CN102271704A

CN102271704A - 重组禽流感疫苗及其用途

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Publication number: CN102271704A
Application number: CN2009801534446A
Authority: CN
Inventors: 郭璇; M·巴布洛特; J·A·普里查德; L·F·迪基
Original assignee: Merial Ltd; Biolex Inc
Current assignee: Merial; Merial Ltd; Byondis BV
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2009-11-30
Publication date: 2011-12-07
Also published as: US8394384B2; WO2010063033A2; EP2367566A2; CA2744454C; MY159543A; KR20110108337A; WO2010063033A3; KR101715415B1; RU2011126359A; IL213189A; RU2559527C2; EP3542815A1; CA2744454A1; IL213189A0; EP2367566B2; EP3168307A1; EP2367566B1; MX2011005604A; US20100189731A1; EP3168307B1

Abstract

本发明含盖流感疫苗，尤其是禽流感疫苗。疫苗可为基于流感血凝素的亚单位疫苗。血凝素可在包括浮萍的植物中表达。发明也含盖编码和表达可用于保护动物免于流感的流感抗原、表位或免疫原的重组载体。其也含盖与DIVA策略兼容的疫苗接种方案，包括使用载体和亚单位疫苗的始施-加施方案。

Description

重组禽流感疫苗及其用途

【相关申请的交叉引用】

本申请要求提交于2008年11月28日的美国临时申请系列No.61/118,492的权利。

【技术领域】

本发明含盖流感疫苗，尤其是禽流感疫苗。疫苗可为重组禽疫苗。

【背景技术】

禽流感(Avian influenza)、有时禽流感(avian flu)以及通常鸟流感(bird flu)指由适于鸟的病毒所致的流感。禽流感病毒(AIV)是RNA病毒属于正粘病毒科，且被分类为A型流感病毒，其涉及其核蛋白和膜蛋白。AIV具有特征为2种不同的糖蛋白的脂质包膜：血凝素(HA)，其辅助病毒进入宿主细胞；以及神经氨酸酶(NA)，其辅助后代病毒从感染的细胞释放(de Jong et al.，J Clin Virol.2006Jan；35(1)：2-13)。已经将H5N1亚型(以HA 5和NA 1为特征的病毒)特异性地与最近亚洲、俄罗斯、中东、欧洲和非洲爆发的相关联(Olsenet al.，Science.2006Apr 21；312(5772)：384-8)。

高度病原性流感病毒亚型H5N1病毒是新出现的作为潜力流行病威胁导致全球关注的禽流感病毒。H5N1已经在贯穿亚洲、欧洲和非洲的越来越多的国家杀死数百万禽。健康专家担心人流感病毒和禽流感病毒(尤其H5N1)的共存将提供遗传物质在物种-特异性病毒之间交换的机会，可能产生容易传播且对于人致死的新强毒流感株(FoodSafety Research Information Office.″A Focus on Avian Influenza″.Created May 2006，Updated November 2007)。

由于首次H5N1爆发发生在1997年，有越来越多的HPAI H5N1鸟到人传播导致临床上严重的且致死的人感染。但是，因为鸟和人之间存在显著的物种屏障，病毒不容易跨越到人。尽管自从其发现，百万的鸟被病毒感染，在印度尼西亚、老挝、越南、罗马尼亚、中国、土耳其和俄罗斯超过200人死于禽流感。

最近，研究植物作为产生治疗性试剂(例如疫苗、抗体和生物医药)的来源。但是，从植物的疫苗、抗体、蛋白和生物医药的生产与治疗处理相去甚远，且有通常与所述疫苗产生相关的多种障碍。成功地产生植物疫苗的限制包括：生物产品或表达的抗原的低产率(Chargelegue et al.，Trends in Plant Science 2001，6，495-496)、蛋白不稳定性、产物质量的不一致性(Schillberg et al.，Vaccine 2005，23，1764-1769)和产生期望的尺寸和免疫原性的病毒样产物的不足的能力(Arntzen et al.，Vaccine 2005，23，1753-1756)。

考虑动物(包括人)对AIV的感受性，防止AIV感染和保护动物的方法是必要的。因此，有对产生针对流感的有效疫苗的方法的需要。

【发明概述】

提供包括流感多肽和其片段和变体的组合物。多肽或抗原在植物中产生，且是高度免疫原性的和保护性的。

多肽和其片段和变体可配制成疫苗和/或药学或免疫学组合物。所述疫苗或组合物可用于免疫接种动物和提供针对同源和异源流感株的保护。

本发明的方法包括使用方法，包括给动物施用有效量的抗原性多肽或其片段或变体，以产生保护性免疫原性应答。方法也包括在浮萍植物中制备抗原性多肽的方法。在浮萍中产生后，抗原性多肽可对于用作疫苗或免疫学组合物是部分或基本上纯化的。

也提供包括至少一种抗原性多肽或其片段或变体和使用说明的试剂盒。

【附图说明】

以下详细的描述，通过实施例方式给予，但不旨在将发明仅限制在描述的特定实施方式的可连同附图被最佳理解，其中：

图1是显示分配到多核苷酸和蛋白序列的SEQ ID NO的表。

图2提供编码A/鸡/印度尼西亚/7/2003H5N1血凝素(HA)(SEQ ID NO：1)的合成的(密码子-优化的)和突变的DNA序列。

图3提供天然的和合成的/突变的A/鸡/印度尼西亚/7/2003H5N1(HA)蛋白序列。

图4提供HA基因的A/鸡/印度尼西亚/7/2003(H5N1)野生型(天然的)cDNA 序列(GenBank Accession No.EF473080)(SEQ ID NO：3)。

图5显示HA蛋白序列比对和序列同一性表。

图6显示MerB01载体序列(SEQ ID NO：6)

图7显示MerB01载体图谱。

图8显示DNA序列比对和序列同一性表。

图9显示阳性转基因植物的HA筛选的平铺实施例和HA测定结果。

图10提供表达H5N1HA的转基因植物的HA测定结果。

图11提供显示靶制剂的估计的产率的表。

图12～14显示用不同的抗体进行的血凝抑制测定结果。

图15显示SDS-PAGE(银染色)和蛋白印迹。

图16提供使用不同的血清的蛋白印迹。

图17显示使用针对A/越南/1203/04流感病毒的H5血凝素的单克隆抗体的浮萍表达的HA的免疫定位测定。

图18是显示免疫原性研究的疫苗接种方案的表。

图19提供HPAI H5N1攻击后保护数据的总结。

图20显示来自在第35天从用浮萍来源的HA免疫接种的鸡收集的血清的血凝抑制滴度(log2)。

图21显示总结在第42天攻击之前和在第56天攻击后收集的样品上的血清学数据的表。

【发明详述】

提供在动物中引起免疫原性应答的包括流感抗原和其片段和变体的组合物。抗原性多肽或其片段或变体可在浮萍植物中产生。抗原性多肽或片段或变体可配制成疫苗或药学或免疫学组合物和用于在动物中引起或刺激保护应答。在一个实施方式中，多肽抗原是血凝素多肽或其活性片段或变体。

需知，本发明的抗原性多肽或抗原可为全长多肽或其活性片段或变体。说道“活性片段”或“活性变体”期望片段或变体保留多肽的抗原性性质。由此，本发明含盖在动物中引起免疫原性应答的任何流感多肽、抗原、表位或免疫原。流感多肽、抗原、表位或免疫原可为任何流感多肽、抗原、表位或免疫原、例如但不限于在动物中引起、诱导或刺激应答的蛋白、肽或其片段或变体。

特定目的抗原性多肽是血凝素(HA)。流感血凝素指见于流感病毒表面的一种类型的血凝素。其为抗原性糖蛋白，且负责病毒与被感染的细胞的结合。有不同的HA抗原，其中任何可在本发明实践中使用。关心的是来自H5N1(高度病原性禽流感病毒)的HA。更尤其，HA可从分离自A/鸡/印度尼西亚/7/2003株的H5N1分离。但是，来自其他流感病毒的HA(即H1～H16)可在本发明的实践中使用的包括：H1、H3、H5、H6、H7、H9等。还需知，可使用HA蛋白之任何的HA前体。

HA是有包含球形头和茎区的胞外域的同原三聚体跨膜蛋白。两个区载N-连接的寡糖，其在HA的生物学功能中起重要的作用(Schulze，I.T.，J Infect Dis，1997.176Suppl 1：p.S24-8；Deshpande，K.L.，et al.，PNAS USA，1987，84(1)：p.36-40)在流感A病毒的不同的亚型之中，在头区糖基化位点中有显著变异，然而茎寡糖更保守且对于融合活性需要(Ohuchi，R.，et al.，J Virol，1997，71(5)：p.3719-25)。接近抗原性肽表位的聚糖干扰抗体识别(Skehel，J.J.，et al.，PNASUSA，1984，81(6)：p.1779-83)，而接近蛋白水解位点的聚糖调节切割和影响流感病毒的感染性(Deshpande，K.L.，et al.，1987)。62种H5基因的核苷酸序列分析支持如下假说，接近HA球形头之内的受体结合位点的额外的糖基化是从野生鸟(尤其水禽)到家禽的物种间传播后病毒的适应(Banks，J.，et al.，Avian Dis，2003，47(3Suppl)：p.942-50)。

就流感病毒HA蛋白鉴定超过150种B细胞表位以及113种CD4+和35CD8+T细胞表位，但是，仅有限的数的表位报告对于禽流感株/亚类(Bui，H.H.，et al.，PNAS USA，2007，104(1)：p.246-51)。在天然的和单克隆抗体-选择的抗原性变体中的氨基酸置换的位点的检查表明全部抗原性位点在主要围绕受体-结合位点的膜远端HA1结构域表面上。有2个抗原性位点的明显特征：它们中几种的环样结构和碳水化合物侧链的出现(Skehel，J.J.，et al.，Annu Rev Biochem，2000，69：p.531-69)。已描述2个H5抗原性位点的定位和精细结构(Kaverin，N.V.，et al.，J Gen Virol，2002.83(Pt 10)：p.2497-505)。位点1是包括HA1残基140～145的暴露的环，其对应于H3的抗原性位点A和H1的Ca2、包括2个亚位点的位点2，对应于H3亚型的位点B的一个(HA1残基156和157)和对应于H1亚型的位点Sa的一个(HA1残基129～133)。表位定位研究推荐，新近分离的H5N1的HA抗原性结构基本上不同于低病原性H5株，且快速进化(Kaverin，N.V.，等人，J Virol，2007.81(23)：p.12911-7)。表位保守性分析推荐显著水平的株间交叉-反应性可能对于T细胞表位，但对于Ab表位少得多。使用重叠肽库，首次鉴定AIV的T细胞表位，其为15聚体肽，HA1结构域之内H5_246-260，其诱导针对H5HA免疫的鸡中T细胞的作用(Haghighi，H.R.，等人，PLoS ONE，2009.4(11)：p.e7772)。

需知，在本公开和尤其在权利要求和/或段落中，术语例如“包括(comprises)”、“包括(comprised)”、“包括(comprising)”等可具有美国专利法规定的含义；例如，它们可意旨“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等；且术语例如“基本上由...构成(consisting essentially of)”和“基本上由...构成consistessentially of”具有美国专利法规定的含义，例如，它们允许不隐含提及的要素、但排除见于现有技术或影响本发明的基本的或新特征性的要素。

除非别有说明，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本公开所属的领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。单数术语“a，”“an，”和“the”包括复数，除非上下文明显表示别的。类似地，字“或”期望包括“及”，除非上下文明显表示别的。

说道“动物”期望是哺乳动物、鸟等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马类(例如、马)、狗类(例如、狗、狼、狐、山狗、豺)、猫类(例如、狮、虎、家养猫、野生猫、其他大猫、及其他猫包括猎豹及山猫)、绵羊类(例如、绵羊)、牛类(例如、牛)、猪类(例如、猪)、禽类(例如、鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(例如、狐猴、跗猴、猴、长臂猿、人猿)和鱼。术语“动物”也包括全部发育阶段的个体动物、包括胚胎及胚胎阶段。

术语“蛋白”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中使用互换，指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为线性或分支的、其可包括修饰的氨基酸或氨基酸类似物，及其可被非氨基酸的化学部分打断。术语也含盖天然地或通过干扰修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物反应性成分缀合。

本发明的抗原性多肽能保护免于流感。这是说，它们能在动物中刺激免疫应答。说道“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可包括全生物、杀死的、减弱的或活的抗原；生物的亚单位或部分；重组载体含有免疫原性性质的插入子；DNA片段能在呈递给宿主动物之后诱导免疫应答；多肽、表位、半抗原或其任何组合。另外，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。

本文所用的术语“免疫原性或抗原性多肽”包括一旦施用给宿主免疫学活跃的多肽，其能够引发针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选蛋白片段与总蛋白有基本上相同的免疫学活性。由此，根据发明的蛋白片段包括至少一种表位或抗原性决定子，或基本上由其构成或由其构成。本文所用的″免疫原性或抗原性″多肽包括蛋白的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。说道″免疫原性或抗原性片段″是指包括一个或多个表位的蛋白片段，且由此引起以上描述的免疫学应答。所述片段可使用本领域熟知的任何数的表位定位技术鉴定。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)。例如、线性表位可如下测定，例如，在固体支持物上同时合成大量的肽，相应于蛋白分子部分的肽，及使肽与抗体反应而肽仍附接于支持物。所述技术本领域中已知及描述于例如，美国专利No.4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986。类似地，构象表位通过确定氨基酸的空间构象轻易鉴定，例如通过，例如，X射线晶体学和2-维核磁性共振。见，例如，上述的表位定位流程。尤其可应用到小泰勒虫(T.parva)的蛋白的方法完全描述于通过引用整体并入本文的PCT/US2004/022605。

