EA018206B1 - Вирусоподобные частицы вируса гриппа, включающие гемагглютинин, продуцированный в растении - Google Patents

Вирусоподобные частицы вируса гриппа, включающие гемагглютинин, продуцированный в растении Download PDF

Info

Publication number
EA018206B1
EA018206B1 EA201000195A EA201000195A EA018206B1 EA 018206 B1 EA018206 B1 EA 018206B1 EA 201000195 A EA201000195 A EA 201000195A EA 201000195 A EA201000195 A EA 201000195A EA 018206 B1 EA018206 B1 EA 018206B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
virus
plant
sequence
protein
influenza
Prior art date
Application number
EA201000195A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201000195A1 (ru
Inventor
Марк-Андре Д`Ау
Манон КУТЮР
Фредерик Орс
Сонья Трепанье
Пьер-Оливье Лавуа
Мишель Даргис
Луи-Филипп ВЕЗИНА
Натали ЛАНДРИ
Original Assignee
Медикаго Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Медикаго Инк. filed Critical Медикаго Инк.
Publication of EA201000195A1 publication Critical patent/EA201000195A1/ru
Publication of EA018206B1 publication Critical patent/EA018206B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
    • C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F9/00—Arrangements for program control, e.g. control units
    • G06F9/06—Arrangements for program control, e.g. control units using stored programs, i.e. using an internal store of processing equipment to receive or retain programs
    • G06F9/46—Multiprogramming arrangements
    • G06F9/50—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU]
    • G06F9/5005—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU] to service a request
    • G06F9/5027—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU] to service a request the resource being a machine, e.g. CPUs, Servers, Terminals
    • G06F9/505—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU] to service a request the resource being a machine, e.g. CPUs, Servers, Terminals considering the load
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/517—Plant cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16223—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F2209/00—Indexing scheme relating to G06F9/00
    • G06F2209/50—Indexing scheme relating to G06F9/50
    • G06F2209/508—Monitor

Abstract

В соответствии с изобретением предлагается способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) в растении или его части. Способ включает введение ГА вируса гриппа в растения и очищение методом эксклюзивной хроматографии по размеру. В изобретении также предлагаются ВЧ, содержащие белок ГА вируса гриппа и растительные липиды. В изобретении также предлагается нуклеиновая кислота, кодирующая ГА вируса гриппа, а также векторы. ВЧ могут использоваться для создания вакцин от гриппа, либо для улучшения существующих вакцин.

