PT1042363E

PT1042363E - Novos imunogenes anti-hiv (toxóides), processos de preparação e de aplicação para a prevenção e para o tratamento do sida

Info

Publication number: PT1042363E
Application number: PT98959984T
Authority: PT
Inventors: Jean-Francois Zagury; Jay Rappaport; Miguel Carcagno
Original assignee: Neovacs
Priority date: 1997-12-26
Filing date: 1998-12-14
Publication date: 2006-11-30
Also published as: EP1042363B1; AU1568499A; US7022326B1; BR9814473A; EP1042363A1; AU1939799A; CY1106152T1; MXPA00006263A; EP1041888A4; WO1999033346A1; EP1041888A1; DK1042363T3; ATE412006T1; CA2316811A1; FR2773156B1; JP2001527029A; FR2773156A1; DE69840152D1; WO1999033872A1; ATE330970T1

Description

DESCRIÇÃO

NOVOS IMUNOGENES ANTI-HIV (TOXÓIDES) , PROCESSOS DE PREPARAÇÃO E DE APLICAÇÃO PARA A PREVENÇÃO E PARA O TRATAMENTO DO SIDA A Sida é induzida pela infecção pelo vírus HIV-1. Este vírus é composto por muitas proteínas. Entre estas proteínas, a Tat é, em conjunto com a proteína Nef, produzida muito precocemente no ciclo virai.

Para lutar contra os efeitos da proteína Tat foram propostas várias aproximações, tais como as aproximações genéticas para bloquear a acção transcripcional da Tat. Assim, os ensaios clínicos tiveram lugar com os antisense (sociedade Hybridon), as experiências in vitro mostraram a viabilidade dos ribozomas ou ainda de chamariz utilizando o ARN da região TAR (local de ligação da Tat ao ARNm).

Também foram descritas as moléculas farmacológicas inibidoras do efeito transcripcional da Tat.

Todos estes métodos visam bloquear a replicação do vírus bloqueando a acção transcripcional da Tat.

Os métodos imunológicos também foram propostos desde longa data.

Para uma inumização específica contra a proteína Tat nativa, a WO-A-91/18454 refere a utilização de polipéptidos de proteínas retrovirais, incluindo a proteína Tat nativa, obtidos através de cortes proteolíticos, de síntese química ou de recombinação genética, como imunogenes para prevenir a replicação retroviral e a actividade citotóxica, em particular, contra os linfócitos e as células nervosas, 1 exercida pelas proteínas retrovirais em particular a Tat. A toxicidade das proteínas nativas ou dos seus fragmentos impede a sua utilização para uma imunização. A WO-A-95/31999 refere a utilização da proteína Tat nativa de HIV-1, de fragmentos da referida proteína ou de polipéptidos com as delecções/substituições como imunogenes de modo a bloguear a replicação do HIV-1 blogueando a captura da proteína Tat extracelular pelas células não infectadas. Apesar da imunogenicidade descrita, tendo em consideração os efeitos tóxicos da proteína nativa Tat em particular, as desordens imunitárias que esta induz, e a ausência de anticorpos neutralizantes pela imunização com os imunogenes descritos nesta patente, há de facto a necessidade de desenvolver novos imunogenes Tat inactivos (que tenham perdido todos os efeitos nocivos da proteína Tat nativa) capazes de induzir uma resposta imunitária humoral e celular. A WO-A-96/27389 refere a utilização de novos produtos, os toxóides da Tat e as proteínas de regulação retrovirais como imunogenes capazes de induzir uma resposta imunitária contra a proteína Tat nativa e de prevenir ou reparar os seus efeitos imunosupressivos. Estes toxóides, produtos inactivos mais imunogénicos, foram preparados através do tratamento químico, com formaldeído, da proteína nativa ou de segmentos derivados desta proteína. Mas a inactivação com a ajuda de um aldeído é delicada. Para uma produção industrial, é preciso resultados regulares, em especial para a inactivação. Além disso, as agências de saúde preferem produtos de estrutura constante e bem definida para autorizar a sua colocação no mercado. Um produto ideal deverá, além disso, possuir uma boa estabilidade ao longo do tempo. 2 É por isso que o presente pedido tem por objecto novos toxóides e um novo método simples e eficaz para fabricar estes toxóides, em especial a partir das proteínas de regulação do HIV-1, que contribuem para o efeito imunosupressivo do HIV-1.

As estratégias dos toxóides possuem grandes vantagens sobre as substituições/delecções dos ácidos aminados: as regiões da proteína Tat nativa responsáveis pelos efeitos pleomorfos da Tat não estão bem identificadas e é difícil prognosticar as substituições/delecções que assegurem uma inocuidade total da preparação. Por exemplo as mutações do resíduo C25 em G revogam o efeito transactivador da Tat sem suprimir o seu efeito imunosupressivo. Por outro lado, as substituições/delecções podem alterar fortemente a estrutura da molécula modificada em relação à da molécula nativa (antigenes lineares e conformacionais) e impedir assim o desenvolvimento de uma reacção imunitária eficaz contra a molécula nativa. Este último ponto é particularmente importante para a formação de anticorpos neutralizantes contra a proteína nativa.

Logo, o presente pedido tem por objecto uma proteína de regulação virai ou um fragmento de proteína de regulação virai, de 8 a 11 ácidos aminados, caracterizados por serem carboximetilados através da reacção com o ácido iodoacético ou através da reacção com a iodoacetamida.

Nas condições preferenciais de realização da invenção, a proteína ou o fragmento acima provêm do vírus HIV-1, HIV-2, HTLV-1 ou HTLV-2 e em especial do vírus HIV 1 ou HIV 2. 3

Nas outras condições preferenciais de realização da invenção a proteína ou o fragmento acima é uma proteína de regulação virai ou um fragmento de proteína de regulação virai.

Ainda noutras condições preferenciais de realização da invenção a proteína ou o fragmento acima provêm da TAT em especial de HIV-1. 0 presente pedido tem também por objecto um processo de preparação de uma proteína ou de um fragmento, tal como definido acima, caracterizado pela referida proteína de regulação virai ou o referido fragmento serem sujeitos a uma carboximetilação, para se obter o composto esperado que é isolado.