如所讨论，发明含盖抗原性多肽的活性片段和变体。由此、术语“免疫原性或抗原性多肽”还涵盖对序列的缺失、添加和置换，只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。术语″保守性变异″是指氨基酸残基被另一生物学类似残基取代，或核酸序列中的核苷酸取代而编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似残基。对此，尤其优选的置换将通常是性质保守性的，即，那些在氨基酸家族之内发生的置换。例如，氨基酸通常被分为的4个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性的--赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性--丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性--甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸被分类为芳族氨基酸。保守性变异之例包括：一种疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸用另一疏水残基置换，或一种极性残基用另一极性残基置换，例如精氨酸用赖氨酸置换、谷氨酸用天冬氨酸置换、或谷氨酰胺用天冬酰胺置换等；或氨基酸与结构上相关的氨基酸的将对生物学活性无主要效应的类似保守性取代。因此，与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有少数基本上不影响蛋白免疫原性的氨基酸置换的蛋白在参照多肽的定义之内。通过这些修饰产生的全部多肽包括在本文中。术语″保守性变异″也包括使用取代的氨基酸代替未经取代的亲本氨基酸，只要对于取代的多肽产生的抗体也与未经取代的多肽免疫反应。

术语″表位″指特异性B细胞和/或T细胞与之响应的抗原或半抗原上的位点。术语也与″抗原性决定子″或″抗原性决定子位点″互换使用。识别相同的表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定。

对组合物或疫苗的″免疫学应答″是在宿主中细胞和/或抗体-介导的对目的组合物或疫苗的免疫应答的发展。通常，″免疫学应答″包括但不限于下列效应的一种或多种：特异性地针对包括在目的组合物或疫苗的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、和/或细胞毒性T细胞的产生。优选，宿主将显示治疗性或保护免疫学应答，从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低。所述保护将被在感染的宿主中通过感染的宿主、更快恢复时间和/或降低的病毒滴度正常显示的症状的降低或缺乏展示。

合成的抗原也包括在定义之内，例如，多表位、侧翼表位、及其他重组或合成来源的抗原。见，例如，Bergmann et al.，1993；Bergmannet al.，1996；Suhrbier，1997；Gardner et al.，1998。用于本发明的目的的免疫原性片段将通常包括分子的至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10～15个氨基酸、或约15～25个氨基酸或更多氨基酸。片段长度无特别上限，其可包括几乎全长蛋白序列或甚至包括蛋白的至少一种表位的融合蛋白。

因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包括编码流感多肽的表位或抗原性决定子的核苷酸或基本上由其构成或由其构成。编码流感多肽的片段的多核苷酸可包括编码多肽的序列的最小15个核苷酸、约30～45个核苷酸、约45～75个或至少57、87或150个连续的核苷酸，或基本上由其构成或由其构成。表位确定过程，例如，产生重叠肽库(Hemmer等人，1998)，Pepscan(Geysen et al.，1984；Geysen etal.，1985；Van der Zee R.et al.，1989；Geysen，1990；Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人，1999；PCT/US2004/022605)可在本发明的实践中使用。

术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。术语也含盖RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非-限制实施例：基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸、例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，例如氟核糖及硫羟酸盐及核苷酸分支。核苷酸序列可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记成分缀合。本定义中包括的其他类型的修饰是加帽、将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物置换、及将多核苷酸附接到蛋白、金属离子、标记成分、其他多核苷酸或固体支持物的手段的导入。多核苷酸可通过化学合成得到或源于微生物。

广泛地使用的术语“基因”指与生物学功能相关的任何多核苷酸段。由此、基因如在基因组序列中一样包括内含子和外显子，或如在cDNA中一样仅包括编码序列和/或对于它们的表达所需的调控序列。例如、基因也指表达mRNA或有功能的RNA、或编码特异性蛋白的核酸片段及其包括调控序列。

发明还包括编码流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为多聚化体及可为任何长度的，及可含以任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。

“分离的”生物学成分(例如核酸或蛋白或细胞器)指在成分天然存在的生物细胞中从其他生物学成分(例如、其他染色体和额外的-染色体DNA和RNA、蛋白和细胞器)基本上分离的或纯化的成分。“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。术语也包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白。

本文所用的术语“纯化的”不要求绝对纯度；而期望是相对术语。由此，例如，纯化的多肽制剂是相比在其天然的环境中的多肽更富含多肽的制剂。这是从细胞成分分离的多肽。说道“基本上纯化的”期望是去除至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少98％、或更多细胞成分或物质的。同样，多肽可为部分纯化的。说道“部分纯化的”期望是少于60％的细胞成分或物质的除去。这同样应用于多核苷酸。本文中公开的多肽可通过本领域已知的任何手段纯化。

如上所述，抗原性多肽或其片段或变体是在浮萍中产生的流感抗原性多肽。公开的多核苷酸和由此编码的多肽的片段和变体也被本发明含盖。说道“片段”期望是多核苷酸的部分或由此编码的抗原性氨基酸序列的部分。多核苷酸的片段可编码保留天然的蛋白的生物学活性的蛋白片段，且因此如在本文中别处所述具有免疫原性活性。多肽序列片段保留在动物中诱导保护免疫应答的能力。

“变体”旨在表示基本上类似的序列。对于多核苷酸而言，变体包括：在天然的多核苷酸中的一个或多个位点的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加；和/或在天然的多核苷酸中的一个或多个位点的一个或多个核苷酸的置换。本文所述的“天然的”多核苷酸或多肽分别包括天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸的变体(即，参照多核苷酸)也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分率来评价。“变体”蛋白旨在表示通过在天然的蛋白中的一个或多个位点的一个或多个氨基酸的缺失或添加；和/或在天然的蛋白中的一个或多个位点的一个或多个氨基酸的置换源于天然的蛋白的蛋白。本发明含盖的变体蛋白是生物学活跃的，即它们有能力引起免疫应答。

来自禽、猪、马、猫、狗、鸭、火鸡、鸡、鹌鹑和其他物种(包括野生动物)的流感多肽的同源物旨在本发明的范围之内。本文所用的术语“同源物”包括直系同原物、类似物及旁系同原物。术语“类似物”指具有相同的或类似功能，但在不相关的生物中独立地进化的2种多核苷酸或多肽。术语“直系同原物”指来自不同的物种，但通过物种形成从共同的祖先基因进化而来的2种多核苷酸或多肽。正常而言，直系同原物编码具有相同的或类似功能的多肽。术语“旁系同原物”指通过在基因组之内复制相关的2种多核苷酸或多肽。旁系同原物通常具有不同的功能，但这些功能可相关。野生型流感多肽的类似物、直系同原物及旁系同原物可与野生型流感多肽不同在翻译后修饰、氨基酸序列差异或二者。尤其是，本发明的同源物将通常与野生型流感多肽或多核苷酸序列的全部或部分呈现至少80～85％、85～90％、90～95％或95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，及将呈现类似功能。

变体包括等位基因变体。术语″等位基因变体″指含导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如、病毒物种或变种)中存在的多态性的多核苷酸或多肽。所述天然的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽内1～5％变异。等位基因变体可通过在许多不同的物种中测序目的核酸序列来鉴定，这可通过使用杂交探针来鉴定那些物种中的相同的基因遗传座位来轻易进行。是天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的任何和全部所述核酸变异和得到的氨基酸多态性或变异期望在本发明的范围之内。

本文所用的术语″衍生物″或“变体”指具有一个或多个保守性氨基酸变异或其他微小修饰的多肽或编码多肽的核酸，从而(1)相应多肽相比野生型多肽具有基本上相当的功能，或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽具有免疫反应性。这些变体或衍生物包括具有流感多肽一级氨基酸序列的微小修饰(可产生相比未修饰的对应多肽具有基本上相当的活性的肽)的多肽。所述修饰可为故意的(如通过定点诱变)或可为自发的。术语“变体”还涵盖序列的缺失、添加和置换，只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。术语“变体”也包括天然的信号肽用异源信号肽取代以辅助多肽从宿主物种表达或分泌的多肽的修饰。其也包括跨膜结构域和/或细胞质尾用类似异源序列取代以辅助多肽在宿主物种中膜表达的多肽修饰。

术语″保守性变异″是指氨基酸残基用另一生物学类似残基取代、或核酸序列中核苷酸取代，从而编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似残基。对此，尤其优选的置换将通常是性质上保守的，如以上所述。

公开的多核苷酸包括遗传密码简并的序列，例如，对于特定宿主的优化的密码子利用。本文所用的“优化的”指经遗传加工来增加其给定物种中的表达的多核苷酸。为提供编码流感多肽的优化的多核苷酸，可修饰流感蛋白基因的DNA序列来：(1)包括在特定物种中高表达的基因优选的密码子；(2)在核苷酸碱基组成中包括基本上在所述物种中发现的A+T或G+C含量；(3)形成所述物种的起始序列；或(4)消除导致去稳定、不适当的多聚腺苷酸化、RNA的降解和终止、或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。流感蛋白在所述物种中增加的表达可通过利用在真核生物及原核生物，或在特定物种中密码子利用的分布频度来实现。术语“优选的密码子利用的频度”指由特定宿主细胞在核苷酸密码子利用中呈现的偏好，以指定给定氨基酸。有20种天然的氨基酸，其中多数由多于一种密码子指定。因此，全部简并核苷酸序列包括在公开中，只要由核苷酸序列编码的流感多肽的氨基酸序列在功能性上未变化。

2个氨基酸序列之间的序列同一性可通过NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)配对blast和blosum62矩阵、使用标准参数建立(见、例如，在″National Center for BiotechnologyInformation″(NCBI，Bethesda，Md.，美国)服务器可用的BLAST或BLASTX算法，也见Altschul等人；及由此，此文献通过术语“blast”说道使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。

有关序列的“同一性”可指相同的核苷酸或氨基酸除以2个序列中较短者的核苷酸或氨基酸数的位置数，其中2个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)、例如、使用20个核苷酸的窗尺寸、4个核苷酸的字长、及4的空位罚分确定、及包括比对的序列数据的计算机-辅助的分析和解释可使用商业上可用的程序方便地进行(例如，Intelligenetics^TM Suite，Intelligenetics Inc.CA)。当说道RNA序列类似、或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。由此、RNA序列在本发明范围之内及可衍生自DNA序列，通过认为DNA序列中的胸苷(T)与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。

2个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA)确定。

以下文献提供比较序列的相对同一性或同源性的算法，及附加地或代替性地与上述相关，这些参考文献的教导可用于确定百分率同源性或同一性：needleman SB和Wunsch CD；Smith TF和Waterman MS；Smith TF、Waterman MS和Sadler JR；Feng DF和Dolittle RF；Higgins DG和Sharp PM；Thompson JD、Higgins DG和Gibson TJ；及Devereux J、Haeberlie P和Smithies O.及、无需额外实验、本领域技术人员可借助许多其他程序或参考文献来确定百分率同源性。

杂交反应可在不同的“严格度”条件下进行。熟知增加杂交反应的严格度的条件。见例如，“分子克隆：实验室手册”，第二版(Sambrook等人，1989)。

“载体”指包括待体外或体内递送到靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包括预防或治疗目的的目的序列，及可任选以表达盒形式。如本文所用，载体需要在最终的靶细胞或受试者中不能复制。术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“重组”是指半合成、或合成来源的，自然上不会存在或以不见于自然的排列连接到另一多核苷酸的多核苷酸。

“异源”是指相比与之比较的实体，源于遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可通过遗传加工技术放入源于不同的来源的质粒或载体，及是异源多核苷酸。从其天然的编码序列移出的及可操作连接到编码非天然的序列的序列的启动子是异源启动子。

本发明涉及禽疫苗或药学或免疫学组合物，其可包括有效量的重组禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。

本文中所述的主题部分针对与如下惊人的发现相关的组合物和方法：在植物蛋白表达系统中制备的禽流感抗原是高度免疫原性的且保护鸡免于来自同源和异源禽流感株的攻击。

【组合物】

在一实施方式中，本文中公开的主题针对组合物，其包括流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对组合物，其包括通过浮萍表达系统产生的禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对组合物，其包括通过浮萍表达系统和来自浮萍属的植物材料产生的禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对通过包括禽流感抗原的浮萍表达系统产生的蛋白。蛋白可为糖基化的。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对通过包括禽流感抗原的浮萍表达系统和来自浮萍属的植物材料产生的蛋白。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对表达禽流感抗原的稳定转化的植物或植物培养物，其中植物或植物培养物选自浮萍属。

在一实施方式中，其中禽流感免疫学组合物或疫苗是重组免疫学组合物或疫苗、组合物或疫苗包括重组载体和药学或兽医学可接受的赋形剂、载质或媒质；重组载体是可包括编码流感多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的植物表达载体。流感多肽、抗原、表位或免疫原、可为血凝素、基质蛋白、神经氨酸酶、非结构性蛋白、核蛋白、聚合酶或其任何片段。

在另一实施方式中，流感多肽、抗原、表位或免疫原可源于感染流感或禽流感株的禽。在一个实施方式中，禽流感抗原、表位或免疫原是血凝素(HA)(例如、HA0前体、HA1和/或HA2)、H1、H2、蛋白、矩阵蛋白(例如、矩阵蛋白M1或M2)、神经氨酸酶、非结构性(NS)蛋白(例如、NS1或NS2)、核蛋白(NP)和聚合酶(例如、PA聚合酶、PB1聚合酶1或PB2聚合酶2)。A型流感病毒可感染人、鸟、猪、马、狗、猫和其他动物，但野生鸟是这些病毒的天然的宿主。

在另一实施方式中，禽流感抗原可为来自不同的流感A亚型的血凝素(HA)(实施例：H1，H3，H5，H6，H7，H9)。再一实施方式中，禽流感抗原可为来自H5N1分离物的HA。在另一实施方式中，H5N1抗原分离自A/鸡/印度尼西亚/7/2003株。

本发明涉及禽疫苗或组合物，其可包括有效量的重组禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。在一个实施方式中，禽流感抗原可为血凝素。

在另一实施方式中，重组流感抗原在植物中表达。再一实施方式中，植物是浮萍。再一实施方式中，植物是浮萍植物。在一个实施方式中，重组流感抗原可在专利浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统，Biolex′s LEX system^SM中表达。

在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质可为油包水乳液。再一实施方式中，油包水乳液可为水/油/水(W/O/W)三层乳液。再一实施方式中，药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质可为水包油乳液。

发明还含盖含于载体分子或表达载体及可操作连接到启动子元件和任选到增强子的流感多核苷酸。

在一方面，本发明提供流感多肽，尤其禽流感多肽。在另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽和其变体或片段。

在另一方面，本发明提供与本发明的抗原性多肽、尤其与具有如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽。

再一方面，本发明提供以上鉴定的流感多肽的片段和变体(SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14)，其可由本领域技术人员使用熟知的分子生物学技术容易制备。

