CN112708599B - 一株禽流感病毒疫苗株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株禽流感病毒疫苗株及其应用。本发明提供了H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18509。本发明所用的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017可以鸡胚中稳定繁殖，毒株稳定，并且安全性很高，对鹌鹑不致病；保护性研究表明该疫苗对于不同分支的鹌鹑源H9N2亚型AIV具有良好的保护作用，能够抵抗不断发生抗原漂移的H9N2病毒的感染，降低了研发成本；该疫苗还能够迅速(一次免疫后2周)产生免疫保护效力。

Description

一株禽流感病毒疫苗株及其应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一株禽流感病毒疫苗株及其应用。
背景技术
目前接种疫苗是我国防控动物疫病的主要手段。其中灭活疫苗的使用可以追溯到1945年，全病毒灭活疫苗在美国开始使用并进行了临床效力观察。因其保留了流感病 毒全部抗原成分，在免疫原性和安全性方面较好，不会出现变异和毒力回复现象，且 制备工艺简单，成品易于储存，被广泛应用于禽类流感大流行的预防。
目前，在鹌鹑中普遍所使用的流感疫苗是由鸡源H9N2亚型AIV研制出的，几乎 没有针对鹌鹑源H9N2亚型AIV研制的重组灭活疫苗。在鹌鹑中流行的H9N2亚型 AIV的HA基因与鸡中流行的位于不同的进化分支，鹌鹑源H9N2亚型AIV与鸡源 H9N2亚型AIV的HA基因于分别属于G1和BJ94进化分支，彼此之间抗原反应较差。 因此，目前鹌鹑中使用的疫苗很难控制当前我国鹌鹑养殖业中流行的H9N2禽流感。
1988年在鹌鹑中分离到H9N2亚型流感病毒，这首次证明了H9亚型流感病毒在 亚洲的陆生禽类中存在。鹌鹑表现出H9N2亚型流感病毒的高感染率——香港市场 16％的鹌鹑呈现H9N2亚型AIV阳性。研究表明相较于鸡，鹌鹑对鸭源H9亚型流感 病毒更易感，从而为AIV从适应水禽到产生能感染陆生禽类的突变株提供了良好的条 件。不仅如此，鹌鹑对多种亚型流感病毒都易感，在流感病毒生态系统中可以作为中 间宿主,病毒在鹌鹑体内经过适应和变异后再传播给其它宿主。先前有研究表明鹌鹑 极易感染从鹅分离的高致病性流感病毒。虽然，这些病毒会引起鹌鹑发病，但是，受 感染的鹌鹑的病程比鸡更长，因此更有可能传播病毒。上述研究表明流鹌鹑在流感病 毒的演化过程中占有重要地位而且对人类公共卫生安全有潜在的威胁。
发明内容
为了有效的解决上述技术问题，本发明的目的是通过寻找交叉免疫反应好的鹌鹑源H9N2亚型AIV作为疫苗候选毒株，成全病毒灭活苗，以期有效防控鹌鹑源H9N2 亚型AIV对鹌鹑的感染，进而消除鹌鹑中流感病毒对公共卫生安全的潜在威胁。
第一方面，本发明要求保护一种鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒毒株。
本发明所要求保护的鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒毒株具体为H9N2亚型鹌鹑源 禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心的保藏编号为CGMCC No.18509。
第二方面，本发明要求保护一种鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗。
本发明所要求保护的鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗，其有效成分为前文所述的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017。
进一步地，所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗的有效成分为灭活的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017。即所述鹌鹑源H9N2亚型流感病 毒疫苗为鹌鹑源H9N2亚型流感病毒灭活疫苗。
更进一步地，所述鹌鹑源H9N2亚型流感病毒灭活疫苗由疫苗抗原和油乳佐剂组成。
所述疫苗抗原为灭活的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒 A/quail/Guangdong/07/2017。在本发明的具体实施方式中，所述疫苗抗原具体为甲醛灭 活的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017。
所述疫苗抗原和所述油乳佐剂的体积比为(1.5～2.3):1(如1.5：1)。
在所述疫苗抗原中，灭活的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒 A/quail/Guangdong/07/2017的病毒含量为108.5EID50/mL。