Description

Изобретение относится к получению вирусоподобных частиц. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на получение вирусоподобных частиц, представляющих собой антигены вируса гриппа.
Предпосылки созданя изобретения
Грипп является основной причиной смерти людей, вызванной респираторными вирусами. К его общим симптомам относятся, помимо прочего, лихорадка, боль в горле, одышка и боль в мышцах. В сезон гриппа вирусом гриппа во всем мире подвергаются инфицированию 10-20% населения, что приводит к смерти 250-500 тыс. человек ежегодно.
Вирусы гриппа являются оболочечными вирусами, почкующимися из клеточной мембраны инфицированных клеток млекопитающих. Вирусы гриппа подразделяются на три типа: А, В и С, в зависимости от присутствия нуклеопротеидов и антигенов белков матрикса. Вирусы гриппа типа А далее могут быть подразделены на подтипы в зависимости от сочетания расположенных на поверхности гликопротеинов: гемагглютинина (ГА) и нейраминидазы (НА). ГА определяет способность вируса связываться с клеткой-хозяином и проникать в нее. НА удаляет терминальные остатки сиаловой кислоты из гликановых цепей на клетке-хозяине и белки на поверхности вируса, что препятствует агрегации вирусов и способствует их подвижности. В настоящее время известно 16 подтипов ГА (Н1-Н16) и 9 подтипов НА (N1N9). Каждый вирус гриппа типа А содержит по одному типу гликопротеинов ГА и НА. В общем случае каждый подтип проявляет видовую специфичность; например, известно, что все подтипы ГА и НА способны инфицировать птиц, но только подтипы Н1, Н2, Н3, Н5, Н7, Н9, Н10, N1, N2, N3 и N7 опасны для людей (НопшоЮ 2006; διιζιιΚί 2005). Вирусы гриппа, содержащие Н5, Н7 и Н9, считаются наиболее патогенными формами вируса гриппа типа А, и скорее всего, именно они в будущем станут причиной пандемий.
Пандемии гриппа, как правило, вызываются активно распространяющимися высоковирулентными вирусами гриппа, они могут привести к повышенному уровню заболеваемости и смертности в мире. Появление новых подтипов А вируса гриппа привело к 4 главным пандемиям в XX веке. Грипп-испанка, вызванный вирусом Н1М в 1918-1919 гг., унес жизни более чем 50 млн людей в мире в период с 1917 по 1920 г.г. В настоящее время постоянно существует риск появления нового подтипа или передачи людям подтипа вируса, эндемичного для животных. Особое беспокойство вызывает высоковирулентная форма, называемая птичий грипп, вспышки которой были зафиксированы в нескольких странах по всему миру. Во многих случаях птичий грипп может вызвать практически 100%-ную смертность в течение 2 суток. Утверждается, что распространение вируса птичьего гриппа (Н5№), который был впервые обнаружен в Гонконге в 1997 г., в другие страны Азии и Европы связано с сезонной миграцией диких птиц.
Современным способом борьбы с гриппом у людей является ежегодная вакцинация. Вакцина обычно представляет собой комбинацию нескольких штаммов, которые, как прогнозируется, будут доминирующими в наступающем сезоне гриппа. Данный прогноз координирует Всемирная организация здравоохранения. В целом количество доз вакцины, которое изготавливается каждый год, недостаточно для вакцинации всего населения в мире. Например, Канада и США получают вакцину в количестве, достаточном для одной трети населения, а для Европейского союза эта величина составляет лишь 17% населения. Очевидно, что существующий объем производства вакцины от гриппа окажется недостаточным перед лицом мировой пандемии. Даже если необходимый годовой объем её производства и будет какимлибо образом достигнут в определенный год, доминирующие штаммы от года к году меняются, и поэтому невозможно предварительное создание запасов вакцины в периоды её низкого потребления. Экономически выгодное крупномасштабное производство эффективной вакцины от гриппа представляет значительный интерес как для государственных промышленных предприятий, так и для частного бизнеса.
Запасы вирусов, предназначенные для применения в вакцинах, получают в оплодотворенных яйцах. Вирусные частицы собирают и, при получении убитой вакцины, обрабатывают детергентом для инактивации. Живые ослабленные вакцины получают из вирусов гриппа, адаптированных для роста при низких температурах, что означает, что в организме при нормальной температуре вакцина будет ослаблена. Такая вакцина лицензирована в США для людей в возрасте от 5 до 49 лет. Убитые цельновирионные вакцины становятся безопасными при инактивации химическими реагентами, они образуются в оплодотворенных яйцах или клеточных культурах млекопитающих. Все указанные типы вакцин имеют свои преимущества и недостатки. Одним из преимуществ вакцин, полученных из цельных вирусов, является тип иммунитета, вызванный такой вакциной. В целом, расщепленные (сплит) вакцины вызывают сильный гуморальный ответ (образование антител), в то время как вакцины, изготовленные из цельных вирусов, вызывают как гуморальный, так и клеточный ответ. Несмотря на то что функциональный гуморальный ответ является критерием для лицензирования, коррелирующим с защитным действием вакцины, имеется все больше указаний на то, что Т-клеточный ответ также играет важную роль в иммунитете против гриппа, обеспечивая более надежную защиту для пожилых людей.
Для получения клеточного иммунного ответа были разработаны вакцины из цельных вирусов.
Вследствие высокой патогенности штамма гриппа (например, Н5№), такие вакцины получают с использованием оборудования с биологической защитой ВЬ3+. Для высокопатогенных штаммов гриппа, таких как Н5№, некоторые производители модифицировали последовательность гена гемагглютинина с целью
- 1 018206 снижения патогенности штамма гриппа, который становится авирулентным и лучше продуцируется в яйцах или клеточных культурах млекопитающих. В других случаях применялись химерные штаммы, где генетические последовательности белков гемагглютинина и нейраминидазы клонируют в высокопродуктивном донорном штамме гриппа низкой патогенности (А/РБ/8/34; Циаи Р-8 с соавт., 2007). Такими способами можно получить полезные вакцины, но при этом не решается задача быстрого производства больших количеств недорогих вакцин в объеме, достаточном для соответствия потребностям обычного года, и разумеется, этого недостаточно в случае пандемии.
При использовании технологии обратной генетики может потребоваться также мутация генетической последовательности белка ГА, чтобы сделать его авирулентным. Для высокопатогенных штаммов гриппа производство цельновирионной вакцины либо требует конфайнмента, либо полученные вакцины не будут полностью соответствовать распространяющемуся вирусу по генетической последовательности. Для ослабленных живых вакцин существует риск того, что введенная вакцина будет рекомбинировать с вирусом гриппа организма-хозяина, давая новый вирус гриппа.
Несмотря на то что указанный способ поддерживает антигенный эпитоп и посттрансляционную модификацию, у него имеется ряд недостатков, в том числе риск загрязнения вследствие использования цельных вирусов и непостоянный объем производства, в зависимости от штамма вируса. Генетическая неоднородность вируса, вследствие его введения в яйца, может привести к уровню защиты ниже оптимального. К прочим недостаткам относятся: предварительное планирование для получения яиц, риск загрязнения вследствие участия химических веществ в процессе очистки и длительное время производства. Помимо этого, лица, имеющие повышенную чувствительность к яичному белку, возможно, не смогут получать такую вакцину.
В случае пандемии производство сплит-вакцин ограничивается необходимостью адаптировать штамм для роста на яйцах и непостоянным количеством продукта. Несмотря на то что данная технология применяется в течение многих лет для получения сезонных вакцин, она вряд ли пригодна для временных рамок развития пандемии, а объем производства в мире ограничен.
Для исключения применения яиц вирусы гриппа производили также в клеточной культуре млекопитающих, например в клетках МОСК или РЕК.С.6 или их аналогах. Еще одним подходом является обратная генетика, где вирусы образуются при трансформации клеток генами вируса. Однако указанные способы также требуют применения цельного вируса, а также хорошо разработанных методов и специальных культурных сред.
В качестве кандидатур на роль рекомбинантной вакцины от гриппа было разработано несколько продуктов. При этом основное внимание уделяется экспрессии, продуцировании и очистке белков ГА и НА вируса гриппа типа А, в том числе экспрессии указанных белков с помощью клеток насекомых, зараженных бакуловирусом (СгаМогб с соавт., 1999; Ιοίιαηδδοη. 1999), вирусных векторов и конструкций ДНК- вакцин (О1§еи с соавт., 1997).
Специфика заражения вирусом гриппа хорошо известна. Вкратце, инфекционный цикл инициируется присоединением белка ГА, находящегося на поверхности вириона, к клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту (гликопротеины и гликолипиды). Белок НА влияет на процессинг рецептора сиаловой кислоты, и проникновение вируса в клетку определяется ГА-зависимым эндоцитозом, обусловленным рецептором. В кислотных условиях интернализированных эндосом, содержащих вирион гриппа, конформационные изменения в ГА-белке приводят к слиянию вирусной и клеточной мембраны и потере вирусом оболочки и М2-опосредованному высвобождению М1-белков из нуклеокапсид-ассоциированных рибонуклеопротеидов (РНП), которые мигрируют в ядро клетки для синтеза вирусной РНК. Антитела к белкам ГА предотвращают инфицирование вирусом, нейтрализуя инфективность вируса, а антитела к белкам НА тормозят их влияние на ранних стадиях репликации вируса.
В работе СгаМогб с соавт. (1999) раскрывается экспрессия ГА вируса гриппа в клетках насекомых, зараженных бакуловирусом. Белки, полученные в результате экспрессии, были способны предотвращать летальное заболевание гриппом, вызванное подтипами Н5 и Н7 птичьего вируса. В работе 1оЬаи88ои с соавт. (1999) указано, что белки ГА и НА вируса гриппа, экспрессированные бакуловирусом, вызывают иммунный ответ у животных, превосходящий иммунный ответ, вызванный обычными вакцинами. Иммуногенность и эффективность гемагглютинина вируса лошадиного гриппа, полученного экспрессией бакуловирусом, сравнивали с вакциной-кандидатом с гомологичной ДНК (О1§еи с соавт., 1997). Все эти данные показывают, что при использовании различных экспериментальных методов и различных животных моделей рекомбинантные белки ГА или НА могут обеспечить высокую степень защиты против вируса гриппа.
Так как предыдущие исследования показали, что гликопротеиды, ГА и НА, расположенные на поверхности вируса гриппа, являются первичными мишенями для выявления защитного иммунитета против вируса гриппа и что М1 представляет собой консервативную мишень для клеточного иммунитета к вирусу гриппа, новая вакцина-кандидат может включать указанные вирусоспецифические антигены в форме белковой макромолекулярной частицы, такой как вирусоподобная частица (ВЧ). Преимущество
ВЧ, используемой в качестве вакцин, состоит в более высокой иммуногенности по сравнению с субъединичными или рекомбинантными антигенами, а также в способности стимулировать как гуморальный, так
- 2 018206 и клеточный иммунный ответ (Сгдас1с апб Апбегкоп, 2006). Далее, частица с такими антигенами вируса гриппа может иметь конформационные эпитопы, приводящие к образованию нейтрализующих антител к множественным штаммам вируса гриппа.
Одним из способов предотвращения случайного инфицирования является производство неинфекционного штамма вируса гриппа для вакцины. В качестве альтернативы исследовали применение вирусоподобных частиц (ВЧ), вместо культивируемого вируса. ВЧ имитируют строение капсулы вируса, но у них отсутствует геном, и таким образом они неспособны реплицироваться или вызывать вторичную инфекцию.
В нескольких исследованиях было показано, что рекомбинантные белки вируса гриппа агрегируются с образованием ВЧ в клеточной культуре с помощью экспрессионной плазмиды млекопитающих или векторов бакуловируса (Сотех-РиеПак с соавт., 1999; №ишапп с соавт., 2000; ЬаШаш апб Са1аг/а. 2001). В работе Соте/-Рпег1ак с соавт. (1999) указано, что эффективное образование ВЧ вируса гриппа зависит от уровня экспрессии нескольких вирусных белков. В работе Ыеитапп с соавт. (2000) создана система на основе экспрессионной плазмиды млекопитающих для генерирования инфекционных вирусоподобных частиц вируса гриппа исключительно из клонированных ДНК. ЬаШат апб Са1агха (2001) сообщили об образовании ВЧ вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, при коэкспрессии генов ГА, НА, М1 и М2. Указанные исследования продемонстрировали, что белки вириона гриппа способны к самосборке при коэкспрессии в клетках-эукариотах.
Согласно Сотех-РиеПак с соавт. (2000), помимо гемагглютинина (ГА), для почкования ВЧ из клеток насекомых необходим матричный белок (М1) вируса гриппа. Однако Сйеп с соавт. (2007) указывали, что М1 может не требоваться для образования ВЧ, и обнаружили, что для эффективного выделения М1 и ВЧ требуется присутствие ГА и сиалидазная активность, которая обеспечивается НА. НА расщепляет сиаловые кислоты гликопротеидов на поверхности клеток, продуцирующих ВЧ, которые выходят во внешнюю среду.
Согласно Оиап с соавт. 2007, вакцина на основе ВЧ, полученная в системе экспрессии бакуловируса (клетка насекомого), вызывает защитный иммунитет против некоторых штаммов вируса гриппа (А/РВ8/34 (Η1Ν1)). В работе Опап при почковании из плазматической мембраны ВЧ имели правильный размер и морфологию, аналогичные тем, что были получены в системе клеток млекопитающих (клетки МОСК).
Оболочечные вирусы могут приобрести липидную оболочку при почковании из инфицированной клетки, а мембрану - из плазматической мембраны либо из мембраны внутренних органелл. Частицы вируса гриппа и ВЧ выходят из плазматической мембраны клетки-хозяина. В системах на основе клеток млекопитающих и бакуловирусов, например, вирус гриппа почкуется из плазматической мембраны (Оиап с соавт. 2007). Известно лишь несколько оболочечных вирусов, способных инфицировать растения (например, топовирусы и рабдовирусы). Среди известных оболочечных вирусов они характеризуются почкованием из внутренних мембран клеток-хозяев, а не из плазматической мембраны. Несмотря на то что лишь немного рекомбинантных ВЧ было получено в растениях-хозяевах, ни одна из них не образовалась из плазматической мембраны, в связи с чем возникает вопрос, возможно ли получение в растениях ВЧ из плазматической мембраны, в том числе и ВЧ вируса гриппа.
Существующие технологии продуцирования ВЧ вируса гриппа основаны на коэкспрессии многих вирусных белков, что является недостатком данных технологий, так как в случае пандемии или ежегодной эпидемии время реагирования является решающим для вакцинации. Для ускорения разработки вакцины предпочтительна более простая система для получения ВЧ, зависящая от экспрессии только одного вирусного белка.
Для защиты населения от гриппа и для предотвращения будущих пандемий производители вакцин должны разработать эффективные и быстрые методы для производства доз вакцины. Существующая технология использования оплодотворенных яиц для производства вакцин неудовлетворительна и требует длительного времени.
Краткое описание изобретения
Изобретение преследует цель получения улучшенных вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа.
В соответствии с настоящим изобретением предлагается нуклеиновая кислота, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую антиген оболочечного вируса, оперативно связанная с регуляторным участком, который активен в растении. Антиген может представлять собой гемагглютинин (ГА) вируса гриппа.
В настоящем изобретении также предлагается способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа в растении, включающий:
a) введение в растение или его часть нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген оболочечного вируса, например гемагглютинин вируса гриппа (ГА), оперативно связанной с регуляторным участком, который активен в растении и
b) инкубирование растения или его части в условиях, позволяющих экспрессию нуклеиновой кислоты с получением таким образом ВЧ.
Способ может также включать стадии сбора растения и очистки или отделения ВЧ от ткани расте- 3 018206 ния.
Настоящее изобретение включает вышеприведенный способ, где на стадии введения (стадия (а)) нуклеиновая кислота может быть экспрессирована в растении временным или стабильным образом. Далее, ВЧ могут быть очищены методом эксклюзионной хроматографии по размеру.
В настоящем изобретении также предлагаются вирусоподобные частицы (ВЧ), содержащие белок Г А вируса гриппа и один или более одного растительный липид.
В настоящее изобретение также входит композиция, содержащая эффективную дозу ВЧ, содержащих белок ГА вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также предусматривает фрагменты или части белков ГА, образующих ВЧ в растении.
ВЧ может содержать белок ГА одного или более чем одного подтипа, в том числе Η1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16 или их фрагмент или часть. Примеры подтипов, содержащих такие белки ГА - А/Новая Каледония/20/99 (НШ1)А/Индонезия/5/2006 (Η5Ν1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавер/677/88 (Η2Ν8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/ ΜΝ/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейки/Онтарио/6118/68(Н8№). А/утки-широконоски/Иран/654/03, А/куры/Германия/№1949(Н10Ю), А/утки/Англия/56(Н1Ш6), А/утки/ Альберта/60/76(Н12№), А/чайки/Мэриленд/704/77(Н13№), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/ 341/83 (Η15Ν8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Н16№), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/ПуэртоРико/8/34 (Η1Ν1), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1), А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1), А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2), А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2), А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1), А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1), А/дикие утки/Гонконг/А312/97 (Η6Ν1), А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7), А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2).
Согласно одному из аспектов изобретения белок ГА может относиться к подтипу Η1, Н2, Н3, Н5, Н6, Н7 или Н9. Согласно другому варианту, белок Η1 может происходить из штаммов А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1), А/Пуэрто-Рико/8/34 (Η1Ν1), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) или А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1). Белок Н3 может также происходить из штаммов А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2) или А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2). Еще в одном варианте изобретения белок Н2 может быть из штамма А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2). Белок Н5 может быть из штамма А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1),
А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) или А/Индонезия/5/2005. В одном из вариантов изобретения белок Н6 может быть из штамма А/дикие утки/Гонконг/А312/97 (Η6Ν1). Белок Н7 может быть из штамма А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7). Согласно варианту изобретения белок Н9 - из штамма А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2). В другом варианте изобретения белок ГА может быть из вируса гриппа, который может быть вирусом типа В, включая В/Малайзия/2506/2004 или В/Флорида/4/2006. Примеры аминокислотных последовательностей белков ГА подтипов Η1, Н2, Н3, Н5, Н6, Н7 и Н9 - 8ЕО ΙΌ ΝΘδ: 48-59.
Белок Г А вируса гриппа может быть белком Н5 Индонезия.
Согласно настоящему изобретению также предлагаются молекулы нуклеиновых кислот с последовательностями, кодирующими белок ГА. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать один или более регуляторный участок, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей белок ГА. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать последовательность, кодирующую Η1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16. В одном варианте изобретения белок ГА, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, относится к подтипу Η1, Η2, Н3, Н5, Н6, Н7 или Н9. Белок Η1, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1), А/Пуэрто-Рико/8/34 (Η1Ν1), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) или А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1). В одном варианте изобретения белок Н3, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2), или А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2). Еще в одном варианте изобретения белок Н2, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из штамма А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2). Белок Н5, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может также быть из штамма А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1), А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) или А/Индонезия/5/2005. В одном варианте изобретения, белок Н6, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из штамма А/Дикие утки/Гонконг/А312/97 (Η6Ν1). Белок Н7, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может также быть из штамма А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7). Помимо этого, белок Н9, который кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, может быть из штамма А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2). Примерами последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки ГА подтипов Η1, Н2, Н3, Н5, Н6, Н7 и Н9, являются 8Ер ГО ΝΟ: 36-47 и 60-73.
Последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать белок ГА Н5 вируса гриппа Индонезия.
Регуляторные участки, которые могут быть оперативно связаны с последовательностью, кодирующей белок ГА, включают оперативные участки клетки растения, клетки насекомого или клетки дрожжей.
К таким регуляторным участкам относятся регуляторный участок пластоцианина, регуляторный участок рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы (К.иВщСО), хлорофилл а/Ь-связывающего белка (САВ), 8Т-Ь81, регуляторный участок полиэдрина или регуляторный участок др64. Другие регуляторные
- 4 018206 участки - 5' НТО, 3' НТО или последовательности прерывания. Регуляторный участок пластоцианина может быть регуляторным участком пластоцианина люцерны; 5' НТО, 3' НТО и последовательность прерывания также могут быть последовательностями люцерны.
Предлагается также способ создания иммунитета к вирусу гриппа у объекта, включающий введение вирусоподобных частиц в составе белок Г А вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Вирусоподобные частицы можно вводить объекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно либо подкожно.
Настоящее изобретение также относится к вирусоподобной частице (ВЧ), состоящей из одного или более одного белка, полученного из вируса, выбранного из группы, включающей вирусы гриппа, кори, Эбола, Марбург и ВИЧ, и одного или более одного липида, полученного из несиалилирующей клеткихозяина. Белок ВИЧ может представлять собой р24, др120 или др41; белок вируса Эбола может быть ΥΡ30 или УР35; белок вируса Марбург может быть Ор/δΟΡ; белок вируса кори может быть Н-белком или Р-белком.
Далее, настоящее изобретение относится к вирусоподобной частице (ВЧ), состоящей из белка ГА вируса гриппа и одного или более одного липида-хозяина. Например, если хозяином является насекомое, вирусоподобная частица (ВЧ) может содержать белок ГА вируса гриппа и один или более одного липид насекомого, либо если хозяин - дрожжи, то вирусоподобная частица (ВЧ) может содержать белок ГА вируса гриппа один или более одного липида дрожжей.
Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим ВЧ двух или более штаммов или подтипов гриппа. Два или более подтипа или штамма могут быть выбраны из группы, включающей: А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) А/Индонезия/5/2006 (Η5Ν1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавер/677/88 (Η2Ν8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/МЦ/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейки/Онтарио/6118/68 (Η8Ν4), А/уткн-широконоски/Иран/654/03, А/куры/Германия/№1949(Н10Ю), А/утки/Англия/56 (Η11Ν6), А/уткн/Альберта/60/76 (Η12Ν5), А/чайкн/Мэриленд/704/77(Н13N6), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/уткн/Австралия/341 /83 (Η15Ν8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Н16№), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (Η1Ν1), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1), А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1), А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2), А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2), А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1), А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1), А/дикие утки/Гонконг/А312/97 (Η6Ν1), А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7) или А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2)). Два или более подтипа или штамма ВЧ могут присутствовать приблизительно в эквивалентных количествах; либо один или более подтип или штамм может составлять большую часть из присутствующих штаммов или подтипов.
Настоящее изобретение относится к способу создания иммунитета к вирусу гриппа у животного или целевого организма, включающему введение эффективной дозы вакцины, состоящей из одного или более одного ВЧ, при этом ВЧ получены с помощью несиалилирующего хозяина, например растенияхозяина, насекомого-хозяина или дрожжей-хозяина. Вакцину можно вводить перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно либо подкожно. Целевой организм может быть выбран из группы, включающей человека, приматов, лошадей, свиней, водоплавающих птиц, перелётных птиц, перепелок, уток, гусей, домашних птиц, кур, верблюдов, псовых, собак, кошачьих, кошек, тигров, леопардов, циветт, норок, каменных куниц, хорьков, комнатных животных, домашний скот, мышей, крыс, тюленей, китов и т.д.
Настоящее изобретение предлагает способ получения ВЧ, содержащих гемагглютинин (ГА) из разных штаммов вируса гриппа, в приемлемом хозяине, способном продуцировать ВЧ, например в растении, насекомом или дрожжах. ВЧ, полученные в растениях, содержат липиды растительного происхождения, ВЧ, полученные в организме насекомых, содержат липиды из плазматической мембраны клеток насекомых (обычно называемые липиды насекомых), а ВЧ, полученные в дрожжах, содержат липиды из плазматической мембраны клеток дрожжей (обычно называемые липиды дрожжей).
Получение ВЧ в растениях имеет ряд преимуществ по сравнению с их получением в клеточных культурах насекомых. Растительные липиды способны стимулировать специфические иммунные клетки и таким образом усилить иммунный ответ. Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), а также содержат гликосфинголипиды, свойственные только растениям, и некоторые бактерии и простейшие. Особенность сфинголипидов в том, что они не являются эфирами глицерина, как ФХ и ФЭ, а состоят из длинноцепного аминоспирта, связанного амидной связью с жирной кислотой, содержащей в цепи более 18 атомов углерода. ФХ и ФЭ, а также гликосфинголипиды могут связываться молекулами ΟΌ1, экспрессирующимися иммунными клетками млекопитающих, такими как антигенпредставляющие клетки (АПК), например, дендритные клетки и макрофаги, и другие клетки, в том числе В- и Т-лимфоциты тимуса и печени (Ткир М., 2006). Далее, помимо потенциального адъювантного действия растительных липидов, растительные Ν-гликаны способствуют захвату антигенов гликопротеидов антигенпредставляющими клетками (БашЫоге-Оирак, 2007), что может повышать эффективность продукции ВЧ в растениях.
Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что ВЧ, полученные в растениях, вызовут более сильную иммунную реакцию, чем ВЧ, полученные в других системах производства, и что иммун
- 5 018206 ная реакция, вызванная ВЧ из растений, будет сильнее по сравнению с иммунной реакцией, вызванной живой или ослабленной цельновирионной вакциной.
В отличие от вакцин, изготовленных из цельных вирусов, преимущество ВЧ в том, что они не инфекционны, поэтому биологическая защита не столь важна, как при работе с цельным инфекционным вирусом и не требуется при производстве. В этом отношении растительные ВЧ имеют дополнительное преимущество, так как систему экспрессии можно выращивать в оранжерее или на открытом воздухе, вследствие чего способ является более экономичным и пригодным для увеличения масштабов производства.
Далее, растения не содержат ферментов, участвующих в синтезе и присоединении к белкам остатков сиаловой кислоты. Получение ВЧ можно проводить в отсутствие нейраминидазы (НА), при этом нет необходимости в коэкспрессии НА либо в обработке продуцирующих клеток или экстракта сиалидазой (нейраминидазой) для получения ВЧ в растениях.
ВЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, не содержат белка М1, который, как известно, связывает РНК. РНК является примесью при получении ВЧ, нежелательной при аттестации продукции официальными органами.
Данное краткое описание изобретения не обязательно включает все признаки изобретения.
Краткое описание рисунков
Приведенные выше и прочие признаки изобретения будут более понятными из последующего подробного описания, в котором содержатся ссылки на прилагаемые чертежи (фиг.), на которых:
на фиг. 1А показана последовательность экспрессирующей кассеты на основе пластоцианина люцерны для экспрессии Н1 в соответствии с осуществлением настоящего изобретения (δΕΟ ΙΌ N0:8). Сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (ΡΌΙ) подчеркнут. Сайты рестрикции ВдШ (АСАТСТ) и 8ае1 (САССТС), используемые для клонирования, показаны жирным шрифтом. На фиг. 1В показана схема функциональных доменов гемагглютинина вируса гриппа. После расщепления ГА0, фрагменты ГА1 и ГА2 остаются связаны дисульфидным мостиком.
На фиг. 2А представлено изображение плазмиды 540 в компоновке для экспрессии ГА подтипа Н1. На фиг. 2В показано изображение плазмиды 660 в компоновке для экспрессии ГА подтипа Н5.
На фиг. 3 представлена эксклюзионная хроматография экстрактов белка из листьев после получения гемагглютинина Н1 или Н5. На фиг. ЗА показан профиль элюирования Н1; декстран голубой 2000 (треугольники) и белки (ромбики). На фиг. ЗВ представлен иммунологический анализ (вестерн-блоттинг; анти Н1) элюированных фракций Н1 после эксклюзионной хроматографии (фаза 8500-НВ). На фиг. ЗС показан профиль элюирования Н5; декстран голубой 2000 (треугольники) и белки (ромбики). На фиг. 3Ό представлен иммунологический анализ (вестерн-блоттинг; анти Н5) элюированных фракций Н5 после эксклюзионной хроматографии (фаза 8500-НК.).
На фиг. 4 показана электронная микрофотография крупных структур гемагглютинина Н1 и Н5, полученных из фракции 9, элюированной из хроматографической колонки. На фиг. 4А показано 50000кратное увеличение ВЧ из Н1, на котором видны множественные сходные структуры (черта соответствует 200 нм). На фиг. 4В показано 150000-кратное увеличение ВЧ из Н1 (черта соответствует 100 нм). На фиг. 4С показано 50000-кратное увеличение ВЧ из Н5, на котором видны множественные сходные структуры (черта соответствует 50 нм).
На фиг. 5А представлена последовательность Ν-терминального фрагмента Н1 (δΕΟ ΙΌ N0: 1). На фиг. 5В представлен С-концевой фрагмент Н1 (δΕΟ ΙΌ N0:2). На фиг. 5С показана полная последовательность, кодирующая ГА0 Н1 (δΕΟ ΙΌ N0:28).
На фиг. 6 показана последовательность, кодирующая Н5, фланкированная сайтом НтбШ непосредственно перед исходным АТС и сайтом 8ае1 непосредственно после стоп-кодона (ТАА) (δΕΟ ΙΌ N0:3)
На фиг. 7А показана последовательность праймера Р1аЧо-443с (δΕΟ ΙΌ N0:4). На фиг. 7В показана последовательность праймера БрНАДиф-РПкЮ.т (δΕΟ ΙΌ N0:5). На фиг. 7С показана последовательность праймера Ркйо-ЗрНА^пф.с (δΕΟ ΙΌ N0:6). На фиг. 7Ό показана последовательность праймера НА(Тпф-8ас.г (δΕΟ ΙΌ N0:7).
На фиг. 8А показана аминокислотная последовательность пептида ГА1 (δΕΟ ΙΌ N0:9). На фиг. 8В представлена аминокислотная последовательность пептида ГА5 (δΕΟ ΙΌ N0: 10). Нативный сигнальный пептид выделен жирным шрифтом.
На фиг. 9 показана последовательность Г А вируса гриппа А подтипа Н7 (δΕΟ ΙΌ ^N0: 11).
На фиг. 10А показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н2 (δΕΟ ΙΌ N0: 12). На фиг. 10В показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н3 (δΕΟ ΙΌ N0: 13). На фиг. 10С показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н4 (δΕΟ ΙΌ N0: 14). На фиг. 10Ό показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н5 (δΕΟ ΙΌ N0: 15). На фиг. 10Е показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н6 (δΕΟ ΙΌ N0: 16). На фиг. 10Е показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н8 (δΕΟ ΙΌ N0: 17). На фиг. 10С показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н9 (δΕΟ ΙΌ N0: 18). На фиг. 10Н показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н10 (δΕΟ ΙΌ N0: 19). На фиг. 10Ι показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н11 (δΕΟ ΙΌ N0:20). На фиг. 101 показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н12 (δΕΟ
- 6 018206
ΙΌ N0:21). На фиг. 10К показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н13 (8Еф ГО N0:22). На фиг. 10Ь показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н14 (8Еф ГО N0:23). На фиг. 10М показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н15 (8Еф ГО N0:24). На фиг. 10Ν показана последовательность ГА вируса гриппа А подтипа Н16 (8Еф ГО 30 N0:25). На фиг. 100 показана последовательность ГА вируса гриппа В (8Еф ГО N0:26). На фиг. 10Р показана последовательность ГА вируса гриппа С (8Еф ГО N0:27). На фиг. 10ф показана последовательность праймера Хта1-рР1а§.с (8Еф ГО N0: 29). На фиг. 10В показана последовательность праймера 8ас1-АТС-рР1а§.г (8Еф ГО N0: 30). На фиг. 108 показана последовательность праймера 8ас1-Р1а§Тег.с (8Еф ГО N0: 31). На фиг. 10Т показана последовательность праймера ЕсоВ1-Р1а§Тег.г (8Еф ГО N0: 32).
На фиг. 11 представлена схема нескольких конструкций, в соответствии с их использованием в данном документе. Конструкция 660 содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую ГА подтипа Н5 при оперативном связывании с промотором (р1а§1о) и терминатором (Р1ег) пластоцианина; конструкция 540 содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую ГА подтипа Н1 в комбинации с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (8Р РЭ1) и оперативно связанную с промотором (Р1а§1о) и терминатором (Р1ег) пластоцианина; конструкция 544, собранная для экспрессии ГА подтипа Н1 - последовательность нуклеотидов, кодирующая Н1, соединена с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (8Р РЭ1) и пептидом с лейциновой застёжкой ССШрП (вместо трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста Н1) и оперативно связана с промотором (Р1а81о) и терминатором (Р1ег) пластоцианина; и конструкция 750 для экспрессии кодирующей области ΜΙ вируса гриппа А/РВ/8/34 комбинируется с вирусом гравировки табака (ТЕУ) 5НТО и оперативно связана с двойным промотором 358 и терминатором №8.
На фиг. 12 представлен иммунологический анализ Н5 с помощью антител к Н5 (Вьетнам) в экстракте белка из листьев N. ЬеШНапйапа. трансформированных конструкцией 660 (дорожка 3). Товарный Н5 из вируса А/Вьетнам/1203/2004 служил в качестве положительного контрольного образца при обнаружении (дорожка 1), а экстракт белка из листьев, трансформированных пустым вектором - в качестве отрицательного контроля (дорожка 2).
На фиг. 13 представлена характеристика структур гемагглютинина методом эксклюзионной хроматографии. Белковый экстракт из отдельных образцов биомассы, продуцирующей Н5, Н1, растворимый Н1 или Н1 и Μ1 разделяли гель-хроматографией на 8-500 НВ. Также фракционировали товарный образец Н1 в виде розеткообразной структуры (розеточный Н1). На фиг. 13 А приведены результаты анализа элюированных фракций на относительное содержание белка (относительное содержание белка - показан стандартный профиль элюирования белков при фракционировании биомассы). Обозначен пик голубого декстрана 2000 (2 МДа, стандартный образец). На фиг. 13В показаны результаты иммуноблоттинга для определения наличия гемагглютинина в элюированных фракциях с антителами к Н5 (Вьетнам). На фиг. 13С показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие Н1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 13Ό показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие растворимого Н1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 13Е показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие розеточного Н1 с помощью антител к вирусу гриппа А. На фиг. 13Е показаны результаты анализа элюированных фракций на наличие Н1 + Μ1 с помощью антител к вирусу гриппа А.
На фиг. 14 показано центрифугирование структур Н5 в градиенте плотности сахарозы и исследование концентрированных фракций гемагглютинина с помощью электронного микроскопа. На фиг. 14А показана характеристика фракций, полученных центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Каждую фракцию анализировали на наличие Н5 методом иммуноблоттинга с антителами к Н5 (Вьетнам) (верх.) и на относительное содержание белка и способность к гемагглютинации (график). На фиг. 14В показаны результаты исследования методом просвечивающей электронной микроскопии с негативным окрашиванием смешанных фракций 17, 18 и 19, полученных центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Черта соответствует 100 нм.
На фиг. 15 показана очистка ВЧ Н5 вируса гриппа. На фиг. 15А показаны результаты определения содержания белков на ДДС-№1-ПААГ с окрашиванием кумасси на стадиях очистки: дорожка 1 - сырой экстракт; дорожка 2 - экстракт, приведенный к рН 6; дорожка 3 - термообработанный экстракт; дорожка
-экстракт, отфильтрованный через диатомовую землю; стадии аффинной очистки на фетуине: дорожка
- загрузка; дорожка 6 - промывка; дорожка 7 - элюирование (концентрирование 10х). На фиг. 15В показаны результаты исследования методом просвечивающей электронной микроскопии с негативным окрашиванием очищенного образца ВЧ Н5. Черта соответствует 100 нм. На фиг. 15 С показана выделенная ВЧ Н5 с увеличением, позволяющим видеть детали строения. На фиг. 15Ό показана ВЧ Н5 на восстанавливающем ДДС-№1-ПААГ с окрашиванием кумасси (дорожка А) и Вестерн-блот анализ (дорожка В) с помощью поликлонального антитела кролика против ГА штамма А/Вьетнам/1203/2004 (Н5Ю).
На фиг. 16 показана последовательность нуклеотидов гена гемагглютинина (ГА) вируса гриппа типа А (А/Новая Каледония/20/99(НШ1)), полная кодирующая последовательность. СепВапк входящий №.
ΑΥ289929 (8Еф ГО N0: 33).
На фиг. 17 показана последовательность нуклеотидов мРНК протеиндисульфидизомеразы Мебюадо δηΐίνη. СепВапк входящий №. Ζ1 1499 (8Еф ГО N0: 34).
- 7 018206
На фиг. 18 показана последовательность нуклеотидов сегмента 7 вируса гриппа типа А (А/ПуэртоΡπκο/8/34(Η1Ν1)), полная последовательность. ОепВапк входящий №. Νϋ_002016.1 (8Εβ ΙΌ N0: 35).
На фиг. 19 показана локализация накопления ВЧ при исследовании методом просвечивающей электронной микроскопии с позитивным окрашиванием Н5-продуцирующей ткани. С\У - клеточная оболочка, ей - хлоропласт, рт - плазматическая мембрана, УЪР - вирусоподобная частица. Черта соответствует 100 нм.
На фиг. 20 показано индуцирование гуморального ответа сывороточных антител через 14 сут после повторной иммунизации мышей линии Ва1Ь/е, вакцинированных ВЧ Н5, полученными в растении, либо рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 20(А) Гуморальный иммунный ответ после иммунизации мышей путем внутримышечной инъекции. На фиг. 20(В) представлен гуморальный иммунный ответ после интраназальной иммунизации мышей. Гуморальный ответ измеряли по отношению к инактивированным цельным вирусам Η5Ν1 (А/Индонезия/5/05). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточка показывает среднее отклонение. * р < 0.05 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА.
На фиг. 21 представлен гуморальный ответ по ингибированию гемагглютинации (ΗΑΙ) через 14 сут после повторной иммунизации мышей линии Ва1Ь/с, вакцинированных ВЧ Н5, полученными в растении, либо рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 21(А) представлен гуморальный иммунный ответ после иммунизации мышей путем внутримышечной инъекции. На фиг. 21(В) показан гуморальный иммунный ответ после иммунизации мышей путем интраназального введения. Гуморальный ответ ΗΑΙ измеряли по отношению к инактивированным цельным вирусам Η5Ν1 (А/Индонезия/5/05). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточка показывает среднее отклонение. * р< 0.05 и ** р< 0.01 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА.
На фиг. 22 показано влияние адъюванта на иммуногенность ВЧ в организме мышей. На фиг. 22(А) показано влияние квасцов при иммунизации мышей путем внутримышечной инъекции. На фиг. 22(В) показано влияние хитозана при интраназальной иммунизации мышей. Гуморальный ответ ΗΑΙ измеряли по отношению к инактивированным цельным вирусам Η5Ν1 (А/Индонезия/5/05). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточка показывает среднее отклонение. * р < 0.05 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА.
На фиг. 23 представлен гуморальный иммунный ответ на введение ВЧ. На фиг. 23(А) показан изотип иммуноглобулина анти-Индонезия/5/05 для мышей, вакцинированных путем внутримышечной инъекции, через 30 сут после повторной иммунизации. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Твердофазный ИФА выполнен с цельными инактивированными вирусами. Черточки показывают среднее отклонение. * р< 0.05, ** р< 0.001 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА. На фиг. 23(В) представлены титры антител к цельным инактивированным вирусам. Все группы статистически различались при отрицательном контроле.
На фиг. 24 представлен титр антител к гомологичным цельным инактивированным вирусам (А/Индонезия/5/05) через 2 недели после первой дозы (неделя 2), через 14 сут после повторной иммунизации (неделя 5) или через 30 сут после повторной иммунизации (неделя 7). СГТ - средний геометрический титр. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. * р< 0.05 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА.
На фиг. 25 представлен перекрестный ответ ίη νίΙΐΌ сывороточных антител. (А) Титры антител к цельным инактивированным вирусам. (В) Титры ингибирования гемагглютинации к различным цельным инактивированным вирусам. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти мышей на группу. Черточки показывают среднее отклонение. Все группы статистически различались при отрицательном контроле. * р< 0.05, ** р< 0.001 по сравнению с рекомбинантным растворимым ГА.
На фиг. 26 показана эффективность ВЧ Н5, полученного в растении. (А) Коэффициент выживаемости мышей после заражения 10 ГН50 (4.09 χ 105 ССШ50 - 50% дозы инфицированной клеточной культуры) штаммом А/Турция/582/06 (Η5Ν1) (В) Масса тела иммунизированных мышей после заражения. Приведены средние массы тела живых мышей.
На фиг. 27 показано образование ВЧ вируса гриппа в растениях. (А) Состав полярных липидов очищенных ВЧ вируса гриппа. Липиды, содержащиеся в пробе, эквивалентной 40 мкг белка, экстрагировали из ВЧ, как описано, отделяли ВЭ-ТСХ и сравнивали по профилю миграции с липидами, выделенными из высокочистой плазматической мембраны (ПМ) табака. Аббревиатуры соответствуют следующим липидам: Ό0Ό0 - дигалактозилдиацилглицерин; д1иСЕВ - глюкозилцерамид; РА - фосфатная кислота; РС - фосфатидилхолин; РЕ - фосфатидилэтаноламин; Рб - фосфатидилглицерин; ΡΙ - фосфатидилинозит; Р8 - фосфатидилсерин; 80 - стерил-гликозид. (В) Состав нейтральных липидов очищенных ВЧ вируса гриппа. Липиды, содержащиеся в пробе, эквивалентной 20 мкг белка, экстрагировали из ВЧ, как описано, отделяли ВЭ-ТСХ и сравнивали по профилю миграции с ситостерином. (С) Иммунологический анализ протонного насоса АТФазы (РМА) маркера плазматической мембраны в очищенных ВЧ и высокоочищенных ПМ из листьев табака (РМЬ) и клеток табака ВУ2 (РМВУ2)- на каждую дорожку наносили 18 мкг белка.
- 8 018206
На фиг. 28 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 774 - последовательность нуклеототидов вируса А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) (8ЕО ΙΌ N0: 36). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на З'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 29 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 775 - последовательность нуклеотидов вируса А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1) (8Е0 ΙΌ N0: 37). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на З'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 30 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 776 - последовательность нуклеотидов вируса А/Брисбен 10/2007 (Η1Ν1) (8Е0 ΙΌ N0: 38). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 31 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 777 - последовательность нуклеотидов вируса А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2) (8Е0 ΙΌ N0: 39). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 32 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 778 - последовательность нуклеотидов вируса В/Малайзия/2506/2004 (8Е0 ΙΌ N0: 40). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 33 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 779 - последовательность нуклеотидов вируса В/Флорида/4/2006 (8Е0 ΙΌ N0: 41). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 34 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 780 - последовательность нуклеотидов вируса А/Сингапур/1/57 (№N2) (8Е0 ΙΌ N0: 42). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 35 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 781 - последовательность нуклеотидов вируса А/Аньхой/1/2005 (Η5Μ) (8Е0 ΙΌ N0: 43). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 36 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 782 - последовательность нуклеотидов вируса А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Μ) (8Е0 ΙΌ N0: 44). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 37 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 783 - последовательность нуклеотидов вируса А/дикие утки/Гонконг/\У312/97 (Η6Μ) (8Е0 ΙΌ N0: 45). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 38 показана последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 784 - последовательность нуклеотидов вируса А/лошади/Прага/56 (№N7) (8Е0 ΙΌ N0: 46). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8ас1 на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 39 после последовательность от сайта ЭгаШ до 8ас1 клона 785 - последовательность нуклеотидов вируса А/Гонконг/1073/99 (Η9№) (8Е0 ΙΌ N0: 47). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная с сайта рестрикции ЭгаШ на 5'-конце и стоп кодоном и сайтом 8аО на 3'-конце. Сайты рестрикции подчеркнуты; кодон АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
На фиг. 40А показана аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 48) полипептида, транслированная с клона 774 (А/Брисбен/59/2007 (Η1№)). Открытая рамка считывания клона 774 начинается с
- 9 018206 кодона АТС, показанного на фиг. 28. На фиг. 40В приведена аминокислотная последовательность (8ЕО ГО N0: 49) полипептида, транслированная с клона 775 (А/Соломоновы Острова 3/2006 (НШ1)). Открытая рамка считывания клона 775 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 29.
На фиг. 41А показана аминокислотная последовательность (8ЕО ГО N0: 50) полипептида, транслированная с клона 776 (А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2)). Открытая рамка считывания клона 776 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 30. На фиг. 41В приведена аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 51) полипептида, транслированная с клона 777 (А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2)). Открытая рамка считывания клона 777 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 31.
На фиг. 42А показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 52) полипептида, транслированная с клона 778 (В/Малайзия/2506/2004). Открытая рамка считывания клона 778 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 32. На фиг. 42В приведена аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 53) полипептида, транслированная с клона 779 (В/Флорида/4/2006). Открытая рамка считывания клона 779 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 33.
