JP2001527029A - 抗レトロウイルス免疫原、調製および使用 - Google Patents
抗レトロウイルス免疫原、調製および使用Info
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Abstract
Description
ボキシメチル化されるレトロウイルス調節タンパク質またはそれらのフラグメン
ト、あるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラグメントに関する。
CD4(+)T細胞を直接的に殺すだけでなく、未感染のT細胞の免疫抑制を誘
導する。2つの免疫抑制タンパク質、インターフェロンαおよび細胞外Tatは
、このプロセスを媒介する。
増殖活性、および免疫調節活性)を発揮することが公知である。当業者に理解さ
れるように、インターフェロンは、種々の型の哺乳動物細胞からの排泄物として
産生される、低分子量のポリペプチドである。その特性、化学的性質および調製
方法は、広範に研究され、そして実証されてきた。現在、3つの主要な型のヒト
インターフェロンが知られ、それぞれは、最初の産生株細胞および適用された誘
導物質に従って区別される。それらは、インターフェロンα(白血球)、β(線
維芽細胞)およびγ(免疫)である。
ンの中の1つであり、炎症性疾患、ウイルス疾患、および悪性疾患のような状態
における、治療的価値を有することが示されている。
パク質の中で、TatおよびNefタンパク質は、ウイルス周期内で最も早期に
産生される。以前に述べられたように、細胞外Tatタンパク質は、免疫抑制活
性を有する。Tatタンパク質はまた、HIV遺伝子発現の効率的な活性化因子
である。
タンパク質の効果に対して戦うために、いくつかのアプローチが提案された。臨
床試験をアンチセンスRNA(Hybridon,Inc.)を用いて実施し、
そしてインビトロ実験において、Tatの転写作用をブロックするためにTAR
領域(RNA中のTat結合部位)のRNAを使用するリボザイムの可能性が示
された。Tatの転写効果を阻害する、いくつかの薬理学的分子もまた記載され
てきた。これら全ての方法は、Tat転写活性をブロックすることによって、ウ
イルスの複製をブロックすることが意図された。
の免疫化のために、タンパク質分解、化学合成、または遺伝子組換えにより得ら
れる、レトロウイルスタンパク質ポリペプチド(ネイティブTatタンパク質を
含む)の利用を報告する。これらのレトロウイルスタンパク質ポリペプチドは、
レトロウイルス複製および細胞障害活性を防御するための免疫原(特に、Tat
のようなレトロウイルスタンパク質に罹患するリンパ球および神経細胞に対する
)として使用される。しかし、ネイティブなタンパク質またはそれらのフラグメ
ントの毒性は、免疫化のためのそれらの利用を防止する。
取り込みをブロックすることにより、HIV−1の複製をブロックする免疫原と
して、HIV−1ネイティブTatタンパク質、欠失/置換を含むそのタンパク
質またはポリペプチドのフラグメントの利用を報告する。WO−A−95/31
999に報告された化合物の免疫原性が記載されたにもかかわらず、ネイティブ
Tatタンパク質の毒性効果、それにより誘導される免疫学的障害、および記載
の免疫原での免疫化による中和抗体の非存在のような、特定の懸念も残っている
。従って、ネイティブTatタンパク質の全ての有害な効果を消失し、そしてま
た、細胞性および/または体液性の免疫学的応答を誘導し得る、新規なTat不
活性化免疫原の開発が必要である。
的応答を誘導し、かつその免疫抑制効果を防御または修復し得る免疫原として、
Tatトキソイドおよびレトロウイルス調節タンパク質の利用を報告する。これ
らのトキソイド(不活性化されているが免疫原性である産物)は、ネイティブな
タンパク質またはこのタンパク質に由来するセグメントのホルムアルデヒドでの
化学的処置により調製されてきた。しかし、アルデヒドでの不活性化は、容易に
再現可能でない。工業生産のためには、特に不活性化の手順に関して、定期的な
結果が必要である。定常構造および明確な産物もまた、好ましい。理想的な産物
はまた、優れた安定期を有するべきである。
ル化トキソイド、およびこれらトキソイドの新規な簡単かつ効果的な生産方法を
提供することを目的とする。これらのトキソイドは、HIV−1調節タンパク質
に、またはインターフェロンαに主に由来し、これら双方は、HIV−1感染に
おける免疫抑制効果に寄与する。これらの調節タンパク質の中で、Tat、Ne
f、Vpr、およびVifを主に議論する。
多型性のTat効果の原因となるネイティブTatタンパク質の領域は、明確で
なく、そして置換/欠失を予測して、調製物の全体的な無害性を保証すること困
難である。
抑制効果を排除することなく、Tatの転写活性化因子の効果を破壊する。さら
に、ネイティブな分子(直鎖状の抗原および高次構造の抗原)に関して、アミノ
酸の置換/欠失は、その改変された分子の構造を強く変化させ得、従ってネイテ
ィブな分子に対する適切な免疫学的反応の発生を防止する。この最後の点は、特
に重要である。なぜなら、ネイティブなタンパク質に対する中和抗体の生成が必
要であるからである。
質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメン
トに関する。
V−1、HIV−2、HTLV−1またはHYLV−2に由来し、そして好まし
くはHIV−1またはHIV−2に由来する。そのタンパク質またはそのフラグ
メントは、レトロウイルス調節活性のタンパク質またはフラグメントである。H
IV−1ウイルス調節タンパク質は主に、Tat、Nef、Vpr、およびVi
fである。
Tatタンパク質に由来し、好ましくはHIV−1のTatタンパク質に由来す
る。
質またはそのフラグメント、あるいはカルボキシメチル化インターフェロンαま
たはそのフラグメントが、治療処置において使用される。本発明の由来する医薬
は、例えば、レトロウイルス感染の治療処置または予防処置において、一般的に
、あるいは特にインターフェロンα過剰産生により引き起こされる有害な効果か