De acordo com a invenção, as proteínas ou os fragmentos que se comportam como toxinas sobre o sistema imunitário, quer seja Tat ou Nef por exemplo, são modificadas pela carboximetilação. Esta modificação química conduz a novas proteínas ou fragmentos que são inactivos biologicamente mas que conservam a sua imunogenicidade. Por outras palavras, estas proteínas ou fragmentos que se comportam como toxinas sobre o sistema imunitário são reconhecidas pelos anticorpos produzidos contra as proteínas ou fragmentos carboximetilados de acordo com a invenção. Estas proteínas ou fragmentos carboximetilados conservam as propriedades imunogénicas suficientes para criar anticorpos que neutralizam ou que bloqueiam a referida proteína nativa e ao mesmo tempo perdem pelo menos 90 %, de preferência pelo menos 95%, em especial pelo menos 99 %, das propriedades biológicas tóxicas da referida proteína nativa, o que quer dizer das propriedades biológicas habituais bem conhecidas. 4 0 composto imunogénico carboximetilado, de acordo com a invenção, pode ser constituído pela totalidade ou por um fragmento, de 8 a 11 ácidos aminados, da proteína em especial de regulação e pode conter, como é bem conhecido dos peritos, uma ou várias modificações dos ácidos aminados dessa proteína ou fragmento, de modo que as delecções, as substituições, as adições, ou as funcionalizações, como a acilação dos ácidos aminados, na medida em que estas modificações permaneçam no quadro definido acima (ausência de toxicidade, características imunológicas) . Por exemplo, em geral a substituição de um resíduo de leucina por um resíduo de isoleucina não modifica essas propriedades. As modificações devem, em geral, dizer respeito a pelo menos 30 % dos ácidos aminados, de preferência pelo menos 20 % e de mais particularmente pelo menos 10 %.

Um fragmento pode comportar, por exemplo, de 8 a 110 ácidos aminados, de preferência de 12 a 60 ácidos aminados e em especial de 12 a 40 ácidos aminados. Este fragmento pode comportar também, do ou dos lados C ou N terminais, de 1 a 5 ácidos aminados suplementares, o que quer dizer diferentes do segmente de origem. Além disso, um fragmento deve comportar uma cisteína pelo menos para ser objecto da carboximetilação.

De um modo geral, no que diz respeito a estas modificações, a homologia ou semelhança entre o imunogene modificado e a proteína ou a parte da proteína nativa, bem como as dimensões do composto imunogénico, do mesmo modo que as modalidades de utilização, ou de junção do composto imunogénico de acordo com a invenção, a uma proteína imunogénica tal como o toxóide tetânico, pode referir-se em particular a WO-A-86/06 414 ou a EP-A-0.220.273 ou ainda a PCT/US.86/00831, equivalentes, cujo ensinamento é aqui incorporado por meio de referência. 5

Os compostos imunogénicos de acordo com a invenção que derivam de proteínas de regulação serão denominados abaixo, por vezes na parte experimental, de "toxóides virais".

Com efeito, tal como os toxóides bacterianos clássicos, são desprovidos de toxicidade própria, mas são, contudo, capazes de provocar uma imunização através da administração a um sujeito.

De modo a verificar que a proteína de regulação nativa é bem reconhecida pelos anticorpos dirigidos contra a referida proteína de regulação modificada, pode, por exemplo verificar imunologicamente por Elisa na presença de anticorpos específicos, a formação de complexos antigenes-anticorpos como se verá abaixo na parte experimental.

De modo a determinar de as propriedades imunogénicas da proteína de regulação foram suficientemente conservadas para criar os anticorpos de neutralização da referida proteína e, ratos) com o auxilio de um composto imunogénico de acordo com a invenção e verificar se os anticorpos produzidos neutralizam as actividades tóxicas da Tat.

De modo a determinar se a proteína de regulação modificada perdeu pelo menos 90% das suas propriedades biológicas tóxicas, pode, por exemplo no que diz respeito à Tat, estudar-se o efeito da Tat inactivada sobre a imunosupressão das células T ou sobre a neoangiogenése. A inactivação da proteína de regulação Tat é verificada, por exemplo, através do Tat Rescue Assay utilizando um mutante de HIV não infeccioso deficiente em Tat cultivado sobre a linha 6 celular HL-1 cuja replicação depende do contributo exógeno da Tat nativa. 0 composto imunogénico, de acordo com a invenção, pode derivar em especial de qualquer uma das proteínas de regulação dos vírus HIV-1, HIV-2, HTLV-1 ou HTLV-2 e em especial de Nef, Rev e de preferência da Tat dos vírus HIV-1 e HIV-2.

Pode assim citar-se a Tax de HTLV-1 ou de HTLV-2. 0 presente pedido tem igualmente por objecto um procedimento de preparação de uma proteína ou de um fragmento, tal como definido acima, caracterizado pela referida proteína de regulação virai ou o referido fragmento serem sujeitos a uma carboximetilação, através da reacção com o ácido iodoacético ou através da reacção com a iodoacetamida, para se obter o composto esperado que se isola se desejado. A reacção de carboximetilação permite modificar os grupos de tióis (grupos sulfidril) presentes ao nível dos resíduos de cisteínas da sequência em ácidos aminados. Estes grupos reagem como o ácido iodoacético ou com a iodoacetamida através de uma reacção de S-carboximetilação ou de S-carboxiamidometilação, respectivamente.

Por exemplo, a proteína Tat possui 7 cisteínas. Estas cisteínas participam na formação de pontes di-sulfureto inter e intra-cadeias e contribuem para a formação de oligómeros. 0 produto da reacção é, neste caso, um resíduo S- carboximetilcisteinico ou S-carboximetilamidocisteinilico. 7 A reacção de carboximetilação pode, assim, ser realizada com outros agentes químicos como o ácido perfórmico, o ácido 3-bromopropiónico, a etilenoimina, o brometo de (2-bromoetil) trimetilamónio, o sulfonato de 2-bromoetano, a 1,3-propanosulfona etc....

Nas condições preferenciais de colocação em prática do procedimento acima descrito, a referida proteína ou o referido fragmento de partida apresenta-se sob a forma fundida com um marcador (FP) quando é sujeito à carboximetilação.

As proteínas ou fragmentos de partida do procedimento são produtos conhecidos, descritos na literatura, por exemplo para a Tat de HIV-1 por Frankel A. D. et al. (Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus, Cell, 1988, 55: 1189-93) ou para a Nef de HIV-1, por Azad A. A. et al. (Large-scale production and characterization of recombinant human immunodeficiency virus type 1 Nef, J. Gen. Virol. 1994, 75: 651-55), ou podem ser preparadas da forma convencional.

