CN111763659B

CN111763659B - 新型冠状病毒及其培养方法，以及新型冠状病毒灭活疫苗

Info

Publication number: CN111763659B
Application number: CN202010864354.6A
Authority: CN
Inventors: 袁润余; 柯昌文; 周平平; 柯碧霞; 安文琪; 马小伟; 张海燕; 黎薇; 武婕
Original assignee: GUANGDONG PROVINCIAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH; Hualan Biological Vaccine Co ltd; CENTRE FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION OF GUANGDONG PROVINCE
Current assignee: GUANGDONG PROVINCIAL INSTITUTE OF PUBLIC HEALTH; Hualan Biological Vaccine Co ltd; CENTRE FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION OF GUANGDONG PROVINCE
Priority date: 2020-08-25
Filing date: 2020-08-25
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2040-08-25
Also published as: CN111763659A

Abstract

本发明涉及疫苗领域，具体而言，涉及新型冠状病毒及其培养方法，以及新型冠状病毒灭活疫苗。该新型冠状病毒，其于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V202039，毒株名称为2019‑nCoV/K‑T13。本发明提供了一种新型冠状病毒的毒株，该毒株的培养效价高、增值快，并且传代稳定性好，即便传代18代以上毒株的抗原决定蔟(RBD)区域序列依然无明显变化，因而可适于病毒的大规模培养，并适合用作疫苗株进行使用。本发明还确定了该毒株的最佳灭活条件，并首次获得新型冠状病毒灭活疫苗。

Description

新型冠状病毒及其培养方法，以及新型冠状病毒灭活疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体而言，涉及新型冠状病毒及其培养方法，以及新型冠状病毒灭活疫苗。

背景技术

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2，或译为严重急性呼吸综合征冠状病毒2、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一种具有包膜的正链单股RNA病毒，属于冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种。它的基因序列和SARS病毒及MERS病毒属于同一谱系但不同进化枝，是已知的第七种可感染人类的冠状病毒。病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物，它造成了于2019年底暴发的2019冠状病毒病(COVID-19)。SARS-CoV-2病毒可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的ACE2为受体达到感染，主要感染器官包括肺部、心脏、肾脏等多个主要器官。

疫苗作为预防新冠病毒感染的手段之一，是目前全球都在攻克的难题。灭活疫苗具有安全性和免疫原性好等特点，是新冠病毒预防的重要手段。新型冠状病毒作为一种新发传染病，目前尚未有可供人使用的新型冠状病毒灭活疫苗上市生产。

发明内容

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种新型冠状病毒，其于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V202039，毒株名称为2019-nCoV/K-T13。

根据本发明的一方面，还涉及如上所述新型冠状病毒的培养方法，包括将所述新型冠状病毒接种于细胞中，于合适的培养条件下进行培养，并收获如此培养得到的病毒。

本发明还涉及如上所述的新型冠状病毒的灭活方法，包括：

将所述新型冠状病毒与β-丙内酯按照1:(3000～5000)的比例共孵育6小时以上。

本发明还涉及一种新型冠状病毒灭活疫苗，其包含如上所述的灭活病毒。

本发明还涉及一种成套试剂盒，其包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种新型冠状病毒的毒株，该毒株的培养效价高、增值快，并且传代稳定性好，即便传代18代以上毒株的抗原决定蔟(RBD)区域序列依然无明显变化，因而可适于病毒的大规模培养，并适合用作疫苗株进行使用。

(2)通过摸索，确定了该毒株的最佳灭活条件，并首次获得新型冠状病毒灭活疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中10倍显微镜下新冠病毒感染Vero细胞的病变图；

图2为本发明一个实施例中10倍显微镜下Vero细胞的阴性对照图；

图3为本发明一个实施例中新冠病毒K-T13疫苗株的电镜图；

图4A和图4B为本发明一个实施例中连续传代的K-T13疫苗株的抗原决定蔟(RBD)区域序列的序列比对图；

图5为本发明一个实施例中连续传代的K-T13疫苗株的进化树；

图6为本发明一个实施例中新冠病毒的生长曲线图；

图7为本发明一个实施例中新冠病毒的生长曲线图；

图8为本发明一个实施例中图10倍显微镜下的灭活后的细胞图；

图9为本发明一个实施例中10倍显微镜下的病毒对照细胞图；

图10为本发明一个实施例中10倍显微镜下的阴性对照细胞图；

图11为本发明一个实施例中灭活的新冠病毒K-T13疫苗株电镜图。

本申请提供的新型冠状病毒，毒株名为2019-nCoV/K-T13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉的武汉大学，保存编号CCTCC NO:V202039，该毒株于2020年7月28日由保藏中心收到并登记入册；经保藏中心于2020年8月3日检测为存活毒株。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