ら、またはウイルス、好ましくはHIV−1由来の調節タンパク質により引き起
こされる効果から、それらの有用性が見出される。
物またはワクチン組成物を提供する。その免疫原性化合物は、単独で投与され得
るか、本発明の別の免疫原性化合物と共に投与され得るか、および/またはアジ
ュバントのような受容可能な薬学的キャリアと共に投与され得るか、または他の
レトロウイルス免疫原と共に投与され得る。
はそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントの調
製のためのプロセスであって、その調節ウイルスタンパク質またはそのフラグメ
ント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントがカルボキシメチル
化され、そして所望の場合、次いで、この化合物が単離される事実により特徴付
けられる、プロセスに関する。
またはそのフラグメントは、その精製を可能にする化合物と融合される。例えば
、タンパク質またはそのフラグメントは、いくつかのヒスチジン、好ましくは4
、5または6、あるいはそれ以上の直列のヒスチジンを含むペプチドフラグメン
トと融合され、そのペプチドフラグメントは、精製工程のためのアフィニティー
カラムのニッケル結合樹脂への固定化を可能にする。好ましい実施態様において
、このペプチドは、精製後切断される。
ラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントは、組換えD
NA技術、または生化学合成および精製により調製され得る。組換えDNA方法
を使用した後、作製されたタンパク質またはそのフラグメント、あるいはインタ
ーフェロンαまたはそのフラグメントは、例えば、その調節タンパク質またはイ
ンターフェロンαまたはこれらのフラグメントの1つに対して惹起された抗体を
使用する、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。アフィニテ
ィーカラムに対するリンカーとして機能する、融合ペプチドに融合されるタンパ
ク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質はまた、合成され得る。
胞性の両方含む)免疫応答を誘導する方法を提供し、その方法は、少なくとも1
つのカルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質、またはインタ
ーフェロンα、またはそれらのフラグメントを含む薬学的組成物あるいはワクチ
ン組成物を、受容可能な薬学的キャリアと共に、免疫応答を誘導するのに十分な
量で投与する工程を含む。
が提供され、その方法は、少なくとも1つのカルボキシメチル化された、レトロ
ウイルス調節タンパク質、またはインターフェロンα、またはそれらのフラグメ
ントを含む薬学的組成物あるいはワクチン組成物を、受容可能な薬学的キャリア
と共に、哺乳動物において抗体を惹起するのに十分な量で投与する方法を含む。
メント(例えば、過剰生成されるインターフェロンα、TatまたはNef)は
、カルボキシメチル化により改変される。この化学的改変は、生物学的に不活性
であるがそれらの免疫原性を保持する新規のタンパク質またはフラグメント(ト
キソイド)をもたらす。免疫系において毒素のようにふるまうネイティブのタン
パク質またはフラグメントは、特許請求の範囲のカルボキシメチル化されたタン
パク質またはフラグメントに対して惹起される抗体によって認識される。このカ
ルボキシメチル化タンパク質もしくはフラグメントは、中和抗体を産生するため
か、またはネイティブタンパク質をブロックするために十分な免疫原性特性を保
持し、そして同時にこのネイティブのタンパク質もしくはフラグメントの生物学
的毒性性質の少なくとも90%〜約95%、または99%でさえも、損失する。
はそのフラグメントを含み得る。さらに、この化合物は、当業者に公知のように
、改変がその化合物を毒性および活性な免疫原性特性のないままにする限り、こ
のタンパク質またはフラグメントのアミノ酸の1つ以上の改変(例えば、欠失、
置換、付加、またはアミノ酸のアシル化のような機能化)を含み得る。例えば、
ロイシン残基のイソロイシン残基による置換は、これらの特性を改変しない。一
般には、この改変は、30%未満のアミノ酸、好ましくは20%未満、より好ま しくは、10%未満のアミノ酸を含むべきである。
なるガイダンスは、Bowie,J.U.ら、「Deciphering th
e Message in Protein Sequences:Toler
ance to Amino Acid Substitutions」Sci
ence 247:1306−1310(1990)に見出され得る。
これらのタンパク質は、当該分野において公知のように、エンドペプチターゼま
たはプロテアーゼ(例えば、トリプシン、キモトリプシン)のような酵素、ある
いは臭化シアンのような化学薬剤を用いて消化され得る。
けるのに必要な長さと同じくらいの長さであり得る。例えば、本発明のペプチド
フラグメントは、8〜110アミノ酸を有し得、好ましくは12〜60アミノ酸
、または12〜40アミノ酸でさえも有し得る。このようなフラグメントはまた
、本来のセグメントに隣接するアミノ酸とは異なる、C末端またはN末端におけ
る1つ以上の、最も好ましくは1〜5の追加のアミノ酸を有し得る。フラグメン
トはまた、少なくとも1つのカルボキシメチル化されるべきシステインを有さな
くてはならない。さらに、改変、改変された免疫原とタンパク質もしくはその一
部分との間の相同性または類似性、および免疫原性化合物の大きさ、そしてまた
、本発明に従う免疫原性化合物の利用または結合に関する全ての方法は、破傷風
トキソイドのような別の免疫原性タンパク質の参照によって解明され得る(WO
−A−86/06 414またはEP−A−0 220 273またはPCT/
US 86/00831でさえも、この開示物は、本明細書中で参考として援用
される)。
ウイルストキソイド」と名づけられる。事実、先行技術の慣用的な細菌性トキソ