Em particular, podem preparar-se as proteínas ou os fragmentos de partida abaixo por: 1) Síntese por engenharia genética ou por síntese bioquímica; 2) Purificação

Por engenharia genética, podem purificar-se as proteínas produzidas por cromatografia de afinidade utilizando, por exemplo, os anticorpos dirigidos contra a proteína ou um dos seus fragmentos; pode sintetizar-se também a proteína fundida com um marcador (FP) que servirá de adesão para uma coluna de

Nas outras condições preferenciais de colocação em prática do procedimento descrito abaixo, quando a proteína ou o fragmento está fundido com um marcador (FP), é submetido a: - Uma concentração, por exemplo, por ultrafiltração; - Um deslocamento, por exemplo, por filtração em gel; - Um tratamento com brometo de cianogénio ou de enteroquinase para clivar a proteína de fusão e libertar assim a proteína ou o fragmento; - Uma concentração e uma diafiltração; - Uma cromatografia de troca catiónica;

Uma concentração por ultrafiltração, seguida por uma filtração em gel de exclusão. A reacção com brometo de cianogénio abaixo permite clivar os tioéteres. A acção do brometo de cianogénio sobre as moléculas polipeptidicas é selectiva efectuando uma clivagem ao nível dos resíduos metionina existentes. Esta reacção tem como objectivo a formação de 2 fragmentos polipeptídicos por resíduo metionina. Esta reacção pode ser acoplada, de forma vantajosa, com a reacção de carboximetilação descrita anteriormente, mas não é necessária à inactivação.

Nas outras condições preferenciais de colocação em prática do procedimento descrito abaixo, prepara-se a proteína ou o(s) fragmento(s) esperado(s) acoplado(s) a um composto que permita a sua purificação, por exemplo a um fragmento peptídico que contenha várias histidinas, de preferência em sequência contínua de 4, 5, em especial de 6 histidinas, o que permite a fixação a uma coluna de Níquel. Na medida em que a presença deste composto não induz toxicidade nem modifica desfavoravelmente a imunogenicidade da proteína ou do fragmento, não é necessário clivar antes da purificação. 9

Todavia, nas condições de realização preferidas, faz-se a clivagem no composto para eliminar.

Os compostos, objecto da presente invenção, possuem propriedades farmacológicas muito interessantes. São biologicamente inactivos pelas funções gue exercem habitualmente como os efeitos imunosupressivos, os efeitos transactivadores do promotor do HIV-1, ou os efeitos oxidativos para a Tat. São imunogenes com os ratos mas também com o homem. Permitem em especial, a indicação de uma resposta imunitária humoral com os anticorpos neutralizantes e de uma resposta celular imunitária.

Estas propriedades são ilustradas aqui de seguida na parte experimental.

Estas justificam a utilização das proteinas ou dos fragmentos descritos abaixo bem como os seus sais de adição com os ácidos farmacologicamente aceitáveis, a titulo de medicamento. É por isso que a invenção tem também por objecto uma proteína ou um fragmento carboximetilado descritos abaixo, para a sua utilização num método de tratamento terapêutico do corpo humano, o que quer dizer a título de medicamento.

Os medicamentos de acordo com a presente invenção encontrar utilização por exemplo no tratamento tanto curativo como preventivo dos efeitos nocivos provocados por uma superprodução de uma proteína de regulação de um vírus, em especial de um retrovírus HIV-1, HIV-2, HTLV-1 ou HTLV-2. 10

As proteínas Tat e Nef possuem regiões relativamente bem conservadas. No entanto, se for caso disso poderá imunizar-se o mesmo sujeito com os toxóides preparados a partir de fontes variáveis, em especial para se adaptar às variantes geográficas da epidemia.

Os compostos imunogénicos de acordo com a invenção podem ser usados da seguinte forma:

Administra-se a um paciente um composto imunogénico, de acordo com a invenção, por exemplo por via subcutânea ou intramuscular, em quantidade suficiente para ser eficaz de acordo com o plano terapêutico, a um sujeito que necessita desse tratamento. A dose administrada pode estar compreendida, por exemplo de 50 a 1000 pg por via intramuscular sob a forma de uma emulsão e/h, uma vez por mês durante três meses, depois periodicamente em função da taxa dos anticorpos séricos induzidos, por exemplo todos os 2-6 meses.

Como medicamentos, as proteínas ou os fragmentos carboximetilados abaixo, podem ser incorporados nas composições farmacologicamente destinadas à administração oral e, em especial, parenteral.

Uma composição, de acordo com a invenção, pode ser administrada sem importar a forma de administração convencional usada no campo das vacinas, em particular por via subcutânea por via intramuscular, por via intravenosa ou por via oral. A administração pode ser de dose única ou repetida uma ou várias vezes num certo intervalo de tempo. 11 A invenção tem, assim, por objecto composições farmacêuticas que reforçam pelo menos um composto pré-citado, como principio activo.

Nestas composições, o principio activo está presente, de forma vantajosa, em doses fisiologicamente eficazes; as composições pré-citadas reforçam em especial uma dose imunogénica eficaz de pelo menos um principio activo. 0 composto imunogénico pode estar condicionado sozinho ou misturado com um excipiente farmacologicamente aceitável, tal como um adjuvante.

Estas composições farmacêuticas podem ser, em especial liquidas e apresentar-se sob as formas farmacêuticas correntemente usadas em medicina humana para as vacinas, como por exemplo as preparações injectáveis em especial sob a forma de uma emulsão; São preparadas através dos métodos usuais. 0 ou os princípios activos podem ser incorporados com os excipientes utilizados habitualmente nas composições farmacêuticas, tal como os veículos aquosos, o fosfato de cálcios, de alumínio... A invenção tem, em especial, por objecto na qualidade de composições farmacêuticas. a) Uma composição farmacêutica que compreende na qualidade de agente preventivo ou curativo um toxóide virai ou um fragmento ou análogo de proteína de regulação, em especial, da Tat, de acordo com a invenção. b) Uma composição farmacêutica que compreende na qualidade de agente preventivo ou curativo os anticorpos anti-Tat produzidos a partir de organismos imunizados contra a 12 referida proteína ou seus fragmentos F(ab') 2 ou Fab, de acordo com a invenção. A presente invenção tem ainda por objecto procedimento de preparação de uma composição acima descrita, caracterizada por se misturarem, de acordo com os métodos conhecidos por eles mesmos, o ou os princípios activos dos excipientes aceitáveis, em especial, farmacologicamente aceitáveis.