变体是与本发明的抗原性多肽、尤其与如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。

流感多肽的免疫原性片段包括具有如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的序列的流感多肽或其变体的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸、或至少30个氨基酸。在另一实施方式中，流感多肽的片段包括见于全长流感多肽的特异性抗原性表位。

在另一方面，本发明提供编码流感多肽的多核苷酸，例如编码具有如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽的多核苷酸。再一方面，本发明提供编码与具有如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的序列的多肽或包括这些多肽之一或这些多肽的组合的至少8个或至少10个连续氨基酸的保守性变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供具有如SEQ ID NO：1、3、7、9、11或13所示的核苷酸序列的多核苷酸或其变体。再一方面，本发明提供与具有如SEQ ID NO：1、3、7、9、11或13所示的序列的多核苷酸之一或其变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可包括额外的序列，例如相同的转录单元之内的额外的编码序列、控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、在相同的或不同的启动子控制下的额外的转录单元、允许克隆、表达、同源重组、及宿主细胞转化的序列及任何所述构建体，如提供本发明的实施方式可期望的。

本发明的载体中有利地存在用于表达流感多肽、抗原、表位或免疫原的元件。以最小方式，此包括：起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子、及任选用于某些载体例如质粒和某些病毒载体，例如，除了痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化序列，或基本上尤其构成或由其构成。当多核苷酸有利地在载体中编码多肽片段、例如流感肽时，ATG位于阅读框的5′，而终止密码子位于3′。可存在其他用于控制表达的元件，例如增强子序列、稳定序列、例如允许蛋白分泌的内含子和信号序列。

本发明也涉及包括载体，例如表达载体的制剂，例如，治疗性组合物。制剂可包括一个或多个载体，例如、表达载体、例如体内表达载体、包括和表达一种或多种流感多肽、抗原、表位或免疫原。在一个实施方式中，载体含和表达多核苷酸，其在药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质中包括：编码(及有利地表达)流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸，或基本上尤其构成或由其构成。由此，根据本发明的实施方式，制剂中的其他载体包括如下多核苷酸，或基本上由其构成或由其构成，所述多核苷酸编码、及在适当的环境下，载体表达一种或多种流感多肽、抗原、表位或免疫原(例如、血凝素、神经氨酸酶、核蛋白)或其片段的其他蛋白。

根据另一实施方式，制剂中的载体包括：编码流感多肽、抗原、表位或免疫原的一种或多种蛋白或其片段的多核苷酸，表达多核苷酸的载体，或基本上由其构成或由其构成。在另一实施方式中，制剂包括1、2或更多种包括编码和有利地体内表达流感多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸的载体。发明也针对包括编码和表达来自除了禽物种(包括鸡、鸭、火鸡、鹌鹑及鹅)之外的不同的物种(例如但不限于人、马、猪、狗、猫)的不同的流感多肽、抗原、表位或免疫原、例如、流感多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的载体混合物。

根据本发明的再一实施方式，表达载体是质粒载体或DNA质粒载体，尤其是体内表达载体。在特定的、非-限制实施例中，可利用pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke等人，1997；Hartikka等人，1996，见，例如，U.S.专利No.5,846,946和6,451,769)作为用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒源于pVR1012和含人tPA信号序列。在一个实施方式中，人tPA信号包括在Genbank中以登录号HUMTPA14的氨基酸M(1)～氨基酸S(23)。在另一特定的，非-限制实施例中，用作用于插入多核苷酸序列的载体的质粒可含Genbank中以登录号U28070的氨基酸M(24)～氨基酸A(48)的马IGF1的信号肽序列。可在实践中咨询或采用的DNA质粒的额外的信息见于，例如，U.S.专利No.6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362。

术语质粒覆盖包括根据本发明的多核苷酸和对于其在期望的宿主或靶细胞中体内表达必需的元件的任何DNA转录单元；及、对此、需知，超螺旋的或非-超螺旋的，环状质粒，以及线性形式，期望在本发明范围之内。

各质粒包括或含编码流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸或基本上由其构成、除了编码流感抗原、表位或免疫原的多核苷酸之外、任选与异源肽序列、变体、类似物或片段融合、可操作连接到启动子或在启动子控制下或依赖于启动子。通常而言，采用在真核细胞中有功能的强启动子有利。强启动子可为但不限于人或鼠来源(或任选具有另一来源(例如大鼠或豚鼠))的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，超级启动子(Ni，M.et al.，Plant J.7，661-676，1995)。CMV-IE启动子可包括实际启动子部分，其可或可不与增强子部分相联。参考文献见EP-A-260148，EP-A-323597，U.S。专利No.5,168,062、5,385,839和4,968,615，也至于PCT申请No WO87/03905。CMV-IE启动子有利地为人CMV-IE(Boshart等人，1985)或鼠CMV-IE。

更通常而言，启动子是病毒、植物或细胞来源的。可用于本发明的实践的非CMV-IE的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可用于本发明的实践的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，例如，结蛋白启动子(Kwissa等人、2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人，1989)。

可使用任何组成性、可调节的或刺激-依赖性启动子。例如，组成性启动子可包括来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶启动子。或者，使用热休克基因启动子、旱-诱导性基因启动子、病原体-诱导性基因启动子、创伤-诱导性基因启动子及光照/暗-诱导性基因启动子是可为有利的。其可对于使用由植物生长调节剂、例如脱落酸、茁长素、细胞分裂素及赤霉酸控制的启动子有用。可也选择给出组织-特异性表达的启动子(例如、根、叶和花-特异性启动子)。

质粒可包括其他表达控制元件。其对于合并稳定序列，例如，内含子序列，例如，玉米醇脱氢酶内含子(玉米ADHI内含子)，hCMV-IE的第一内含子(PCT申请No.WO1989/01036)，兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，1979)尤其有利。在另一实施方式中，质粒可包括3’UTR。3’UTR可为但不限于土壤杆菌胆脂碱合酶(Nos)3’UTR。

至于用于质粒和非痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A)，更可使用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(见U.S.5,122,458)、或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。

“宿主细胞”表示已通过施用外源多核苷酸、例如重组质粒或载体经遗传改变的、或能遗传改变的原核生物或真核细胞。当说道遗传改变的细胞时，术语是指原本改变的细胞及其后代。

在一个实施方式中，在转基因浮萍植物中表达重组流感抗原。在另一实施方式中，转基因植物是浮萍植物。再一实施方式中，转基因植物是浮萍(Lemna minor)。再一实施方式中，重组流感抗原可在浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统，Biolex′s LEX system^SM中表达。浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统的细节可见于例如，U.S专利No6,815,184；7,022,309；7,160,717；7,176,024、6,040,498、7,161,064和7,326,38；将其公开内容通过引用整体并入本文。流感抗原在一实施方式中可为本文中公开的任何多肽，或由本文中公开的任何多核苷酸编码的多肽。

【在浮萍中表达抗原性流感多肽的方法】

由此，在本发明的一些实施方式中，流感多肽、或其片段或变体，在浮萍中表达。这些方法包括使用本领域已知的任何适宜转化方法导入浮萍植物的表达盒的使用。这些表达盒之内的多核苷酸可如下修饰用于抗原性流感多肽、或其片段或变体，在浮萍中增强的表达。

【用于抗原性流感多肽的浮萍表达的盒】

表达流感多肽、或其片段或变体的转基因浮萍通过用包括编码流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达盒转化浮萍得到。以此方式，将编码目的流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸构建入表达盒及通过本领域已知的任何适宜转化方法导入浮萍植物。

在一些实施方式中，用包括编码目的流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达盒转化的浮萍植物也用提供用于另一目的异源多肽、例如、另一流感多肽、片段或其变体的表达的表达盒转化。提供用于另一目的异源多肽的表达的表达盒可提供于用于在相同的时间或在不同的时间，通过相同的或通过不同的导入方法、例如、通过相同的或不同的转化方法导入浮萍植物的相同的多核苷酸(例如，于相同的转化载体)，或提供于用于在相同的时间或在不同的时间，通过相同的或通过不同的导入方法，例如，通过相同的或不同的转化方法导入浮萍植物的不同的多核苷酸(例如，于不同的转化载体)。

用于转化浮萍的表达盒包括可操作连接到目的多核苷酸(即、编码抗原性流感多肽、其片段或变体的多核苷酸)的至少包括转录起始区(例如，启动子)的表达控制元件。本文参照核苷酸序列所用的“可操作连接的”指以功能关系彼此放置的多种核苷酸序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，且如果需要，在阅读框中接合2个蛋白编码区。所述表达盒提供有多个限制位点用于插入目的多核苷酸(例如、1种目的多核苷酸、2种目的多核苷酸、等)在启动子和其他表达控制元件的转录调节下。在本发明的特别的实施方式中，待转移的多核苷酸含2或多个表达盒，每各含至少一种目的多核苷酸。

说道“表达控制元件”期望是DNA的调控区，通常包括TATA盒，能引导RNA聚合酶II(或在一些实施方式中是RNA聚合酶III)在用于特定编码序列的适当的转录起始位点起始RNA合成。表达控制元件可附加地包括通常定位在TATA盒的上游或5′的其他识别序列，其影响(例如，增强)转录起始速度。此外，表达控制元件可附加地包括通常定位在TATA盒的下游或3′的序列，其影响(例如，增强)转录起始速度。

转录起始区(例如、启动子)可为天然的或对于浮萍宿主是同源或外源或异源的、或可为天然的序列或合成的序列。说道外源，期望转录起始区不见于待导入转录起始区的野生型浮萍宿主。说道“有功能的启动子”，期望是启动子，当可操作连接到编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的序列时，能驱动编码的多肽、片段或变体的表达(即、转录和翻译)。启动子可基于期望的结果选择。由此，本发明的表达盒可包括组成性、诱导性、组织-优选的或其他用于在浮萍中表达的启动子。

可在根据本发明的表达盒中采用任何本领域已知的适宜启动子，包括细菌、酵母、真菌、昆虫、哺乳动物和植物启动子。例如，可使用植物启动子，包括浮萍启动子。例示启动子包括、但不限于花椰菜花叶病毒35S启动子、冠瘿碱合成酶启动子(例如、nos、mas、ocs、等)、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸(RubP)羧基化酶小亚基启动子及醇脱氢酶启动子。本领域已知浮萍RubP羧基化酶小亚基启动子(Silverthorne et al.(1990)Plant Mol.Biol.15：49)。其他来自感染植物(优选浮萍)的病毒的启动子，也适宜包括但不限于分离自芋花叶病毒，小球藻病毒(例如，小球藻病毒腺飘零甲基转移酶启动子；Mitra et al.(1994)Plant Mol.Biol.26：85)、番茄斑萎病毒、烟草脆裂病毒、烟草坏死病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、黄瓜花叶病毒、花生残肢病毒、紫花苜蓿花叶病毒、甘蔗杆状DNA病毒等的启动子。

可选择表达控制元件，包括启动子来给出期望的调节水平。例如，在一些实例中，使用赋予组成性表达的启动子(例如来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶启动子)可有利。或者，在其他情况中，使用响应特异性环境刺激活化的启动子(例如，热休克基因启动子、旱-诱导性基因启动子、病原体-诱导性基因启动子、创伤-诱导性基因启动子、及光照/暗-诱导性基因启动子)或响应植物生长调节剂活化的启动子(例如，来自基因诱导的通过脱落酸、茁长素、细胞分裂素及赤霉酸的启动子)可有利。作为替代，可选择给出组织-特异性表达的启动子(例如、根、叶和花-特异性启动子)。

给定启动子的总体强度可受到顺式-作用核苷酸序列(例如上游活化序列)的组合和空间组织的影响。例如，源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶基因的活化核苷酸序列可增强来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶启动子的转录(见U.S.专利5,955,646，Gelvin等人)。在本发明中，表达盒可含插入启动子序列的上游来增强目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的表达的活化核苷酸序列。在一个实施方式中，表达盒包括源于可操作连接到源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶基因的启动子的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶基因的3个上游活化序列(见U.S专利5,955,646，通过引用并入本文)。

表达盒由此以5′-3′转录方向包括：包括转录和翻译起始区的表达控制元件、编码目的抗原性流感多肽(或其片段或变体)的多核苷酸、及在植物中有功能的转录和翻译终止区。可根据本发明使用本领域已知的任何适宜终止序列。终止区可与转录起始区相同来源、可与目的编码序列相同来源或可源于另一来源。方便的终止区从根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒可用，例如章鱼碱合成酶及胆脂碱合成酶终止区。也见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141；Proudfoot(1991)Cell 64：671；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261；Munroe et al.(1990)Gene91：151；Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891；及Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15：9627。额外的例示终止序列是豌豆RubP羧基化酶小亚基终止序列和花椰菜花叶病毒35S终止序列。

通常，表达盒将包括用于选择转化的浮萍细胞或组织的可选择的标记基因。可选择的标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码不敏感于除草剂的修饰的靶蛋白或编码其可发挥作用之前在植物中降解或脱毒除草剂的酶。见DeBlock et al.(1987)EMBO J.6：2513；DeBlock etal.(1989)Plant Physiol.91：691；Fromm et al.(1990)BioTechnology8：833；Gordon-Kamm et al.(1990)Plant Cell 2：603。例如，对glyphosphate或磺酰脲除草剂的抗性已使用编码突变体靶酶、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)及乙酰乳酸合酶(ALS)的基因得到。对草铵膦铵、溴苯腈和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的抗性已通过使用编码脱毒相应除草剂的膦丝菌素乙酰基转移酶、腈水解酶或2，4-二氯苯氧基乙酸单氧合酶的细菌基因得到。

