» yw yn yn yn yu yis yw y(i7) = yi yz yz y4 ys yó yz y& y« yw yn yn yn yw yn yw yn 127-

   e em que *i é I, R, M, IQR, V, L, K, F, S, G, Y, SRG.ou YQR; x2 é H, R, Y, T, S, P, F, N, A, K, G.OU V; x3 é I, L, Μ, T, V, E, G, F, ouY; X4 é R, S, G, Η, A, K, ou não está presente x5 é K, R, I, N, Q, A, IR, RQ, ou não está presente x*é R, K, S, I, P, Q, E, G, ouT; X7 é T, K, V, I, A, R, P, ouE; x8é N, NV, Y, ΚΙ, I, T, DK, H, ouK; x*é N, S, K, E, Y, D, I, ouQ; x10é N, Y, S, D, G,ou H; xu éP; *12 éR, I, ouK; x13 éT, I, M ou A; yi é R, K, Q, G, S, ouT; y2 e A, V, N, R, K, T, S, F, P,ou W; y3 é F, I, V, L, W, Y, G, S, ouT; y4 é Y, V, H, L, F, S, I, T, M, R, VH, ouFT; y5 é T, A, V, Q, Η, I, S, Y, ou não está presente yó é T, R, I, Q, A, M, ou não está presente y7 é G, E, K, R, T, D, Q, A, Η, N, P, ou não está presente y8 é R, Q, E, K, D, N, A, G, S, I, ou não está presente y9 é I, V, R, N, G, ou não está presente yio é I, T, V, K, M, R, L, S, E, Q, A, ou não está presente yné G, R, E, K, H, ou não está presente yné D, N, I, R, T, S, ou não está presente yi3 é I, M, ME, L, ou não está presente Yi4 é R, G, K, S, E, ou não está presente yi5 é Q. Rrou R; yióé Aí e y17 é Η, Y, R,ou Q. -128-

   27â. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) seleccionado(s) do grupo constituído por (a) a-Y-S-N-V-R-N-R-I-H-I-G-P-G-R-A-F-H-T-T-K-R-I-T-b; (b) u-N-N-NT-S-R-G-l-R-I-G-P-G-R-A-I-L-A-T-E-R-I-I-b; (c) a-N-NN-T-R-K-G-I-FI-G-P-G-R-N-I-Y-T-T-G-N-I-I-b; (d) a-N-T-R-K-S-I-R-I-Q-R-G-P-G-R-A-F-V-T-I-G-K-I-G-b; (e) a-N-N-N-T-R-K-R-(I°u V)-T-M-G-P-G-R-V-(You W)-Y-(Xou T)-(A ouT>G-Q-I-l-b; (f) e-N-N-N-(I ouT)-R-K-(R ouS)-l-T-(R ouK)-G-P-G-(Rou K)-V-I-Y-A-T-G-Q-I-I-b; (g) a-N-N-N-T-R-K-G-I-Y-V-G-S-G-R-(A ouK)-V-T-T-R-(D ou Hou Q)-K-I-(I ouM)-b; e (h) a-T-R-Q-(R ouS)-T-P-l-G-L-G*Q-(A ouS)-L-Y-T-T-R-b. 28â. - Processo para a produção de uma vacina destinada a gerar uma ampla resposta imunológi-ca, neutralizante caracterizado por se incluir na referida vacina compreender uma mistura compreendendo compostos, em que os referidos compostos não são^proteínas naturais do invólucro de HIV ocorrendo naturalmente, mas possuem a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo os referidos compostos o domínio de neutralizante principal, ou um seu segmento, de variantes de HIV. 29â. - Processo para a produção de uma vacina destinada a gerar uma ampla resposta imunológi ca neutralizante, caracterizado por se incluir na referida vacina um composto híbrido que compreende polipeptídeos, em que os referidos polipeptídeos não são proteínas naturais do