Por outro lado, a invenção tem por objecto um kit que compreende uma composição farmacêutica de vacina que além do principio activo (por exemplo toxóide-Tat ou dos seus derivados ou anticorpos anti-Tat) pode compreender um adjuvante e/ou um outro imunogene com propriedades anti-retrovírus.

Podem citar-se por exemplo como outro imunogene a proteína de envelope GP 160, em especial a glicoproteína tansmembranar GP 10 de HIV-1 ou os seus fragmentos conhecidos no estado da técnica, a proteína Gag da cápside virai, ou ainda a proteína Pol. A invenção tem por fim por objecto a utilização de uma proteína ou do fragmento carboximetilado acima descritos, para a obtenção de um medicamento destinado a uma utilização na qualidade imunogénica.

Os exemplos que se seguem ilustram o presente pedido. A figura 1 representa os resultados dos ensaios efectuados dos efeitos da Tat nativa comparados aos do produto do exemplo 1 sobre a proliferação dos linfócitos normais estimulados por um antigene de repetição. 13

Preparação A.

Cultiva-se 2 ml da bactéria colocada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de Paris a 26 de Dezembro de 1997 com o N° 1-1964 a qual é uma bactéria E coli na qual se inseriu, por transfecção, um plasmídeo recombinante que contém um gene que codifica um polipeptido que possui um fragmento constituído por 6 histidinas, associado ao gene da proteína Tat , em 40 0 ml de um meio de cultura de base (extracto de levedura 5g/l, triptona ig/i, cloreto de sódio lg/1) e 40 ml de uma solução 1 (CaCl2 2H20: 0, 175 g/i,

MgS047H20: 5,9 g/1, glucose: 6g/l). Encuba-se assim a cultura a 30 °C durante 10 horas a 250 tr/mn. A pré-fermentação acima é seguida de uma fermentação em condições análogas, mantendo o nível de oxigénio dissolvido em 70 % da saturação por através da regulação da agitação. Quando a densidade óptica medida a 650 nm atinge um valor de 6, junta-se 100 ml de uma solução estéril a 3,75 % de IPTG (isopropilo β-d-tiogalactopiranosido) em água desionizada. Ao mesmo tempo, suplementa-se o meio com uma solução estéril de extracto de levedura a 25 %. Adiciona-se, então, uma solução que compreende MgS047H20: 8,5 g/1, glucose: 300 g/1, (NH4)2S04: 106g/l, oligo-elementos, mantendo a concentração de glucose além de 2 g/1. Recolhe-se, então, a massa bacteriana 4 horas antes da introdução de IPTG. Realiza-se uma diafiltração contra um tampão tris 0,1 M, NaH2P04 0,1 M, ditrioteitol 1 Mm, pH 8,0, por filtração contracorrente (limiar 0,3 pm).

Três litros do produto bruto acima são lisados através de 4 passagens a uma sobrepressão de 500 bars. O lisado é, então, centrifugado durante 15 mn a 4 °C e 5000 tr/mn. Adiciona-se 14 então ao sobrenadante uma quantidade suficiente de ureia para se obter uma solução 8 M e ajusta-se o pH para 8.

Realiza-se, então, uma purificação através de cromatografia de afinidade numa coluna de niquel-NTA agarose (Qiagen) previamente equilibrada com 600ml de tampão A (ureia 8M, NaH2P04 0,1 M, tris-HCl 0,1 M, DTT 1 Mm, pH 8,0). Uma vez carregada, a coluna é lavada com 250 ml de tampão A. Faz-se a eluição da proteína usando um gradiente descontínuo para se obter a proteína fundida pretendida.

Concentra-se a solução assim obtida sobre uma membrana Amicon com limiar de corte de 3000 daltons para se obter uma concentração final de 10 mg/ml. Obtém-se, assim, um eluato bruto que possui a desejada proteína recombinante fundida Tat de HIV-1.

Produziu-se assim uma proteína de fusão Tat fundida geneticamente com um fragmento peptidico rico em histidinas que permitem a sua ligação ao níquel com vista a uma purificação. O eluato assim obtido será submetido à reacção de carboximetilação.

Exemplo 1: Preparação de toxóide Tat

Estado A: Carboximetilação

Ajusta-se uma solução da proteína TAT fundida a um fragmento peptidico rico em histidina preparado como na preparação 1 acima para se obterem as seguintes concentrações: Ureia 8M, TrisHCl 0,3M, Ditrioteitol, 10 mM, pH 8,4. 15

Sob atmosfera, adiciona-se 2,6 g de ácido iodoacético a 100 ml da solução acima. Esta solução é incubada a 37 °C ao abrigo da luz e sob atmosfera inerte durante 90 mn. A reacção é bloqueada através da adição de 1 ml de β-mercaptoetanol a 98% e a incubação é feita durante 60 mn nas mesmas condições acima. A solução resultante da etapa precedente é concentrada com a ajuda de um concentrador Amicon (Cat#8400) sobre uma membrana YM3 (limiar de 3000 D) até uma concentração de 10 mg/ml.

Desloca-se então através da passagem por uma coluna Cellufine GH25 (MATREX) equilibrada com o auxilio de 300 ml de uma solução de ureia 4M, HCI 0,1 M.

Estado B - Purificações 0 eluato é, então, ultrafiltrado e tratado com brometo de cianogénio para clivar ao nivel da metionina a parte amino terminal do produto carboximetilado. O brometo de cianogénio é adicionado em excesso sob atmosfera inerte, na proporção de cerca de 50 moles de brometo de cianogénio por mole de metionina. Esta solução é conservada num recipiente fechado durante 24h a 37 °C. O excesso de brometo de cianogénio é retirado por evaporação sob pressão reduzida. A solução obtida é, então concentrada, diafiltrada contra o tampão de ácido acético- acetato de sódio 0,05M, pH 5 utilizando um diafiltro Amicon munido de uma membrana YM3 (limiar de 3000 KD) . A quantidade de produto inactivo obtida em solução é da ordem de 450 mg. 16

Esta solução é filtrada numa coluna de troca iónica SP-Sépharose FF previamente equilibrada com 200 ml de tampão A e o produto é eluido com um gradiente de NaCl. 0 eluato é, de novo, concentrado por diafiltração no mesmo sistema Amicon, e a fracção obtida é purificada por filtração gel sobre uma coluna de Sephacryl S (Pharmacia) equilibrada com o tampão fosfato pH 7,4. O produto final é filtrado com uma membrana de 0,22 pm e armazenado a 4 °C até à utilização

Este produto foi submetido às análises acima, e foi objecto de testes farmacológicos.