イドとして、本発明の化合物は、それら自体の毒素を欠乏する、しかしそれにも
かかわらず、生物体へ投与する場合、免疫応答を誘発し得る。
たはフラグメントに対して惹起される抗体によって良好に認識されることを確認
するために、ネイティブのタンパク質は、例えば、ELISA法によって免疫学
的にアッセイされ得る。このアッセイは、当該分野において公知のようにおよび
実験の節で見られるように、本発明のカルボキシメチル化ポリペプチドまたはオ
リゴペプチドに対して惹起される特異的な抗体の存在下において実行され、そし
てAg−Ab複合体形成が決定される。例えば、競合免疫アッセイまたはサンド
イッチ免疫アッセイが使用され得る。
産生するために十分保存/保持されているかどうかを測定するために、哺乳動物
(ウサギ、ラット、マウス)は、本発明に従う免疫原性カルボキシメチル化化合
物の補助で免疫化され得る。続いて、実験の節で実証されるように、産生された
抗体が毒性のネイティブタンパク質の活性を中和するかどうかを確認し得る。
0%を損失したかどうかを決定するために、Tatの場合、T細胞の免疫抑制、
または新脈管形成における不活性化Tatの効果が研究され得る。
供給に依存するHL−1細胞株で培養したTat欠損HIV非感染変異体を使用
したTatレスキューアッセイによって、確認される。
1またはHTLV−2ウイルスのいずれかの調節タンパク質由来、より好ましく
はNef、RevまたはVpr由来、そして最も好ましくはHIV−1もしくは
HIV−2ウイルス由来のTat由来であり得る。
イルスのTaxタンパク質由来であり得る。
ンターフェロンαは、全血液、新生児線維芽細胞、リンパ芽球腫および種々の白
血病細胞株から単離される白血球を含むいくつかの細胞供給源から精製される。
組換えインターフェロンαについて使用される利用可能な精製手法の総説につい
て、T.L.NagabhushanおよびP.P.Trotta,Ulman
n’s Encyclopedia of Industrial Chemi
stry A14,VCH:372(Weinheim,Federal Re
public of Germany 1989)を参照のこと。
24種より多くが、これまでに遺伝子およびタンパク質配列データから同定され
ている。大部分の種が、23アミノ酸残基のシグナルペプチド配列および166
アミノ酸残基の成熟アミノ酸配列を有する(Goeddel,D.V.ら、Na
ture 290:20−26(1981);Weissmann,C.および
Weber,H.,Prog.Nuc.Acid Res.Mol.Biol.
33:251−300(1986);Zoon,K.C.,Interfero
n 9:1−12(1987))。
ankel,A.D.ら、(Cellular uptake of the
Tat protein from human immunodeficie
ncy virus,Cell 55:1189−1193(1988))の文
献に記載の公知の産物、または、HIV−1 NefについてはAzad,A.
A.ら、(Large scale production and char
acterization of recombinant human im
munodeficiency virus type1 Nef,J.Gen
.Virol.75:651−55(1994))に記載の公知の産物のいずれ
かであるか、あるいは従来の方法で調製され得る。
、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントは、例えば、タンパク質
もしくはインターフェロンα、またはそれらのフラグメントの一つに対して惹起
される抗体を使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得
る。本発明のタンパク質、またはそのフラグメント、ならびにアフィニティーカ
ラムでリンカーとして作用することにより精製工程で補助する融合ペプチド(例
えば、ヒスチジンリッチオリゴペプチド)を含む融合タンパク質(FP)はまた
、合成され得る。カルボキシメチル化レトロウイルス調節タンパク質もしくはそ
のフラグメント、またはインターフェロンαタンパク質もしくはそのフラグメン
トを含む融合タンパク質は、本発明の別の実施態様である。
の手順についての別の実施態様において、この融合タンパク質は、以下: 例えば限外濾過法による濃縮工程; 例えばゲル濾過法による脱塩工程; 融合タンパク質を切断し、そしてそのタンパク質またはフラグメントを放出す
る、臭化シアン処理またはエンテロキナーゼ消化; 濃縮およびダイアフィルトレーション工程; 陽イオン交換クロマトグラフィー工程、および 限外濾過工程、続いて排除ゲル濾過によるによる濃縮工程、 に供され得る。
る臭化シアン作用は、存在するメチオニン残基のレベルでの切断の実行において
、選択的である。この反応は、メチオニン残基あたり2つのポリペプチドフラグ
メントの形成を生じる。この反応物は、記載のカルボキシメチル化反応物に有利
に組み合せられ得るが、不活性化するためには必要ではない。
質もしくはそのフラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメ
ントの調製についてのプロセスに関し、調節ウイルスタンパク質もしくはそのフ
ラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントがカルボキシ
メチル化される事実により特徴付けられ、次いでこの化合物は、所望される場合
、単離される。
に存在するチオール基を改変し得る。これらの基は、それぞれ、S−カルボキシ
メチル化またはS−カルボキシアミドメチル化におけるヨード酢酸またはヨード
アセトアミドと反応する。各々の場合の反応産物は、S−カルボキシルメチルシ
ステイニルまたはS−カルボキシメチルアミドシステイニル残基である。一般に
、チオール基の少なくとも1つは、カルボキシルメチル化反応により改変される
べきである。本発明の化合物を得るためには、実質的な免疫原性を保持し、実質
的な毒性を回避するために必要である程度の多くのチオール基が、カルボキシル