在本发明的具体实施方式中，所述疫苗抗原具体为将血凝效价为27、病毒滴度为108.5EID50/mL的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚 尿囊液用甲醛溶液(分析纯)灭活后所得。
灭活时，所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液和所述甲醛溶液的体积配比为1000：1。
本发明所提供的制备鹌鹑源H9N2亚型流感病毒灭活疫苗的方法，具体可包括如下步骤：
(a1)按照包括如下步骤的方法制备疫苗抗原：将血凝效价为27、病毒滴度为108.5EID50/mL的前文所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的 鸡胚尿囊液用甲醛溶液(分析纯)灭活，灭活时，所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒 A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液和所述甲醛溶液的体积配比为1000：1，即得 所述疫苗抗原。
(a2)将所述疫苗抗原和油乳佐剂按照(1.5～2.3):1(如1.5：1)的体积比混合， 乳化，得到所述鹌鹑源H9N2亚型流感病毒灭活疫苗。
第四方面，本发明要求保护前文所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒 A/quail/Guangdong/07/2017在制备前文所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗中的应 用。
在上述各方面中，所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗具体为能够用于预防鹌鹑因感染鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒所致疾病的疫苗。
进一步地，所述疾病可为H9N2亚型禽流感。所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒 可为所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017。
第五方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
(b1)含有前文所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液；
(b2)含有前文所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的细胞；
(b3)前文所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的基因组核酸；
(b4)含有(b3)所述基因组核酸的重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬 菌体载体、病毒载体、工程菌或细胞系。
第六方面，本发明要求保护所述生物材料在制备鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗中的应用。
灭活疫苗能够应用的前提是必需保证病毒的产量及稳定性。同时灭活疫苗对不同分支鹌鹑源H9N2亚型AIV的有效免疫保护效力也是疫苗评价的重要组成部分。为此， 本发明通过在鸡胚中连续传代来评价病毒的稳定性。并通过免疫鹌鹑攻毒保护试验来 评价其免疫效力。研究发现，以本发明分离得到的交叉免疫反应好的H9N2亚型鹌鹑 源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017(CGMCC No.18509，简称GD/07/17毒株) 作为目前鹌鹑源H9N2亚型AIV的代表毒株，病毒在鸡胚中连续传至15代时仍能保 持稳定的血凝效价，血凝效价稳定在27，测定病毒滴度达到108.5EID50/mL，表明该病 毒稳定性好。将GD/07/17毒株的全病毒进行灭活后辅以佐剂制成全病毒灭活苗。疫苗 对鹌鹑的免疫攻毒保护试验结果证实，疫苗免疫后能够迅速(一次免疫后2周)产生 针对鹌鹑源H9N2亚型AIV感染的抵抗力。研究结果表明，本发明所研制的鹌鹑流感 病毒灭活苗具有稳定和免疫效果好的特点，为鹌鹑中流感病毒的防控奠定了基础。
本发明优点：本发明所用的疫苗候选株可以鸡胚中稳定繁殖，毒株稳定，并且安全性很高，对鹌鹑不致病；保护性研究表明该疫苗对于不同分支的鹌鹑源H9N2亚型 AIV具有良好的保护作用，能够抵抗不断发生抗原漂移的H9N2病毒的感染，降低了 研发成本；该疫苗还能够迅速(一次免疫后2周)产生免疫保护效力。
保藏说明
科学描述：H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒
参椐的生物材料(株)：A/quail/Guangdong/07/2017
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2019年9月20日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18509