为本发明的目的，可选择的标记基因包括，但不限于，编码下列的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley et a1.(1986)CRC CriticalReviews in Plant Science 4：1)；氰酰胺水合酶(Maier-Greiner et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4250)；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Perl et al.(1993)BioTechnology 11：715)；条基因(Tokiet al.(1992)Plant Physiol.100：1503；Meagher et al.(1996)Crop Sci.36：1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn et al.(1993)Plant Mol.Biol.22：907)；新霉素磷酸转移酶(NE O；Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Gen.1：327)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG；Shimizu et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6：1074)；二氢叶酸还原酶(DHFR；Kwok等人(1986)Proc.natl.acad.sci.美国83：4552)；膦丝菌素乙酰基转移酶(DeBlock等人(1987)EMBO J.6：2513)；2，2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron et al.(1989)J.Cell.Biochem.13D：330)；乙酰羟酸合酶(U.S.pat.No.4,761,373，Anderson等人；Haughn等人(1988)Mol.gen.Genet.221：266)；5-烯醇丙酮酰基-莽草酸-磷酸合酶(aroA；Comai et al.(1985)Nature 317：741)；卤芳基腈水解酶(WO 87/04181，Stalker等人)；乙酰基-辅酶A羧基化酶(Parker etal.(1990)Plant Physiol.92：1220)；二氢蝶酸合酶(sulI；Guerineau etal.(1990)Plant Mol.Biol.15：127)；及32kDa光系统II多肽(psbA；Hirschberg等人(1983)Science 222：1346(1983))。

也包括编码对下列抗性的基因：庆大霉素(例如，aacC1，Wohlleben et al.(1989)Mol.Gen.Genet.217：202-208)；氯霉素(Herrera-Estrella et al.(1983)EMBO J.2：987)；甲氨喋呤(Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303：209；Meijer et al.(1991)Plant Mol.Biol.16：807)；潮霉素(Waldron et al.(1985)Plant Mol.Biol.5：103；Zhijian et al.(1995)Plant Science 108：219；Meijer et al.(1991)Plant Mol.Bio.16：807)；链霉素(Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.210：86)；大观霉素(Bretagne-Sagnard et al.(1996)TransgenicRes.5：131)；博来霉素(Hille et al.(1986)Plant Mol.Biol.7：171)；磺酰胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Bio.15：127)；溴苯腈(Stalker et al.(1988)Science 242：419)；2，4-D(Streber et al.(1989)BioTechnology 7：811)；膦丝菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.6：2513)；大观霉素(Bretagne-Sagnard and Chupeau，TransgenicResearch 5：131)。

条基因赋予对草铵膦-类型除草剂(例如膦丝菌素(PPT)或双丙氨膦等)的除草剂抗性。如上所述，其他可在载体构建体中使用的可选择的标记物包括，但不限于pat基因、也用于双丙氨膦及膦丝菌素抗性、用于咪唑啉酮抗性的ALS基因、用于潮霉素抗性的HPH或HYG基因、用于草甘膦抗性的EPSP合酶基因、用于对Hc-毒素的抗性的Hm1基因、及本领域技术人员常规使用的和已知的其他选择性试剂。见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506；Chistophersonet al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314；Yao et al.(1992)Cell71：63；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419；Barkley et al.(1980)The Operon 177-220；Hu et al.(1987)Cell 48：555；Brown et al.(1987)Cell 49：603；Figge et al.(1988)Cell 52：713；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549；Deuschle et al.(1990)Science 248：480；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：5072；Wyborski et al.(1991)Nuc.Acids Res.19：4647；Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10：143；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35：1591；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094；Gatz et al.(1992)Plant J.2：397；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913；Hlavka etal.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology 78；and Gill et al.(1988)Nature 334：721。所述公开内容通过引用并入本文。

以上可选择的标记基因的列表不是有限的。任何可选择的标记基因可在本发明中使用。

【用于在植物宿主中增强的表达的核苷酸序列的修饰】

当抗原性流感多肽或其片段或变体在浮萍中表达时，可修饰表达的编码流感多肽或其片段或变体的多核苷酸序列来增强其在浮萍中的表达。一种所述修饰是使用植物-优选的密码子(尤其浮萍-优选的密码子)的多核苷酸的合成。本领域中可用对于合成有植物-优选的密码子的核苷酸序列的方法。见，例如，U.S.Patent Nos.5，380,831 and5,436,391；EP 0 359 472；EP 0 385 962；WO 91/16432；Perlak et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 15：3324；Iannacome et al.(1997)Plant Mol.Biol.34：485；and Murray et al.(1989)Nucleic Acids.Res.17：477，通过引用并入本文。合成可使用任何本领域技术人员已知的方法实现。优选的密码子可由浮萍中表达的蛋白中最高频度的密码子确定。例如，浮萍(Lemna minor)的密码子利用的频度见于下表。

浮萍(Lemna minor)[gbpln]：4CDS′s(1597个密码子)

为本发明的目的，“浮萍-优选的密码子”指在浮萍中具有大于17％的密码子利用的频度的密码子。本文所用的“浮萍-优选的密码子”指在浮萍属中具有大于17％的密码子利用的频度的密码子。本文所用的“浮萍(Lemna minor)-优选的密码子”指在浮萍(Lemna minor)中具有大于17％的密码子利用的频度的密码子，其中浮萍(Lemnaminor)中密码子利用的频度从密码子利用数据库(GenBank释放160.0(2007年6月15日))得到。

还需知编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的全部或任何部分可优化或合成。换言之，也可使用完全优化的或部分优化的序列。例如、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的密码子可为浮萍-优选的密码子。在一个实施方式中，90和96％之间的密码子是浮萍-优选的密码子。编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸序列的编码序列可包括以在膨胀浮萍(Lemna gibba)中至少17％的频度或在浮萍(Lemna minor)中至少17％的频度使用的密码子。在一个实施方式中，流感多肽是HA多肽，例如，SEQ ID NO：2所示的HA多肽、及表达盒包括用于此HA多肽的优化的编码序列、其中编码序列包括浮萍-优选的密码子、例如、浮萍(Lemna minor)-优选的或膨胀浮萍(Lemna gibba)-优选的密码子。在所述实施方式中，表达盒包括SEQ ID NO：1，其含编码SEQ ID NO：2所示的HA多肽的浮萍(Lemna minor)-优选的密码子。

也可对编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸进行其他修饰来增强其在浮萍中的表达。这些修饰包括、但不限于消除编码假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列和其他此类可对基因表达有害的良好表征的序列。序列的G-C含量可调整到浮萍的平均水平，如通过参照在此植物中表达的已知的基因计算。当可能时，可修饰编码目的异源多肽的多核苷酸来避免预测的发卡二级mRNA结构。

动物和植物的翻译起始密码子的最佳翻译起始背景核苷酸序列之间有已知的差异。本文所用的“翻译起始背景核苷酸序列”指直接在翻译起始密码子的5′的3个核苷酸的同一性。“翻译起始密码子”指起始从目的核苷酸序列转录的mRNA的翻译的密码子。这些翻译起始背景核苷酸序列的组成可影响翻译起始的效率。见，例如，Lukaszewicz etal.(2000)Plant Science 154：89-98；and Joshi et al.(1997)；Plant Mol.Biol.35：993-1001。在本发明中，可修饰编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的翻译起始密码子的翻译起始背景核苷酸序列来增强在浮萍中的表达。在一个实施方式中，修饰核苷酸序列，从而翻译起始密码子的直接上游的3个核苷酸是″ACC″。在第二实施方式中，这些核苷酸是″ACA″。

抗原性流感多肽在浮萍中的表达可也通过使用5′前导序列来增强。所述前导序列可发挥增强翻译的作用。本领域已知翻译前导序列及包括，但不限于，微小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区；Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA 86：6126)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒；Allison et al.(1986)Virology 154：9)；人免疫球蛋白重-链结合蛋白(BiP；Macajak and Sarnow(1991)Nature 353：90)；来自紫花苜蓿花叶病毒的包被蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4；Jobling and Gehrke(1987)Nature 325：622)；烟草花叶病毒前导序列(TMV；Gallie(1989)Molecular Biology of RNA，23：56)；马铃薯蚀纹病毒前导序列(Tomashevskaya et al.(1993)J.Gen.Virol.74：2717-2724)；Fed-15′未翻译的区(Dickey(1992)EMBO J.11：2311-2317)；RbcS 5′未翻译的区(Silverthorne et al.(1990)J.Plant.Mol.Biol.15：49-58)；及玉米黄萎病斑点病毒前导序列(MCMV；Lommel et al.(1991)Virology 81：382)。见也，Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiology 84：965。包括植物内含子序列、包括来自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因、蓖麻豆过氧化氢酶基因或拟南芥色氨酸通路基因PAT1的内含子序列的前导序列也显示增加在植物中的翻译效率(Callis et al.(1987)Genes Dev.1：1183-1200；Mascarenhas et al.(1990)Plant Mol.Biol.15：913-920)。

在本发明的一些实施方式中，将相应于玉米醇脱氢酶1基因(ADH1；GenBank登录号X04049)的核苷酸1222～1775的核苷酸序列插入编码目的抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸上游来增强其翻译效率。在另一实施方式中，表达盒含来自膨胀浮萍(Lemnagibba)核酮糖-双-磷酸羧基化酶小亚基5B基因的前导序列(RbcS前导序列；见Buzby et al.(1990)Plant Cell 2：805-814)。

需知，以上描述的任何表达-增强核苷酸序列修饰可在本发明中使用，包括任何单个修饰或任何可能的修饰的组合。短语本文所用的在浮萍中“修饰用于增强的表达”指含这些修饰的任何一种或任何组合的多核苷酸序列。

【信号肽】

目的流感多肽可作为分泌的蛋白正常或有利地表达。分泌的蛋白通常从包括与内质网(ER)膜上的受体蛋白相互作用来引导生长的多肽链跨膜及转位进入内质网用于从细胞分泌的“信号肽”的前体多肽翻译。此信号肽常从前体多肽切割下产生缺少信号肽的“成熟的”多肽。在本发明的一实施方式中，流感多肽、或其片段或变体，在浮萍中从与编码引导抗原性流感多肽、或其片段或变体分泌进入培养基的信号肽的核苷酸序列可操作连接的多核苷酸序列表达。本领域已知使蛋白转位靶向到内质网的植物信号肽(用于细胞外分泌)。见，例如，U.S。专利No.6,020,169。在本发明中，任何植物信号肽可用于将表达的多肽靶向ER。

在一些实施方式中，信号肽是拟南芥(Arabidopsis thaliana)碱性内切壳多糖酶信号肽(NCBI蛋白Accession No.BAA82823的氨基酸14～34)，伸展蛋白信号肽(Stiefel et al.(1990)Plant Cell2：785-793)，稻α-淀粉酶信号肽(NCBI蛋白Accession No.AAA33885的氨基酸1～31；见也GenBank M24286)。在另一实施方式中，信号肽对应于分泌的浮萍蛋白的信号肽。

或者，哺乳动物信号肽可用于使重组产生的抗原性流感多肽靶向用于从浮萍分泌。已展示，植物细胞识别靶向内质网的哺乳动物信号肽，且这些信号肽可引导多肽不仅通过血浆膜而且通过植物细胞壁分泌。见U.S专利No 5,202,422和5,639,947。

在一个实施方式中，利用以上公开的任何修饰或修饰的组合修饰编码信号肽的核苷酸序列用于目的多核苷酸序列在浮萍中增强的表达。

分泌的抗原性流感多肽、或其片段或变体可通过任何本领域已知的常规手段(包括但不限于层析、电泳、透析、溶剂-溶剂提取等)从培养基收获。由此，可从培养基得到部分或基本上纯化的抗原性流感多肽、或其片段或变体。

【转化的浮萍植物和浮萍根瘤培养物】

本发明提供表达目的流感多肽、或其片段或变体的转化的浮萍植物。术语“浮萍”指浮萍科的成员。此家族目前分为如下5个属和38个物种的浮萍：浮萍属(Lemna)(稀脉萍(L.aequinoctialis)，L.disperma，L.ecuadoriensis，膨胀浮萍(L.gibba)，日本脉萍(L.Japonica)，脉萍(L.minor)，L.miniscula，L.obscura，L.perpusilla，L.tenera，L.trisulca，L.turionifera，L.valdiviana)；紫萍属(Spirodela)(S.intermedia，紫萍(S.polyrrbiza)，S.punctata)；芜萍属(Wolffia)(Wa.angusta，Wa.arrhiza，Wa.australina，Wa.borealis，Wa.brasiliensis，Wa.columbiana，Wa.elongata，Wa.globosa，Wa.microscopica，Wa.neglecta)；Wolfiella属(Wl.caudata、Wl.denticulata、Wl.gladiata、Wl.hyalina、Wl.lingulata、Wl.repunda、Wl.rotunda及Wl.neotropica)和Landoltia属(L.punctata)。浮萍科的任何其他属或物种(如果它们存在)也在本发明的范围内。浮萍物种可使用由Landolt(1986)Biosystematic Investigation on the Family ofDuckweeds：The family of Lemnaceae-A Monograph Study(Geobatanischen Institut ETH，Stiftung Rubel，Zurich)描述的分类方案分类。

本文所用的“植物”包括全植物、植物器官(例如、frond(叶)、茎、根、等)、种子、植物细胞及其后代。转基因植物的部分旨在理解为在发明的范围之内，包括、例如、源于之前用目的多核苷酸转化的和因此至少部分由转基因细胞构成的转基因植物或它们的后代的可再生植物的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物、组织、植物愈伤组织、胚胎以及花、胚珠、茎、果实、叶、根、根尖、根瘤、等。本文所用的术语“植物细胞”包括种子、胚胎、胚珠、分生组织区、愈伤组织、叶、叶状体(frond)、根、根瘤、芽、花药和花粉的细胞。

本文所用的“浮萍根瘤”是指包括其中至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞是分化细胞的浮萍细胞的浮萍组织。本文所用的“分化的细胞”是指具有将其从未分化的细胞或从见于其他组织类型的细胞区别开来的至少一种表型特征性(例如，不同的细胞形态或标记核酸或蛋白的表达)的细胞。本文中描述的浮萍根瘤培养物的分化的细胞在它们的相邻细胞壁形成与已组织成扩散到组织的叶原基的根瘤互连的细胞的平滑表面。根瘤培养物组织表面是经胞间连丝彼此连接的表皮细胞。