メチル化によって改変されるべきである。
イン残基は、鎖内または鎖間のジスルフィド架橋形成に関与し、そしてオリゴマ
ーの形成に寄与する。ヒト、ウシ、マウスおよびラットのインターフェロンαフ
ァミリーは、ジスルフィド架橋に関与する4つの保存的システインを含む(例え
ば、Spanjaard,R.A.ら、FEBS Lett.249:186−
88(1989)を参照のこと)。
ロモプロピオン酸、エチレンイミン、2−ブロモエチルトリメチルアンモニウム
ブロミド、2−ブロモエタンスルホネート、1,3−プロパンスルホン、ならび
に当業者に周知の他の試薬(例えば、Means,G.E.およびFeeney
,R.E,Chemical Modification of Protei
ns,Holden−Day,Inc.,San Francisco,CA(
1971)を参照のこと)を用いて実施され得る。
実施において、タンパク質またはそのフラグメントは、精製を可能にする化合物
と結合される。例えば、そのタンパク質またはそのフラグメントは、いくつかの
ヒスチジンを含むペプチドフラグメント、好ましくは4、5もしくは6、もしく
はより多くのヒスチジンをタンデムに含むペプチドフラグメントと融合され、そ
して精製工程のアフィニティーカラムのニッケル結合樹脂へ固定させる。好まし
い実施態様において、このオリゴペプチドは、精製の後切断される。
このタンパク質(またはフラグメント)の免疫原性を不利に改変しない場合、精
製後のその切断は必要ではない。しかし、好ましい条件下で、この化合物は、そ
れを除去するために切断される。
薬理的特性を有する。それらは、通常発揮する機能(例えば、免疫抑制効果、H
IV−1プロモータートランス活性化効果、Tat酸化効果、MDBK系に対す
る抗水疱性口内炎ウイルス(VSV)効果、またはインターフェロンαの免疫抑
制効果)に関して生物学的に不活性である。
和化抗体を用いる液性免疫応答、ならびに細胞性免疫応答の誘導を誘発する。
ための(すなわち、薬剤のように)、カルボキシメチル化タンパク質もしくはそ
のフラグメント、またはインターフェロンαもしくはそのフラグメントに関する
。
はウイルス(主にHIV−1、HIV−2、HTLV−1もしくはHTLV−2
のようなレトロウイルス)由来の調節タンパク質の効果によって誘発される有害
な効果の治癒的処置または予防処置において、有用性を見出す。
t、Nef、Vpr、およびVif)は、比較的よく保存された領域を有する。
特定の場合において、主に流行の地理的改変体に適応するために、同じ被験体が
可変性株由来のトキソイドで免疫化され得る。
経路(例えば、皮下、筋内、静脈内または経口)により投与され得る。投与は、
単回用量または特定の期間の後の1回以上の反復用量としてであり得る。
合物は、皮下経路または筋内経路を介して、このタイプの処置を必要とする被験
体における治療スケジュールの有効性について十分な量で、患者に投与される。
投与される用量は、3ヶ月の間毎月、次いで誘導された血清抗体に従って定期的
に(すなわち、2〜6ヶ月おきに)、エマルジョン形態(o/h)で筋内経路に
より50〜1000μgの範囲であり得る。
、筋内経路、静脈内経路、皮内経路のために、および経口経路のためにでさえ設
計された薬学的組成物にこのようにして組み込まれ得る。
的組成物に関する。これらの組成物において、活性成分は生理学的な有効用量で
有利に存在する;この組成物は、少なくとも1つの活性成分の効果的な免疫原性
用量を含む。免疫原性化合物は単独、または受容可能な薬学的賦形剤(例えば、
アジュバント)と混合されて投与され得る。
例えば、エマルジョン形態での注射可能な調製物)において、現在使用される薬
学的形態で存在する。それらは当該分野において公知の通常の方法により調整さ
れる。活性成分は、薬学的組成物において通常使用される賦形剤(例えば、水性
ビヒクル、リン酸カルシウム、およびアルミニウムなど)に組み込まれ得る。
エリキシル、または滅菌の溶液形態(例えば、溶液もしくは懸濁液)のような形
態で使用され得る。任意の非活性キャリア(例えば、生理食塩水、リン酸緩衝化
生理食塩水、またはタンパク質フラグメントもしくはペプチドまたは複合ワクチ
ン(conjugate vaccine)が、適切な可溶性特性を有するよう
な任意のキャリア)が好ましくは使用される。このワクチンは、単回用量調製物
の形態、または大量のワクチン接種プログラムについて使用され得る複数回用量
のフラスコの中に存在し得る。ワクチンを調製および使用する方法については、
Remington’s Pharmaceutical Sciences,
Mack Publishing Co.,Easton,PA,Osol(編
)(1980);およびNew Trends and Developmen
ts in Vaccines,Vollerら(編)、University
Park Press,Baltimore,MD(1978)に、参考が記
載される。
さらに含み得る。そのようなアジュバントは、フロイント完全アジュバント(F
CA)、ステアリルチロシン(ST、米国特許第4,258,029号を参照の
こと)、MDPとして公知のジペプチド、サポニン(米国特許第5,057,5
40号を参照のこと)、水酸化アルミニウム、およびリンパ性サイトカインのよ
うな種々の油性処方物を含むが、それらに限定されない。
ジョンである。フロイントアジュバントは強力であるが、それは通常ヒトに投与
されない。代わりに、ミョウバン(水酸化アルニミウム)アジュバントまたはS
Tが、ヒトへの投与について使用され得る。タンパク質フラグメントもしくはペ
プチドワクチンまたはそれらの複合ワクチンは、水酸化アルミニウム上に吸着さ
れ得、そこから、注射後に徐々に放出される。このワクチンはまた、Fulle
rton、米国特許第4,235,877号に従って、リポソーム内にカプセル
化され得る。
グメントとして含む、好ましくはTat由来の、本発明に従った薬学的組成物;
または (b)予防薬剤もしくは治療薬剤、抗−Tat抗体、F(ab’’)2または
Fabとして含む、カルボキシメチル化されたタンパク質またはそれらのフラグ