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的血凝(HA)试验，具体如下：
用移液枪向96孔微量血凝板中每孔加入25μl生理盐水，在每行的第1孔中加 入25μl待测病毒抗原，吹打3～4次混匀后吸取25μl加至第2孔，依次进行倍比稀 释至第11孔后弃去25μl，第12孔不加入抗原，作为阴性对照孔。倍比稀释后吸取 25μl的1％鸡红细胞悬液从最高稀释度向最低稀释度依次加入各孔，震荡混匀后室温 静置30min后观察结果。将反应板倾斜，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流 动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝 成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，表明红细胞被病毒所凝集。病毒血凝效价的判定 方法：能够凝集1％红细胞悬液的病毒的最大稀释度。
下述实施例中所涉及的血凝抑制(HI)试验，具体如下：
根据病毒血凝效价配制四单位抗原，即4个血凝单位的病毒液。用血凝效价除以 4即为抗原的稀释倍数，根据稀释倍数加入生理盐水将病毒原液进行稀释，即得到四 单位抗原，配制完成后应按照HA试验方法对其进行验证配制是否准确。配制准确后 方可进行后续HI试验。
HI试验的具体方法：用移液枪向96孔微量血凝板的各孔加入25μl生理盐水。 吸取25μl待检血清置于第1孔中，吹打3～4次混匀后吸取25μl于第2孔，依次 倍比稀释至第11孔，弃去25μl，最后一孔设为阴性对照，不稀释。依次从血清最高 稀释度向最低稀释度每孔加入25μl配制好的四单位抗原，振荡混匀后室温静置 30min。吸取1％级红细胞悬液从最高稀释度向最低稀释度依次每孔加25μl，振荡混 匀后室温静置30min观察结果。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝 抑制试验滴度，即血抑效价。
实施例1、鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒GD/07/17株的分离与鉴定
本发明中的H9亚型禽流感病毒GD/07/17株，是从广东省某地区鹌鹑中分离到三株低致病性禽流感病毒中的一株，经中国农业大学动物流感实验室鉴定，为H9N2亚 型禽流感病毒。三个分离毒株分别为GD/07/17、GD/21/17和GD/11/18株，命名为 A/quail/Guangdong/07/2017(Qa/GD/07/17)、A/quail/Guangdong/21/2017(Qa/GD/21/17)和 A/quail/Guangdong/11/2018(Qa/GD/11/18)株，分类命名：A型流感病毒H9N2亚型。
三个毒株的分离鉴定过程如下：
(1)样品的处理
向每个拭子样本中加入1ml含(10000UL/ml)的双抗PBS溶液，涡旋震荡混匀 30S。将处理后的样本置于4℃冰箱保存过夜，次日接种9～11日龄鸡胚。
(2)鸡胚接种和尿囊液的收获
将处理后的样品采用尿囊腔接种的方法接种9～11日龄鸡胚，每份样品接种2枚鸡胚，每枚接种0.5ml，接种后石蜡封口，置于35℃温箱培养48～72h。每隔12h检 查鸡胚生长情况，如24h内发现死胚，应及时弃去。48～72h过后，将鸡胚置于4℃ 冰箱过夜。收获鸡胚时用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破， 吸取25μl尿囊液，收取对应鸡胚尿囊液于冻存管中，置于-80℃冰箱保存。
GD/07/17、GD/21/17和GD/11/18三毒株HA反应均为阳性。
(3)H9N2亚型禽流感病毒的鉴定
AIVs反转录通用引物为Unit 12。H9N2 AIVs的HA基因片段鉴定性扩增 引物序列为：
HA-F：5’-GGGGAGCAAAAGCAGGGGAATTTC-3’；
HA-R：5’-GGTTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTTGCCAAT-3’。
引物的贮存浓度为100μM，工作浓度为20μM，置于-20℃冰箱贮存备用。
根据RaPure Total RNA Mini Kit RNA提取试剂盒说明书进行病毒RNA的提 取。
反转录的反应体系：
Figure BDA0002247286880000051
依次加入上表中各成分，混匀之后瞬时离心。37℃水浴反应反转录1h，由此得到的cDNA产物即为PCR扩增反应的模板。
PCR反应体系：
ddH2O 9.5μL
上游引物(20μM) 0.5μL
下游引物(20μM) 0.5μL
cDNA 2μL
2×EasyTaq PCR Supermix 12.5μL
总体积 25μL
依次加入上表中各成分，混匀后瞬时离心。
Figure BDA0002247286880000061
PCR扩增反应后，取6μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。三株分离毒株 PCR鉴定均为阳性。
鉴于上述鉴定结果，确定鹌鹑来源的A/quail/Guangdong/07/2017(Qa/GD/07/17)、 A/quail/Guangdong/21/2017(Qa/GD/21/17)、A/quail/Guangdong/11/2018(Qa/GD/11/18)这 三个毒株均为H9N2亚型流感病毒。