Análises - Quantidade total de produto inactivo doseado pelo teste de Bradford: 150 mg. - Electroforese em gel de poliacrilamida SulfoDodecilSulfato-PAGE, agente de coloração (Phast System, Pharmacia, gel homogéneo a 20%) : banda única com um peso molecular compatível com o que é aqui pretendido. Não se detectaram outras bandas a pesos superiores ou inferiores. - Electroforese por gradiente isoeléctrico (Phast System, Pharmacia, GEL IEF 3-9): só uma banda visível.

Western Blot (Phast System. Pharmacia, anticorpos monoclonais do hibridoma 5G11): só foi observada uma banda e a ausência de material agregado ou degradado. - Actividade biológica (indução do gene CAT na linha HELA-HIV-l-LTR CAT): nenhuma actividade detectável. - Sequenciação da parte N-terminal usando a técnica padrão de sequenciação de Edman com um sequenciados Applied Biosystems (modelo 477A): os primeiros 20 aminoácidos coincidem com a sequência pretendida 17 E-P-V-D-P-R-L-E-P-W-K-H-P-G-S-Q-P-K-T-A Endotoxinas (teste LAL de acordo com o protocolo USP XXIII): menos de 0,5 unidades endotóoxicas por mg de proteína.

Esterilidade (de acordo com o protocolo USP XXIII): responde às normas. - medida do grau de substituição: utilizando o reagente de Ellman para determinar os grupos sulfidrilos livres em comparação com uma curva padrão que mede as cisteínas. Comparando a Tat nativa com a Tat carboximetilada, encontrou-se que apenas 0,03 % das cisteínas permanecem activas na Tat carboximetilada, ou seja 1 cisteína activa por 3330 cisteínas inactivas. Um cálculo simples mostra que para haver uma molécula de Tat com 7 cisteínas activas nestas condições, eram necessários muitos kg de proteína Tat. A inactivação é, deste modo, quase total.

Exemplo 2. Preparação do toxóide Nef.

Para a clonagem, são as Nef que são utilizadas para se obter o gene Nef por RT-PCR a partir do ARN de células infectadas pelo VIH-1. É de seguida o mesmo plasmídeo com o mesmo segmento fundido rico em lisina que permite a ligação sobre a coluna de níquel que é utilizada. O protocolo de produção e de purificação é, deste modo, o mesmo que o do exemplo 1 mas o corte é realizada através da acçao da enteroquinase e não do brometo de cianogénio.

Os resultados da análise são semelhenates aos obtidos com a proteína Tat.

Exemplo 3. Preparação do toxóide IFNa. 18

Desta vez o plasmídeo não utiliza uma proteína de fusão. A proteína é produzida tal e qual por engenharia genética sem o segmento fundido, e é purificada usando uma coluna de cromatografia à qual estão ligados os anticorpos monoclonais anti-IFNa. Uma vez eluida, a proteína é imediatamente inactivada de acordo com o mesmo protocolo que foi aqui descrito no exemplo 1.

Os resultados da análise são idênticos aos obtidos com a proteína Tat com um teste biológico que mostra uma actividade antiviral nula (vírus VSV sobre as células MDBK): a inactivaçãobiológica é total.

ESTUDO FARMACOLÓGICO 1) Ausência do efeito imunosupressivo do toxóide Tat.

Existe um teste simples que mostra o efeito imunosupressivo da proteína Tat nativa. Faz-se a incubação de células do sangue periférico (PBMCs) em meio sem soro com a proteína Tat nativa ou com o toxóide Tat com concentrações que variam de 0 a 10 mg/ml. Após 2h de contacto, o soro é adicionado a uma concentração final de 10% e as células são estimuladas da forma habitual por Enterotoxina B Staphylococcus (SEB) ou por um antigene de repetição Protein Purified Derived (PPD). Mede-se a proliferação após 3 dias SEB ou 5 dias PPD.

Verificou-se que a proliferação diminui de forma dependente da dose para a Tat nativa o que não acontece para o toxóide.

Na figura lm as 4 barras da esquerda correspondem à Tat nativa e as 4 barras da direita correspondem ao composto do exemplo 1 (toxóide Tat). Os dígitos na abcissa são as 19 concertações de produto em pg/ml, respectivamente 0, 1, 3, 10 pg/ml. As ordenadas precisam a proliferação das células T em percentagem. O controlo corresponde a uma concentração de Tat usada igual a 0. Verificou-se que a Tat nativa inibe a proliferação celular enquanto que o composto do exemplo lnão tem efeito. 2) Imunogenicidade do toxóide Tat no rato, produção de anticorpos de neutralização. O Tat toxóide preparado de acordo com o exemplo lfoi utilizado para imunizar rato. O protocolo de imunização é o usado geralmente: injecta-se por via intramuscular (im) nos ratos 100 μΐ de emulsão (1:1) em adjuvante completo de Freund que contém 20 pg de produto no dia 0 com repetição em adjuvante incompleto de Freund de 5 pg nos dias 21 e 35. O soro dos ratos é antecipado aos dias -2, 28 e 40 e os anticorpos anti-Tat são medidos por ELISA sobre as placas sensibilizadas com a proteína Tat recombinante nativa (não tratada quimicamente) ou com o composto do exemplo 1. Os soros foram testados numa diluição de 1/1000. Os resultados obtidos, expressos em densidade óptica, sobre 3 ratos imunizados (1 a 3) e 3 ratos não imunizados (4 a 6) são apresentados na tabela seguinte:

Tat nativo Tat toxóide Rato 1 D -2 0,3 0,3 D 28 1,6 1,5 D 40 2 2,1 Rato 2 D -2 0,2 0,3 D 28 1,9 1,8 D 40 2,2 2,2 20

Rato 3 D -2 0,4 0,4 D 28 1,7 1,5 D 40 1,9 2,2 Rato 4 D -2 0,2 0,2 D 28 0,3 0,2 D 40 0,3 0,3 Rato 5 D -2 0,4 0,4 D 28 0,4 0,3 D 40 0,3 0,3 Rato 6 D -2 0,3 0,3 D 28 0,4 0,3 D 40 0,3 0,3

Estes resultados mostram que os ratos imunizados com o toxóide que produz os anticorpos que reconhecem da mesma forma a proteina nativa e o toxóide.