На фиг. 43 А показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 54) полипептида, транслированная с клона 780 (А/Сингапур/1/57 (Н2№)). Открытая рамка считывания клона 780 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 34. На фиг. 43В приведена аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 55) полипептида, транслированная с клона 781 (А/Аньхой/1/2005 (Н5№)). Открытая рамка считывания клона 781 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 35.
На фиг. 44А показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 56) полипептида, транслированная с клона 782 (А/Вьетнам/1194/2004 (Н5№)). Открытая рамка считывания клона 782 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 36. На фиг. 44В приведена аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 57) полипептида, транслированная с клона 783 (А/дикие утки/Гонконг/\У312/97 (Н6№)). Открытая рамка считывания клона 783 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 37.
На фиг. 45А показана аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 58) полипептида, транслированная с клона 784 (А/лошади/Прага/56 (Н7Ю)). Открытая рамка считывания клона 784 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 38. На фиг. 45В приведена аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 59) полипептида, транслированная с клона 785 (А/Гонконг/1073/99 (Н9№)). Открытая рамка считывания клона 785 начинается с кодона АТС, показанного на фиг. 39.
На фиг. 46 показан иммунологический анализ (вестерн-блот) элюированных фракций ВЧ, полученных в растении, после эксклюзионной хроматографии. Показаны подтипы гемагглютинина Н1, Н2, Н5, Н6 и Н9. Гемагглютинин обнаруживается во фракциях 7-14, соответствующих элюированию ВЧ.
На фиг. 47 показаны результаты иммуноблот-анализа экспрессии ряда гемагглютининов Н1 из ежегодного эпидемического штамма. На дорожки 1 и 2 наносили соответственно 10 и 20 мкг белковых экстрактов.
На фиг. 48 показаны результаты иммуноблот-анализа экспрессии ряда гемагглютининов Н5 из потенциально пандемических штаммов. На дорожки 1 и 2 наносили соответственно 10 и 20 мкг белковых экстрактов.
На фиг. 49 показаны результаты иммуноблот-анализа Н5 из А/Индонезия/5/2005 в экстрактах белков из листьев Меойапа 1аЬаеит. агроинфильтрованных АСЫ/660. Проводили инфильтрацию двух растений, на дорожки 1 и 2 наносили соответственно 10 и 20 мкг растворимых белков из каждого растения.
На фиг. 50 представлен перекрестный ответ ίη νίίτο сывороточных антител. Титры ингибирования гемагглютинации (Н1) в сыворотке крови хорька через 14 суток (А) после первой иммунизации и (В) после повторной иммунизации ВЧ Н5 вируса гриппа, полученных в растении. Гуморальный иммунный ответ НА! измеряли с помощью перечисленных ниже инактивированных цельных вирусов Н5Ю: А/индейки/Турция/1/05, А/Вьетнам/1194/04, А/Аньхой/5/05 и гомологичного штамма А/Индонезия/5/05. Приведены СГТ (1од2) обратных величин конечного титра для пяти хорьков на группу. Диагональные полосы: А/Индонезия/6/06 (клада 2.1.3); клетки - А/индейки/Турция/1/05 (клада 2.2); белые колонки А/Вьетнам/1194/04 (клада 5 1); черные колонки - А/Аньхой/5/05. Указаны респондеры. Черточки показывают среднее отклонение.
На фиг. 51 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н5 из А/Индонезия/5/2005 (конструкция # 660), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 52 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н1 из А/Новая Каледония/20/1999 (конструкция # 540), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 53 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н1 из А/Брисбен/59/2007 (конструкция #774), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 54 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА,
- 10 018206 содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н1 из А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1) (конструкция #775), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 55 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н2 из А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2) (конструкция # 780), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 56 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н5 из А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) (конструкция # 781), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 57 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н5 из А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) (конструкция # 782), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 58 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н6 из А/дикие утки/Гонконг/^312/97 (Η6Ν1) (конструкция # 783), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 59 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н9 из А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) (конструкция # 785), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 60 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н3 из А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 61 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н3 из А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 62 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для Н7 из А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7), а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 63 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для ГА из В/Малайзия/2506/2004, а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 64 показана последовательность нуклеиновой кислоты для экспрессирующей кассеты ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютинин-кодирующую последовательность для ГА из В/Флорида/4/2006, а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
На фиг. 65 показана консенсусная аминокислотная последовательность (8ЕО ГО ΝΟ: 74) для ГА штаммов А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) (который кодируется 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 33), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) (НЕС) ГО ΝΟ: 48), А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1) (НЕС) ГО ΝΟ: 49) и 8ЕС ГО ΝΟ: 9. Х1 (положение 3) - А или V; Х2 (положение 52) - Ό или Ν; Х3 (положение 90) - К или К; Х4 (положение 99) - К или Т; Х5 (положение 111) - Υ или Н; Х6 (положение 145) - V или Т; Х7 (положение 154) - Е или К; Х8 (положение 161) - К или К; Х9 (положение 181) - V или А; Х10 (положение 203) - Ό или Ν; ΧΙ1 (положение 205) - К или К; Х12 (положение 210) - Т или К; Х13 (положение 225) - К или К; Х14 (положение 268) - или К; Х15 (положение 283) - Т или Ν; Х16 (положение 290) - Е или К; Х17 (положение 432) - I или Ь; Х18 (положение 489) - Ν или Ό.
На фиг. 66 показана аминокислотная последовательность Η1 штамма Новая Каледония (ААР34324.1), который кодируется 8ЕО ГО ΝΟ: 33.
На фиг. 67 показана аминокислотная последовательность Η1 штамма Пуэрто-Рико (ΝΕ_0409878.1). который кодируется 8ЕО ГО ΝΟ: 35
Подробное описание изобретения
Изобретение относится к получению вирусоподобных частиц. Более конкретно, настоящее изобретение направлено на получение вирусоподобных частиц, представляющих собой антигены вируса гриппа.
Приведенное описание относится к предпочтительному осуществлению.
Согласно настоящему изобретению предлагается нуклеиновая кислота, включающая последова
- 11 018206 тельность нуклеотидов, кодирующую антиген оболочечного вируса, например гемагглютинин вируса гриппа (ГА), оперативно связанная с регуляторным участком, который активен в растении.
Далее, в настоящем изобретении предлагается способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа. Метод включает введение в растение или его часть нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, оперативно связанной с регуляторным участком, который активен в растении, и инкубирование растения или части растения в условиях, позволяющих экспрессию нуклеиновой кислоты, что приводит к получению ВЧ.
ВЧ можно получать из вируса гриппа, но ВЧ можно получать также из других вирусов, происходящих из плазматической мембраны, в том числе (без ограничения) вирусы кори, Эбола, Марбург и ВИЧ.
Изобретение включает ВЧ всех типов вирусов гриппа, которые способны инфицировать человека, в том числе (без ограничения) очень распространенный тип А (Η1Ν1) (например, А/Новая Каледония/20/ 99 (Η1Ν1)), А/Индонезия/5/05 (Η5Ν1) (8ЕЦ ΙΌ N0: 60) и менее распространенный тип В (например, 8ЕЦ ΙΌ N0:26, На фиг. 100) и С (8ЕЦ ΙΌ N0:27, На фиг. 10Р), а также ГА, полученные из других подтипов вируса гриппа. Настоящее изобретение включает также ВЧ других подтипов вируса гриппа, например, А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1; 8ЕО ГО N0:48), А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1; 8ЕО ГО N0:49), А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2; 8ЕО ГО N0:54), А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1; 8ЕО ГО N0:55), А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1; 8ЕС) ГО N0:56), А/дикие утки/Гонконг/№312/97 (Η6Ν1; 8ЕО ГО N0:57), А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2; 8ЕС) ГО N0:59), А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2; 8ЕО ГО N0:50), А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2; 8ЕО ГО N0:51), А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7; 8ЕО ГО N0:58), В/Малайзия/2506/2004 (8ЕО ГО N0:52) или В/Флорида/4/2006 (8ЕО 20 ΙΌ N0:53).
Настоящее изобретение также относится к вирусам гриппа, инфицирующим других млекопитающих или животных-хозяев, например человека, приматов, лошадей, свиней, птиц, водоплавающих птиц, мигрирующих птиц, перепелок, уток, гусей, домашних птиц, кур, верблюдов, псовых, собак, кошачьих, кошек, тигров, леопардов, циветт, норок, каменных куниц, хорьков, комнатных животных, домашний скот, мышей, крыс, тюленей, китов и так далее.
Примерами (без ограничения) других антигенов, которые могут быть экспрессированы в вирусах из плазматической мембраны являются капсидный белок ВИЧ - р24; др120, др41 - оболочечные белки, структурные белки УР30 и ΥΡ35; Ср/8СР (гликозилированный интегральный белок мембраны) филовирусов, например вирусов Эбола или Марбург, либо белок Н, а также белок Р парамиксовирусов, например вируса кори.
Настоящее изобретение включает также (без ограничения) ВЧ вируса гриппа, формирующие липидную оболочку из плазматической мембраны клетки, в которой происходит экспрессия белков ВЧ. Например, если экспрессия ВЧ происходит в системе на основе растения, то ВЧ получают липидную оболочку из плазматической мембраны клетки.
В общем случае термин липид относится к растворимым в жирах (липофильным) природным молекулам. Термин используется также более конкретно по отношению к жирным кислотам и их производным (в том числе три-, ди- и моноглицеридам и фосфолипидам), а также другим жирорастворимым стеринсодержащим метаболитам или к стеринам. Фосфолипиды являются основным компонентом всех биологических мембран, наряду с гликолипидами, стеринами и белками. К фосфолипидам относятся фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин и аналогичные. Примерами стеринов являются зоостерины (например, холестерин) и фитостерины. Более 200 фитостеринов были идентифицированы в различных видах растений, наиболее распространенными из них являются кампестерин, стигмастерин, эргостерин, брассикастерин, дельта-7-стигмастерин, дельта-7-авенастерин, даукостерин, ситостерин, 24-метилхолестерин, холестерин или бета-ситостерин. Специалисту в данной области ясно, что липидный состав плазматической мембраны клетки может изменяться в зависимости от культуры, условий выращивания клеток или организма, из которого клетку получают.
Клеточные мембраны обычно содержат липидные бислои и белки, выполняющие различные функции. Определенные липиды могут быть локализованы в липидном бислое, образуя так называемый липидный рафт. Не желая ограничиваться конкретной теорией, можно полагать, что липидный рафт играет значительную роль в эндо- и экзоцитоце, входе и выходе вирусов и других возбудителей инфекции, межклеточной трансдукции сигналов, взаимодействии с другими структурными компонентами клетки или организма, такими как внутриклеточные и внеклеточные матрицы.
В отношении вируса гриппа термин гемагглютинин или ГА в данном документе означает гликопротеид, расположенный на наружной стороне вирусной частицы гриппа. ГА - гомотримерный гликопротеид мембранного типа Ι, как правило включающий сигнальный пептид, домен ГА1, а также домен ГА2, содержащий участок трансмембранного якоря на С-конце и малый цитоплазматический хвост (на фиг. 1В). Нуклеотидные последовательности, кодирующие ГА, хорошо известны и доступны, см., например, базу данных ВюИеГепсе РиЬйс Иеа1111 (вирус гриппа; см. иКЬ: ЬюйеаИйЬаке.отд) или Национальный центр информации по биотехнологии (см. ИКТ: псЬЕп1т.п1й.доу), оба источника включены в данный документ посредством ссылки.
Термин гомотример или гомотримерный относится к олигомеру, образованному тремя молекулами белка ГА. Если не ограничиваться конкретной теорией, белок ГА образуется при синтезе в виде
- 12 018206 мономерного предшественника (ГАО) молекулярной массой около 75 кДа, который организуется на поверхности в вытянутый тримерный белок. Перед тримеризаций белок-предшественник расщепляется по консервативному участку активации (называемому также слитым пептидом) на две полипептидные цепи, ГА1 и ГА2 (включающие трансмембранный участок), связанные дисульфидным мостиком. Сегмент ГА1 может состоять из 328 аминокислот, а ГА2 - из 221 аминокислоты. Несмотря на то что указанное расщепление может быть важно для инфективности вируса, оно может не иметь существенного значения для тримеризаций белка. Внедрение ГА в мембрану эндоплазматической сети (ЭПС) клетки-хозяина, расщепление сигнального пептида и гликозилирование белка - котрансляционные процессы. Для правильного рефолдинга ГА требуется гликозилирование белка и образование шести внутрицепных дисульфидных связей. Тример ГА образуется в цис- и транс-Гольджи комплексе, при этом трансмембранный домен участвует в процессе тримеризации. Кристаллические структуры обработанных бромелайном белков ГА, в которых отсутствует трансмембранный домен - высококонсервативны среди штаммов вируса гриппа. Было также установлено, что в процессе инфицирования в ГА происходит 20 основных конформационных изменений, для чего требуется расщепление предшественника - ГА0 на две полипептидных цепи ГА1 и ГА2. Белок ГА может быть процессирован (т.е., содержать домены ГА1 и ГА2), либо непроцессирован (т.е., содержать домен ГА0).
Настоящее изобретение относится к применению белка ГА, включающего трансмембранный домен и домены ГА1 и ГА2. Например, белок ГА может быть ГА0, либо процессированным ГА, состоящим из ГА1 и ГА2. Белок ГА может быть использован для получения или образования ВЧ с помощью системы экспрессии на основе растения или клетки растения.
ГА в соответствии с настоящим изобретением может быть получен из любого подтипа. Например, ГА может относиться к подтипам Н1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 или Н16. Рекомбинантные ГА в соответствии с настоящим изобретением могут содержать также аминокислотную последовательность, основанную на последовательности любого гемагглютинина, известного в данной области, см., например, базу данных ВюБеГепсе РиЫ1е НеаНй (вирус гриппа; см. ИКБ: ЬюйеаИЪЬаке.огд) или Национальный центр информации по биотехнологии (см. ИКБ: псЫ.п1ш.п1й.доу). Далее ГА может быть основан на последовательности гемагглютинина, выделенного из одного или нескольких появившихся или вновь идентифицированных вирусов гриппа.
К настоящему изобретению также относятся ВЧ, включающие ГА, полученные из одного или более одного подтипа вируса гриппа. Например, ВЧ могут содержать один или более одного ГА подтипа Н1 (который кодируется БЕО ГО N0:28), Н2 (который кодируется БЕО ГО N0: 12), Н3 (который кодируется БЕО ГО N0: 13), Н4 (который кодируется БЕО ГО 10 N0: 14), Н5 (который кодируется БЕО ГО N0: 15), Н6 (который кодируется БЕО ГО N0: 16), Н7 (который кодируется БЕО ГО N0: 11), Н8 (который кодируется БЕО ГО N0: 17), Н9 (который кодируется БЕО ГО N0: 18), Н10 (который кодируется БЕО ГО N0: 19), Н11 (который кодируется БЕО ГО N0:20), Н12 (который кодируется БЕО ГО N0:21), Н13 (который кодируется БЕО ГО N0:27), Н14 (который кодируется БЕО ГО N0:23), Н15 (который кодируется БЕО ГО N0:24), Н16 (который кодируется БЕО ГО 15 N0:25), либо их сочетание. Один или более одного ГА из одного или более одного подтипа вируса гриппа может образоваться при коэкспрессии в клетке растения или насекомого, в результате чего синтез одного или более одного ГА приводит к образованию ВЧ, содержащих комбинацию ГА, полученных из одного или более одного подтипа вируса гриппа. Выбор указанной комбинации ГА может определяться предполагаемым применением вакцины, приготовленной из ВЧ. Например, вакцина, предназначенная для вакцинации птиц может содержать любую комбинацию подтипов ГА, а ВЧ для вакцинации человека могут содержать один или более одного из подтипов Н1, Н2, Н3, Н5, Н7, Н9, Н10, N1, N2, N3 и N7. В зависимости от назначения вакцины могут быть приготовлены и другие комбинации подтипов ГА.
Таким образом, настоящее изобретение относится к ВЧ, содержащим один или более одного подтипа ГА.
Согласно настоящему изобретению предлагаются также нуклеиновые кислоты, кодирующие гемагглютинины, образующие ВЧ при экспрессии в растениях.
Белки ГА вируса гриппа имеют как общие характеристики, так и различия по молекулярной массе, изоэлектрической точке, составу гликанов и т.п. Различия в физико-химических свойствах гемагглютининов позволяют различить ГА, полученные при экспрессии в клетках растений, насекомых или дрожжей, что особенно полезно при коэкспрессии более чем одного ГА в одной системе. Примеры таких физико-химических свойств приведены в табл. 1.
- 13 018206
Таблица 1. Физико-химические свойства гемагглютининов вируса гриппа
Клон № Тип Штаммы гриппа АА Гликаны ГАО Молекулярная масса (кДа) ГА2 Изоэлектрическая
ГАО ГА1 ГА2 ГАО ГА1 ГА2 ГАО 1 ГА1 ГА1 I ГА2 ГАО точка ГА1 ГА2
774 Н1 А/Брисбен/59/2007 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6,4 7,5 5,3
775 Н1 А/Соломоновы Острова/3/2006 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6,1 6,7 5,3
776 НЗ А/Брисбен/10/2007 550 329 221 12 11 1 62 80 37 54 25 27 8,5 9,6 5,2
777 НЗ А/Висконсин/67/2005 550 329 221 11 10 1 62 79 37 52 25 27 8,8 9,6 5,3
778 в В/Малайзия/2506/2004 570 347 223 12 8 4 62 80 38 50 24 30 8,0 9,7 4,5
779 в В/Флорида/4/2006 569 346 223 10 7 3 62 77 38 48 24 29 8,0 9,7 4,5
780 Н2 А/Сингапур/1/57 547 325 222 6 4 2 62 71 36 42 25 28 6,0 7,5 4,9
781 Н5 А/Аньхой/1/2005 551 329 222 7 5 2 62 73 37 45 25 28 6,2 8,9 4,7
782 Н5 А/Вьетнам/1194/2004 552 330 222 7 5 2 63 74 38 45 25 28 6,4 9,1 4,8
783 Н6 А/дикие утки/ГонконгАУЗ 12/97 550 328 222 8 5 3 62 75 37 45 25 30 5,7 5,9 5,6
784 Н7 А/лошади/Прага/56 552 331 221 6 4 2 62 71 37 43 25 28 8,9 9,7 4,9
785 Н9 А/Гонконг/1073/99 542 320 199 9 7 2 61 75 36 46 23 26 8,4 9,5 5,3
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидной последовательности 8Ε^ ГО N0:28; 8Ε^ ГО N0:3; 8Ε^ ГО N0: 11, кодирующей ГА из соответственно Н1, Н5 или Н7, нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях в 8Ε^ ГО N0:28; 8Ε^ ГО N0:3; 8Ε^ ГО N0:11 или нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях в комплемент 8Ε^ ГО N0:28; 8Ε^ ГО N0:3; 8Ε^ ГО N0:1, причем нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинин, который при экспрессии образует ВЧ, и указанные ВЧ индуцируют образование антител при введении в организм объекта. Например, экспрессия нуклеотидной последовательности в клетке растения приводит к образованию ВЧ, а ВЧ позволяет получать антитела, способные связывать ГА, включая зрелые ГА, ГА0, ГА1 или ГА2 одного или более типов или подтипов вируса гриппа. При введении в организм объекта ВЧ индуцирует иммунный ответ.
Гибридизация в жестких условиях известна в данной отрасли (см., например, Сиггеп! Рго1осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, Аи§иЬе1 с соавт., ед§. 1995 и приложения; МашаГО с соавт., в Мо1еси1аг С1ошп§ (А ЕаЬогаФгу Мапиа1), Со1д 8рпп§ НагЬог ЕаЬогаФгу, 1982; 8атЬгоок апд Кц§8е11, в Мо1еси1аг С1опт§: А ЕаЬогаФгу Мапиа1, третье изд., 2001; каждый из указанных источников включен в данный документ посредством ссылки). Примером таких жестких условий гибридизации является например: гибридизация в течение около 16-20 ч в буфере 4 х 88С при 65°С с последующей промывкой в 0.1 х 88С при 65°С в течение часа, либо две промывки в 0.1 х 88С при 65°С каждая в течение 20 или 30 мин. Другим примером жестких условий гибридизации может служить выдержка до следующего дня (16-20 ч) в 50%-ном формамиде, 4 х 88С при 42°С с последующей промывкой в 0.1 х 88С при 65°С в течение 1 ч либо две промывки в 0.1 х 88С при 65°С каждая в течение 20 или 30 мин, либо до следующего дня (16-20 ч), либо гибридизация в водном фосфатном буфере Черча (7% ДДС №; буфер 0.5М №Р04 рН 7.2; 10 мМ ЭДТА) при 65°С, две промывки либо при 50°С в 0.1 х 88С, 0.1% ДДС № по 20 или 30 мин либо две промывки при 65°С в 2 х 88С, 0.1% ДДС № по 20 или 30 мин.
Помимо этого согласно настоящему изобретению предлагаются последовательности нуклеотидов, имеющие около 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%) или любой промежуточный процент идентичности или сходства данной последовательности, с последовательностью нуклеотидов, кодирующей ГА из Н1 (8Ε^ ГО N0:28), Н5 (8Ε^ ГО N0:3) или Н7 (8Ε^ ГО N0: 11), где последовательность нуклеотидов кодирует белок гемагглютинин, который при экспрессии образует ВЧ, и указанные ВЧ индуцируют образование антитела. Например, при экспрессии последовательности нуклеотидов в клетке растения образуется ВЧ, а ВЧ можно использовать для образования антитела, способного связывать ГА, включая зрелые ГА, ГА0, ГА1 или ГА2. При введении в организм объекта ВЧ индуцирует иммунный ответ.
Аналогично, настоящее изобретение относится к ГА, ассоциированным с подтипами Н1 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:28), Н2 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 12), Н3 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 13), Н4 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 14), Н5 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 15), Н6 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 16), Н7 (который кодируется 8Ε^ 10 ГО N0: 11), Н8 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:17), Н9 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 18), Н10 (который кодируется 8Ε^ ГО N0: 19), Н11 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:20), Н12 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:21), Н13 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:27), Н14 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:23), Н15 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:24), Н16 (который кодируется 8Ε^ ГО N0:25); см. фиг. 10А - 10Р) и к последовательностям нуклеотидов, имеющим от прибл. 70 до 100% или любой промежуточный процент, 80 - 100% или любой промежуточный процент, 90-100% или любой промежуточный процент либо 95-100% или любой промежуточный процент идентичности последовательности с Н1 (8Ε^ ГО N0:28), Н2 (8Ε^ ГО N0: 12), Н3 (8Ε^ ГО N0: 13), Н4 (8Ε^ ГО N0: 14), Н5 (8Ε^ ГО N0: 15), Н6 (8Ε^ ГО N0: 16), Н7 (8Ε^ ГО N0: 11), Н8 (8Ε^ ГО N0: 17), Н9 (8Ε^ ГО N0: 18), Н10 (8Ε^ ГО N0: 19), Н11 (8Ε^ ГО N0:20), Н12 (8Ε^ ГО N0:21), Н13 (8Ε^ ГО N0:27), Н14 (8Ε^ ГО N0:23), Н15 (8Ε^ ГО N0:24), Н16 (8Ε^ ГО N0:25), последовательность нуклеотидов кодирует гемагглютинин, который при экспрессии образует ВЧ, и указанные ВЧ индуцируют образование антитела. Например, при экспрессии последовательности нуклеотидов в клетке растения обра
- 14 018206 зуются ВЧ, а ВЧ позволяет получать антитела, способные связывать ГА, включая зрелые ГА, ГА0, ГА1 или ГА2. При введении в организм объекта ВЧ индуцирует иммунный ответ.
Иммунный ответ обычно относится к реакции адаптивной иммунной системы. Адаптивная иммунная система как правило предполагает гуморальный ответ и клеточный иммунный ответ. Гуморальный ответ - часть иммунитета, опосредованная секретированными антителами, образованными в клетках линии В-лимфоцитов (В клетки). Секретированные антитела связываются с антигенами на поверхности инвазивных микробов (вирусов или бактерий), что является сигналом к их уничтожению. Термин гуморальный иммунитет, как правило, относится к продукции антител и процессам, которые его сопровождают, а также эффекторной функции антител, в том числе активации Тй2-клеток и продукции цитокинов, образованию Т-лимфоцитов, влиянию опсонинов на фагоцитоз, удаление патогенных микроорганизмов и прочее. Термины модулировать и модулирование и аналогичные относятся к повышению или понижению конкретного ответа или параметра, по данным любого из нескольких испытаний, известных и применяемых в общем случае, некоторые из которых описаны в данном документе.
Клеточный иммунный ответ - это иммунный ответ, в котором не участвуют антитела, но участвует активация макрофагов, природных клеток-киллеров (ΝΚ), антиген-специфические цитотоксичные Тлимфоциты и выделение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточный иммунитет обычно относится к активации некоторых Тй-клеток, Тс-клеток и Т-клеточному ответу. Клеточный иммунитет особенно важен при вирусной инфекции.
Например, индукцию антиген-специфических СЭЗ-положительных Т-лимфоцитов можно измерить методом ЕЬ18РОТ; стимуляцию СП4-положительных Т-лимфоцитов можно определить измерением пролиферации. Количественное определение титров антител к вирусу гриппа осуществляют методом твердофазного ИФА; изотипы антиген-специфических или перекрестно-отвечающих антител можно определить также с помощью антител к изотипам (например, анти-1дС, 1дА, 1дЕ или 1дМ). Способы и методики указанных количественных испытаний хорошо известны в данной отрасли.
Определение ингибирования гемагглютинации (Η1 или ΗΑΙ) может также служить для демонстрации эффективности антител, образование которых индуцировано вакциной, либо вакцина может ингибировать агглютинацию красных кровяных клеток (эритроцитов) рекомбинантными ГА. Титры антител, ингибирующих гемагглютинацию, в образцах сыворотки могут быть оценены микротитрованием ΗΑΙ (Аутагб с соавт. 1973). При этом могут быть использованы эритроциты любого вида животных: лошадь, индейка, курица и т.д. Такой метод анализа дает косвенную информацию тримеризации ГА на поверхности ВЧ, подтверждая правильную презентирование сайтов антигенов на ГА.
Титры перекрестного ответа ΗΑΙ могут служить также для демонстрации эффекта иммунного ответа на другие штаммы вирусов, родственных подтипу вакцины. Например, сыворотку, полученную от объекта, вакцинированного композицией вакцины на основе первого штамма (например, ВЧ штамма А/Индонезия 5/05), можно использовать в анализе ΗΑΙ со вторым штаммом цельного вируса или вирусных частиц (например, А/Вьетнам/1194/2004), и определения титра ΗΑΙ.
Также возможно определение наличия или уровня цитокинов. Например, ответ Т-клеток-хелперов (Т111/Т112) характеризуется путем определения ΙΕΝ-γ- и ΙΕ-4-секретирующих клеток методом твердофазного ИФА (например, ΒΌ ΟρΐΕΙΑ производства Вюкаепсек). Культивируют мононуклеары периферической крови (МПК) или спленоциты объекта, после чего супернатант можно анализировать. Количественное определение Т-лимфоцитов проводят также методом флуоресцентной сортировки активированных клеток (ΕΑС8) с помощью маркер-специфических флуоресцентных меток и методов, известных в отрасли.
Для оценки иммунного ответа также проводят анализ методом микронейтрализации, см. например, методы Во\\'е с соавт., 1973. Титры нейтрализации вирусов могут быть получены несколькими способами, в том числе: 1) подсчет бляшек лизиса (анализ бляшкообразования) после фиксации/окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым; 2) наблюдение лизиса клеток в культуре через микроскоп; 3) твердофазный ИФА и спектрофотометрическое определение нуклеокапсидного белка вируса (корреляция с вирусным инфицированием клеток-хозяев).
Идентичность или сходство последовательностей определяют с помощью программы сравнения последовательностей нуклеотидов, например, программы, поставляемой в пакете ΌΝΑ8Ι8 [например, без ограничения, на основе следующих параметров: 6ΑΡ репайу (коррекция пропуска) 5, #о£ 1ор б1адопа1к 5 (число совпадающих к-плетов), Пхеб ΟΑΡ репа11у (фиксированная коррекция пропуска) 10, к-1ир1е 2 (размер идентичного участка), Поайпд дар (плавающий пропуск) 10 и \утбо\у κί/е (длина сегмента) 5]. Другие методы выравнивания последовательностей для сопоставления хорошо известны в отрасли, например алгоритмы 8ιηί11ι & \Уа1егшап (1981, Α6υ. Αρρ1. Ма1й. 2:482), №еб1етап & ХУипксй (1. Мо1. Вю1. 48:443, 1970), Реагкоп & Ыртап (1988, 25 Ргос. Αсаб. 8ск США 85:2444), а также программная реализация указанных алгоритмов (например, ΟΑΓ, ВЕ8ТЕТТ, ΕΑί^Α и ΒΕΑδ^, либо выравнивание вручную и визуальный осмотр.
Термин домен гемагглютинина относится к пептиду, содержащему либо домен ГА0, либо домены ГА1 и ГА2. Домен гемагглютинина не включает сигнальный пептид, трансмембранный домен и цитоплазматический хвост, присутствующие в природном белке.
- 15 018206
Термины вирусоподобная частица и вирусоподобные частицы (ВЧ) относятся к самоорганизующимся структурам, содержащим структурные белки, таким как белок Г А вируса гриппа. Обычно ВЧ морфологически и антигенно сходны с вирионами, образующимися при инфекции, но не несут генетической информации, достаточной для репликации и поэтому неинфекционны. В некоторых примерах ВЧ могут содержать один вид белка, либо белки более чем одного вида. Если ВЧ содержит более одного вида белка, то белок может соответствовать тому же виду вируса, но может быть и белком из другого вида, рода, подсемейства или семейства вирусов (в соответствии с обозначением в номенклатуре международного комитета по таксономии вирусов). В других примерах один или более одного из видов белка, содержащихся в ВЧ, может быть модифицирован по отношению к природной последовательности. Получение ВЧ осуществляют в пригодных клетках-хозяевах, в том числе клетках растений и насекомых. После экстракции из клетки-хозяина, ВЧ могут быть выделены и очищены в соответствующих условиях и получены в неизменном виде.
ВЧ, полученные из белков вирусов гриппа в соответствии с настоящим изобретением, не содержат белок М1. Известно, что белок М1 связывается с РНК (АУакеНек! апб Вго^п1ее, 1989), которая присутствует в качестве примеси при получении ВЧ. Присутствие РНК нежелательно для сертифицирования продукта ВЧ органами государственного регулирования, поэтому препарат ВЧ, не содержащий РНК, имеет преимущество.
ВЧ согласно настоящему изобретению получают в клетках-хозяевах, которые характеризуются неспособностью к сиалилированию белков, т.е., не содержат сиалидазу, например, это клетки растений, клетки насекомых, грибы и другие организмы, в том числе губки, кишечнополостные, кольчатые черви, членистоногие, моллюски, нематоды, трохельминты, плоские черви, щетинкочелюстные, щупальцевые, хламидии, спирохеты, грамположительные бактерии, цианобактерии, архебактерии, в соответствии с определениями на сайте д1уео£огиш (см., например, ИКЕ: §1усо£огиш.дг.1р/8С1епсе/^огб/еуо1и11оп/Е8Л03Е.Ыш1). ВЧ, полученные как описано в данном документе, обычно не содержат нейраминидазу (НА). Тем не менее возможна коэкспрессия НА вместе с ГА, если требуются ВЧ, содержащие ГА и НА.
ВЧ, полученные в растении в соответствии с некоторыми вариантами изобретения, могут сочетаться с липидами растительного происхождения. ВЧ может содержать пептид ГА0, ГА1 или ГА2. Липиды растительного происхождения могут присутствовать в форме липидного бислоя и могут дополнительно содержать оболочку, окружающую ВЧ. Липиды растительного происхождения могут содержать компоненты плазматической мембраны растения, в котором были получены ВЧ, в том числе (без ограничения) фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), гликосфинголипиды, фитостерины или их комбинации. Липид растительного происхождения может также быть назван растительным липидом. Примеры фитостеринов известны в данной отрасли, к ним относятся, например, стигмастерин, ситостерин, 24метилхолестерин и холестерин - см., например, Мопдгапб с соавт., 2004.
Строение и размер ВЧ можно определить, например, методами анализа гемагглютинации, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии.
Для проведения эксклюзионной хроматографии, суммарный растворимый белок экстрагируют из ткани растения путем гомогенизации (Ро1у1гоп) образца растительного материала, измельченного в замороженном виде, в экстракционном буфере, и нерастворимый остаток удаляют центрифугированием. Хорошие результаты могут быть получены и при осаждении ПЭГ. Проводят количественное определение растворимого белка и экстракт пропускают через колонку с 8ерйаегу1™. Стандартом для градуировки служит декстран голубой 2000. Фракции, полученные после хроматографии, можно анализировать методом иммуноблоттинга для определения белкового состава фракции.
Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что способность ГА связываться с эритроцитами различных животных регулируется сродством ГА к сиаловым кислотам α2,3 или α2,3 и присутствием указанных сиаловых кислот на поверхности эритроцитов. ГА лошадей и птиц из вирусов гриппа агглютинируют эритроциты нескольких видов, к которым относятся индейки, куры, утки, морские свинки, человек, овцы, лошади и коровы; при этом ГА человека способны связываться с эритроцитами индейки, курицы, утки, морской свинки, человека и овцы (см. также Ио Т. с соавт., 1997, У1го1оду, том 227, стр. 493-499; и Мебепоз К. с соавт., 2001, У1го1оду, том 289 стр.74-85). Примеры ответа на ГА различных штаммов гриппа приведены в табл. 2А и 2В.
Таблица 2А. Виды эритроцитов, с которыми связываются Г А некоторых сезонных штаммов гриппа
Сезонный Штамм № происхождение лошади индейки
Н1 А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) 774 человек + ++
А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1) 775 человек + ++
НЗ А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2) 776 человек + ++
А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2) 777 человек + ++
В В/Малайзия/2506/2004 778 человек + ++
В/Флорида/4/2006 779 человек + ++
- 16 018206
Таблица 2В. Виды эритроцитов, с которыми связываются ГА некоторых пандемических штаммов гриппа
Пандемия Штамм № происхождение лошади индейки
Н2 А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2) 780 человек + ++
Н5 А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) 781 чел.-птицы ++ +
А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) 782 чел.-птицы ++ +
Н6 А/дикие утки/Гонконг/^З 12/97 (Η6Ν1) 783 птицы ++ +
Н7 А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7) 784 лошади ++ ++
Н9 А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) 785 человек ++ +
В данном документе белок означает цепь аминокислот, связанных пептидной связью, которая может складываться с формированием вторичной, третичной или четвертичной структуры с соответствующей морфологией. Альтернативно, в аналогичном контексте могут использоваться термины полипептид, пептид или пептидный фрагмент.
Фрагмент или часть белка, слитый белок или полипептид означает пептид или полипептид, содержащий часть аминокислотного состава определенного белка или полипептида при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, фрагмент может содержать область антигена, область, обусловливающую реакцию на стресс, или область, включающую функциональный домен белка или полипептида. Фрагмент может также содержать область или домен, общий для белков определенного семейства, либо фрагмент может содержать аминокислотную последовательность, достаточную для специфичной идентификации полноразмерного белка, из которого он произошел.
Например, фрагмент или часть может включать от около 60 до около 100% полноразмерного белка, либо любое промежуточное количество, при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, от примерно 60 до примерно 100%, от примерно 70 до примерно 100%, от примерно 80 до примерно 100%, от примерно 90 до примерно 100%, от примерно 95 до примерно 100% длины полноразмерного белка либо любое промежуточное количество. В качестве альтернативы, фрагмент или часть может содержать от примерно 150 до примерно 500 аминокислот или любое промежуточное количество, в зависимости от ГА и при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, фрагмент может иметь от 150 до примерно 500 аминокислот или любое промежуточное количество, от примерно 200 до примерно 500 аминокислот, или любое промежуточное количество, от примерно 250 до примерно 500 аминокислот, или любое промежуточное количество, от примерно 300 до примерно 500 или любое промежуточное количество, от примерно 350 до примерно 500 аминокислот или любое промежуточное количество, от примерно 400 до примерно 500 или любое промежуточное количество, от примерно 450 до примерно 500 или любое промежуточное количество, в зависимости от ГА и при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии. Например, около 5, 10, 20, 30, 40 или 50 аминокислот или любое промежуточное количество может быть удалено с С-конца, Ν-конца или как с Ν-, так и с С-конца белка ГА при условии, что фрагмент может образовать ВЧ при экспрессии.
Нумерация аминокислот в любой данной последовательности осуществляется относительно конкретной последовательности, тем не менее, специалист может без труда определить равноценность отдельной аминокислоты в последовательности на основе структуры и/или последовательности. Например, если при конструировании клона для кристаллографии удалено 6 Ν-терминальных аминокислот, то при этом изменится нумерация конкретных аминокислот в цепи (напр., относительно полноразмерного белка), но не изменится их относительное расположение в структуре.
Сопоставление последовательности или последовательностей может осуществляться с помощью алгоритма ВЬА8Т (А11зсйи1 с соавт., 1990. I. Мо1 Βίοί 215:403-410). Поиск ВЬА8Т позволяет сопоставить изучаемую последовательность с заданной последовательностью или группой последовательностей или с большой библиотекой или базой данных (например, ОеиВаик или ОеиРер!) и идентифицировать не только последовательности, имеющие 100%) идентичность, но также и имеющие меньшую степень идентичности. Последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот можно сопоставлять с помощью алгоритма ВЬА8Т. Далее, идентичность двух или более последовательностей можно определить, выравнивая последовательности и рассчитывая процент их идентичности. Выравнивание можно осуществить с помощью алгоритма ВЬА8Т (например, в базе данных ОеиВаик; иКЬ: исЫ.и1т.и1й.доу/сд1-Ыи/ВРА8Т/ с параметрами по умолчанию: Ргодгат: Ыаз1и; Па1аЬазе: иг; Ехрес! 10; Т111ег: беТаи1!; Айдитеи!: раплмзе; Онегу деиейс Собез: 81аибагб(1)), или алгоритма ВЙА8Т2 в базе ЕМВЬ иКЬ: етЫ-йе1бе1йегд.бе/8егу1се8/ 1ийех.й1т1 с параметрами по умолчанию: Майгх 5 ВЬО8иМ62; Рй1ег: беТаиЙ, есйоййег: ои, Ехрес!: 10, си!оТТ: беТаиЙ; 81гаиб: йо!й; Оезспрйоиз: 50, Айдитеи1з: 50; или алгоритм РА8ТА с параметрами по умолчанию) либо сопоставляя последовательности вручную и рассчитывая процент идентичности.
Настоящее изобретение описывает, не ограничиваясь этим, клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА, в экспрессирующий вектор растения и получение из растения ВЧ вируса гриппа, при
- 17 018206 годных для производства вакцины. Примерами таких нуклеиновых кислот являются (без ограничения) грипп А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) ГА вируса (напр., 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 61), ГА из подтипа А/Индонезия/5/05 (Η5Ν1) (напр., 8Ер ΙΌ ΝΟ: 60), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 36, 48,62), А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1) (напр., 8ЕР15 ГО ΝΟ: 37, 49, 63), А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 42, 54, 64), А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 43, 55, 65), А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 44, 56, 66), А/дикие утки/Гонконг/А312/97 (Η6Ν1) ((напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 45, 57, 67), А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 47, 59, 68), А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 38, 50, 69), 20 А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 39, 51, 70), А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7) (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 46, 58, 71), В/Малайзия/2506/2004 (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 40, 52, 72), В/Флорида/4/2006 (напр., 8ЕО ГО ΝΟ: 41, 53, 73). Соответствующие номера клонов или конструкций для этих штаммов приведены в табл. 1. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие 8ЕО ГО ΝΟ: 36-47, содержат пластоцианин, оперативно связанный с кодирующей последовательностью ГА для каждого из типов или подтипов, как показано на фиг. 28-39. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие 8ЕО ГО ΝΟ: 60-73 представляют собой кассету, экспрессирующую ГА, содержащую промотор пластоцианина люцерны и 5'-НТО, гемагглютининкодирующую последовательность для ГА, а также последовательности 3' НТО и терминатора пластоцианина люцерны, как показано на фиг. 51-64.
ВЧ позволяют получать реагенты, состоящие из рекомбинантных структурных белков вируса гриппа, самоорганизующихся в функциональные и иммуногенные гомотипные макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы вируса гриппа и ВЧ вируса гриппа, в трансформированных клетках-хозяевах, например клетках растений или клетках насекомых.
Таким образом, согласно изобретению, предлагаются ВЧ и способ получения вирусных ВЧ в растительной системе экспрессии при экспрессии отдельного оболочечного белка. Указанные ВЧ могут представлять собой ВЧ вируса гриппа или ВЧ, полученные из других вирусов плазматической мембраны, в том числе (без ограничения) вирусы кори, Эбола, Марбург и ВИЧ.
Также можно использовать белки из других оболочечных вирусов, например (без ограничения) филовирусов (напр., вирус Эбола, вирус Марбург и т.п.), парамиксовирусов (напр., вирус кори, вирус паротита, респираторно-синцитиальный вирус, пневмовирусы и т.п.), ретровирусов (напр., вирус иммунодефицита человека-1, вирус иммунодефицита человека-2, вирус Т-клеточной лейкемии человека-1, и т.п.), флавивирусов (напр., вирус лихорадки Западного Нила, вирус тропической лихорадки, вирус гепатита С, вирус жёлтой лихорадки и т.п.), буньявирусов (напр., хантавирус и т.п.), коронавирусов (напр., коронавирус, вирус атипичной пневмонии и т.п.), как это известно специалистам. Неограничивающими примерами антигенов, которые могут экспрессироваться в вирусах из плазматической мембраны являются капсидный белок ВИЧ - р24; гликопротеиды др120 и др41, белки филовирусов, в том числе ΥΡ30 или УР35 вируса Эбола, Ор/8ОР вируса Марбург, Н белок или Е белок парамиксовируса кори. Например, Р24 ВИЧ (напр., см. ОепВапк, геГегепсе βί: 19172948) - белок, получаемый трансляцией и расщеплением последовательности дад генома вируса ВИЧ (напр., ОепВапк геГегепсе д1:9629357); др 120 и др41 ВИЧ - гликопротеиды, полученные трансляцией и расщеплением белка др160 (напр., ОепВапк геГегепсе д1:9629363), который кодируется епу генома вируса ВИЧ. УР30 вирус Эбола (ОепРерг геГегепсе дт 55770813) - белок, получаемый трансляцией последовательности ур30 генома вируса Эбола (напр., ОепВапк геГегепсе д1:55770807); УР35 вируса Эбола (ОепРерг ВеГегепсе д1:55770809) - белок, получаемый трансляцией последовательности ур35 генома вируса Эбола. Ор/8ОР вируса Марбург (ОеиРер! геГегепсе дт 296965) белок, полученный трансляцией (последовательности) генома вируса Марбург (ОеиВаηк геГегепсе дт 158539108). Белок Н (ОепРер! ВеГегепсе дт 9626951) - белок Н последовательности генома вируса кори (ОепВапк ВеГегепсе дк 9626945); Е белок (СепРер! геГегепсе дт 9626950) - белок Е последовательности генома вируса кори.
Однако способы настоящего изобретения предполагают применение и других белков оболочки, что известно специалисту.
Таким образом, согласно изобретению, предлагается молекула нуклеиновой кислоты, последовательность которой кодирует ВИЧ-р24, ВИЧ-др120, ВИЧ-др41, вирус Эбола-УР30, вирус Эбола-УР35, вирус Марбург Ор/8ОР, Η белок или Е белок вируса кори. Молекула нуклеиновой кислоты может быть оперативно связана с регуляторным участком, активным в клетке насекомого, дрожжей или растения, либо в определенной ткани растения.
Далее, в настоящем изобретении предлагается клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА, например, но без ограничения, ГА вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (Η5Ν1), в вектор экспрессии насекомого (например, вектор экспрессии бакуловируса) и получение вакцин-кандидатов от гриппа либо реагентов, состоящих из рекомбинантньгх структурных белков вируса гриппа, которые в результате самосборки превращаются в функциональные и иммуногенные гомотопные макромолекулярные белковые структуры, в том числе субвирусные частицы гриппа и ВЧ вируса гриппа в трансформированных клетках растений или в трансформированных клетках насекомых.
Экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА подтипов вируса гриппа, например, но без ограничения, подтипа А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1), А/Индонезия/5/05 (Η5Ν1), А/Брисбен/59/2007
- 18 018206 (НШ1), А/Соломоновы Острова/3/2006 (НШ1), А/Сингапур/1/57 (№N2), А/Аньхой/1/2005 (Н5Ю). А/Вьетнам/1194/2004 (Н5М), А/дикие утки/Гонконг/№312/97 (Н6М), А/Гонконг/1073/99 (Н9№), А/Брисбен/10/2007 (№N2), А/Висконсин/67/2005 (№N2), А/лошади/Прага/56 (№N7), В/Малайзия/2506/ 2004, В/Флорида/4/2006, может осуществляться, например, с помощью системы экспрессии бакуловируса в подходящей линии клеток, например, в клетках δροάορΙοΓαΓΓίιφροΓάα (например, линия клеток δΓ-9; АТСС РТА-4047). Можно использовать и другие клеточные линии насекомых.
В качестве альтернативы, экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей ГА, может осуществляться в клетке растения или в растении. Нуклеиновую кислоту, кодирующую ГА, можно синтезировать обратной транскрипцией и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с помощью РНК ГА. Например, РНК может быть выделена из вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (НШ1), или вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (Н5Ю), или из другого вируса гриппа, например А/Брисбен/59/2007 (НШ1), А/Соломоновы острова/3/2006 (НШ1), А/Сингапур/1/57 (№N2), А/Аньхой/1/2005 (Н5Ю), А/Вьетнам/ 1194/2004 (Н5М), А/дикие утки/Гонконг/^312/97 (Н6М), А/Гонконг/1073/99 (Н9№), А/Брисбен/ 10/2007 (№N2), А/Висконсин/67/2005 (№N2), А/лошади/Прага/56 (НЖ7), В/Малайзия/2506/2004, В/ Флорида/4/2006, либо из клеток, инфицированных вирусом гриппа. Для обратной транскрипции и ПЦР пригодны олигонуклеотидные праймеры, специфичные для РНК ГА, например, но без ограничения, последовательности ГА вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (НШ1), последовательности ГА0 вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (Н5Ю) или последовательности ГА подтипов А/Брисбен/59/2007 (НШ1), А/Соломоновы Острова/3/2006 (НШ1), А/Сингапур/1/57 (№N2), А/Аньхой/ 1/2005 (Н5М), А/Вьетнам/1194/2004 (Н5М), А/дикие утки/Гонконг/№312/97 (Н6М), А/Гонконг/1073/99 (Н9№), А/Брисбен/10/2007 (№N2), А/Висконсин/67/2005 (№N2), А/лошади/Прага/56 (Н7Ю), В/ Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006. Помимо этого, нуклеиновая кислота, кодирующая ГА, может быть химически синтезирована способами, известными специалистам в данной области.
Полученные копии ДНК указанных генов могут быть клонированы в подходящем векторе экспрессии, как требуется для системы экспрессии хозяина. Примеры соответствующих векторов экспрессии для растений приведены ниже, помимо этого, возможно применение вектора экспрессии бакуловируса, например, рРак®ас1 (ΙηνίΙΐΌβοη), приводящее к плазмидам на основе рРайВас1, с помощью известных методов и информации, приведенной в инструкции производителя.