已经于2019年9月20日将毒株A/quail/Guangdong/07/2017(Qa/GD/07/17)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18509。其 科学描述：H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒；参椐的生物材料(株)： A/quail/Guangdong/07/2017。
实施例2、鹌鹑源H9N2亚型AIV灭活苗的制备
1、疫苗病毒株的筛选
供试疫苗病毒株：(1)三株鹌鹑来源的H9N2亚型AIV，即实施例1分离得到的 A/quail/Guangdong/07/2017(Qa/GD/07/17)、A/quail/Guangdong/21/2017(Qa/GD/21/17)和A/quail/Guangdong/11/2018(Qa/GD/11/18)。(2)六株现有本实验室保存的鹌鹑来源或鸡来源的H9N2亚型AIV，即A/chicken/Guangdong/89/2017(Ck/GD/89/17)、 A/quail/Hongkong/G1/1997(Qa/G1/97)、A/chicken/Beijing/F/1998(Ck/F/98)、 A/chicken/Shandong/ZB/2007(Ck/ZB/07)、A/chicken/Jiangsu/TS/2010(Ck/TS/10)和 A/chicken/Beijing/0701/2015(Ck/BJ/15)。
将九株供试毒株的10倍稀释后的血清分别按相应倍数稀释至与自身抗原反应的血抑效价为1280，并用分离毒株和抗原性分析毒株与抗血清进行血凝抑制(HI)试验 来选取疫苗候选株。
结果如表1所示，可见：鸡源H9N2亚型AIV与鹌鹑源H9N2亚型AIV抗原反应 差异很大，并且，目前分离的鹌鹑毒株与早期鹌鹑毒株(A/quail/Hongkong/G1/1997 (Qa/G1/97))抗原反应差异较大。本发明选取分离毒株中与其他分离鹌鹑毒株抗原反 应较好的A/quail/Guangdong/07/2017(Qa/GD/07/17)，即实施例1中分离得到的H9N2 亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509作为疫苗候选 株。
表1通过HI试验进行候选毒株选择
毒株 Qa/GD/07/17 Qa/GD/21/17 Qa/GD/11/18 Qa/G1/97 Ck/GD/89/17 Ck/F/98 Ck/ZB/07 Ck/TS/10 Ck/BJ/15
Qa/GD/07/17 1280 640 1280 < < < < < <
Qa/GD/11/18 640 320 1280 20 < < 20 20 20
Qa/GD/21/17 1280 1280 640 20 < < 20 < 20
Qa/G1/97 20 40 20 1280 < 40 80 80 40
Ck/GD/89/17 < < < 20 1280 40 320 640 640
Ck/F/98 < < < 20 20 1280 160 160 40
Ck/ZB/07 < < < < 320 40 1280 80 40
Ck/TS/10 < < < < 320 20 160 1280 20
Ck/BJ/15 < < < 40 640 320 160 80 1280
注：表中数据为病毒与抗血清的反应效价，<表示彼此之间不反应。
2、病毒血凝效价测定
将H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509 的鸡胚尿囊液做10-1～10-3稀释，经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，接种量为0.2 m L/胚，37℃孵育。无菌收集48h～96h鸡胚尿囊液，用1％鸡红细胞血凝试验(HA) 测定其血凝效价，将血凝效价较高的鸡胚尿囊液收取混合后用无菌生理盐水稀释 10-1～10-3后继续接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔。反复传代，直至收获的病毒尿囊液血 凝效价稳定。经SPF鸡胚扩大培养，收集72h～96h鸡胚尿囊液，混合后测定其血 凝效价，作为疫苗种毒。
经测定，H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCCNo.18509在鸡胚中连续传至15代时仍能保持稳定的血凝效价，血凝效价稳定在27。
3、病毒EID50测定
(1)鸡胚的准备：将9-11日龄鸡胚置于暗室，用照蛋器观察，标记出每个鸡胚 的气室，避开大血管标记；
(2)病毒的倍比稀释：将H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒 A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509从-80℃冰箱中取出，置于冰上自然融化。 准备10个1.5mL的EP管，每管中加入900μL的双抗PBS。第一管中加入100μL病 毒原液，充分混匀后吸出100μL至第二管，依次稀释到第十管，做好标记。置于冰上 保存。