该毒株的培养效价高、增值快，并且传代稳定性好，即便传代18代以上毒株的抗原决定蔟(RBD)区域序列依然无明显变化，因而可适于病毒的大规模培养，并适合用作疫苗株进行使用。

本发明请求保护上述保藏编号的新型冠状病毒毒株，以及在适度范围内发生突变或改造的变体毒株。

所谓“变体毒株”，可由现有技术的病毒经公知的基因编辑技术将保藏编号为CCTCC NO:V202039经适度改造或适度突变，或将保藏编号为CCTCC NO:V202039所示的病毒与其它病毒进行融合而得到的实质上相同的毒株。

在本发明中，表述“实质上相同的毒株”可以通过基因组方面高度类似涵盖：

一种病毒毒株的基因组同2019-nCoV/K-T13毒株的基因组相比，包含至多150个突变事件，优选包含至多140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失，及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量：将2019-nCoV/K-T13毒株的基因组视为对照，鉴定存在于突变株基因组中的突变事件，每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即，例如，插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中，本发明的突变株的基因组序列由同2019-nCoV/K-T13毒株相比所含突变事件的数量限定，除这种限定方式外，还可额外由其与2019-nCoV/K-T13毒株的基因组序列的同一性百分比限定，其中同一性百分比在本文表示在一种毒株的基因组中发现存在于另一种毒株的基因组中的序列的百分比，具体地讲：a)在2019-nCoV/K-T13毒株的基因组中发现并存在于突变毒株的基因组中的序列的百分比，或b)在突变毒株的基因组序列中发现并存在于2019-nCoV/K-T13毒株的基因组中的序列的百分比。因此，与2019-nCoV/K-T13毒株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变毒株，具有的基因组与2019-nCoV/K-T13毒株的基因组的同一性百分比为100％，因为在一种毒株的基因组中完全发现了另一种毒株的整个基因组序列。在一个具体实施例中，由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列，与2019-nCoV/K-T13的基因组序列的同一性百分比为至少90％、为至少91％、为至少92％、为至少93％、为至少94％、为至少95％、为至少96％、为至少97％、为至少98％、为至少99％、为至少99.1％、为至少99.2％、为至少99.3％、为至少99.4％、为至少99.5％、为至少99.6％、为至少99.7％、为至少99.8％、为至少99.9％、为至少99.92％、为至少99.94％、为至少99.96％、为至少99.98％或为至少99.99％，其中同一性百分比表示在一种毒株的基因组中发现并存在于另一种毒株的基因组中的序列的百分比；同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。

本发明还涉及如上所述新型冠状病毒的培养方法，包括将所述新型冠状病毒接种于细胞中，于合适的培养条件下进行培养，并收获如此培养得到的病毒。

在一些实施方式中，所述细胞为禽类和哺乳动物的细胞，包括它们的卵(蛋)或胚胎细胞等。

禽类例如野生或经过驯化的鸡、鸭、鹅、天鹅、大雁、鸽子、鹌鹑。

哺乳动物例如人、猴、猪、马、猫、犬、海豹、鲸鱼等。

在一些实施方式中，人的细胞选自CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞。

在一些实施方式中，犬的细胞选自MDCK细胞。

在一些实施方式中，猴的细胞选自Vero细胞。

在一些实施方式中，所述Vero细胞的浓度为(1.0～3.0)×10⁵个/mL，所述新型冠状病毒以0.005～0.015MOI(还可以选择0.008、0.01、0.012)接种于所述Vero细胞中。

在一些实施方式中，所述细胞所用的培养液为MEM营养液。

在一些实施方式中，在培养的第2～4天收获病毒，也可以选择3天。

本发明还涉及如上所述的新型冠状病毒的灭活方法，包括：

所述方法灭活病毒操作方便，且灭活完全，所得疫苗具有很好的安全性。

在一些实施方式中，所述新型冠状病毒与β-丙内酯按照1:(3500～4500)的比例共孵育。

在一些实施方式中，所述新型冠状病毒与β-丙内酯按照1:(3700～4300)的比例共孵育。

在一些实施方式中，所述新型冠状病毒与β-丙内酯按照1:4000的比例共孵育。

在一些实施方式中，所述共孵育的温度为2℃～8℃；也可以选择4℃或6℃。

本发明还涉及如上所述的灭活方法制备得到的灭活病毒。

在一些实施方式中，所述灭活病毒以液体的或干燥的形式保存于所述疫苗中。

在一些实施方式中，所述新型冠状病毒是冷冻的。

在一些实施方式中，其还包括可以药用的载体、稀释剂以及免疫佐剂中的至少一种。

适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对所述重组流感病毒中B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及可增强细胞介导的针对所述重组流感病毒中T细胞表位的反应的佐剂。这些佐剂是本领域所熟知的。