Esses anticorpos são os mais neutralizantes. Isto foi estabelecido com a ajuda de 2 testes diferentes: 0 teste de inactivação da proteina Tat. 0 Adiciona-se às células em cultura da linha HELA-HIV-l-LTR-CAT, que foram transfectadas de forma estável com um plasmideo que contém o Long Terminal Repeat (LTR) do HIV-1 como promotor do gene Cloranfenicol Acetil Transferase (CAT), da proteina Tat nativa ou do toxóide Tat, ou da proteina Tat nativa pré-incubada 1 hora com o soro (diluição de 1/50) de rato (DO ou D 40) imunizados ou não imunizados. A proteina Tat nativa a 5 pg/ml penetra nas células e vai jogar o seu papel transactivador sobre a LTR do HIV-1 e induzir a expressão da proteina CAT. Após 48H, as células são lisadas e a quantidade 21 de proteína CAT presente é medida através de um teste ELISA (Boehringer).Os resultados são expressos em densidade óptica: N° de ratos / dia DO (medida da proteína CAT) Tat nativa 1,4 Tat toxóide 0,2 Tat nativa + soro de rato 2 / D 0 1,5 Tat nativa + soro de rato 6 / D 0 1,3 Tat nativa + soro de rato 2 / D 40 0,3 Tat nativa + soro de rato 6 / D 40 1,4

Estes resultados mostram que o soro do rato imunizado (rato 2) contém anticorpos que neutralizam a proteína Tat nativa, o que não acontece com o soro de um rato não imunizado.

Do mesmo modo, se forem utilizados os anticorpos produzidos pelos ratos imunizados com o toxóide no teste de imunosupressão descrito no estudo farmacológico 1) acima (diluição de 1/50), bloqueia-se o efeito imunosupressivo da proteína Tat nativa.

Todos estes resultados demonstram que o composto do exemplo 1 é imunogénico e permite induzir uma resposta imunitária que neutraliza a proteína nativa. 3) Imunogenicidade do toxóide IFNa no rato, produção de anticorpos neutralizantes. O toxóide IFNa preparado de acordo com o exemplo 3 foi usado para imunizar os ratos. 0 protocolo da imunização é o utilizado classicamente: os ratos são injectados (em im) com 22 100 μΐ de emulsão (1:1) em adjuvante completo de Freund que conte, 20 pg de produto no dia 0 com repetição em adjuvante incompleto de Freund de 5 pg nos dias 21, e 35, 45. O soro dos ratos é retirado antecipadamente nos dias -2, 28 e 50 e é analisado através de ELISA sobre as placas sensibilizadas com a proteína IFNa recombinante nativa (não tratada quimicamente) ou com o toxóide. Os soros foram testados a uma diluição de 1/1000. Os resultados obtidos em densidade óptica em 3 ratos imunizados (1 a 3) e em 3 ratos não imunizados (4 a 6) são apresentados na tabela seguinte: IFNa nativo IFNa toxóide Rato 1 D -2 0,3 0,3 D 28 1 0,9 D 50 2,1 2,1 Rato 2 D -2 0,2 0,3 D 28 1,2 1,1 D 50 1,9 2 Rato 3 D -2 0,4 0,4 D 28 O co 0,9 D 50 2 2,1 Rato 4 D -2 0,1 0,1 D 28 0,2 0,2 D 50 0,1 0,1 Rato 5 D -2 0,2 0,2 D 28 0,2 0,2 D 50 0,2 0,3 Rato 6 D -2 0,3 0,3 D 28 0,2 0,3 D 50 0,3 0,3 23

Estes resultados mostram que os ratos imunizados pelo toxóide produzem os anticorpos de reconhecimento do mesmo modo da proteína nativa e do toxóide. Por outro lado isto confirma a inocuidade da imunização pelo toxóide IFNa porque os ratos toleraram muito bem a imunização.

Estes anticorpos são os mais neutralizantes. Isto foi estabelecido pelo teste clássico do vírus VSV sobre as células MDBK. Normalmente adicionando de 1 a 10 unidades de interferão, determinam-se as células resistentes à lise pelo vírus VSV. Incubando o IFNa nativo com o soro do rato 1 ou 4 (D 0, D 50) diluídos de 1/50, a lise só é observada quando o IFNa nativo estiver pré-incubado com o soro do D 50 do rato 1.

Este exemplo demonstra que o composto do exemplo 3 é imunogénico, com formação de anticorpos de neutralização. 4) Imunogenicidade do toxóide Nef no rato. 0 toxóide Nef preparado de acordo com o exemplo e foi usado para imunizar os ratos. O protocolo da imunização é o utilizado classicamente: os ratos são injectados por via im com 100 μΐ de emulsão (1:1) em adjuvante completo de Freund que contém 20 yg de produto no dia 0 com repetição em adjuvante incompleto de Freund de 5 yg nos dias 21, e 35. O soro dos ratos é retirado antecipadamente nos dias -2, 28 e 40 e é analisado através de ELISA sobre as placas sensibilizadas com a proteína Nef recombinante nativa (não tratada quimicamente) ou com o toxóide do exemplo 2. Os soros foram testados a uma diluição de 1/1000. Os resultados obtidos, expressos em densidade óptica, em 3 ratos imunizados (1 a 3) e em 3 ratos não imunizados (4 a 6) são apresentados na tabela seguinte:

Nef nativo Nef toxóide Rato 1 D -2 0,1 0,1 D 28 1 0,9 D 50 2,1 2,1 Rato 2 D -2 0,1 0,1 D 28 1,5 1,4 D 50 1,9 2 Rato 3 D -2 0,1 0,1 D 28 0,8 0,9 D 50 1,6 1,6 Rato 4 D -2 0,1 0,1 D 28 0,1 0,1 D 50 0,1 ι—1 O Rato 5 D -2 1—1 O 0,1 D 28 0,1 0,1 D 50 0,1 0,1 Rato 6 D -2 ι—1 O 0,1 D 28 0,1 0,1 D 50 0,1 0,1