(3)接种病毒；将标记好的鸡胚用75％的酒精消毒，将打孔器消毒后在气室上 方和配体处打孔。将1mL注射器沿着胚体处小孔插入0.5cm，注入0.1mL病毒液，每 个稀释度的病毒液接种三个鸡胚，做好标记。石蜡封口。置于孵化箱孵育，每日照蛋。
(4)收获鸡胚：接毒后48-72h，将鸡胚置于4℃冰箱1h，防止鸡胚出血。用75％ 酒精消毒气室后，用镊子打开，吸取25μL的尿囊液至96孔血凝板，进行血凝试验， 并记录结果。
按Reed-Muench法公式，计算半数感染量(EID50)，10倍系列稀释的修正系数 为1。
logEID50＝高于50％感染率的病毒稀释度对数+相应距离比×稀释系数的对数
Figure BDA0002247286880000081
经测定，H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCCNo.18509在鸡胚中连续传至15代时，病毒滴度仍能稳定在108.5EID50/mL。
4、灭活疫苗的制备
(1)制备疫苗抗原；
疫苗抗原的制备方法：将血凝效价为27、病毒滴度为108.5EID50/mL的H9N2亚型 鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509的鸡胚尿囊液分析纯 的甲醛溶液灭活，灭活时，所述鹌鹑源H9N2亚型流感病毒GD/07/17株的鸡胚尿囊液 和所述甲醛溶液的体积配比为1000：1，即得疫苗抗原。
(2)疫苗的制备参考“兽用生物制品规程”方法，将上述制得的疫苗抗原(其中H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509的病毒含 量约为108.5EID50/mL)和油乳佐剂按照1.5:1的体积比混合，常规方法乳化，得到鹌 鹑源H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗。
实施例3、鹌鹑源H9N2亚型AIV灭活苗保护性评价
免疫攻毒保护实验：分为免疫组和对照组(每组9只2周龄鹌鹑，并对其进行编号)。免疫组静脉注射0.3mL实施例2制备得到的鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒灭活 疫苗；对照组不接种疫苗。
分别将H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509一次免疫后2周的鹌鹑(免疫组)和同日龄非免疫鹌鹑(对照组)，通过滴 鼻点眼的方式接种106EID50/ml(0.2ml)的不同病毒(实施例1分离得到的 A/quail/Guangdong/07/2017(Qa/GD/07/17)、A/quail/Guangdong/21/2017(Qa/GD/21/17)和 A/quail/Guang dong/11/2018(Qa/GD/11/18))。
感染后24小时，每个感染组中放入3只鹌鹑同居，免疫组放入的为一次免疫后2 周的鹌鹑，对照组放入同日龄非免疫鹌鹑。分别在H9N2病毒接种后3天、5天、7 天采集感染鹌鹑和同居鹌鹑口腔拭子和泄殖腔拭子，并测定拭子中的病毒滴度 (EID50/mL)(表2)。
表2鹌鹑源H9N2亚型AIV灭活苗保护性评价
Figure BDA0002247286880000091
结果显示，免疫组鹌鹑在病毒感染后均没有排毒，后期放入的一次免疫后2周的鹌鹑均没有感染H9N2病毒。而对照组鹌鹑在病毒感染后有排毒情况，后期放入的同 日龄非免疫鹌鹑感染H9N2病毒。证明本发明的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017CGMCC No.18509作为灭活疫苗免疫后能够迅速(单次免 疫后2周)产生针对不同基因型鹌鹑源H9N2病毒感染的抵抗力，具有安全性高和免 疫效果好的特点，为鹌鹑源H9N2流感病毒的防治奠定了基础。

Claims (13)

1.H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18509。
2.一种鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗，其有效成分为权利要求1所述的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗为鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗由疫苗抗原和油乳佐剂组成；
所述疫苗抗原为灭活的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017；
所述疫苗抗原和所述油乳佐剂的体积比为（1.5～2.3）:1。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：在所述疫苗抗原中，灭活的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的病毒含量为108.5EID50/mL。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗抗原为将血凝效价为27、病毒滴度为108.5EID50/mL的所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液用甲醛溶液灭活后所得；