浮萍的生长习惯对于培养方法是理想的。植物通过新叶的植物性芽殖以类似于在酵母中无性繁殖的宏观方式快速增值。此增殖通过从分生组织细胞的植物性芽殖发生。分生组织区小，且见于叶的腹表面。分生组织细胞位于2个囊中，一个在叶中脉的各侧。小的中脉区也是根来源及茎产生的位点，其将各叶与其母叶相连。分生组织囊被组织瓣保护。叶从这些囊交替生芽。倍增时间随物种不同，及短至20～24小时(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67：271；Chang et al.(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24：19；Datko and Mudd(1970)Plant Physiol.65：16；Venkataraman et al.(1970)Z.Pflanzenphysiol.62：316)。浮萍的密集培养导致最高速度的生物质蓄积/单位时间(Landolt and Kandeler(1987)The Family of Lemnaceae-AMonographic Study Vol.2：Phytochemistry，Physiology，Application，Bibliography(Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH，Stiftung Rubel，Zurich))，跨6～15％的新鲜重量的干重量蓄积(Tillberg et al.(1979)Physiol.Plant.46：5；Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67：271；Stomp，未公开的数据)。已报告在变化的条件下生长的许多浮萍物种的蛋白含量在15～45％干重量的范围(Chang et al.(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24：19；Chang andChui(1978)Z.Pflanzenphysiol.89：91；Porath et al.(1979)AquaticBotany 7：272；Appenroth et al.(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177：251)。使用这些值，浮萍中培养基的蛋白产生水平/l与酵母基因表达系统呈现相同的量级。

本发明的转化的浮萍植物可通过将包括编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达构建体导入目的浮萍植物来得到。

在多核苷酸(例如、包括编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达构建体)背景下的术语“导入”旨在表示以多核苷酸进入浮萍植物细胞内的方式给浮萍植物提供多核苷酸。当待导入多于一种多核苷酸时，这些多核苷酸可组装为单个核苷酸构建体的部分，或组装为分离的核苷酸构建体，且可位于相同的或不同的转化载体。因此，这些多核苷酸可在单个转化事件中、在分离的转化事件中或，例如，作为繁殖过程的一部分导入目的浮萍宿主细胞。本发明的组合物和方法不依赖于将一种或多种多核苷酸导入浮萍植物的特定方法，只要多核苷酸进入浮萍植物的至少一个细胞内。本领域已知的将多核苷酸导入植物的方法包括但不限于瞬时的转化方法、稳定的转化方法及病毒-介导的方法。

在多核苷酸(例如编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸)背景下的“瞬时的转化”旨在表示多核苷酸被导入浮萍植物且不整合进浮萍植物的基因组。

说道“稳定导入”或“稳定导入的”，在导入到浮萍植物的多核苷酸(例如编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸)背景下，期望导入的多核苷酸稳定合并入浮萍基因组，且由此将浮萍植物用多核苷酸稳定转化。

“稳定的转化”或“稳定转化的”旨在表示导入浮萍植物的多核苷酸(例如、编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸)整合进植物基因组，且能通过其后代(更尤其，通过多轮后继后代的后代)遗传。在一些实施方式中，后继后代包括营养性地(例如，用克隆繁殖)产生的后代(即，无性繁殖)。在其他实施方式中，后继后代包括经有性繁殖产生的后代。

可将包括编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的表达构建体使用本领域技术人员已知的任何转化流程导入目的浮萍植物。将核苷酸序列导入浮萍植物细胞或根瘤的适宜方法：包括微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320334)，电穿孔(Riggs etal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：56025606)，土壤杆菌-介导的转化(U.S.专利Nos.5,563,055和5,981,840，两个均通过引用并入本文)，直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3：27172722)，弹道粒子加速(见，例如，U.S.专利Nos.4,945,050；5,879,918；5,886,244；及5,932,782(各通过引用并入本文)；及Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment，”in Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923926)。已转化的细胞可根据常规方式生长为植物。

如上所述，稳定转化的浮萍可通过本领域已知的任何基因转移方法得到，例如公开下列文献的基因转移方法之一：U.S专利No.6,040,498或U.S专利申请公开No 2003/0115640、2003/0033630或2002/0088027；各通过引用整体并入本文。浮萍植物或根瘤培养物可用含如本文中所述的核酸序列的表达盒通过包括土壤杆菌-介导的基因转移、弹道轰击或电穿孔的许多方法任何之一有效转化。使用的土壤杆菌可为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。稳定的浮萍转化体可通过用目的核酸序列和赋予对选择试剂的抗性的基因转化浮萍细胞，之后在含选择试剂的培养基中培养转化的细胞来分离。见，例如，U.S专利No.6,040,498，将其内容通过引用整体并入本文。

这些方法中利用的稳定转化的浮萍植物应呈现正常形态且通过有性繁殖能育和/或能够营养繁殖(即，无性繁殖)，例如，用克隆繁殖。优选，本发明的转化的浮萍植物含单个拷贝的包括编码抗原性流感多肽、或其片段或变体的多核苷酸的转移的核酸及无明显的重排的转移的核酸。需知，本发明的转化的浮萍植物可含以低拷贝数存在的转移的核酸(即、每个转化的细胞不多于12个拷贝、不多于8个拷贝、不多于5个拷贝，或者，不多于3个拷贝，再或，少于3个拷贝的核酸)。

表达抗原性流感多肽、或其片段或变体的转化的植物可在用于表达抗原性流感多肽、或其片段或变体的适宜条件下培养。然后可从浮萍植物、培养基、或浮萍植物和培养基(及如果期望、使用本领域已知的任何常规分离和纯化方法(包括层析、电泳、透析、溶剂-溶剂提取等)纯化的)收获抗原性流感多肽、或其片段或变体。然后可将抗原性流感多肽、或其片段或变体，配制为用于治疗性应用的疫苗，如在本文中别处所述。

【制备禽流感多肽的方法】

如本文中充分所述、在一实施方式中，产生抗原性禽流感多肽的方法包括：(a)浮萍培养基中培养浮萍植物培养物或浮萍根瘤培养物，其中浮萍植物培养物或浮萍根瘤培养物经稳定转化，以表达抗原性多肽，且其中抗原性多肽从包括所述抗原性多肽的编码序列和可操作连接的引导抗原性多肽分泌到培养基的信号肽的编码序列的核苷酸序列表达；及(b)从所述培养基收集抗原性多肽。术语收集包括但不限于从培养基收获或纯化。

在浮萍中产生重组多肽后，本领域可用的任何方法可用于蛋白纯化。各步骤包括从非蛋白或植物材料游离蛋白，之后从其他蛋白纯化目的蛋白。纯化处理中的初始步骤包括：离心、过滤或其组合。组织的细胞外空间中分泌的蛋白可使用真空或离心提取得到。最小的处理也可涉及制备粗产物。其他方法包括浸软和提取，以便允许直接使用提取物。

纯化目的蛋白的方法可利用蛋白尺寸，物理-化学性质和结合亲和性的差异。所述方法包括层析、包括普鲁卡因胺亲和性、大小排除、高压液体、逆相和阴离子-交换层析、亲和性标签，过滤等。尤其是，可将固定的Ni-离子亲和性层析用于纯化表达的蛋白。见Favacho et al.(2006)Protein expression and purification 46：196-203.See also，Zhouet al.(2007)The Protein J 26：29-37；Wang et al.(2006)Vaccine15：2176-2185；及WO/2009/076778；将其全文通过引用并入本文。保护剂可在纯化处理中使用，例如渗压剂、抗氧化剂、酚氧化抑制剂、蛋白酶抑制剂等。

【使用方法】

在一实施方式中，本文中公开的主题针对疫苗接种动物的方法，包括：给动物施用有效量的疫苗，其可包括有效量的重组禽流感抗原和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。

疫苗或组合物包括重组流感多肽。重组多肽可在浮萍植物中产生。重组多肽可为部分或基本上纯化的。重组多肽可为糖基化的。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对引起免疫应答的方法，包括：给禽施用包括表达的禽流感抗原的疫苗，其中引起免疫应答。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对引起免疫应答的方法，包括：给禽施用包括在浮萍及来自浮萍的植物材料中产生的禽流感抗原的疫苗，其中引起免疫应答。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对制备稳定转化的选自浮萍属的植物或植物培养物的方法，包括：(a)将包括禽流感抗原基因的遗传构建体导入植物；及(b)培养植物。转化浮萍的方法本领域中可用及本在文中提供。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对制备疫苗或组合物的方法，其包括通过浮萍表达系统分离产生的禽流感抗原，以及任选与药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质组合。

在一实施方式中，本文中公开的主题针对制备疫苗或组合物的方法，其包括组合通过浮萍表达系统产生的禽流感抗原和来自浮萍属的植物材料，以及任选药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。

再一实施方式中，可将疫苗或组合物施用给一日龄的或更年长的鸡。

在本发明的一个实施方式中，可采用始施-加施(prime-boost)方案，其包括使用至少一种共同的多肽、抗原、表位或免疫原至少一次初次施用和至少一次加强施用。一般而言，初次施用中使用的免疫学组合物或疫苗与那些用作加强施用的在性质上不同。但是，需知，相同的组合物可用作初次施用和加施。此施用过程称为“始施-加施”。

在本发明中，重组病毒载体用于表达编码抗原性流感多肽或其片段或变体的流感编码序列或其片段。特别地，病毒载体可表达禽流感序列，更特异性地HA基因或其编码抗原性多肽的片段。本文中含盖的病毒载体包括但不限于：痘病毒[例如，痘苗病毒或减毒的痘苗病毒、禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘病毒，鸡痘病毒，鸽痘病毒(dovepox)，鸽痘病毒(pigeonpox)，鹌鹑痘病毒，ALVAC，TROVAC；见例如，美国5,505,941，美国5,494,8070)，浣熊痘病毒，猪痘病毒，等]，腺病毒(例如，人腺病毒，狗腺病毒)，疱疹病毒(例如狗疱疹病毒，火鸡疱疹病毒，马雷克氏病病毒，感染性喉气管炎病毒，猫疱疹病毒，牛疱疹病毒，猪疱疹病毒)，杆状病毒，反转录病毒，等。在另一实施方式中，禽痘病毒表达载体可为金丝雀痘病毒载体，例如，ALVAC。再一实施方式中，禽痘病毒表达载体可为鸡痘病毒载体，例如，TROVAC。流感抗原、表位或免疫原可为血凝素，例如H5。鸡痘病毒载体可为vFP89或vFP2211。金丝雀痘病毒载体可为vCP2241(见美国2008-0107681和美国2008-0107687)。将本发明的待表达的禽流感抗原插入在特异性痘病毒启动子控制下，特别是例如，痘苗启动子7.5kDa(Cochran等人，1985)，痘苗启动子I3L(Riviere等人，1992)，痘苗启动子HA(Shida，1986)，牛痘启动子ATI(Funahashi等人，1988)，痘苗启动子H6(Taylor等人，1988b；Guo等人，1989；Perkus等人，1989)。

在本发明的始施-加施流程或方案的另一方面，在施用含和体内表达禽流感抗原和/或其变体或片段的重组病毒载体之后，施用包括本发明的禽流感抗原的组合物。同样，始施-加施流程可包括：施用重组病毒载体，之后施用本发明的重组禽流感抗原。还需知，第一及第二施用可包括本发明的重组禽流感抗原。由此，本发明的重组禽流感抗原可与病毒载体以任何顺序施用，或替代性地，可作为第一及第二组合物单独使用。

在本发明的始施-加施流程的再一方面，在施用包括禽流感抗原的灭活的病毒组合物或疫苗之后，施用包括本发明的禽流感抗原的组合物。同样，始施-加施流程可包括在施用本发明的重组禽流感抗原之后，施用灭活的病毒组合物或疫苗。还需知，第一及第二施用可包括本发明的重组抗原性多肽。本发明的抗原性多肽可与灭活的病毒组合物或疫苗以任何顺序施用，或替代性地，可作为第一及第二组合物单独使用。

始施-加施方案包括使用至少一种共同的多肽和/或其变体或片段至少一次始施和至少一次加施。始施中使用的疫苗可与用作后期加施疫苗的疫苗在性质上不同。始施可包括一次或多次施用。类似地，加施可包括一次或多次施用。

用于靶物种(哺乳动物)的组合物的剂量体积，例如，基于病毒载体的禽组合物(例如，基于非-痘病毒-载体的组合物)的剂量体积通常在约0.1～约2.0ml之间、约0.1～约1.0ml之间及约0.5ml～约1.0ml之间。

疫苗的功效可在通过用强毒流感株(有利地属于H5亚型的流感，例如H5N1、H5N2、H5N8或H5N9株)攻击动物(例如禽)最后免疫的约2～4周后测试。将同源和异源株二者用于攻击，以测试疫苗功效。动物可通过喷雾、鼻内、眼内、气管内、和/或经口攻击。攻击病毒可以依赖于施用途径的体积为约10^5-8EID₅₀。例如，如果通过喷雾施用，将病毒悬浮液气雾化以产生约1～100μm滴，如果鼻内、气管内或口服施用，攻击病毒的体积分别为约0.5ml、1～2ml和5～10ml。动物可每天观察临床体征至攻击后14天，例如，脱水及糊状气。此外，可使所述组的动物安乐死，并评估肺部和胸膜出血、气管炎、支气管炎、细支气管炎和支气管肺炎的病理发现。可从攻击后的全部动物收集口咽拭物用于病毒分离。可通过定量实时反转录聚合酶链反应(qRRT-PCR)评价呼吸系统组织中病毒抗原的存在或缺乏。可在攻击之前和后收集血样品，及可分析抗-流感H5N1病毒-特异性抗体的存在。

始施-加施流程中使用的包括本发明的重组抗原性多肽的组合物含于药学或兽医学可接受的媒质、稀释剂或赋形剂中。本发明的流程保护动物免于禽流感和/或在感染的动物中阻止疾病进展。

各施用优选以1～6周间隔进行。根据一个实施方式，也考虑每年加施。在第一施用时动物至少为一日龄。

本领域技术人员应理解，本文公开通过实施例提供，而本发明不限于此。从本文的公开内容和现有知识，本领域技术人员可确定用于各注射流程的施用数、施用途径及剂量，无需过多实验。

本发明涵盖至少一次给动物施用有效量的根据本发明制备的治疗性组合物。动物可为雄性、雌性、怀孕的雌性及新生儿。此施用可经各途径，包括但不限于：肌内(IM)、真皮内(ID)或皮下(SC)注射或经鼻内或口服施用。根据本发明的治疗性组合物也可通过无针设备施用(例如用Pigjet、Dermoj et、Biojector、Avijet(Merial、GA、美国)、Vetjet或Vitajet设备(Bioject，Oregon，美国)的实施例)。施用质粒组合物的另一方法旨在使用电穿孔(见，例如tollefsen等人，2002；Tollefsen等人，2003；Babiuk等人，2002；PCT申请No.WO99/01158)。在另一实施方式中，治疗性组合物通过基因枪或金粒子轰击递送给动物。在有利的实施方式中，动物是禽。