Estes resultados mostram que os ratos imunizados pelo toxóide do exemplo 2 produzem os anticorpos de reconhecimento do mesmo modo da proteína nativa e do toxóide. Por outro lado isto confirma a inocuidade da imunização pelo toxóide Nef porque os ratos toleraram muito bem a imunização. 5) Efeito dos anticorpos dos ratos imunizados com os toxóides Tat e IFNa na infecção pelo HIV-1 in vitro. 25

Desenvolveu-se um teste de imunosupressão induzida pela infecção por HIV-1 in vitro. Este teste foi realizado da seguinte forma:

As células do sangue periférico (PBMCs) de um sujeito são foram infectadas por uma fonte de HIV-1 linfotrópica (HIV-HTLVIIIB). Após a estimulação por Fitohemaglutinina (PHA) e cultura durante 6 dias em presença de interleuquina-2, irradiaram-se as células. As células irradiadas são supressivas porque são capazes de inibir a proliferação das PBMCs autologas estimuladas pelos antigenes como o SEB ou o PPD. Este efeito imunosupressivo não está ligado ao do vírus residual após a irradiação porque os testes de dosagem de transcriptase inversa ou do antigene p24 nos sobrenadantes foram negativos. Se for realizada uma preparação de células sem vírus (controlo), irradiadas da mesma forma 6 dias após a estimulação dom PHA, acrescentando as células autologas estimuladas por SEB ou por PPD, não se observa nenhuma inibição da proliferação. 0 efeito inibidor é devido ao vírus HIV-1. J F Zagury et al, (Cell Pharmacol AIDS Sciences, 1996, Vol. 3, P. 97-103, A criticai role of the Tat and IFNa in theHIV-1 induced immunosuppression leading to AIDS) descreve que a génese destas células supressivas depende ao mesmo tempo de IFNa e da proteína Tat porque os anticorpos que neutralizam estas 2 proteínas inibem a formação de células supressivas. Quando numa experiência deste tipo, se adiciona em simultâneo os soros (diluídos de 1/50) dos ratos imunizados com os produtos descritos nos exemplos 1 e 3 (toxóide Tat e toxóide IFNa), estes soros bloqueiam a formação de células supressivas. O que não acontece com os soros dos ratos não 26 imunizados (controlo negativo) ou com os soros retirados antes da imunização. Se for utilizado o soro de ratos imunizados apenas com o toxóide Tat, não se bloqueia mais a imunosupressão. Pelo contrário, quando se utiliza o soro de rato imunizado com o toxóide IFNa, a inibição da supressão é de 70%. Se forem combinados os 2 soros anti-Tat e anti-IFNa, bloqueia-se completamente a génese das células supressivas. Estes resultados foram obtidos usando diversos lotes de vírus, em especial dos isolados primários. Isto mostra que os anticorpos anti-Tat obtidos com um só toxóide podem quanto muito possuir uma reactividade cruzada.

Estes resultados, descritos por J F Zagury et al. (Cell Pharmacol AIDS Sciences, 1996, Vol. 3, P. 97-103, A criticai role of the Tat and IFNa in the HIV 1 induced immunosuppression leading to AIDS), confirmam o efeito inibidor combinado da Tat e de IFNa do estado imunosupressivo nos pacientes com SIDA. Além disso, confirmam o papel iniciador da Tat e o papel determinante de IFNa nesta imunosupressão (consultar a publicação D. Zagury et al. (IFN and Tat involvement in the immunosuppression of uninfected T cells and C-C chemokine decline in AIDS, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998, em impressão). Os resultados destes trabalhos demonstram a necessidade de lutar contra a proteína Tat extracelular através da indução de uma resposta dos anticorpos neutralizantes intervenientes, se possível, desde a produção da Tat através da indução de uma resposta imunitária celular. 6. Imunogenicidade e inocuidade dos toxóides Tat e IFNa, combinados ou não, no homem. Compatibilidade com as quimioterapias. 27

As Tabelas 1, 2, 3 descrevem os resultados obtidos no momento de um ensaio de fase 1 utilizando os toxóides dos exemplos 1 e 3 em emulsão 50-50 com ISA 51 (SEPPIC): volume de 1 ml que contém 100 pg de agente activo de acordo com a invenção. As respostas do toxóide IFNa (dadas, não mostrada aqui) são semelhantes às já descritas nas publicações de Gringeri et al. em JAIDS 1994, Vol. 7, 978-988 e 1996, Vol. 13, 55-67 sobre um toxóide, realizados por formulação.

Tabela 1: descrição dos pacientes incluindo no ensaio de fase 1.

Tabela 2: parâmetros biológicos no tempo inicial e final (em geral de 6 meses).

Tabela 3: análise da resposta especifica anti-Tat.

Tabela 1

Demografia dos pacientes imunizados contra a Tat de HIV-1, idade no momento da seroconversão e do tratamento antiretroviral Código Idade Sexo Factor de risco Idade no momento da seroconversão Tratamento antiviral Imunização Anti-IFNa com proteínase 1 25 M Hemofilia 12 0 0 0 2 39 M Hemofilia 26 N N N 3 33 F Parceiro sexual 26 0 0 0 4 38 M Hemofilia 23 N N 0 5 25 M Hemofilia 12 N N N 6 31 M Hemofilia 19 0 N N 7 19 M Hemofilia 7 N N 0 8 35 M Hemofilia 22 0 N 0 28 9 26 M Hemofilia 15 N N N 10 38 M Heraofilia 26 N N N 11 26 M Hemofilia 14 0 0 N 12 33 M Hemofilia 20 0 0 N 13 40 F Parceiro sexual 36 N N N 14 28 F Parceiro sexual 20 N N 0