灭活时，所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液和所述甲醛溶液的体积配比为1000：1。
7.权利要求2-6中任一所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗，其特征在于：所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗为能够用于预防和/或治疗鹌鹑因感染鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒所致疾病的疫苗。
8.一种制备鹌鹑H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括如下步骤：
（a1）按照包括如下步骤的方法制备疫苗抗原：将血凝效价为27、病毒滴度为108.5EID50/mL的权利要求1所述的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液用甲醛溶液灭活，灭活时，所述H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液和所述甲醛溶液的体积配比为1000：1，即得所述疫苗抗原；
（a2）将所述疫苗抗原和油乳佐剂按照（1.5～2.3）:1的体积比混合，乳化，得到所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒灭活疫苗。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于：所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗为能够用于预防和/或治疗鹌鹑因感染鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒所致疾病的疫苗。
10.权利要求1所述的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017在制备权利要求2-6中任一所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗中的应用。
11.权利要求10所述的应用，其特征在于：所述鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗为能够用于预防和/或治疗鹌鹑因感染鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒所致疾病的疫苗。
12.如下任一生物材料：
（b1）含有权利要求1所述的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的鸡胚尿囊液；
（b2）含有权利要求1所述的H9N2亚型鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Guangdong/07/2017的细胞。
13.权利要求12所述生物材料在制备鹌鹑源H9N2亚型禽流感病毒疫苗中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102271704A (zh) * 2008-11-28 2011-12-07 梅里亚有限公司 重组禽流感疫苗及其用途
CN106794241A (zh) * 2014-08-18 2017-05-31 圣诺菲·帕斯图尔公司 烷基化流感疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102271704A (zh) * 2008-11-28 2011-12-07 梅里亚有限公司 重组禽流感疫苗及其用途
CN106794241A (zh) * 2014-08-18 2017-05-31 圣诺菲·帕斯图尔公司 烷基化流感疫苗

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Avian influenza overview September – November 2017;Ian Brown等;《EFSA Journal》;20171231;第15卷(第12期);e5141 *
H9N2亚型禽流感疫苗株的筛选;胡晓苗等;《中国兽医杂志》;20171122(第11期);第36-41页 *
一株鹌鹑源禽流感病毒A/quail/Jilin/7/2015(H9N2)的遗传进化分析和致病性研究;刘慧敏等;《中国预防兽医学报》;20171227(第12期);第958-962页 *
鹌鹑源Ｈ９Ｎ２亚型流感病毒的分离鉴定及其生物学特性研究;于杨等;《病毒学报》;20160131;第32卷(第1期);第70-76页 *

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