在一些实施方式中，所述佐剂选自角鲨烯、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly(I：C)，以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。可与本发明所述重组流感病毒一起应用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐)。尤其适用于本发明的优选佐剂是氢氧化铝凝胶，诸如Alhydrogel^TM。对氢氧化铝凝胶而言，是将所述嵌合体蛋白与该佐剂混合，使每一剂量含有大约50到大约800微克铝，优选含有大约400到大约600微克铝。另一种尤其优选的佐剂是可获得自SuperfosBiosector，Denmark的商标为Adju-Phos^TM的磷酸铝。初期的磷酸铝颗粒具有板状形态，直径为大约50到大约100nm，产物中的最终颗粒尺寸为大约0.5到大约10μm。磷酸钙毫微粒(CAP)是由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)研制的一种佐剂。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种，但本发明还考虑了口腔和皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

本发明进一步提供了保护动物免于SARS-CoV-2感染的方法，其包括给所述动物施用有效量的根据本发明的疫苗。

在一些实施方式中，所述动物为人。

有效量定义为在它被施用的个体中将诱导免疫应答的所述疫苗的量，导致在个体中针对所述疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。针对疫苗的所述分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答针对用强毒流感病毒株的攻击也是有效的。

所述有效量优选经口或口鼻或肌内施用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1 K-T13毒株的分离、培养与鉴定

一、样品处理

本发明请求保护的K-T13毒株分离自新冠病毒感染者的样本。

在生物安全三级实验室中，对标本进行相应的处理：

将送检的新冠病毒感染者痰标本加入适量的MEM于痰瓶中，漩涡振荡器振荡2～3分钟，使痰液充分匀化，室温放置。如未加抗生素者，直接加入双抗至终浓度为1000U/mL，转移入冻存管中。

二、实验溶液的配置

备注：如果MEM培养基中含有谷氨酰胺，可不再添加；如果MEM培养基中不含有谷氨酰胺，需加入1％(V/V)浓度为200mM谷氨酰胺溶液。

三、病毒分离

1.新型冠状病毒分离：

将形态良好、长成80-95％单层细胞(经显微镜检查)的Vero培养管，倒掉培养液，每管接种200uL待检标本，每份标本接种2管，置37℃培养箱培养，同时设正常细胞对照；

2.细胞病变观察

从本发明所保藏的K-T13接种样本的次日起逐日在倒置显微镜下观察细胞形态变化，细胞多从边缘出现病变(CPE)，细胞出现不规则形态，细胞间颗粒增多，病变细胞圆缩、脱落(图1)，而正常对照细胞形态良好(图2)，此时将培养细胞置于-80℃冻存待鉴定。同时将分离的病毒进行电镜观察(图3)。

四、鉴定及序列测定

新型冠状病毒等冠状病毒主要采用荧光定量PCR、RT-PCR、rRT-PCR或间接免疫荧光方法检测鉴定，目前常用荧光定量PCR的方法进行快速鉴定。

新型冠状病毒等冠状病毒细胞分离物，选择有细胞病变的细胞分离物，从病毒分离物中提取核酸(核酸提取和实时荧光RT-PCR反应体系参考相关厂家试剂盒说明)，用新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(ORF1a/b)和核壳蛋白(nucleocapsidprotein，N)作为鉴定基因。在实验室要确认病毒培养物为阳性，需满足新型冠状病毒2个靶标(ORF1ab、N)特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。

将本发明所保藏的K-T13毒株连续传代，每一代都进行鉴定和2代测序。分析结果如图4A和图4B所示，即便传代18次以上，连续传代的疫苗株的抗原决定蔟(RBD)区域序列依然无变化。从序列进化来看，随着疫苗株代次的增加，高代次的毒株序列主要位于进化树右侧且进化树无明显的稳定节点分支(图5)。