Настоящее изобретение далее относится к генетической конструкции, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую ГА, как описано выше, оперативно связанную с регуляторным элементом, который активен в растении. Примерами регуляторных элементов, активных в клетке растения и пригодных для использования в соответствии с настоящим изобретением, являются, без ограничения, регуляторный участок пластоцианина (υδ 307125978; включен в данный документ посредством ссылки), регуляторный участок рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы/оксигеназы (К.иВЦС0; υδ 4962028; включен в данный документ посредством ссылки), хлорофилл а/Ь-связывающий белок (САВ; Ьеи1М1ег с соавт.; 1986; включен в данный документ посредством ссылки), δ^Γ-δ! (связанный с выделяющим кислород комплексом фотосистемы ΙΙ и описанный δ^ΚΙιηιΐδ с соавт. 1987, 1989; включено в данный документ посредством ссылки). Пример регуляторного участка пластоцианина - последовательность, содержащая нуклеотиды 10-85 δΕΟ ΙΌ N0: 36 или аналогичный участок любой из δΕΟ ΙΌ N0δ: 37-47.
Если конструкция экспрессируется в клетке насекомого, примерами регуляторных элементов, оперирующих в клетке насекомого являются, без ограничения промотор полиэдрина (Роккее аиб Нотагй 1987. №.1с1ею Λαάκ Векеагск 15:10233-10248), промотор др64 (Кодап с соавт., 1995. 1 νίΓθ1θβν 69:14521461) и т.п.
Соответственно, согласно варианту изобретения предлагается нуклеиновая кислота, содержащая регуляторный участок и последовательность, кодирующую ГА вируса гриппа. Регуляторный участок может быть регуляторным элементом пластоцианина, а ГА вируса гриппа может быть выбран из группы штаммов или подтипов гриппа, в том числе А/Новая Каледония/20/99 (НШ1), А/Индонезия/5/05 (Н5Ю), А/Брисбен/59/2007 (Н1М), А/Соломоновы острова/3/2006 (НШ1), А/Сингапур/1/57 (№N2),
А/Аньхой/1/2005 (Н5М), А/Вьетнам/1194/2004 (Н5М), А/дикие утки/Гонконг/Ж312/97 (Н6М), А/Гонконг/1073/99 (Н9№), А/Брисбен/10/2007 (№N2), А/Висконсин/67/2005 (№N2), А/лошади/Прага/56 (№N7), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006. В данном документе примером последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторный элемент пластоцианина и ГА вируса гриппа являются δΕΟ ΙΌ N0: 36-47.
Известно, что в аминокислотной последовательности гемагглютинина вируса гриппа или кодирующих его нуклеиновых кислот возможны различия при получении вируса гриппа культивированием в яйцах или в клетках млекопитающих (например, в клетках ΜΌΟΚ) или выделением из зараженного организма. Неограничивающие примеры таких различий проиллюстрированы в данном документе, в том числе в примере 18. Далее, специалисту в данной области понятно, что в случае гемагглютининов, полученных из новых штаммов, могут наблюдаться дополнительные вариации, так как мутации продолжают происходить. Вследствие известной вариативности последовательностей в различных гемагглютининах вируса гриппа, настоящее изобретение относится к ВЧ, которые могут быть получены на основе любого гемагглютинина вируса гриппа при условии, что при экспрессии в клетке-хозяине, как описано в на
- 19 018206 стоящем документе, гемагглютинин вируса гриппа образует ВЧ.
Выравнивание последовательностей и консенсусные последовательности могут быть определены с помощью нескольких пакетов программного обеспечения, известных в данной области, например ΜϋΣΤΑΉΙΝ (Г. ΟΟΕΡΕΤ, 1988, Кие1. Άεΐάδ Ке§., 16 (22), 10881-10890), либо последовательности могут выравниваться вручную с определением сходства и различий между последовательностями.
Строение гемагглютининов хорошо изучено, а также известно, что оно является консервативным. При наложении гемагглютининовых структур наблюдается высокая степень консервативности (среднекв. отклонение < 2 А). Консервативность структуры сохраняется, несмотря на то, что аминокислотная последовательность в некоторых положениях может различаться (см., например, 8кеЬе1 апд АИеу, 2000 Апп Кеу ВюсЬет 69:531-69; 10 Уассаго с соавт. 2005). Участки гемагглютининов также высоко консервативны, например, структурные домены: полипротеин ГА0 расщепляется с образованием зрелого ГА. ГА - гомотример, где каждый мономер включает рецептор-связывающий домен (ГА1) и заякоренный в мембране домен (ГА2), которые связаны одинарной дисульфидной связью; 20 Ν-терминальных остатков субъединицы ГА2 также являются связывающим доменом или связывающей последовательностью ГА. Также имеется участок хвоста (внутренний по отношению к мембранной оболочке). Такие участки или домены присутствуют в каждом гемагглютинине. Отдельные участки или домены обычно консервативны по длине;
все гемагглютинины содержат одинаковое число внутри- и межмолекулярных дисульфидных мостиков в тех же положениях. Количество цистеинов, участвующих в сети дисульфидных связей, и их положение в аминокислотной последовательности остается постоянным для всех ГА. Примеры структур, иллюстрирующие характерные внутри- и межмолекулярные дисульфидные мостики и другие консервативные аминокислоты, а также их относительные положения приведены например, в работе ОатЫт с соавт. 2004 (8с1епсе 303:1838-1842). Примеры структур и последовательностей включают 11КУ/, 1КУХ, 1КУГ, 1КУ0, 1КЦУ, 1КИ7, которые можно найти в базе данных структур белков (ЦКЬ: \а\у\у.гсЧтогц); цитоплазматический хвост - большая часть гемагглютининов содержит 3 цистеина в постоянном положении. При посттрансляционной модификации один и более из данных цистеинов может быть пальмитоилирован.
Для гемагглютининов вируса гриппа возможно варьирование аминокислот. Указанное варьирование приводит к появлению новых штаммов, которые постоянно идентифицируют. Инфекционные свойства новых штаммов могут различаться. Однако образование тримеров гемагглютинина, которые затем образуют ВЧ, сохраняется. В настоящем изобретении, таким образом, предложена аминокислотная последовательность гемагглютинин либо нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность гемагглютинина, образующая ВЧ в растении, при этом оно включает как известные последовательности, так и альтернативные последовательности, которые могут возникнуть.
На фиг. 65 приведен пример такой известной вариации. На фиг. изображает консенсусную последовательность аминокислот (8ЕР ΙΌ ΝΟ: 74) для ГА следующих штаммов Η1Ν1: А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) (который кодируется 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 33), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) (8Ер ΙΌ ΝΟ: 48), А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1) (8Ер ΙΌ ΝΟ: 49) и ЕЕО ΙΌ ΝΟ: 9. XI (положение 3) - А или V; Х2 (положение 52) - Ό или Ν; Х3 (положение 90) - К или К; Х4 (положение 99) - К или Т; Х5 (положение 111) - Υ или Н; Х6 (положение 145) - V или Т; Х7 (положение 154) - Е или К; Х8 (положение 161) - К или К; Х9 (положение 181) - V или А; Х10 (положение 203) - Ό или Ν; Х11 (положение 205) - К или К; Х12 (положение 210) - Т или К; Х13 (положение 225) - К или К; Х14 (положение 268) - или К; Х15 (положение 283) - Т или Ν; Х16 (положение 290) - Е или К; Х17 (положение 432) - Ι или Ь; ХЕ8 (положение 489) - Ν или Ό.
В качестве другого примера вариации ниже в табл. 3 приведено выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА штаммов А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) (который кодируется ЕЕО ΙΌ ΝΟ: 33), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) (8Ер ΙΌ ΝΟ: 48), А/Соломоновы острова/3/2006 (Η1Ν1) (8Ер ΙΌ ΝΟ: 49), А/ Пуэрто-Рико /8/34 (Η1Ν1) и ЕЕО ΙΌ ΝΟ: 9.
Таблица 3. Выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА некоторых штаммов Η1Ν1
8Εζ) Ιϋ ΝΟ. Последовательность
75 1 МКАКЬЕУЕЕС ΤΡΤΑΤΥΑϋΤΙ ΟΙΟΥΗΑΝΝ8Τ ϋΤνϋΤνίΈΚΝ 50 ντνΤΗδνΝΙΧ
9 МКАКЬЬУЪЬС ΤΡΤΑΤΥΑϋΤΙ ϋΙΟΥΗΑΝΝδΤ ϋΤνϋΤνΕΕΚΝ УТУТНЗУИЬЕ
48 МКУКЬЬУЬЬС ΤΡΤΑΤΥΑϋΤΙ ΟΙΟΥΗΑΝΝδΤ ϋΤνϋΤνΕΕΚΝ УТУТНЗУИЬЕ
49 76 Консенсусная МКУКЬЕУЬЬС ΤΡΤΑΤΥΑϋΤΙ ΟΙΟΥΗΑΝΝδΤ ϋΤνϋΤνΕΕΚΝ УТУТН8УИЕЬ
ткхкПуПс 1йа1уа±1 с12уйапп8( <11уас11у1екп νΐνίΡδνηΙΙ
последовательность 51 100
75 ΕϋδΗΝΟΚΙΧΧ ЬКО1АРЬеЬО ΝΟδΥΑΟν/ΙΕΟ ИРЕСЕЬЫЗК ΕδΨδΥΙΥΕΤΡ
- 20 018206
9 ЕОЗНЫОКЬСЬ ΕΚΟΙΑΡΙφΕΟ ΝΟδνΑΟν/ΙΕΟ ΝΡΕΟΕΕυδΚ ΕδΨδΥϊνΕΤΡ
48 ΕΝδΗΝΟΚΕΟί ЕКСИАРЬрЬС ΝΟδνΑΟΨΙΕΟ ΝΡΕΟΕΕΠδΚ ΕδΨδΥϊνΕΚΡ
49 76 ΕΏδΗΝΟΚΙΧΕ υΚΟΙΑΡΕφίΟ ΝΟδνΑΟΧνίΤΟ ΝΡΕΟΕΙΧΙδΚ ΕδλνδΥϊνΕΚΡ
Консенсусная ех5Нп§к1с! 1к§1ар1я1е ηρεεεΙΙίδ. е5Ц8у1Уе.р
последовательность
101 150
75 ΝΡΕΝΟΊΌΥΡΟ ΥΓΑΟΥΕΕίΚΕ φΕδδνδδΕΕΚ ΓΕΙΡΡΚΕδδΑ ΡΝΗΤνΤΟνδΑ
9 ΝΡΕΝΟΤΟΥΡΟ ΥΕΑΟΥΕΕίΚΕ φίδδνδδΓΕΚ ΓΕΙΡΡΚΕδδΑ ΡΝΗΤνΤΟνδΑ
48 ΝΡΕΝΟΤΟΥΡΟ ΗΓΑϋΥΕΕΕΚΕ φΕδδνδδΓΕΚ ΕΕΙΓΡΚΕδδΑ ΡΝΗΤνΤΟνδΑ
49 76 ΝΡΕΝΟΤΟΥΡΟ ΗΡΑϋΥΕΕίΚΕ φΕδδνδδΓΕΚ ΕΕΙΡΡΚΕδδΑ ΡΝΗΤΤΤΟνδΑ
Консенсусная ηρεηβίεγρβ хГадуее1ге ςίδδνχδίετ Гейркеи'ж рпЬ1х1§У8а
последовательность
151 200
75 δΟδΗΝΟΚδδΡ ΥΚΝΕίΧνΕΤΟΚ ΝΟίΥΡΝΕδΚδ ΥνΝΝΚΕΚΕνΕ νρχνονΗΗΡΡΝ
9 δΟδΗΝΟΚδδΡ ΥΕΝΙ±\νΕΤΟΚ ΝΟΙΤΥΡΝΕδΚδ ΥνΝΝΚΕΚΕΎΕ νίΑΥΟνΗΗΡΡΝ
48 δεδΗΝΟΕδδΡ ΥΗΝΕίΧνΕΤΟΚ ΝΟΕΥΡΝίδΚδ ΥΑΝΝΚΕΚΕΎΕ νΕ\νθνΗΗΡΡΝ
49 76 δΟδΗΝΟΕδδΡ ΥΚΝΙΧΎΕΤΟΚ ΝΟΕΥΡΝΕδΚδ ΥΑΝΝΚΕΚΕνΈ νρν/ανΗΗΡΡΝ
Консенсусная δεδΙίηβΧδδΓ ухп11тлИ1§к п§1урп1зк8 ухппкекеу! ν1\ν§ν!ιΗρρη
последовательность
201 250
75 ΙΟΝΟΚΑΕΥΗΤ ΕΝΑΥνδννδδ ΗΥδΚΚΡΤΡΕΙ ΑΚΚΡΚνΚϋφΕ ΟΚΙΝΥΥΨΤΕί
9 ΙΟΝΟΚΑίΥΗΤ ΕΝΑΥνδννδδ ΗΥδΚΚΡΤΡΕΙ ΑΚΕΡΚνΚϋφΕ ΟΚΙΝΥΥΎΤίΕ
48 ΙΟϋφΚΑΕΥΗΤ ΕΝΑΥνδννδδ ΗΥδΚΚΡΤΡΕΙ ΑΚΚΡΚνΚΒφΕ ΟΚΙΝΥΥΎΤΕί
49 ΙΟΟΟΚΑίΥΗΚ ΕΝΑΥνδννδδ ΗΥδΚΚΡΤΡΕΙ ΑΚΚΡΚνΚϋφΕ ΟΡΓΝΥΥν/ТЕЬ
76 .....М8ЬЬТ ΕνΕΤΥνίδΙΙ ΡδΟΡίΚΑΕΙΑ ΟΚΙ,ΕΟνΡΑΟΚ
Консенсусная 1£хцха1уЬх епауузуузз ΗγβίΓχήρεΙ акгРкугйде §Κί#γγ\νΐ11
последовательность
251 300
75 ΕΡΟϋΤΙΙΓΕΆ ΝΟΝυΑΡΧΥΥΑ ΕΑίδΡΟΡΟδΟ ΙΙΤδΝΑΡΜϋΕ СОАКСфТРфС
9 ΕΡΟϋΤΙΙΡΕΑ ΝΟΝΜΑΡίνΥΑ ΕΑΙΑΚΟΡΟδΟ ΙΙΤδΝΑΡΜϋΕ СОАКСфТРфб
48 ΕΡΟϋΤΠΡΕΑ ΝΟΝΙΛΑΡΚΥΑ ΡΑΕδΚΟΡΟδΟ ΙΙΝδΝΑΡΜϋΚ СОАКСфТРОС
49 ΕΡΟϋΤΙΙΓΕΑ ΝΟΝΜΑΡΚΥΑ ΕΑΕδΚΟΡΟδΟ ΙΙΝδΝΑΡΜϋΕ СОАКСфТРфб
76 ΝΤϋΕΕνΕΜΕΑ ... ЬКТКР1Ь 8РЬТКО1ЬСР νΡΊΈΤνΡδΕΚ ΟΕφΚΚΚΡνφΝ
Консенсусная #р§скН(Еа п^пЫархуа ГаЬзгСГ^б !йзпаРт#х сдаксц1рОе
последовательность
301 350
75 ΑΙΝδδίΡΡφΝ νΗΡντιαΕερ ΚΥνΚδΑΚΕΚΜ ντ. ΟΕΚΝΙΡδ ϊΟδκουροΑΐ
9 ΑΙΝδδΕΡΡφΝ νΗΡνΤΙΟΕΟΡ ΚΥνΚδΑΚΣΚΜ ντ. ΟΕΚΝΙΡδ ΙΟδΚΟΕΡΟΑΙ
48 ΑΙΝδδΕΡΡφΝ νΗΡντιοΕΟΡ ΚΥνΚδΑΚΕΚΜ ντ. ΟΕΚΝΙΡδ ΙφδΚΟΕΡΟΑΙ
49 ΑΙΝδδίΡΡφΝ νΗΡνΤΙΟΕΰΡ ΚΥνΚδΑΚΕΚΜ ντ. ΟΕΚΝΙΡδ ΙΟδΚΟΕΡΟΑΙ
76 ΑίΝΟ.....Ν ΟϋΡΝΝΜϋΚΑν ΚΕΥΚΚΕΚΚΕΙ ΤΡΗΟΑΚΕΙδί δΥδΑΟΑΕΑδΟ
Консенсусная ΑίΝδδΙρίςΝ νΗΡνΙίβεερ КууК.8аК1гт νΐχΟ1Γ#Ιρδ ίςδιΟΙί^ί
последовательность 351 400
75 ΑΟΡΙΕΟΟΎΤΟ ΜνϋΟΨΥΟΥΗΗ φΝΕφΟδΟΥΑΑ ΟΟΚδΤφΝΑΙΝ ΟΙΤΝΚνΝδνΐ
9 ΑΟΡΙΕΟΟΨΤΟ ΜνϋΟΨΥΟΥΗΗ φΝΕΟΟδΟΥΑΑ ϋρΚδΤΟΝΑΙΝ ΟΙΤΝΚνΝδνΐ
48 ΑΟΡΙΕΟΟ\νΤΟ ΜνϋΟν/ΥΟΥΗΗ φΝΕφΟδΟΥΑΑ ϋφΚδΤΟΝΑΙΝ ΟΙΤΝΚΥΝδνΐ
49 76 ΑΟΡΙΕΟΟΨΤΟ МСЫУИЯМ.С ΜνϋΟΨΥΟΥΗΗ АУТТЕУАРОБ φΝΕφΟδΟΥΑΑ νΟΑΤΟΕφΙΑϋ ϋφΚδΤφΝΑΙΝ δφΗΚδΗΚφΜν ΟΙΤΝΚνΝδνΐ ΤΤΤΝΡΕΙΚΗΕ
Консенсусная последовательность 401 гпУ<1£\¥у§%ЬЬ Япец£5£уАа <1()к81цпат §ίΤΝ1<νη5νί 450
75 ΕΚΜΝΤφΡΤΑν ΟΚΕΡΝΚΕΕΡΚ ΜΕΝΕΝΚΚνϋΟ ΟΡΕϋΙΨΤΥΝΑ ΕΕΕνΕΕΕΝΕΚ
9 ΕΚΜΝΤφΡΤΑν ΟΚΕΡΝΚΕΕΚΚ ΜΕΝΕΝΚΚνϋΟ ΟΡΕϋΙλνΤΥΝΑ ЕЕЕУЕБЕНЕЯ
48 ΕΚΜΝΤφΡΤΑν ОКЕРИКБЕКК ΜΕΝΕΝΚΚνϋϋ ΟΡΕϋΙΨΤΥΝΑ ΕΙ,ΕνΡΕΕΝΕΚ
49 ΕΚΜΝΤφΡΤΑν 6ΚΕΡΝΚΕΕΚΚ ΜΕΝΕΝΚΚνϋϋ ΟΡΕϋΙ\νΤΥΝΑ ЕЕБУББЕМЕК
76 ΝΚΜνΕΑδΤΤΑ ,ΚΑΜΕφΜΑΟδ δΕφΑΑΕΑΜΕν Α..........8 фАЯрМУфАМК
Консенсусная йкМпЦГТау §КеЖ$егг тЕ#1пкку#6 §1хсР\¥1упа #11ν$1#ηεΚ
последовательность
451 500
75 ΤΕϋΡΗϋδΝνΚ ΝΕΥΕΚνΚδφΕ ΚΝΝΑΚΕΙΟΝΟ ΟΡΕΡΥΗΚΟΝΝ ΕΟΜΕδνΚΝΟΤ
9 ΤΕΟΡΗϋδΝνΚ ΝΕΥΕΚνΚδφΕ ΚΝΝΑΚΕΙΟΝΟ ΟΡΕΡΥΗΚΟΝΝ ΕΟΜΕδνΚΝΟΤ
48 ΤΕϋΡΗϋδΝνκ ΝΕΥΕΚνΚδφΕ ΚΝΝΑΚΕΙΟΝΟ ΟΡΕΡΥΗΚΟΝϋ ΕΟΜΕδνΚΝΟΤ
49 ΤΕϋΡΗϋδΝνΚ ΝΕΥΕΚνΚδφΕ ΚΝΝΑΚΕΙΟΝΟ ΟΡΕΡΥΗΚΟΝϋ ΕΟΜΕδνΚΝΟΤ
76 ΤΙΟΤΗΡδδδΑ ΟΕΚΝϋΕΕΕΝΕ φΑΥφΚΚΜΟνφ МЦКРК.....
Консенсусная ΤΙάίΗάδηνΚ пЕу#кук5#Ь кппаКе|'Оп§ сГеРуЬкспх есте5Укп§1
последовательность
501 550
75 ΥϋΥΡΚΥδΕΕδ ΚΕΝΚΕΚΙϋΟν ΚΕΕδΜΟνΥφΙ ϋΑΙΥδΤνΑδδ БУБЕУвБОА!
9 ΥϋΥΡΚΥδΕΕδ ΚΕΝΚΕΚΙϋΟν ΚΕΕδΜΟνΥφΙ ΕΑΙΥδΤνΑδδ ΕνΕΕνδίΟΑΙ
48 ΥϋΥΡΚΥδΕΕδ ΚΕΝΚΕΚΙϋΟν ΚΕΕδΜΟνΥφΙ ΕΑΙΥ8ΤνΑ88 ΕνΕΕνδΕΟΑΙ
49 76 ΥϋΥΡΚΥδΕΕδ ΚΕΝΚΕΚΙϋΟν ΚΕΕδΜΟνΥφΙ ΕΑΙΥδΤνΑδδ ЕУЕЕУ8БОА1
Консенсусная удуркузеез ИпгекИ^у к1е5т§ууц| 1а1у51уа58 Ινίΐνεί^ί
последовательность
551
75 δΡΨΜΟδΝΟδΕ ФСК1С1
9 δΡΧΥΜΟδΝΟδΕ ФСК1С1
48 δΡΧνΜΟδΝΟδϋ ФСК.1С1
49 δΡΨΜΟδΝΟδϋ ФСЯ1С1
76
Консенсусная δίΧντηοδηβδΙ ςαποί
последовательность
В консенсусную последовательность входят аминокислоты, общие для всех последовательностей в обозначенных положениях, записанные прописными буквами; строчными буквами записаны аминокислоты, общие как минимум для половины или большей части последовательностей; символ ! означает I или V; символ $ - любое из Ь или М; символ % - любое из Г или Υ; символ # - любое из N Ώ, 0, Е, В или Ζ; а символ . означает отсутствие аминокислоты (например, делению); X в положении 3 - любое из А или V; X в положении 52 - любое из Е или N X в положении 90 - К или К; X в положении 99 - Т или К; X в положении 111 - любое из Υ или Н; X в положении 145 - любое из V или Т; X в положении 157 - К или Е; Х в положении 162 - К или К; X в положении 182 - V или А; X в положении 203 - N или Ώ; X в положении 205 - К или К; X в положении 210 - Т или К; X в положении 225 - К или Υ; X в положении 333 - Н или деления; X в положении 433 - I или Ь; X в положении 490 - N или Ώ.
В качестве еще одного примера вариации, ниже в табл. 4 приведено выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА штаммов А/Аньхой/1/2005 (Н5№) (БЕО Ю N0: 55), А/Вьетнам/1194/2004 (Н5М) и А/Индонезия/5/2006 (Н5Ы1) (БЕО 10 N0: 10).
- 22 018206
Таблица 4. Выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность для ГА некоторых
штаммов НН1
8Е(} ГО N0. Последовательность
10 1 МЕК1УЬЕЕА1 У8ЬУК8О01С ΙΟΥΗΑΝΝ8ΤΕ φνϋΤΙΜΕΚΝν 50 ΤνΤΗΑϋϋΙίΕ
56 МЕЮУЬЬГА! νδΕνΚδϋφΙΟ Ι6ΥΗΑΝΝ8ΤΕ φνϋΤΙΜΕΚΝν ТУТНАООШЕ
55 МЕК1УЕЬЬА1 У8ЬУК8О(ДС ΙΟΥΗΑΝΝ8ΤΕ φνϋΤΙΜΕΚΝν ΤνΐΉΑφϋΙΕΕ
Консенсусная МЕК1УЕЫА1 У8ЬУК80ф1С ΙΟΥΗΑΝΝ8ΤΕ φνϋΤΙΜΕΚΝν ΤνΤΗΑφϋΙΕΕ
последовательность
51 100
10 КТНИОКЬСОЕ ООУКРЫЬКО εδνΑΟν/ΕΕΟΝ ΡΜΰϋΕΓΙΝνΡ ΕΙΥδΥϊνΕΚΑΝ
56 ΚΤΗΝΟΚϋεϋΕ обукрыыиэ εδνΑΟ\νΕΕΟΝ ΡΜϋϋΕΓΓΝνΡ Ε\νδΥΐνΕΚΑΝ
55 ктннокьсоь ОСУКРЫБКО С8УАС\УЫ^ ΡΜΟϋΕΓΙΝνΡ Ε\ν8ΥΐνΕΚΑΝ
Консенсусная ктниокьспь ОбУКРЫЫШ С8УА6\УЬЬОН ΡΜεϋΕΕΙΝνΡ ΕΑΥδΥϊνΕΚΑΝ
последовательность
101 150
10 РПМОЬСУРбЗ ΓΝϋΥΕΕΕΚΗΕ Ε8Κ.ΙΝΗΓΕΚΙ φΙΙΡΚδδίνδϋ НЕА88ОУ88А
56 РУЫОЬСУРСгО ΓΝϋΥΕΕΕΚΗΕ ϋδΚΙΝΗΓΕΚΙ фПРК88\У88 НЕА8ЕОУ88А
55 ΡΑΝϋΕΟΥΡΟΝ ΓΝϋΥΕΕΕΚΗΕ Ε8ΚΓΝΗΓΕΚΙ ςπρκδδχνδϋ НЕА88ОУ88А
Консенсусная ΡχΝϋΕεΥΡΟχ ΓΝϋΥΕΕΕΚΗΕ Ε8ΚΙΝΗΕΕΚΙ ςπρκδδχνδά ΗΕΑδδΟνδδΑ
последовательность
151 200
10 СРУЬбЗРЗРГ ΚΝννίνΕΙΚΚΝ 8ΤΥΡΤΙΚΚ8Υ ΝΝΤΝΟΕϋϋΕν ϋΨΟΙΗΗΡΝϋΑ
56 ΟΡΥφΟΚδδΓΓ ΚΝννχνΠΚΚΝ 8ΤΥΡΤΙΚΚ8Υ ΝΝΤΝφΕϋΕΕν ΕΨΟΙΗΗΡΝϋΑ
55 СРУфОТРЗГГ ΚΝννν/ΕΙΚΚΝ ΝΤΥΡΤΙΚΚ8Υ ΝΝΤΝΟΕϋΕΜ ϋλνΟΙΗΗδΝϋΑ
Консенсусная СРУяОхрЗЕГ ΡΝννΧΥΕΙΚΚΝ δΤΥΡΤΙΚτδΥ ΝΝΤΝΟΕϋϋΕ! ΕΨΟΙΗΗρΝϋΑ
последовательность
201 250
10 ΑΕφΤΚΕΥφΝΡ ΤΤΥΙ8ΙΟΤ8Τ Ь^КЬУРКИ ΤΚδΚνΝΟφδΟ КМЕГГУГПЬК
56 ΑΕφΤΚΕΥφΝΡ ΤΤΥΙδνΟΤδΤ ΕΝφΚΕνΡΚΙΑ ΤΚδΚνΝΟφδΟ КМЕЕГ\УТ1ЬК
55 АЕфТК1У(ЖР ΤΤΥΙδνΟΤδΤ 1ЕЫ(ЖУРК1А ΤΚδΚνΝΟφδΟ ΡΜϋΓΓΧνΤΙΕΚ
Консенсусная АЕфТкЬУСДЧР ΤΤΥΙ816Τ8Τ ΕΝφΚΕνΡΚΙΑ ΤΚδΚνΝΟφδΟ ΡΜ#ΕΕ\νΤΙΕΚ
последовательность
251 300
10 ΡΝϋΑΙΝΓΕδΝ 6ΝΓΙΑΡΕΥΑΥ ΐνΚΚΟϋδΑΙ ΜΚδΕΕΕΥΟΝϋ ЫТКСЦТРМСА
56 ΡΝϋΑΙΝΕΕδΝ 6ΝΓΙΑΡΕΥΑΥ ινκκοϋδτι ΜΚδΕΕΕΥΟΝΰ ΝΤΚΟφΤΡΜΟΑ
55 ΡΝϋΑΓΝΓΕδΝ ΟΝΓΙΑΡΕΥΑΥ ΐνΚΚΟϋδΑΙ νΚδΕΥΕΥΟΝΟ ΝΤΚεφΤΡΙΟΑ
- 23 018206
Консенсусная ΡΝϋΑΙΝΡΕδΝ ΟΝΡΙΑΡΕΥΑΥ ΐνΚΚ6ϋδ3ΐ ιτιΚδΕΙΕΥΟΝε ΝΤΚεφΤΡιτιΟΑ
последовательность 301 350
10 ΙΝ83ΜΡΡΗΝΙ НРЬТЮЕСРК УУКЗЫКЬУЬА ТОЬ№8РфЯЕ ЗКККККОЬРС
56 ΙΝ88ΜΡΡΗΝΙ НРЬТЮЕСРК УУКЗЫКТУЬА ΤΟίΕΝδΡΟΚΕ ККККККСЬРС
55 ΙΝ88ΜΡΡΗΝΙ НРЬТЮЕСРК УУКЗЫКЬУЬА ТСЫШЗРЬКЕ КККК.КОЬЕО
Консенсусная ΙΝ88ΜΡΡΗΝΙ НРЬТЮЕСРК УУКЗИгЬУЬА ΤΟΕΚ.Ν8ΡςΚΕ гКККкКОЬРС
последовательность
351 400
10 А1АСР1ЕССХУ ΦΟΜνυον/γογ ΗΗ8ΝΕφ686Υ ΑΑϋΚΕδΤφΚΑ ΙϋΟνΤΝΚνΝδ
56 ΑΙΑΟΓΙΕΟΟ\ν φΟΜνϋΟΨΥΟΥ ΗΗδΝΕφΟδΟΥ ΑΑΟΚΕδΤφΚΑ ΙϋΟνΤΝΚνΝδ
55 ΑΙΑΟΕΙΕΟΰν φΟΜνϋΟΨΥΟΥ ΗΗδΝΕφΟδΟΥ ΑΑϋΚΕδΤφΚΑ ΙϋΟνΤΝΚνΝδ
Консенсусная ΑΙΑΟΡΙΕΟΟΨ φΟΜΥΩΟν/ΥΟΥ ΗΗδΝΕφΟδΟΥ ΑΑΟΚΕδΤφΚΑ ΙϋΟνΤΝΚνΝδ
последовательность
401 450
10 ΙΙϋΚΜΝΤφΡΕ ΑνΟΚΕΡΝΝΕΕ Κ.Κ.ΙΕΝΕΝΚΚΜ ΕΟΟΡΕϋν\νΤΥ НАЕЬЬУЬМЕИ
56 ΙΙϋΚΜΝΤφΡΕ АУСЖЕРЫЖЕ ΚΚ1ΕΝΕΝΚΚΜ ΕϋΟΡΕϋνΨΤΥ НАЕЬЬУЬМЕИ
55 ΙΙϋΚΜΝΤφΡΕ ΑνΟΚΕΕΝΝίΕ ΚΚΙΕΝΕΝΚΚΜ ЕЭСРЬОУХУТУ НАЕЬЬУЬМЕИ
Консенсусная ΙΙϋΚΜΝΤφΡΕ ΑΥΟΚΕΡΝΝΕΕ ΚΚΙΕΝΕΝΚΚΜ ЕОСРЬОУХУТУ НАЕЬЬУЬМЕИ
последовательность
451 500
10 ΕΚΤΕϋΡΗϋδΝ УКИЬУОКУКЬ фЫНЖАКЕЬС РЮСРЕРУНКС ΩΝΕεΜΕδΙΚΝ
56 ΕΚΤΕϋΡΗϋδΝ УКМЬУОКУЕЬ фЫГПНАКЕЬС ЖСРЕРУНКС ΟΝΕΟΜΕδνΚΝ
55 ΕΚΤΕϋΡΗϋδΝ УКЖУОКУКЬ фЬЯОМАКЕЬО РЮСРЕРУНКС ϋΝΕΟΜΕδνΚΝ
Консенсусная ΕΚΤΕϋΡΗϋδΝ УКЖУОКУКЬ фиНЖАКЕЬб РЮСРЕРУНКС ϋΝΕεΜΕ8!ΚΝ
последовательность
501 550
10 ΟΤΥΝΥΡφΥδΕ ΕΑΚΕΚΚΕΕΙ8 ОУКЬЕЗЮТУ ф1Ь31УЗТУА 88ЬАЬА1ММА
56 ΟΤΥϋΥΡφΥδΕ ΕΑΚΕΚΚΕΕΙ8 СУКЬЕЗЮ1У ф1Ь81У8ТУА 88ЬАЬА1МУА
55 ΟΤΥϋΥΡφΥδΕ ЕАКЬККЕЕ18 I ОУКЬЕЗЮТУ ф1Ь81УЗТУА ЗЗЬАЬА1МУА
Консенсусная ΟΤΥ#ΥΡζ)Υ8Ε ΕΑΚΕΚΚΕΕΙ8 (лУКЬЕЗЮ1У ф1Ь31УЗТУА ЗЗЬАЬА1МуА
последовательность
551
10 СЬЗЬХУМСЗРЮ ЗЬфСК1С1
56 СЬЗЬХУМСЗРЮ 8ЬфСК1С1
55 СЬЗЬХУМСЗРЮ 8ЬфСК1С1
Консенсусная 6ЬЗЬ\УМС8РЮ ЗЬфСЮС!
последовательность
В консенсусную последовательность входят аминокислоты, общие для всех последовательностей в обозначенных положениях, записанные прописными буквами; строчными буквами записаны аминокислоты, общие как минимум для половины или большей части последовательностей; символ ! означает I или V; символ $ - любое из Ь или М; символ % - любое из Г или Υ; символ # - любое из N Ώ, О, Е, В или Ζ; X в положении 102 - любое из Т, V или А; X в положении 110 - любое из 8, Ώ или N X в положении 156 - любое из 8, К или Т.
Приведенные выше вариации выравнивания последовательностей и консенсусные последовательности представляют собой неограничивающие примеры вариантов аминокислотных последовательностей гемагглютинина для применения в различных осуществлениях изобретения для получения ВЧ в растении.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, несложно определить, так как кодоны для каждой аминокислоты известны в данной области. Следовательно, предлагаемая аминокислотная последовательность представляет вырожденную последовательность нуклеиновой кислоты, которая ее кодирует. В настоящем изобретении, таким образом, предлагается последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гемагглютинин штаммов и подтипов гриппа, раскрытых в данном документе (например, А/Новая Каледония/20/99 (НШ1) А/Индонезия/5/2006 (Н5И1), А/куры/НьюЙорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр/677/88 (Н2Ж), А/Техас/32/2003, А/кряквы/Миннесота/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейка/Онтарио/6118/68 (Н8Ш), А/уткишироконоски/Иран/С54/03, А/куры/Германия^/1 949(Н 10Ю), /утки/Англия/56 (Н1Ш6), А/утки/Альберта/60/76 (Н12^), А/чайки/Мэриленд/704/77 (Н'13Ж), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/ 341/83 (Н'15Ж), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99 (Н'16№), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/ПуэртоРико/8/34 (НШ1), А/Брисбен/59/2007 (НШ1), А/Соломоновы острова 3/2006 (НШ1), А/Брисбен 10/2007 (№N2), А/Висконсин/67/2005 (Н3№), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (Н2№), А/Аньхой/1/2005 (Н5М), А/Вьетнам/1194/2004 (Н5М), А/дикие утки/Гонконг/№312/97 (Н6М),
- 24 018206
А/лошади/Прага/56 (Н7Ю), А/Гонконг/1073/99 (Н9№), а также вырожденные последовательности, которые кодируют указанные выше гемагглютинины.
Далее, аминокислотную последовательность, которую кодирует нуклеиновая кислота, можно легко определить, так как кодон или кодоны для каждой аминокислоты известны. Таким образом, предлагаемая нуклеиновая кислота представляет аминокислотную последовательность, которая ею кодируется. В настоящем изобретении, таким образом, предлагаются аминокислотные последовательности гемагглютинина штаммов и подтипов гриппа, раскрытых в данном документе (например, А/Новая Каледония/20/99 (Н1М) А/Индонезия/5/2006 (Н5№), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр /677/88 (№N8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/Миннесота/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейки/Онтарио/6118/68(Н8№), А/утки-широконоски/Иран/С54/03, А/куры/Германия/Ж1949(Н10Ю), А/утки/Англия/56(Н1Ш6), А/утки/Альберта/60/76 (Н12№), А/чайки/Мэриленд/ 704/77(Н13Ж>), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/341/83 (Н15Ж), А/чайки обыкновенные/ Швеция/5/99(Н16Ж), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (НШ1), А/Брисбен/59/2007 (НШ1), А/Соломоновы острова 3/2006 (НШ1), 30 А/Брисбен 10/2007 (№N2), А/Висконсин/67/2005 (№N2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (№N2), А/Аньхой/1/2005 (Н5М), А/Вьетнам/1194/2004 (Н5Ж), А/дикие утки/Гонконге/\У312/97 (Н6Ж), А/лошади/Прага/56 (Н7Ж), А/Гонконг/1073/99 (Н9№)).
В растении ВЧ вируса гриппа отпочковываются из плазматической мембраны (см. пример 5, и на фиг. 19), поэтому липидный состав ВЧ отражает их происхождение. ВЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, включают ГА одного или более чем одного типа или подтипа вируса гриппа в комплексе с липидами растений. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усилить иммунный ответ. Растительные мембраны состоят из липидов, фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), а также содержат гликосфинголипиды, сапонины и фитостерины. Кроме того, в плазматических мембранах растений обнаруживаются липидные рафты - микродомены, обогащенные сфинголипидами и стеринами. В растениях содержатся различные фитостеролы, в том числе стигмастерин, ситостерин, 24-метилхолестерин и холестерин (Мопдгаиб с соавт., 2004).
ФХ и ФЭ, а также гликосфинголипиды могут связываться с молекулами СЭЕ экспрессированными иммунными клетками млекопитающих, таким как антигенпредставляющие клетки (АПК), например, дендритные клетки и макрофаги, а также другие клетки, в том числе В- и Т-лимфоциты в тимусе и печени (Тыщ М., 2006). Молекулы СЭ1 сходны по строению с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса Ι, их роль заключается в представлении антигенов гликолипидов клеткам природных киллеров М<Т. При активации клетки М<Т активируют клетки естественного иммунитета, такие как NΚ-клетки и дендритные клетки, а также активируют адаптивные иммунные клетки, такие как антителопродуцирующие В-клетки и Т-клетки.
В плазматической мембране обнаруживается ряд различных фитостеринов - специфический комплемент может варьировать, в зависимости от вида, условий выращивания, запасов питательных веществ или патогенного состояния, помимо прочих факторов. Как правило, наиболее распространенным фитостерином является бета-ситостерин.
Фитостерины, присутствующие в ВЧ вируса гриппа в комплексе с липидным бислоем, таким как оболочка из плазматической мембраны, могут быть предпочтительны для состава вакцины. Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что полученные в растениях ВЧ в комплексе с липидным бислоем, таким как оболочка из плазматической мембраны, может вызвать более сильную иммунную реакцию по сравнению с ВЧ, полученных в других системах экспрессии, аналогичную иммунной реакции, вызванной живой или ослабленной цельновирионной вакциной.
Таким образом, в некоторых осуществлениях изобретения предложены ВЧ в комплексе с липидным бислоем растительного происхождения. В некоторых осуществлениях липидный бислой растительного происхождения может представлять собой оболочку ВЧ.
ВЧ, полученные в растении, могут индуцировать Г А, содержащий специфические растительные N гликаны. Следовательно, в настоящем изобретении предложены также ВЧ, содержащие ГА со специфическими растительными Жгликанами.
Далее, модификация Жгликана в растениях известна (см., например, и.8. 60/944344; включен в данный документ посредством ссылки), и возможно получение ГА с модифицированными Жгликанами. Возможно получение ГА с модифицированным типом гликозилирования, например, с пониженным уровнем фукозилирования, ксилозилирования или как фукозилирования, так и ксилозилирования N гликанов, либо получение ГА с модифицированным типом гликозилирования, где в белке уменьшен уровень фукозилированиия, ксилозилирования или и того, и другого, но присутствует повышенный уровень галактозилирования. Далее, модулирование пост-трансляционной модификации, например, присоединение терминальной галактозы может привести к снижению степени фукозилирования и ксилозилирования экспрессированного ГА по сравнению с растением дикого типа, экспрессипующим ГА.
Например, не считая данный пример ограничивающим, синтез ГА с модифицированным гликозилирования можно осуществить при коэкспрессии целевого белка с последовательностью нуклеотидов, кодирующей бета-1.4-галактозилтрансферазу (Са1Т), например, без ограничения, Са1Т млекопитающих
- 25 018206 или Са1Т человека; также можно брать Са1Т и из других источников. Каталитический домен Са1Т может быть слит с доменом СТ8 (т.е. цитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом, стволовым участком) №ацетилглюкозаминилтрансферазы (СЭТ1) с образованием гибридного фермента СЭТ1-Са1Т, и указанный гибридный фермент может выделяться при коэкспрессии с ГА. Другой вариант - коэкспрессия ГА с последовательностью нуклеотидов, кодирующей №ацетилглюкозаминилтрансферазу ΙΙΙ (СпТΙΙΙ), например, но без ограничения, СпТ-ΙΙΙ млекопитающих или СпТ-ΙΙΙ человека; также можно брать СпТ-ΙΙΙ из других источников. Еще один вариант - гибридный фермент СКП-СпТ-Ш, состоящий из СТ8 СКТ1, слитого с СпТ-ΙΙΙ.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к ВЧ, содержащим ГА с модифицированными №гликанами.
Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что наличие растительных №гликанов на ГА может стимулировать иммунный ответ, способствуя связыванию ГА антигенпредставляющими клетками. Стимулирование иммунного ответа с помощью растительных №гликанов было предложено в работе 8а1п1-]оге-Оира5 с соавт. (2007). Далее, конформация ВЧ может быть выгодной для представления антигена и повышать адъювантное действие ВЧ в комплексе с липидным слоем растительного происхождения.
Под терминами регуляторный участок, регуляторный элемент или промотор подразумевается часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, расположенная ранее участка гена, кодирующего белок, и состоящая из ДНК, РНК или одновременно и ДНК, и РНК. Если регуляторный участок активен, и оперативно ассоциирован или оперативно связан с целевым геном, это может привести к экспрессии целевого гена. Регуляторный элемент может влиять на органоспецифичность или регулировать временную активацию гена или активацию в ходе развития. Регуляторный участок включает элементы промоторов, коровые регуляторные элементы, проявляющие базовую промоторную активность, элементы, способные индуцироваться в ответ на внешнее воздействие, элементы, опосредующие промоторную активность, такие как негативные регуляторные элементы или усилители транскрипции. Регуляторный участок в данном документе также включает элементы, которые активны после транскрипции, например регуляторные элементы, модулирующие экспрессию генов, такие как усилители трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, расположенные ранее активирующие последовательности и детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из последних упомянутых элементов могут быть расположены вблизи кодирующей области.
В рамках данного описания термин регуляторный элемент или регуляторный участок как правило относится к последовательности ДНК, обычно, но не всегда, расположенной ранее (5') кодирующей последовательности структурного гена, которая регулирует экспрессию кодирующей области за счет распознавания РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции на определенном участке. Однако следует учитывать, что другие последовательности нуклеотидов, расположенные в интронах, или 3' последовательности могут также участвовать в регулировании экспрессии целевой кодирующей области. Примером регуляторного элемента, осуществляющего распознавание РНК-полимеразы или других факторов транскрипции, что обеспечивает ее начало в определенной позиции, является элемент промотора. Большая часть, но не все, регуляторные элементы эукариотов содержат ТАТА-бокс - консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из пар азотистых оснований аденозин и тимидин, обычно расположенных приблизительно за 25 пар оснований ранее сайта начала транскрипции. Элемент промотора содержит базальный элемент промотора, ответственный за инициирование транскрипции, а также другие регуляторные элементы (как указано выше), модифицирующие экспрессию генов.
Регуляторные участки относятся к нескольким типам, в том числе активные в ходе развития, индуцируемые или конститутивные. Регуляторный участок, активный в ходе развития или управляющий дифференциальной экспрессией гена, активируется в определенных органах или тканях органа в определенные моменты времени в процессе развития данного органа или ткани. Тем не менее, некоторые регуляторные участки, которые активны в ходе развития, могут быть предпочтительно активны в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, но могут также быть активны либо в ходе развития либо на базовом уровне в других органах или тканях растения. Примерами тканеспецифических регуляторных участков, например, кее-специфических регуляторных участков являются промотор напина и промотор круциферина (Какк с соавт., 1998, 1. Р1ап1 ΡΗνδίο1. 152: 595-599; Вйобеаи с соавт., 1994, Р1ап1 Се11 14: 125-130). Примером промотора, специфического для листьев, является промотор пластоцианина (На фиг. 1Ь или 8ЕО ΙΌ N0:23); ϋδ 7125978, включен в данный документ посредством ссылки).
Индуцируемым является регуляторный участок, который способен прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или более последовательности ДНК или гена под действием индуктора. В отсутствие индуктора транскрипции последовательности ДНК или гена не происходит. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемым регуляторным участком для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем прямо или косвенно превращается в активную под действием индуктора. Однако белковый фактор может и отсутствовать. В качестве индуктора может служить химический агент, такой как белок, метаболит, регулятор роста, герби
- 26 018206 цид или производное фенола, а также физиологический стресс, оказываемый прямо действием тепла, холода, соли или токсичных элементов или косвенно при действии патогенного микроорганизма или болезнетворного агента, например вируса. Действие индуктора на клетку растения, содержащую индуцируемый регуляторный участок, происходит за счет внешнего воздействия - обрызгивания, полива, нагревания и прочих способов. Индуцируемые регуляторные элементы могут иметь происхождение из растительных или нерастительных генов (напр., Са1х. С. апб Ьепк, Ι.Κ.Ρ., 1998, Тгепбз Р1ап1 8с1. 3, 352-358; включен посредством ссылки). Примеры возможных индуцируемых промоторов (без ограничения) - индуцируемый тетрациклином промотор (Οαΐζ, С.,1997, Апп. Кеу. Р1ап1 Р11У81о1. Р1ап1 Мо1. Бю1. 48, 89-108; включен посредством ссылки), индуцируемый стероидами промотор (Аоуата, Т. апб С1ша, Ν.Η.,1997, Р1ап1 ί. 2, 5 397-404; включен посредством ссылки) и индуцируемый этанолом промотор (8а11ег, М.С., с соавт., 1998, Р1ап1 1оигпа1 16, 127-132; Сабб1ск, М.Х., с соавт.,1998, №11иге Вю1есЬ. 16, 177-180, включены посредством ссылки) гены ΙΒ6 и СК11, индуцируемые цитокином (Вгапбйабег, I. апб КлеЬег, 11,1998, Р1ап1 Се11 10, 1009-1019; Как1то1о, Т., 1996, 8с1епсе 274, 982-985; включены посредством ссылки) и индуцируемый ауксином элемент ΌΒ5 (Ытазоу, Т., с соавт., 1997, Р1ап1 Се11 9,1963-1971; включен посредством ссылки).
Конститутивный регуляторный участок управляет экспрессией гена в разных частях растения и постоянно в ходе его развития. Примерами известных конститутивных регуляторных элементов являются промоторы, связанные с транскриптом СаМУ 358 (0бе11 с соавт., 1985, №11иге, 313: 810-812), гены актина риса 1 (2Ьапд с соавт., 1991, Р1ап1 Се11, 3: 1155-1165), актина 2 (Ап с соавт., 1996, Р1ап1 1., 10: 107-121), тропомиозина 2 (И.8. 5428147, включен в данный документ посредством ссылки), и триозофосфатизомеразы 1 (Хи с соавт., 1994, Р1ап1 РЬу8ю1. 106: 459-467), ген убиквитина кукурузы 1 (С.’огпе)о с соавт., 1993, Р1ап1 Мо1. В1о1. 29: 637-20 646), гены убиквитина АгаЬ1бор81 1 и 6 (Ио11огГ с соавт., 1995, Р1ап1 Мо1. Вю1. 29: 637-646), и фактор гена инициации трансляции табака 4А (Мапбе1 с соавт., 1995 Р1ап1 Мо1. Вю1. 29: 995-1004). В данном документе термин конститутивный не означает обязательно, что экспрессия гена под управлением конститутивного регуляторного участка осуществляется на одном и том же уровне во всех типах клеток - экспрессия осуществляется в широком интервале типов клеток, хотя часто в различном количестве.
Термин оперативно связанный подразумевает, что определенные последовательности, например регуляторный элемент и целевая кодирующая область, взаимодействуют прямо или косвенно для осуществления заданной функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии генов. Взаимодействие оперативно связанных последовательностей может, например, осуществляться за счет белков которые взаимодействуют с оперативно связанными последовательностями.
Экспрессия одной или более одной последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению может происходить в любом приемлемом растении-хозяине, трансформированном последовательностью нуклеотидов, конструкцией или векторами в соответствии с настоящим изобретением. К таким хозяевам относятся (без ограничения) сельскохозяйственные культуры, в том числе люцерна, рапс канола, Вгазбка брр., кукуруза, Мсобапа зрр., люцерна, картофель, женьшень, горох, овес, рис, соя, пшеница, ячмень, подсолнечник, хлопчатник и т.п.
Одна или более химерная генетическая конструкция согласно настоящему изобретению может также содержать 3'-нетранслируемую область. 3'-Нетранслируемая область относится к той части гена, включающей сегмент ДНК, которая содержит сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно способствует присоединению треков полиадениловой кислоты к 3'-концу прекурсора мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5'-ААТААА3', несмотря на то, что вариации нередки. Одна или несколько химерных генетических конструкций в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать дополнительные энхансеры - энхансеры трансляции или транскрипции, по необходимости. Такие области энхансеров хорошо известны специалистам в данной области и могут содержать АТГ-кодон инициации и ближайшие последовательности. Кодон инициации должен находится в фазе с рамкой считывания кодирующей последовательности для осуществления трансляции всей последовательности.
Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются нетранслируемые 3'-области транскрипции, содержащие сигнал полиаденилирования опухолеиндуцирующей Т1-плазмиды гена агробактерии, например, нопалинсинтазы (Иоз-ген), и гены растений, такие как гены белков хранения сои и гены малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы (5бКиВ18С0; И8 4962028; включен в данный документ посредством ссылки), промотор, используемый при регулировании экспрессии пластоцианина (Р\гее и Сгау 1993; включен в данный документ посредством ссылки). Пример промотора пластоцианина описан в документе И8 7125978 (включен в данный документ посредством ссылки).
В соответствии с настоящим документом промоторы, включающие энхансеры с известной эффективностью при экспрессии в листьях, оказываются эффективными и при временной экспрессии. Не желая ограничиваться конкретной теорией, полагают, что присоединение предшествующих регуляторных элементов гена фотосинтеза к ядерной матрице может влиять на экспрессию. Например, до -784 от сайта начала трансляции пластоцианина гороха можно использовать для получения значительной экспрессии
- 27 018206 гена-репортера.
Для более простой идентификации трансформированных клеток растения конструкции согласно настоящему изобретению можно далее изменять с включением селектируемых маркеров растений. К полезным селектируемым маркерам относятся ферменты, обеспечивающие устойчивость к химическим агентам, таким как антибиотики, например гентамицин, гигромицин, канамицин, или гербициды, например, фосфинотрицин, глифосат, хлорсульфурон и т.п. Аналогичную роль могут играть ферменты, осуществляющие получение соединения, которое обнаруживается по изменению цвета, например СИ8 (бетаглюкуронидаза) или по люминесценции, например люцифераза или СЕР (зеленый фосфоресцирующий белок).
Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, клетки или семена растений, содержащие конструкцию химерного гена в соответствии с настоящим изобретением. Способы регенерации целого растения из его клеток также известны в данной области. В общем виде трансформированные клетки растения культивируют в соответствующей среде, которая может содержать селективные агенты, такие как антибиотики, при этом селектируемые маркеры служат для идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллюса, формирование ростков можно стимулировать действием соответствующих растительных гормонов известными способами, затем ростки переносят в субстрат для регенерации растения. Далее растения могут служить для производства следующих генераций, либо из семян либо методами вегетативного размножения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования культур тканей.
Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, деревья, дрожжи, бактерии, грибы, клетки насекомых и животных, содержащие конструкцию химерного гена, представляющую собой нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантные Г А0 для получения ВЧ, в соответствии с настоящим изобретением.
Регуляторные элементы настоящего изобретения могут комбинироваться с целевой кодирующей областью для экспрессии в ряде организмов-хозяев, пригодных для трансформации или временной экспрессии. К таким организмам относятся, без ограничения, растения (как однодольные, так и двудольные), например, без ограничения кукуруза, зерновые растения, пшеница, ячмень, овес, Мсобапа зрр, Вгазыса зрр, соя, бобы, горох, люцерна, картофель, томат, женьшень и ЛгаЫборыз.
Способы стабильной трансформации и регенерации указанных организмов хорошо разработаны в данной области и известны специалистам. Способ получения трансформированного и регенерированного растения не является принципиальным в отношении настоящего изобретения.
Под трансформацией понимается межвидовой перенос генетической информации (последовательности нуклеотидов), который проявляется в генотипе и/или в фенотипе. Межвидовой перенос генетической информации от химерной конструкции к хозяину может быть наследуемым, тогда перенос генетической информации считается стабильным, либо перенос может быть транзиентным (временным), тогда перенос генетической информации не наследуется.
Понятие растительное вещество означает любой материал, полученный из растения. Растительным веществом может быть растение целиком, ткань, клетки или любая их часть. Далее, растительное вещество может включать внутриклеточные компоненты, внеклеточные компоненты, жидкие или твердые экстракты растения либо их сочетание. Далее, растительное вещество может представлять собой растение, клетки растения, ткани, жидкий экстракт или их сочетание из листьев, стеблей, плодов, корней или их сочетания. Растительное вещество может быть растением или его частью, которые не подвергались ни одной из стадий обработки. Однако предусмотрено и что растительное вещество прошло стадии минимальной переработки, которые раскрыты ниже, либо более жесткой переработки, включая частичную или значительную очистку белка обычными методами, известными в данной области, к которым относятся (без ограничения) хроматография, электрофорез и т.п.
Понятие минимальная переработка относится к растительному веществу, например растению или части растения, содержащему целевой белок, которое было частично очищено с получением экстракта растения, гомогената, фракции гомогената и т.п. (т.е. минимально переработано). Частичная очистка может представлять собой (без ограничения) нарушение клеточной структуры растения, приводящее к образованию композиции, содержащей растворимые компоненты растения и нерастворимые компоненты растения, которые можно разделить, например, (без ограничения) центрифугированием, фильтрованием или их сочетанием. При этом белки, секретированные в межклеточном пространстве листа или другой ткани, можно легко выделить вакуумной или центробежной экстракцией либо провести экстракцию тканей под давлением, пропуская их через валки, измельчая и т.п., чтобы отжать или выделить белок из межклеточного пространства. Минимальная переработка может также подразумевать приготовление первичного экстракта растворимых белков, так как указанные препараты будут содержать пренебрежимо малое количество примесей из вторичных растительных продуктов. Далее, минимальная переработка может подразумевать экстракцию растворимого белка из листьев в водную фазу с последующим осаждением любой приемлемой солью. К другим методам относятся мацерация и жидкостная экстракция в крупных масштабах, что позволяет непосредственное использование экстракта.
Растительное вещество в виде растительного материала или ткани пригодно для перорального при
- 28 018206 менения. Растительное вещество можно принимать в составе добавки к рациону - вместе с пищей или в капсулах. Можно провести концентрирование вещества или ткани растения для улучшения или повышения его съедобности, либо объединить с другими материалами, ингредиентами, или фармацевтическим наполнителем, по необходимости.
Примерами объектов или целевых организмов для введения ВЧ настоящего изобретения являются, без ограничения, человек, приматы, птицы, водоплавающие птицы, перелётные птицы, перепелки, утки, гуси, домашние птицы, куры, свиньи, овцы, лошади, верблюды, псовые, собаки, кошачьи, кошки, тигры, леопарды, циветты, норки, каменные куницы, хорьки, комнатные животные, домашний скот, кролики, мыши, крысы, морские свинки или другие грызуны, тюлени, киты и т.д. Указанные целевые организмы приведены как примеры и не должны считаться ограничивающими область применения настоящего изобретения.
Предусматривается, что растение, содержащее целевой белок либо экспрессирующее ВЧ, содержащие целевой белок, можно вводить в организм объекта или целевой организм разными способами, в зависимости от необходимости и ситуации. Например, целевой белок, полученный из растения, можно экстрагировать перед использованием в неочищенном, частично очищенном или очищенном виде. Если предполагается очистка белка, то его получение может осуществляться в съедобном либо несъедобном растении. Далее, при пероральном введении белка, растения можно собрать и непосредственно употреблять в пищу, либо собранные растения можно предварительно высушить, и только затем употреблять в пищу, либо животные могут поедать растущие растения без предварительного сбора урожая. В рамках данного изобретения собранные ткани растений могут также применяться в составе пищевой добавки к корму животных. Если животные поедают растительную ткань после лишь незначительной переработки или без нее, то предпочтительно, чтобы данная растительная ткань была съедобной.
В ограничении экспрессии трансгенов в растениях может принимать участие посттранскрипционный сайленсинг генов (РТС8), а коэкспрессия супрессора сайленсинга из вируса картофеля Υ (ИсРго) может быть использована для противодействия специфической деградации трансгенных мРНК (Видней с соавт., 1998). Другие супрессоры сайленсинга хорошо известны в данной области и могут применяться как здесь описано (СйЬа с соавт., 2006, У1го1оду 346:7-14; включен в данный документ посредством ссылки), например (без ограничения): ТЕУ -р1/ИС-Рго (вирус гравировки табака-р1/ИС-Рго), ΒΥν -р21, р19 вируса кустистой карликовости томата (ТВ8У р19), капсидный белок вируса скрученности томата (ТСУ -СР), 22Ь вируса огуречной мозаики; СМУ-2Ь), р25 вируса картофеля X (РУХ-р25), р11 вируса картофеля М (РУМ-р11), р11 вируса картофеля δ (РУ8-р11), р16 вируса ожога черники (В8сУ -р16), р23 вируса тристеца цитрусовых (СТУ-р23), р24 вируса скручивания листьев винограда-2 (бЬКаУ-2 р24), р10 вируса винограда Α (ΟνΑ^θ^ р14 вируса винограда В (СУВ-р14), р10 латентного вируса борщевика (ИТУ-рЮ) или р16 обыкновенного латентного вируса чеснока (ССЬУ-р16). Таким образом, для дополнительного повышения уровня экспрессии белка в растении возможна коэкспрессия супрессора сайленсинга, например (без ограничения), МсРго, ТЕУ -р1/ИС-Рго, ΒΥV-ρ21, ТВ8У р19, ТСУ-СР, СМУ-2Ь, РУХ-р25, РУМ-р11, РУ8-р11, В8сУ-р16, СТУ-р23, бЬКаУ-2 р24, СВУ-р14, I Н-У-рНк 6СЬУ-р16 или СVΑ-ρ10. одновременно с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок.
Далее, можно осуществить получение ВЧ, представляющих собой комбинацию подтипов ГА. Например, ВЧ могут содержать один или более одного ГА подтипов Η1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15, Н16 или их комбинацию. Выбор комбинации ГА определяется предполагаемой областью применения полученной их ВЧ вакцины. Например, вакцина, предназначенная для вакцинации птиц, может содержать любую комбинацию подтипов ГА, в то время как ВЧ, предназначенные для вакцинации людей, могут содержать один или более одного из подтипов Η1, Н2, Н3, Н5. Тем не менее, возможно приготовление и других комбинаций подтипов ГА, в зависимости от применения ВЧ. Для получения ВЧ, содержащих комбинации подтипов ГА, возможна коэкспрессия требуемого подтипа ГА в той же клетке, например, в клетке растения.
Далее, ВЧ, полученные как описано в настоящем документе, не содержат нейраминидазу (НА). Тем не менее, если требуются ВЧ, содержащие ГА и НА, возможна совместная экспрессия НА с ГА.
В настоящем изобретении также предлагается соответствующий вектор, включающий химерную конструкцию, пригодную для использования в системах стабильной либо временной экспрессии. Генетическая информация может быть заключена в одной или нескольких конструкциях. Например, последовательность нуклеотидов, кодирующая целевой белок, может быть введена в виде одной конструкции, а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, модифицирующий тип гликозилирования целевого белка, может быть введена как отдельная конструкция. Указанные последовательности нуклеотидные могут быть коэкспрессированы в растении. Можно использовать также конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую как целевой белок, так и белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка. В этом случае последовательность нуклеотидов будет содержать первую последовательность, соответствующую нуклеиновой кислоте, кодирующей целевой белок и оперативно связанную с промотором или регуляторным участком, и вторую последовательность, соответствующую второй нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, при этом вторая последовательность оперативно связана с промотором или
- 29 018206 регуляторным участком.
Под коэкспрессией понимается, что экспрессия двух или нескольких нуклеотидных последовательностей происходит в растении примерно в одно и то же время, причем в одной и той же ткани растения. Однако экспрессия нуклеотидных последовательностей не обязана происходить строго одновременно. Экспрессия двух или нескольких нуклеотидных последовательностей должна осуществляться таким образом, чтобы была возможность взаимодействия между продуктами. Например, белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, может экспрессироваться ранее или в тот же период времени, что и целевой белок, так чтобы происходило модифицирование типа гликозилирования целевого белка. Коэкспрессия двух или нескольких последовательностей нуклеотидов может иметь место в системе временной экспрессии, при этом две или несколько последовательностей вводят в растение приблизительно одновременно, в условиях, когда происходит экспрессия обеих последовательностей. Альтернативой является временная или стабильная трансформация растения-платформы, содержащего одну из последовательностей нуклеотидов, например последовательность, кодирующую белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка дополнительной последовательностью, кодирующей целевой белок. В этом случае экспрессия последовательности, кодирующей белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, может осуществляться в заданной ткани, на заданной стадии развития, либо указанную экспрессию можно вызвать с помощью индуцируемого промотора, а дополнительная последовательность, кодирующая целевой белок, может экспрессироваться в аналогичных условиях в той же ткани, что обеспечивает коэкспрессию указанных последовательностей нуклеотидов.
Конструкции в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в клетки растения методами Т1 плазмид, К! плазмид, векторов вирусов растений, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Обзор таких методов можно найти, например, в работах ^е188Ьасй аиб ХУекзЬасй, Ме1йоб8 Тог Р1ан1 Мо1еси1аг Вю1оду, Асабету Ргезз, Нью-Йорк VIII, стр. 421-463 (1988); Се1ег8он аиб Согеу, Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду, 2б Еб. (1988); М1к1 аиб 1уег, ЕинбатегИак оТ Сене ТгаизТег ίπ Р1ан18. 1и Р1аи! Ме1аЬо1кт, 2б Еб. ОТ. Оеишв, ΌΗ Тигр1и, ΌΌ ЬеТеЬгуе, ЭВ Йаухе11 (ебз), Аббкои ^ез1у, Еаидтаиз Ыб. Еоибои, стр. 561-579 (1997). К другим методам относятся прямая абсорбция ДНК, применение липосом, электропорация, например, с помощью протопластов, микроинъекций, микроснярядов или вискеров, и вакуум инфильтрации. См., например, Вйаид, с соавт. (Сеие 100: 247-250 (1991), 8сйе1б с соавт. (Мо1. Сеи. Сеие! 228: 104-112, 1991), Сиегсйе с соавт. (Р1аЫ 8с1еисе 52: 111-116, 1987), №ийаи8е с соавт. (Тйеог. Арр1 Сеие! 75: 30-36, 1987), К1ет с соавт., №11иге 327: 70-73 (1987); Но\\е11 с соавт. (8с1еисе 208: 1265, 1980), Ногзсй с соавт. (8с1еисе 227: 1229-1231,1985), ЭеВ1оск с соавт., Р1аи! Рйу8ю1оду 91: 694701,1989), МеШобз Тог Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду (ХУекзЬасй аиб ^е1ззЬасй, ред., Асабетю Ргезз 1ис., 1988), МеШобз т Р1аи! Мо1еси1аг Вю1оду (8сйи1ег аиб 21е1шзк1, ред., Асабетю Ргезз 1ис., 1989), Ын аиб ЬотоиоззоТТ (1. νΐΐΌ1 Ме1й, 105:343-348, 2002,), Пат. США №№ 25 4945050; 5036006; 5100792, патентные заявки США, сер. №№ 08/438, 666 (теперь патент США № 6403865), и 07/951715 (теперь патент США № 5625136) (все документы включены в данный документ посредством ссылки).