   invólucro de HIV que possuem a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo os referidos polipeptideos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 30i. - Processo para a produção de uma vacina caracterizada por se incluir na referida vacina pelo menos um composto possuindo a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes de HIV, tendo o referido composto a fórmula axGzGyb na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento; £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b, individualmente, podem compreender qualquer um dos seguintes: cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 31â. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida vacina ser for mulada com um adjuvante imunológico. 32â. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por x ser escolhido de entre: -130-

   x(0) = x não está presente x(l) s xx x(2) e x2 xj x(3) e x3 x2 Xj x(4) B X4 x3 x2 Xi x(5) s x5 *4 *3 *2 *1 x(6) = χ^ x5 x4 χ3 x2 X! x(7) 3X7X6X514X3 x2 *1 x(8) s Xg x7 X6 X5 X4 X3 X2 X! x(9) 3 X9 Xg X7 X6 X5 X4 X3 x2 Xi x(10) s X10 X9 Xg X7 X6 x5 X4 X3 x2 Xi x(ll) 3 xn X10 X9 Xg X7 X6 x5 X4 X3 x2 Xi x(12) s x12 XU x10 X9 Xg x7 X6 x5 *4 x3 x2 Xi x(13) 3 X13 xl2 XU xl0 19X8X7X6X5X4X3X2 *1 * é P, L,A,S, ou Q e y é seleccionado de y(0)3 y não está presente y(i) * λ y(2) * yi y2 y(3) * yi y2 y* y(4) = yi y2 ya y4 y(5) = yi y2 y3 y4 ys y(6) = yi y2 y3 y4 ys n y(7) = yi y2 y3 y4 ys y6 y? y(8) = yi y2 y3 y4 y5 % y? ys y(9) — yj y2 y3 y4 y5 ye y7 ye ys y(io) = yi y2 y3 y4 ys yó y7 ys y9 yio y(ii) = yi y2 y3 y4 ys yó y7 ys y9 yio yn y(12) S y, y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10 yn yn y(i3) = >’i y2 y3 y4 ys n yi ys y9 yio yn yi2 yn y(i4) = yi y2 y3 y4 y5 yó yi ye ye yio yn yn yn y« y(is) = yi y2 y3 y4 ys yó y7 ye ye yio yn yn yn yi4 yn y(i6) = yi y2 y3 y4 ys yó y7 ye ys yio yn yn yn yi4 yn yn y(i7) = yi y2 y3 y4 y5 yó y7 ye ye yio yn yn yn yi4 yn yn yn e em que Xl é I, R, M, IQR, V, L, K, F, S, G, Y, SRG.ou YQR; x2 é H, R, Y, T, S, P, F, N, A, K, G, ou V; x3 é I, L, Μ, T, V, E, G, F, ou Y; X4 é R, S, G, Η, A, K, ou não está presente x5 é K, R, I, N, Q, A, IR, RQ, ou não está presente Xó é R, K, S, I, P, Q, E, G, ouT; x7 é T, K, V, I, A, R, P,ou E; x8 é N, NV, Y, ΚΙ, I, T, DK, H, ouK; Χ9 é N, S, K, E, Y, D, I, ouQ; x10 é N, Y, S, D, G, ouH; xu éP; x12 é R, I, ouK; Χχ3 éT’ I. MOUA; yx é R. ^ Q. G, S, or T; y2 é A, V, N, R, K, T, S, F, P, ou W; y3 é F, I, V, L, W, Y, G, S, euT; y4 Ó Y, V, H, L, F, S, I, T, M, R, VH.ou FT; ys é T, A, V, Q, Η, I, S, Y, yó é T, R, I, Q, A, M, y7 é G, E, K, R, T, D, Q, A, Η, N, P, y8 é R, Q. E, K, D, N, A, G, S, I, y9 él, V, R, N, G, -132- -132-