在一个实施方式中，发明提供用于在靶细胞中递送和表达流感抗原或表位的治疗性有效量的制剂的施用。治疗性有效量的确定是本领域技术人员的常规实验。在一个实施方式中，制剂包括包含表达流感抗原或表位的多核苷酸的表达载体和药学或兽医学可接受的载质、媒质或赋形剂。在另一实施方式中，药学或兽医学可接受的载质、媒质或赋形剂辅助转染或感染和/或改善载体或蛋白在宿主中的保留。

在一个实施方式中，本文中公开的主题提供疫苗接种方案和用于感染的和免疫接种动物的区分(DIVA)的检测方法。

目前、有2种类型的禽流感疫苗、灭活的全AI病毒(AIV)和活重组疫苗(基于鸡痘病毒及新城疫病毒)其中血凝素(HA)被证明是产生保护免疫的主要靶[Peyre，et al.，Epidemiol Infect，2009.137(1)：p.1-21.；Bublot，et al.，Ann N Y Acad Sci，2006.1081：p.193-201；Skehel，et al.，Annu Rev Biochem，2000.69：p.531-69]。常规灭活的疫苗要求AIV在含胚的蛋或细胞培养物中生长，其使得有影响环境和人员的潜在危害的高度封闭的设备成为必需。此外，目前无与使用灭活的疫苗兼容的商业上可用的DIVA测试[Bublot，et al.，2006；ElSahly，et al.，Expert Rev Vaccines，2008.7(2)：p.241-7；Veits，et al.，Vaccine，2008.26(13)：p.1688-96]。允许“感染的和免疫接种动物的区分”(DIVA)的策略已经被推进为可能的不涉及鸟质量减除和随后经济损伤地最终根除AI的方案，尤其在发展中国家(Food andAgriculture Organization of the United(FAO)(2004).FAO，OIE&WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza.Animal health special report)。此策略有疫苗接种的益处(环境中少病毒)，有鉴定感染的畜群的能力，仍允许实施其他对照测量，包括根绝。在畜群水平，简单方法旨在规则性地监控在各免疫接种畜群中保留未免疫接种的警哨鸟，但此可导致一些管理问题，尤其在大的畜群中鉴定警哨时。作为替代，可对免疫接种鸟进行野外暴露测试。为了实现此，应使用致使免疫接种的群中野外暴露的检测的疫苗接种系统。最近开发了几种系统，包括使用含来自野生病毒的相同的H亚型但不同的N的病毒的疫苗。针对野生病毒的N的抗体发挥感染的天然标记物的作用，但是，如果新出现具有与既有的野生病毒不同的N抗原的野生病毒，或如果有不同的N抗原的亚型已在野生中循环，则将产生问题。另外，仅含HA的疫苗的使用将允许使用典型AGID和NP-或基于底物的ELISA来检测免疫接种的鸟中的感染。

本文中公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许使用旨在检测针对非HA的流感蛋白的抗体应答的可用的诊断测试(例如琼脂凝胶免疫扩散或基于NP的ELISA)在免疫接种动物中检测流感感染。本文中公开了本发明的疫苗或组合物的使用允许通过感染的和免疫接种动物之间的区分(DIVA)在动物中检测感染。本文中公开了用于使用基于NP的免疫原性检测方法(例如，基于NP的ELISA)在动物中诊断流感感染的方法。在一个实施方式中，本文中公开的主题针对在动物中诊断流感感染的方法，包括：(a)使包括核蛋白(NP)的固体基材与从动物得到的样品接触；(b)使固体基材与针对NP的单克隆抗体(MAb)接触；及(c)检测固体基材上MAb与被NP捕获的样品的结合，其中相对阴性对照的测试样品的百分率抑制表示受试者感染流感，由此诊断受试者中的流感感染。

【产品】

在一实施方式中，本文中公开的主题针对实施引起或诱导免疫应答的方法的试剂盒，其可包括重组流感免疫学组合物或疫苗、或灭活的流感免疫学组合物或疫苗、重组流感病毒组合物或疫苗的任何之一及用于实施方法的使用说明。

本发明的另一实施方式是用于实施在动物中诱导针对流感的免疫学或保护应答的方法的试剂盒，包括组合物或疫苗，其包含本发明的禽流感抗原和重组流感病毒免疫学组合物或疫苗，及用于实施以有效量递送以在动物中引起免疫应答的方法的使用说明。

本发明的另一实施方式是用于实施在动物中诱导针对流感的免疫学或保护应答的方法的试剂盒，包括组合物或疫苗，其包括本发明的禽流感抗原和灭活的流感免疫学组合物或疫苗，及用于实施以有效量递送以在动物中引起免疫应答的方法的使用说明。

本发明的再一方面涉及用于根据本发明如上所述的始施-加施疫苗接种的试剂盒。试剂盒可包括至少2个瓶：第一瓶含用于根据本发明的始施-疫苗接种的疫苗或组合物、及第二瓶含根据本发明的加施-疫苗接种的疫苗或组合物。试剂盒可有利地含额外的第一或第二瓶，用于额外的始施-疫苗接种或额外的加施-疫苗接种。

以下实施方式包括在本发明中。在一实施方式中，公开了组合物，其包括禽流感抗原或其片段或变体和药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质。在另一实施方式中，公开了以上描述的组合物，其中禽流感抗原或其片段或变体包括包含禽流感抗原的至少15个氨基酸的免疫原性片段。再一实施方式中，公开了以上组合物，其中禽流感抗原或其片段或变体在浮萍中产生。在一实施方式中，公开了以上组合物，其中禽流感抗原或其片段或变体是部分纯化的。在一实施方式中，公开了以上组合物，其中禽流感抗原或其片段或变体是基本上纯化的。在一实施方式中，公开了以上组合物，其中禽流感抗原或其片段或变体是禽H5N1多肽。在一实施方式中，公开了以上组合物，其中H5N1多肽是血凝素多肽。在一实施方式中，公开了以上组合物，其中禽流感抗原或其片段或变体与如SEQ ID NO：2、4、5、8、10、12或14所示的序列具有至少80％序列同一性。在一个实施方式中，公开了以上组合物，其中禽流感抗原由与如SEQ ID NO：1、3、6、7、9、11或13所示的序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸编码。在一实施方式中，公开了以上组合物，其中药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质是油包水乳液或水包油包水或水包油乳液。在另一实施方式中，公开了给易患禽流感的动物疫苗接种的方法，包括给动物施用以上组合物。在一实施方式中，公开了给易患禽流感的动物疫苗接种的方法，包括始施-加施方案。在一实施方式中，公开了基本上纯化的在浮萍中表达的抗原性多肽，其中多肽包括：与具有如SEQ ID NO：2、4、5、10、12或14所示的序列的多肽具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方式中，动物优选是禽、马、狗、猫或猪。在一个实施方式中，公开了在动物中诊断流感感染的方法。再一实施方式中，公开了用于始施-加施疫苗接种的试剂盒，其包括至少2个瓶，其中第一瓶含本发明的组合物，且第二瓶含用于加施-疫苗接种的组合物，其包含：包括重组病毒载体的组合物或包括灭活的病毒组合物的组合物。

药学或兽医学可接受的载质或媒质或赋形剂为本领域技术人员熟知。例如、药学或兽医学可接受的载质或媒质或赋形剂可为0.9％NaCl(例如、盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学或兽医学可接受的载质或媒质或赋形剂包括、但不限于：聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学可接受的载质或媒质或赋形剂可为辅助载体(或由本发明的载体体外表达的蛋白)施用的任何化合物或化合物的组合；有利地、载质、媒质或赋形剂可辅助转染和/或改善载体(或蛋白)保存。剂量和剂量体积在发明概述中讨论，及也可由本领域技术人员从本公开结合现有知识，无需过多实验地确定。

含季铵盐(其有利地但不唯一适宜于质粒)的阳离子脂质有利地是具有下式的那些：

其中R1是具有12～18个碳原子的饱和的或不饱和的直-链脂肪族基、R2是含2或3个碳原子的另一脂肪族基，和X是胺或羟基，例如DMRIE。在另一实施方式中，阳离子脂质可与中性脂质(例如DOPE)相联。

这些阳离子脂质之中，偏好DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷基氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，其有利地与中性脂质(有利地DOPE(二油酰基-磷脂酰-乙醇胺；Behr，1994))相联形成DMRIE-DOPE。

有利地，临时形成与佐剂的质粒混合物及有利地与制剂的施用同步或制剂施用直前；例如，施用直前，质粒-佐剂混合物形成、有利地以便给出在施用之前对于混合物形成复合物足够的时间，例如施用之前约10和约60分钟之间，例如施用之前约30分钟。

当DOPE存在时，DMRIE∶DOPE摩尔比有利地约95∶约5～约5∶约95，更有利地约1∶约1，例如，1∶1。

DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂∶质粒重量比可在约50∶约1和约1∶约10之间、例如约10∶约1和约1∶约5之间、及约1∶约1和约1∶约2之间、例如、1∶1和1∶2之间。

药学或兽医学可接受的载质、赋形剂或媒质可为油包水乳液。适宜油包水乳液的实施例包括：于4℃稳定和是流体的基于油的油包水疫苗乳液含：6～50v/v％的含抗原-水相、优选12～25v/v％、50～94v/v％的含总体或部分非-可代谢的油(例如、矿物油，例如石蜡油)和/或可代谢的油(例如、蔬菜油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的油相、0.2～20p/v％的表面活性剂(优选3～8p/v％)、后者总体或部分、或以混合物是聚甘醇酯(所述聚甘醇酯优选是聚甘醇(聚)蓖麻醇酸酯)、或聚氧乙烯蓖麻毒素油或是氢化聚氧乙烯蓖麻毒素油。可在油包水乳液中使用的表面活性剂的实施例包括：乙氧基化的山梨糖醇酐酯(例如、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯(Tween

)、可从AppliChem，Inc.，Cheshire获得，CT)和山梨糖醇酐酯(例如，山梨糖醇酐单油酸酯(Span

)，可从Sigma Aldrich，St.Louis，MO获得)。此外，有关油包水乳液，也见美国专利No.6,919,084，例如，其实施例8，通过引用并入本文。在一些实施方式中，含抗原水相包含包括一个或多个缓冲剂的盐水溶液。适宜缓冲溶液的例是磷酸盐缓冲的盐水。在有利的实施方式中，油包水乳液可为水/油/水(W/O/W)三层乳液(U.S.专利No.6,358,500)。其他适宜乳液的例描述于U.S专利No.7,371,395。

根据本发明的免疫学组合物和疫苗可包括一种或多种佐剂或基本上由其构成。用于本发明的实践的适宜佐剂是：(1)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物、(2)具有一个或多个非-甲基化的CpG单元的免疫刺激序列(ISS)、例如寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)、(3)水包油乳液、例如，由M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”的147页描述的SPT乳液、及同一文献的183页描述的乳液MF59、(4)含季铵盐的阳离子脂质、例如、DDA(5)细胞因子、(6)氢氧化铝或磷酸铝、(7)皂苷或(8)通过引用并入本申请的任何文献中讨论的其他佐剂、或(9)它们的任何组合或混合物。

对于病毒载体尤其适当的水包油乳液(3)可基于：轻液体石蜡油(European pharmacopoeia type)、类异戊二烯油(例如角鲨烷、角鲨烯)、由烯(例如异丁烯或癸烯)的寡聚化得到的油、具有直-链烷基的酸或醇的酯(例如蔬菜油、乙基油酸酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯、或分支的酯、脂肪醇或酸，尤其异硬脂酸酯。

油与乳化剂组合使用形成乳液。乳化剂可为非离子型表面活性剂，例如：一方面是山梨糖醇酐、二缩甘露醇(例如无水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚甘醇或丙二醇的酯，及另一方面是油酸、异硬脂酸、蓖麻醇酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯任选是乙氧基化的或是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如Pluronic，例如，L121。

类型(1)佐剂聚合物之中，偏好交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、尤其通过糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物已知在卡波姆名下(Pharmeuropa，vol.8，No.2，1996年6月)。本领于技术人员可也参考U.S专利No.2,909,462，其提供通过具有至少3个羟基(优选不多于8个所述基团)的聚羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，至少3个羟基的氢原子被不饱和的，具有至少2个碳原子的脂肪族自由基取代。优选的自由基是含2～4个碳原子的那些、例如乙烯基、烯丙基和其他以乙烯键不饱和的基团。不饱和的自由基可也含其他取代基，例如甲基。在卡波泊尔(BF Goodrich，Ohio，美国)名下出售的产物尤其适宜。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。它们之中，参考卡波泊尔974P、934P和971P。

至于马来酸酐-烯基衍生物共聚物、偏好EMA(Monsanto)，其是直-链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物和它们是，例如，通过二烯基醚交联的。也参考J.Fields et al.，1960。

关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选通过具有下式的基本单元形成：

其中：

-R1和R2，其可为相同的或不同的、代表H或CH3

-x＝0或1，优选x＝1

-y＝1或2，且x+y＝2。

对于EMA而言，x＝0和y＝2，而对于卡波姆x＝y＝1。

这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)，pH可调整到7.3～7.4，例如，通过苏打(NaOH)，以提供可合并表达载体的佐剂溶液。最终免疫学或疫苗组合物中的聚合物浓度可跨约0.01～约1.5％w/v、约0.05～约1％w/v及约0.1～约0.4％w/v之间。

细胞因子(5)可在免疫学或疫苗组合物中为蛋白形式、或可在宿主中与免疫原或其表位共表达。偏好通过与表达免疫原或其表位的载体相同的载体或通过其分离的载体的细胞因子的共表达。

发明涵盖，例如通过将活性成分、有利地与佐剂、载质、细胞因子和/或稀释剂一起以及与佐剂、载质、细胞因子和/或稀释剂混合来制备所述组合组合物。

可在本发明中使用的细胞因子包括、但不限于：粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α

干扰素β

干扰素γ

白细胞介素

白细胞介素

白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β

及转化生长因子β

应理解，细胞因子可与本发明的免疫学或疫苗组合物共施用和/或依次施用。由此，例如，本发明的疫苗也可含体内表达适宜细胞因子的外源核酸分子、例如、与此待疫苗接种或要在其中引起免疫学应答的宿主匹配的细胞因子(例如，用于施用给禽的制剂的禽细胞因子)。

适宜乳液或佐剂的实施例还描述于，例如，在US 6,235,282；US6,224,882；US 7,371,395；US 2006-0233831；US 2005-0238660；US2006-0233831(全部Merial’s专利和专利申请)。

根据本发明的免疫学组合物和/或疫苗包括有效量以引起本文中讨论的一种或多种表达载体和/或多肽的治疗性应答或基本上由其构成或由其构成；及、有效量可从本公开(包括合并到本文中的文献及现有知识)确定，无需过多的实验。

基于质粒载体的免疫学组合物和/或疫苗的情况中，剂量可通常包括：约1μg～约2000μg、有利地约50μg～约1000μg和更有利地约100μg～约800μg的表达流感抗原、表位或免疫原的质粒，或基本上由其构成或由其构成。当用电穿孔施用基于质粒载体的免疫学组合物和/或疫苗时，质粒剂量通常在约0.1μg和1mg之间、有利地在约1μg和100μg之间、有利地在约2μg和50μg之间。剂量体积可在约0.1和约2ml之间、有利地在约0.2和约1ml之间。

有利地、当抗原是血凝素时，剂量以血凝单元(HAU)或以μg HA测量。在有利的实施方式中，剂量可为约655个血凝单元(HAU、0.2μgHA)/剂量、约6550HAU、2.3μg HA/剂量或约65,500HAU/剂量。在某些实施方式中，剂量是约26,200HAU，9.2μg HA/剂量。体积可为约0.1ml～约1.0ml和在一日龄的鸡中是优选0.1和0.3ml之间和在更年长的鸡中是0.3和0.5ml之间。

免疫学组合物和/或疫苗每剂量含约10⁴～约10¹¹、有利地约10⁵～约10¹⁰和更有利地约10⁶～约10⁹表达流感抗原、表位或免疫原的重组腺病毒的病毒粒子。当免疫学组合物和/或疫苗基于痘病毒时，剂量可在约10²pfu和约10⁹pfu之间。免疫学组合物和/或疫苗每剂量含约10⁵～10⁹、有利地约10²～10⁸pfu的表达流感抗原、表位或免疫原的痘病毒或疱疹病毒重组体。

用于靶物种(哺乳动物)的组合物的剂量体积、例如、基于病毒载体的禽组合物(例如、基于非-痘病毒-载体的组合物)的剂量体积是通常在约0.1～约2.0ml之间、约0.1～约1.0ml之间及约0.1ml～约0.5ml之间。

发明现在将通过以下非-限制实施例进一步描述。

【实施例】

DNA插入子、质粒和重组病毒或植物载体的构建使用由J.Sambrook等人描述的标准分子生物学技术进行(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989)。

【实施例1：质粒构建和植物转化】

此研究中，使用Biolex′s LEX系统^TM，专利浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统表达来自高度病原性禽流感(HPAI)H5N1A/鸡/印度尼西亚/7/2003(ck/印度尼西亚/03)分离物的合成的血凝素(HA)基因。

血凝素(HA)是表面病毒糖蛋白，负责将病毒附着于宿主细胞受体上的末端唾液酸和通过其自身的切割介导病毒粒子和细胞膜之间的融合。其是在天然的感染和疫苗接种中针对流感病毒的宿主应答的关键抗原。

HA0前体是含564个氨基酸、有77kDa的近似分子量的蛋白，及有能力凝集红细胞。在HA1区有6个预测的N-连接的糖基化位点，而在HA2区有1个预测的N-连接的糖基化位点。

HA在植物的质外体空间高表达，通过蛋白印迹分析具有期望的尺寸及具有血凝活性。从转基因浮萍系制备粗植物提取物，用于在SPF鸡中评估免疫原性和功效。使用同源和异源抗原的显著的血清血凝抑制滴度指示，浮萍来源的HA是高度免疫原性的。将用单个剂量的配制进油包水乳液的浮萍来源的HA免疫接种的3周龄的SPF鸡用A/ck/印度尼西亚/7/2003或抗原性变体A/ck/WestJava/PWT-WU/2006HPAI H5N1分离物攻击。分别针对A/ck/印度尼西亚/07/2003和A/ck/WestJava/PWT-WU/2006诱导全和80～90％的保护。在一日龄用鸡痘病毒禽流感载体疫苗始施的HA-免疫接种鸟中得到全临床保护(始施-加施方案)。对于全部免疫接种者观察到口咽脱落的显著降低，及在血清样品进行的基于NP的ELISA明显区分免疫接种者和感染的鸡。在用颗粒化的表达HA的浮萍饲养的鸡中未观察到保护。

结果，浮萍(Lemna minor)表达的HA引发强免疫应答和赋予的优良的免于同源和变体H5N1攻击的保护水平。转基因浮萍用DIVA潜力可为当前灭活的疫苗的出色的替代品。

【植物转化质粒的构建】将来自高度病原性禽流感(HPAI)病毒A/鸡/印度尼西亚/7/2003(H5N1)分离物的优化版的血凝素(HA)基因设计为具有浮萍(L.minor)优选的密码子利用(63～67％GC含量)。在从高度病原性禽流感序列(多个碱性的氨基酸：RERRRKKR-SEQ ID NO：17)至低病原性禽流感序列(RETR-SEQ ID NO：18)的HA1和HA2之间的切割位点修饰合成的HA基因。将天然的HA信号序列用融合到密码子-优化的H5N1编码序列(SEQ ID NO：1)的5’端的稻α-淀粉酶信号序列(GenBank M24286)取代。将用于克隆的限制内切核酸酶位点(5’-EcoRI和3’-SacI)添加到根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)二元载体。将浮萍(L.minor)优化的HA基因以EcoRI/SacI克隆进有膨胀浮萍(Lemna gibba)RBCS SSU15’前导序列及胆脂碱合酶(Nos)终止子的嵌合章鱼碱和甘露碱合酶启动子之间的修饰的pMSP3根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)二元载体(Gasdaska、J.、等人、Bioprocessing J.3、50-56、2003)，产生植物转化载体MerB01。

【转基因系产生和筛选】使用经植物转化载体MerB01转化的根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)C58Z707(Hepburn，A.G.et al.，J.Gen.Microbiol.131，2961-2969，1985)，从如Yamamoto，Y.et al.，In VitroCell.Dev.Biol.37，349-353(2001)所述的快速生长浮萍(L.minor)根瘤产生代表个体克隆系的转基因植物。对于转基因筛选而言，将个体克隆系以150～200mmol m-2s-1，在不含蔗糖的含SH培养基的通气的植物生长容器中预处理1周(Schenk，R.，et al.，Can.J.Bot.50，199-204，1972)。然后将15～20个预处理的叶放入含新鲜SH培养基的通气的容器，及允许生长2周。将来自各系的组织样品冷冻和于-70℃储存。将这些组织样品随后经血凝测定筛选HA表达。简言之，将冷冻的组织匀浆、离心和移出上清用于测定。将转基因样品的稀释液与火鸡红细胞(Fitzgerald Industries International)的10％溶液温育和对血凝活性评分。使用更大稀释再次测定用此测定以初始稀释选定的最高系，以评定滴度。将样品与作为阳性对照的重组H5N1和浮萍野生型对照比较。系筛选的实施例显示于图9。

【实施例2：禽流感H5N1系的开发】

产生130个转基因禽流感H5N1系用于筛选。在产生转基因系后，筛选它们的培养基和组织中禽流感H5N1的表达。简言之，在小的研究容器中使植物生长2周，且收集得到的培养基和组织，用于分析。为组织分析，将冷冻的组织匀浆、离心和移出上清用于测定。

使用血凝测定方法筛选样品。简言之，将转基因样品的稀释物与火鸡红细胞的10％溶液(Fitzgerald Industries International，Concord，MA，USA)温育和对血凝活性评分。使用更大稀释再次测定用此测定以初始稀释选定的最高系。将样品与作为阳性对照的重组H5N1和作为阴性对照的浮萍野生型植物比较。血凝测定中培养基的分析显示对系的亚组无活性，及测定中不测试系的残留物。来自血凝测定的代表性的板和转基因植物筛选的血凝分析的结果(以条形图及表格式)示于图9。放大来自初始筛选的最高，以提供约1kg的生物质，用于进一步表征。

【实施例3：浮萍(Lemna minor)中禽流感H5N1血凝素的产生】

将血凝测定(HA)、血凝抑制测定(HI)、ELISA、SDS-PAGE和蛋白印迹用于表征H5N1HA。也通过HI测试针对一组阳性鸡血清筛选重组蛋白。

【植物提取】根据以下描述的过程制备来自含H5N1HA的系的粗组织提取物。全部步骤于4℃发生。将100g的冷冻的生物质与200ml提取缓冲液(50mM NaPO₄，0.3M NaCl，10mm EDTA，pH7.4，蛋白酶抑制剂混合剂1∶1000(Sigma P9599，Sigma，St.louis、MO、美国))混合，然后在韦林氏搅切器中以20s爆裂匀浆4次，和期间10～20s冷却。将匀浆物于4℃以14,000×g离心30分钟，通过使通过粗平布来澄清，以去除任何大的碎片和最后使通过乙酸纤维素过滤器(0.22μm)。将得到的匀浆物储存于4℃或在冰上用于立即测试。将匀浆物以等份于-80℃冷冻，用于分析，以避免任何冷冻-解冻循环。使用Bradford测定用牛血清白蛋白作为标准品测定总可溶性蛋白(TSP)。

【血凝测定(HA)】血凝测定是用于检测和定量血凝性抗原的推定测试。HA测试的基础是病毒血凝素会与红细胞(RBC)表面上的受体附接而产生RBC凝集。使用对Nunc U-底板中粗提取物的2倍系列稀释物进行HA测定。将50μl的10％火鸡红细胞(FitzgeraldIndustries International Inc.)与50μl的测试样品温育于室温1小时，并在观察指定的底之前在最高稀释评分滴度。阴性对照包括浮萍野生型和PBS，及阳性对照包括表达重组禽流感血凝素A/越南/1203/2004(87μg/ml)的杆状病毒。

PBS阴性对照和浮萍野生型样品不导致血凝，表明，H5N1HA是凝集的单独来源(图10)。对于灭活的禽流感H5N1ck/印度尼西亚/03(突变的)、重组HA蛋白参照及含H5N1HA的粗提取物，HA滴度测定分别为64、12,800和51,200～102,400。结果表明，甚至当稀释102,400倍时，粗提取物仍能凝集RBC和防止它们形成紧密沉淀。如通过HA测定判断，含H5N1HA的粗提取物有生物学活性，以及相比10^8.5EID₅₀的灭活的全病毒和87μg/ml的重组HA参照有显著更高的活性。

将商业火鸡红细胞用于初始筛选。为估计制剂可行性，使用标准化的HA测定评估粗H5N1HA提取物。将新鲜鸡红细胞用PBS洗涤3次，及与测试样品温育30分钟而非1小时。结果表明标准HA测定和当前HA测定之间HA滴度的1～2倍差异。确定估计的产率，如图11中所示。

【血凝抑制测定(HI)和ELISA】血凝抑制测定的基础是特异性抗体与同源病毒血凝素的相互作用会抑制血凝。表达的HA抗原被特异性抗体的识别确认HA的抗原性。

H5N1HA粗提取物的凝集活性成功地被全部HI阳性血清(即，A/越南/1203/04流感病毒(Rockland、Gilbertsville，PA)的单克隆抗-H5血凝素、CP62和364/1(CDC、Atlanta、GA、美国)的单克隆抗-H5N1Ab集、FP2211鸡血清及禽流感H5N1ck/印度尼西亚/03(突变的)鸡血清)中和。阴性对照包括PBS及不导致血凝的浮萍野生型样品(图12～14)。结果确证，存在于粗H5N1HA提取物的HA具有期望的抗原性。

对于收集自临床免疫原性研究的样品的血清学分析，根据NVSL标准流程进行HI测试。测试一组抗原的血清交叉-反应性：H5N1分化体2.1A/鸡/印度尼西亚/7/2003(Indo/03)、H5N1分化体2.1(变体)A/ck/西爪哇/PWT-WIJ/2006、H5N1分化体2.2A/WS/蒙古/244/05、H5N1分化体1A/越南/1203/2004(VN/04)及H5N8A/火鸡/爱尔兰/1378/1983(爱尔兰/83)。使用SAS V9.1进行统计学分析。根据生产商的使用说明(FlockCheck AI MultiS-Screen Antibody Test Kit，IDEXX Laboratories，Westbrook，ME)进行阻断酶连接的免疫吸附测定(bELISA)。

【SDS-PAGE和蛋白印迹】在SDS-PAGE样品缓冲液中稀释蛋白样品(粗组织提取物)、在Nu-PAGE 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen、Carlsbad，CA)上分离，和使用Invitrogen iBlot转移到PVDF膜。于室温阻断膜1hr(或于4℃过夜)，用针对A/越南/1203/04流感病毒(Rockland)的H5血凝素的单克隆抗体于室温探查1hr。在含0.1％Tween-20的PBS中洗涤4次后，将膜与缀合HRP的第二抗体温育1hr，在含0.05％Tween-20的PBS中洗涤4次及然后通过TMB膜过氧化物酶底物系统(KPL，Gaithersburg，MD)显影5分钟。使用Odyssey LICOR衍射成像系统9120(LICOR，Lincoln，NE)进行图像分析。

在银-染色的SDS-PAGE上，在HA表达系中观察到77kDa的区分的条带(图15A)。使用A/越南/1203/04流感病毒的单克隆抗-H5血凝素的蛋白印迹确认有期望的77kDa的分子量的HA的表达，然而浮萍野生型仍阴性(图15B)。在蛋白印迹上，在非还原条件下，A/越南/1203/04流感病毒(Rockland)的单克隆抗-H5血凝素和CP62和364/1(CDC、Atlanta，GA)的单克隆抗-H5N1Ab集将H5N1HA识别为有77kDa的期望的分子量的一个主要条带，然而浮萍野生型仍阴性(图15C)。图16也显示，HA由FP2211鸡血清和禽流感H5N1ck/印度尼西亚/03(突变的)鸡血清识别为一个77kDa的期望的条带，然而Biolex野生型仍阴性。灭活的全病毒和重组HA参照显示50kDa和28kDa的2个条带，表明HA0被切割为2个亚基HA1和HA2。蛋白印迹结果与血凝抑制测试中的观察一致。

【总结】血凝测定结果确证了有51,200HAU/50μl的滴度的H5N1HA的生物学活性、其相比87μg/ml的纯化的重组HA和108.5EID50的灭活的禽流感H5N1ck/印度尼西亚/03(突变的)两者显著更高。H5N1HA的血凝活性被一组HI阳性血清(即，A/越南/1203/04流感病毒(Rockland)的单克隆抗-H5血凝素、CP62和364/1(CDC)的单克隆抗-H5N1Ab集、FP2211鸡血清及禽流感H5N1ck/印度尼西亚/03鸡血清)成功地中和。结果提示，各抗体识别以它们的天然的形式的抗原。通过SDS-PAGE和蛋白印迹进一步确证HA表达。77kDa的条带对应于在银-染色的SDS-PAGE上可视化的HA0前体的期望的尺寸。在蛋白印迹上，H5N1HA以期望的77kDa的分子量被全部测试的MAb和鸡血清(即A/越南/1203/04流感病毒(Rockland)的单克隆抗-H5血凝素、CP62和364/1(CDC)的单克隆抗-H5N1Ab集、FP2211鸡血清及禽流感H5N1ck/印度尼西亚/03鸡血清)非常良好识别。

【实施例4：来自通过植物中的免疫定位由浮萍(Biolex系统)产生的印度尼西亚AIV H5N1株的HA的表达的表征】

浮萍组织中HA的表达通过免疫荧光测定分析。将植物在MTSB缓冲液(EGTA 5mM、Pipes 50mM、MgSO45mM、pH7.0)中用4％甲醛在真空下固定在载玻片上，然后用MTSB+0.1％Triton×100润洗及之后用水+0.1％Triton×100润洗。将细胞壁使用崩溃酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)于37℃消化30分钟，再次用MTSB+0.1％Triton×100、MTSB+10％DMSO+3％NP40及MTSB+0.1％Triton×100洗涤，然后用MTSB+3％BSA阻断。然后将经处理的植物与针对A/越南/1203/04流感病毒的H5血凝素的单克隆抗体于4℃过夜温育，及用缀合荧光黄(FITC)的第二抗体于室温探查3小时，载玻片使用Nikkon遮蔽600荧光显微镜检检查。

结果指示，在浮萍野生型中未观察到荧光背景，然而在转化的浮萍中检测到强和特异性荧光信号(图17)。也提示，HA在植物组织的质外体中表达，这与HA表达的靶细胞位置一致。

【实施例5：免疫原性和攻击研究】

在3周龄时用有佐剂相佐的浮萍表达的HA免疫接种的无特定病原体(SPF)鸡中进行免疫原性和攻击研究。将10只鸡分配到各疫苗组。包括用有佐剂相佐的浮萍野生型材料免疫接种的组作为两个研究的阴性对照组，及也包括在杆状病毒系统中表达的有佐剂相佐的实验重组HA的组用于攻击研究。在有佐剂相佐的浮萍表达的HA的3周前(见以下)，1个组(组8)在一日龄接受鸡痘病毒载体AIV H5(vFP89、见、US 2008-0107681和US 2008-0107687)疫苗。

【免疫原性研究】将鸡如图18所示免疫接种。使用2种不同的方案测试6组3周龄的鸡：一次施用(组5～7)或2次施用(组2～4)，以3剂量水平(655HAU、6550HAU和26200HAU)。始施-加施方案(组8)在始施表达H5N8(A/火鸡/爱尔兰/1378/83)的HA基因的

(vFP89)及加施6550HAU的浮萍表达的HA的一日龄的鸡中研究。在颈项皮下施用(10³TCID₅₀/0.2ml/剂量)。通过肌内途径在腿上给予粗浮萍提取物的油包水乳液(0.3ml/剂量)。在第21及35天收集血样品用于血凝抑制测试。

无鸡显示对植物来源的疫苗的不利的反应。通过收集自免疫接种鸡的血清的HI滴度测定免疫原性(图20)。用浮萍野生型免疫接种的鸡通过针对全部测试的H5抗原的HI测定是阴性的。免疫的21天后，在浮萍HA组诱导特异性抗体，针对同源Indo/03株的平均HI滴度在655HAU、6550HAU和262000HAU剂量水平分别达到4、6.5和8.1log2。在疫苗接种后的第35天(p.v.)，用一次施用方案，对于低到高剂量，针对Indo/03的HI滴度保持在4.7、6.6和7.6log2；而对于2次施用方案，HI滴度显著升高到6.8、9.4和9.5log2，表明明显的加施效应(p＜0.005)和剂量效应(p＜0.005，在低和中/高剂量之间)。此结果还被分别对于1次施用和2次施用方案在655HAU、6550HAU和262000HAU剂量水平，2.9，5.4，6.5log2对比5.3、7.7、8.5log2和2.6，3.6，4.8对比4.2、6.0、6.6log2的针对异源株Mong/244/05和VN/1203/04的HI滴度证实。对于两种疫苗接种方案，免疫应答针对同源H5N1分化体2.1Indo/03株最高、之后是分化体2.2Mong/244/05、然后是分化体1VN/1203/04。也用立即剂量的6550HAU的浮萍HA研究始施加施方案，使用表达HA的鸡痘病毒重组体作为始施。在始施后的第21天，除了TK/Ire/83有4.0log2的滴度之外，对于任何H5抗原未观察到HI滴度。在加施后的第35天，HI滴度针对VN/1203/04、Indo/03、Mong/244/05和Tk/Ire/83分别升高到5.3、5.6、5.4和9.2log2。但是，当的与浮萍HA比较时，6.0、9.4、7.7和7.3log2的滴度的2次施用方案，除了Tk/Ire/83之外，抗体应答低。

【攻击研究】根据图19免疫接种鸡。类似于免疫原性研究，将鸡用浮萍HA以3种不同的剂量免疫接种，但是通过单次免疫(组2～3、5～7)，除了组4(口服疫苗接种)和组8(始施-加施方案)之外。

在第42天，将鸡用HPAI H5N1病毒、A/ck/印度尼西亚/07/2003(组1～4)或A/ck/WestJava/PWT-WU/2006(组5～8)以10^6.0EID₅₀/鸡经鼻内/经口攻击。攻击后，每天观察鸡的病态和死亡率，及将病态鸡计数为经流感感染的。在攻击的2和4天后(DPC)，在1.5ml的含抗微生物化合物(100μg/mL庆大霉素、100单元/mL青霉素，及5μg/mL两性霉素B)的脑心脏输注(BHI)培养基(Becton-Dickinson、Sparks，MD)中收集用于测定攻击病毒从呼吸道脱落的口咽拭物。在第42及56日龄对其余来自全部组的鸡采血用于血清收集。在56日龄将鸟的用静脉内戊巴比妥钠(100mg/kg身体重量)安乐死。

期望用HPAI H5N1病毒攻击将在2天之内可再现地诱导幼稚的鸡的100％死亡率。对于两个阴性对照组，用浮萍野生型免疫接种和用Indo/03株攻击的鸡、及用实验重组体HA对照免疫接种和用PWT/06攻击的鸡在此时期内死亡(图19)。在用Indo/03攻击的组中，用浮萍来源的HA经IM途径免疫接种的鸡在655HAU和6550HAU剂量水平100％存活。在用PWT/06攻击的组中，分别以6550HAU和26200HAU的一次施用方案后，10只鸡中的9和8只存活。在6550HAU组中，将一只鸟在攻击后的第10天(dpc)安乐死，由于严重的斜颈。

/浮萍始施-加施方案展示100％抵御此变体株。

使用定量RT-PCR测试对在2和4dpc获取自存活的鸟的口咽拭物样品研究病毒脱落。通过对于禽流感病毒的定量实时反转录聚合酶链反应(qRRT-PCR)测试口咽拭物，及基于使用攻击病毒稀释系列产生的回归线将qRRT-PCR循环阈值转变为相当的含胚鸡卵中的感染性滴度(Lee et al.，Journal of Virological Methods 119(2)：151-158)。简言之，通过将250μl的拭物培养基添加到750μl的Trizol LS(Invitrogen Inc.、Carlsbad，CA)从口咽拭物提取RNA，之后经涡旋混合，于室温温育10分钟及然后添200μl的氯仿。将样品再次涡旋，于室温温育10分钟，及然后以约12,000×g离心15分钟。收集水相，并用MagMAX AI/ND病毒RNA分离试剂盒(Ambion，Inc.AustinTX)根据试剂盒使用说明，使用KingFisher磁性粒子处理系统(Thermo Scientific，Waltham，MA)分离RNA。将禽流感病毒攻击株用于产生RNA用于定量标准品。在BHI肉汤(Becton-Dickinson)中稀释尿囊液病毒浓储物及在稀释时间按照标准方法在含胚鸡卵中滴定(Swayne et al.，2008，Avian influenza.In：Isolation andIdentification of Avian Pathogens.5th ed.，pp.128-134)。如对拭物所述从滴定的病毒的10倍稀释提取全病毒RNA。如前所述进行对于流感基质基因的qRRT-PCR(Lee等人，2004)。基于标准曲线计算样品中的病毒滴度，通过Smart Cycler II计算(Cepheid，Inc.Sunnyvale，CA)软件或标准曲线等式的推导。对于用Indo/03攻击的组，用浮萍野生型免疫接种的全部鸡发现在10^6.9EID₅₀的病毒滴度是阳性，然而浮萍HA组的病毒脱落在2dpc显著降低到刚在分别对于6550HAU和655HAU的10^2.9和10^3.1EID₅₀的检测限以上，及在4dpc变得非-可检测。对于用抗原性变体PWT/06株攻击的组，用实验HA以5000HAU免疫的全部鸡在2dpc仍以10^7.1EID₅₀脱落病毒，仅1、2及10只鸟中的1只可分别检测6550HAU、26200HAU和

/浮萍组，2只在4dpc后以6550和26200HAU对于浮萍HA组仍阳性，但是，在

/浮萍组，病毒接近或低于检测限(10^3.5EID₅₀)。

也使用ELISA试剂盒研究样品的H5N1攻击之前和后核蛋白(NP)特异性抗体的存在(图19)。NP特异性抗体在用浮萍HA免疫后和攻击之前收集的全部血清样品中缺乏。PWT/06攻击后，9分之9、8分之8、及10分之8的样品展示分别对于6550HAU、26200HAU和始施-加施组的阳性信号。

图21显示在第42天攻击之前和在第56天攻击后(14dpc)收集的样品的血清学分析。非浮萍野生型也非口服组发展任何对Indo/03株的体液免疫，10分之3用表达HA的实验杆状病毒免疫接种的显示针对VN/04株的2.4log2的可检测的抗体滴度。全部其他组显示对所测抗原(即Indo/03、VN/04和Mong/05)的阳性免疫应答，这支持免疫原性研究中的数据。

Indo/03攻击后，针对Indo/03的平均HI滴度分别对于655HAU和6550HAU组，从4.5升高到7.1log2，及从6.9升高到8.2log2。血清也显示针对PWT/06从非-可检测显著增加到2.7log2，及从2.2显著增加到3.8log2。PWT/06攻击后，针对同源PWT/06的平均HI滴度分别对于6550HAU、26200HAU和始施-加施组，从2.2跳到6.0log2、从2.2跳到6.3log2、及从2.7跳到4.9log2。在针对Indo/03的HI滴度中也观察到类似趋势，对于相同的组从6.9到8.6log2、从6.8到9.0log2及从7.1到7.7log2。

有趣的是，基于NP的ELISA结果显示，如所期望，攻击之前无可检测的NP-免疫应答。但是，攻击后，保护的鸟的大部分血清变成阳性。此结果明显表示，浮萍-表达的HA疫苗单独或用表达HA的鸡痘病毒载体的始施-加施疫苗接种方案(所谓的始施-加施方案)与DIVA(感染的和免疫接种的动物的区分)策略完全比肩。所述疫苗的使用应容易允许通过使用商业上可用的ELISA检查抗-NP抗体来检测免疫接种的畜群中的感染。

【实施例6：来自浮萍植物的禽流感蛋白的纯化】

将禽流感抗原性多肽或其片段或变体通过从培养基分离抗原性多肽来纯化。初始纯化包括离心去除植物材料和细胞碎片。此部分纯化后，粗提取物可通过pH转移和热处理澄清，之后在硅藻土上过滤。从这些澄清的提取物通过亲和层析在胎球蛋白柱上纯化重组HA。纯化可通过光密度测定法在考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上测定。

将植物组织用50mM磷酸钠、0.3M氯化钠和10mM EDTA，pH7.2使用Silverson高剪力混合器匀浆。将匀浆物用1M柠檬酸酸化至pH4.5，及于4℃以7,500g离心30分钟。将上清的pH用2M 2-氨基-2-[羟甲基]-1，3-丙二醇(Tris)调整到pH7.2，之后使用0.22μm过滤器过滤。将材料直接装载到用含50mM磷酸钠、0.3M氯化钠和10mM EDTA，pH7.2的溶液平衡的mAbSelect SuRe蛋白A树脂(GEHealthcare)上。装载后，用平衡缓冲液将柱洗涤到基线，之后立即用5个柱体积的0.1M乙酸钠，pH5.0洗涤。将结合的抗体用10个柱体积的0.1M乙酸钠，pH3.0洗脱。将蛋白A洗出液立即用2M Tris中和。为聚集物去除，将蛋白A洗出液调整到pH5.5，并施加到用25mM磷酸钠，pH5.5平衡的I型陶瓷羟基磷灰石(Bio-Rad，CA，USA)柱。用5个柱体积的平衡缓冲液洗涤柱后，将蛋白使用0.25M磷酸钠，pH5.5在单步骤洗脱中洗脱。将含通过A₂₈₀监控的蛋白的级分合并，且于-80℃储存(Cox，K.M.，等人，2006.24(12)：p.1591-7)。

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