Методы временной экспрессии могут служить для экспрессии конструкций в соответствии с настоящим изобретением (см. Ын аиб ЬотоиоззоТТ, 2002, 1оита1 оТ ^го1одюа1 30 Ме1йобз, 105:343-348; включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, применим метод временной экспрессии на основе вакуума, как описано в работе Карба с соавт. 1997 (включен посредством ссылки). Указанные методы могут включать, например (без ограничения) методы агроинокуляции или агроинфильтрации; применимы также и другие транзиентные методы, как указано выше. Согласно способам агроинокуляции или агроинфильтрации, смесь агробактерий (АдгоЬас(еп), содержащих заданную нуклеиновую кислоту, вводится в межклеточное пространство ткани, например листья, надземную часть растения (стебель, листья, цветок), другую часть растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После перехода через эпидермис, агробактерии инфицируют копии т-ДНК и переносят их в клетки. Эписомная транскрипция т-ДНК и трансляция м-РНК, приводят к продукции целевого белка в инфицированных клетках, тем не менее, проникновение т-ДНК внутрь ядра является временным.
Если целевая нуклеотидная последовательность кодирует продукт, который прямо или косвенно токсичен для растения, тогда при использовании способа настоящего изобретения такая токсичность может быть снижена во всем растении за счет селективной экспрессии целевой последовательности нуклеотидов в выбранной ткани или на выбранной стадии развития растения. Кроме того, ограниченный период экспрессии, связанный с временной экспрессией, может снизить влияние при продуцировании токсичного продукта в растении. Для селективного управления экспрессией целевой последовательности можно использовать индуцируемый промотор, тканеспецифический промотор или специфический клеточный промотор.
Рекомбинантные ГА ВЧ согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с существующими вакцинами, для дополнения вакцин, придания им более высокой эффективности и для снижения необходимых доз. Специалисту в данной области известно, что вакцина может быть направлена против одного или более одного вируса гриппа. Примеры пригодных вакцин включают, без ограничения, имеющиеся на рынке вакцины компаний 8аηοТ^-Разΐеи^, ГО Вютеб1са1, Мепай 8тоуас, Сйкои, Косйе, Меб1ттиηе, С1ахо8тИйК1те, №уаШз, 8апοТ^-Аνепΐ^з, 8егоио, 8й1ге РйагтасеиксаЕ и т.п.
- 30 018206
При желании ВЧ в соответствии с настоящим изобретением могут быть смешаны с приемлемым адъювантом, которые известны специалистам. Далее ВЧ могут применяться в составе вакцины, содержащей эффективную дозу ВЧ для воздействия на целевой организм, как указано выше. Далее ВЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно комбинировать с ВЧ, полученными с использованием различных белков вируса гриппа, например, нейраминидазы (НА).
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ формирования иммунитета к инфицированию вирусом гриппа у животного или целевого организма, заключающийся во введении эффективной дозы вакцины, содержащей один или более одного ВЧ. Вакцину можно вводить перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, или подкожно.
Введение ВЧ, полученных в соответствии с настоящим изобретением, описано в примере 6. Введение ВЧ Н5, полученного в растении, привело к заметно более сильному ответу по сравнению с введением растворимого ГА (см. фиг. 21А и 21В).
Как показано на фиг. 26А и 26 В, объект, получивший ВЧ Н5 штамма А/Индонезия/5/05, показал перекрёстный иммунитет против гриппа А/Турция/582/06 (Η5Ν1; Турция Η5Ν1). Введение ВЧ Н5 штамма Индонезия перед контрольным заражением не привело к потере массы тела. Объект, не получивший ВЧ Н5, но получивший контрольное заражение штаммом Турция Η5Ν1, имел значительную потерю массы тела, и некоторые объекты умерли.
Таким образом, приведенные данные показывают, что полученные в растении ВЧ вируса гриппа, содержащие вирусный белок гемагглютинин Н5, вызывают иммунный ответ, специфичный для патогенных штаммов гриппа, и что вирусоподобные частицы могут отпочковаться из плазматической мембраны растения.
Так, в настоящем изобретении предлагается композиция, содержащая эффективную дозу ВЧ, включающих белок ГА вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Белок ГА вируса гриппа может быть Н5 штамма Индонезия/5/2006. Предложен также способ формирования иммунитета против вируса гриппа у объекта. Способ заключается во введении вирусоподобных частиц, включающих белок ГА вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Введение вирусоподобных частиц осуществляется перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Композиции согласно различным осуществлениям настоящего изобретения могут содержать ВЧ двух или более штаммов или подтипов вируса гриппа. Два или более означает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более штаммов или подтипов. Штаммы или подтипы могут относиться к одному подтипу (например, все Η1Ν1 или все Η5Ν1) или представлять собой комбинацию подтипов. Примерами подтипов и штаммов являются, без ограничения, перечисленные здесь (например, А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1), А/Индонезия/5/2006 (Η5Ν1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/ Делавэр /677/88 (Η2Ν8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/ Миннесота/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейки/Онтарио/6118/68(Η8N4), А/утки-широконоски/Иран/О54/03, А/куры/Германия/Ы/1949(Н10Ю), А/утки/Англия/56 (Η11Ν6), А/утки/Альберта/60/76(Н12№), А/чайки/Мэриленд/704/77(Н13^), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/341/83 (Η15Ν8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Н16№3), В/Ьее/40, С/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (Η1Ν1), А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1), А/Соломоновы острова 3/2006 (Η1Ν1), А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2), А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2), А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1), А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1), А/дикие утки/Гонконг/А312/97 (Η6Ν1), А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7), А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2)).
Выбор сочетания штаммов и подтипов зависит от: географической области нахождения объектов, где вероятно заражение гриппом; близости видов животных с местом проживания людей, подлежащих иммунизации (например, виды водоплавающих птиц, сельскохозяйственных животных, таких как свиньи и т.п.), и штаммов, которые у этих животных обнаруживаются или вероятно могут быть обнаружены; прогнозов антигенной изменчивости по подтипам или штаммам; или от сочетания указанных факторов. Примеры сочетаний, применявшихся в последние годы, имеются в доступе (см. ϋΚΕ: \ν1ю.^иι/с5^/ά^ееа5е/^иΠиеиζаΛ'асс^ие гесоттепбайопх 1/еп). При разработке состава вакцины можно использовать некоторые или все эти штаммы в приведенных сочетаниях или в других сочетаниях.
Более конкретно, примеры сочетаний включают ВЧ из двух или более штаммов или подтипов, выбранных из группы, включающей: А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1), А/Брисбен/59/2007 (НШ1)-подобный вирус, А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2), А/Брисбен/10/2007 (Н3№)-подобный вирус, В/Флорида/4/2006 или В/Флорида/4/2006-подобный вирус.
Другой пример сочетания может включать ВЧ из двух или более штаммов или подтипов, выбранных из группы, содержащей А/Индонезия/5/2005, А/Индонезия/5/2005-подобный вирус, А/Вьетнам/ 1194/2004, А/Вьетнам/1194/2004-подобный вирус, А/Аньхой/1/05, А/Аньхой/1/05-подобный вирус, А/гуси/Гуйян/337/2006, А/гуси/Гуйян/337/2006-подобный вирус, А/куры/Шаньси/2/2006, или А/куры/Шаньси/2/2006-подобный вирус.
Другой пример сочетания может включать ВЧ из штаммов вируса гриппа А/куры/Италия/13474/99 (тип Н7) или А/куры/Британская Колумбия/04 (Η7Ν3).
- 31 018206
Другой пример сочетания может включать ВЧ из штаммов или подтипов А/куры/Гонконг/С9/97 или А/Гонконг/1073/99. Другой пример сочетания может включать ВЧ из А/Соломоновы Острова/3/2006. Другой пример сочетания может включать ВЧ из А/Брисбен/10/2007. Другой пример сочетания может включать ВЧ из А/Висконсин/67/2005. Другой пример сочетания может включать ВЧ из В/Малайзия/ 2506/2004, В/Флорида/4/2006 или В/Брисбен/3/2007.
Два или более ВЧ могут получаться при раздельной экспрессии, после чего очищенные или частично очищенные ВЧ объединяют. В качестве альтернативы, возможна коэкспрессия ВЧ в том же хозяине, например, в растении. ВЧ можно комбинировать или получать в заданном соотношении, например, примерно в эквивалентном отношении, или их можно комбинировать таким образом, что один подтип или штамм представляет собой большую часть ВЧ в композиции.
Таким образом, изобретение предлагает композиции, содержащие ВЧ двух или более штаммов или подтипов.
Обычно ВЧ оболочечных вирусов приобретают оболочку из мембраны, из которой они почкуются. Плазматические мембраны растений имеют фитостериновый комплемент, который может оказывать иммуностимулирующее действие. Для исследования указанной возможности, полученные в растениях ВЧ Н5 вводили животным в присутствии или в отсутствие адъюванта и определяли НА1 (гуморальный ответ по ингибированию гемагглютинации) (фиг. 22А, 22В). В отсутствие добавки адъюванта полученные в растениях ВЧ Н5, показали значительный НА1, указывающий на системный иммунный ответ на введение антигена. Более того, профили изотипов антител для ВЧ, введенных в присутствии или в отсутствие адъюванта аналогичны (на фиг. 23 А).
В табл. 5 приведены последовательности, предлагаемые согласно различным осуществлениям настоящего изобретения.
Таблица 5. Описание последовательностей для идентификатора последовательностей
8Εζ) ГО Νο Описание последовательности Раскрыто
1 Ν-терминальный фрагмент Н1 На ФИГ. 5 а
2 С-терминальный фрагмент Н1 На ФИГ. 5Ь
3 Последовательность, кодирующая Н5 На ФИГ. 6
4 праймер Р1а1о-443с На ФИГ. 7а
5 праймер 8рНА(1пд)-Р1а81о.г На ФИГ. 7Ь
6 праймер Р1аз1о-8рНА(1п4).с На ФИГ. 7с
7 праймер НА(1пб)-8ас.г На ФИГ. 7ά
8 Последовательность экспрессирующей кассеты на основе пластоцианина люцерны для экспрессии Η1 На ФИГ. 1
9 Последовательность пептида ГА1 (А/Новая Каледония/20/99) На ФИГ. 8а
10 Последовательность пептида ГА5 (А/Индонезия/5/2006) На ФИГ. 8Ъ
11 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н7 (А/куры/Нью-Йорк/1995) На ФИГ. 9
12 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н2 (А/серебристые чайки/ Делавер /677/88 (Η2Ν8)) НаФИГ. 10а
13 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа НЗ (А/Техас/32/2003) На ФИГ.ЮЬ
14 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н4 (А/кряквы/ Миннесота /33/00) НаФИГ. Юс
15 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н5 (А/утки/Шанхай/1/2000) На ФИГ. 10ά
16 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н6 (А/шилохвости/Техас/828189/02) На ФИГ. Юе
17 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н8 (А/индейки/Онтарио/6118/68(Η8Ν4)) На ФИГ. ЮГ
18 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н9 (А/утки-широконоски/Иран/654/03) На ФИГ. 10§
19 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа НЮ (А/куры/ГерманияЖ/1949(Н10Н 7)) На ФИГ. 10Ь
20 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н11 (А/утки/Англия/56(Н11Ν6)) На ФИГ. 10Ϊ
21 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н12 (А/утки/Альберта/60/76(Н121Ч5)) На ФИГ. 10)
22 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н13 НаФИГ. Юк
- 32 018206
8ЕО ГО Νο Описание последовательности Раскрыто |
(А/чайки/Мэриленд/704/77(Н13Ν6))
23 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н14 (А/кряквы/Г урьев/263/82) НаФИГ. 101
24 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н15 (А/утки/Австралия/341/83 (Η15Ν8)) НаФИГ. Ют
25 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н16(А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Н 16Ν3)) НаФИГ. 10п
26 Последовательность, кодирующая ГА вируса гриппа В (В/Ли /40) НаФИГ. 10о
27 Последовательность, кодирующая ГА вируса гриппа С (С/Йоханнесбург/66) НаФИГ. Юр
28 Полная последовательность Н1 НАО На ФИГ. 5с
29 Праймер Хта1-рР1аз.с НаФИГ. Юц
30 Праймер 8ас1-АТ6-рР1аз.г НаФИГ. Юг
31 Праймер 8ас1-Р1а8Тег.с НаФИГ. Юз
32 Праймер ЕсоК1-Р1азТег.г НаФИГ. 101
33 А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) (ЗепВапк входящий №. ΑΥ289929 НаФИГ. 16
34 Протеиндисульфидизомераза люцерны М. 8айуа, (ЗепВапк входящий № Ζ11499 НаФИГ. 17
35 А/Пуэрто-Рико/8/34 (Η1Ν1) (ЗепВапк входящий № Ν(3 002016.1 НаФИГ. 18
36 Клон 774: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) На ФИГ. 28
37 Клон 775: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1) На ФИГ. 29
38 Клон 776: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2) На ФИГ. 30
39 Клон 777: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2) На ФИГ. 31
40 Клон 778: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА В/Малайзия/2506/2004 На ФИГ. 32
41 Клон 779: ДНК от ЭгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА В/Флорида/4/2006 На ФИГ. 33
42 Клон 780: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая На ФИГ. 34
- 33 018206
8ЕО Ю Νο Описание последовательности Раскрыто |
регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2)
43 Клон 781: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей Г А А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) На ФИГ. 35
44 Клон 782: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей Г А А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) На ФИГ. 36
45 Клон 783: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/дикие утки/ГонконгЛУЗ 12/97 (Η6Ν1) На ФИГ. 37
46 Клон 784: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей Г А А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7) На ФИГ. 38
47 Клон 785: ДНК от ОгаШ до 8ас1, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей ГА А/Гонконг/107 3/99 (Η9Ν2) На ФИГ. 39
48 Клон 774: аминокислотная последовательность ГА штамма А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) На ФИГ. 40А
49 Клон 775: аминокислотная последовательность ГА штамма А/Соломоновы Острова 3/2006 (Η1Ν1) На ФИГ. 40В
50 Клон 776: аминокислотная последовательность ГА штамма А/Брисбен 10/2007 (Η3Ν2) На ФИГ. 41А
51 Клон 777: аминокислотная последовательность ГА штамма А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2) На ФИГ. 41В
52 Клон 778: аминокислотная последовательность ГА штамма В/Малайзия/25 06/2004 На ФИГ. 42А
53 Клон 779: аминокислотная последовательность ГА штамма В/Флорида/4/2006 На ФИГ. 42В
54 Клон 780 ГА аминокислотная последовательность А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2) На ФИГ. 43А
55 Клон 781: аминокислотная последовательность ГА штамма А/Аньхой/1 /2005 (Η5Ν1) На ФИГ. 43 В
56 Клон 782: аминокислотная последовательность ГА штамма А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) На ФИГ. 44А
57 Клон 783 ГА: аминокислотная последовательность ГА штамма А/дикие утки/ГонконгЛУЗ 12/97 (Η6Ν1) На ФИГ. 44В
58 Клон 784: аминокислотная последовательность ГА штамма А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7) На ФИГ. 45А
59 Клон 785Ж аминокислотная последовательность ГА штамма А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) На ФИГ. 45В
60 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность На ФИГ. 51
- 34 018206
8Е<2 ГО Νο Описание последовательности Раскрыто
для Н5 из А/Индонезия/5/2005 (конструкция # 660), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
61 Экспрессирующая кассета Г А, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н1 из А/Новая Каледония/20/1999 (конструкция # 540), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 52
62 Экспрессирующая кассета Г А, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н1 из А/Брисбен/59/2007 (конструкция #774), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 53
63 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н1 из А/Соломоновы острова/3/2006 (Η1Ν1) (конструкция #775), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 54
64 Экспрессирующая кассета Г А, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н2 из А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2) (конструкция #780), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 55
65 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н5 из А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) (конструкция #781), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 56
66 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н5 из А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) (конструкция # 782), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 57
67 Экспрессирующая кассета Г А, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н6 из А/дикие утки/ГонконгАУЗ 12/97 (Η6Ν1) (конструкция # 783), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 58
68 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н9 из А/Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) (конструкция #785), а также последовательности 3 ’ На ФИГ. 59
- 35 018206
8Е0 ГО Νο Описание последовательности Раскрыто
НТО и терминатора пластоцианина люцерны.
69 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для НЗ из А/Брисбен/10/2007 (Η3Ν2), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 60
70 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для НЗ из А/Висконсин/67/2005 (Η3Ν2), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 61
71 Экспрессирующая кассета ГА, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для Н7 из А/лошади/Прага/56 (Η7Ν7), а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 62
72 Экспрессирующая кассета Г А, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для ГА из В/Малайзия/250672004, а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. Прогнозный На ФИГ. 63
73 Экспрессирующая кассета Г А, содержащая промотор пластоцианина люцерны и 5’-НТО, гемагглютинин- кодирующую последовательность для ГА из В/Флорида/4/2006, а также последовательности 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны. На ФИГ. 64
74 Консенсусная последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 49,48, 33 и 9 На ФИГ. 65
75 Аминокислотная последовательность Н1 штамма Новая Каледония (ААР34324.1), которая кодируется §Е(/) ΙΟ N0: 33 На ФИГ. 67
76 Аминокислотная последовательность Н1 штамма Пуэрто-Рико (N0 0409878.1), которая кодируется 8Е(2 10 N0: 35 На ФИГ. 68
Далее подробное описание изобретения будет дано путем ссылок только на приведенные ниже неограничивающие примеры.
Материалы и методы
1. Сборка экспрессирующих кассет.
Все операции выполнялись по стандартным методикам молекулярной биологии, заимствованным из δатЬ^οοк апб Кикке11 (2001; включен в данный документ посредством ссылки). Первая стадия клонирования представляла собой сборку плазмиды рецепторов, содержащих предшествующие (ир81геат) и последующие (бошпк!геат) регуляторные элементы гена пластоцианина люцерны. Последовательности промотора пластоцианина и 5'НТО амплифицировали из геномной ДНК люцерны с помощью олигонуклеотидных праймеров ХтаНрРНк.с (δΕΡ ΙΌ N0: 29; фиг. 10Р) и δасI-АТС-рΡ1а8.^ (δΕΡ ΙΌ N0: 30; фиг. 10К). Продукт амплификации гидролизовали действием XтаI и δасI и лигировали в рСАМЫА2300 (СатЫа, Канберра, Австралия), предварительно гидролизованный теми же ферментами для формирования рСАМВГАргото Р1ак1о. Аналогично последовательности 3'НТО и терминатор гена пластоцианина амплифицировали из геномной ДНК люцерны посредством следующих праймеров: δасI-Ρ1а8Те^.с (δΕΡ ΙΌ N0: 31; фиг. 10δ) и ΕсοКI-Ρ1а8Те^.^ (δΕΡ ΙΌ N0: 32; фиг. 10Т), и продукты гидролизовали действием δасI и КсоШ после чего внедряли в те же сайты рСАМЫАрготоРНкШ для создания рСАМЫАР1а81о.
Открытую рамку считывания из гена Н1 штамма А/Новая Каледония/20/99 (НШ1) синтезировали в двух фрагментах (Р1ап1 Вю1есйпо1оду Ιπκΐιΐυΐο, №йопа1 Кекеагсй Соипсй, δа8каΐοοη, Сапаба). Первый синтезированный фрагмент соответствовал кодирующей последовательности Н1 дикого типа (СепВапк асе. №. 5 АУ289929; δΕΟ ΙΌ N0: 33; фиг. 16), где отсутствовала кодирующая последовательность сигнального пептида на 5'-конце и кодирующая последовательность трансмембранного домена на 3'-конце. К 5'
- 36 018206 концу кодирующей последовательности присоединяли сайт рестрикции ВдШ, а непосредственно за стопкодоном в 3'-концевой области фрагмента присоединяли двойной сайт ЗасЕЗШк что приводило к ЗЕЦ ГО N0: 1 (фиг. 5А). Синтезировали второй фрагмент, кодирующий С-терминальную область белка Н1 (содержащий трансмембранный домен и цитоплазматический хвост) от сайта Крп1 до стоп-кодона, фланкированный в 3' сайтами рестрикции 8ас1 и 30.1Ι (ЗЕЦ ГО N0. 2; фиг. 5В).
Первый фрагмент Н1 гидролизовали ВдШ и 8ас1 и клонировали в те же сайты бинарного вектора (рСЛМВ1ЛР1а51о). содержащего промотор пластоцианина и 5'-НТО, слитые с геном сигнального пептида протеиндисульфидизомеразы люцерны. (ΡΌΙ) (нуклеотиды 32-103; входящий №. Ζ11499; ЗЕЦ ГО N0: 34; фиг. 17), что приводит к образованию химерного гена ΡΌΙ-Η1, расположенного после регуляторных элементов пластоцианина. Последовательность кассеты, основанной на пластоцианине и содержащей сигнальный пептид ΡΌΙ, представлена на фиг. 1 (ЗЕЦ ГО N0:8). Полученная плазмида содержала кодирующую область Н1, слитую с сигнальным пептидом ΡΌΙ и фланкированную регуляторными элементами пластоцианина. Присоединение кодирующей области С-конца (кодирующей трансмембранный домен и цитоплазматический хвост) осуществляли внедрением синтезированного фрагмента (ЗЕЦ ГО N0: 2; фиг. 5В), предварительно гидролизованного действием Крп1 и 8ас1, в плазмиду экспрессии Н1. Полученная плазмида под номером 540 представлена на фиг. 11 (см. также фиг. 2А).
2. Сборка кассеты экспрессии Н5.
Фрагмент, кодирующий гемагглютинин штамма вируса гриппа А/Индонезия/5/05 (Н5Ю; входящий №. ЬЛМЫ8П№25873), синтезировали в лаборатории Еросй Вю1аЬ§ (Шугар Лэнд, Техас, США). Полученный фрагмент, содержащий полную кодирующую область Н5, включая нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом НтбШ, непосредственно перед исходным АТС и сайтом 8ас1, непосредственно после стоп-кодона (ТАА), представлен как ЗЕЦ ГО N0: 3 (фиг. 6). Кодирующую область Н5 клонировали в экспрессирующую кассету на основе пластоцианина методом лигирования на основе ПЦР, опубликованным в работе Оагуеан с соавт. (1995). Кратко: первую ПЦР амплификацию получали с праймерами Р1а1о-443с (ЗЕЦ ГО N0: 4; фиг. 7А), 8рНА(1пб)-Р1айо.г (ЗЕЦ ГО N0:5; фиг. 7В) на матрице рСАМВ1А рготоР1ак1о. Параллельно проводили вторую амплификацию с праймерами Р1айо-8рНА(1пб).с (ЗЕЦ ГО N0: 6; на фиг. 7С) и НА(1пб)-8ас.г (ЗЕЦ ГО N0:7; фиг. 7Ό) на матрице - кодирующем фрагменте Н5. Амплификации, полученные в обоих случаях, смешивали, и смесь служила матрицей для третьей реакции (сборки) с праймерами Р1а1о-443с (ЗЕЦ ГО N0: 4; фиг. 7А) и НА(1пб)-8ас.г (ЗЕЦ ГО 10 N0: 7; фиг. 70). Полученный фрагмент гидролизовали действием ВатН1 (промотор пластоцианина) и 8ас1 (3'конец фрагмента) и клонировали в рСАМШАРЦйо, предварительно гидролизованный теми же ферментами. Полученная плазмида 660 представлена на фиг. 2В (см. также фиг. 11).
Кассету, кодирующую растворимую форму Н1, готовили замещением области, кодирующей трансмембранный домен и цитоплазматический хвост в 540, фрагментом, кодирующим лейциновую молнию ССШ ρΙΙ (НагЬигу с соавт., 1993, Зс1епсе 1993; 262: 1401-1407). Указанный фрагмент синтезировали с фланкирующими сайтами Крп1 и ЗасЕ что способствует клонированию. Плазмида, полученная при такой замене, получила номер 544, соответствующая экспрессирующая кассета приведена на фиг. 11.
Слитые 5'-НТО вируса гравировки табака (ТЕУ) и открытой рамки считывания гена вируса гриппа А/РК./8/34 М1 (входящий # N€'-002016) синтезировали с фланкирующим сайтом Заск присоединенным после стоп-кодона. Фрагмент гидролизовали (в 5'НТО ТЕУ) и Зай и клонировали в экспрессирующую кассету на основе 2Х35З/ТЕУ в бинарной плазмиде рСАМША. Полученная плазмида несла кодирующую область М1 под контролем промотора 2Х35З/ТЕУ и 5'НТО и терминатора N03 (конструкция 750; фиг. 11).
Конструкцию НсРго (35НсРго) готовили, как описано НатШои с соавт. (2002). Все клоны секвенировали для подтверждения целостности конструкций. Плазмиды использовали для трансформации АдгоЬас1ешт ШтеГааепк (АСЬ1; АТСС, 30 Мапаккак, УА 20108, США) методом электропорации (Майапоуюй с соавт., 1989). Целостность штаммов А, ШтеГааепк подтверждали рестрикционным картированием.
3. Приготовление растительной биомассы, инокулята, агроинфильтрация и сбор растений.
Растения Мсобапа ЬеЩйаткта или №со1кта (аЬасит были выращены из семян в ящиках, заполненных товарным субстратом - болотным мхом. Растения находились в оранжерее в условиях светового дня/ночи 16/8 и при температурном режиме: днем: 25°С, ночью: 20°С. Через три недели после посева ростки вынимали и пересаживали в горшки и выращивали в оранжерее еще три недели при тех же условиях внешней среды. Перед трансформацией удаляли апикальные и пазушные почки в различные моменты времени, как указано ниже, либо отщипывая почки с растения, либо обрабатывая растение химическим реагентом.
После трансфекции конструкциями 660, 540, 544, 750 или 353НсРго, АдгоЬас1епа выращивали на среде УЕВ (бульон с дрожжевым экстрактом) с добавлением 10 мМ 2-[Юморфолино]этансульфоновой кислоты (МЭС), 20 мкм ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина, рН5.6 до достижения 0Ό600 в интервале 0,6-1,6. Суспензии АхроЬас1епшп центрифугировали перед использованием, затем продукт повторно суспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ МдС12 и 10 мМ МЭС, рН 5.6). шприцевую инфильтрацию проводили как описано в работе Ьш апб БотопоккоГГ (2002, 1оигпа1 оГ У1го1о§1са1 Мебюбк, 105:343-348). Для вакуумной инфильтрации суспензии А. ТшпеГааеп центрифуги
- 37 018206 ровали, продукт повторно суспендировали в среде для инфильтрации и оставляли на ночь при температуре 4°С. В день проведения инфильтрации партии культуры разбавляли в 2,5 объемах культуры и перед использованием давали разогреться. Цельные растения МЬеп1Ьат1апа или М1аЬасит помещали вверх ногами в бактериальную суспензию и выдерживали в герметичной емкости из нержавеющей стали в вакууме 20-40. После шприцевой или вакуумной инфильтрации растения возвращали в оранжерею, где инкубировали 4-5 суток перед сбором.
4. Отбор образцов листьев и экстракция суммарного белка.
После инкубации надземную часть растений собирали, замораживали при -80°С, измельчали в куски. Суммарный растворимый белок экстрагировали, гомогенизируя (Ро1у1гоп) пробы растительного материала, измельченного в замороженном виде, в 3 объемах холодной среды, состоящей из 50 мМ Трис, рН 7.4, 0.15 М №С1, и 1 мМ фенилметансульфонилфторида. После гомогенизации полученные образцы жидкой массы центрифугировали при 20000 д в течение 20 мин при 4°С, и полученные прозрачные сырые экстракты (супернатанты) оставляли для анализа. Суммарное содержание белка в прозрачных сырых экстрактах определяли методом Бредфорда (Βίο-Кай, ^гсикв, СА), стандарт - бычий сывороточный альбумин.
5. Эксклюзионная хроматография экстрактов белка.
Колонки для эксклюзионной хроматографии (ЭХ) заполняли 32 мл фазы 8ерЬасгу1™ 8-500 высокого разрешения (8-500 11К : ОЕ 11еа1111саге. Упсала, Швеция, Са1. Νο. 17-0613-10) и приводили в равновесие с буфером/подвижной фазой (50 мМ Трис рН 8, 150 мМ \аС1). 1.5 мл сырого экстракта белка наносили на колонку, после чего элюировали 45 мл буфера/подвижной фазы. Элюат собирали в виде фракций объемом по 1.5 мл. Относительное содержание белка в элюированных фракциях контролировали, смешивая 10 мкл фракции с 200 мкл разбавленного реагента-красителя на белок Βίο-Кай (Βίο-Кай, ^шикз, СА). Колонку промывали двукратным объемом 0.2 Ν №ΟΗ (по отношению к объему колонки), а затем десятикратным объемом смеси 50 мМ Трис рН 8, 150 мМ №С1, 20% этанол. После каждого разделения проводили градуировку колонки красителем декстран голубой 2000 (ОЕ 11еа11Ксаге Βΐο-15 8с1епсе Согр., Р18са1а^ау, ΝΙ, США). Профили элюирования декстрана голубого 2000 и растворимых белков хозяина при каждом разделении сравнивали для обеспечения однородности профилей элюирования для каждой из используемых колонок.
6. Анализ белка методом иммуноблоттинга.
Концентрацию белков определяли методом анализа с БСА (Р1егсе ВюсЬетюаЦ Кοскрο^ΐ ГЬ). Белки разделяли электрофорезом на ДДС-Ыа-ПААГ в восстанавливающих условиях и окрашивали кумасси синим. Окрашенные гели исследовали и проводили денситометрический анализ с применением программного обеспечения Инаде.! 8οί'ΐ^а^е (ΝΙΗ).
Белки из элюированных хроматографических фракций осаждали ацетоном (Βο1^ с соавт., 1996), повторно суспендировали в 1/5 объема буфера/ подвижной фазы, разделяли электрофорезом на ДДС-ЫаПААГ в восстанавливающих условиях и переносили методом электроблоттинга на поливинидендифторидные (ПВДФ) мембраны (Клсйе ^^адηο8ΐ^С8 Сο^рο^аΐ^οп, ^^^ρο^δ, ΙΝ) для иммунологического анализа. Перед иммуноблоттингом мембраны выдерживали в 5%-ном молоке и 0.1% Твин-20 в солевом растворе Трис буфера (ΤΒ8-Τ) в течение 16-18 ч при 4°С.
Иммуноблоттинг проводили инкубированием с подходящим антителом (табл. 6) в 2 мкг/мл 2% молока в буфере ΤΒ8-Твин 20 0.1%. Вторичные антитела, использованные для хемилюминесцентного обнаружения перечислены в табл. 4, они были разбавлены, как указано, в 2% молоке в ΤΒ8-Твин 200.1 %. Иммунореактивные комплексы обнаруживали на основе хемилюминесценции в присутствии субстрата люминола (Εοο^ ^^адηο8ΐ^С8 Сο^ρο^аΐ^οп). Конъюгацию пероксидазы хрена с антителом ГО человека проводили с помощью набора ΕΖ-Тшк Р1из® Асйуа1ей РегохШазе (Р1егсе, Кοскί'ο^й, Ш).
Таблица 6. Условия электрофореза, антитела и разбавление для иммуноблоттинга белков, полученных экспрессией
ПОДТИП ГА Штамм вируса гриппа Условия электрофореза Первичное антитело Разбав- ление Вторичное антитело Разбавление
Н1 А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) восстанавливающие РП 10-150 4 мкг/мл козьи к мышиным антигенам (ЛК 115- 035-146) 1:100
Н1 А/Соломоновы острова/3/2006 (Η1Ν1) восстанавливающие МВ8С 07/104 1:2000 кроличьи к антигенам овцы (ЛК 313-035045) 1:100
Н1 А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) восстанавливающие РП 10-150 4 мкг/мл КОЗЬИ к мышиным антигенам 1:100
- 38 018206
Н2 А/Сингапур/1/57 (Η2Ν2) невосстанавливающие ΝΙΒδΟ 00/440 1:1000 (ЛК 115-035- 146) кроличьи к антигенам овцы (ЛК 313-035045) 1:100
Н5 А/Индонезия/5/200 5 (Η5Ν1) восстанавливающие 1ТС 1Т-003-005У 1:4000 козьи к антигенам кролика (ЛК 111-035- 144) 1:100
Н5 А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) восстанавливающие ΝΙΒδΟ 07/338 1:750 кроличьи к антигенам овцы (ЛК 313-035 -045) 1:100
Н5 А/Вьетнам/1194/20 0 4(Η5Ν1) невосстанавливающие 1ТС ΙΤ-003-005 1:2000 козьи к антигенам кролика (ЛК 111-035 -144) 1:100
Н6 А/дикие утки/Г онконгАУЗ 12 /97 (Η6Ν1) невосстанавливающие ΒΕΙ ΝΚ 663 1:500 кроличьи к антигенам овцы (ЛК 313-035045) 1:100
Н9 А/ Гонконг/1073/99 (Η9Ν2) восстанавливающие ΝΙΒδΟ 07/146 1:1000 кроличьи к антигенам овцы (ЛК 313-035045) 1:10 000
ΡΙΙ: Р1^дега1б 1пбиз1пез 1п1егпайопа1, Конкорд, Миннесота, США; М8В1С: Х'аВошИ 1пз111и1е Гог Вю1од1са1 81апбагбз апб Соп1го1; ЛК: 1аскзоп 1ттипоКезеагсй, Вест-Грув, Пенсильвания, США; ВЕШК: ВюбеГепзе апб етегдтд тГесйопз гезеагсй гезоигсез герозйогу; 1ТС: 1ттипе Тес1по1оду Согрогайоп, Вудсайд, Нью-Йорк, США.
Определение гемагглютинации Н5 основано на способе, описанном Х'ауак апб Ке1с11 (2004). Кратко, готовили серию последовательных разбавлений испытуемых проб (100 мкл) 1 : 1 в У-образных 96луночных планшетах для микротитрования, содержащих 100 мкл солевого фосфатного буфера (РВ8), оставляя 100 мкл разбавленного образца в каждой лунке. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0.25%-ной суспензии эритроцитов индейки (Вю Ыпк 1пс., 8угасизе, ΝΥ) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Обратную величину наибольшего разбавления, при котором происходила полная гемагглютинация, записывали как активность ГА. Параллельно разбавляли в РВ8 стандарт рекомбинантного ГА (А/Вьетнам/1203/2004 Η5Ν1) (Рго1ет 8с1епсе СогрогаЦоп, Мериден, СТ) и помещали на каждый планшет в качестве контрольного образца.
7. Ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы.
По 1 мл фракций 9, 10 и 11, полученных при гель-хроматографии Н5-содержащей биомассы, объединяли, помещали в градиент плотности сахарозы 20-60% (мас./об.) и центрифугировали в течение 17.5 ч при 125000 д (4°С). Градиент фракционировали на 19 фракций объемом 3 мл, начиная с верхней фракции, и диализом удаляли сахарозу перед проведением иммунологического анализа и анализа гемагглютинации.
8. Электронная микроскопия.
Фракции, полученные при эксклюзионной хроматографии и предназначенные для исследования под электронным микроскопом (ЭМ), концентрировали на установке ультрафильтрации 30 М\С0 (М11йроге, ВШепса, Миннесота, США), затем фиксировали в буфере РВ8 рН 7.4, содержащем 2% глутарового альдегида, в течение 24 ч при 4°С. После фиксации образцы адсорбировали на покрытых формваром никелевых сетках 200 меш (Сапетсо, Лэйкфилд, Канада) в течение 2 мин, после чего сетки дважды промывали деионизированной водой, а затем окрашивали 1% фосфорновольфрамовой кислотой. Наблюдение проводили методом просвечивающей электронной микроскопии при увеличении от 10000Х до 150000Х (для микрофотографий, приведенных на фиг. 4А и 4В).
В качестве альтернативы 100 мкл образцов для микроскопического исследования помещали в ультрацентрифугу с воздушным приводом (Весктап 1пз1гитеп1з, Ра1о А11о, Калифорния, США). Сетку помещали на дно пробирки, которую центрифугировали в течение 5 мин при 120000 д. Сетку вынимали, осторожно сушили и помещали на каплю 3%-ной фосфорновольфрамовой кислоты при рН 6 для окрашивания. Сетки исследовали м помощью просвечивающего электронного микроскопа Ηΐ3.ο1 7100 (микрофотографии приведены на фиг. 14В, 15В и 15С).
Для получения микрофотографий фиг. 19, фрагменты листа размером около 1 мм3 фиксировали буфером РВ8, содержащим 2.5% глутарового альдегида, и промывали РВ8, содержащим 3% сахарозы, а
- 39 018206 затем дофиксировали 1.33%-ным тетраоксидом осмия. Фиксированные образцы заключали в смолу 8ригг и ультратонкие пленки помещали на сетку. Перед исследованием образцы окрашивали 5%-ным раствором уранил-ацетата и 0.2%-ным раствором цитрата свинца. Сетки исследовали под просвечивающим электронным микроскопом ΗίΙηΟιί 7100.
9. Анализ липидов плазматической мембраны.
Плазматические мембраны (ПМ) получали из листьев табака и клетки ΒΥ2 культивировали после фракционирования, как описано Мопдгапб с соавт., распределяя их в водно-полимерной двухфазной системе, содержащей полиэтиленгликоль 3350/декстран Т-20 500 (по 6.6%). Все стадии проводили при 4°С.
Липиды экстрагировали из разных фракций и очищали по методу Блая и Дайера Полярные и нейтральные липиды разделяли одномерной высокоэффективной ТСХ с системами растворителей, описанными БеГеЬуге с соавт. Липиды фракций ПМ обнаруживали после окрашивания ацетатом меди, как описано в работе Маса1а с соавт. Липиды идентифицировали сравнением их времени миграции со стандартом (все стандарты были получены от фирмы Бгдта^бпсй, Сент-Луис, Миссури, США, кроме 8С, который был получен от Ма1геуа, Плезант Гэп, Пенсильвания, США).
10. Очистка ВЧ Н5.
Замороженные инфильтрованные 660 листья растения Ν. ЬегИйапнапа гомогенизировали в 1.5 объемах 50 мМ Трис рН 8, 150 мМ №1С1 и 0.04% метабисульфита натрия с помощью в коммерческого блендера. К полученному экстракту добавляли 1 мМ фенилметансульфонилфторида (ФМСФ). Величину рН приводили к 6 добавлением 1 М уксусной кислоты, после чего нагревали при 42°С в течение 5 мин. К термообработанному экстракту прибавляли диатомовую землю (ДЗ) для удаления примесей, осажденных при сдвиге рН и термообработке, и полученную массу фильтровали через ватмановский бумажный фильтр. Полученный прозрачный экстракт центрифугировали при 10000 д в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления остатков ДЗ, пропускали через фильтры Αс^оρаск 20 0.8/0.2 мкм и наносили на колонку для аффинной хроматографии с фетуин-агарозой (8^дта-Α1б^^с11. Сент-Луис, Миссури, США). После стадии промывки в 400 мМ №С1, 25 мМ Трис рН 6, связанные белки элюировали 1.5 М №С1, 50 мМ МЭС рН 6. К элюированным ВЧ добавляли Твин-80 до концентрации 0.0005 об. %. Полученные ВЧ концентрировали на мембране МУСО Αт^соη 100 кДа, центрифугировали при 10000 д в течение 30 мин при 4°С и повторно суспендировали в буфере РВ8 с рН 7.4, содержащем 0.01% Твин-80 и 0.01% тимерозала. Суспендированные ВЧ стерилизовали фильтрацией перед использованием.
11. Испытание на животных.
Мыши.
Для исследования иммунного ответа на введение ВЧ вируса гриппа брали самок мышей линии ΒΑ^Β/с (Сйаг1ек Кгуег ЬаЬога1опек) возрастом 6-8 недель. Семьдесят мышей случайным образом делили на 14 групп по пять животных в каждой. В восьми группах проводили внутримышечную иммунизацию, а в шести группах - интраназальную. Во всех группах иммунизацию проводили по двухдозовой схеме, причем дополнительную дозу вводили через три недели после первой.
При внутримышечной иммунизации в задние ноги мышей без анестезии вводили либо полученную в растении вакцину ВЧ Н5 (0.1, 1, 5 или 12 мкг) или контроль — антиген гемагглютинин (ГА). Контрольный ГА содержал рекомбинантный растворимый гемагглютинин, полученный на основе штамма А/Индонезия/5/05 Η5Ν1 очищенный от культуры клеток 293 Цтшипе Тесйпо1оду Согр., Нью-Йорк, США) (применяли 5 мкг на 1 инъекцию, если не указано иначе). Буфер для контроля представлял собой РВ8. Данный антиген состоит из аминокислот 18-530 белка ГА и имеет И|к-1ад и модифицированный сайт расщепления. Исследованием с помощью электронного микроскопа было подтверждено, что данный товарный продукт не находится в форме ВЧ.
Для определения влияния адъюванта две группы животных вакцинировали 5 мкг полученной в растении вакцины ВЧ Н5 плюс один объем 2% А1-гидрогеля (квасцы, Α^ιπη^ С11е1шса1 & 8с1еп11Пс Согрогайоп, ХУеЧЬигу, ΝΥ, И8) или 5 мкг рекомбинантного гемагглютинина, очищенного от культуры клеток 293, плюс 1 объем квасцов. Семьдесят мышей случайным образом делили на 14 групп по пять животных в каждой. В восьми группах проводили внутримышечную иммунизацию, а в шести группах - интраназальную. Во всех группах иммунизацию проводили по двухдозовой схеме, причем дополнительную дозу вводили через три недели после первой.
При внутримышечной иммунизации в задние ноги мышей без анестезии вводили либо полученную в растении вакцину ВЧ Н5 (0,1, 1, 5 или 12 мкг) или контроль - антиген гемагглютинин (ГА) (5 мкг) или РВ8. Перед иммунизацией все препараты антигена смешивали с 1% А1-гидрогеля (квасцы, Α^ΐ-ΐηΝ С11е1шса1 & 8с1еп11Пс Согрогайоп, Вестбери, Нью-Йорк, США) в отношении 1:1. Для измерения влияния адъюванта двум группам животных вводили либо 5 мкг полученной в растении вакцины ВЧ Н5 либо 5 мкг контроля - антигена ГА без адъюванта.
При интраназальном введении мыши получали кратковременную анестезию вдыханием изофлурана в автоматической индукционной камере. После чего проводили иммунизацию введением в каждую ноздрю 4 мкл полученной в растении ВЧ-вакцины (0.1 или 1 мкг), или контроля - антигена ГА (1 мкг), или РВ8. Перед иммунизацией все препараты антигена были смешаны с 1% хитозан глутамата (Рго1окап, №уатайгх/ РМС ВюРо1утег, Норвегия). Затем мыши вдыхали полученные растворы. Для оценки влияния
- 40 018206 адъюванта при интраназальном пути введения двум группам животных проводили иммунизацию 1 мкг полученной в растении вакцины ВЧ Н5 или 1 мкг контроля - антигена ГА.
Хорьки.
Для испытания брали десять групп по 5 хорьков (самцы, возраста 18-24 недели, массой около 1 кг). Обработка для каждой группы приведена в табл. 7. В качестве адъюванта применяли А1-гидрогель (квасцы) (8ирег&8 В|озес1ог, Дания), 2% (окончательно=1%). В состав вакцины входили мембраноассоциированные ВЧ штамма А/Индонезия/5/05 (Н5М), подученные как описано в настоящем документе. Контрольная вакцина (положительный контроль) представляла собой полностью гликозилированный связанный с мембраной рекомбинантный Н5 из штамма Индонезия, полученный с помощью аденовируса в культуре клеток 293 компанией 1ттипе Тесйпо1оду СогрогаРоп (1ТС).
Таблица 7. Испытуемые группы группа
Продукт, введенный животным
буфер РВ8 (отрицательный контроль) _____испытуемая вакцина, 1 мкг_____ _____испытуемая вакцина, 1 мкг_____ _____испытуемая вакцина, 5 мкг_____ _____испытуемая вакцина, 5 мкг испытуемая вакцина, 7.5 мкг испытуемая вакцина, 15 мкг испытуемая вакцина, 15 мкг испытуемая вакцина, 30 мкг вакцина-контроль, 5 мкг
Способ введения в.м.* в.м. в.м. в.м. в.м. в.м. в.м. в.м. в.м. в.м.
адъювант квасцы квасцы квасцы
в.м.: внутримышечно, п - количество
В ходе испытаний регулярно оценивали общее состояние и внешний вид хорьков (массу тела, ректальную температуру, позу, мех, траектории перемещения, дыхание, помёт). Животные получали внутримышечные инъекции (общий объем 0.5-1.0) в четырехглавую мышцу на 0, 14 и 28-й день; для схем, включающих адъювант, вакцину смешивали с А1-гидрогелем в отношении 1 : 1 по объему непосредственно перед иммунизацией). Образцы сыворотки получали на 0-й день перед иммунизацией и на 21-й и 35-й день. Животных забивали (обескровливание/сердечная пункция) на 40-45-й день, проводили вскрытие и вынимали селезенку.
Титры антител против вируса гриппа можно определить твердофазным ИФА с помощью гомо- или гетерологичных инактивированных вирусов Н5N1.
Титры ингибирования гемагглютинации образцов сыворотки (до вакцинации, 21-й день, 35-й день) оценивали методом микротитрования НА1 как описано в работе (Аутагб с соавт. 1973). Кратко: сыворотки предварительно обрабатывали рецептор-разрушающим ферментом, термически инактивировали и смешивали с суспензией эритроцитов (отмытые красные кровяные клетки). Рекомендуются отмытые эритроциты лошади (10%) производства компании Ьатрпе. Учитывая, что результаты анализа могут различаться в зависимости от источника эритроцитов (в зависимости от лошади), испытывали отмытые эритроциты от 10 лошадей и выбирали наиболее чувствительную партию. В качестве альтернативы возможно применение эритроцитов индейки. Титы антител выражали как обратную величину наибольшего разбавления, при котором гемагглютинация полностью ингибируется.
Титры перекрестного ответа НА1: титры НА1 хорьков, привитых вакциной против штамма А/Индонезия/5/05 (клада 2.1) определяли с помощью инактивированных штаммов Н5М из другой субклады или клады, например, штаммов клады 1 Вьетнам: А/Вьетнам/1203/2004 и А/Вьетнам/1194/2004 или А/Аньхой/01/2005 (субклада 2.3) или А/индейки/Турция/1/05 (субклада 2.2). Все анализы проводили на индивидуальных образцах.
Анализ полученных данных: статистический дисперсионный анализ (ΑN0VΑ) проводят для всех полученных данных с целью выяснения, являются ли обнаруженные различия статистически значимыми.
Методика эксперимента по летальному инфицированию (мыши).
Сто двадцать восемь мышей случайным образом делили на 16 групп по восемь животных в каждой, при этом одна группа не получала ни прививки, ни инфицирования (отрицательный контроль). Все группы прививали внутримышечно по двухдозовой схеме, причем дополнительную дозу вводили через две недели после первой.
При внутримышечной иммунизации в задние ноги мышей без анестезии вводили либо полученную в растении вакцину ВЧ Н5 (1, 5 или 15 мкг) или контроль (15 мкг) - антиген гемагглютинин (ГА) или РВ8. Перед иммунизацией все препараты антигена смешивали в объемном отношении 1 : 1 с 1% А1гидрогелем (квасцы, Ассига1е Сйет1са1 & 8с1епбйс СогрогаЧоп, Вестбери, Нью-Йорк, США).
В период иммунизации мышей взвешивали один раз в неделю и осматривали место укола для обнаружения местной реакции.
Через двадцать два дня после второй иммунизации мыши получали анестезию и интраназально (и.н) проводили их контрольное заражение в лаборатории системной защиты В1.4 (Р4-1еап Мепеих
- 41 018206
ΙΝ8ΕΚΜ, Лион, Франция) дозой 4,09 х 106 50%-ной клеточной культуры (ССГО50) вируса гриппа А/Турция/5 82/06 (любезно предоставленной Др. БруноЛина, Лионский Университет, Лион, Франция). После заражения, вели наблюдение за мышами для обнаружения клинических симптомов и ежедневно взвешивали в течение четырнадцати суток. Мышей с тяжелыми симптомами инфекции и с потерей массы более >25% усыпляли под анестезией.
Сбор крови, смывы из легких и из носа и сбор селезенок.
Сбор крови из подкожной вены на ноге проводили через четырнадцать суток после первой иммунизации и через четырнадцать суток после повторной иммунизации, сделанной без анестезии. Сыворотку собирали центрифугированием при 8000 г в течение 10 мин.
Через четыре недели после второй иммунизации мышам давали наркоз газообразным СО2 и сразу после окончания, проводили сердечную пункцию для сбора крови.
После забора крови, вводили катетер в трахею в направлении легких и в шприц малой емкости, присоединенный к катетеру, помещали один мл холодного раствора РВ8-смесь ингибиторов протеаз и вводили его в легкие, а затем удаляли для анализа. Указанную процедуру промывки повторяли дважды. Смывы из легких центрифугировали для удаления продуктов распада клеток. Для получения смывов из носа катетер направляли в область носа и 0,5 мл раствора РВ8-смесь ингибиторов протеаз впрыскивали через катетер в носовой ход, а затем собирали. Смывы из носа центрифугировали для удаления продуктов распада клеток. Сбор селезенок осуществляли у мышей, получивших внутримышечную иммунизацию 5 мкг полученной в растении вакциной с адъювантом или 5 мкг рекомбинантного антигена Н5 с адъювантом, а также у мышей, получивших интраназальную иммунизацию 1 мкг полученной в растении вакцины с адъювантом или 1 мкг рекомбинантного антигена Н5 с адъювантом. Собранные селезенки помещали в среду ΚΡΜΙ с добавлением гентамицина и измельчали в конической пробирке объемом 50 мл с фиксатором шприца на 10 мл. Измельченные селезенки дважды промывали и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин и повторно суспендировали в буфере для лизиса АСК в течение 5 мин при комнатной температуре. Спленоциты промывали смесью РВ8-гентамицин, повторно суспендировали в 5%-ной среде ΚΡΜΙ и считали. Спленоциты служили для анализа пролиферации.
Титры антител.
Титры антител к вирусу гриппу в сыворотках определяли на 14-й день после первой иммунизации, а также на 14-й и 28-й день после второй иммунизации. Титы определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием инактивированного вируса А/Индонезия/5/05 в качестве антигена покрытия. Конечные титры выражали в виде обратной величины наибольшего разбавления, при котором величина оптической плотности была хотя бы на 0,1 выше, чем в образцах отрицательного контроля.
Для определения класса антител (1§С1, 1дС2а. 1§С2Ь. 1дС3, 1дМ) оценивали титры методом тИФА, как описано ранее.
Титры ингибирования гемагглютинации (Н1).
Титры ингибирования гемагглютинации (Н1) сывороток определяли на 14-й и 28-й день после второй иммунизации, как описано ранее (\УНО 2002; Кепба1 1982). Для тестирования образцов мышиной сыворотки на активность Н1 использовали инактивированные вирусы штаммов А/Индонезия/5/05 или А/Вьетнам/1203/2004. Предварительно сыворотки обрабатывали рецептор-разрушающим ферментом II (КИЕ II) (Иепка 8е1кеп Со., Токио, Япония), полученным из У1Ьпо сйо1етае (Кепба1 1982). Измерение Н1 проводили с 0,5% эритроцитами индейки. Титры антител Н1 выражали в виде обратной величины наибольшего разбавления, при котором наблюдалось полное ингибирование агглютинации.
Примеры