   y10 é I, T, V, K, M, R, L, S, E, Q, A, ou não está presente yn é G, R, E, K, H, ou não está presente y12 é D, N, I, R, T, S, ou não está presente y13é I, M, ME, L,. ou não está presente yi4 é R, G, K, S, E, ou não está presente yj5 é Q, K, ouR; yió é A; e y17 é Η, Y, R, ou Q. 33â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por x ser escolhido de entre é I; *2 é H; *3 é I; *4 é R; X5 é K; *6 é R; x7 é T; z éP; yi é R; y2 é A; y3é F; y4é Y; y5é T; y6é T; y?é G. -133-

   34§. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) seleccionado(s) do grupo constituído por (a) a-Y-S-N-V-R-N-R-I-H-I-G-P-G-R-A-F-H-T-T-K-R-I-T-b; (b) aN-N-N-T-S-R-G-I-R-I-G-P-G-R-A-I-L-A-T-E-R-I-I-b; (c) a-N-N-N-T-R-K-G-I-F-l-G-P-G-R-N-I-Y-T-T-G-N-I-I-b; (d) a-N-T-R-K-S-I-R-I-Q-R-G-P-G-R-A-F-V-T-I-G-K-I-G-b; (e) a-N-N-N-T-R-K-R-(l ouV)-T-M-G-P-G-R-V-(Y ou W)-Y-(X our).(Aou T)-G-Q-M-b; (0 a-N-N-N-(I ouT)-R-K-(R <oi£)-I-T-(R ou K)-G-I G-(R ouK)-V-I-Y-A-T-G-Q-I-I-b; (g) a-N-N-N-T-R-K-G-I-Y-V-G-S-G-R-(Aou K)-V-T-T-R-(D ou H ou Q)-K-I-(I M)-b; (h) a-T-R-Q-(R ou S)-T-P-I-G-L-G-Q-(A ou S)-L-Y-T-T-R-b. 35â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) capaz(es) de introduzir anticorpos que se ligam à sequência G-P-G-R-A-F. 36â, - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) compos-to(s) ser(em) capaz(es) de induzir anticorpos que se ligam à sequência I-G-P-G-R-A-F. 37§. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) capaz(es) de induzir anticorpos que se ligam à sequência I-G-P-G-R-A» 38§, - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) capaz(es) de induzir anticorpos que se ligam à sequência i-a-i-G-P-G-R, na qual a é qualquer um dos 20 ami-noácidos.
5. 393. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por a ser H.
6. 403. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) compostos ser(em) capaz(es) de induzir anticorpos que se ligam à sequência i-a-i-G-P-G-R-A, na qual a é qualquer um dos 20 ami-noácidos.
7. 413. - Processo de acordo com a reivindicação 40 caracterizado por a ser H.
8. 423. - Processo de acordo cora a reivindicação 32, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) capaz(es) de induzir anticorpos que se ligam à sequência i-a-i-G-P-G-R-A-F, na qual a é qualquer um dos 20 aminoácidos.
9. 433. - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a ser H.
10. 443. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) estar(em) circularizados.

    45â, - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o(s) referido(s) compoe-to(s) compreender(em) epítopos de mais de uma variante de HIV. 46â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por X^ ser i; Z ser P; Y^ ser R; e Y2 ser A. 47â, - Processo de acordo com a reivindicação 32, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por ser i; x3 ser i; Z ser P; e ser R, 48â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por Z ser P Y^ ser R Yg ser A ser P -136- 49ã. - Processo cie acordo com a reivindicação 32, caracterizado por x ser seleccionado do grupo constituído por x(5), x{6), x(7), x(8)# x(9), x(10), e x(ll-) e Y ser seleccionado de entre ^(5), ^(6), 2.(7), 2(8)# 2.(9)# 2(10), e 2(11)· -136- i 50â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o referido composto ter a seguinte sequência de aminoácidos: 8-X13-R-P-Xi0-Xy-X8x7-x6-x5-x4-x3*x2-xl*G*z-G*yi-y2'y3-y4*y5-y6-y7*y8-y9-yiO-G-yi2-yi3-R-yiS-A*y1rb. 51§. - Sistema para ser utilizado na detecção de anticorpo contra HIV num fluido biológico, caracterizado por compreender: (a) um composto, em que esse composto não é uma proteína natural do invólucro de HIV, possuindo o referido composto a capacidade de suscitar e/ou de se ligar com anticorpos neutra-lizantes, compreendendo o referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV; e (b) um meio de detecção dos complexos formados entre o referido anticorpo e o referido composto. reivindicação 51, 52a. - Sistema de acordo com a caracterizado por o referido composto ter a a fórmula x G L· G Ί. na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e sséP, A, S, Q ou L. 53ã, - Sistema de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por x ser seleccionado de x(0) e x não está presente *(1) E X1 x(2) E X2 XX x(3) m x3 x2 xx *(4) * *4 x3 x2 xx *(5) * *5 *4 *3 *2 *1 x(6) = Xé x5 *4 x3 x2 X1 x(7) — X7 X6 x5 *4 x3 x2 X1 x(8) s X8 χ7 X* χ5 X4 x3 x2 X1 x(9) Ξ X, XB X7 Xí X5 x4 x3 x2 X1 x(10) s X10 x^ x8 x7 *6 x5 ^ x3 x2 *1 X(ll) E XU X10 X9 Xg x7 Xó x5 *4 x3 x2 χ1 χ(12) S Xi2 Xn χ10 X9 x8 x7 X<. x5 ^ x3 x2 X1 x(13) 3 X13 X12 Xn x10 *9 x8 x7 X« XS x4 x3 x2 Xl z é P,L,A,S ou Q; e y é seleccionado de 133- y(0) = y não está presente y(i) Ξ yi y(2) = yi y2 y(3) Ξ yi y2 κ y(4) = yi y2 y3 y4 y(5) Ξ yi y2 y3 y4 ys y(6) s yi y2 ^ y< ys yó y(7) = >'i y2 y3 y4 ys yó y7 y(8) s yi y2 y3 y4 ys yó y7 ys y(9) = yi y2 y3 y4 ys yó y7 ys y» y(10) H yj y2 y3 y4 y5 y6 y7 y« Y9 yio y(ii) b yi y2 y3 y4 ys yó y7 y» ys yio yn y(i2) = yi y2 y3 y4 ys yó yn ys y9 yio yn yn y(i3) s yi y2 y3 y4 ys y<, y7 ys ys yio yn yn yn y(i4) = y1 y2 y3 y4 ys yó y7 ys ys yio yn yn yn yu y(15) B yj y2 y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 yio yn yn yn Yu Yis y(16) = yi y2 y3 y4 ys yó y7 ye y9 yio yn yn yn yw yn yn y(i7) = y2 y2 y3 y4 y5 yó y7 ye ys yio yn yn yn yn yn yn yn e em que Xl é I, R, M, 1QR, V, L, K, F, S, G, Y, SRG, ou YQR; x2é H, R, Y, T, S, P, F, N, A, K, G, or V; x3é I, L, Μ, T, V, E, G, F, ouY; x4 é R, S, G, Η, A, K, não está presente x5 é K, R, I, N, Q, A, IR, RQ, ou não está presente Xó é R, K, S, I, P, Q, E, G, ouT; x7 é T, K, V, I, A, R, P.ouE; χ8 é N, NV, Y, ΚΙ, I, T, DK, H, or K; X9 é N, S, K, E, Y, D, I, ouQ; -139- -139-