Tabela 2

Contagem das células CD4 em valor absoluto, viremia de HIV-1 e antigenemia dos 14 pacientes seropositivos imunizados com os produtos dos exemplos 1 ou 3 Código Nos meses Contagem das células CD4 em células/mm3 Viremia de HIV-1 Antigenes anti-HIV Antes Depois Basal Depois Basal Depois 1 8 284 (28,4%) 345 (34,5%) 5, 75 5, 71 11 4 2 8 453 (16,8%) 434 (18,4%) 2,06 2,15 32 3 3 12 227 (28,4%) 345 (34,5%) 0,35 <0,005 17 4 4 3 287 (22,1%) 252 (21,0%) 0, 49 0, 70 3 3 5 5 282 (28,2%) 319 (22,8%) 3,34 0,91 4 4 6 9 224 (11,8%) 294 (12,8%) 5,23 3,90 3 3 7 3 313 (24,1%) 443 (23,3%) 5,39 5, 55 4 4 8 4 275 (30,6%) 314 (31,4%) 4, 12 3,18 5 4 9 6 274 (8,3%) 386 (9,9%) 5, 08 5, 74 4 5 10 8 295 (22,7%) 372 (26,6%) 4, 02 3,9 5 4 11 4 219 (16,9%) 235 (23,5%) 4, 01 <1 8 3 12 12 272 (20,9%) 340 (30,9%) 4, 74 2,30 n . a. 4 13 9 435 (33,5%) 478 (28,1%) 4,30 4,07 3 4 14 3 257 (13,5%) 274 (13,7%) 2,05 2,90 3 3 29

Tabela 3

Imunogenicidade da imunização anti-Tat do HIV-1 dos pacientes com HIV-1 seropositivos Código do paciente Imunização tipo (A/B) Resposta dos anticorpos anti-Tat Anticorpos anti-Tat (en unidades de densidade óptica Resposta HSR Resposta CMI Basal Pic 1 B 0 0, 240 1,230 n . a n . a 2 A 0 0, 104 1,526 n . a POS 3 B 0 0, 207 0,537 NEG NEG 4 B 0 0, 214 1,063 POS n. a 5 A 0 0, 446 1,612 n . a n. a 6 A 0 0, 213 0,664 NEG NEG 7 A 0 0, 204 1, 139 n . a n. a 8 B 0 0, 104 1,045 POS POS 9 A 0 0, 422 0, 812 NEG n. a 10 B 0 0, 125 1,492 n . a n. a 11 A 0 0, 252 0,682 NEG n. a 12 A 0 0, 410 2,219 POS POS 13 A 0 0, 162 0, 508 POS POS 14 B 0 0, 120 2,012 n . a n. a HSR: Hipersensibilidade retardada CMI: Imunidade para a mediação celular. 15-09-2006 30

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Proteína ou fragmento de proteína com 8 a 110 aminoácidos, caracterizada por estes serem carboximetilados através da reacção com o ácido iodoacético e além disso uma proteína de regulação virai ou um fragmento proteína de regulação virai.
2. Proteína ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo vírus ser o HIV-1 ou o HIV-2.
3. Proteína ou fragmento de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser uma proteína de regulação virai ou um fragmento de proteína de regulação virai.
4. Proteína ou fragmento de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por ser proveniente da Tat.
5. Procedimento de preparação de uma proteína ou fragmento tal como definidos na reivindicação 1, caracterizado por se submeter a referida proteína ou o referido fragmento a uma carboximetilação através da reacção com o ácido iodoacético, para se obter o composto desejado que se isola.
6. Procedimento de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida proteína ou pelo referido fragmento se apresentarem sob a forma fundida com um marcador (FP) aquando da carboximetilação.
7. Procedimento de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo marcador ser clivado após purificação.
8. Procedimento de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo marcador compreender um composto peptídico que compreende várias histidinas. 1
9. Proteína ou fragmento de acordo com a reivindicação 1, para serem utilizados num método de tratamento terapêutico do corpo humano ou animal.
10. Proteína ou fragmento de proteína com 8 a 110 aminoácidos da proteína Tat do HIV-1 carboximetilada, através da reacção com o ácido iodoacético, para a sua utilização num método de tratamento terapêutico do corpo humano ou animal.
11. Composição farmacêutica caracterizada por conter na qualidade de princípio activo um ou pelo menos uma das proteínas ou fragmentos carboximetilados, tal como definido na reivindicação 1, assim como um excipiente farmacologicamente aceitável.
12. Composição farmacêutica caracterizada por conter na qualidade de princípio activo um ou pelo menos das proteínas ou fragmentos, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 4, assim como um excipiente farmacologicamente aceitável.
13. Vacina caracterizada por conter na qualidade de princípio activo um ou pelo menos uma das proteínas ou fragmentos tal como definido na reivindicações 1 a 4.
14. Proteína caracterizada por ser obtida por carboximetilação através da reacção com a iodoacetamida e de uma proteína de regulação virai.
15. Proteína de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo vírus ser HIV-1 ou HIV-2. 2
16. Proteína de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizada por consistir na proteína Tat.
17. Procedimento de preparação de uma proteína de acordo com uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado por se submeter a referida proteína a uma carboximetilação através da reacção com a iodoacetamida, para se obter o composto desejado que se isola.
18. Procedimento de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela referida proteína se apresentar sob a forma fundida com um marcador (FP) aquando da carboximetilação.
19. Procedimento de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo marcador ser clivado após purificação.
20. Procedimento de acordo com uma das reivindicações 18 e 19, caracterizado pelo marcador compreender um composto peptídico que compreende várias histidinas.
21. Fragmento de proteína com 8 a 110 aminoácidos, caracterizado por ser obtido por carboximetilação através da reacção com o ácido iodoacético e em que seja um fragmento de uma proteína de regulação virai, o referido fragmento apresenta-se sob a forma fundida com um marcador (FP) aquando da carboximetilação.
22. Fragmento de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo marcador compreender um composto peptídico que compreende várias histidinas. 3
23. Proteína ou fragmento de acordo com as reivindicações 14 a 16 e 21 a 22, para a utilização num método de tratamento terapêutico do corpo humano ou animal.
24. Composição farmacêutica caracterizada por conter na qualidade de princípio activo pelo menos uma proteínas ou um fragmento de proteína tal como definido numa das reivindicações 14 a 16 e 21 a 22, assim como um excipiente farmacologicamente aceitável.
25. Vacina caracterizada por conter na qualidade de princípio activo pelo menos uma proteínas ou um fragmento de proteína, tal como definido numa das reivindicações 14 a 16 e 21 a 22.
26. Vacina de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por compreender um excipiente farmacologicamente aceitável.
27. Vacina de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo excipiente farmacologicamente aceitável consistir num adjuvante. 15-09-2006 4