Пример 1. Временная экспрессия гемагглютинина вируса гриппа А/Индонезия/5/05 (Н5№) при агроинфильтрации в растения Ν. ВепФапиапа.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинин вируса гриппа определяли при экспрессии подтипа Н5 штамма А/Индонезия/5/05 (№N1). Как показано на фиг. 11, кодирующая последовательность гена гемагглютинина (входящий #ЕБ541394) с нативным сигнальным пептидом и трансмембранным доменом была сначала собрана в экспрессирующей кассете пластоцианина - промотор, 5'НТО, 3'НТО и последовательность терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны - и собранную кассету (660) помещали в бинарную плазмиду рСАМВХ. Указанную плазмиду трансфецировали в АдгоЬас1ег1пш (АСЬ1), создавая рекомбинантный штамм АСБ1/660, который и использовали для временной экспрессии.
Проводили инфильтрацию растения Ν. ЬепФапнапа АСШ/660, и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления Н5 в агроинфильтрованных листьях, белки сначала экстрагировали из ткани инфильтрованных листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с поликлональными антителами против Н5 (Вьетнам). В экстрактах обнаруживалась единственная полоса около 72 кДа (на фиг. 12), что соответствует по размеру нерасщепленной форме ГА0 гемагглютинина вируса гриппа. Товарный Н5, служивший положительным контролем (А/Вьетнам/1203/2004; Рго1еш 8с1епсе Согр., Мериден, Коннектикут, США), давал две полосы около 48 и 28 кДа, что соответствует молярной массе фрагментов ГА1 и ГА2. Таким образом, экспрессия Н5 в инфильтрованных листьях приводит
- 42 018206 к накоплению нерасщепленного продукта трансляции.
Образование активных тримеров ГА было показано по способности сырых экстрактов белка из АОЫ/660-трансформированных листьев агглютинировать эритроциты индейки (данные не показаны).
Пример 2. Исследование гемагглютинин-содержащих структур в экстрактах растений методом экслюзионной хроматографии.
Организацию полученного в растении гемагглютинина вируса гриппа в высокомолекулярные структуры оценивали методом гель-хроматографии. Сырые экстракты белка из АОЬ1/660-инфильтрованного растения (1.5 мл) фракционировали методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ) на колонках высокого разрешения с 8ерЬасгу1™ 8-500 (ОЕ ^аИксаю Вю-8с1епсе Согр., Пискатавэй, Нью-Йорк, США). В элюированных фракциях определяли общее содержание белка и содержание ГА методом иммунологического анализа с помощью антител против ГА (на фиг. 13А). Как видно на фиг. 13А, голубой декстран (2 МДа) содержался уже во фракции 10, а основная масса белков-хозяев оставалась в колонке и выходила между фракциями 14 и 22. При (пятикратном) концентрировании белков из 200 мкг каждой фракции ЭХ осаждением ацетоном и анализе их методом вестерн-блоттинга (На фиг. 15А, Н5), гемагглютинин (Н5) был обнаружен в основном о фракциях 9-14 (на фиг. 13В). Не желая ограничиваться конкретной теорией, можно предположить, что белок ГА либо организован в крупную сверхструктуру или присоединен к высокомолекулярной структуре.
Вторую экспрессирующую кассету собирали с последовательностью нуклеиновой кислоты Η1 из штамма А/Новая Каледония/20/99 (Η1Ν1) (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 33; фиг. 16; ОепВапк входящий №. ΑΥ289929), что давало конструкцию 540 (фиг. 11). Химерную конструкцию конструировали так, чтобы получить растворимый тример Η1, где сигнальный пептид происходил из гена протеиндисульфидизомеразы, а трансмембранный домен Η1 был заменен вариантом рП лейциновой молнии ΟΟΝ4 - пептидом, который самоорганизуется в тримеры (ΗηΛιηΎ с соавт., 1993) (кассета 544, фиг. 11). Несмотря на отсутствие трансмембранного домена, данная растворимая тримерная форма оказалась способна к гемагглютинации (данные не показаны).
Экстракты белка из растений, инфильтрованных АОЫ/540 или АОЫ/544, фракционировали методом ЭХ и фракции Η1 исследовали методом вестерн-блоттинга с антителами против вируса гриппа А (ЕйхдегаШ, Конкорд, Миннесота, США). В листьях, инфильтрованных АОЫ/540, Η1 преимущественно накапливался в виде высокомолекулярной структуры, при этом пик был скошен к структурам меньшего размера (Η1; фиг. 13С). В листьях, инфильтрованных АОЫ/544, растворимая форма Η1 в основном накапливалась в виде изолированных тримеров, по данным гель хроматографии, которые совпадают с профилями элюирования белка-хозяина (растворимый Η1; фиг. 13Ό). При этом розеточный Η1 (Ргогеш 8с1епсе Согр., Мериден, Коннектикут, США), состоящий из мицелл, включающий 5-6 тримеров гемагглютинина , элюированных как фракции 12-16 (фиг. 13Е), ранее чем растворимая форма Η1 (фиг. 13Ό), но позже, чем нативный Η1 (фиг. 13С).
Для оценки влияния коэкспрессии Μ1 на организацию гемагглютинина в структуры, собирали экспрессирующую кассету Μ1 с нуклеиновой кислотой, соответствующей кодирующей последовательности А/РК./8/34 (Η1Ν1) Μ1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 35; фиг. 18; ОепВапк, входящий №. Ν^002016). Конструкция получила номер 750, она представлена на фиг. 11. Для коэкспрессии М1и Η1 суспензии АОЫ/540 и АОЫ/750 смешивали перед инфильтрацией в равных объемах. Совместная инфильтрация суспензий АдгоЬасгегшш позволяет проводить коэкспрессию многих трансгенов. Вестерн-блот-анализ фракций ЭХ показывает, что коэкспрессия Μ1 не меняет профиль элюирования структур Η1, но снижает уровень накопления Η1 в листьях после агроинфильтрации (см. фиг. 13Е).
Пример 3. Выделение структур Н5 центрифугированием в градиенте сахарозы и исследование под электронным микроскопом.
Для исследования структуры гемагглютинина под электронным микроскопом (ЭМ) требуется более высокая концентрация и уровень очистки, чем можно получить в результате ЭХ сырых экстрактов белка из листьев. С целью исследования структур Н5 с помощью ЭМ, сырой экстракт белка из листьев концентрировали осаждением ПЭГ (20% ПЭГ), затем повторно суспендировали в 1/10 объема буфера для экстракции. Концентрированный экстракт белка фракционировали с помощью гель хроматографии на 8-500 ΗΒ, и фракции 9, 10 и 11 (в соответствии со свободным объёмом колонки) объединяли и далее отделяли от белков-хозяев ультрацентрифугированием на 20-60%-ном градиенте плотности сахарозы. Градиент плотности сахарозы фракционировали начиная с верхней фракции, и полученные фракции перед проведением анализа, диализовали и концентрировали на центробежном фильтре 100 ИМАЬ. Как показывают результаты Вестерн-блот-анализа и исследования гемагглютинации (фиг. 14А), Н5 в основном накапливались во фракциях 16-19, где содержалось около 60% сахарозы, а основное количество белка-хозяина оказалось во фракции 13. Фракции 17, 18 и 19 объединяли, негативно окрашивали и исследовали под ЭМ. В образце отчетливо наблюдались структуры сферической формы с зазубренными краями размером от 80 до 300 нм, которые по морфологическим характеристикам соответствовали ВЧ вируса гриппа (фиг. 14В).
Пример 4. Очистка ВЧ вируса гриппа Н5 из растительной биомассы.
Помимо значительного содержания растворимого белка, экстракты из листьев растений содержат
- 43 018206 сложную смесь растворимых сахаров, нуклеиновые кислоты и липиды. Сырой экстракт осветляли сдвигом рН и термической обработкой с последующей фильтрацией через диатомовую землю (более подробное описания метода осветления приведено в разделе Материалы и методы). На фиг. 15А (дорожки 1-4) представлен окрашенный кумасси синим гель, показывающий содержание белка на различных стадиях процесса осветления. Сравнение содержания белка в сыром экстракте (дорожка 1) и в осветленном экстракте (дорожка 4) показывает способность стадий процесса осветления снижать суммарное содержание белка и удалять большую часть основной примеси, которая наблюдается в сыром экстракте из листьев при 50 кДа. Полоса при 50 кДа относится к большой субъединице ΗιιΒίδίΌ. к которой относится до 30% суммарного белка листьев.
Из осветленных экстрактов выделяли ВЧ Н5 вируса гриппа методом аффинной хроматографии на колонке с фетуином. Сравнение фракции, помещенной на колонку (на фиг. 15А, дорожка 5), с промытыми (на фиг. 15А, дорожка 6) и элюированными ВЧ (фиг. 15А, дорожка 7) показывает специфичность колонки для аффинной хроматографии с фетуином в отношении ВЧ Н5 вируса гриппа в осветленном растительном экстракте.
В результате процесса очистки достигается чистота Н5 более 75% по данным денситометрии на ДДСNа/ПААГ геле, окрашенным кумасси синим (фиг. 15А, дорожка 7). Для оценки структурного качества очищенного продукта очищенный Н5 концентрировали на центробежном фильтре 100 ХМ\УЕ (номинальный предел молекулярной массы), после чего исследовали под ЭМ после негативного окрашивания. На фиг. 15В приведен репрезентативный участок, на котором видно присутствие большого количества ВЧ. Более тщательное исследование показывает наличие выступов на ВЧ (фиг. 15С).
Как показано на фиг. 15Ό, ВЧ Н5 из осветленного экстракта очищали до достижения приблизительно 89%-ной чистоты методом аффинной хроматографии на колонке с фетуином, на основе плотности окрашенного синим гемагглютинина Н5 и на определении суммарного содержания белка методом с бицинхониновой кислотой (ВСА).
Биологическую активность ВЧ Г А подтверждали по их способности агглютинировать эритроциты индейки (данные не приведены).
Данные фиг. 20В подтверждают идентичность очищенных ВЧ, визуализованных методом вестернблоттинга и иммунологического анализа с поликлональной сывороткой против Н5 (А/Вьетнам/ 1203/2004). Обнаруживается единственная полоса около 72 кДа, соответствующая по величине нерасщепленной форме ГА0 гемагглютинина вируса гриппа. На фиг. 15С приведено строение вакцины как ВЧ с покрывающими ее гемагглютининновыми выступами.
ВЧ вводили в состав рецептуры для иммунизации мышей путем фильтрации через фильтр с размером отверстий 0,22 мкм; содержание эндотоксина определяли с помощью набора для ЬАЬ-теста (лизат амебоцитов Лимулюс) на эндотоксины (Ьопха, ^а1к5егу111е, М8, США). Фильтрованная вакцина содержала 105,8 ± 11,6% ЭдЕ/мл (эндотоксиновых единиц/мл).
Пример 5. Локализация ВЧ вируса гриппа в растениях.
Для локализации ВЧ и подтверждения их образования из плазматической мембраны, готовили тонкие срезы листьев Н5-продуцирующих растений и исследовали их методом ПЭМ после положительного окрашивания. Исследование клеток листьев указывает на наличие ВЧ во внеклеточных кавернах, образованных при втягивании плазматической мембраны (фиг. 19). Форма и расположение наблюдаемых ВЧ показывают, что несмотря на аппозицию плазматических мембран на стенке клетки, клетки растения обладают достаточной пластичностью для продуцирования ВЧ вируса гриппа из своей плазматической мембраны и накопления их в апопластическом пространстве.
Пример 6. Анализ липидов плазматической мембраны.
Дальнейшее подтверждение состава и происхождения ВЧ вируса гриппа в растениях было получено из анализа содержания липидов. Липиды экстрагировали из очищенных ВЧ и их состав сравнивали с составом липидов высоко очищенной плазматической мембраны табака методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭ-ТСХ). Траектории миграции полярных и нейтральных липидов из ВЧ и контрольных плазматических мембран были аналогичны. Очищенные ВЧ содержали основные фосфолипиды (фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин) и сфинголипиды (гликозил-церамид), присутствующие в плазматической мембране (фиг. 27А), а также в обоих случаях обнаружены свободные стерины как единственный вид нейтральных липидов (фиг. 27В). Однако иммунологический анализ белкамаркера плазматической мембраны (АТФаза) в экстрактах очищенных ВЧ показал, что липидный бислой ВЧ не содержит одного из основных белков, ассоциированного с плазматическими мембранами растений, что позволяет предположить, что белки-хозяева могли уйти из мембран в ходе почкования ВЧ из клеток растения (фиг. 27С).
Пример 7. Иммуногенность ВЧ Н5 и роль способа введения.
Мышам вводили полученные в растении ВЧ Н5 путем внутримышечной инъекции или интраназальной ингаляции. Внутримышечно вводили от 0,1 до 12 мкг ВЧ с квасцами в качестве адъюванта в соответствии с описанными способами. Максимальные титры антител наблюдали при минимальном количестве антигена, той же величины, что и в случае 5 мкг рекомбинантного растворимого гемагглютинина (ГА) (фиг. 20А).
- 44 018206
От 0,1 до 1 мкг полученных в растении ВЧ Н5 вводили интраназально с хитозаном в качестве адъюванта, получая более значительный гуморальный иммунный ответ, чем для рекомбинантного растворимого ГА с адъювантом - квасцами (фиг. 20В).
При обоих способах введения и во всем интервале количества антигена сероконверсию наблюдали для всех мышей. Рекомбинантный растворимый Н5 антиген вызывал низкий (<1/40) или пренебрежимо малый (1<1/10 в случае рекомбинантных Н5 без адъюванта) титр Н1.
Пример 8. Титр антител по ингибированию гемагглютинации (НАЦ для ВЧ Н5.
На фиг. 21 А, В показывает гуморальный ответ по ингибированию гемагглютинации (НАЦ через 14 суток после дополнительной иммунизации полученными в растении ВЧ Н5 или рекомбинантным растворимым ГА. Наименьшая доза антигена (0.1 мкг) при внутримышечном введении приводила к более высокому ответу НАЕ чем десятикратная доза (5 мкг) рекомбинантного растворимого ГА. Более высокие дозы ВЧ Н5 приводили к незначительному повышению НАХ по сравнению с минимальной дозой.
Ответ НАI после интраназального введения был значительно выше в случае полученных в растении ВЧ Н5 (1,0 или 0,1 мкг), чем в случае введения 1 мкг рекомбинантного растворимого ГА, где результат был близок к отрицательному контролю. Все мыши, получившие внутримышечную инъекцию ВЧ Н5 (от 0., до 12 мкг) имели более высокие титры НАЕ чем мыши, получившие прививку контрольным антигеном ГА (фиг. 4а - теперь 21 А). Для одной и той же дозы, равной 5 мкг, ВЧ приводили к образованию в 20 раз более высоких титров НАЕ чем такая же доза контрольного антигена ГА. Также ВЧ давали значительно более высокие титры НАI по сравнению с контрольным антигеном Г А при интраназальном введении (фиг. 21Ь). Для определенной дозы ВЧ Н5, уровень титров НА! был ниже в случае мышей, получивших прививку интраназально по сравнению с внутримышечной иммунизацией; 1 мкг ВЧ приводил к среднему титру НАЕ равному 210, при в.м. введении, а та же доза при и.н. введении вызывала ответ титра НАЕ равный 34.
При внутримышечном введении все дозы ВЧ вызывали появление высокого уровня антител, способных связывать гомологичные цельные инактивированные вирусы (фиг. 20Ь и 24). Между вакциной на основе полученных в растении ВЧ и контрольным антигеном ГА не обнаружено значимых различий (не считая группы, получившей 12 мкг ВЧ, через 14 суток после дополнительной прививки), так как оба препарата антигенов приводят к появлению высоких титров антител против гомологичных штаммов. Однако при интраназальном введении ВЧ вызывали образование более высоких титров антител, чем контрольный антиген ГА (фиг. 20Ь). При смешивании с хитозаном иммунизация 1 мкг ВЧ давала обратную величину титра антител 5500, что в 8.6 раз выше, чем уровень, обнаруженный для мышей после иммунизации 1 мкг контрольного антигена ГА (средняя обратная величина тира - 920).
Далее иммуногенность ВЧ вируса гриппа растительного происхождения исследовали при варьировании дозы на мышах. Группы из пяти мышей линии ВАЬВ/с получали внутримышечную прививку двукратно с интервалом в три недели, содержащую 0.1-12 мкг ВЧ, содержащих ГА из штамма А/Индонезия/5/05 (Н5Ю) в смеси с квасцами (1 : 1). Титры ингибирования агглютинации (Н1) измеряли с помощью ценного инактивированного антигена вируса (А/Индонезия/5/05 (Н5Ю)) на сыворотках, собранных через 14 суток после повторной иммунизации. Иммунизация ВЧ в дозах лишь 0.1 мкг индуцировала продукцию антител, которые ингибировали агглютинацию эритроцитов вирусами при большом разбавлении (Фиг. 21 А). Параллельная иммунизация мышей 5 мкг контрольного антигена Н5 (также из А/Индонезия/5/05), не являющегося ВЧ, но содержащего адъювант - квасцы, вызывает ответ Н1, уступающий ответу достигнутому с наиболее низкой дозой ВЧ, на 2-3 логарифмических единицы.
При обоих способах введения и во всем интервале количеств антигена более высокий ответ НА! был получен у мышей, получавших ВЧ.
Пример 9. Влияние адъюванта на иммуногенность ВЧ Н5.
Полученной в растении ВЧ Н5 образован из плазматической мембраны (фиг. 19, пример 5). Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что оболочечные вирусы или ВЧ оболочечных вирусов обычно получают свою оболочку из мембраны, через которую они почкуются. Плазматические мембраны растений содержат фитостериновый комплемент, который редко (если вообще когда-либо) обнаруживается в клетках животных, причем для некоторых из этих стеринов была показана способность проявлять иммуностимулирующее действия.
Полученные в растении ВЧ Н5 вводили мышам внутримышечно (фиг. 22А) или интраназально (фиг. 22В) в присутствии или в отсутствие адъюванта и определяли показатель НАI (гуморальный ответ по подавлению гемагглютинации). ВЧ, введенные с добавлением или без добавления адъюванта (квасцы или хитозан, как в приведенных примерах), в обоих случаях дали существенно более высокие значения ингибирования гемагглютинина НА!, чем рекомбинантный растворимый Г А. Даже в отсутствие добавки адъюванта (т.е. квасцов или хитозана), полученной в растении ВЧ Н5 показал достаточно высокую величину НАЕ указывающую на системный иммунный ответ на введение антигена.
Квасцы повышали средний уровень титров НАI в 5 раз при внутримышечном введении ВЧ (фиг. 22а) и в 3,7 раз для контрольного антигена ГА. После в.м. введения 5 мкг ВЧ, средний титр НА! был в 12 раз выше, чем при введении соответствующей дозы контрольного антигена ГА. Хитозан не изменял средний уровень НАI для контрольного антигена Г А (фиг. 22Ь), но повышал среднюю величину НА! для
- 45 018206 мышей, получивших 1 мкг ВЧ и.н. в пять раз.
Пример 10. Изотипы антител.
Для мышей, которым ввели полученные в растении ВЧ Н5 или рекомбинантный растворимый ГА в присутствии или в отсутствие добавки адъюванта - квасцов, наблюдали изотипов иммуноглобулина (фиг. 23А).
В присутствии добавки адъюванта профили изотипов антител для ВЧ и ГА аналогичны, доминирующим изотипом является 1дС1. При введении ВЧ или ГА без добавки адъюванта ответ 1дС1 снижается, но остается доминирующим изотипом, отвечающим на ВЧ, при этом 1дМ, 1дС2а. 1дС2В и 1дС3 имеют похожие титры, как и в присутствии добавки адъюванта. Титры 1дС1, 1дС2а и 1дС2Ь заметно снижаются при введении ГА без добавки адъюванта.
Таким образом, полученные результаты показывают, что полученной в растении ВЧ не требуют добавки адъюванта для появления гуморального ответа в организме хозяина.
Титры антител против штаммов цельного инактивированного вируса гриппа (А/Индонезия/5/05; А/Вьетнам/1203/04), обнаруженные для мышей, внутримышечно получивших полученные в растении ВЧ или растворимый рекомбинантный ГА в присутствии добавки антигена показаны на фиг. 23В. Не обнаружено значительных различий в титрах антител для этих штаммов гриппа у мышей, получивших 1 мкг или 5 мкг ВЧ или 5 мкг растворимого ГА.
Пример 11. Перекрестный ответ сывороточных антител, индуцированный вакциной на основе ВЧ Н5.
Перекрестный ответ сывороточных антител, индуцированный ВЧ Н5 определяли по отношению к цельным инактивированным вирусам гриппа различных штаммов. Все дозы ВЧ (от 0.1 до 12 мкг) а также доза 5 мкг контрольного антигена ГА приводили к высоким титрам связывающих антител против штамма клады 1 (А/Вьетнам/1194/04), гомологичного штамма А/Индонезия/5/05 клады 2,1 и штамма клады 2.2 А/индейки/Турция/1/05 (фиг. 25А).
Однако только полученные в растении ВЧ приводили к появлению титра НА1 против штаммов А/индейки/Турция/1/05 (фиг. 25Ь). Титры НА1 против А/Индонезия/5/05 для ВЧ были высокими.
Пример 12. Перекрёстный иммунитет при иммунизации полученными в растении ВЧ Н5.
Мышей, которым ранее вводили ВЧ Н5 штамма А/Индонезия/5/05 по двухдозовой схеме, затем подвергали контрольному заражению инфективным вирусом гриппа А/Турция/582/06 (№N1) (Турция Н5Ю) и наблюдали. Введенная доза на 1 животное составляла 10 ЬП50 (4,09х 105ССГО50).
К 7 дню после заражения только 37,5% мышей, получивших контрольную вакцину РВ8, остались живыми после воздействия штамма Турция Н5Ю (фиг. 26А). После введения контрольного антигена (ГА) или 1,5 или 15 мкг ВЧ Н5 Индонезия, 100% животных оставались живыми до 17 суток после заражения, когда эксперимент прекращали.
В ходе эксперимента следили также за массой тела мышей, и строили график средней массы оставшихся живыми мышей (фиг. 26В). Мыши, которым вводили 1,5 или 15 мкг ВЧ Н5 Индонезия до заражения, не теряли массу значительно в ходе эксперимента, и конкретно мыши, получившие 5 мкг ВЧ, набрали массу. Для отрицательного контроля (без заражения штаммом Турция Н5Ю) не обнаружено ни значительного повышения, ни значительной потери массы тела. Для группы мышей положительного контроля (не получивших ВЧ, но зараженных штаммом Турция Н5Ю), наблюдали значительную потерю массы тела в ходе эксперимента, и три из этих мышей умерли. Так как масса тела считалась как средняя величина для всех мышей данной категории, удаление самых больных мышей (три умершие особи) может привести к кажущемуся общему повышению массы, однако, обращает на себя внимание тот факт, что средняя масса тела категории, относящейся к положительному контролю, тем не менее остается значительно ниже этой величины для категории отрицательного контроля или для получивших ВЧ.
Таким образом, полученные результаты показывают, что полученные в растении ВЧ вируса гриппа, включающие вирусный белок гемагглютинин Н5, индуцируют иммунный ответ, специфичный для патогенных штаммов гриппа и что вирусоподобные частицы могут почковаться из плазматической мембраны растения.
Таким образом, полученные результаты показывают, что растения способны продуцировать вирусоподобные частицы вируса гриппа и также впервые показывают, что вирусоподобные частицы могут почковаться из плазматической мембраны растения.
Далее, используя имеющуюся технологию временной экспрессии, первая партия антигена была изготовлена уже через 16 суток после получения последовательности целевого ГА. При существующих выходах ВЧ Н5 и при примерной дозе, равной 5 мкг на 1 объект, каждый килограмм инфильтрованного листа может продуцировать ~20000 доз вакцины. Уникальное сочетание простоты платформы, буферной емкости и высокой иммуногенности обеспечивают, помимо прочих осуществлений, новый вариант ответа в условиях пандемии.
Пример 13. Исследование гемагглютининсодержащих структур в экстрактах растений методом эксклюзионной хроматографии.
Организация гемагглютинина вирусов гриппа различных подтипов, полученных в растении, в высокомолекулярные структуры оценивали методом гель хроматографии. Сырые или концентрированные
- 46 018206 экстракты белков и растений, инфильтрованных АСЫ/660, АСЫ/540, АСЫ/783, АСЫ/780 и АСЫ/785 (1,5 мл), разделяли на фракции методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ) на колонках высокого разрешения с 8ерйасгу1™ 8-500 (СЕ НеаНЬсаге В|о-8с1еисе Согр., Ркса1амау, Нью-Йорк, США). Как показано на фиг. 46, голубой декстран (2 25 МДа) содержался уже во фракции 10. При (пятикратном) концентрировании белков из 200 мкг каждой фракции ЭХ осаждением ацетоном и анализе их вестерн-блоттинг методом (фиг. 46), гемагглютинины были обнаружен в основном во фракциях 7-14, что указывает на внедрение ГА в ВЧ. Не желая ограничиваться конкретной теорией, можно полагать, что белок Г А либо организован в крупную сверхструктуру либо присоединен к высокомолекулярной структуре, независимо от продуцированного подтипа.
Пример 14. Временная экспрессия гемагглютинина сезонного вируса гриппа агроинфильтрацией в растения М ЬеШйатзаиа.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинин сезонного вируса гриппа определяли при экспрессии подтипа Н1 из штаммов А/Брисбен/59/2007 (Η1Ν1) (плазмида #774), А/Новая Каледония/20/1999 (Η1Ν1) (плазмида #540) и А/Соломоновы Острова/3/2006 (Η1Ν1) (плазмида #775). Кодирующие последовательности гена гемагглютинина сначала собирали в пластоцианин-экспрессирующую кассету - промотор, 5'НТО, 3'НТО и последовательности терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны - и собранные кассеты вносили в бинарную плазмиду рСАМВ1А. Плазмиды трансфектировали в АдгоЬас1епит (АСЫ), продуцирующие соответственно штаммы АдгоЬас1егшт АСЫ/774, АСЫ/540 и АСЫ/775.
Проводили инфильтрацию растения Ν. ЬеШйатзаиа АСЫ/774, АСЫ/540 и АСЫ/775 и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления Η1 в агроинфильтрованных листьях, белки сначала экстрагировали из ткани инфильтрованных листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с антителами против Η1. В экстрактах обнаруживалась единственная полоса около 72 кДа (фиг. 47), что соответствует по размеру нерасщепленной форме ГА0 гемагглютинина вируса гриппа.
Таким образом, экспрессия различных ежегодных эпидемических штаммов гемагглютинина в инфильтрованных листьях приводит к накоплению.
Пример 15. Временная экспрессия гемагглютинина потенциально пандемического вируса гриппа агроинфильтрацией в растения М. ЬеШйатаиа.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинины вирусов гриппа определяли при экспрессии подтипа Н5 из штаммов А/Аньхой/1/2005 (Η5Ν1) (плазмида #781), А/Индонезия/ 5/2005 (Η5Ν1) 30 (плазмида #660) и А/Вьетнам/1194/2004 (Η5Ν1) (плазмида #782). Кодирующие последовательности гена гемагглютинина сначала собирали в пластоцианин-экспрессирующую кассету промотор, 5'НТО, 3'НТО и последовательности терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны и собранные кассеты вносили в бинарную плазмиду рСАМВ1А. Плазмиды трансфектировали в АдгоЬас1епиш (АСЫ).
Проводили инфильтрацию растения Ν. Ьейкашзаиа АСЬ 1/781, АСЫ/660 и АСЫ/782, и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления Н5 в агроинфильтрованных листьях, белки сначала экстрагировали из ткани инфильтрованных листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с антителами против Н5. В экстрактах обнаруживалась единственная полоса около 72 кДа (фиг. 48), что соответствует по размеру нерасщепленной форме ГА0 гемагглютинина вируса гриппа. Таким образом, экспрессия различных потенциально пандемических штаммов гемагглютинина в инфильтрованых листьях приводит к накоплению нерасщепленного продукта трансляции.
Пример 16. Временная экспрессия Н5 агроинфильтрацией в растения М. 1аЬасит.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинин вируса гриппа в листьях растения №соиа1'1а 1аЬасит определяли при экспрессии подтипа Н5 из штаммов А/Индонезия/5/2005 (Η5Ν1) (плазмида #660). Кодирующие последовательности гена гемагглютинина сначала собирали в пластоцианин-экспрессирующую кассету - промотор, 5'НТО, 3'НТО и последовательности терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны - и собранные кассеты вносили в бинарную плазмиду рСАМВ1А. Плазмиды трансфектировали в Ад^οЬасΐе^^иш (АСЫ).
Проводили инфильтрацию растения Ν. ίаЬасиш АСЫ/660 и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления Н5 в агроинфильтрованных листьях, белки сначала экстрагировали из ткани инфильтрованных листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с антителом против Н5. В экстрактах обнаруживалась единственная полоса около (фиг. 49), что соответствует по размеру нерасщепленной форме ГА0 гемагглютинина вируса гриппа. Таким образом, экспрессия гемагглютинин инфильтрованных листьях Ν. ίаЬасиш приводит к накоплению нерасщепленного продукта трансляции.
Пример 17. Иммуногенность полученной в растении вакцины на основе ВЧ Η5Ν1 из штамма А/Индонезия/5/05 (Η5Ν1) для хорьков.
Влияние повышения дозы для хорьков исследовали для оценки иммуногенности ВЧ растительного происхождения. Перекрестный ответ сывороточных антител ш У11го, вызванный действием вакцины на основе ВЧ Н5 при трех дозах (1, 5 и 15 мкг) оценивали по ингибированию гемагглютинации трех других
- 47 018206 штаммов Н5Ш - А/индейки/Турция/1/05 (клада 2.2), А/Вьетнам/1194/04 (клада 1) и А/Аньхой/5/05 (все цельные инактивированные вирусы), используя сыворотку, взятую через 14 суток после введения первой дозы вакцины (фиг. 50А) и через 14 суток после введения второй дозы (фиг. 50 В). Для трех использованных доз наблюдали перекрестный ответ.
Пример 17а. Анализ данных по иммуногенности в соответствии с критериями СНМР (Комитета по медицинским продуктам для человека).
Комитет по медицинским продуктам для человека (СНМР) Европейских медицинских агентств (И11р://^^^.етеа.еигора.еи/й1т8/депега1/соп1ас18/СНМР/СНМР.Ыт1) ставит три критерия (применимых после второй дозы) для оценки эффективности вакцин: 1 - Число сероконверсии или значительное повышение титра Н1 (в четыре раза) - >40%; 2 - Среднее геометрическое повышение - не менее 2,5; 3 - доля объектов, у которых достигается титр Н1, равный 1/40 - не менее 70%. Анализ выполнения указанных критериев на модели хорьков приведен в табл. 8-11. (*) означает, что критерий СНМР выполнен или превзойден. Выводы по данным анализа перекрестной иммуногенности в отношении критериев СНМР для лицензирования приведены в табл. 12.
Ежедневно измеряли массу тела животных, температуру и общее состояние. Признаков болезни или недомогания в ходе исследования не обнаружено. Масса тела и температура оставались в интервалах нормальных значений. Вакцина была безопасна и хорошо переносилась животными.
Таблица 8. Данные по гомологичному штамму (А/Индонезия/5/05)
Сутки Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5мкг 5 мкг + адъювант 7.5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг 1ТС
14 (после % 4-кратного повышения титра ΗΙ 0% 100% 0% 100%* 20% 20% 80% * 0% 0%
1-й Среднее геометрическое повышение 0% 7.6 0% 15.6 * 1.3 1.2 11.2* 0% 0%
инъекции) % титров ΗΙ равных 1/40 0% 60% 0% 100%* 20% 0% 80% * 0% 0%
Средний титр ΗΙ 38 78 56
35(14 сут. % 4-кратного повышения титра ΗΙ 0% 100% * 0% 60%* 0% 0% 40% * 0% 0%
после Среднее геометрическое повышение 0% 10.8* 0% 5.9* 0.7 0% 4* 0% 0%
дополн. % титров ΗΙ равных 1/40 0% 100% * 0% 100% * 0% 0% 100* 0% 0%
инъекции) Средний титр ΗΙ 411 465 217
Таблица 9. Данные по гетерологичному штамму (А/Вьетнам/1194/04)
Сутки Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5мкг 5 мкг + адъювант 7.5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг 1ТС
14 (после 1-й инъекции) % 4-кратного повышения титра ΗΙ Среднее геометрическое повышение % титров ΗΙ равных 1/40 0% 1,2 0% 0% 1,2 0% 0% 1,3 0%
35(после дополн. инъекции) % 4-кратного повышения титра ΗΙ Среднее геометрическое повышение % титров ΗΙ равных 1/40 60% 2,3 0% 80%* 5,1* 80%* 60% 1,78 20%
Таблица 10. Данные по гетерологичному штамму (А/Индейки/Турция/1/05)
Сутки Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5мкг 5 мкг + адъювант 7.5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг 1ТС
14 (после 1-й инъекции) % 4-кратного повышения титра ΗΙ Среднее геометрическое повышение % титров ΗΙ равных 1/40 40% 1,9 40% 20% 1,7 20% 60% 2,8 40%
35(после дополн. инъекции) % 4-кратного повышения титра ΗΙ Среднее геометрическое повышение % титров ΗΙ равных 1/40 80%* 10,6* 100%* 100%* 20,8* 100%* 80%* 7,7* 100%*
Таблица 11. Данные по гетерологичному штамму (А/Аньхой/5/05)
Сутки Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5мкг 5 мкг + адъювант 7.5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг 1ТС
14 (после 1-й инъекции) % 4-кратного повышения титра ΗΙ Среднее геометрическое повышение % титров ΗΙ равных 1/40 40% 1,8 20% 20% 1,3 20% 80%* 6,4* 80%*
35(после дополн. инъекции) % 4-кратного повышения титра ΗΙ Среднее геометрическое повышение % титров ΗΙ равных 1/40 100%* 11,8* 100%* 100%* 14,4* 80%* 60%* 3* 80%*
- 48 018206
Таблица 12. Выводы о перекрестной иммуногенности согласно критериям СНМР для лицензирования
Штамм Критерий Исследованная группа
1 мкг + адъювант 5мкг + адъювант 15 мкг + адъювант
А/индейки/Турция/1 / 05 (клада 2.2) % 4-кратного повышения титра ΗΙ 80% * 100% * 80% *
Среднее геометрическое повышение 10.6* 20.8* 7.7*
% титров ΗΙ равных 1/40 100% * 100% * 100% *
А/Аньхой/1/05 (клада 2.3) % 4-кратного повышения титра ΗΙ 100% * 100% * 60% *
Среднее геометрическое повышение 11.8* 14.4* 3*
% титров ΗΙ равных 1/40 100% * 80% * 80% *
А/Вьетнам/1194/04 (клада 1) % 4-кратного повышения титра ΗΙ 60% 80%* 60%
Среднее геометрическое повышение 2.3 7.1* 1.78
% титров ΗΙ равных 1/40 0% 80%* 20%
Пример 18. Выбор последовательностей нуклеотидов гемагглютинина.
Последовательности нуклеотидов ГА были взяты из базы данных последовательностей вирусов гриппа (см. иКЬ: £1ц.1ап1.§оу), или ресурса Национального центра информации по биотехнологии по вирусам гриппа (см. иКЬ: псЬгп.т.Ыкдоу/депоте8/РЕи/РЕи.й1:т1). Для нескольких последовательностей нуклеиновых кислот ГА в базах данных имеется несколько вариантов (табл. 13). Некоторые вариации связаны в основном с системой культивирования (происхождение - культура МЭСК, яйца, неизвестное, вирусная РНК/ клинический штамм); например, гликозилирование в положении 194 (нумерация зрелого белка) ГА отсутствует, если вирус гриппа типа В экспрессирован в аллантоисной жидкости яиц (см. также Сйеп с соавт., 2008). Для некоторых последовательностей могут отсутствовать домены (например, неполные клоны, артефакты секвенирования и т.д.). Последовательность гемагглютинина можно разделить на пять доменов: сигнальный пептид (СП), ГА1, ГА2, трансмембранный домен (ЭТт) и цитоплазматический хвост. Домены первой последовательности могут сочетаться с доменами из второй существующей последовательности, например, сигнальный пептид последовательности первого штамма может сочетаться с балансом кодирующей последовательности гемагглютинина из второго штамма для образования полной кодирующей последовательности.
Таблица 13. Вариации подтипов вируса гриппа для выбранных кодирующих последовательностей ГА
Штамм База данных поел, ссылка № Происхо ждение СП ГА1 ГА2 ОТт Расхождение
Н1 А/Соломоновы Острова/3/2 006 Ι8ΏΝ231 558 (уассте гее.) МОСК Υ Υ Υ Υ 189: Кили6, 220: К (МОСК) Т(яйцо), 249: 9 (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 Ι8ΟΝ238 190 яйцо Υ Υ Υ Υ 189: К или О, 220: К (МОСК) Т(яйцо), 249: 0 (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 Ευ 10072 4 ? Υ Υ Υ Υ 189:К или С, 220: К (МОСК) Т(яйцо), 249: <5 (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 Ι8ϋΝ220 951 МОСК Υ Υ N N 189: К. или 6, 220: К (МОСК) Т(яйцо), 249: р (МОСК) К(яЙцо), 550: Ь (МОСК) К (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 Ι8ϋΝ220 953 яйцо Υ Υ N N 189: К или С, 220:К (МОСК) Т(яйцо), 249: 0 (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 ЕШ2413 7 яйцо Υ Υ N N 189: К или 6, 220:К (МОСК) Т(яйцо), 249: 0 (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К. (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 ЕШ2413 5 МОСК Υ Υ N N 189: К или О, 220:К (МОСК) Т(яйцо), 249: (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К. (яйцо)
А/ Соломоновы Острова /3/2 006 ЕШ2417 7 МОСК Υ Υ Υ Υ 189: К или 6, 220: К (МОСК) Т(яйцо), 249: ς (МОСК) К(яйцо), 550: Ь (МОСК) К (яйцо)
- 49 018206
Η1 А/Брисбен /59/2007 Ι8ΟΝ282 676 МОСК Υ Υ Υ 203: ϋ/Ι/Ν ϋ наиболее распространен в Η1
А/ Брисбен /59/2007 Ι8ΏΝ285 101 яйцо Υ Υ N N 203: ϋ/Ι/Ν ϋ наиболее распространен в Η1
А/Брисбен /59/2007 Ι8ΟΝ285 777 яйцо Υ Υ Υ Υ 203: ϋ/Ι/Ν ϋ наиболее распространен в Η1
нз нз в А/Брисбен е/59/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен Штамм /10/2007 А/Брисбен е/10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Брисбен /10/2007 А/Висконсин/67/2 005 А/Висконсин/67/2 005 А/ Висконсин/67/200 5 А/ Висконсин/67/200 5 А/ Висконсин /67/2005 А/ Висконсин /67/2005 В/Малайзия /2506/2004 В/ Малайзия /2506/200 4 В/ Малайзия /2506/200 4 В/ Малайзия /2506/200 4 Ι8ΟΝ282 677 Ι8ΏΝ274 893 Ι8ΌΝ257 648 Ι8ΏΝ256 751 Ι8ΏΝ273 757 Ι8ΌΝ273 759 База данных поел, ссылка № Еи 19924 8 Еи 199366 Ι8ΟΝ257 043 Еи 19925 0 Ι8ΏΝ275 357 Ι8ϋΝ260 430 Ι8ΟΝ131 464 (уасс1пе гес.) 0(286594 7 ЕР473424 Ι8ΟΝ138723 ЕР473455 Ι8ΏΝ138 724 Ι8ΟΝ126 672 (уассте гес.) ЕР566433 Ι8ΟΝ231 265 Ι8ΟΝ231 557 яйцо ЯЙЦО МОСК яйцо яйцо яйцо Происхо ждение яйцо яйцо яйцо МОСК яйцо яйцо 7 ? 7 яйцо яйцо ? яйцо яйцо яйцо МОСК Υ Υ N Υ Υ Υ СП N Υ N N N N N N N N N N Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ ГА1 Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ ГА2 Υ Υ Υ Υ N Υ Υ части чно Υ Υ Υ Υ N N Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ ОТт Υ Υ Υ Υ N Υ N N N Υ Υ Υ N N Υ Υ 203: ϋ/1/Ν О наиболее распространен в Н1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: деления А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/С, 210:1УР, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: Расхождение делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:17Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Е/Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:Ь/Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 202: ν/Ο, 210:17Р, 215: делеция А1а, 242: 8/1 138: А/8 156: Н/ф 186: Ο/ν 196: Η/Υ 138: А/8 156: Н/ф 186: Ο/ν 196: Η/Υ 138: А/8 156: Н/ζ) 186: Ο/ν 196:Η/Υ 138: Α/8 156: Η/ς 186: Ο/ν 196: Η/Υ 138: Α/8 156: Η/<3 186: Ο/ν 196: Η/Υ 138: Α/8 156: Η/ζ> 186: Ο/ν 196: Η/Υ 120 Κ/Ν 210 Τ/Α 120 Κ/Ν 210 Τ/Α 120 Κ/Ν 210 Τ/Α 120 Κ/Ν 210 Τ/Α
В/ Малайзия /2506/200 4 ЕР566394 МОСК Υ Υ N N 120 Κ/Ν 210 Τ/Α
В/ Малайзия /2506/200 4 Еи 12427 4 яйцо Υ Υ Υ Υ 120 Κ/Ν 210 Τ/Α
В/ Малайзия /2506/200 4 Еи 12427 5 МОСК Υ Υ Υ Υ 120 Κ/Ν 210 Τ/Α
- 50 018206
Штамм
МОСК
Ι8ΟΝ261 649
В/Брисбен /3/2007
Ι5ΟΝ256 628
В/Брисбен /3/2007
Ι8ΟΝ263
А/ Вьетнам /1194/
А/ Вьетнам /1194/
ЕР541402
А/Аньхой/ 1/2005
А/Аньхой/ /2005
Ι8ΟΝ13
А191720
АВ298277 реассортант)
АИ04626
АВ08022 6
АВ29607
Ь204 0
Е20406
Штамм
Б20407
СУ0 497 6
ΑΥ20995
ГО2127
0050884 1
ΑΥ64308 6
АВ28933
ΑΥ64308
ΑΥ64308
База данных поел, ссылка
Происхо ждение
База данных поел, ссылка
Происхо ждение
Лекарстве нно-устои отс. гликозилирования в положении 211; 10 аминокислот
ОТт/цитоплазматического хвоста
208 (Ν/ϋ) (отс. позиции гликозилирования)
0037928 (уассше включает цитоплазматический хвост
Н2 А/Япония/30
5/1957
МОСК
МОСК
В/Флорида/ 4/2006
В/Флорида/ 4/2006
В/Флорида/ 4/2006
ЕС 10060 4
Ι8ΟΝ218 061
Ι8ΏΝ285 778
В/Брисбен /3/2007
А/Вьетнам/1194/ отс. гликозилирования в положении 211 отс.гликозилирования в положении 211
Ι8ΟΝ263 783
Ι8ΌΝ386 86 (уассше гее.)
ΑΥ65133 3
А/лошади/
Прага/56
А/Гонконг/1073 /999
А/Гонконг/1073 /999
А/Сингапур /1/1957
А/ Сингапур /1/1957
А/Сингапур /1/1957
А/Япония/3
05/1957
А/Япония/3
05/1957
А/ Япония /3
05/1957
А/ Япония /3
05/1957
А/Япония/3
05/1957
А/Япония/3
05/1957
А/Япония/3
05/1957
А/Япония/3
05/1957
А/Япония/3
05/1957
В/ Малайзия /2506/200 4
В/Флорида/4 /2006
Н7 А/куры/
Италия/13474 /999
А/лошади/Прага/5 чивыи
Н6 А/Дикие утки/Г онконгАУЗ 1 2/1997 (Η6Ν1) АР2504797 яйцо Υ Υ Υ N
- 51 018206
Υ, Ν - соответственно Да и Нет;
СП - наличие последовательности сигнального пептида Υ/Ν;
ГА1 - полный домен ГА1 Υ/Ν;
ГА2 - полный домен ГА2 Υ/Ν;
□Τη - полный трансмембранный домен Υ/Ν;
Штамм. Η1 из А/Соломоновы Острова/3/2006.
Сравнивали восемь аминокислотных последовательностей и идентифицировали вариации (таблица 14). В положении 171 обнаружена вариация глицина (О) или аргинина (К) в некоторых последовательностях.
яйцо
Т
К
К
МРСК К _0_ ь
Таблица 14. Вариация аминокислот в А/Соломоновы Острова/3/2006 Аминокислота #*
212____________
241______________
542
Нумерация с начального М.
Штамм: Η1 из А/Брисбен/'59/2007.
В положении 203 обнаружена вариация - аспарагиновая кислота (Ώ), изолейцин (Ι) или аспарагин (Ν).
Штамм: Н3 из А/Брисбен/10/2007.
Вариации последовательностей обнаружены в пяти положениях (табл. 15). В положении 215 в двух образцовых последовательностях присутствовала делеция.
Т аблица 15. Вариации аминокислот Н3 из А/Брисбен/10/2007
Происхождение 202,210,215,235 242*
Ι8ΡΝ274893 яйцо УЬ-ΥΙ
Ι8ΡΝ273759 яйцо СР Α8Ι
Еи 199248 яйцо СР Α8Ι
Е1Л 99366 яйцо СР Α8Ι
Ι8ΡΝ273757 яйцо УЬ-88
Ι8ΡΝ257043 яйцо СР Α8Ι
Е1Л 99250 МОСК СЬА81
Ι8ΡΝ375357 яйцо СР Α8Ι
Ι8ΡΝ260430 яйцо СР А81
Ι8ΡΝ256751 яйцо СР Α8Ι
Ι8ΡΝ257648 МОСК СЬА81
* Нумерация с начального М Штамм: НЗ из А/Висконсин/67/2005.
Вариации последовательностей для этого штамма обнаружены в четырех положениях (табл. 16).
Таблица 16. Вариации аминокислот Н3 из А/Висконсин/67/2005
происхождение 138, 156, 186, 196
ΙδϋΝ 138724 неизвестно АНСН
ЭО865947 неизвестно 8Н V Υ
ЕР473424 неизвестно АНОН
Ι8ΟΝ138723 яйцо 8(} V Υ
ΙδϋΝΙ 31464 неизвестно АНОН
ЕР473455 яйцо АНОН
* Нумерация из зрелого белка.
Штамм: В из В/Малайзия/2506/2004.
Вариации наблюдались в двух положениях (табл. 17). Положение 120не является сайтом гликозилирования; положение 210 участвует в гликозилировании; данное гликозилирование устраняется после культивирования в яйцах.
Таблица 17. Вариации аминокислот гемагглютинина из В/Малайзия/2506/2004
Аминокислота #* ΜΌΟΚ яйцо
120 К N
210 Т А
* Нумерация от центра СП.
Штамм: гемагглютинин из В/Флорида/4/2006; Ι8ΏΝ261649.
Наблюдаемые вариации включают варьирование аминокислотной последовательности в положении 211, в зависимости от системы культивирования. В последовательностях, выделенных из клеток МЭСК, обнаруживается аспарагин (Ν), а в последовательности, выделенной из яиц - глутаминовая кислота (Ώ). Положение 211 является сайтом гликозилирования и устраняется после культивирования в яйцах.
Штамм: Н2 из А/Сингапур/1/1957.
Вариации последовательностей наблюдались в шести положениях (табл. 18).
- 52 018206
Таблица 18. Вариации аминокислот Н2 из А/Сингапур/1/1957
Происхождение Аминокислота № 166 168 199/236 238 358
Л20410 вирусная РНК КЕТЛ8V
и 1142 неизвестен ЕСКЛ 81
АВ296074 неизвестен
консенсусная поел. А/Япония/305/1957 К О Т б/Л О V
Нумерация из зрелого белка.
Штаммы: Н5 из А/Вьетнам/1194/2004 и Н5 из А/Аньхой/1/2005.
При выравнивании первичных последовательностей любого из указанных штаммов Н5 вариаций в аминокислотных последовательностях не обнаружено.
Штамм: Н6 из А/дикие утки/Гонконг/У312/1997.
Для данного штамма имеется только один вариант (ΑΤ250179).
Штамм: Н7 из А/лошади/Прага/56.
В базах данных обнаружено всего два варианта последовательностей. Вариант АВ298877 не рассматривался, так как является лабораторным реассортантом.
Штамм: Н9 из А/Гонконг/1073/1999; ΑΊ404626.
В базах данных обнаружено всего два варианта последовательностей. Только один из них был полным.
Все цитируемые материалы включены в данный документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение описано в отношении одного или более осуществлений. Однако для специалиста в данной области очевидно, что возможны варианты и модификации, не выходящие за рамки объема изобретения, представленного в формуле изобретения.
Литература
Αута^б, Н. М, М. Т. Со1етап, У. К. Во^б1е, У. С. Лауег, С. С 8сЫ1б, апб К. С. УеЬк!ег. 1973. Ьйиепха у1гик пеигат1шбаке-ту1Ь1!юп !ек! ргосебигек. Ви11. У.И.О. 48: 199-202.
Во11ад, О.М., Ко/уск1, М.О., апб Ебе1к!ет, 8.Ί. (1996) Рго!ет те!Ьобк (2паебНюп). \УПеу-1лкк, Хе\у ХогХ ϋ8Α.
ВНдЬ, Е.С., & Л)уег, УД. Сап. Л Меб. 8сЁ 37, 911-917 (1959).
СЬеп, ВЛ., Лекег, С.Р., Моп!а, Е., апб ЛатЬ Κ.Α. (2007) [пПиеп/а У1гик Ьетадд1и!тт апб пеигатт1баке, Ьи1 по! 1Ье та!пх рго!ет, аге гецшгеб Гог аккетЬ1у апб Ьиббтд оГ р1акт1б-бепуеб У1гик-11ке рагйс1ек. 1. У1го1. 81,7111-7123.
СЬеп Ζ., Ακρе1ииб Α., Лп Η. 2008 81аЬ111'х1'пд !Ье д1усоку1а!юп ра11егп оГ тПиеп/а В Ьетадд1и!1тп Го11о\утд абар!а!юп !о дго^!Ь т еддк.Уассте уо1 26 р 361-371.
Сга^Гогб, Л, УПкткоп, В., Уокпекепкку, Α., 8т1!Ь, С., Сагша, М, 8!опе, Η., апб Регбие, М. Л. (1999). Васи1оу1гик-бег1уеб Ьетадд1и!тт уасстек рго!ес! адатк! 1е!Ьа1 тбиеп/а тГесйопк Ьу ау1ап Η5 апб Η7 киЬ1урек. Уассте 17,2265-2274.
Оагуеаи, Α., Ре11е!1ег, Α. & Реггеаи1!, Л РСК-теб1а!еб куп!Ьек1к оГ сЫтепс то1еси1ек. Ме!Ьобк Хеигокс. 26, 77-85 (1995).
Сгдашс Е.У.Л., Αпбе^κоп Ό.Α. Уник-Нке раг!1с1ек: раккрог! !о 1ттипе гесодпШоп. Ме!Ьобк 2006; 40: 60-65.
СПНт-Кокк, Л., апб 8иЬЬагао, К. (2006) Етегдтд гекр1га!огу уникек: сЬап11епдек апб уассте к!га!ед1ек. С1т. М1сгоЬю1. Кеу. 19, 614-636.
Соте7-Риег!ак, Р., Мепа, Ι., Сак!111о, М., У1уо, Α., Реге7-Рак!гапа, Е. апб Рог!е1а, Α. (1999) ЕГЛшеп! Гогтабоп оГ тбиеп/а У1гик-Ъке раг!1с1ек: берепбепсе оп !Ье ехргеккюп 1еуе1 оГ У1га1 рго!етк. 1. Сеп. Уно1. 80,1635-1645.
Соте7-Риег!ак, Р., .-\.1Ьо, С, Реге7-Рак!гапа, Е., У1уо, Α., апб Рог!е1а, Α. (2000) НЫиен/а У1гик рго!ет 1к !Ье тащг бпутд Гогсе т У1гик Ьиббтд. 1 У1го1. 74, 11538-11547.
Ηат^1!оп, Α., Уотпе!, О., СЬарре11, Л. & Ваи1сотЬе, Ό. Т\\о с1аккек оГ кЬог! т!егГеппд ΚΝΑ т ΚΝΑ кбепстд. ЕМВО 7. 21, 4671-4679 (2002).
^Где^ К. & \УИ1тН/ег, Л. 8!огаде оГ сотре!еп! се11к Гог Αд^оЬас!е^^ит !гапкГогта!1оп. АисЫс ΑοκΙ Кек. 16, 9877 (1988).
Ш^игу Р.В., ΖΙιηιψ Т., К1т Р.8., Α1Ηγ Т. (1993) Α к\уЧс11 ЬеЛуееп !^о-, !Ьгее-, апб Гоиг-к!гапбеб собеб собк т СС№ 1еисте /1ррег ти!ап!к. 8с1епсе; 262: 1401-1407)
ЩитоЮ Т., Ка^аока Υ. 8!га!ед1ек Гог беуе1ортд уасстек адатк! Η5Ν1 тбиеп/а а У1гикек. Тгепбк т Мо1. Меб. 2006; 12(11):506-514.
Ηποΐ£ Ζ., Е1кт С., Ма1опеу В.Л, ВеиЬпег Ν., Α^п!ζеп С.Л, ТЬапауа1а Υ., Макоп Η.8. Ушик-Нке раг!1с1е ехргеккюп апб аккетЬ1у т р1ап!к: Ьера!Ык В апб Шг^аШ уникек. Уассте. 2005 Маг 7;23(15):1851-8.
.1о11апккоп, В.Е. (1999). Iттии^ζа!^оп \νΗΐι тбиеп/а Α У1гик Ьетадд1и!тт апб пеигат1шбаке ргобисеб т гесотЫпап! Ьаси1оу1гик геки1!к т а Ьа1апсеб апб Ьгоабепеб 1ттипе гекропке кирепог !о сопуеп!юпа1 уассте. Уассте 17, 2073-2080.
- 53 018206
Ьа!Нат, Т., апб Са1агха, 1. М. (2001). ЕогтаПоп оГ \\'11б-(уре апб сНипегк тПиепха у1гиз-11ке раг!1с1ез Го11о^1пд зтшИапеоиз ехргеззюп оГ оп1у Гоиг з(гис(ига1 рго(етз. 1. У1го1. 75,6154-6165.
ЬеГеЬуге, В. е! а1. Р1ап! Рйузюк 144, 402-418 (2007).
Ьеиг^бег Ь.8. е! а1. 1986. №.1с1ею Ас1б 8гезеагсН 14910):4051-64.
Ыи, Ь & ЕотопоззоГГ, О.Р. АдготГесбоп аз а гар1б те(Ноб Гог ргорадайпд Со\\реа тозак У1ги5-Ьа5еб сопз(гис1з. 1. У1го1. Ме!1обз 105, 343-348 (2002).
Маса1а, Ь.1, Υο, В.К. & Апбо, 8.1. Ь1р1бВез. 24, 1243-1250 (1983).
МаиапоткН, Ό., Вйкег, Е., ба Сатага МасНабо, А., Ьатег, М., Ведпег, Е., 8(етке11пег, Η., Штткг, О., апб КаОпдег, Η. (1989) ЕПккп( (гапзГогтаНоп оГ АдгоЬас1егшт зрр. Ву е1ес(горогаПоп. Νϋθ1. Ас. Вез. 17, 6747.
Мепа, Ι., νίνο, А., Регех, Е., апб Рог(е1а, А. (1996) Везсие оГ зуп(НеПс сН1огатрйепко1 асе(у11гапзГегазе ВNА ίп!о тПиепха гйиз-Нке рагйскз оЫатеб Ггот гесотЬтап! р1азт1бз. 1. νίίοΐ. 70, 5016-5024.
Мопдгапб 8., Моге1 1., ЬагосНе 1., С1агего1 8., Сагбе !Р., ШИтат М.А. е! а1. Ыр1б гайз ίίί Шдйег р1ап! се11з. ТНе 1оигпа1 оГ Вю1одка1 СНепиз1гу 2004; 279(35): 36277-36286.
Nеитапи, О., Аа!апаЬе, Т., апб Катаока, Υ. (2000) Р1аз1тб-бпгеп ГогтаНоп оГ гйиз-Нке рагйс1ез. 1. νΐιοί. 74, 547-551.
Аауак Э.Р., ВекН1 и. (2004) №игатйпбазе асНгНу аззауз Гог топНогтд МОСК се11 сиЬиге бепгеб тПиепха гтиз. 1 νίΓοΙ Мебюбз 122(1):9-15.
Ο1зеп, С. А., МсОгедог, М. А., ПуЬбаН1-81ззоко, Ν., 8сНгат, В. В., №1зоп, К. М., Бипп, Ό., Маск1т, М. Ό., апб 8\уат, А. Е. (1997). Iттииοдешс^ίу апб еГПсасу оГ Ьаси1оу1гиз-ехргеззеб апб ЭНА-Ьазеб ес.|ите тПиепха упиз йетадд1ийпт гасстез ίιι тке. ν;κθικ 15, 1149-1156.
Оиап Е.8., Ηη;!^ С, Сотрапз ВА, Капд 8М. νίπ^-ΗΙ^ рагйск уассте тбисез ргоксйуе пптипбу адатз! Ното1одоиз апб Не!его1одоиз з1га1пз оГ тПиепха У1гиз. 1оигпа1 оГ νίΓοΙοβν 2007; 81(7): 3514-3524.
Воте, Т. с соавт. 1999. ^е!есйοи оГ апйЬобу !о ат1ап тПиепха а (Η5Ν1) У1гпз ίιι Нитап зегит Ьу изтд а стЫаПоп оГ зего1одк аззауз. 1. С1т МкгоЪю1 37(4):937-43.
8ат!-1оге-Эираз С е! а1. 2007. Егот р1ап(а !о рНагта \\ί11ι д1усозу1айоп т (Не !оо1Ьох. Тгепбз ίιι Вю1ес1то1оду 25(7) :317-23.
8атЬгоок 1., апб Виззе11 ЭА. Мо1еси1аг с1оптд: а 1аЬога!огу тапиа1. Со1б 8ргтд ΗιΛογ, Ν.Υ. Со1б 8ргтд ΗιΛογ ЬаЬога!огу Ргезз, 2001.
8!оскНаиз 1. е! а1. 1987. АпаЕкз оГ аз-асПте зес.|иепсез тгокеб ίιι !ке 1еаГ-зресйк ехргеззюп оГ а ро!а!о депе ίιι (гапздепк р1ап!з. Ргосеебтдз оГ (Не №йопа1 Асабету оГ 8скпсез и.8.8. 84(22):7943-7947.
8!оскНаиз 1. е! а1. 1989. Iбеиί^йсайοи оГ епНапсег е1етеп!з ίιι (Не ирз!геат гедюп оГ (Не пис1еаг рНо!озуп(НеПс депе 8Т-Б81. Р1ап! Се11. 1(8):805-13.
8ιιχιι1<ί, Υ. (2005) 81а1оЬю1оду оГ тПиепха. Мо1еси1аг тесНатзт оГ Ноз! гапде тапаПоп оГ тПиепха νίгизез. В1о1. РНагт. Ви11 28, 399-408.
Тзир М., Се11. Мо1. Ьке 8ск, 63 (2006); 1889-1898
Аакейе1б Ь., О.О. Вго^пке Ыис Ас1б Вез. 17 (1989); 8569-8580.
КепбаН А.Р., Регейа М8, 8кеНе1 1. Сопсер!з апб ргосебигез Гог 1аЬога!огу-Ьазеб тПиепха зиггеШапсе. АЙапшСОС; 1982. р.В17-В35.
ΑΗΟ. Мапиа1 оп атта1 тПиепха б1адпоз1з апб зиггеШапсе. Оераг(теп1 оГ соттипкаЫе б1зеазе зигуеШапсе апб гезропзе. Аог1б ^;ι111ι Ο^дашзайοи О1оЬа1 [пПпепха Ргодгат. 2002.
8кеНе1 1.1. апб Аббу Ό.Ε Апп Вег ВюсНет 2000 69:531-69.
νι^ι-Ηο Ь. е! а1. 2005. ВюрНузка1 1. 88:25-36.
ОатЬ1т, 8 1., Шке, Ь.Е., Виззе11, В.к, 8!еνеиз, Ό.Ι, Х1ао, В., На, Υ., Vаз^зНι. Ν., 8к1пйаиег, Э.А., Оапк1з, В.8., ЕШо!, А., А11еу, Э.С., 8кеНе1, 1.1. (2004) ТНе з!гис!иге апб гесер!ог Ьтбтд ргорегйез оГ (Не 1918 тПиепха Нетадд1ийпт. 8скпсе 303: 1838-1842.