メントに対して免疫化された生物により産生される、本発明に従った薬学的組成
物。
薬学的に受容可能)と混合することにより特徴付けられる、上記の薬学的組成物
を調製するための工程に関する。
しくはインターフェロンαトキソイド、またはそれらの混合物、あるいは誘導体
または抗−Tat抗体)に加えて、さらに抗レトロウイルス特性を保有する別の
免疫原をさらに含み得る)に関する。
の膜貫通タンパク質GP41、もしくは当該分野において公知であるそれらのフ
ラグメント、ウイルス性カプシドgagタンパク質、またはpolタンパク質さ
えも含む。
/または細胞性応答の両方を含む)、少なくとも1つのカルボキシメチル化され
たレトロウイルスの調節タンパク質、もしくはインターフェロンαまたはそれら
のフラグメントを有する薬学的組成物あるいはワクチン組成物を、免疫応答を誘
導するのに十分な量で、受容可能な薬学的キャリアと共に投与する工程を包含す
る方法に関する。
受容可能な薬学的キャリアと共に、哺乳動物において抗体を惹起するのに十分な
量で、少なくとも1つのカルボキシメチル化されたレトロウイルスの調節タンパ
ク質、もしくはインターフェロンαまたはそれらのフラグメントを有する薬学的
組成物あるいはワクチン組成物を投与する工程を包含する。
る以下の実施例の参照を通して、より容易に理解される。そしてこの実施例は、
特に明記されないかぎり、本発明を限定することを意図されない。
ヒスチジンポリペプチドをコードする遺伝子フラグメントを順に含む)を含有す
るE.coli細菌株No.I−1964(1997年12月26日にColl
ection nationale de cultures de micr
o−organismes de Parisに寄託された)を、以下のように
培養した: 2mlのこの株の接種材料を、400mLの基本培養培地(5g/Lの酵母抽
出物、1g/Lのトリプトン、1g/LのNaCl)および40mLの溶液♯1
(CaCl22H2O:0.175g/L、MgSO47H2O;5.9g/L、グ
ルコース:6g/L)中で、250rpmで30℃で10時間インキュベートし
た。
70%飽和より低く溶解酸素レベルを維持する。650nmで測定される光学密
度がO.D.=6.0の値に到達した時点で、脱イオン水中の3.75%IPT
G(イソプロピル−β−D−チオガラクトシド)滅菌溶液の100mLを添加し
た。同時に、培地を滅菌25%酵母抽出物溶液で補給した。8.5g/LのMg
SO47H2O;300g/Lのグルコースおよび106g/Lの(NH4)2SO 4 を含む溶液をまた、グルコース濃度を約2g/Lまたはそれを超える濃度に維 持するために添加した。細菌集団をIPTG添加の4時間後に回収した。濾過工
程を、0.1M Tris;0.1M NaH2PO4、1mMジチオトレイトー
ル(pH8.0)の緩衝溶液に対して、向流濾過(0.3μm孔)により実施し
た。
通過後に溶解した。次いで、この溶解産物を5000rpmで15分間、4℃で
遠心した。次いで、固形尿素を最終濃度8Mまで上清液体に添加し、そしてpH
を8に調整した。次いで、アフィニティ−クロマトグラフィーを、600mLの
緩衝液A(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.1M Tris HCl、
1mM DTT、pH8)で予め平衡化されたNi−アガロースカラム(Qia
gen)上で実施した。
融合タンパク質を得るために溶出を非連続勾配で実施した。
000ダルトンの分子量切り捨てを伴うAmiconメンブレン上で濃縮した。
粗溶出画分は、期待通りHIV−1 Tatの組換え融合タンパク質を含んだ。
atからなる融合タンパク質(これは、精製工程についてNi−結合樹脂への結
合を可能にする)をこのようにして得た。次いで、この溶出画分をカルボキシメ
チル化反応に供した。
ンパク質を、8M尿素、0.3M Tris HCl、10mMジチオトレイト
ール(pH8.4)に取り入れるか、またはこれに調整する。
rt atmosphere)下で添加する。この溶液を、暗黒下および非活性
大気下で90分間37℃でインキュベートする。反応を1mLの98% β−メ
ルカプトエタノールを添加することによりブロックし、そしてこの溶液を80分
間、上記と同じ条件下でインキュベートする。
hold pore))上でAmicon濃縮器(カタログ番号8400)によ
り、濃度が10mg/mLになるまで濃縮した。
lufine GH25カラム(MATREX)で実施した。
チオニン位置でアミノ末端を切断するためにブロモシアンで処理した。ブロモシ
アンを、非活性大気下で、メチオニン1モル当たり約50モルのCNBrの比率
で、過剰に添加する。この溶液を密閉されたフラスコ中に24時間、37℃で貯
蔵/保存する。過剰のCNBrを減圧下で蒸発させる。
ブレンを有するダイアフィルターAmiconを使用することによって、酢酸/
酢酸ナトリウム0.05M緩衝溶液(pH5)に対してダイアフィルトレーショ
ンする。溶液中で得られた非活性産物の量は、約450mgである。
pharose FFカラムを通して濾過し、そしてその産物をNaCl勾配で
溶出した。
ンにより濃縮し、そして得られた画分を、リン酸緩衝液(pH7.4)で平衡化
されたSephacryl S(Pharmacia)カラムでのゲル濾過によ
り精製した。この最終産物を0.22μmメンブレンを通して濾過し、そして使
用まで4℃で保存した。
物の総量:150mg。
−PAGE)、銀染色。(Phast System、Pharmacia、同
質ゲル20%アクリルアミド):期待分子量の固有のバンド;より低いまたはよ
り高い分子量値の、他のバンドは全く検出されない。
、GELIEF 3−0):単一の明白なバンドが観察された。
イブリドーマ5G11由来のモノクローナル抗体:単一バンドが観察され、そし
て凝集物質または分解物質は、全く観察されなかった。
遺伝子の誘導):検出可能な活性は全く観察されなかった。
の標準エドマン技術によるN末端領域の配列決定:得られた最初の20のアミノ
酸は、期待される配列に一致した: Glu−Pro−Val−Asp−Pro−Arg−Leu−Glu−Pro−