    χΐθ é N, Y, S, D, G, or H; xn é P; x12 é R> X13 é T, I, Μ A; yi éR« Ri Q> G. S, T; y2 e A, v, N, R, K, T, S, F, p, W; y3 éF. I, V, L, W, Y, G, S, T; y4 é Y, V, H, L, F, S, I, T, M, R, VH, or FT; y5 éT. A, V, Q, Η, I, S, Y. ou não está presente yó é T, R, I, Q, A, M, ou não está presente y7 é G, E, K, R» T, D, Q, A, Η, N, P, ou não está presente y8 é R. Q» E, K, D, N, A, G, S, I, ou não está presente y9 g I, V, R, N, G, ou não está presente yio é I, T, V, K, M, R, L, S, E, Q, A, ou não está presente yn éG, R, E, K, H, ou não está presente yl2 é D. N, I, R, T, S, ou não está presente yi3 é I> M, ME> L, ou não está presente y14 é R> G, K, S, E, ou não está presente yis é Q* R» ouR; yi6 é A; e y17 é Η, Y, R, ou Q. 54ã. - Sistema de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por o(s) referido(s) composto (s) ser(em) seleccionado(s) do grupo constituído por (a) a-Y-S-N-V-R-N-R-l-H-I-G-P-G-R-A-F-H-T-T-K-R-I-T-b; (b) a-N-N-N-T-S-R-G-l-R-J-G-P-G-R-A-I-L-A-T-E-R-I-I-b; (c) aN-N-N-T-R-K-G-I-F-I-G-P-G-R-N-I-Y-T-T-G-N-I-I-b; (d) a-N-T-R-K-S-I-R-I-Q-R-G-P-G-R-A-F-V-T-I-G-K-I-G-b; (e) a-N-N-N-T-R-K-R-(I ouV)-T-M-G-P-G-R-V-(Y ouW)-Y-(X ou T)-(A ou T)-G-Q-I-I-b (f) a-N-N-N-(I ouT)-R-K-(R ouS)-I-T-(R ouK)-G-P-G-(R ou K)-V-l-Y-A-T-G-Q-I-l-b; (g) a-N-N-N-T-R-K-G-I-Y-V-G-S-G-R-(A ou K)-V-T-T.R-(Dou h ou Q)-K-1-(I ou M)-b; (h) a-T-R-Q-(R ou S)-T-P-I-G-L-G-Q-(A ou S)-L-Y-T-T-R-b. 55â. - Ensaio imunológico para detecção e/ou quantificação do anticorpo contra HIV num fluído, caracterizado por o referido ensaio utilizar pelo menos um composto, em que esse composto não é uma proteína natural do invólucro de HIV, possuindo o referido composto a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizan-tes, compreendendo o referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 56â. - Ensaio imunológico de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por o referido composto ter a fórmula X G z G £ na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a ou b individualmente podem compreender qualquer um dos seguintes; cis-teína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 57â. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais neutralizantes, de larga gama de actividade, caracterizado por compreender a imunização com uma mistura que compreende compostos, em que esses compostos não são proteínas naturais do invólucro de HIV, tendo os referidos compostos a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, em que cada um dos referidos compostos compreende o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 58â. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais neutralizantes amplos, caracterizado por compreender a imunização com um composto híbrido que compreende polipeptídeos possuindo a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, em que cada um dos referidos polipeptídeos compreende o domínio neutralizante principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV.
11. 591. - Processo para a preparação de anticorpos neutralizantes de larga gama de actividade, caracterizada por compreender a imunização de um animal ou ser humano com pelo menos um composto compreendendo um domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV, seguida pela imunização do referido animal ou ser humano com (a) uma mistura compreendendo composto, em que esses compostos não são proteínas naturais do invólucro de HIV que, possuin do os referidos compostos a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes compreendendo os referidos compostos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV; ou (b) um composto híbrido que compreende polipeptídeos, em que esses polipeptídeos não são proteínas naturais do invólucro de HIV que, possuindo os referidos polipeptídeos a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo os referidos polipeptídeos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 6Gã. - Processo de acordo com a reivindicação 59a, caracterizado por compreender a imunização com, pelo menos, um composto possuindo a capacidade de introduzir e/ou de se ligar com anticorpo neutralizantes, possuindo o referido composto à fórmula x G 2. G Σ na qual

    x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b individualmente podem compreender qualquer um dos seguintes; cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 61â. - Método para detecção de um anticorpo contra HIV num fluído biológico, caracterizado por os seguintes passos: (a) incubação de um composto, que não uma proteína natural do involucro de HIV que, possuindo o referido composto a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neu-tralizantes, compreendendo o referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento de uma variante de HIV; (b) detecção dos complexos formados entre o referido anticorpo e o referido composto. 62ã. - Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado por o referido composto ter a seguinte fórmula x G z G £ -144- na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, QouL; e 63â. - Método para a profilaxia ou tratamento de infecções de HIV, caracterizado por compreender a administração a um animal ou ser humano necessitando dessa profilaxia ou tratamento uma composição compreendendo um anticorpo obtido contra uma mistura compreendendo compostos, em que esses compostos não são proteínas naturais do invólucro de HIV que, mas que possuem a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo cada um dos referidos compostos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV; em que a referida composição contem de 0,5 a 10% de compostos acti-vos. 64â. - Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado por os referidos compostos terem a fórmula seguinte: x G z G y na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b indi- vidualmente podem compreender qualquer um dos seguintes; cis-teína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 65ã. - Método para estimular uma reacção conducente à profiláxia de linfócitos caracterizado por compreender o tratamento de humanos necessitando de estimulação de uma reacção conducente à profilaxia de linfócitos com pelo menos um composto, que não é uma proteína natural do invólucro de HIV que ocorre naturalmente, possuindo o referido composto a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo o referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV; em que a referida composição contem de 0,5 a 10% de compostos activos. 66i. - Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado por o referido composto ter a fórmula x G z G £ na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, ·£ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b individualmente podem compreender qualquer um dos seguintes;

    cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 67â. - Método para o tratamento de infecção de HIV, caracterizado por compreender a administração a um animal ou ser humano necessitando de tal tratamen to uma composição compreendendo um ou mais compostos em que estes compostos não são proteínas naturais de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo cada um dos referidos compostos o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV; em que a referida composição contem de 0,5 a 10% de compostos activos. 68§. - Método de acordo com a reivindicação 67, caracterizado por os referidos compostos ter a fórmula X G z G £ I na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e zéP, A, S, QouL; e ou a, ou b mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b individualmente podem compreender qualquer um dos seguintes; cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização \ -147-

    principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 69â. - Método para testar um flui do biológico relativamente à presença de uma proteína específica de determinada variante de HIV, caracterizado por compreender (a) o contacto do referido fluido com um anticorpo específico para compostos me que não são proteínas naturais do invólucro de HIV que ocorrem naturalmente,mas têm a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizan-tes, compreendendo os referido compostos o domínio de neutralização principal, ou um dos segmentos, de uma variante de HIV; e (b) a detecção de complexos imunológicos como uma medida da referida variante no fluido referido. 70â. - Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizado por os referidos compostos da parte (c) terem a fórmula axGzG^b na qual .X tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z_ é P, A, S, QouL; e -148- ou a, ou b, roas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b individualmente podem compreender qualquer um dos seguintes; cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 71§. - Método de estimulação in vitro de linfócitos, caracterizado por compreender o tratamen to de células linfóides de animais imunes com pelo menos um composto, que não proteínas naturais do invólucro de HIV que ocorrem naturalmente, possuindo o referido composto a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizan-tes, compreendendo o referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 72i. - Método de acordo com a reivindicação 71, caracterizado por o referido composto ter a fórmula a x G z_ G £ b na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e z é P, A, S, Q ou L; e ou a, ou b mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b individualmente podem compreender um dos seguintes; cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a iraunogeni-cidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal 149-

    de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 73ã, - Método para identificação de anticorpos monoclonais ou policlonais que são úteis na profilaxia ou terapia, caracterizada por compreender a triagem de células produtoras de anticorpos relativamente à capacidade de ligação a, pelo menos, um composto, que não proteínas naturais do invólucro de HIV que possuindo o referido composto a capacidade de induzir e/ou de se ligar com anticorpos neutralizantes, compreendendo o referido composto o domínio de neutralização principal, ou um seu segmento, de uma variante de HIV. 74ã. - Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizado por o referido composto ter a fórmula a x G z G y b I na qual x tem 0 a 13 aminoácidos de comprimento, £ tem 0 a 17 aminoácidos de comprimento; e £ é P, A, S, QouL; e ou a, ou b, mas não ambos, podem ser omitidos; ou a, ou b individualmente podem compreender qualquer um dos seguintes: cisteína, uma proteína ou outra fracção capaz de intensificar a imunogenicidade, um peptídeo de um domínio de neutralização principal de HIV, um peptídeo capaz de estimular células-T, ou um agente estimulante do sistema imunitário em geral. 75 ã. - Gene sintético que codifica um polipeptídeo, caracterizado por o referido polipeptí-deo compreender mais de um epítopo neutralizante de HIV. 76ã. - Gene sintético que codifi ca um polipeptídeo, caracterizado por o referido polipeptídeo compreende epítopos neutralizantes de mais de um isolado de HIV. 77ã. - Gene sintético de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por o referido polipeptídeo compreender epítopos neutralizantes de 2 a 20 isolados de HIV.
12. 781. - Gene sintético de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por um dos referidos epítopos neutralizantes ser do isolados de HIV designado HIV-MIN. 79â. - Gene sintético de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por o referido polipeptídeo compreender epítopos neutralizantes isolados de HIV designados HIV-MN, HIV-IIIB, HIV-RF, HIV-SC e HIV-WMjl. 80§, - Gene sintético de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por as regiões que codificam epítopos neutralizantes de diferentes isolados de HIV estarem separados por espaçadores de aminoácidos. 81ã. - Gene sintético de acordo com a reivindicação 80, caracterizado por os referidos espaça dores de arainoácidos serem glicinas 82ã. - Gene sintético de acordo com a reivindicação 76, caracterizado por o referido gene co dificar um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos indicado no Quadro 13, ou uma sequência de arainoácidos equivalentes. 83ã, - Gene sintético de acordo com a reivindicação 7õ, caracterizado por o referido gene codificar um polipeptídeo de fusão. 84ã. - Gene sintético de acordo com a reivindicação 83, caracterizado por o referido gene codificar um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos indicado no Quadro 13A ou uma sequência de aminoácidos equivalente. 85â. - Processo para a produção de composto caracterizado por se incorporar no referido composto epítopos neutralizantes relativas a mais de um isolado de HIV. 86ã. - Processo de acordo com a reivindicação 83, caracterizado por se incorporar no referido composto compreender epítopos neutralizantes de 2 a 20 isolados de HIV. 87ã. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por um dos epítopos neutralizantes referidos ser do isolado de HIV designado HIV-MN. -152- 88ã. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por se incorporar no referido composto epítopos neutralizantes de isolados de HIV designados por HIV-MN, HIV-IIIB, HIV-RF, HIV-SC e HIV-WMji. 89§. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por os referidos epítopos neutralizantes estarem separados por espaçadores de aminoácidos. 90â. - Processo de acordo com a reivindicação 89, caracterizado por os referidos espaçadores de. aminoácidos serem glicinas. 91â. - Processo de acordo com a reivindicação 89, caracterizado por se incorporar no referido composto a sequência de aminoácidos indicada na Tabela 13, ou uma sequência equivalente Tabela 13 IIIB MetThrArgIIeGInArgGlyProGlyArgAlaPheVal GlyGIyGlyGly - RF SerlleThrArgGlyProGIyArgValIleTyr GlyGIyGlyGly - MN ArgIleHisIleGlyProGlyArgAIaPheTyr GlyGIyGlyGly - SC SerlleHisIIeGIyProGIyArgAIaPheTyr GlyGIyGlyGly - WMJ1 HisIleHisIleGIyProGlyArgAlaPheTyr GlyGIyGlyGly - LeuSerlleCys 92ã. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o referido composto ser um polipeptídeo de fusão. 93ã. - Processo, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado por se incluir no referido composto a sequência de aminoácidos indicada na Tabela 13A, ou uma sequência de aminoácidos equivalente.

    TABELA 13A E.coli BG MetLeuArgProValGluThrProThrArgGluIleLysLysLeuAspGlyLeuTrp -AlaPheSerLeuAspArgGluArgValValArgTyrHisArgTrpIleArgGInAlaSer - IIIB MetThrArgIIeGInArgGIyProGlyArgAlaPheVal GlyGlyGlyGly - RF SerlleThrArgGIyProGlyArgValIleTyr GlyGlyGlyGly - MN ArgIleHisIleGlyProGlyArgAlaPheTyr GlyGlyGlyGly - SC SerlleHisIIeGlyProGlyArgAIaPheTyr GlyGlyGlyGly - WMJ1 HisIIeHisIleGlyProGIyArgAIaPheTyr GlyGlyGlyGly -LeuSerlleCys
13. 941. - Processo para a produção de uma composição profiláctica ou terapêutica, caracterizada por se incluir na referida composição imunoglobulinas, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos policlonais gerados mediante imunização de um animal apropriado com uma composição que compreende um composto multi-epítopo, em que o referido composto multi-epítopo compreende epítopos neutralizantes de 2 a 20 isolados de HIV, em que um dos referidos é HIV-MN.
14. 951. - Processo de acordo com a reivindicação 94, caracterizado por o referido composto multi--epítopo compreende epítopos neutralizantes dos designados HIV-MN, HIV-IIIB, HIV-RF, HIV-SC e HIV-WMji.
15. 961. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais neutralizantes amplos, caracterizado por compreender a imunização de um animal apropriado com uma composição compreendendo um composto multi-epítopo, em que o referido composto-multi-epítopo compreende epítopos neutralizantes de 2 a 20 isolados de HIV, em que um desses isolados é HIV-MN.
16. 971. - Processo de acordo com a reivindicação 96, caracterizado por o referido composto multi--epítopo compreende epítopos neutralizantes dos isolados de HIV designado HIV-MN, HIV-IIIB, HIV-RF, HIV-SC e HIV-WMjl.
17. 981. - Método para a profilaxia ou terapia de infecção de HIV, caracterizado por compreender a administração a um animal ou ser humano necessitando dessa profilaxia ou terapia uma composição farmacêutica compreendendo imunoglobulina, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos po-liclonais obtidos mediante imunização dum animal apropriado com uma composição compreendendo um composto multi-epítopo em que o referido composto compreende epítopos neutralizantes de 2 a 20 isolados de HIV, em que um desses isolados é HIV-MN, em que a referida composição contém 0,5% a 10% de compostos activos. 99ã. - Método de acordo com a reivindicação 98, caracterizado por o referido composto multi--epítopo compreender domínios neutralizantes dos isolados de HIV designados HIV-MN, HIV-IIIB, HIV-RF, HIV-SC e HIV-WMjl. lOOã. - Processo para estimular uma reacção em humanos conducente à profilaxia de linfócitos caracterizado por compreender o tratamento de seres humanos necessitando de estimulação de uma reacção conducente à poli-feraçao de linfócitos com uma composição compreendendo um composto multi-epítopo em que o referido composto compreende um domínio neutralizante de 2 a 20 isolados de HIV, em que um dos referidos isolados é HIV-MN; em que a referida composição contem 0,5 a 10% de compostos activos. -158- 101§. - Processo de acordo com a reivindicação 100, caracterizado por o referido composto muiti-epítopo compreender epítopos neutralizantes dos isolados de HIV designados HIV-Mn, HIV-I1IB, HIV-RF, HIV-SC e HIV-WMjl, Lisboa, 3 de Outubro de 1989

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