Claims (28)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа в растении, включающий:
    a) введение нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую гемагглютинин вируса гриппа (ГА), оперативно связанную с регуляторным участком, активным в растении, в растение или его часть,
    b) содержание растения в условиях, позволяющих экспрессию нуклеиновой кислоты, с получением таким образом ВЧ,
    c) сбор растения и
    б) очистку ВЧ, причем ВЧ варьируют в размере от 80 до 300 нм.
  2. 2. Способ по п.1, в котором нуклеотидную последовательность выбирают из группы, состоящей из Η1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н9, Н10, Н11, Н12, Н13, Н14, Н15 и Н16.
  3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии введения (стадия а) нуклеиновая кислота экспрессируется в растении транзиторно.
  4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии введения (стадия а) нуклеиновая кислота экс
    - 54 018206 прессируется в растении стабильно.
  5. 5. Вирусоподобная частица (ВЧ), полученная способом по п.1, содержащая белок ГА вируса гриппа и один или более одного липид растительного происхождения.
  6. 6. Вирусоподобная частица (ВЧ) по п.5, отличающаяся тем, что белок ГА вируса гриппа - Н5, Индонезия.
  7. 7. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ВЧ по п.5 для индуцирования иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель.
  8. 8. Способ индуцирования иммунитета против инфицирования вирусом гриппа у субъекта, включающий введение вирусоподобной частицы по п.5.
  9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что вирусоподобную частицу вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
  10. 10. Вирусоподобная частица (ВЧ), полученная способом по п.1, содержащая ГА вируса гриппа, несущий №гликаны или модифицированные №гликаны, специфичные для растений.
  11. 11. Композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ВЧ по п.10 для индуцирования иммунного ответа и фармацевтически приемлемый носитель.
  12. 12. Способ индуцирования иммунитета против инфицирования вирусом гриппа у субъекта, включающий введение композиции по п. 11.
  13. 13. Способ по п.12, отличающийся тем, композицию вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
  14. 14. Вирусоподобная частица по п.5, в которой один или более фосфолипидов относятся к группе фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, гликосфинголипидов, сфинголипида и их комбинации.
  15. 15. Вирусоподобная частица по любому из пп.5, 6, 10 и 14, дополнительно включающая один или более из фитостерина, стерина, сапонина и их комбинации.
  16. 16. Вирусоподобная частица по п.15, в которой фитостерин относится к группе стигмастерина, ситостерина, бета-ситостерина, 24-метилхолестерина, холестерина и их комбинации.
  17. 17. Способ по любому из пп.1-4, в котором на стадии введения (стадия а) в растение вводят дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую супрессор сайленсинга.
  18. 18. Способ по п.17, в котором супрессор сайленсинга выбирают из НсРго вируса картофеля, р1/НСРго вируса гравировки табака (ΊΈν -р1/НС-Рго), ВУУ-р21, р19 вируса кустистой карликовости томата (ΊΈδν р19), капсидного белка вируса скрученности томата (ТСV-СР), 2Ь вируса огуречной мозаики (СΜV-2Ь), р25 вируса картофеля X (ΡVX-р25), р11 вируса картофеля М (ΡVΜ-р11), р11 вируса картофеля δ ^νδ^Π), р16 вируса ожога черники (ВδсV-р16), р23 вируса тристеца цитрусовых (С^-р23), р14 вируса скручивания листьев винограда-2 (С^-р14), р10 вируса винограда А (СVА-р10), р14 вируса винограда В (С^-р14), р10 латентного вируса борщевика (НЬА-рИ)) или р16 обыкновенного латентного вируса чеснока (СС^-р16).
  19. 19. Способ по любому из пп.1-4, в котором на стадии введения (стадия а) в растение вводят дополнительную нуклеотидную последовательность, кодирующую бета-1,4-галактозилтрансферазу (Са1Т), N ацетилглюкозаминилтрансферазу ΙΙΙ (СпТ ΙΙΙ), гибридный фермент Са1Т-№ацетилглюкозаминилтрансферазу (Са1Т-СЭТ1), гибридный фермент СЭТ1-СпТ-Ш.
  20. 20. Вирусоподобная частица, полученная способом по п.19.
  21. 21. Поликлональное антитело, полученное с использованием вирусоподобной частицы (ВЧ) по любому из пп.5, 6, 10, 14-16 или композиции по любому из пп.7 и 11.
  22. 22. Применение вирусоподобной частицы (ВЧ) по любому из пп.5, 6, 10, 14-16 или композиции по любому из пп.7 и 11 для получения сыворотки, содержащей антитела, специфичные в отношении гемагглютинина (ГА) вируса гриппа.
  23. 23. Экстракт растения, содержащий вирусоподобную частицу (ВЧ), полученную способом по любому из пп.1-4, 17-19.
  24. 24. Растение или клетка растения, содержащие вирусоподобную частицу (ВЧ), полученную способом по любому из пп.1-4, 17-19.
  25. 25. Композиция, содержащая вирусоподобную частицу (ВЧ) по любому из пп.5, 6, 10, 14-16 и растительный экстракт.
  26. 26. Применение растительного экстракта по п.23, растения или клетки растения по п.24 или композиции по п.25 для индуцирования иммунитета против инфекции, вызванной вирусом гриппа, у пациента.
  27. 27. Применение по п.26 для индуцирования иммунитета против инфекции, вызванной вирусом гриппа, у пациента, причем ВЧ пригодна для орального введения.
  28. 28. Пищевая добавка, включающая растительный экстракт по п.23, растение или клетку растения по п.24 или композицию по п.25.
EA201000195A 2007-07-13 2008-07-11 Вирусоподобные частицы вируса гриппа, включающие гемагглютинин, продуцированный в растении EA018206B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95941407P 2007-07-13 2007-07-13
US99060307P 2007-11-27 2007-11-27
US1327207P 2007-12-12 2007-12-12
CA002615372A CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2008-01-21 Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
US2277508P 2008-01-22 2008-01-22
PCT/CA2008/001281 WO2009009876A1 (en) 2007-07-13 2008-07-11 Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin produced within a plant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201000195A1 EA201000195A1 (ru) 2010-10-29
EA018206B1 true EA018206B1 (ru) 2013-06-28