五、病毒株效价滴定

1.细胞的制备：

Vero细胞悬液的制备：将细胞吹打均匀后，取样计数，将细胞稀释成10-15×10⁴/mL。

2.病毒稀释

从K-T13病毒原液作10倍系列稀释至10^-8，稀释时，每个稀释度要换吸管，吸管尖部的0.1mL不用，或用300μL吸头稀释，每个稀释度亦要换吸头。

3.病毒接种

每个试验孔接种0.1mL细胞悬液，然后按上述稀释度以同法接种病毒，每孔0.1mL，摇匀后置CO₂培养箱内培养。4天初步观察CPE，7天以+、－判定结果，按Reed-Muench的方法计算TCID₅₀。发明人分离的新型冠状病毒有多株，以K16和4276作为示例比较例。

选取的候选毒株结果如图6所示，K16、K-T13和4276三个不同的新冠毒株在增殖的第3～4天滴度最高，是最适合新冠病毒收获的时间。同时，从图上所示，KT13毒株的增殖的滴度稳定性较好，K16和4276毒株在增殖的第三天以后滴度越来越低。因此，本申请选择K-T13进行噬斑纯化。

六、噬斑纯化

(1)挑选生长状态好的Vero细胞，消化后制备成均匀的细胞悬液接种于6孔板中，培养至基本单层待用。

(2)对要进行蚀斑纯化的病毒进行10倍递增系列稀释。

(3)将6孔板中的细胞生长液弃去，把系列稀释后的样品接种于相应孔中，440μL/孔。同时每块板设定细胞对照孔；将加样后的细胞板标记后于37℃、5％CO₂培养箱中吸附60分钟，间隔20分钟摇板一次。

(4)按照每孔4ml的量计算最终覆盖层所用液体量。

(5)待病毒吸附60分钟后向6孔板中加覆盖液，待基本凝固后于37℃、3～5％CO₂培养箱进行培养。

7.病毒株效价滴定

具体操作同五，如图7中所示，毒株经过两次噬斑纯化后，滴度明显的比纯化前提高了100倍。

将经过噬斑纯化后的毒株进行保藏。

实施例2新冠病毒灭活

(1)病毒收获液(收获时为37℃)，加灭活剂前先平衡至2-8℃；

(2)β-丙内酯(保存在-20℃)，使用时放在冰上确保温度在2-8℃以下，使用后迅速放回-20℃；

(3)灭活剂β-丙内酯按照不同比例加入病毒收获液(2-8℃)中，摇晃均匀后，用无菌移液管转移至新的储液瓶中；

(4)设立阴性对照，按照不同比例将灭活剂(β-丙内酯)加入细胞维持液中，摇晃均匀后，用无菌移液管转移至新的储液管中；

(5)将加灭活剂后的样品置于2-8℃进行灭活，间隔一定时间摇晃一次，刚开始时频次高些；

(6)灭活适当的时间后，进行37℃水浴作用2小时；

(7)进行灭活验证，注意调节灭活病毒收获液的pH值达7.2。

将灭活后病毒液接种于Vero细胞，培养器皿为斜面管，置37℃培养7天，观察细胞病变情况，同时设定病毒阳性对照和细胞对照。如图8～11所示，病毒对照应出现细胞病变，细胞对照与完全灭活的病毒液应不出现细胞病变。

从下表中可以看出，使用1:4000灭活剂(β-丙内酯)灭活6小时以上可以将新冠病毒完全灭活。

新冠病毒灭活效果观察

从图11可见，灭活后的新冠病毒结构完整。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.新型冠状病毒，其于2020年7月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V202039，毒株名称为2019-nCoV/K-T13。

2.权利要求1所述新型冠状病毒的培养方法，包括将所述新型冠状病毒接种于细胞中，于合适的培养条件下进行培养，并收获如此培养得到的病毒。

3.根据权利要求2所述的培养方法，所述细胞为Vero细胞。

4.根据权利要求3所述的培养方法，所述Vero细胞的浓度为(1.0～3.0)×10⁵个/mL，所述新型冠状病毒以0.005～0.015MOI接种于所述Vero细胞中；

所述细胞所用的培养液为MEM营养液；

在培养的第2～4天收获病毒。

5.权利要求1所述的新型冠状病毒的灭活方法，包括：

6.根据权利要求5所述的灭活方法，所述共孵育的温度为2℃～8℃。

7.权利要求5或6所述的灭活方法制备得到的灭活病毒。

8.新型冠状病毒灭活疫苗，其包含权利要求7所述的灭活病毒。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其还包括可以药用的载体、稀释剂以及免疫佐剂中的至少一种。

10.成套试剂盒，其包含权利要求8或9所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。