Trp−Lys−His−Pro−Gly−Ser−Gln−Pro−Lys−
Thr−Ala (配列番号1)。
1mgあたり0.5未満の内毒素単位が観察された。
リル(sulphydryl)基を決定するためにエルマン試薬を使用した。;
ネイティブTatをカルボキシメチル化されたTatと比較することにより、0
.03%のシステインのみがカルボキシメチル化されたTatにおいて活性を残
存し、3330の不活性システインあたり1つの活性システインを生じた。
t分子を得るためにはは、数キログラムのTatタンパク質を有する必要がある
ことを示す。この不活化は、ほぼ完全であった。
ゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、RT−PCR法によってHIV−
1感染細胞からNef cDNAを得た。ヒスチジンリッチな遺伝子セグメント
を含む、実施例1において使用されたものと同一のプラスミド(これは、Ni−
カラムへの連結を可能にする)を、使用した。従って、この産生プロトコルおよ
び精製は、切断がCNBrの代わりにエンテロキナーゼ消化によって行われるこ
とを除いて、実施例1に記載されたものと同じである。得られた結果は、Tat
タンパク質について得られた結果と類似していた。
フェロンαタンパク質を、ヒスチジンリッチなペプチドをコードする遺伝子フラ
グメントを使用せずに、組換えDNA方法論によって直接産生した。αインター
フェロンを、抗インターフェロンαモノクローナル抗体を付着したカラムアフィ
ニティークロマトグラフィーによって精製した。
、即時に不活化した。
非抗ウイルス活性(MDBK細胞上のVSV)を示す生物学的試験を使用して、
生物学的不活化が完全であることを結論付けた。
末梢血細胞(PBMC)を、0〜10mg/mLの濃度のネイティブのTatタ
ンパク質またはトキソイドTatタンパク質とともに、血清を含まない培地中で
インキュベートした。2時間後、血清を添加して10%の最終濃度にし、そして
細胞をStaphylococcusエンテロトキシンB(SEB)を用いて、
または記憶抗原「Protein Purified Derived」(PP
D)によって刺激した。SEBについては3日後、またはPPDについては5日
後に、増殖を評価した。
観察されたが、減少は、トキソイドについては観察されなかった。
棒グラフは、実施例1の化合物(Tatトキソイド)に対応する。横軸において
、生成物濃度が、μg/mLで、0、1、3、および10として表される。縦軸
において、T細胞の増殖の百分率が示される。コントロールは、0μg/mLの
Tat濃度に対応する。この結果は、ネイティブのTatは細胞性の増殖を阻害
したが、実施例1の化合物は効果的でなかったことを示す。
免疫プロトコルは、古典的に使用されるものである: 完全フロイントアジュバント(100μL)を有する、20μgの生成物を含
むトキソイドのエマルジョン(1:1)を、0日目に、筋内経路によってマウス
に注射した。
35日目に注射した。マウス血清を−2、28および40日目に抽出し、そして
抗Tat抗体を、ネイティブの(化学的に処理していない)Tatタンパク質ま
たは実施例1の化合物で感作したプレート上でELISAによって評価した。血
清を、1:1000希釈液で試験した。得られた結果を、3匹の免疫されたマウ
ス(1〜3)および3匹の免疫されていないマウス(4〜6)について、光学密
度(OD)単位で表し、以下の表に示す:
ンパク質およびトキソイドを認識する抗体を産生したことを示す。
証明された。
LTRプロモーターの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ(CAT)をコードする)を含むプラスミドで安定にトランスフェクトした、
HeLa−HIV1−LTR−CAT細胞株の培養物に、免疫されたマウスまた
は免疫されていないマウス(0日目または40日目)由来の血清(1:50希釈
)とともに1時間プレインキュベートした、ネイティブのTatタンパク質また
はトキソイドTatタンパク質を供給した。ネイティブのTatタンパク質(5
μg/mL)は細胞に侵入し、そしてHIV−1由来のLTRに対するこのトラ
ンス活性化の効果を及ぼして、CATタンパク質発現を誘導した。
oehringer)試験によって決定した。結果を、OD単位で表す:
のタンパク質についての中和抗体を含んだことを示す。これは、免疫されていな
いマウス血清の場合にはあてはまらない。
生された抗体が薬理学的実験(1:50希釈)で使用される場合、ネイティブの
Tatタンパク質の免疫抑制効果は、ブロックされた。
のタンパク質を中和する免疫応答を誘導することを示す。
した。免疫プロトコルは、古典的に使用されるものである:マウスに、20μg
の産生物を含む完全フロイントアジュバントとの100μLのエマルジョン(1
:1)を0日目に筋肉内に注射し、そして不完全フロイントアジュバント(5μ
g)中の記憶抗原を、21日目、35日目、および45日目に注射した。マウス
血清を−2、28および50日目に抽出し、そして化学的に処理していない組換
えネイティブのIFNαか、またはトキソイドのいずれかで感作されたプレート
上でELISAによって分析した。
および3匹の免疫されていないマウス(4〜6)について、OD単位で表した結
果を、以下の表に示す:
タンパク質およびトキソイドを認識する抗体を産生したことを示す。さらに、マ
ウスが、免疫を十分に寛容化するので、これらの結果は、トキソイド免疫の無毒
性(innocuity)を確認する。
VSV試験によって証明された。通常は、細胞は、IFNαの1〜10単位の添
加によってVSV溶解耐性になる。インキュベーションがネイティブのIFNα
に関して1:50希釈でのマウス1または4(D0−D50)の血清とともに実
行された場合、溶解は、50日目でのマウス1の血清とともにプレインキュベー
ションしたネイティブのINFαの場合においてのみ、観察された。
ンパク質を中和する抗体の産生を誘導することを示す。
に使用した。古典的なプロトコルを使用した:完全フロイントアジュバント中で
20μgの生成物を含む、100μLのNefトキソイドの(1:1)エマルジ
ョンを、21日目および35日目に、マウスに筋肉内に感染させた。マウス血清
を、−2,28および40日目に抽出し、そして化学的に処理していないネイテ
ィブの組換えNefか、または実施例2のNefトキソイドのいずれかで感作し
たプレートを用いるELISAによって分析した。血清を、1:1000希釈に
おいて試験した。得られた結果を、3匹の免疫されたマウス(1〜3)および3
匹の免疫されていないマウス(4〜6)について、OD単位で表し、以下の表に
示す:
様式でネイティブのタンパク質およびトキソイドを認識する抗体を産生したこと
を示す。さらに、マウスが、免疫を十分に寛容化したので、これらの結果は、N
efトキソイド免疫の無毒性を確認した。
イド免疫されたマウスの効果) インビトロ誘導された免疫抑制の試験をまた、開発した。この試験は、以下の
様式で実施された: 健常な被験体由来の末梢血細胞(PBMC)を、HIV−1リンパ栄養(HI
V−HTLVIIIB)株によって感染させた。フィトヘマグルチニン(phy
tohemaglutinin)(PHA)刺激、およびインターロイキン−2
(IL−2)の存在下での6日間の培養後に、細胞を照射した。照射された細胞
は抑制性であり、SEBまたはPPDのような刺激抗原によって、PBMC増殖
を阻害し得る。逆転写酵素またはp24抗原アッセイが、上清液中で陰性であっ
たために、この免疫抑制効果は、照射後に残存するウイルスにつながらなかった
。
同様の様式で照射され、次いで、SEBまたはPPDによって刺激された細胞に
添加された場合、増殖の阻害は、少しも観察されなかった。この阻害効果は、H
IV−1ウイルスに起因した。J.F.Zaguryら(代理人の手書きの注記
)AIDSを導くHIV−1誘導免疫抑制におけるTatおよびIFNαの重要
な役割(Cell Pharmacol.AIDS Sciences 3:9
7〜103(1996))は、これらのタンパク質に対する中和抗体が抑制性細
胞形成を阻害するために、この抑制細胞の発生が、IFNαおよびTatタンパ
ク質の両方に依存することを記載する。
実施例1および3)を添加した同様の実験において、これらは、抑制細胞の生成
をブロックした。これは、免疫されていない(ネガティブコントロール)または
予備免疫されたマウス血清に関してあてはまらなかった。Tatトキソイド免疫
されたマウスの血清のみが使用された場合、この免疫抑制は、ブロックされなか
った。対照的に、IFNαトキソイド免疫されたマウスの血清は、免疫抑制の7
0%の阻害を生じる。
は、完全にブロックされた。これらの結果は、異なるウイルスバッチ、主に最初
の単離物を使用することによって得られた。これは、1つのトキソイドで得られ
たTatに対する抗体はまた、交差反応を示し得ることを示す。これらの結果(
J.F.Zaguryら(前掲書中)(1996)に記載される)は、AIDS
患者における免疫抑制状態に対する、組合されたTatおよびIFNαで免疫さ
れた血清の阻害効果を立証する。これらはまた、この免疫抑制におけるTatの
開始因子の役割およびIFNαの決定因子の役割を確証する(D.Zagury
ら、IFN and Tat involvement in the imm
unosuppression of uninfected T cells
and C−C−chemokine decline in AIDS P
roc.Natl.Acad.Sci.USA、1998 印刷中、を参照のこ
と)。
、細胞性免疫応答の誘導によるTatの産生に対して作用することによって、細
胞外Tatの効果を阻害する必要性を示す。
Nαトキソイドの免疫原性ならびに無害性;化学療法との適合性) 表1、2、および3は、ISA51(SEPPIC):本発明による100μ
gの活性剤を含む1mL容量の50:50エマルジョンにおいて、実施例1およ
び3のトキソイドを使用するフェーズ1臨床試験の間に得られた結果を記載する
。IFNαトキソイドに対する応答(データは示していない)は、ホルマリン化
(formolization)によって調製されたトキソイドに関して、Gr
ingeriら、J.AIDS 7:978〜988(1994)および13:
55〜67(1996)の論文に既に記載された応答と同様であった。 表1:フェーズ1臨床試験において含まれる患者の説明。 表2:開始時および終了時(一般に6ヶ月)での生物学的パラメーター。 表3:抗Tat特異的応答の分析。
イティブTatの効果の結果を示している。
Claims (25)
- 【請求項1】 カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質
またはそのフラグメントあるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラ
グメント。 - 【請求項2】 前記タンパク質またはそのフラグメントが、HIV−1また
はHIV−2からなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項1に記載の
タンパク質またはフラグメント - 【請求項3】 前記タンパク質またはそのフラグメントが、TatまたはN
efであるか、あるいはTatまたはNefに由来する、請求項2に記載のタン
パク質またはフラグメント。 - 【請求項4】 前記タンパク質またはそのフラグメントが、HIV−1のT
atタンパク質であるか、またはHIV−1のTatタンパク質に由来する、請
求項1に記載のタンパク質またはフラグメント。 - 【請求項5】 カルボキシメチル化された、レトロウイルス調節タンパク質
またはそのフラグメントあるいはインターフェロンαタンパク質またはそのフラ
グメントを含有する、融合ペプチド。 - 【請求項6】 前記融合タンパク質が、いくつかのヒスチジンを含む、請求
項5に記載の融合ペプチド。 - 【請求項7】 薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも1つの請求
項1に記載のタンパク質またはフラグメントを含有する、薬学的組成物。 - 【請求項8】 薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも1つの請求
項2に記載のタンパク質またはフラグメントを含有する、薬学的組成物。 - 【請求項9】 薬学的に受容可能なキャリアと共に、少なくとも1つの請求
項3に記載のタンパク質またはフラグメントを含有する、薬学的組成物。 - 【請求項10】 免疫学的に受容可能なキャリアと共に、免疫原性に有効量
の少なくとも1つの請求項1に記載の前記タンパク質またはフラグメントを含有
する、ワクチン組成物。 - 【請求項11】 さらに以下: (a)アジュバント; (b)抗レトロウイルス免疫原;または (c)それらの混合物 を含有する、請求項10に記載のワクチン組成物。
- 【請求項12】 前記抗レトロウイルス免疫原(b)が、HIV−1由来の
膜タンパク質GP160またはそのフラグメント、HIV−1由来の膜貫通タン
パク質GP41またはそのフラグメント、ウイルスカプシドgagタンパク質ま
たはpolタンパク質を含有する、請求項11に記載のワクチン組成物。 - 【請求項13】 実質的に免疫原性であるが、実質的に非毒性なレトロウイ
ルス調節タンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまた
はそのフラグメントを得るためのプロセスであって、以下: (d)該タンパク質もしくはインターフェロンαまたはそれらのフラグメント
を、カルボキシメチル化に供する工程;および (e)実質的に免疫原性であるが、実質的に非毒性なタンパク質もしくはイン
ターフェロンαまたはそれらのフラグメントを得る工程 を含む、プロセス。 - 【請求項14】 前記タンパク質またはそのフラグメントが、カルボキシメ
チル化の間、融合ペプチドの形態であって、ここで該融合ペプチドが、該タンパ
ク質またはそのフラグメントの精製を助ける、請求項13に記載のプロセス。 - 【請求項15】 前記融合ペプチドが切断される、請求項14に記載のプロ
セス。 - 【請求項16】 前記融合ペプチドがいくつかのヒスチジンを含む、請求項
14に記載のプロセス。 - 【請求項17】 前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメン
ト、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントが、組換えDNA技術
または化学合成により得られる、請求項13に記載のプロセス。 - 【請求項18】 前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメン
ト、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントが精製される、請求項
17に記載のプロセス。 - 【請求項19】 前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメン
ト、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメントがアフィニティークロ
マトグラフィーにより精製される、請求項18に記載のプロセス。 - 【請求項20】 前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメン
トが、HIV−1またはHIV−2からなる群から選択されるウイルスに由来す
る、請求項13に記載のプロセス - 【請求項21】 前記レトロウイルス調節タンパク質またはそのフラグメン
トが、TatまたはNefであるか、あるいはTatまたはNefに由来する、
請求項20に記載のプロセス。 - 【請求項22】 哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、該哺
乳動物に対して、請求項1に記載の、少なくとも1つのレトロウイルス調節タン
パク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグ
メントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において免疫応答を誘
導するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程を包
含する、方法。 - 【請求項23】 哺乳動物において体液性応答を惹起する方法であって、該
哺乳動物に対して、請求項1に記載の、少なくとも1つのレトロウイルス調節タ
ンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラ
グメントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において体液性応答
を惹起するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 【請求項24】 哺乳動物において細胞性応答を惹起する方法であって、該
哺乳動物に対して、請求項1に記載の、少なくとも1つのレトロウイルス調節タ
ンパク質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラ
グメントを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において細胞性応答
を惹起するために十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程
を包含する、方法。 - 【請求項25】 哺乳動物において抗体を惹起する方法であって、該哺乳動
物に対して、請求項1に記載の、少なくとも1つのレトロウイルス調節タンパク
質またはそのフラグメント、あるいはインターフェロンαまたはそのフラグメン
トを、薬学的に受容可能なキャリアと共に、哺乳動物において抗体を惹起するた
めに十分な量で含有する、有効量のワクチン組成物を投与する工程を包含する、
方法。
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