Family

ID=40255124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201000195A EA018206B1 (ru) 2007-07-13 2008-07-11 Вирусоподобные частицы вируса гриппа, включающие гемагглютинин, продуцированный в растении

Country Status (19)

Country Link
US (4) US20100239610A1 (ru)
EP (1) EP2173886B1 (ru)
JP (1) JP5624465B2 (ru)
KR (1) KR101541330B1 (ru)
CN (1) CN101883856B (ru)
AU (1) AU2008278222B2 (ru)
CA (2) CA2615372A1 (ru)
CR (1) CR11209A (ru)
DK (1) DK2173886T3 (ru)
EA (1) EA018206B1 (ru)
ES (1) ES2428384T3 (ru)
MX (1) MX2010000525A (ru)
MY (1) MY155236A (ru)
NZ (1) NZ582360A (ru)
PL (1) PL2173886T3 (ru)
PT (1) PT2173886E (ru)
SI (1) SI2173886T1 (ru)
TN (1) TN2009000557A1 (ru)
WO (1) WO2009009876A1 (ru)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI377253B (en) 2001-04-16 2012-11-21 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7566458B2 (en) 2003-06-16 2009-07-28 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
EP2441471B1 (en) 2005-03-08 2014-10-08 MedImmune, LLC Reassortant influenza viruses
CA2659275C (en) * 2006-07-27 2017-01-10 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Chimeric influenza virus-like particles
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
EP2238253B1 (en) 2007-11-27 2012-09-12 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
US8771703B2 (en) 2008-07-08 2014-07-08 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
WO2010006144A2 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Medlmmune, Llc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
MY161965A (en) * 2008-07-18 2017-05-15 Medicago Inc New influenza virus immunizing epitope
AU2015202195B2 (en) * 2008-07-18 2017-10-12 Medicago Inc. New influenza virus immunizing epitope
KR101939014B1 (ko) 2009-03-16 2019-01-15 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 라비린툴로바이코타문 미생물에서의 단백질 생산
AU2010234849B2 (en) 2009-03-30 2017-06-22 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
US8933200B2 (en) 2009-04-09 2015-01-13 Alfa Biogene International B.V. Filtration of a liquid comprising a plant stress protein
AU2010265766B2 (en) 2009-06-24 2015-03-19 Medicago Inc. Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
PL222497B1 (pl) 2009-06-26 2016-08-31 Inst Biochemii I Biofizyki Pan Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej
WO2011003100A2 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for diagnosing and/or treating influenza infection
JP5551780B2 (ja) 2009-09-22 2014-07-16 メディカゴ インコーポレイテッド 植物由来のタンパク質を調製する方法
JP5933451B2 (ja) * 2009-12-28 2016-06-08 メリアル リミテッド 組換えｎｄｖ抗原及びその使用
EA030095B1 (ru) 2009-12-28 2018-06-29 ДиЭсЭм АйПи АССЕТС Б.В. Получение белка гемагглютинин-нейраминидазы в микроводорослях
EP4130273A1 (en) * 2009-12-28 2023-02-08 Sanofi Vaccine Technologies, S.A.S. Production of heterologous polypeptides in microalgae, microalgal extracellular bodies, compositions, and methods of making and uses thereof
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
AU2015202267B2 (en) * 2010-01-26 2017-03-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
KR20120132506A (ko) 2010-02-18 2012-12-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 질환의 예방 및 치료에 사용되는 백신
AU2011235220B2 (en) 2010-03-30 2016-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2011305371B2 (en) 2010-09-21 2015-05-21 Massachusetts Institute Of Technology Human-adapted HA polypeptides, vaccines, and influenza treatment
WO2012041503A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Franvax S.R.L. Generation of virosome particles
SG189236A1 (en) 2010-10-04 2013-05-31 Massachusetts Inst Technology Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto
KR20130122947A (ko) * 2010-10-27 2013-11-11 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. 팽창성 베드 크로마토그래피를 사용하여 식물로부터 바이러스 유사 입자를 포획하는 방법
AU2011325827B2 (en) 2010-11-04 2016-08-04 Medicago Inc. Plant expression system
TWI526539B (zh) 2010-12-22 2016-03-21 苜蓿股份有限公司 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp
EP2665817A1 (en) * 2011-01-17 2013-11-27 Philip Morris Products S.a.s. Vectors for nucleic acid expression in plants
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
RU2655433C2 (ru) * 2011-06-13 2018-05-28 Медикаго Инк. Получение вирусоподобной частицы вируса бешенства в растениях
KR20140047069A (ko) 2011-06-20 2014-04-21 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 계산에 최적화된 광범위 반응을 나타내는 ｈ１ｎ１ 인플루엔자를 위한 항원
WO2013043729A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
US11390878B2 (en) 2011-09-30 2022-07-19 Medicago Inc. Increasing protein yield in plants
EP3626733B1 (en) * 2011-09-30 2024-01-24 Medicago Inc. Increasing virus-like particle yield in plants
EP2776063B1 (en) * 2011-11-11 2019-04-03 Philip Morris Products S.a.s. Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin produced in nicotiana tabacum
US9234008B2 (en) 2012-02-07 2016-01-12 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for H3N2, H2N2, and B influenza viruses
CA2863949C (en) 2012-02-13 2021-06-29 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian h5n1 influenza
US9364530B2 (en) 2012-03-22 2016-06-14 Fraunhofer Usa, Inc. Virus-like particles comprising a matrix protein from a plant enveloped virus and uses thereof
CN104284978B (zh) * 2012-05-11 2018-02-02 麦迪卡格公司 植物中类轮状病毒颗粒的产生
SG10201810400TA (en) * 2012-09-05 2018-12-28 Medicago Inc Picornavirus-like particle production in plants
CN108641002A (zh) 2012-12-18 2018-10-12 西奈山伊坎医学院 流感病毒疫苗及其用途
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
CA2907591A1 (en) 2013-03-28 2014-10-02 Medicago Inc. Influenza virus-like particle production in plants
JP6358257B2 (ja) 2013-09-06 2018-07-18 三菱ケミカル株式会社 植物を用いたタンパク質の製造方法
CN106460005B (zh) 2014-03-27 2020-01-03 莫迪卡戈公司 修饰的cpmv增强子元件
JP6788582B2 (ja) * 2014-07-11 2020-11-25 メディカゴ インコーポレイテッド 植物におけるタンパク質生産の改変
AU2016209032A1 (en) 2015-01-23 2017-08-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
CA2974438A1 (en) 2015-01-23 2016-07-28 Medicago Inc. Rotavirus-like particle production in plants
KR101637955B1 (ko) * 2015-05-18 2016-07-08 한국생명공학연구원 범용성 인플루엔자 바이러스 백신 조성물
AU2016287799A1 (en) 2015-07-02 2018-01-04 Medicago Inc. Jasmonic acid pathway activator
JP7237344B2 (ja) 2016-06-15 2023-03-13 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質及びその使用
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
KR101964044B1 (ko) * 2018-03-14 2019-04-02 인제대학교 산학협력단 재조합 아데노바이러스를 이용한 다가형 인플루엔자 생백신 플랫폼
SG11202012398UA (en) * 2018-06-27 2021-01-28 Medicago Inc Influenza virus hemagglutinin mutants
WO2020007715A1 (en) * 2018-07-04 2020-01-09 Probiogen Ag Method for purifying an enveloped virus
AU2019434270A1 (en) 2019-03-14 2021-09-30 Medicago Inc. Endogenous plant expression enhancer
JPWO2021002355A1 (ru) 2019-07-03 2021-01-07
CN111122417B (zh) * 2020-02-22 2022-06-21 太原理工大学 一种测定含瓦斯煤开闭孔总体积膨胀率的装置及方法
WO2022260849A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Nant Holdings Ip, Llc Methods and systems for producing a protein of interest in a plant
CN115992101B (zh) * 2023-03-22 2023-07-28 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986003224A1 (en) 1984-11-29 1986-06-05 Scripps Clinic And Research Foundation Polypeptides and antibodies related to deglycosylated viral glycoproteins
US5232833A (en) * 1988-09-14 1993-08-03 Stressgen Biotechnologies Corporation Accumulation of heat shock proteins for evaluating biological damage due to chronic exposure of an organism to sublethal levels of pollutants
DE69213804T2 (de) * 1991-03-28 1997-03-27 Rooperol Na Nv Zusammensetzungen von Phytosterolen mit Phytosterolinen als Immunmodulatoren
US6326470B1 (en) 1997-04-15 2001-12-04 The Penn State Research Foundation Enhancement of accessibility of cellulose by expansins
US5762939A (en) * 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
GB9414118D0 (en) 1994-07-13 1994-08-31 Axis Genetics Ltd Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides
AU6504796A (en) 1995-07-20 1997-02-18 Washington State University Research Foundation Production of secreted foreign polypeptides in plant cell culture
US6042832A (en) 1996-08-28 2000-03-28 Thomas Jefferson University Polypeptides fused with alfalfa mosaic virus or ilarvirus capsid proteins
US20010006950A1 (en) 1998-02-11 2001-07-05 Juha Punnonen Genetic vaccine vector engineering
US6489537B1 (en) 1998-08-07 2002-12-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Phytochelatin synthases and uses therefor
ATE342994T1 (de) 1998-08-11 2006-11-15 Biosource Tech Inc Verfahren zur gewinnung von proteinen aus der interstitiellen flüssigkeit von pflanzen
WO2000020557A2 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Boyce Institute For Plant Research At Cornell University Gemini virus vectors for gene expression in plants
US6287570B1 (en) * 1998-11-23 2001-09-11 Patricia L. Foley Vaccine against swine influenza virus
FR2791358B1 (fr) 1999-03-22 2003-05-16 Meristem Therapeutics Promoteurs chimeriques d'expression, cassettes d'expression, plasmides, vecteurs, plantes et semences transgeniques les contenant et leurs methodes d'obtention
CZ20013860A3 (cs) 1999-04-29 2002-04-17 Syngenta Ltd. Herbicidně rezistentní rostliny
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2435000C (en) 2001-01-18 2014-03-25 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Oligomeric complexes of chimeric proteins with enhanced immunogenic potential
CN1333370A (zh) * 2001-08-16 2002-01-30 深圳市三方圆信息技术有限公司 抗家禽病毒病的作物及其生产方法
CA2492097C (en) * 2002-02-13 2013-06-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Signal for packaging of influenza virus vectors
AU2003217413A1 (en) 2002-02-14 2003-09-04 Novavax, Inc. Method for isolation and purification of expressed gene products in vitro
AU2003219402B2 (en) * 2002-03-19 2008-05-08 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek GnTIII (UDP-n-acethylglucosamine:beta-D mannoside beta (1,4)-N-acethylglucosaminy ltransferase III) expression in plants
ES2224792B1 (es) 2002-06-28 2007-02-16 Era Plantech, S.L. Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas.
CU23202A1 (es) * 2003-01-31 2007-05-18 Ct Ingenieria Genetica Biotech ANTIGENOS RECOMBINANTES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A OBTENIDOS EN CéLULAS VEGETALES
CN1460718A (zh) * 2003-04-11 2003-12-10 浙江大学 表达传染性支气管炎病毒纤突蛋白的转基因马铃薯生产方法
US20040268442A1 (en) 2003-05-05 2004-12-30 Dow Agrosciences Llc Stable immunoprophylactic and therapeutic compositions derived from transgenic plant cells and methods for production
WO2004098533A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Boyce Thompson Institute For Plant Research Vectors and cells for preparing immunoprotective compositions derived from transgenic plants
US7566458B2 (en) * 2003-06-16 2009-07-28 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
AU2005220734A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-22 Dow Global Technologies Inc. High efficiency peptide production in plant cells
CN101065145B (zh) 2004-08-13 2010-12-15 印度科学工业研究所 嵌合g蛋白基狂犬疫苗
ATE541938T1 (de) 2005-04-29 2012-02-15 Univ Cape Town Expression viraler proteine in pflanzen
CN100410378C (zh) 2005-05-09 2008-08-13 中国农业科学院生物技术研究所 编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用
WO2007011904A2 (en) 2005-07-19 2007-01-25 Dow Global Technologies Inc. Recombinant flu vaccines
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
US20070042002A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Hawaii Biotech, Inc. Influenza recombinant subunit vaccine
CA2625406C (en) * 2005-10-18 2016-08-09 Novavax, Inc. Functional influenza virus like particles (vlps)
EP1969001A2 (en) 2005-11-22 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
JP2009526526A (ja) 2006-02-13 2009-07-23 フラウンホーファー ユーエスエー， インコーポレイテッド インフルエンザ抗原、ワクチン組成物、および関連する方法
US7993655B2 (en) 2006-04-21 2011-08-09 Dow Agrosciences Llc Vaccine for avian influenza and methods of use
US8778353B2 (en) 2006-05-01 2014-07-15 Technovax, Inc. Influenza virus-like particle (VLP) compositions
CA2657849A1 (en) 2006-05-18 2008-05-08 Pharmexa Inc. Inducing immune responses to influenza virus using polypeptide and nucleic acid compositions
US20070286873A1 (en) * 2006-05-23 2007-12-13 Williams John V Recombinant Influenza H5 Hemagluttinin Protein And Nucleic Acid Coding Therefor
US7730950B2 (en) 2007-01-19 2010-06-08 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for treating intervals of a subterranean formation having variable permeability
PT2155880T (pt) 2007-06-15 2016-11-18 Medicago Inc Modificação da produção de glicoproteína em plantas
KR100964462B1 (ko) 2007-07-10 2010-06-16 성균관대학교산학협력단 형질전환 식물 유래의 조류독감 바이러스 백신 및 그 제조방법
CA2615372A1 (en) * 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
CA2696764A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Fraunhofer Usa, Inc. Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
EP2238253B1 (en) * 2007-11-27 2012-09-12 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
WO2009083420A1 (en) 2007-12-28 2009-07-09 Unilever Plc Process for recovering aroma from tea
GB0800272D0 (en) 2008-01-08 2008-02-13 Plant Bioscience Ltd Protein expression systems
EA034733B1 (ru) 2008-01-21 2020-03-13 Медикаго Инк. Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение
US8771703B2 (en) 2008-07-08 2014-07-08 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
MY161965A (en) 2008-07-18 2017-05-15 Medicago Inc New influenza virus immunizing epitope
AU2009285667B2 (en) 2008-08-27 2015-05-28 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University A DNA replicon system for high-level rapid production of vaccines and monoclonal antibody therapeutics in plants
WO2010025235A1 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Regents Of The University Of Michigan Selective ligands for the dopamine 3 (d3) receptor and methods of using the same
WO2010077712A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Novavax, Inc. Bovine respiratory syncytial virus virus-like particle (vlps)
AU2010265766B2 (en) * 2009-06-24 2015-03-19 Medicago Inc. Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
WO2011011390A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Novavax, Inc. Purified recombinant influenza virus ha proteins
JP5551780B2 (ja) 2009-09-22 2014-07-16 メディカゴ インコーポレイテッド 植物由来のタンパク質を調製する方法
CA2789945A1 (en) 2010-02-18 2011-08-25 Technovax, Inc. Universal virus-like particle (vlp) influenza vaccines
AU2011325827B2 (en) 2010-11-04 2016-08-04 Medicago Inc. Plant expression system
CN109157658A (zh) 2010-11-05 2019-01-08 诺瓦瓦克斯股份有限公司 狂犬病糖蛋白病毒样颗粒(vlp)
TWI526539B (zh) 2010-12-22 2016-03-21 苜蓿股份有限公司 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAHN B-S et al. Expression of hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus in transgenic tobacco PLANT BIOTECHNOLOGY REPORTER June 2007 1:85-92 (see whole document) *
SHOL Y. et al. Plant-expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate VACCINE June 2008 26:2930-2934 (see whole document) *

Also Published As

Publication number Publication date
US20100239610A1 (en) 2010-09-23
EP2173886A1 (en) 2010-04-14
CN101883856A (zh) 2010-11-10
MY155236A (en) 2015-09-30
PT2173886E (pt) 2013-09-03
KR20100032920A (ko) 2010-03-26
KR101541330B1 (ko) 2015-08-05
AU2008278222A1 (en) 2009-01-22
WO2009009876A1 (en) 2009-01-22
EP2173886A4 (en) 2010-10-13
JP5624465B2 (ja) 2014-11-12
PL2173886T3 (pl) 2013-12-31
CR11209A (es) 2010-03-23
MX2010000525A (es) 2010-04-27
JP2010533001A (ja) 2010-10-21
ES2428384T3 (es) 2013-11-07
CA2693956A1 (en) 2009-01-22
NZ582360A (en) 2012-04-27
DK2173886T3 (da) 2013-09-30
US9492528B2 (en) 2016-11-15
EP2173886B1 (en) 2013-06-26
CN101883856B (zh) 2013-10-30
SI2173886T1 (sl) 2013-11-29
US20110293650A1 (en) 2011-12-01
CA2693956C (en) 2013-09-24
CA2615372A1 (en) 2009-01-13
EA201000195A1 (ru) 2010-10-29
US9452210B2 (en) 2016-09-27
US20230044454A1 (en) 2023-02-09
AU2008278222B2 (en) 2014-03-06
US20130183341A1 (en) 2013-07-18
TN2009000557A1 (en) 2011-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018206B1 (ru) Вирусоподобные частицы вируса гриппа, включающие гемагглютинин, продуцированный в растении
JP6215363B2 (ja) 赤血球凝集素を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）
JP5921884B2 (ja) 赤血球凝集素を含むインフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐｓ）
JP5813505B2 (ja) 新規インフルエンザウイルス免疫エピトープ
US10272148B2 (en) Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
EP3626733B1 (en) Increasing virus-like particle yield in plants
RU2569195C9 (ru) Химерные вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, сходные с частицами вируса гриппа
AU2015202195A1 (en) New influenza virus immunizing epitope
D'AOUST et al. Sommaire du brevet 2615372

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM