JP6215363B2 - 赤血球凝集素を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰｓ） - Google Patents

赤血球凝集素を含むインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰｓ） Download PDF

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Description

本出願は、２００９年１月１２日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００００３２号の一部継続出願であり、２００８年７月１１日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１２８１号の一部継続出願であり、それからの優先権を主張し；２００８年１月２１日に出願されたカナダ特許出願第２，６１５，３７２号；２００８年１月２２日に出願された米国特許出願第６１／０２２，７７５号；２００７年７月１３日に出願された米国特許出願第６０／９５９，４１４号；２００７年１１月２７日に出願された米国特許出願第６０／９９０，６０３号；および２００７年１２月１２日に出願された米国特許出願第６１／０１３，２７２号からの優先権を主張する。
本発明はウイルス様粒子の産生に関する。より具体的には、本発明はインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
インフルエンザは、呼吸系ウイルスに起因するヒトにおける代表的な死因である。一般的な病徴は熱、咽頭炎、息切れおよび筋肉痛を特に含む。インフルエンザシーズンの間に、インフルエンザウイルスは、世界中で集団の１０〜２０％に感染し、毎年２５０，０００〜５００，０００人の死亡をもたらす。
インフルエンザウイルスは、感染した哺乳類細胞およびトリ細胞の原形質膜から出芽するエンベロープウイルスである。それらは、存在する核タンパク質およびマトリックスタンパク質抗原に基づいてＡ型、Ｂ型またはＣ型へと分類される。インフルエンザＡ型ウイルスは、表面の糖タンパク質が提示する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の組み合わせに従って亜型へとさらに分類することができる。ＨＡは、ウイルスが宿主細胞に結合し浸透する能力を決定する。ＮＡは宿主細胞およびウイルス表面タンパク質上のグリカン鎖から末端シアル酸残基を除去し、それによりウイルス凝集を妨害し、ウイルス移動性を促進する。現在、１６個のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９個のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型が認識されている。各々のＡ型インフルエンザウイルスは１タイプのＨＡおよび１タイプのＮＡの糖タンパク質を提示する。一般的には、各々の亜型は種特異性を示し、例えば、すべてのＨＡおよびＮＡ亜型は鳥類に感染することが公知であるが、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ７のみがヒトに感染することが示されている（Horimoto 2006; Suzuki 2005）。Ｈ５、Ｈ７およびＨ９を含むインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルスの最も高病原性の形態と判断され、将来のパンデミックを引き起こす可能性が最も高い。
インフルエンザパンデミックは通常、高度に伝播性の毒性のインフルエンザウイルスによって引き起こされ、疾病および死亡のレベルの上昇を世界的にもたらしうる。新しいインフルエンザＡ亜型の出現は２０世紀中で４つの大きなパンデミックをもたらした。１９１８〜１９１９年のスペインかぜ（Ｈ１Ｎ１ウイルスによって引き起こされた）は、１９１７年から１９２０年の間に世界中で５０００万人以上の死亡をもたらした。現在、新しい亜型の出現のリスクまたは動物に固有の亜型のヒトに対する伝播のリスクは常に存在する。特に重要なものは鳥類インフルエンザ（「トリインフルエンザ」とも呼ばれる）の高度に毒性の形態であり、大発生が世界中のいくつかの国で報告されている。多くの事例において、このトリインフルエンザは４８時間以内に１００％に近い死亡率をもたらしうる。最初に１９９７年に香港で同定された鳥類インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の他のアジア諸国およびヨーロッパへの広がりは、野鳥の移動パターンに関連することが提唱されている。
ヒトのインフルエンザに対抗する現行の方法は毎年のワクチン接種による。ワクチンは通常、次の「インフルエンザシーズン」で優勢株と予測されるいくつかの株の組み合わせである。この予測は世界保健機構によって統合される。一般的には、毎年産生されるワクチン用量の数は世界の集団のワクチン接種には十分ではない。例えば、カナダおよび米国は集団の約３分の１の免疫に十分なワクチン用量を得るが、欧州連合では集団の１７％しかワクチン接種することができない。インフルエンザワクチンの世界中の現行の産生は、世界的なインフルエンザパンデミックに直面して不十分であろうことは明らかである。ある年になんとかして必要な年間の産生量を満たすことができたとしても、優勢株は毎年変化し、したがってその年の中で必要性が低い時に備蓄することは実践的ではない。効果的なインフルエンザワクチンの経済的で大規模な産生は、政府および民間産業に同様に重大な関心事である。
ワクチンで使用されるウイルスストックは受精卵で産生される。ウイルス粒子を採取し、不活性化ウイルスワクチンのために、界面活性剤によって破壊して不活性化する。弱毒化生ワクチンは低温での増殖に適合したインフルエンザウイルスから作製され、これは正常体温では、ワクチンが弱毒化されることを意味する。かかるワクチンは、合衆国では５乃至４９歳の個人における使用が許可されている。不活性化全ウイルスワクチンは化学薬剤による不活性化によって無害にされ、それらは孵化卵または哺乳類細胞培養において産生されている。これらのすべてのタイプのワクチンはいくつかの特異的な利点および欠点を示す。全ウイルスに由来するワクチンの１つの利点は、かかるワクチンによって誘導される免疫のタイプである。一般に、スプリットワクチンは強い抗体応答を誘導するが、全ウイルスから作製されるワクチンは抗体（液性）および細胞応答の両方を誘導する。機能的抗体応答がワクチンによって誘導される防御と関連することが認可のための基準であっても、Ｔ細胞応答もインフルエンザ免疫において重要であり、高齢者においても良好な防御を提供できるという証拠が増えている。
細胞性免疫反応を誘導するために、全ウイルスから作製されたワクチンが開発された。インフルエンザ菌株（例えばＨ５Ｎ１）の高い病原性に起因して、これらのワクチンはＢＬ３＋施設中で産生される。Ｈ５Ｎ１などの高病原性インフルエンザ株については、いくつかの製造業者はインフルエンザ株の病原性を低下させて無発病性にし、より容易に孵化卵または哺乳類細胞培養において産生されるようにするために、赤血球凝集素遺伝子配列を修飾した。他の業者は、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのタンパク質の遺伝子配列が高収量低病原性インフルエンザドナー株中でクローン化されたリアソータントインフルエンザ株も使用する（Ａ／ＰＲ／８／３４；Quan F-S et al, 2007）。これらの方法は有用なワクチンを産生することができるが、例年の世界的な需要を満たすのに必要なスケールで、多量で低コストで迅速なワクチン産生の必要性に対する解決を提供せず、パンデミックに直面してほとんど確実に不十分となるだろう。
このリバースジェネティクス技術を使用する場合、ＨＡタンパク質の遺伝子配列を変異させて無発病性にすることが必要かもしれない。高病原性インフルエンザ株については、全ウイルスワクチンの産生は、封じ込め手順または生じたワクチンを循環ウイルスの遺伝子配列に正確に一致させないことのいずれかが必要とされる。弱毒化生ワクチンの事例において、投与されたワクチンが宿主からのインフルエンザウイルスと組換えを起こし、新しいインフルエンザウイルスをもたらすリスクがなお存在する。
この方法は抗原エピトープおよび翻訳後修飾を維持しているが、この方法には全ウイルスの使用に起因する汚染のリスクおよびウイルス株に依存する収率変動性を含む多数の短所がある。卵の中への導入に起因するウイルスの遺伝的異質性から、最適レベル以下の防御が生じうる。他の短所は、卵を得るための大規模な計画、精製において使用される化学物質に起因する汚染リスク、および長期の生産時間を含む。さらに、卵タンパク質に過度に感受性のある人は、ワクチンの服用にふさわしい候補ではない。
パンデミックの事例において、スプリットワクチン産生は、卵中の増殖のために株を適応させる必要性および達成される産生収率の変動性によって限定される。この技術は近年季節性ワクチンの産生のために使用されてきたが、パンデミックに対して妥当な時間枠で対応することはほとんどできず、世界的な製造能力は限定されている。
インフルエンザウイルスは、卵の使用を回避するために哺乳類細胞培養（例えばＭＤＣＫ細胞またはＰＥＲＣ．６細胞または同種のもの）においても産生されている。別のアプローチは、ウイルス遺伝子による細胞の形質転換によってウイルスが産生されるリバースジェネティクスである。しかしながら、これらの方法は手の込んだ方法および特殊な培養環境に加えて全ウイルスの使用も必要とする。
いくつかの組換え産物が組換えインフルエンザワクチン候補として開発されている。これらのアプローチは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Crawford et al, 1999; Johansson, 1999）、ウイルスベクターおよびＤＮＡワクチンコンストラクト（Olsen et al., 1997）を使用するこれらのタンパク質の発現を含む、インフルエンザＡ型のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現、産生および精製に焦点を当てられる。
「ブタインフルエンザ」（株Ａ／カリフォルニア／０４／０９）の大発生が最近重要である。メキシコにおける最初の大発生によりこのウイルス株は数日のうちに世界の注目を集め、インフルエンザの感染が迅速であることの証として世界中の国で検出され、それに加えて、隔離、抗ウイルス薬産生、伝染病制御および最終的にはワクチン産生のための試験となった。
インフルエンザウイルス感染の詳細は周知である。簡潔には、感染サイクルは、シアル酸含有細胞受容体（糖タンパク質および糖脂質）へのビリオン表面のＨＡタンパク質の付着によって開始される。ＮＡタンパク質はシアル酸受容体のプロセシングを媒介し、細胞の中へのウイルス侵入はＨＡ依存性受容体媒介性エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを含有する内部移行されたエンドソームの酸性域の中で、ＨＡタンパク質はコンフォメーション変化し、ウイルス膜および細胞膜の融合、ならびにウイルス脱外被、ならびにヌクレオカプシドと会合したリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）からのＭＩタンパク質のＭ２媒介性放出をもたらし、ＲＮＰはウイルスＲＮＡ合成のために細胞核へと移動する。ＨＡタンパク質に対する抗体はウイルス感染性を中和することによってウイルス感染を妨害するが、ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス複製の初期段階でのＮＡタンパク質の作用を干渉する。
Crawford et al. (1999)は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるインフルエンザＨＡの発現を開示する。発現されたタンパク質は、トリＨ５およびＨ７インフルエンザ亜型によって引き起こされる致死性インフルエンザ疾患を妨害することができると記載されている。Johansson et al. (1999)は、バキュロウイルスにより発現されたインフルエンザのＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、従来のワクチンによって誘導されたものより優れた免疫応答を動物中で誘導することを教示する。バキュロウイルスにより発現されたウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素の免疫原性および有効性は、相同なＤＮＡワクチン候補と匹敵していた（Olsen et al., 1997）。まとめると、これらのデーターは、インフルエンザウイルスの攻撃感染(influenza virus challenge)に対する高度の防御を、異なる動物モデルにおいて様々な実験的アプローチを使用して、組換えのＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質により誘導できることを実証する。
表面のインフルエンザ糖タンパク質（ＨＡおよびＮＡ）はインフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発のための一次標的であること、およびＭ１はインフルエンザへの細胞性免疫のための保存された標的を提供することが従来の研究により示されているので、新しいワクチン候補は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質の巨大分子性粒子としてこれらのウイルス抗原を含むことができる。ワクチン製品として、ＶＬＰは、サブユニット抗原または組換え抗原よりも免疫原性が高いという長所があり、液性免疫反応および細胞性免疫反応の両方を刺激することができる（Grgacic and Anderson, 2006）。さらに、これらのインフルエンザ抗原を持つ粒子は、インフルエンザウイルスの複数の株に対する中和抗体を誘発するコンフォメーショナルエピトープを提示することができる。
ワクチン目的のための非感染性インフルエンザウイルス株の産生は、不慮の感染を回避する１つの手段である。あるいは、培養されたウイルスの代替物としてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が研究されている。ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するがゲノムを欠損し、したがって複製または二次感染の手段を提供することができない。
いくつかの研究により、組換えインフルエンザタンパク質は、哺乳類発現プラスミドまたはパキュロウイルスベクターを使用する細胞培養においてＶＬＰへと自己集合することが実証された（Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham and Galarza, 2001）。Gomez-Puertas et al. (1999)は、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成がいくつかのウイルスタンパク質の発現レベルに依存することを開示する。Neumann et al. (2000)は、もっぱらクローン化されたｃＤＮＡから感染インフルエンザウイルス様粒子を生成するために哺乳類の発現プラスミドに基づくシステムを確立した。Latham and Galarza (2001)は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスにより感染した昆虫細胞中のインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。これらの研究は、インフルエンザビリオンタンパク質は真核生物細胞中で共発現させると自己集合できることを実証した。
Gomez-Puertas et al. (2000)は、赤血球凝集素（ＨＡ）に加えてインフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）が昆虫細胞からのＶＬＰ出芽に必須であることを教示する。しかしながら、Chen et al. (2007)は、Ｍ１はＶＬＰ形成に必要とされない可能性を教示し、Ｍ１およびＶＬＰの効率的な放出はＨＡの存在およびＮＡにより提供されるシアリダーゼ活性を必要とすることを観察した。ＮＡは細胞表面で糖タンパク質のシアル酸を切断し、ＶＬＰを産生し、培地中にＶＬＰを放出する。
Quan et al 2007は、バキュロウイルス発現システム（昆虫細胞）で産生されたＶＬＰワクチンは、インフルエンザウイルスのいくつかの株（Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１））に対する防御免疫を誘導することを教示する。Quanによって研究されたＶＬＰは原形質膜から出芽することが観察され、哺乳類システム（ＭＤＣＫ細胞）で得られるものに類似する正しいサイズおよび形態であると判断された。
ＰＣＴ公報ＷＯ２００４／０９８５３０およびＷＯ２００４／０９８５３３は、培養中の形質転換されたＮＴ−１（タバコ）細胞におけるニューカッスル病ウイルスＨＮまたは鳥類インフルエンザＡ型／シチメンチョウ／ウィスコンシン／６８（Ｈ５Ｎ９）の発現を教示する。植物細胞の培養で発現されたポリペプチドを含む組成物は、ウサギおよびニワトリにおいて多様な免疫応答を誘発する。
エンベロープウイルスは感染細胞から「出芽」するときに脂質エンベロープを得て、原形質膜からまたは細胞内小器官の膜から膜を得ることができる。インフルエンザウイルス粒子およびＶＬＰは宿主細胞の原形質膜から出芽する。哺乳類の細胞システムまたはバキュロウイルス細胞システムにおいて、例えば、インフルエンザは原形質膜から出芽する（Quan et al 2007）。少数のエンベロープウイルスのみが植物に感染することが公知である（例えばトポウイルスおよびラブドウイルスのメンバー）。公知の植物のエンベロープウイルスは、原形質膜からではなく宿主細胞の内膜から出芽することによって特徴づけられる。少数の組換えＶＬＰは植物の宿主において産生されたが、どれも原形質膜に由来せず、植物において原形質膜に由来するＶＬＰ（インフルエンザＶＬＰを含む）を産生することができるかという疑問が生じる。
現行のインフルエンザＶＬＰ生産技術は複数のウイルスタンパク質の共発現に依存し、パンデミックおよび毎年の流行の事例においては応答時間がワクチン接種に重要であるので、この依存性はこれらの技術の短所となる。ワクチンの開発を加速するために、より単純なＶＬＰ産生システム、例えば、非構造ウイルスタンパク質の発現を必要とせずに、１つのみまたは少数のウイルスタンパク質の発現によるものが所望される。
インフルエンザから世界人口を守り、将来のパンデミックを食い止めるために、ワクチン製造業者は、ワクチン用量を産生する効果的な迅速な方法を開発する必要があるだろう。ワクチンを産生するための受精卵の現行の使用は不十分であり、長いプロセスを含む。ワクチンを産生するための受精卵の現行の使用は不十分であり、長いプロセスを含む。
本発明の目的は、改善されたインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供することである。
本発明に従えば、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスからの抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供され、抗原はインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）である。好ましくは、抗原はインフルエンザＡ型／カリフォルニア／０４／０９からのＨＡである。
ＨＡは天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含むことができ、非天然のシグナルペプチドはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドでありえる。
核酸によってコードされるＨＡは、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６を含む群から選択されたＡ型インフルエンザの亜型でありえる。本発明のいくつかの態様において、核酸によってコードされるＨＡはＡ型インフルエンザに由来し、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９を含む群から選択することができる。好ましくは、インフルエンザＨＡは、株Ａ／カリフォルニア／０４／０９に由来する。
本発明は、植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスからの抗原、例えば株Ａ／カリフォルニア／０４／０９からのインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードする核酸を、植物またはその一部の中へ導入することと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物またはその一部をインキュベーションし、それによってＶＬＰを産生することと
を含む方法も提供する。
方法は、植物を採取する工程および植物の組織からＶＬＰを精製または分離する工程をさらに含むことができる。
方法は、導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含むことができる。
１つまたは複数のシャペロンタンパク質はＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択することができる。
本発明は、導入工程（工程ａ）において、核酸が植物中で一過性に発現されるかまたは植物中で安定的に発現される、上記方法を含む。さらに、ＶＬＰはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することができる。
本発明の別の態様に従えば、植物または植物の一部を提供することと、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されたインフルエンザＡ型／カリフォルニア／０４／０９からのＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むことと、核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベーションし、それによってＶＬＰを産生することとを含む植物中でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法が提供される。
方法は、植物を収穫する工程および植物の組織からＶＬＰを精製または分離する工程をさらに含むことができる。
本発明は、提供工程に続いて、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が導入され、核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部がインキュベーションされ、それによってＶＬＰが産生される、上記方法を含む。
１つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択することができる。
本発明は、導入工程（工程ａ）において、インフルエンザＡ型／カリフォルニア／０４／０９からのＨＡをコードする核酸が植物中で安定的に発現される、上記方法を含む。さらに、ＶＬＰはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することができる。
本発明は、株Ａ／カリフォルニア／０４／０９からのインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、および植物に由来する１つまたは複数の脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）も提供する。
ＶＬＰのＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群から選択されたＡ型インフルエンザＨＡの亜型でありえる。本発明のいくつかの態様において、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９を含む群から選択されたＡ型インフルエンザに由来する。
効果的な用量のＶＬＰ（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含むＶＬＰ）および薬学的に許容される担体を含む組成物も本発明中に含まれる。
本発明は、植物中でＶＬＰを形成するＨＡタンパク質の断片または一部も意図する。
本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾されたＮ−グリカンを持つインフルエンザウイルスＨＡを含むＶＬＰにも関する。ＶＬＰのＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群から選択されたＡ型インフルエンザＨＡの亜型でありえる。本発明のいくつかの態様において、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７およびＨ９を含む群から選択されたＡ型インフルエンザに由来する。
ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６、または断片もしくはその一部を含む、１つまたは複数の亜型のＨＡタンパク質を含むことができる。そのようなＨＡタンパク質を含む亜型の例には以下が含まれる。かかるＨＡタンパク質を含む亜型の実例は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／１９９５、Ａ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／テキサス／３２／２００３、Ａ／マガモ／ＭＮ／３３／００、Ａ／アヒル／上海／１／２０００、Ａ／キタオナガガモ／テキサス／８２８１８９／０２、Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ハシビロガモ／イラン／Ｇ５４／０３、Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／アヒル／イギリス／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／マガモ／グルジェブ（Ｇｕｒｊｅｖ）／２６３／８２、Ａ／アヒル／オーストラリア／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／リー／４０、Ｃ／ヨハネスブルグ／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）を含む。
本発明の１つの態様において、ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７またはＨ９亜型でありえる。別の態様において、Ｈ１タンパク質は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）株からでありえる。Ｈ３タンパク質は、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）またはＡ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株からでもありえる。本発明のさらなる態様において、Ｈ２タンパク質は、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株からでありえる。Ｈ５タンパク質は、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）またはＡ／インドネシア／５／２００５株からでありえる。本発明の１つの態様において、Ｈ６タンパク質は、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株からでありえる。Ｈ７タンパク質は、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）株からでありえる。本発明の１つの態様において、Ｈ９タンパク質はＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株からである。本発明のさらなる態様において、ＨＡタンパク質はインフルエンザウイルスからでありえ、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４またはＢ／フロリダ／４／２００６を含むＢ型ウイルスでありえる。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢ亜型からのＨＡタンパク質のアミノ酸配列の実例は、配列番号：４８〜５９および１２８を含む。
インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、株Ａ／インドネシア／０５／０５（Ｈ５Ｎ１）からのＨ５、または株Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１でありえる。
本発明は、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子も提供する。核酸分子は、ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたは複数の調節領域をさらに含むことができる。核酸分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、ＢまたはＣをコードする配列を含むことができる。本発明の別の態様において、核酸分子によってコードされるＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢ亜型でありえる。核酸分子によってコードされるＨ１タンパク質は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）株からである。本発明の１つの態様において、核酸分子によってコードされるＨ３タンパク質は、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）株からでありえる。本発明のさらなる態様において、核酸分子によってコードされるＨ２タンパク質はＡ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）株からでありえる。核酸分子によってコードされるＨ５タンパク質は、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）またはＡ／インドネシア／５／２００５株からでもありえる。本発明の１つの態様において、核酸分子によってコードされるＨ６タンパク質は、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）株からでありえる。核酸分子によってコードされるＨ７タンパク質はＡ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）株からでありえる。さらに、核酸分子によってコードされるＨ９タンパク質はＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）株からでありえる。核酸によってコードされるＢ亜型からのＨＡタンパク質は、Ｂ／フロリダ／４／２００６、またはＢ／マレーシア／２５０６／２００４株からでありえる。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢ亜型からのかかるＨＡタンパク質をコードする核酸分子の配列の実例は、配列番号：３６〜４７、６０〜７３および１２７を含む。
核酸配列は、株Ａ／インドネシア／０５／０５（Ｈ５Ｎ１）、または株Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）からのインフルエンザウイルスＨＡタンパク質をコードすることができる。
ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結することができる調節領域は、植物細胞、昆虫細胞または酵母細胞中で作動可能なものを含む。かかる調節領域は、プラストシアニン調節領域、リブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の調節領域、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）、ＳＴ−ＬＳ１、ポリヘドリン調節領域、またはｇｐ６４調節領域を含むことができる。他の調節領域は５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはターミネーター配列を含む。プラストシアニン調節領域はアルファルファのプラストシアニン調節領域でありえ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲまたはターミネーター配列もアルファルファ配列でありえる。
インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法も提供され、方法はウイルス様粒子（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を投与することを含む。ウイルス様粒子は、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で被験体に投与することができる。
本発明は、インフルエンザ、麻疹、エボラ、マールブルクおよびＨＩＶからなる群から選択されたウイルスに由来する１つまたは複数のタンパク質ならびにシアル化しない宿主産生細胞に由来する１つまたは複数の脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）にも関する。ＨＩＶタンパク質はｐ２４、ｇｐ１２０またはｇｐ４１でありえ、エボラウイルスタンパク質はＶＰ３０またはＶＰ３５でありえ、マールブルグウイルスタンパク質はＧｐ／ＳＧＰでありえ、麻疹ウイルスタンパク質はＨタンパク質またはＦタンパク質でありえる。
さらに、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。例えば、宿主が昆虫ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の昆虫の脂質を含み、または宿主が酵母ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の酵母の脂質を含みうる。
本発明は、２つまたはそれ以上の株またはインフルエンザの亜型のＶＬＰを含む組成物にも関する。２つまたはそれ以上の亜型または株は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／インドネシア／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／１９９５、Ａ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／テキサス／３２／２００３、Ａ／マガモ／ＭＮ／３３／００、Ａ／アヒル／上海／１／２０００、Ａ／キタオナガガモ／テキサス／８２８１８９／０２、Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ハシビロガモ／イラン／Ｇ５４／０３、Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／アヒル／イギリス／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／マガモ／グルジェブ／２６３／８２、Ａ／アヒル／オーストラリア／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／リー／４０、Ｃ／ヨハネスブルグ／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、またはＡ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）を含む群から選択することができる。ＶＬＰの２つまたはそれ以上の亜型または株がほぼ等量であるか、あるいは１つまたは複数の亜型または株が示される株または亜型の大部分を占めることができる。
本発明は、１つまたは複数のＶＬＰ（シアル化しない宿主、例えば植物宿主、昆虫宿主、酵母宿主を使用して産生されたＶＬＰ）を含む、効果的な用量のワクチンを投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を動物または標的の生物中で誘導する方法に関する。ワクチンは、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で投与することができる。標的生物は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ、イヌ、ネコ、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラ、および同種のものを含む群から選択することができる。
本発明は、ＶＬＰを産生することができる適切な宿主（例えば植物、昆虫、または酵母）中の異なるインフルエンザ株から赤血球凝集素（ＨＡ）を含有するＶＬＰを産生する方法を提供する。植物において産生されるＶＬＰは、植物起原の脂質を含有し、昆虫細胞において産生されたＶＬＰは、昆虫細胞の原形質膜からの脂質（一般的には「昆虫脂質」と呼ばれる）を含み、酵母において産生されたＶＬＰは、酵母細胞の原形質膜からの脂質（一般的には「酵母脂質」と呼ばれる）を含む。
本発明は、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスからの抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物、植物組織または植物細胞にも関する。抗原はインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）でありえる。好ましくは、抗原はインフルエンザＡ型／カリフォルニア／０４／０９からのＨＡである。
植物は、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含むことができる。１つまたは複数のシャペロンタンパク質はＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択することができる。
植物中のＶＬＰの産生は、昆虫細胞培養中のこれらの粒子の産生を上回るいくつかの利点を示す。植物脂質は特異的な免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を促進することができる。植物膜は脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からできており、植物ならびにある種の細菌および原虫類に特有なグリコスフィンゴ脂質も含有する。スフィンゴ脂質は、ＰＣまたはＰＥのようなグリセロールのエステルではなく、むしろ１８個以上の炭素を含有する脂肪酸鎖とアミド結合を形成する長鎖アミノアルコールからなるという点で独特である。スフィンゴ糖脂質に加えてＰＣおよびＰＥは、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに胸腺および肝臓中のＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞などの哺乳類の免疫細胞によって発現されるＣＤ１分子と結合することができる（Tsuji M, 2006）。さらに、植物脂質の存在下のアジュバント効果の可能性に加えて、植物Ｎ−グリカンが抗原提示細胞による糖タンパク質抗原の捕捉を促進する能力（Saint-Jore-Dupas, 2007）は、植物中のＶＬＰの産生で有利でありえる。
理論に束縛されるものではないが、植物で作製されたＶＬＰが他の製造システムにおいて作製されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し、生全ウイルスワクチンまたは弱毒化全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応と比較した場合、植物で作製されたＶＬＰによって誘導された免疫反応がより強くなることが予想される。
全ウイルスから作製されたワクチンとは異なって、ＶＬＰは非感染性であり、したがって制限的な生物学的封じ込めは、感染性の全ウイルスを用いて作業するときほど重要な問題ではなく、産生には必要とされないので、ＶＬＰは有利である。植物で作製されたＶＬＰは、発現システムを温室または野外で生育させることを可能にし、したがって有意に経済的であることおよびスケールアップに適切であることによって、一層の利点をさらに提供する。
さらに、植物は、シアル酸残基の合成およびタンパク質への付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で産生することができ、植物中のＶＬＰ産生を保証するために、ＮＡを共発現する必要性、またはシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）により産生する細胞または抽出物を処理する必要性はない。
本発明に従って産生されたＶＬＰは、ＲＮＡを結合することが公知であるＭ１タンパク質を含まない。ＲＮＡはＶＬＰ調製物の混入物であり、ＶＬＰ産物についての規制認可を得るときには所望されない。
本発明のこの概要は必ずしも本発明のすべての特色を記載するとは限らない。
本発明のこれらおよび他の特色は添付の図面を参照する以下の記載からより明らかになるだろう。
本発明の実施形態に従う株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１の発現のために使用される、アルファルファのプラストシアニンベースの発現カセットの配列を示した図である（配列番号：８）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）シグナルペプチドに下線が引かれる。クローニングのために使用したＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）制限部位およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限部位は、太字で示される。 インフルエンザ赤血球凝集素の機能ドメインの概略図を示した図である。ＨＡ０の切断後に、ＨＡ１およびＨＡ２の断片は、ジスルフィド架橋によってともに結合されたままである。 株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からのＨＡ亜型Ｈ１の発現のために組み立てられたプラスミド５４０の説明を示した図である。 株Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）からのＨＡ亜型Ｈ５の発現のために組み立てられたプラスミド６６０の説明を示した図である。 赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を産生する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示した図である。ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）の溶出プロフィールを示す。 サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）に続く、Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウエスタンブロット；抗Ｈ１）を示した図である。 赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を産生する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示した図である。Ｈ５の溶出プロフィールを示し、ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）である。 サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）に続く、Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウエスタンブロット；抗Ｈ５）を示した図である。 ＦＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＮ末端断片をコードする配列を示した図である（配列番号：１）。 Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＣ末端断片をコードする配列を示した図である（配列番号：２）。 Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＨＡ０をコードする完全な配列を示した図である（配列番号：２８）。 最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位が隣接するＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードする配列を示した図である（配列番号：３） プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃの配列を示した図である（配列番号：４）。 プライマーＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒの配列を示した図である（配列番号：５）。 プライマーＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒの配列を示した図である（配列番号：６）。 プライマーＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒの配列を示した図である（配列番号：７）。 Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）；配列番号：９）のアミノ酸配列を示した図である。 Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）；配列番号：１０）のアミノ酸配列を示した図である。天然のシグナルペプチドは太字で示される。 インフルエンザＡ亜型Ｈ７のＨＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１１）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ２のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１２）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ３のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１３）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ４のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１４）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ５のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１５）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ６のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１６）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ８のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１７）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ９のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１８）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１０のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１９）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１１のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２０）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１２のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２１）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１３のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２２）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１４のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２３）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１５のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２４）。 インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１６のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２５）。 インフルエンザＢ型ＨＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２６）。 インフルエンザＣ型ＨＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２７）。 プライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２９）。 プライマーＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：３０）。 プライマーＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：３１）。 プライマーＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：３２）。 本明細書において使用されるいくつかのコンストラクトの図式的説明を示した図である。コンストラクト６６０は、プラストシアニンプロモーター（ｐｌａｓｔｏ）およびプラストシアニンターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結された、ＨＡ亜型Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み；コンストラクト５４０は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ ＰＤＩ）と組み合わせたＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み、プラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびプラストシアニンターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；コンストラクト５４４は、ＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））の発現のために組み立てられ、Ｈ１をコードするヌクレオチド配列は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ ＰＤＩ）およびＧＣＮ４ｐＩＩロイシンジッパー（Ｈ１の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の代わりに）と組み合わせて、プラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびプラストシアニンターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；ならびに、インフルエンザＡ型／ＰＲ／８／３４からのＭ１コード領域の発現のためのコンストラクト７５０は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲに組み合わせ、２つの３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターと作動可能に連結された。 コンストラクト６６０により形質転換されたＮ．ベンサミアナナ（Ｎ． ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉からのタンパク質抽出物における、抗Ｈ５（ベトナム）抗体を使用したＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の免疫検出を示した図である（レーン３）。市販のインフルエンザＡ型／ベトナム／１２０３／２００４からのＨ５を検出の陽性対照として使用し（レーン１）、空ベクターにより形質転換した葉からのタンパク質抽出物は陰性対照として使用した（レーン２）。 サイズ排除クロマトグラフィーによる赤血球凝集素構造の特性評価を示した図である。Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））、Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、可溶性Ｈ１、またはＨ１とＭ１を産生する個別のバイオマスからのタンパク質抽出物を、Ｓ−５００ ＨＲ上にゲル濾過によって分離した。ロゼット形態の市販のＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））も分画した（Ｈ１ロゼット）。図１３Ａは、相対的タンパク質含有量を分析した溶出画分を示す（相対的タンパク質レベル−バイオマス分画のスタンダードタンパク質溶出プロフィールが示される）。ブルーデキストラン２０００（２ＭＤａ参照スタンダード）の溶出ピークを示す。図１３Ｂは、抗Ｈ５（ベトナム）の抗体（Ｈ５に対する）によるイムノブロットによって赤血球凝集素の存在を分析した溶出画分を示す。図１３Ｃは、Ｈ１に対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。図１３Ｄは、可溶性Ｈ１に対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。図１３Ｅは、Ｈ１ロゼットに対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。図１３Ｆは、Ｈ１＋Ｍ１に対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。 ショ糖勾配遠心によるインフルエンザＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））構造の濃縮を示した図である。ショ糖密度勾配遠心からの画分の特性評価を示す。各々の画分は、抗Ｈ５（ベトナム）の抗体を使用するイムノブロットによるＨ５の存在（上部パネル）、ならびにそれらの相対的タンパク質含有量および赤血球凝集能（グラフ）について分析した。 ショ糖勾配遠心による赤血球凝集素濃縮画分の電子顕微鏡検査を示した図である。ショ糖勾配遠心からプールした画分１７、１８および１９のネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍに相当する。 インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示した図である。清澄化工程におけるタンパク質含有物のクマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。−レーン１、粗抽出物；レーン２、ｐＨ６に調整した抽出物；レーン３、熱処理した抽出物；レーン４、ＤＥで濾過した抽出物；フェチュイン親和性精製工程：レーン５、ロードしたもの；レーン６、フロースルー；レーン７、溶出したもの（１０倍濃縮）。 インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示した図である。精製されたＨ５ ＶＬＰサンプルのネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍに相当する。 インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示した図である。構造の詳細を示すために拡大した単離Ｈ５ ＶＬＰを示す。 インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示した図である。クマシー染色した還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンＡ）および株Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）からのＨＡに対して作製されたウサギポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロット（レーンＢ）上のＨ５ ＶＬＰ産物を示す。 インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、完全ｃｄｓのヌクレオチド配列を示した図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２８９９２９（配列番号：３３） タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示した図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ１１４９９（配列番号：３４）。 インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））セグメント７、完全配列のヌクレオチド配列を示した図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０１６．１（配列番号：３５）。 Ｈ５産生組織のポジティブ染色透過型電子顕微鏡観察によるＶＬＰ蓄積の局在を示した図である。ＣＷ：細胞壁、ｃｈ：葉緑体、ｐｍ：原形質膜、ＶＬＰ：ウイルス様粒子。バーは１００ｎｍに相当する。 植物で作製されたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の血清抗体応答の誘導を示した図である。筋肉内注射を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）に対して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数（reciprocal end-point titer）のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。 植物で作製されたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の血清抗体応答の誘導を示した図である。鼻腔内投与を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）に対して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。 植物で作製されたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の赤血球凝集阻害抗体応答（ＨＡＩ）を示した図である。筋肉内注射を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊および＊＊は、組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５および ｐ＜０．０１。 植物で作製されたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の赤血球凝集抑制抗体応答（ＨＡＩ）を示した図である。鼻腔内投与を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊および＊＊は、組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５および ｐ＜０．０１。 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＬＰの免疫原性に対するアジュバントの効果を示した図である。筋肉内注射を介して免疫されたマウスに対するミョウバンの効果を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。 Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＬＰの免疫原性に対するアジュバントの効果を示した図である。鼻腔内投与を介して免疫されたマウスに対するキトサンの効果を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。 Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））投与に対する抗体応答を示した図である。筋肉内投与を介して免疫されたマウスにおける追加接種３０日後の抗インドネシア／５／０５免疫グロブリンアイソタイプを示す。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｏｇ2）である。ＥＬＩＳＡは、コーティング剤として不活性化Ｈ５Ｎ１（Ａ／インドネシア／５／２００５）全ウイルスを使用して行われた。バーは平均偏差を表わす。＊および＊＊は、対応する組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））と比較して、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１。 Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））投与に対する抗体応答を示した図である。非活性化全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１））に対する抗体力価。すべての群は陰性対照に対して統計的な有意差がある。 第１の投薬１４日後（２週目）、追加接種１４日後（５週目）または追加接種３０日後（７週目）の、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスからの、同種の非活性化全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）に対する抗体力価を示した図である。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。＊は組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。 追加接種３０日後の、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスからの血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。非活性化全ウイルスに対する抗体力価を示す。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。すべての群は陰性対照に対して統計的な有意差がある。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。１０よりも少ない値はすべて、５（ｌｎでは１．６）の任意の値を与えられ、陰性であると判断される。 追加接種３０日後の、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスからの血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。様々な非活性化全ウイルスに対する赤血球凝集阻害力価を示す。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。すべての群は陰性対照に対して統計的な有意差がある。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。１０よりも少ない値はすべて、５（ｌｎでは１．６）の任意の値を与えられ、陰性であると判断される。 植物で作製されたＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の有効性を示した図である。１０００ＬＤ50（４．０９×１０6ＣＣＩＤ50）のインフルエンザ株Ａ／トルコ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１）による攻撃感染後(after challenge)のマウスの生存率を示す。 植物で作製されたＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の有効性を示した図である。攻撃感染後の免疫されたマウスの体重を示す。値は生存マウスの平均体重である。 植物に由来するインフルエンザＶＬＰの起原を示した図である。精製されたインフルエンザＶＬＰの極性脂質組成物を示す。４０μｇのタンパク質の相当物に含有される脂質を、記載されるようにＶＬＰから抽出し、ＨＰ−ＴＬＣによって分離し、高度に精製されたタバコ原形質膜（ＰＭ）から単離した脂質の移動プロフィールに対して比較した。脂質略称は以下のとおりである。ＤＧＤＧ、ジガラクトシルジアシルグリセロール；ｇｌｕＣＥＲ、グルコシルセラミド；ＰＡ、ホスファチン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ ａｃｉｄ）；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＳＧ、ステリルグリコシド。 植物に由来するインフルエンザＶＬＰの起原を示した図である。精製されたインフルエンザＶＬＰの中性脂質組成を示す。２０μｇのタンパク質の相当物に含有される脂質は、記載されるようにＶＬＰから抽出され、ＨＰ−ＴＬＣによって分離され、シトステロールの移動と比較された。 植物に由来するインフルエンザＶＬＰの起原を示した図である。精製されたＶＬＰならびにタバコ葉（ＰＭＬ）およびＢＹ２タバコ細胞（ＰＭＢＹ２）から高度に精製されたＰＭ中の原形質膜マーカーのプロトンポンプＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ）の免疫検出を示す。１８マイクログラムのタンパク質を各々のレーン中にロードした。 クローン７７４のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３６）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７７５のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３７）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７７６のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３８）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７７７のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３９）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７７８のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４０）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７７９のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ｂ／フロリダ／４／２００６のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４１）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７８０のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４２）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７８１のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４３）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７８２のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４４）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７８３のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４５）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７８４のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ウマ／プラハのヌクレオチド配列／５６（Ｈ７Ｎ７））を示した図である（配列番号：４６）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７８５のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４７）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。 クローン７７４（Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４８）を示した図である。クローン７７４のオープンリーディングフレームは図２８中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７７５（Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４９）を示した図である。クローン７７５のオープンリーディングフレームは図２９中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７７６（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５０）を示した図である。クローン７７６のオープンリーディングフレームは図３０中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７７７（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５１）を示した図である。クローン７７７のオープンリーディングフレームは図３１中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７７８（Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５２）を示した図である。クローン７７８のオープンリーディングフレームは図３２中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７７９（Ｂ／フロリダ／４／２００６）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５３）を示した図である。クローン７７９のオープンリーディングフレームは図３３中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７８０（Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５４）を示した図である。クローン７８０のオープンリーディングフレームは図３４中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７８１（Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５５）を示した図である。クローン７８１のオープンリーディングフレームは図３５中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７８２（Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５６）を示した図である。クローン７８２のオープンリーディングフレームは図３６中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７８３（Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５７）を示した図である。クローン７８３のオープンリーディングフレームは図３７中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７８４（Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５８）を示した図である。クローン７８４のオープンリーディングフレームは図３８中で示されたＡＴＧで開始する。 クローン７８５（Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５９）を示した図である。クローン７８５のオープンリーディングフレームは図３９中で示されたＡＴＧで開始する。 植物で産生されたＶＬＰのサイズ排除クロマトグラフィー後の溶出画分７〜１７の免疫検出（ウエスタンブロット）を示した図である。ブルーデキストランの溶出ピーク（画分１０）は矢印によって示される。赤血球凝集素亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６およびＨ９を示す。赤血球凝集素は画分７〜１４中で検出され、ＶＬＰの溶出に対応する。 一連の各年の流行株からの赤血球凝集素の発現のイムノブロット分析を示した図である。様々なインフルエンザ株（イムノブロットの上部に示す）からのＨＡを発現する植物について、１０および２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物を、それぞれレーン１および２中にロードした。 一連の可能性のあるパンデミック株からの一連のＨ５赤血球凝集素の発現のイムノブロット分析を示した図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物を、それぞれレーン１および２中にロードした。 選択されたインフルエンザ株からのＨ２、Ｈ７およびＨ９赤血球凝集素の発現のイムノブロット分析を示した図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物を、それぞれレーン１および２中にロードした。 ＡＧＬ１／６６０でアグロインフィルトレーションしたニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）葉からのタンパク質抽出物における株Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のイムノブロットを示した図である。２つの植物（植物１および植物２）をインフィルトレーションし、各々の植物から抽出した１０および２０μｇの可溶性タンパクをそれぞれレーン１および２中にロードした。 血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。植物で作製されたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））による第１の免疫１４日後のフェレット血清における赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価。ＨＡＩ抗体応答は以下の不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルスを使用して測定された。Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５、Ａ／ベトナム／１１９４／０４、Ａ／アンホイ／５／０５およびＡ／インドネシア／５／０５と同種の株。値は、１群あたり５匹のフェレットの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｏｇ2）である。斜め縞−Ａ／インドネシア／６／０６（クレード２．１．３）；市松模様−Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（クレード２．２）；白色の棒−Ａ／ベトナム／１１９４／０４（クレード１）；黒色の棒Ａ／アンホイ／５／０５。レスポンダーが示される。バーは平均偏差を表わす。 血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。植物で作製されたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））による第２の追加接種の１４日後のフェレット血清における赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価。ＨＡＩ抗体応答は以下の不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルスを使用して測定された。Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５、Ａ／ベトナム／１１９４／０４、Ａ／アンホイ／５／０５およびＡ／インドネシア／５／０５と同種の株。値は、１群あたり５匹のフェレットの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｏｇ2）である。斜め縞−Ａ／インドネシア／６／０６（クレード２．１．３）；市松模様−Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（クレード２．２）；白色の棒−Ａ／ベトナム／１１９４／０４（クレード１）；黒色の棒Ａ／アンホイ／５／０５。レスポンダーが示される。バーは平均偏差を表わす。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号６６０）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６０）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からのＨ１の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号５４０）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６１）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７７４）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６２）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７７５）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６３）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）からのＨ２の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８０）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６４）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）からのＨ５の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８１）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６５）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）からのＨ５の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８２）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６６）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）からのＨ６の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８３）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６７）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）からのＨ９の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８５）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６８）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）からのＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６９）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）からのＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７０）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ウマ／プラハからのＨ７の赤血球凝集素コード配列、／５６（Ｈ７Ｎ７）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７１）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４からのＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７２）を示した図である。 アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７３）を示した図である。 Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：３３によってコードされる）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４８）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４９）および配列番号：９のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号：７４）を示した図である。Ｘ１（ポジション３）はＡまたはＶであり；Ｘ２（ポジション５２）はＤまたはＮでありＸ３（ポジション９０）はＫまたはＲであり；Ｘ４（ポジション９９）はＫまたはＴであり；Ｘ５（ポジション１１１）はＹまたはＨであり；Ｘ６（ポジション１４５）はＶまたはＴであり；Ｘ７（ポジション１５７）はＥまたはＫであり；Ｘ８（ポジション１６２）はＲまたはＫであり；Ｘ９（ポジション１８２）はＶまたはＡであり；Ｘ１０（ポジション２０３）はＤまたはＮであり；Ｘ１１（ポジション２０５）はＲまたはＫであり；Ｘ１２（ポジション２１０）はＴまたはＫであり；Ｘ１３（ポジション２２５）はＲまたはＫであり；Ｘ１４（ポジション２６８）はＷまたはＲであり；Ｘ１５（ポジション２８３）はＴまたはＮであり；Ｘ１６（ポジション２９０）はＥまたはＫであり；Ｘ１７（ポジション４３２）はＩまたはＬであり；Ｘ１８（ポジション４８９）はＮまたはＤである。 配列番号：３３によってコードされるＨ１ニューカレドニア（ＡＡＰ３４３２４．１）のアミノ酸配列（配列番号：７５）を示した図である。 配列番号：３５によってコードされるＨ１プエルトリコ（ＮＣ＿０４０９８７８．１）のアミノ酸配列（配列番号：７６）を示した図である。 ＰａｃＩ（上流プロモーター）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）の発現カセット番号８２８の一部の核酸配列を示した図である。変異させたＡＴＧを持つＣＰＭＶ ＨＴ ５’ＵＴＲ配列に下線が引かれる。ＡｐａＩ制限部位（発現されるタンパク質コード配列、この事例においてＣ５−１κ軽鎖のＡＴＧのすぐ上流）。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）までのコンストラクト番号６６３の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５からの）コード配列に下線が引かれる。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７８７の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＨ１（Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からの）コード配列に下線が引かれる。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７９０の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＨ３（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からの）コード配列に下線が引かれる。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７９８の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＢ／フロリダ／４／２００６コード配列からのＨＡに下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号５８０の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からの）のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号６８５の一部の核酸配列を示した図である。Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号６８６の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＡ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３２の一部の核酸配列を示した図である。Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３３の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合されたＡ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３５の一部の核酸配列を示した図である。Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３６の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＡ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３のコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３８の一部の核酸配列を示した図である。Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのコード配列に下線が引かれる。 ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３９の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ ＳＰと融合させたＢ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのコード配列に下線が引かれる。 Ｍｓｊ１をコードする核酸配列（配列番号：１１４）を示した図である。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８５０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ４０コード配列に下線が引かれる。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８６０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ７０コード配列に下線が引かれる。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ４０コード配列は下線を引いたイタリック体であり、ＨＳＰ７０コード配列は下線が引かれる。ヌクレオチド１〜５００３を示す。 ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ４０コード配列は下線を引いたイタリック体であり、ＨＳＰ７０コード配列は下線が引かれる。ヌクレオチド５００４〜９４９３を示す。 コンストラクトＲ４７２の図式的説明を示す。 アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼからのシグナルペプチドを使用するＨＡの発現のイムノブロット分析を示した図である。５マイクログラムのＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））が使用された以外は、３つの個別の植物から得られた２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。示された対照（同種株の非活性化全ウイルス（ＷＩＶ））を、５又は２０マイクログラムのモックインフィルトレーションした植物にスパイク(spike)した。ａ）Ａ／ニューカレドニア／２０／９９からのＨ１の発現を示す。ｂ）Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１の発現を示す。ｃ）Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３の発現を示す。ｄ）Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の発現を示す。ｅ）Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡの発現を示す。矢印はＨＡ０に対応する免疫反応性バンドを示す。ＳＰ ＷＴ：天然のシグナルペプチド、ＰＳ ＰＤＩ：アルファルファのＰＤＩシグナルペプチド。 葉タンパク質抽出物のイムノブロット分析によるＨＡ発現ストラテジーの比較を示す。ＨＡはプラストシアニンベースのカセットまたはＣＰＭＶ−ＨＴベースのカセットを使用して産生した。ＣＰＭＶ−ＨＴについては、野生型ＨＡシグナルペプチドおよびアルファルファのＰＤＩからのシグナルペプチドも比較した。Ｈ１ニューカレドニアについては５マイクログラムをロードした以外は、分析されるＨＡ亜型について２０マイクログラムのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ａ）Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からのＨ１の発現を示す。ｂ）Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１の発現を示す。ｃ）Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３の発現を示す。ｄ）Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の発現を示す。ｅ）Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＢの発現を示す。矢印はＨＡ０に対応する免疫反応性バンドを示し、ＨＡ発現のために使用した特異的なベクターを含む特異的なアグロバクテリウム株をレーンのトップに示す。 Ｈｓｐ ４０およびＨｓｐ７０を共発現した場合のＨＡ蓄積のイムノブロットを示した図である。Ｈ１ニューカレドニア（ＡＧＬ１／５４０）およびＨ３ブリズベーン（ＡＧＬ１／７９０）を単独で発現させるかまたはＡＧＬ１／Ｒ８７０と共発現させた。ＨＡ蓄積レベルはインフィルトレーションした葉からのタンパク質抽出物のイムノブロット分析によって評価した。株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９の非活性化全ウイルス（ＷＩＶ）またはブリズベーン／１０／２００７を対照として使用した。 Ａ／カリフォルニア／０４／０９（コンストラクト番号５６０）からのＨ１についてのＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットを示した図である。 インフィルトレーション２日後にアグロインフィルトレーションした植物からのタンパク質抽出物におけるＡ／カリフォルニア／０４／０９からのＨ１のウエスタンブロット解析を示した図である。各々のレーン中に泳動したサンプルを表２０中で示す。 Ａ／カリフォルニア／０４／０９（カセット番号５６０）からのＨ１についてのＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットのヌクレオチド配列（配列番号：１２７）を示した図である。アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドのコード配列に下線が引かれ、成熟Ｈ１コード配列は太字で強調される。 Ａ／カリフォルニア／０４／０９（配列番号：１２７によってコードされる）からのＨ１のアミノ酸配列（配列番号：１２８）を示した図である。アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドに下線が引かれる。 ２×３５Ｓプロモーター（配列番号：１２９）のヌクレオチド配列を示した図である。 ＰａｃＩ（上流プロモーター）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）の中間発現カセット番号９７２（配列番号：１３４）のヌクレオチド配列を示した図である。２×３５Ｓプロモーター配列に下線が引かれる。変異させたＡＴＧは囲まれている。ＡｐａＩ制限部位（発現されるタンパク質コード配列、この事例においてＨ５ Ａ／インドネシアのＨＡ０についてのＡＴＧのすぐ下流）は網掛けされる。 天然のＨ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列（配列番号：１３５）のヌクレオチド配列を示した図である。天然のＨ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９シグナルペプチドに下線が引かれる。ＳａｃＩ部位およびＳｔｕＩの制限部位は囲まれている。 Ｈ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列を含有する合成の最終配列（配列番号：１３６）のヌクレオチド配列を示した図である。ＤｒａＩＩＩ制限部位からＡｐａＩ制限部位のＭタンパク質部分に下線が引かれる。ＰＤＩＳＰは太字である。変異させたＳａｃＩ制限部位およびＳｔｕＩ制限部位は囲まれている。 ＰＣＲベースのライゲーションを使用してＨ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列を合成するために使用される断片１（配列番号：１３７）、断片２（配列番号：１３８）および断片３（配列番号：１３９）のヌクレオチド配列を示した図である。 ＰａｃＩ（上流プロモーター）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）の発現カセット番号５６０（配列番号：１４６）のヌクレオチド配列を示した図である。ＰＤＩＳＰ−ＨＡ０ Ｈ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列に下線が引かれる。
本発明はウイルス様粒子の産生に関する。より具体的には、本発明はインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
以下の記載は好ましい実施形態である。
本発明は、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されたエンベロープウイルス（例えばインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ））からの抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
さらに、本発明は、植物においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法を提供する。方法は、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入すること、および核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の一部をインキュベーションし、それによってＶＬＰを産生することを含む。
ＶＬＰはインフルエンザウイルスから産生することができるが、ＶＬＰは、麻疹、エボラ、マールブルクおよびＨＩＶを含むが、これらに限定されない、他の原形質膜に由来するウイルスからも産生することができる。
本発明は、例えば、非常に優勢なＡ（Ｈ１Ｎ１）亜型（例えばＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、Ａ／インドネシア／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（配列番号：６０）およびそれほど一般的でないＢ型（例えば配列番号：２６、図１０Ｏ）およびＣ型（配列番号：２７、図１０Ｐ）を含むが、これらに限定されない、ヒトに感染することができるすべての型のインフルエンザウイルスのＶＬＰ、ならびに他のインフルエンザ亜型から得られるＨＡを含む。他のインフルエンザ亜型、例えばＡ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１；配列番号：４８）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１；配列番号：４９）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２；配列番号：５４）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１；配列番号：５５）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；配列番号：５６）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１；配列番号：５７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２；配列番号：５９）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２；配列番号：５０）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２；配列番号：５１）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７；配列番号：５８）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（配列番号：５２）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（配列番号：５３）または、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：１２７）のＶＬＰも本発明中に含まれる。
本発明は、他の哺乳類または宿主動物、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ、鳥類、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラ、および同種のものに感染するインフルエンザウイルスにも関する。
原形質膜に由来するウイルスにおいて発現されうる他の抗原の非限定例は、ＨＩＶのカプシドタンパク質ｐ２４；ＨＩＶのエンベロープタンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ４１、フィロウイルス（例えばエボラ、マールブルク）の構造タンパク質ＶＰ３０およびＶＰ３５；Ｇｐ／ＳＧＰ（糖鎖付加された膜内在性タンパク質）、またはパラミクソウイルス（例えば麻疹）のＨタンパク質およびＦタンパク質を含む。
本発明は、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得る、インフルエンザに由来するＶＬＰも含むが、これらに限定されない。例えば、ＶＬＰが植物をベースのシステム中で発現されるならば、ＶＬＰは細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得ることができる。
一般的には、「脂質」という用語は、脂溶性（親油性）で天然に存在する分子を指す。この用語は、より具体的には、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリドならびにリン脂質を含む）に加えて、他の脂溶性のステロール含有代謝物質またはステロールを指すのにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロールおよびタンパク質と共に、すべての生体膜の主要な成分である。リン脂質の実例は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよび同種のものを含む。ステロールの実例は、動物性ステロール（例えばコレステロール）および植物性ステロール（例えばシトステロール）およびステリルグルコシドを含む。２００以上の植物性ステロールが様々な植物種において同定され、最も一般的なものは、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラジカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはβ−シトステロールである。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞、または細胞が得られる生物の培養または増殖の条件に応じて変動しうる。
細胞膜は一般的には、様々な機能のために、脂質二重層に加えてタンパク質を含む。特定の脂質の局所的な濃縮は、「脂質ラフト」と呼ばれて、脂質二重層において見出すことができる。理論に束縛されるものではないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染因子の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックスなどの細胞または生物の他の構造成分との相互作用における有意な役割を有することができる。
インフルエンザウイルスに関して、「赤血球凝集素」または「ＨＡ」という用語は、本明細書において使用される時、インフルエンザウイルス粒子の外側上で見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、一般的にはシグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、ならびにＣ末端の膜通過アンカー部位および小さな細胞質尾部を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体の膜のタイプＩ糖タンパク質である（図１Ｂ）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知であり利用可能である。例えば、バイオディフェンスパブリックヘルスベース（ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｂａｓｅ）（インフルエンザウイルス；URL: biohealthbase.orgを参照）、または全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照）を参照（その両者は参照として本明細書に組み込まれる）。
「ホモ三量体」または「ホモ三量体の」という用語は、オリゴマーが３つのＨＡタンパク質分子によって形成されることを示す。理論に束縛されるものではないが、ＨＡタンパク質は約７５ｋＤａの単量体前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、それは伸長した三量体タンパク質へと表面で集合する。三量体化が起こる前に、前駆体タンパク質は、ジスルフィド結合によって連結される２つのポリペプチド鎖、ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）へと保存された活性化切断部位（融合ペプチドとも呼ばれる）で切断される。ＨＡ１セグメントは３２８アミノ酸長でありえ、ＨＡ２セグメントは２２１アミノ酸長でありえる。この切断はウイルス感染性に重要であるが、タンパク質の三量体化に必須ではない可能性がある。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内部へのＨＡの挿入、シグナルペプチド切断、およびタンパク質糖鎖付加は、翻訳と同時に起こる事象である。ＨＡの正しい再折畳みは、タンパク質の糖鎖付加および６つの鎖内ジスルフィド結合の形成を必要とする。ＨＡ三量体はシスゴルジ複合体およびトランスゴルジ複合体内で集合し、膜貫通ドメインが三量体化プロセスにおいて役割を果たす。ブロメライン処理したＨＡタンパク質の結晶構造（膜貫通ドメインを欠損する）は、インフルエンザ株の中で高度に保存された構造を示した。感染プロセス（前駆体ＨＡ０が２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２へと切断されることを必要とする）の間にＨＡが大きなコンフォメーション変化を受けることも立証された。ＨＡタンパク質はプロセシングを受ける（すなわち、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含む）か、またはプロセシングを受けない（すなわち、ＨＡ０ドメインを含む）。
本発明は、膜貫通ドメインを含むＨＡタンパク質の使用に関し、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含み、例えば、ＨＡタンパク質はＨＡ０、またはＨＡ１およびＨＡ２を含むプロセシングされたＨＡでありえる。ＨＡタンパク質は、植物を使用するＶＬＰの産生または形成、または植物細胞、発現システムにおいて使用することができる。
本発明のＨＡは任意の亜型から得ることができる。例えば、ＨＡは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、またはインフルエンザＢ型のものでありえる。本発明の組換えＨＡは、当技術分野において公知の任意の赤血球凝集素の配列に基づいたアミノ酸配列も含むことができる。例えば、バイオディフェンスパブリックヘルスベース（インフルエンザウイルス；URL: biohealthbase.orgを参照）、または全米バイオテクノロジー情報センター（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照）を参照。さらに、ＨＡは、１つまたは複数の新興インフルエンザウイルスまたは新しく同定されたインフルエンザウイルスから単離した赤血球凝集素の配列に基づくことができる。
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から得られたＨＡを含むＶＬＰも含む。例えば、ＶＬＰは、亜型Ｈ１（配列番号：２８によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：１５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：１６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：１７によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：１８によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１９によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：２０によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：２１によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：２７によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：２３によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：２４によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号：２５によってコードされる）もしくはインフルエンザＢ型（配列番号：２６によってコードされる）、またはその組み合わせからの１つまたは複数のＨＡを含むことができる。１つまたは複数のＨＡの合成が１つまたは複数のインフルエンザ亜型から得られたＨＡの組み合わせを含むＶＬＰの形成をもたらすことを保証するために、１つまたは複数のインフルエンザ亜型からの１つまたは複数のＨＡは、植物細胞または昆虫細胞内で共発現させることができる。ＨＡの組み合わせの選択は、ＶＬＰから調製したワクチン使用の意図によって決定することができる。例えば、トリの接種における使用のためのワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組み合わせを含むことができ、その一方でヒトの接種に有用なＶＬＰは亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ７の１つまたは複数の亜型を含むことができる。しかしながら、他のＨＡ亜型の組み合わせは、接種物の使用に応じて調製することができる。
したがって、本発明は、１つまたは複数のＨＡ亜型（例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上のＨＡ亜型）を含むＶＬＰを指向する。
本発明は、植物中で発現させた場合にＶＬＰを形成する赤血球凝集素をコードする核酸も提供する。
例示的な核酸は、インフルエンザ亜型の選択された株からの赤血球凝集素のヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：３３）などのＡ（Ｈ１Ｎ１）亜型、Ａ／インドネシア／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（コンストラクト番号６６０；配列番号：６０を含む）およびそれほど一般的でないＢ型（例えば配列番号：２６（図１０Ｏ））およびＣ型（配列番号：２７（図１０Ｐ））、ならびに他のインフルエンザ亜型から得られたＨＡ。他のインフルエンザ亜型、例えばＡ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１；配列番号：３６）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１；配列番号：３７）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２；配列番号：４２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１；配列番号：４３）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；配列番号：４４）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１；配列番号：４５）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２；配列番号：４７）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２；配列番号：３８）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２；配列番号：３９）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７；配列番号：４６）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（配列番号：４０）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（配列番号：４１）またはＡ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：１２７）のＶＬＰも本発明中に含まれる。
赤血球凝集素の正しい折り畳みは、インフルエンザ赤血球凝集素のいくつかある特徴の中で特に、タンパク質の安定性、多量体の形成およびＶＬＰの形成およびＨＡの機能（凝集させる能力）に重要でありえる。タンパク質の折り畳みは、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集の程度、折り畳まれたタンパク質、部分的に折り畳まれたタンパク質、もしくは折畳まれていないタンパク質と結合するかもしくは一過性に会合するコファクターの利用可能性、１つまたは複数のシャペロンタンパク質の存在、または同種のものを含むが、これらに限定されない１つまたは複数の因子によって影響を受けうる。
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質はシャペロンタンパク質の実例であり、タンパク質合成、細胞内トラフィッキング、誤った折り畳みの妨害、タンパク質凝集の妨害、タンパク質複合体の集合および脱集合、タンパク質の折り畳み、ならびにタンパク質脱凝集を含む様々な細胞過程に参加することができるものである。かかるシャペロンタンパク質の実例はＨｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、サイクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含むが、これらに限定されない。例えば、Macario, A.J.L.、Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995;Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993)；米国特許番号第５，２３２，８３３号を参照。いくつかの実例において、シャペロンタンパク質の特定の群はＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む。
Ｈｓｐ７０の実例は、哺乳類の細胞からのＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌（特に癩菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）などのマイコバクテリア）からのＤｎａＫ（カルメット・ゲラン桿菌などの：本明細書においてＨｓｐ７１と呼ばれる）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、酵母および他の原核生物からのＤｎａＫ、およびシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）などの真核生物からのＢｉＰおよびＧｒｐ７８（Lin et al. 2001, Cell Stress and Chaperones 6:201-208）を含む。Ｈｓｐ７０の特定の実例はシロイヌナズナＨｓｐ７０（配列番号：１２２、または配列番号：１２３によってコードされた）である。Ｈｓｐ７０は折畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに加えてＡＴＰも特異的に結合することができ、それによって、タンパク質複合体の集合および脱集合に加えてタンパク質の折り畳みおよび折り畳みの解消にも参加する。
Ｈｓｐ４０の実例は、大腸菌およびマイコバクテリアなどの原核生物からのＤｎａＪ、ならびにアルファルファなどの真核生物からのＨＳＪ１、ＨＤＪｌおよびＨｓｐ４０を含む（Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408）。Ｈｓｐ４０の特定の実例は、アルファルファＭｓＪ１（配列番号：１２１、１２３または１１４によってコードされる）である。Ｈｓｐ４０は、他の細胞活動の中でも、タンパク質の折り畳み、熱耐性およびＤＮＡ複製における分子シャペロンとしての役割を果たす。
Ｈｓｐの中で、Ｈｓｐ７０およびそのコシャペロン（Ｈｓｐ４０）は、合成が完了する前の翻訳中のポリペプチドおよび新しく合成されたポリペプチドの安定化に関与する。理論に束縛されるものではないが、Ｈｓｐ４０は、折畳まれていない（新生のまたは新しく導入された）ポリペプチドの疎水性パッチに結合し、したがって、ポリペプチドとＨｓｐ７０−ＡＴＰ複合体の相互作用を促進する。ＡＴＰ加水分解は、ポリペプチド、Ｈｓｐ７０およびＡＤＰとの間の安定した複合体の形成およびＨｓｐ４０の放出をもたらす。ポリペプチドの疎水性パッチとのＨｓｐ７０ＡＤＰ複合体の会合は、他の疎水性パッチとそれらの相互作用を妨害し、不正確な折り畳みおよび他のタンパク質との凝集の形成を妨害する（Hartl, FU. 1996. Nature 381:571-579中で概説される）。
さらに、理論に束縛されるものではないが、タンパク質産生が組換えタンパク質発現システム中で増加するにつれて、組換えタンパク質発現に対する密集の効果は、誤って折り畳まれたポリペプチドの分解から生じた組換えタンパク質の凝集および／または蓄積の低下をもたらすことができる。天然のシャペロンタンパク質は低レベルの組換えタンパク質の正確な折り畳みを促進することができるが、発現レベルが増加するにつれて、天然のシャペロンは限定因子となりうる。アグロインフィルトレーションした葉における赤血球凝集素の高レベル発現はサイトゾル中で赤血球凝集素ポリペプチドの蓄積をもたらすことができ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、またはＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０の両方などの１つまたは複数のシャペロンタンパク質の共発現は、ポリペプチドを発現する細胞のサイトゾル中での安定性を増加させることができ、したがって誤って折り畳まれるかまたは凝集した赤血球凝集素ポリペプチドのレベルを低下させ、赤血球凝集および／またはウイルス様粒子の形成を可能にする三次構造特性および四次構造特性を示す安定した赤血球凝集素として蓄積するポリペプチドの数を増加させる。
したがって、本発明は、インフルエンザＨＡをコードする第１の核酸がシャペロンをコードする第２の核酸と共発現される、植物中でインフルエンザＶＬＰを産生する方法も提供する。第１の核酸および第２の核酸は、同じ工程で植物に導入することができるか、または植物に連続して導入することができる。本発明は、植物が第１の核酸を含み、第２の核酸が続いて導入される植物においてインフルエンザＶＬＰを産生する方法も提供する。
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ赤血球凝集素をコードする核酸、および１つまたは複数のシャペロンをコードする核酸を含む植物も提供する。
インフルエンザ赤血球凝集素の発現および／または分泌の間のＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）配列のプロセシングは、折り畳みプロセスにおける役割を有することが提唱されている。「シグナルペプチド」という用語は、一般的に、特定の細胞内小器官へ新しく翻訳されたポリペプチドの移動を方向付けることができるか、またはポリペプチドの特異的ドメインのポジショニングを支援することができ、一般的に赤血球凝集素ポリペプチドのＮ末端で見出されるアミノ酸の短い（およそ５〜３０のアミノ酸）配列を指す。赤血球凝集素のシグナルペプチドは、小胞体の中へのタンパク質の移行を標的化し、成熟赤血球凝集素の切断および折り畳みを支援するために新生赤血球凝集素ポリペプチドの膜アンカードメインに対するＮ末端近位ドメインのポジショニングを支援することが提案されている。シグナルペプチドの除去（例えばシグナルペプチダーゼによる）は、成熟赤血球凝集素を提供するためにシグナルペプチドの正確な切断および除去を必要とし、この正確な切断は、シグナルペプチドの一部またはすべて、切断部位に隣接するアミノ酸配列、シグナルペプチドの長さ、またはこれらの組み合わせを含む任意のいくつかの因子に依存し、すべての因子が所定の配列に適用されるとは限らない。
シグナルペプチドは発現されている赤血球凝集素に天然であるか、または組換え赤血球凝集素は第２のインフルエンザ型、亜型または株からの赤血球凝集素とバランスのとれた第１のインフルエンザ型、亜型または株からのシグナルペプチドを含む。例えば、ＨＡ亜型のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはインフルエンザＢ型の天然のＳＰは、植物システムにおいてＨＡを発現するために使用することができる。
シグナルペプチドは、非天然、例えば、インフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質もしくは赤血球凝集素から、または植物、動物もしくは細菌のポリペプチドからでもありえる。例示的なシグナルペプチドは、アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）（アクセッション番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３；配列番号：３４；図１７；アミノ酸配列ＭＡＫＮＶＡＩＦＧＬＬＦＳＬＬＬＬＶＰＳＱＩＦＡＥＥ）である。
本発明は、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含むインフルエンザ赤血球凝集素、およびかかる赤血球凝集素をコードする核酸も提供する。
インフルエンザＨＡタンパク質は、分子量、等電点、サイズ、グリカン相補物および同種のものに関してある範囲の類似性および差異を示す。様々な赤血球凝集素の物理化学的特性は、植物システム、昆虫細胞システムまたは酵母システムで発現されたＨＡの間の区別を可能にするのに有用であり、１つ以上のＨＡが単一のシステム中で共発現されるときに特に役に立つ可能性がある。かかる物理化学的特性の実例は表１中で提供される。
表１：インフルエンザ赤血球凝集素の物理化学的特性
本発明は、Ｈ１、Ｈ５またはＨ７からのＨＡをコードするそれぞれのヌクレオチド配列の配列番号：２８；配列番号：３；配列番号：１１も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：２８；配列番号：３；配列番号：１１にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：２８；配列番号：３；配列番号：１の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。配列番号または配列番号の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは被験体に投与された場合抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、１つまたは複数のインフルエンザの型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡへの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは、被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
本発明は、ヌクレオチド配列の配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７もしくは配列番号：４７にハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列、または配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７もしくは配列番号：４７の相補物は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは被験体に投与された場合抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、１つまたは複数のインフルエンザの型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡへの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
いくつかの実施形態において、本発明は、インフルエンザＡ型のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７もしくはＨ９亜型からのＨＡ、またはＢ型インフルエンザからのＨＡをコードするヌクレオチド配列の配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７もしくは配列番号：４７にハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列、または配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７もしくは配列番号：４７の相補物は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは被験体に投与された場合抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、１つまたは複数のインフルエンザの型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含む、ＨＡへの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは当技術分野において公知である。（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、１９９５年およびサプリメント；Maniatis et al.、Molecular Cloning (A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社、１９８２年；Sambrook and Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版２００１年を参照；その各々は参照として本明細書に組み込まれる）。１つのかかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃の４×ＳＳＣ中で約１６〜２０時間のハイブリダイゼーション、続いて６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１時間の洗浄、または６５℃の０．１×ＳＳＣ中で各々２０分間または３０分間の２回の洗浄でありえる。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で一晩（１６〜２０時間）、続いて６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１時間の洗浄、または６５℃の０．１×ＳＳＣ中で各々２０分間もしくは３０分間または一晩（１６〜２０時間）２回の洗浄、または６５℃でＣｈｕｒｃｈ水性リン酸緩衝液（７％ ＳＤＳ；０．５Ｍ ＮａＰＯ4緩衝液ｐＨ７．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中でハイブリダイゼーション、そして５０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で各々２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、または６５℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で各々２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄でありえる。
さらに、本発明は、Ｈ１（配列番号：２８または配列番号：１２７）、Ｈ５（配列番号：３）またはＨ７（配列番号：１１）からのＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡへの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
さらに、本発明は、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
さらに、本発明は、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３、配列番号：４４、配列番号：４５、配列番号：４６、配列番号：１２７または配列番号：４７のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡへの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
同様に、本発明は、以下の亜型のＨ１（配列番号：２８または配列番号：１２７によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：１５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：１６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：１７によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：１８によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１９によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：２０によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：２１によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：２７によってコードされた）、Ｈ１４（配列番号：２３によってコードされた）、Ｈ１５（配列番号：２４によってコードされた）、Ｈ１６（配列番号：２５によってコードされた）、またはインフルエンザＢ型（配列番号：２６によってコードされる）と関連したＨＡ；（図１０Ａから１０Ｏを参照）、およびＨ１（配列番号：２８または配列番号：１２７）、Ｈ２（配列番号：１２）、Ｈ３（配列番号：１３）、Ｈ４（配列番号：１４）、Ｈ５（配列番号：１５）、Ｈ６（配列番号：１６）、Ｈ７（配列番号：１１）、Ｈ８（配列番号：１７）、Ｈ９（配列番号：１８）、Ｈ１０（配列番号：１９）、Ｈ１１（配列番号：２０）、Ｈ１２（配列番号：２１）、Ｈ１３（配列番号：２７）、Ｈ１４（配列番号：２３）、Ｈ１５（配列番号：２４）、Ｈ１６（配列番号：２５）、と、約７０〜１００％もしくはその間の任意の量、８０〜１００％もしくはその間の任意の量、９０〜１００％もしくはその間の任意の量、または９５〜１００％もしくはその間の任意の量の配列同一性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内のヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡへの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
「免疫応答」は、一般的には適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は一般的には液性応答および細胞媒介性応答を含む。液性応答は、Ｂリンパ球系列（Ｂ細胞）の細胞において産生される分泌抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌抗体は、侵入微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面上の抗原に結合し、抗体は破壊のために微生物に目印を付ける。液性免疫は、一般的には、抗体産生およびそれに伴うプロセスに加えて、抗体のエフェクター機能（Ｔｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生、メモリー細胞生成、ファゴサイトーシスのオプソニン促進、病原菌除去および同種のものを含む）を指すために使用される。「修飾する」もしくは「修飾」という用語または同種のものは、一般的に公知であるかまたは使用されるいくつかの分析のいずれか（そのいくつかは本明細書において例示される）によって決定される、特定の応答またはパラメーターの増加または減少を指す。
細胞媒介性応答は、抗体を含まないが、むしろマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および抗原に応答した様々なサイトカインの放出を含む免疫応答である。細胞媒介性免疫は、一般的に、何らかのＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化およびＴ細胞媒介性応答を指すために使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染への応答において特に重要である。
例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘導はＥＬＩＳＰＯＴ分析を使用して測定することができ、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は増殖分析を使用して測定することができる。抗インフルエンザの抗体力価はＥＬＩＳＡ分析を使用して定量することができ、抗原特異的抗体または交差反応性抗体のアイソタイプは、抗アイソタイプ抗体（例えば抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＥまたは抗ＩｇＭ）を使用して測定することもできる。かかる分析を行う方法および技術は、当技術分野において周知である。
赤血球凝集阻害（ＨＩまたはＨＡＩ）分析は、組換えＨＡによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集を阻害することができる、ワクチンまたはワクチン組成物によって誘導された抗体の有効性を実証するためにも使用することができる。血清サンプルの赤血球凝集阻害抗体力価はマイクロタイターＨＡＩによって評価することができる（Aymard et al 1973）。いくつかの種のいずれか（例えばウマ、シチメンチョウ、ニワトリまたは同種のもの）からの赤血球を使用することができる。この分析は、ＶＬＰの表面上のＨＡ三量体の集合に関する間接的情報を与え、ＨＡ上での抗原部位の適切な提示が確認される。
交差反応性ＨＡＩ力価も、ワクチン亜型に関連する他のウイルスの株に免疫応答の有効性を実証するために使用することができる。例えば、第１の株のワクチン組成物（例えばＡ／インドネシア５／０５のＶＬＰ）で免疫した被験体からの血清を、第２の株の全ウイルスまたはウイルス粒子（例えばＡ／ベトナム／１１９４／２００４）によるＨＡＩ分析において使用し、ＨＡＩ力価を決定することができる。
サイトカインの存在またはレベルも定量することができる。例えば、Ｔ−ヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えばＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社、ＯｐｔＥＩＡキット）を使用するＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を分泌する細胞の測定によって特徴づけられるだろう。被験体から得られた末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）または脾細胞を培養し、上清を分析することができる。Ｔリンパ球はマーカー特異的蛍光標識を使用して蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）によって定量することもでき、方法は当技術分野において公知である。
被験体の免疫応答を特徴づけるために微量中和の分析も行うことができる（例えばRowe et al., 1973の方法を参照）。ウイルス中和力価は、以下のものを含むいくつかの手段から得ることができる。１）クリスタルバイオレット固定／呈色に続く細胞の溶菌プラークの計数（プラーク分析）；２）培養における細胞溶解の顕微鏡観察；３）ＮＰウイルスタンパク質のＥＬＩＳＡおよび分光光度検出（宿主細胞のウイルス感染に相関する）。
配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されたものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定することができる（例えば以下のパラメーターを使用するが、これらに限定されない：ギャップペナルティ５、トップダイアゴナル数５、固定ギャップペナルティ１０、ｋ−タプル２、フローティングギャップ１０およびウィンドサイズ５）。しかしながら、比較のための配列のアライメントの他の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444)のアルゴリズムであり、これらのアルゴリズムのコンピューターによる遂行（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）によって、または手動アライメントおよび目視検査によって行われるものである。
「赤血球凝集素ドメイン(hemagglutinin domain)」という用語は、ＨＡ０ドメイン、またはＨＡ１ドメインおよびＨＡ２のドメイン（互いにＨＡ１断片およびＨＡ２断片と呼ばれる）のいずれかを含むペプチドを指す。ＨＡ０はＨＡ１断片およびＨＡ２断片の前駆体である。ＨＡ単量体は一般的には、２つの機能ドメイン（ステムドメインおよび球状頭部または頭部ドメイン）に細分することができる。ステムドメインは、酸性のｐＨに曝露された場合、可能なコンフォメーション変化を介してウイルスの伝染性および病原性に関与する。ステムドメインは以下の４つのサブドメインまたは断片へとさらに細分される。融合サブドメインまたは融合ペプチド（酸性ｐＨコンフォメーショナル状態で宿主膜との融合に関与するアミノ酸の疎水性ストレッチ）、ステムサブドメイン（２つまたはそれ以上のコンフォメーションに適合することができる）、膜貫通ドメインまたは膜貫通サブドメイン（ＴｍＤ）（脂質ラフトに対するＨＡの親和性に関与する）、および細胞質尾部（細胞質尾部サブドメイン）（Ｃ尾部）（ＨＡの分泌に関与する）。球状頭部は、２つのサブドメイン（ＲＢサブドメインおよび痕跡のエステラーゼドメイン（Ｅ））に分けられる。Ｅサブドメインは部分的にまたは完全に埋まっており、球状頭部の表面に曝露されず、したがってＨＡに対して作製されたいくつかの抗体はＲＢサブドメインに結合することができる。
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）、または「複数のウイルス様粒子」もしくは「複数のＶＬＰ」という用語は、自己集合し、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰは一般的には、感染中に産生されるビリオンに形態学的および抗原的に類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠損し、したがって非感染性である。いくつかの実例において、ＶＬＰは単一のタンパク質種、または１つ以上のタンパク種を含むことができる。１つ以上のタンパク種を含むＶＬＰについては、タンパク種はウイルスの同じ種からでありえるか、またはウイルスの異なる種、属、亜科または科（ＩＣＴＶ命名法によって表記されるように）からのタンパク質を含むことができる。他の実例において、ＶＬＰを含む１つまたは複数のタンパク種は、天然に存在する配列から修飾されてもよい。ＶＬＰは植物宿主細胞および昆虫宿主細胞を含む適切な宿主細胞中で産生することができる。宿主細胞からの抽出に続いて、そして適切な条件下での単離およびさらなる精製に際して、ＶＬＰはインタクトな構造として精製することができる。
本発明に従ってインフルエンザに由来するタンパク質から産生されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質はＶＬＰ調製物の混入物であるＲＮＡを結合すること（Wakefield and Brownlee, 1989）が公知である。ＶＬＰ産物についての規制認可を得るときにＲＮＡの存在は所望されず、したがってＲＮＡを欠損するＶＬＰ調製物は有利であろう。
本発明のＶＬＰは、タンパク質をシアル化する能力の欠損によって特徴づけられる宿主細胞（例えば植物細胞、昆虫細胞、真菌、および他の生物（海綿動物、腔腸動物、環形動物、節足動物、軟体動物、線形動物、輪形動物、扁形動物、毛顎動物、有触手動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、古細菌、または同種のものを含む））中で産生することができる。例えば、グリコフォーラム（Ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ）（URL: glycoforum.gr.jp/science/word/evolution/ES-A03E.html)またはGupta et al., 1999. Nucleic Acids Research 27:370-372;またはToukach et al., 2007. Nucleic Acids Research 35:D280-D286;またはURL:glycostructures.jp （Nakahara et al., 2008. Nucleic Acids Research 36:D368-D371；２００７年１０月１１日にオンラインで出版（ｄｏｉ：１０．１０９３／ＮＡＲ／ｇｋｍ８３３）を参照。本明細書において記載されるように産生されたＶＬＰは、典型的にはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望されれば、ＮＡはＨＡと共発現することができる。
本発明のいくつかの態様に従う植物中で産生されたＶＬＰは、植物に由来する脂質と複合体を形成することができる。ＶＬＰはＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２ペプチドを含むことができる。植物に由来する脂質は、脂質二重層形態であり、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含むことができる。植物に由来する脂質は、ＶＬＰが産生される植物の原形質膜の脂質成分（ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質または植物性ステロールまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない）を含むことができる。植物に由来する脂質は「植物脂質」とも呼ぶことができる。植物性ステロールの実例は当技術分野において公知であり、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む（例えば、Mongrand et al., 2004を参照）。
ＶＬＰは、例えば、赤血球凝集分析、電子顕微鏡法またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて評価することができる。
サイズ排除クロマトグラフィーのために、全可溶性タンパク質は、抽出緩衝液中で凍結破砕された植物材料のサンプルをホモジナイズすること（ポリトロン）、および不溶性物質を遠心分離によって除去することによって、植物の組織から抽出することができる。ＰＥＧによる沈降も有益であろう。可溶性タンパクを定量し、抽出物はセファクリル（商標）カラムを通す。ブルーデキストラン２０００はキャリブレーションスタンダードとして使用することができる。クロマトグラフィーに続いて、画分のタンパク質相補物を決定するために、画分はイムノブロットによってさらに分析することができる。
理論に束縛されるものではないが、異なる動物からのＲＢＣに結合するＨＡの能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡの親和性、およびＲＢＣの表面上のこれらのシアル酸の存在によって決定される。ウマおよび鳥類のインフルエンザウイルスからのＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシを含むいくつかの種のすべてのからの赤血球を凝集するが、ヒトＨＡはシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジの赤血球に結合する（Ito T. et al, 1997, Virology, vol 227, p493-499；Medeiros R et al, 2001, Virology, vol 289 p.74-85も参照）。異なるインフルエンザ株のＨＡの種反応性の実例を、表２Ａおよび２Ｂ中に示す。
表２Ａ：選択された季節性インフルエンザ株のＨＡによって結合されるＲＢＣの種。
表２Ｂ：選択されたパンデミックインフルエンザ株のＨＡによって結合されるＲＢＣの種
タンパク質の断片もしくは一部、融合タンパク質またはポリペプチドは、発現させたときに断片がＶＬＰを形成することができれば、特定のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸相補物のサブセットを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。断片は、例えば、抗原性領域、ストレス応答誘導領域、またはタンパク質もしくはポリペプチドの機能ドメインを含む領域を含むことができる。断片は同じ一般的なファミリーのタンパク質に共通の領域またはドメインも含むことができるか、または断片は由来する全長タンパク質を特異的に同定するために十分なアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、断片または一部は、発現させたときに断片がＶＬＰを形成することができれば、全長の約６０％乃至約１００％の長さ、またはその間の任意の量のタンパク質を含むことができる。例えば、タンパク質の全長の約６０％乃至約１００％、約７０％乃至約１００％、約８０％乃至約１００％、約９０％乃至約１００％、約９５％乃至約１００％の長さ、またはその間の任意の量である。あるいは、断片または一部は、ＨＡに依存して、および発現させたときに断片がＶＬＰを形成することができれば、約１５０乃至約５００のアミノ酸、またはその間の任意の量でありえる。例えば、断片は、ＨＡに依存して、および発現させたときに断片がＶＬＰを形成することができれば、１５０乃至約５００のアミノ酸、またはその間の任意の量、約２００乃至約５００のアミノ酸、またはその間の任意の量、約２５０乃至約５００のアミノ酸、またはその間の任意の量、約３００乃至約５００またはその間の任意の量、約３５０乃至約５００のアミノ酸、またはその間の任意の量、約４００乃至約５００またはその間の任意の量、約４５０乃至約５００またはその間の任意の量でありえる。例えば、約５、１０、２０、３０、４０もしくは５０アミノ酸、またはその間の任意の量は、発現させたときに断片がＶＬＰを形成することができれば、ＨＡタンパク質のＣ末端、Ｎ末端またはＮ末端およびＣ末端の両方から除去することができる。
任意の与えられた配列のアミノ酸の番号付けは特定の配列に関連するが、当業者は、構造および／または配列に基づいて、特定のアミノ酸の配列の「等価性」を容易に決定することができる。例えば、結晶構造解析のためのクローンを構築するときに６個のＮ末端アミノ酸を除去するならば、これはアミノ酸の特定の数の同一性を変化させるだろう（例えばタンパク質の全長と比較して）が、構造中のアミノ酸の相対的位置は変更しないだろう。
配列（複数可）の比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行うことができる（Altschul et al., 1990. J. Mol Biol 215:403-410）。ＢＬＡＳＴ検索は、問い合わせ配列と特異的配列もしくはグループの配列との比較、またはより大きなライブラリーまたは配列のデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎＰｅｐｔ）との比較を可能にし、１００％の同一性を示す配列だけでなく、より低い程度の同一性の配列も同定する。核酸配列またはアミノ酸配列はＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して比較することができる。さらに、２つまたはそれ以上の配列の間の同一性は、配列をともにアライメントさせて配列の間の％同一性を決定することによって決定することができる。アライメントは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ；URL: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/を介して利用可能、以下のデフォルトパラメーターを使用する：プログラム：ｂｌａｓｔｎ；データベース：ｎｒ；期待値１０；フィルター：デフォルト；アライメント：ペア毎に；問い合わせ遺伝コード：スタンダード（１））、またはＢＬＡＳＴ２ＥＭＢＬ URL: embl-heidelberg.de/Services/ index.htmlを介して、以下のデフォルトパラメーターの使用する：マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２；フィルター：デフォルト、エコーフィルター：オン、期待値：１０、カットオフ：デフォルト；ストランド：両方；ディスクリプション：５０、アライメント：５０；またはＦＡＳＴＡ、デフォルトパラメーター使用）を使用して、または配列を手動で比較して％同一性を計算することによって、実行することができる。
本発明は、ＨＡをコードする核酸の植物発現ベクターへのクローニング、およびワクチン産生に適切な植物からのインフルエンザＶＬＰの産生を記載するが、これらに限定されない。かかる核酸の実例は、例えば、インフルエンザＡ型／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ（例えば配列番号：６１）、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（配列番号：１２７）からのＨＡ、Ａ／インドネシア／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号：６０）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（例えば配列番号：３６、４８、６２）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（例えば配列番号：３７、４９、６３）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）（例えば配列番号：４２、５４、６４）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号：４３、５５、６５）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号：４４、５６、６６）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）（例えば配列番号：４５、５７、６７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）（例えば配列番号：４７、５９、６８）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）（例えば配列番号：３８、５０、６９）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）（例えば配列番号：３９、５１、７０）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）（例えば配列番号：４６、５８、７１）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（例えば配列番号：４０、５２、７２）、Ｂ／フロリダ／４／２００６（例えば配列番号：４１、５３、７３）からのＨＡを含むが、これらに限定されない。これらの株について対応するクローンまたはコンストラクトの番号は表１に提供される。配列番号：３６〜４７に対応する核酸配列は、図２８〜３９中で図示されるように、プラストシアニン上流を含み、型または亜型の各々についてのＨＡのコード配列に作動可能に連結される。配列番号：６０〜７３に対応する核酸配列は、図５１〜６４中で図示されるように、アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、ＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットを含む。
ＶＬＰは、形質転換された宿主細胞（例えば植物細胞または昆虫細胞）中で、機能的および免疫原的に同型の巨大分子性タンパク質構造（インフルエンザサブウイルス粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む）へと自己集合する組換えインフルエンザ構造タンパク質からなる試薬を産生するためにも使用することができる。
したがって、本発明は、ＶＬＰ、および単一のエンベロープタンパク質の発現から植物発現システム中でウイルスＶＬＰを産生する方法を提供する。ＶＬＰは、インフルエンザＶＬＰ、または麻疹、エボラ、マールブルクおよびＨＩＶを含むが、これらに限定されない、他の原形質膜由来ウイルスから産生されるＶＬＰでありえる。
他のエンベロープウイルス、例えば、フィロウイルス科（例えばエボラウイルス、マールブルグウイルスまたは同種のもの）、パラミクソウイルス科（例えば麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ニューモウイルスまたは同種のもの）、レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス−２、ヒトＴ細胞白血球ウイルス−１または同種のもの）、フラビウイルス科（例えば西ナイル脳炎、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよび黄熱ウイルスまたは同種のもの）、ブンヤウイルス科（例えばハンタウイルスまたは同種のもの）、コロナウイルス科（例えばコロナウイルス、ＳＡＲＳまたは同種のもの）として当業者に公知であるが、これらに限定されないものからのタンパク質も使用することができる。原形質膜に由来するウイルスにおいて発現されうる抗原の非限定例は、ＨＩＶのカプシドタンパク質ｐ２４；ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０またはｇｐ４１、フィロウイルスタンパク質（エボラウイルスのＶＰ３０もしくはＶＰ３５またはマールブルグウイルスのＧｐ／ＳＧＰを含む）または麻疹パラミクソウイルスのＨタンパク質またはＦタンパク質を含む。例えば、ＨＩＶのＰ２４（例えばＧｅｎＢａｎｋ参照番号ｇｉ：１９１７２９４８）は、ＨＩＶウイルスゲノムのｇａｇ配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ参照番号ｇｉ：９６２９３５７）の翻訳および切断によって得られるタンパク質であり；ＨＩＶのｇｐ１２０およびｇｐ４１は、ＨＩＶウイルスゲノムのｅｎｖによってコードされるｇｐ１６０タンパク質（例えばＧｅｎＢａｎｋ参照番号ｇｉ：９６２９３６３）の翻訳および切断によって得られる糖タンパク質である。エボラウイルスのＶＰ３０（ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ｇｉ：５５７７０８１３）は、エボラウイルスゲノムのｖｐ３０配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ参照番号ｇｉ：５５７７０８０７）の翻訳によって得られるタンパク質であり；エボラウイルスのＶＰ３５（ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ｇｉ：５５７７０８０９）は、エボラウイルスゲノムのｖｐ３５配列の翻訳によって得られるタンパク質である。マールブルグウイルスのＧｐ／ＳＧＰ（ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ｇｉ：２９６９６５）は、マールブルグウイルスゲノムの配列（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ｇｉ：１５８５３９１０８）の翻訳によって得られるタンパク質である。Ｈタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ｇｉ：９６２６９５１）は、麻疹ウイルスゲノムのＨ配列のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ｇｉ：９６２６９４５）であり；Ｆタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ｇｉ：９６２６９５０）は、麻疹ウイルスゲノムのＦ配列のタンパク質である。
しかしながら、他のエンベロープタンパク質は、当業者に公知であるように、本発明の方法内で使用することができる。
本発明は、したがって、ＨＩＶ−ｐ２４、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶ−ｇｐ４１、エボラウイルス−ＶＰ３０、エボラウイルス−ＶＰ３５、マールブルグウイルスＧｐ／ＳＧＰ、麻疹ウイルスＨタンパク質または麻疹ウイルス−Ｆタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、昆虫細胞、酵母細胞もしくは植物細胞、または特定の植物の組織において活性のある調節領域に作動可能に連結することができる。
本発明は、ＨＡ（例えば、ヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５ウイルスＨＡ（Ｈ５Ｎ１）またはインフルエンザ株Ａ／カリフォルニア／０４／０９からのＨＡであるが、これらに限定されない）をコードする核酸の植物または昆虫の発現ベクター（例えばバキュロウイルス発現ベクター）へのクローニング、および形質転換された植物細胞または形質転換された昆虫細胞中で、機能的および免疫原的に同型の巨大分子性タンパク質構造（インフルエンザサブウイルス粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む）へと自己集合する組換えインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチンの候補または試薬の産生をさらに提供する。
インフルエンザ亜型のＨＡをコードする核酸、例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６であるが、これらに限定されないものを、適切な細胞株、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えばＳｆ−９細胞株；ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４０４７）中で、例えば、バキュロウイルス発現システムを使用して、発現させることができる。他の昆虫細胞株も使用することができる。
ＨＡをコードする核酸は、代わって、植物細胞または植物中で発現させることができる。ＨＡをコードする核酸は、ＨＡ ＲＮＡを使用する逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成することができる。一例として、ＲＮＡは、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスもしくはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルス、または他のインフルエンザウイルス（例えばＡ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６）から、またはインフルエンザウイルスに感染させた細胞から単離することができる。逆転写およびＰＣＲのために、ＨＡ ＲＮＡ（例えば、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ配列もしくはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスＨＡ０配列、またはインフルエンザ亜型Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡ配列であるが、これらに限定されないもの）に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。さらに、ＨＡをコードする核酸は、当業者に公知であるような方法を使用して、化学的に合成することができる。
これらの遺伝子のもたらされたｃＤＮＡコピーは、宿主発現システムによって要求されるような適切な発現ベクター中でクローン化することができる。あるいは、植物に適切な発現ベクターの実例は、以下に記載されるバキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）社）であり、公知の方法を使用して、および製造者の使用説明書によって提供された情報を使用して、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミドがもたらされる。
本発明は、上記されるように、植物中で作動可能な調節エレメントに作動可能に連結されたＨＡをコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトをさらに指向する。植物細胞中で作動可能な調節エレメントおよび本発明に従って使用することができるものの実例は、プラストシアニン調節領域（ＵＳ７，１２５，９７８；参照として本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Leutwiler et al; 1986；参照として本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と会合し、Stockhaus et al.1987、1989によって記載される；参照として本明細書に組み込まれる）の調節領域を含むが、これらに限定されない。プラストシアニン調節領域の一例は、配列番号：３６のヌクレオチド１０〜８５を含む配列、または配列番号：３７〜４７のうちの任意の１つの類似領域である。調節エレメントまたは調節領域は、作動可能に連結されるヌクレオチド配列の翻訳を促進することができ、ヌクレオチド配列はタンパク質またはポリペプチドをコードする。調節領域の別の実例は、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳領域に由来するものであり、作動可能に連結されるヌクレオチド配列を優先的に翻訳するために使用することができる。このＣＰＭＶ調節領域はＣＭＰＶ−ＨＴシステムを含む。例えば、Sainsbury et al, 2008, Plant Physiology 148: 1212-1218を参照。
コンストラクトが昆虫細胞中で発現されるならば、昆虫細胞中で作動可能な調節エレメントの実例は、ポリヘドリンプロモーター（Possee and Howard 1987. Nucleic Acids Research 15:10233-10248）、ｇｐ６４プロモーター（Kogan et al, 1995. J Virology 69:1452-1461）および同種のものを含むが、これらに限定されない。
したがって、本発明の態様は、インフルエンザＨＡをコードする調節領域および配列を含む核酸を提供する。調節領域はプラストシアニン調節エレメントでありえ、インフルエンザＨＡは、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６を含む、インフルエンザ株または亜型の群から選択することができる。プラストシアニン調節エレメントおよびインフルエンザＨＡを含む核酸配列は、配列番号：３６〜４７によって本明細書において例示される。
インフルエンザウイルスが卵もしくは哺乳類の細胞（例えばＭＤＣＫ細胞）中で培養されたときに、または感染した被験体から単離されたときに、インフルエンザ赤血球凝集素アミノ酸配列の配列またはそれらをコードする核酸中に配列の差異が存在しうることが公知である。かかる差異の非限定例は本明細書において示され、実施例１８を含む。さらに、当業者が理解するように、追加の変異が起こり続けるので、新しい株から得られたインフルエンザ赤血球凝集素内で追加の変動を観察することができる。異なるインフルエンザ赤血球凝集素の間に公知の配列変動性があるので、本明細書において記載されるように宿主中で発現されたときにインフルエンザ赤血球凝集素がＶＬＰを形成すれば、本発明は任意のインフルエンザ赤血球凝集素を使用して作製することができるＶＬＰを含む。
配列アライメントおよびコンセンサス配列は、当技術分野において公知のいくつかのソフトウェアパッケージのいずれか、例えばＭＵＬＴＡＬＩＮ（F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881-10890）を使用して決定することができるか、または配列は手動でアライメントさせ、配列の間の類似性および差異を決定することができる。
赤血球凝集素の構造はよく研究されており、構造は高度に保存されていることが公知である。赤血球凝集素構造を重ねた場合、高度の構造的保存が観察される（ｒｍｓｄ＜２Ａ）。たとえアミノ酸配列がいくつかの位置で変動しても、この構造的保存が観察される（例えば、Skehel and Wiley, 2000 Ann Rev Biochem 69:531-69; Vaccaro et al 2005を参照）。赤血球凝集素の領域もよく保存されており、例えば、
・構造的ドメイン：ＨＡ０ポリタンパク質は切断されて成熟ＨＡを提供する。ＨＡは、単一のジスルフィド結合によって連結される受容体結合ドメイン（ＨＡ１）および膜アンカードメイン（ＨＡ２）を含む各単量体を持つホモ三量体であり；ＨＡ２サブユニットのＮ末端２０の残基はＨＡ融合ドメインまたはＨＡ融合配列とも呼ばれる。「尾部」領域（膜エンベロープに対して内面）も存在する。各々の赤血球凝集素はこれらの領域またはドメインを含む。個別の領域またはドメインの長さは典型的には保存される。
・すべての赤血球凝集素は、同じ数および位置の分子内ジスルフィド架橋および分子間ジスルフィド架橋を含有する。ジスルフィド架橋ネットワークに参加するシステインのアミノ酸配列上での量および位置はＨＡの間で保存される。特徴的な分子内ジスルフィド架橋および分子間ジスルフィド架橋を示す構造ならびに他の保存されたアミノ酸およびそれらの相対的位置の実例は、例えばGamblin et al 2004 (Science 303:1838-1842)中で記載される。例示的な構造および配列は１ＲＶＺ、１ＲＶＸ、１ＲＶＴ、１ＲＶ０、１ＲＵＹ、１ＲＵ７を含み、プロテインデータバンク（Berman et al. 2003. Nature Structural Biology 10:980；URL: rcsb.org）から利用可能である。
・細胞質尾部。大多数の赤血球凝集素は保存部位に３つのシステインを含む。１つまたは複数のこれらのシステインは翻訳後修飾としてパルミトイル化されうる。
アミノ酸変動はインフルエンザウイルスの赤血球凝集素において許容される。この変動は、絶えず同定される新しい株を提供する。新しい株の間の伝染性は変動してもよい。しかしながら、続いてＶＬＰを形成する赤血球凝集素三量体の形成は維持される。本発明はしたがって、植物中でＶＬＰを形成し、公知の配列および発生しうるバリアント配列を含む、赤血球凝集素アミノ酸配列または赤血球凝集素アミノ酸配列をコードする核酸を提供する。
図６５は、かかる公知の変動の実例を示す。この図は以下のＨ１Ｎ１株のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号：７４）を示す。
Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：３３によってコードされる）、
Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４８）、
Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４９）および
配列番号：９。Ｘ１（位置３）はＡまたはＶであり；Ｘ２（位置５２）はＤまたはＮであり；Ｘ３（位置９０）はＫまたはＲであり；Ｘ４（位置９９）はＫまたはＴであり；Ｘ５（位置１１１）はＹまたはＨであり；Ｘ６（位置１４５）はＶまたはＴであり；Ｘ７（位置１５４）はＥまたはＫであり；Ｘ８（位置１６１）はＲまたはＫであり；Ｘ９（位置１８１）はＶまたはＡであり；Ｘ１０（位置２０３）はＤまたはＮであり；Ｘ１１（位置２０５）はＲまたはＫであり；Ｘ１２（位置２１０）はＴまたはＫであり；Ｘ１３（位置２２５）はＲまたはＫであり；Ｘ１４（位置２６８）はＷまたはＲであり；Ｘ１５（位置２８３）はＴまたはＮであり；Ｘ１６（位置２９０）はＥまたはＫであり；Ｘ１７（位置４３２）はＩまたはＬであり；Ｘ１８（位置４８９）はＮまたはＤである。
かかる変動の別の実例として、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：３３によってコードされる）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４８）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４９）、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）および配列番号：９のＨＡについての配列アライメントおよびコンセンサス配列が、表３中で以下に示される。
表３：選択されたＨ１Ｎ１株のＨＡについての配列アライメントおよびコンセンサス配列
コンセンサス配列は表記された位置でのすべての配列に共通のアミノ酸を大文字で示し；小文字は配列の少なくとも２分の１または大部分に共通のアミノ酸を示し；記号！はＩまたはＶのうちのいずれか１つであり；記号＄はＬまたはＭのうちのいずれか１つであり；記号％はＦまたはＹのうちのいずれか１つであり；記号＃は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、ＢまたはＺのうちのいずれか１つであり；記号「．」はアミノ酸が無く（例えば欠失）；Ｘは位置３でＡまたはＶのうちのいずれか１つであり；Ｘは位置５２でＥまたはＮのうちのいずれか１つであり；Ｘは位置９０でＫまたはＲであり；Ｘは位置９９でＴまたはＫであり；Ｘは位置１１１でＹまたはＨのいずれか１つであり；Ｘは位置１４５でＶまたはＴのいずれか１つであり；Ｘは位置１５７でＫまたはＥであり；Ｘは位置１６２でＲまたはＫであり；Ｘは位置１８２でＶまたはＡであり；Ｘは位置２０３でＮまたはＤであり；Ｘは位置２０５でＲまたはＫであり；Ｘは位置２１０でＴまたはＫであり；Ｘは位置２２５でＫまたはＹであり；Ｘは位置３３３でＨまたは欠失であり；Ｘは位置４３３でＩまたはＬであり；Ｘは位置４９）でＮまたはＤである。
かかる変動の別の実例として、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（配列番号：５５）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／インドネシア／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）（配列番号：１０）のＨＡについての配列アライメントおよびコンセンサス配列が、表４中で以下に示される。
表４：選択されたＨ１Ｎ１株のＨＡについての配列アライメントおよびコンセンサス配列
コンセンサス配列は表記された位置でのすべての配列に共通のアミノ酸を大文字で示し；小文字は配列の少なくとも２分の１または大部分に共通のアミノ酸を示し；記号！はＩまたはＶのうちのいずれか１つであり；記号＄はＬまたはＭのうちのいずれか１つであり；記号％はＦまたはＹのうちのいずれか１つであり；記号＃は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、ＢまたはＺのうちのいずれか１つであり；Ｘは位置１０２でＴ、ＶまたはＡのうちのいずれかであり；Ｘは位置１１０でＳ、ＤまたはＮのうちのいずれかであり；Ｘは位置１５６でＳ、ＫまたはＴのうちのいずれかである。
上で図示し記載されたアライメントおよびコンセンサス配列は、植物中でのＶＬＰの産生のための本発明の様々な実施形態において使用することができる、赤血球凝集素アミノ酸配列におけるバリアントの非限定例である。
各々のアミノ酸のコドンが当技術分野において公知であるので、アミノ酸配列をコードする核酸は容易に決定することができる。したがって、アミノ酸配列の供与により、それをコードする縮重核酸配列が教示される。本発明は、したがって、本明細書において開示されたこれらのインフルエンザ株および亜型（例えば、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／インドネシア／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／１９９５およびＡ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／テキサス／３２／２００３、Ａ／マガモ／ＭＮ／３３／００、Ａ／アヒル／上海／１／２０００、Ａ／キタオナガガモ／テキサス／８２８１８９／０２、Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ハシビロガモ／イラン／Ｇ５４／０３、Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／アヒル／イギリス／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／マガモ／グルジェブ／２６３／８２、Ａ／アヒル／オーストラリア／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／リー／４０、Ｃ／ヨハネスブルグ／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））の赤血球凝集素をコードする核酸配列に加えて、上記の赤血球凝集素をコードする縮重配列を提供する。
さらに、各々のアミノ酸のコドン（複数可）が公知であるので、核酸によってコードされるアミノ酸配列は容易に決定することができる。したがって、核酸の供与により、それによってコードされるアミノ酸配列が教示される。本発明は、したがって、本明細書において開示されたインフルエンザ株および亜型（例えば、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／インドネシア／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／１９９５、Ａ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／テキサス／３２／２００３、Ａ／マガモ／ＭＮ／３３／００、Ａ／アヒル／上海／１／２０００、Ａ／キタオナガガモ／テキサス／８２８１８９／０２、Ａ／シチメンチョウ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ハシビロガモ／イラン／Ｇ５４／０３、Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／アヒル／イギリス／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／マガモ／グルジェブ／２６３／８２、Ａ／アヒル／オーストラリア／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／リー／４０、Ｃ／ヨハネスブルグ／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））の赤血球凝集素のアミノ酸配列を提供する。
植物において、インフルエンザＶＬＰは原形質膜から出芽し（実施例５および図１９を参照）、したがってＶＬＰの脂質組成はそれらの起原を反映する。本発明に従って産生されたＶＬＰは、植物に由来する脂質と複合体を形成した１つまたは複数の型または亜型のインフルエンザのＨＡを含む。植物脂質は特異的免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を促進することができる。植物膜は脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から構成されており、スフィンゴ糖脂質、サポニンおよび植物性ステロールも含有する。さらに、脂質ラフトも植物原形質膜に見出され、これらのマイクロドメインはスフィンゴ脂質およびステロールに富んでいる。植物において、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む、様々な植物性ステロールが存在することが公知である（Mongrand et al., 2004）。
スフィンゴ糖脂質に加えて、ＰＣおよびＰＥは、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに胸腺および肝臓中のＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞などの哺乳類の免疫細胞によって発現されたＣＤ１分子と結合することができる（Tsuji M,. 2006）。ＣＤ１分子はクラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に構造的に類似しており、それらの役割はＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）に対して糖脂質抗原を提示することである。活性化に際して、ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞および樹状細胞などの先天性免疫細胞を活性化し、抗体を産生するＢ細胞およびＴ細胞のような適応免疫細胞も活性化する。
様々な植物性ステロールを原形質膜に見出すことができ、特異的相補物は、種、生育条件、栄養素源または病原体状態（いくつかの因子が挙げられる）に応じて変動してもよい。一般的には、β−シトステロールは最も多量にある植物性ステロールである。
原形質膜由来エンベロープなどの脂質二重層と複合体を形成したインフルエンザＶＬＰにおいて提示された植物性ステロールは、有利なワクチン組成物を提供することができる。理論に束縛されるものではないが、原形質膜由来エンベロープなどの脂質二重層と複合体を形成した植物で作製されたＶＬＰは、他の発現システム中で作製されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し、生または弱毒化された全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応に類似する。
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、植物に由来する脂質二重層と複合体を形成したＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態において、植物に由来する脂質二重層は、ＶＬＰのエンベロープを構成することができる。
植物内で産生されたＶＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含むＨＡを含むことができる。したがって、本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンを有するＨＡを含むＶＬＰも提供する。
さらに、植物におけるＮ−グリカンの修飾は公知であり（例えば米国の６０／９４４，３４４を参照；参照として本明細書に組み込まれる）、修飾されたＮ−グリカンを有するＨＡを産生することができる。例えばフコシル化、キシロシル化、またはフコシル化およびキシロシル化の両方が減少したＮ−グリカンを持つ修飾された糖鎖付加パターンを含むＨＡを得ることができるか、またはタンパク質がフコシル化、キシロシル化もしくはその両方を欠損し、増加したガラクトシル化を含む、修飾された糖鎖付加パターンを有するＨＡを得ることができる。さらに、翻訳後修飾の修飾（例えば末端ガラクトースの追加）は、ＨＡを発現する野生型植物と比較したときに、発現されたＨＡのフコシル化およびキシロシル化の減少をもたらすことができる。
例えば、限定して判断すべきではないが、修飾された糖鎖付加パターンを有するＨＡの合成は、β−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）（例えば、哺乳類のＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴであるがこれらに限定されず、しかしながら別の源からのＧａｌＴも使用することができる）をコードするヌクレオチド配列と共に対象となるタンパク質を共発現させることによって達成することができる。ＧａｌＴの触媒ドメインは、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を産生するために、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１）のＣＴＳのドメイン（すなわち細胞質尾部、膜貫通ドメイン、ステム領域）に融合することもでき、ハイブリッド酵素はＨＡと共発現することができる。ＨＡは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列とも共に共発現することができ、例えば哺乳類のＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩであるがこれらに限定されない他の源からのＧｎＴ−ＩＩＩも使用することができる。さらに、ＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素（ＧｎＴ−ＩＩＩに融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含む）も使用することができる。
したがって、本発明は修飾されたＮ−グリカンを有するＨＡを含むＶＬＰも含む。
理論に束縛されるものではないが、ＨＡ上の植物Ｎ−グリカンの存在は、抗原提示細胞によるＨＡの結合を促進することによって免疫応答を刺激することができる。植物のＮグリカンを使用する免疫応答の刺激はSaint-Jore-Dupas et al. (2007)によって提案されている。さらに、ＶＬＰのコンフォメーションは抗原の提示に有利で、植物に由来する脂質層と複合体を形成したときにＶＬＰのアジュバント効果を促進することができる。
「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモーター」によって、典型的には遺伝子のタンパク質コード領域の上流であるが必ずしもそうではない核酸の一部が意味され、それはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなることができる。調節領域に活性があり、対象となる遺伝子と作動可能に会合しているかまたは作動可能に連結される場合、これは対象となる遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介することができるか、または発生的遺伝子活性化または時間的遺伝子活性化を制御することができる。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基底プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答する誘導可能エレメント、負の調節エレメントなどのプロモーター活性を媒介するエレメントまたは転写エンハンサーを含む。「調節領域」は、本明細書において使用される時、転写の後に活性のあるエレメント、例えば、翻訳および転写のエンハンサー、翻訳および転写のリプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性デターミナントなどの遺伝子発現を修飾する調節エレメントも含む。これらの後者エレメントのいくつかのものは、コード領域に近くに位置することができる。
本開示の文脈において、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、典型的には構造遺伝子のコード配列に対して通常上流（５’）であるが必ずしもそうではないＤＮＡの配列を指し、それはＲＮＡポリメラーゼおよび／または特定の部位での転写の開始に必要とされる他の因子のための認識を提供することによって、コード領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内、または配列の３’に位置する他のヌクレオチド配列も、対象となるコード領域の発現の調節に寄与できることを理解すべきである。特定の部位での開始を保証するためにＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。大部分であるがすべてではない真核生物プロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス（通常、転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基対からなる保存された核酸配列）を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基底プロモーターエレメントに加えて、遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント（上でリストされるような）を含む。
発生的に調節されるもの、誘導可能なもの、または構成的なものを含むいくつかのタイプの調節領域がある。発生的に調節される調節領域、またはその制御下で遺伝子の差異的な発現を制御する調節領域は、その器官または組織の発生の間の特異的時間で特定の器官または器官の組織内で活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特異的発生段階の特定の器官または組織内で優先的に活性があってもよく、それらは、植物内の他の器官または組織で発生的に調節される様式でも、または基底レベルででも同様に活性があってもよい。例えば、組織特異的調節領域の実例は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む特異的調節領域を参照（Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130）。葉特異的プロモーターの一例は、プラストシアニンプロモーターを含む（図１ｂ；ＵＳ７，１２５，９７８、参照として本明細書に組み込まれる）。
誘導可能調節領域は、インデューサーに応答して１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。インデューサーの非存在下において、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。典型的には、転写を活性化するために誘導可能調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は不活性形態で存在し、次いでそれはインデューサーによって直接または間接的に活性形態に変換される。しかしながら、タンパク質因子も存在しなくてもよい。インデューサーは、タンパク質、代謝物質、増殖調節因子、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学薬剤、または熱、寒冷、塩もしくは有毒物質によって直接、またはウイルスなどの病原菌もしくは病原体の作用を介して間接的に、課された生理的ストレスでありえる。誘導可能調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、潅水、加熱または類似する方法によってなど、細胞または植物にインデューサーを外部的に適用することによって、インデューサーに曝露することができる。誘導可能調節エレメントは植物遺伝子または非植物遺伝子のいずれかに由来しうる（例えばGatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358；参照として組み込まれる）。可能性のある誘導可能プロモーターの実例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108；参照として組み込まれる）、ステロイド誘導可能プロモーター（Aoyama, T. and Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404；参照として組み込まれる）およびエタノール誘導可能プロモーター（Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180、参照として組み込まれる）、サイトカイニン誘導可能なＩＢ６遺伝子およびＣＫＩ１遺伝子（Brandstatter, I. and Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985；参照として組み込まれる）ならびにオーキシン誘導可能エレメント、ＤＲ５（Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971；参照として組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。
構成的調節領域は、植物の様々な部分にわたって、および植物発生の全体にわたって連続的に遺伝子の発現を指令する。公知の構成的調節エレメントの実例は、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物（Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812）、コメのアクチン１遺伝子（Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165）、アクチン２遺伝子（An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121）、またはｔｍｓ ２遺伝子（Ｕ．Ｓ．５，４２８，１４７、参照として本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467）、トウモロコシのユビキチン１遺伝子（Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、シロイヌナズナのユビキチン１および６遺伝子（Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、ならびにタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004）と結合したプロモーターを含む。本明細書において使用される時「構成的」という用語は、構成的調節領域の制御下で遺伝子がすべての細胞タイプにおいて同じレベルで発現することを必ずしも示さないが、存在量の変動はしばしば観察されても遺伝子が広範囲の細胞タイプにおいて発現することを示す。構成的調節エレメントは、作動可能に連結されるヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに促進するために、他の配列にカップリングすることができる。例えば、ＣＭＰＶ−ＨＴシステム（Sainsbury et al, 2008, Plant Physiology 148: 1212-1218）は、ササゲモザイクウイルス（ＣＯＭＶ）の非翻訳領域に由来し、結合したコード配列の翻訳促進を実証する。
「天然の」によって、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在することまたは「野生型」であることが意味される。
「作動可能に連結された」によって、特定の配列（例えば調節エレメントおよび対象となるコード領域）が、遺伝子発現の媒介または修飾などの意図された機能を実行するために直接または間接的に相互作用することが意味される。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介されうる。
本発明の１つまたは複数のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、またはコンストラクト、またはベクターによって形質転換される任意の適切な植物宿主において発現することができる。適切な宿主の実例は、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属の種、トウモロコシ、タバコ属の種、アルファルファ、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、カラスムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタおよび同種のものを含む農作物を含むが、これらに限定されない。
本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝子コンストラクトは、３’非翻訳領域をさらに含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡの前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラックの追加をもたらすことによって通常特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルは、変動がないわけではないが、カノニカル形態５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって一般に認識される。本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝子コンストラクトは、エンハンサー（翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれか）も必要に応じてさらに含むことができる。これらのエンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含むことができる。完全な配列の翻訳を保証するために、開始コドンはコード配列のリーディングフレームと同調しなくてはならない。
適切な３’領域の非限定例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウムの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、ならびにダイズ貯蔵タンパク質遺伝子およびリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）遺伝子などの植物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写される非翻訳領域、ならびにプラストシアニン発現調節に使用されるプロモーター（Pwee and Gray 1993；参照として本明細書に組み込まれる）である。プラストシアニンプロモーターの一例は、ＵＳ７，１２５，９７８（参照として本明細書に組み込まれる）中で記載される。
本明細書において記載されるように、葉発現において実証された効率を持つエンハンサー配列を含むプロモーターは一過性発現に効果的であることが見出されてきた。理論に束縛されるものではないが、核マトリックスへの付着による光合成の遺伝子の上流調節エレメントの付着は、強い発現を媒介することができる。例えば、エンドウのプラストシアニン遺伝子の翻訳開始部位から−７８４までは、強いレポーター遺伝子発現を媒介するために使用することができる。
形質転換された植物細胞の同定を支援するために、本発明のコンストラクトは植物選択マーカーを含んでいるようにさらに操作することができる。有用な選択マーカーは、抗生物質（例えばゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン）または除草剤（ホスフィノトリシン、グリフォサート、クロロスルフロンおよび同種のものなど）などの化学物質に対する耐性を提供する酵素を含む。同様に、色変化（ＧＵＳ（β-グルクロニダーゼ）など）または発光（ルシフェラーゼまたはＧＦＰなど）によって識別可能な化合物の産生を提供する酵素を使用することができる。
本発明の考慮される部分は、本発明のキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、植物細胞または種子である。植物細胞から全植物体を再生する方法も当技術分野において公知である。一般に、形質転換された植物細胞の同定を促進するために選択マーカーが使用される場合、形質転換された植物細胞は、適切な培地（抗生物質などの選択薬剤を含むことができる）中で培養される。いったんカルスが形成されたなら、公知の方法に従う適切な植物ホルモンを用いることによって芽形成は促進することができ、シュートを植物の再生のための発根培地に移す。次いで、種子または栄養繁殖技術の使用のいずれかからの反復世代を確立するために、植物を使用することができる。トランスジェニック植物は組織培養を使用せずに生成することもできる。
本発明の考慮される部分は、本発明に従う、ＶＬＰ産生のための組換えＨＡ０をコードする核酸を含むキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、樹木、酵母、細菌、真菌および昆虫および動物細胞である。
本発明の調節エレメントは、形質転換に適用可能な宿主生物の範囲内の発現または一過性発現のために、対象となるコード領域とも組み合わせることができる。かかる生物は、植物（単子葉植物および双子葉植物の両方）を含むが、これらに限定されず、例えば、トウモロコシ、穀物用植物、コムギ、オオムギ、カラスムギ、タバコ属の種、アブラナ属の種、ダイズ、インゲンマメ、エンドウ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、チョウセンニンジンおよびシロイヌナズナであるが、これらに限定されない。
これらの生物の安定した形質転換および再生のための方法は、当技術分野において確立され、当業者に公知である。形質転換され再生された植物を得る方法は本発明に重大ではない。
「形質転換」によって、遺伝子型、表現型、または両方によって明示される遺伝情報（ヌクレオチド配列）の安定した種間移行が意味される。キメラコンストラクトから宿主への遺伝情報の種間移行は遺伝性であり、遺伝情報の移行は安定性であるか、または移行は一過性であり遺伝情報の移行は遺伝可能ではないと判断される。
「植物素材」という用語によって、植物に由来する任意の材料が意味される。植物素材は、植物全体、組織、細胞または任意のその画分を含むことができる。さらに、植物素材は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体の抽出物、またはその組み合わせを含むことができる。さらに、植物素材は、植物葉、茎、果実、根またはその組み合わせからの植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはその組み合わせを含むことができる。植物素材は、任意の加工工程が行われていない植物またはその一部を含むことができる。植物の一部は植物素材を含むことができる。しかしながら、植物材料に対して、以下に定義されるような最小の加工工程、またはより厳密な加工（クロマトグラフィー、電気泳動および同種のものを含むがこれらに限定されない当技術分野内で一般に公知である部分的または実質的なタンパク質精製を使用する技術を含む）を行うことができることも意図される。
「最小限の加工」という用語によって、植物素材、例えば、対象となるタンパク質を含む植物またはその一部を、部分的に精製して、植物抽出物、ホモジネート、植物ホモジネートの画分または同種のものを得る（すなわち最小限に加工する）ことが意味される。部分的精製は、植物の細胞構造を破壊すること、それによって、例えば、遠心分離、濾過またはその組み合わせであるがこれらに限定されないものによって分離することができる可溶性植物成分および不溶性植物成分を含む組成物を生成することを含むことができるが、これらに限定されない。この点に関して、葉または他の組織の細胞外空間内の分泌タンパク質を真空または遠心による抽出を使用して容易に得ることができるか、または細胞外空間内からタンパク質を圧搾または遊離させるために圧力下でのローラーを介する通過もしくは粉砕または同種のものによって組織を抽出することができる。可溶性タンパク質の粗抽出物の調製物は二次的な植物産物からの混入がほとんどないので、最小限の加工は可溶性タンパク質の粗抽出物の調製物も含みうる。さらに、最小限の加工は、葉からの可溶性タンパクの水抽出、続いて任意の適切な塩による沈殿を含むことができる。他の方法は、抽出物の直接使用を可能にするために大規模浸軟および液汁抽出を含みうる。
植物素材（植物材料または組織の形態で）は、被験体に経口送達することができる。植物素材は、食事へのサプリメントの一部分として他の食品と共に投与されるか、またはカプセル化して投与することができる。植物素材もしくは組織は、食味性を改善もしくは増加させるために濃縮するか、または必要に応じて、他の材料、成分もしくは医薬品賦形剤と共に提供することもできる。
本発明のＶＬＰが投与されてもよい被験体または標的生物の実例は、ヒトおよび霊長類、トリ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウマ科の動物、ウマ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモットまたは他のげっ歯類、アザラシ、クジラ、および同種のものを含むが、これらに限定されないかかる標的生物は例示的であり、本発明の適用および使用に対して限定して判断されるべきではない。
対象となるタンパク質を含む植物、または対象となるタンパク質を含むＶＬＰを発現する植物は、必要性および状況に応じた様々な手段で、被験体または標的生物に投与できることが意図される。例えば、植物から得られる対象となるタンパク質は、粗製形態、部分精製形態、または精製形態のいずれかで使用前に抽出することができる。タンパク質が精製される予定ならば、食用植物または非食用植物のいずれかにおいて産生することができる。さらに、タンパク質が経口投与されるならば、植物の組織を収穫し被験体に直接食物として与えるか、または収穫された組織を食物として与える前に乾燥させるか、または事前に収穫することなく動物を植物上で放牧させることができる。収穫された植物の組織を動物用食物内の食品サプリメントとして提供することも本発明の範囲内である判断される。植物の組織が、ほとんどまたはまったくさらに加工されずに、動物に食物として与えられるならば、投与されている植物組織が食用であることが好ましい。
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は植物中での導入遺伝子の発現を限定することに関与し、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を打ち消すためにジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）からのサイレンシングサプレッサーの共発現を使用することができる（Brigneti et al., 1998）。代替のサイレンシングサプレッサーは当技術分野において周知であり、本明細書において記載されるように使用することができ（Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；参照として本明細書に組み込まれる）、例えば、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、柑橘トリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ）潜在ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）またはニンニク共通潜在ウイルスのｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）であるが、これらに限定されない。したがって、サイレンシングサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であるが、これらに限定されないものは、植物内での高レベルタンパク質産生をさらに保証するために、対象となるタンパク質をコードする核酸配列と共に共発現させることができる。
さらに、ＨＡ亜型の組み合わせを含むＶＬＰを産生することができる。例えば、ＶＬＰは、亜型のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｂ型、またはその組み合わせからの１つまたは複数のＨＡを含むことができる。ＨＡの組み合わせの選択は、ＶＬＰから調製されたワクチンの意図される使用によって決定することができる。例えば、トリの接種で使用されるワクチンはＨＡ亜型の任意の組み合わせを含むが、ヒトの接種に有用なＶＬＰは亜型のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはＢの１つまたは複数の亜型を含むことができる。しかしながら、他のＨＡ亜型の組み合わせもＶＬＰの使用に応じて調製することができる。ＨＡ亜型の組み合わせを含むＶＬＰを産生するために、所望されるＨＡ亜型は同じ細胞（例えば植物細胞）内で共発現させることができる。
さらに、本明細書において記載されるように産生されたＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望されるならばＮＡはＨＡと共発現させることができる。
したがって、本発明は、安定的発現システムまたは一過性発現システムによる使用に適切なキメラコンストラクトを含む適切なベクターをさらに含む。遺伝情報は１つまたは複数のコンストラクト内でも提供することができる。例えば、対象となるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を１つのコンストラクト中に導入し、対象となるタンパク質の糖鎖付加を修飾するタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列は個別のコンストラクトを使用して導入することができる。次いで、これらのヌクレオチド配列を植物内で共発現させることができる。しかしながら、対象となるタンパク質および対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質の両方をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトも使用することができる。この事例において、ヌクレオチド配列は、対象となるプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結されたタンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の配列、および対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２の配列（第２の配列はプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結される）を含むだろう。
「共発現される」によって、植物内でおよそ同じ時間で、および植物の同じ組織内で２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が発現されることが意味される。しかしながら、ヌクレオチド配列が正確に同じ時間で発現される必要はない。むしろ、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は、コードされた産物が相互作用する機会を有するような様式で発現される。例えば、対象となるタンパク質の糖鎖付加を修飾するタンパク質は、対象となるタンパク質の糖鎖付加の修飾が行われるように、対象となるタンパク質が発現される期間の前にまたはその間に発現させることができる。２つまたはそれ以上の配列の両方の配列が発現されるという条件下でおよそ同じ時間で植物内で導入される場合には、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は一過性発現システムを使用して共発現させることができる。あるいは、ヌクレオチド配列のうちの１つ（例えば対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする配列）を含むプラットフォーム植物は、一過性様式にまたは安定的様式で、対象となるタンパク質をコードする追加の配列により形質転換することができる。この事例において、対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする配列は、所望される発生ステージの間に所望される組織内で発現させることができるか、またはその発現は誘導可能プロモーターを使用して誘導することができ、対象となるタンパク質を、コードする追加の配列を類似する条件下でおよび同じ組織で発現させて、ヌクレオチド配列が共発現されることを保証することができる。
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インフィルトレーションおよび同種のものを使用して、植物細胞へと導入することができる。かかる技術の総説については、例えば、Weissbach and Weissbach、Methods for Plant Molecular Biology、アカデミー・プレス（Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨークＶＩＩＩ、ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Geierson and Corey、Plant Molecular Biology、第２版（１９８８）；およびPlant Metabolism中のMiki and Iyer、Fundamentals of Gene Transfer in Plants.、第２版DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell（編）、アディソン−ウェズリー・ラングマン社（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ， Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ．）ロンドン、ｐｐ．５６１−５７９（１９９７）を参照。他の方法は、直接的ＤＮＡ取込、リポソームの使用、エレクトロポレーション（例えばプロトプラストを使用して）、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、およびバキュームインフィルトレーションを含む。例えば、Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991)、Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991)、Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987)、Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987)、Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)；Howell et al. (Science 208: 1265, 1980)、Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)、DeBlock et al. (Plant Physiology 91: 694-701, 1989)、Methods for Plant Molecular Biology（Weissbach and Weissbach編、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、１９８８年）、Methods in Plant Molecular Biology（Schuler and Zielinski編、アカデミックプレス社、１９８９年）、Liu and Lomonossoff（J. Virol Meth, 105:343-348, 2002）、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；第５，１００，７９２号；第６，４０３，８６５号；第５，６２５，１３６号を参照（そのすべては参照として本明細書に組み込まれる）。
本発明のコンストラクトを発現するために一過性発現方法を使用することができる（Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348を参照；参照として本明細書に組み込まれる）。あるいは、Kapila et al. 1997（参照として本明細書に組み込まれる）によって記載された真空に基づく一過性発現方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、アグロ接種またはアグロインフィルトレーションの方法を含むが、これらに限定されず、しかしながら、他の一過性方法も上述されるように使用することができる。アグロ接種またはアグロインフィルトレーションのいずれかにより、所望される核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば、葉、植物の地上構造の一部（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部（茎、根、花）、または全草の細胞間の空間に入り込む。表皮の通過後に、アグロバクテリウムは感染し、細胞へとｔ−ＤＮＡコピーを移行させる。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染した細胞中で対象となるタンパク質の産生をもたらすが、核の内部でのｔ−ＤＮＡの継代は一過性である。
対象となるヌクレオチド配列が植物に対して直接または間接的に毒性のある産物をコードするならば、本発明の方法の使用によって、かかる毒性は、所望される組織内でまたは所望される植物の発生ステージで対象となるヌクレオチド配列を選択的に発現させることによって、植物の全体で減少させることができる。さらに、植物中で毒性産物を産生するときに、限定された期間での一過性発現からもたらされる発現は効果を低下させることができる。誘導可能プロモーター、組織特異的プロモーターまたは細胞の特異的プロモーターは、対象となる配列の発現を選択的に指令するために使用することができる。
本発明の組換えＨＡ ＶＬＰは、ワクチンを補足してそれらをより効果的にし、必要な投与量を減少させるために、既存のインフルエンザワクチンと併用して使用することができる。当業者に公知であるように、ワクチンは１つまたは複数のインフルエンザウイルスに対して指向することができる。適切なワクチンの実例は，サノフィ・パスツール（Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ）社、ＩＤ・バイオメディカル（ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）社、メリアル（Ｍｅｒｉａｌ）社、シノバック（Ｓｉｎｏｖａｃ）社、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）社、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社、メディミューン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）社、グラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）社、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）社、サノフィ・アベンティス（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）社、セローノ（Ｓｅｒｏｎｏ）社、シレ・ファーマシューティカルズ（Ｓｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社および同種のものから商業的に入手可能なものを含むが、これらに限定されない。
所望されるならば、本発明のＶＬＰは、当業者に公知であるような適切なアジュバントと混合することができる。さらに、ＶＬＰは、上で定義されるように標的生物の処置に効果的な用量のＶＬＰを含むワクチン組成物中で使用することができる。さらに、本発明に従って産生されたＶＬＰは、異なるインフルエンザタンパク質（例えばノイラミニダーゼ（ＮＡ））を使用して得られるＶＬＰと組み合わせることができる。
したがって、本発明は、１つまたは複数のＶＬＰを含むワクチンの効果的な用量を投与することを含む、動物または標的生物中でインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法を提供する。ワクチンは、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で投与することができる。
本発明に従って産生されたＶＬＰの投与は実施例６中で記載される。植物で作製されたＨ５ ＶＬＰの投与は、可溶性ＨＡの投与と比較した場合、有意により高い応答をもたらした（図２１Ａおよび２１Ｂを参照）。
図２６Ａおよび２６Ｂ中で示されるように、Ａ／インドネシア／５／０５ Ｈ５ ＶＬＰを投与した被験体は、インフルエンザＡ型／トルコ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１；「トルコＨ５Ｎ１」）による攻撃感染に対して交差防御を提供する。攻撃感染の前のインドネシアＨ５ ＶＬＰの投与は体重のいかなる減少ももたらさなかった。しかしながら、Ｈ５ ＶＬＰを投与しないがトルコＨ５Ｎ１により攻撃感染した被験体において、体重の有意な減少が示され、複数の被験体は死亡した。
これらのデータは、したがって、Ｈ５赤血球凝集素ウイルスタンパク質を含む植物で作製されたインフルエンザＶＬＰが病原性インフルエンザ株に特異的免疫応答を誘導し、ウイルス様粒子が植物原形質膜から出芽できることを実証する。
したがって、本発明は、効果的な用量のＶＬＰ（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５インドネシア／５／２００６、Ａ／ブリズベーン／５０／２００７、Ａ／ソロモン諸島３／２００６、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００５、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７、Ａ／アンホイ／１／２００５、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７、Ａ／ウマ／プラハ／５６、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／香港／１０７３／９９でありえる。さらに、インフルエンザウイルス感染に対する被験体の免疫を誘導する方法が提供される。方法は、ウイルス様粒子（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を投与することを含む。ウイルス様粒子は、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で被験体に投与することができる。
本発明の様々な実施形態に従う組成物は、２つまたはそれ以上のインフルエンザ株または亜型のＶＬＰを含むことができる。「２つまたはそれ以上」は２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の株または亜型を指す。示された株または亜型は、単一の亜型（例えば、すべてＨ１Ｎ１、またはすべてＨ５Ｎ１）、または亜型の組み合わせでありえる。例示的な亜型および株は、本明細書において開示されたものを含むが、これらに限定されない（例えば、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ニワトリ／ニューヨーク／１９９５、Ａ／セグロカモメ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／テキサス／３２／２００３、Ａ／マガモ／ＭＮ／３３／００、Ａ／アヒル／上海／１／２０００およびＡ／キタオナガガモ／テキサス／８２８１８９／０２、Ａ／トルコ／オンタリオ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ハシビロガモ／イラン／Ｇ５４／０３、Ａ／ニワトリ／ドイツ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／アヒル／イギリス／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／アヒル／アルバータ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／カモメ／メリーランド／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／マガモ／グルジェブ／２６３／８２、Ａ／アヒル／オーストラリア／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ユリカモメ／スウェーデン／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／リー／４０、Ｃ／ヨハネスブルグ／６６、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））。
株および亜型の組み合わせの選択は、インフルエンザに曝露される可能性の高い被験体の地理的領域、免疫されるヒト集団に接近する動物種（例えば、水鳥の種、ブタのような農業用動物など）およびこれらの動物種が保有する株、曝露される株もしくは曝露される可能性の高い株、亜型または株内での抗原ドリフトの予測、またはこれらの因子の組み合わせに依存しうる。過去に使用された組み合わせの実例が利用可能である。（URL: who.int/csr/dieease/influenza/vaccine recommendations1/enを参照）。これらの株のいくつかまたはすべては、ワクチン組成物の産生において示された組み合わせ、または他の組み合わせで用いることができる。
より詳細には、例示的な組み合わせは、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）様ウイルスまたはＢ／フロリダ／４／２００６、またはＢ／フロリダ／４／２００６様ウイルスを含む群から選択された２つまたはそれ以上の株または亜型からのＶＬＰを含むことができる。
別の例示的な組み合わせは、Ａ／インドネシア／５／２００５、Ａ／インドネシア／５／２００５様ウイルス、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４様ウイルス、Ａ／アンホイ／１／０５、Ａ／アンホイ／１／０５様ウイルス、Ａ／ガチョウ／貴陽／３３７／２００６、Ａ／ガチョウ／貴陽／３３７／２００６様ウイルス、Ａ／ニワトリ／サンセイ／２／２００６、Ａ／ニワトリ／サンセイ／２／２００６様ウイルス、Ａ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／カリフォルニア／０４／０９（Ｈ１Ｎ１）様ウイルスを含む群から選択された２つまたはそれ以上の株または亜型からのＶＬＰを含むことができる。
別の例示的な組み合わせは、Ａ／ニワトリ／イタリア／１３４７４／９９（Ｈ７タイプ）またはＡ／ニワトリ／ブリティッシュコロンビア／０４（Ｈ７Ｎ３）のインフルエンザ株を含むことができる。
別の例示的な組み合わせは、Ａ／ニワトリ／香港／Ｇ９／９７またはＡ／香港／１０７３／９９のＶＬＰを含むことができる。別の例示的な組み合わせは、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６のＶＬＰを含むことができる。別の例示的な組み合わせは、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７のＶＬＰを含むことができる。別の例示的な組み合わせは、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５のＶＬＰを含むことができる。別の例示的な組み合わせは、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４、Ｂ／フロリダ／４／２００６またはＢ／ブリズベーン／３／２００７の株または亜型のＶＬＰを含むことができる。
２つまたはそれ以上のＶＬＰは個別に発現することができ、続いて精製されたＶＬＰまたは半精製されたＶＬＰを組み合わせることができる。あるいは、ＶＬＰは同じ宿主（例えば植物）中で共発現することができる。ＶＬＰは所望される比（例えばおよそ等しい比）で組み合わせるかもしくは産生することができ、または１つの亜型または株が組成物中で大多数のＶＬＰを構成するように組み合わせることができる。
したがって、本発明は、２つまたはそれ以上の株または亜型のＶＬＰを含む組成物を提供する。
エンベロープウイルスのＶＬＰは、一般的には出芽する膜からエンベロープを取得する。植物原形質膜は、免疫刺激効果がある植物性ステロール相補物を有している。この可能性を調査するために、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰをアジュバントの存在下または非存在下において動物に投与し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体応答）を決定した（図２２Ａ、２２Ｂ）。追加アジュバントが存在しなくても、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰは有意なＨＡＩを実証し、抗原の投与に対する全身性免疫応答を表す。さらに、アジュバントの存在下または非存在下において投与されたＶＬＰの抗体アイソタイププロフィールは類似している（図２３Ａ）。
表５は、本発明の様々な実施形態において提供される配列をリストする。
表５：配列識別名のための配列記載。












本発明はここで以下の非限定例を単なる参照として詳細に記載される。
方法および材料
１．天然のＨＡのためのプラストシアニンベースの発現カセットの組み立て
すべての操作は、Sambrook and Russell（２００１；参照として本明細書に組み込まれる）の一般的な分子生物学プロトコールを使用して行われた。第１のクローニング工程は、アルファルファのプラストシアニン遺伝子の上流および下流の調節エレメントを含有するレセプタープラスミドを組み立てることであった。プラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ配列は、オリゴヌクレオチドプライマーのＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃ（配列番号：２９；図１０Ｑ）およびＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒ（配列番号：３０；図１０Ｒ）を使用して、アルファルファゲノムＤＮＡから増幅した。もたらされた増幅産物をＸｍａＩおよびＳａｃＩで消化し、事前に同じ酵素で消化したｐＣＡＭＢＩＡ２３００（キャンビア（Ｃａｍｂｉａ）社、キャンベラ、オーストラリア）の中へライゲーションして、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏ Ｐｌａｓｔｏを生成した。同様に、プラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲ配列およびターミネーターを、プライマーのＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃ（配列番号：３１；図１０Ｓ）およびＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒ（配列番号：３２；図１０Ｔ）を使用してアルファルファゲノムＤＮＡから増幅し、産物をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化した後にｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏの同じ部位の中へ挿入して、ｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏを生成した。
インフルエンザ株Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１；アクセッション番号ＬＡＮＬ ＩＳＤＮ１２５８７３）からの赤血球凝集素をコードする断片は、エポック・バイオラボ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ）社（シュガーランド、テキサス、アメリカ）によって合成された。最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドを含む完全なＨ５コード領域およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含有する、産生された断片を、配列番号：３（図６）中で提示する。Ｈ５コード領域を、Darveau et al. (1995)中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってプラストシアニンベースの発現カセットの中へクローン化した。簡潔には、第１のＰＣＲ増幅物を、プライマーのＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号：５；図７Ｂ）、ならびに鋳型としてｐＣＡＭＢＩＡ ｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏを使用して得た。平行して、鋳型としてＨ５コード断片、プライマーのＰｌａｓｔｏ−ＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃ（配列番号：６；図７Ｃ）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：７；図７Ｄ）を用いて、第２の増幅を行った。両方の反応から得た増幅をともに混合し、プライマーとしてＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：７；図７Ｄ）を使用し、混合物を鋳型として、第３の反応（組み立て反応）を行った。もたらされた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中の）およびＳａｃＩ（断片の３’末端で）で消化し、事前に同じ酵素で消化したｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏの中へクローン化した。６６０と命名したもたらされたプラスミドを図２Ｂ中で提示する（図１１も参照）。
赤血球凝集素発現カセット番号７７４から７８５を以下のように組み立てた。合成断片は、プラストシアニンのＡＴＧの上流の最初の８４ヌクレオチドに対応し、ＤｒａＩＩＩ制限部位で終了するアルファルファプラストシアニン遺伝子配列が３’で隣接した、完全な赤血球凝集素コード配列（ＡＴＧからストップ）を含んで合成された。合成断片は終止コドン後にＳａｃＩ部位も含んでいた。
合成赤血球凝集素断片は、トップ・ジーン・テクノロジーズ（Ｔｏｐ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、モントリオール、ケベック、カナダ）、エポック・バイオラボ社（シュガーランド、テキサス、アメリカ）によって合成された。合成された断片は図２８乃至３９中で提示され、配列番号：３６乃至配列番号：４７に対応する。完全な発現カセットの組み立てのために、合成断片をＤｒａＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、事前に同じ酵素で消化したｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏの中へクローン化した。表６は、対応するＨＡにより産生されたカセット、および本文中の他の参照を提示する。
表６：ＤｒａＩＩＩ−ＳａｃＩ合成断片から組み立てられた赤血球凝集素発現カセット。
プラストシアニンベースのＰＤＩＳＰ／ＨＡ融合発現カセットの組み立て
Ｈ１ Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（コンストラクト番号５４０）
インフルエンザ株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）のＨ１遺伝子からのオープンリーディングフレームは、２つの断片で合成された（プラント・バイオテクノロジー・インスティテュート（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、国立研究評議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）、サスカトゥーン、カナダ）。合成された第１の断片は、５’末端のシグナルペプチドコード配列および３’末端の膜貫通ドメインコード配列を欠損する、野生型Ｈ１コード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２８９９２９；配列番号：３３；図１６）に対応する。ＢｇｌＩＩ制限部位をコード配列の５’末端で追加し、２重のＳａｃＩ／ＳｔｕＩ部位を終止コドンのすぐ下流の断片の３’末端端部で追加し、配列番号：１を得た（図５Ａ）。ＫｐｎＩ部位から終止コドンのＨ１タンパク質のＣ末端（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む）をコードし、ＳａｃＩ制限部位およびＳｔｕＩの制限部位が３’で隣接した第２の断片も合成された（配列番号：２；図５Ｂ）。
第１のＨ１断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）遺伝子（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）のシグナルペプチドに融合したプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲを含有するバイナリーベクター（ｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏ）の同じ部位の中へクローン化し、プラストシアニン調節エレメントの下流のＰＤＩ−Ｈ１キメラ遺伝子をもたらす。ＰＤＩシグナルペプチドを含有するプラストシアニンベースのカセットの配列を、図１中で提示する（配列番号：８）。もたらされたプラスミドは、ＰＤＩシグナルペプチドに融合され、プラストシアニン調節エレメントが隣接したＨ１コード領域を含有していた。Ｃ末端コード領域（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をコードする）の追加は、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩにより事前に消化した合成断片（配列番号：２；図５Ｂ）をＨ１発現プラスミドの中へ挿入することによって得られた。５４０と命名したもたらされたプラスミドを図１１中で提示する（図２Ａも参照）。
Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／２００５（コンストラクト番号６６３）
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）を、Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のＨＡ０コード配列に以下のように連結した。Ｈ５コード配列は、鋳型としてコンストラクト番号６６０（配列番号：６０；図５１）を使用して、プライマーのＳｐＰＤＩ−ＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃ（配列番号：８２）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号：７；図７Ｄ）で増幅した。もたらされた断片は、ＰＤＩＳＰをコードする最後のヌクレオチド（ＢｇｌＩＩ制限部位を含む）が５’で隣接し、ＳａｃＩ制限部位が３’で隣接したＨ５コード配列であった。断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、事前に同じ制限酵素により消化したコンストラクト番号５４０（配列番号：６１；図５２）の中へクローン化した。コンストラクト番号６６３（配列番号：８３）と命名した最終カセットを図６９中で提示する。
Ｈ１ Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（コンストラクト７８７）
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）を、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１のＨＡ０コード配列に以下のように連結した。Ｈ１コード配列は、鋳型としてコンストラクト７７４（配列番号：６２；図５３）を使用して、プライマーＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ｂ．ｃ（配列番号：８４）およびＳａｃＩ−Ｈ１Ｂ．ｒ（配列番号：８５）により増幅した。もたらされた断片は、ＰＤＩＳＰをコードする最後のヌクレオチド（ＢｇｌＩＩ制限部位を含む）が５’で隣接し、ＳａｃＩ制限部位が３’で隣接したＨ１コード配列であった。断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、事前に同じ制限酵素により消化したコンストラクト番号５４０（配列番号：６１；図５２）の中へクローン化した。コンストラクト番号７８７（配列番号：８６）と命名した最終カセットを図７０中で提示する。
Ｈ３ Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（コンストラクト番号７９０）
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）を、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３のＨＡ０コード配列に以下のように連結した。ＰＤＩＳＰを、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってＨ３コード配列に連結した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、ＰＤＩＳＰに融合したプラストシアニンプロモーターのセグメントを、鋳型としてコンストラクト５４０（配列番号：６１；図５２）、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨ３Ｂ−ＳｐＰＤＩ．ｒ（配列番号：８７）を使用して増幅した。平行して、Ｈ３ Ａ／ブリズベーン／１０／２００７のコード配列の一部を含有する別の断片（コドン１７からＳｐｅＩ制限部位）を、鋳型としてコンストラクト７７６（配列番号：６９；図６０）を使用してプライマーのＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ｂ．ｃ（配列番号：８８）およびＨ３（Ａ−Ｂｒｉ）．９８２ｒ （配列番号：８９）で増幅した。次いで増幅産物を混合し、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨ３（Ａ−Ｂｒｉ）．９８２ｒ（配列番号：８９）と共に鋳型として第２の１ラウンドの増幅（組み立て反応）に使用した。もたらされた断片をＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中の）およびＳｐｅＩ（Ｈ３コード配列中の）により消化し、同じ制限酵素により事前に消化したコンストラクト番号７７６（配列番号：６９；図６０）の中へクローン化して、コンストラクト番号７９０（配列番号：９０）を得た。コンストラクトを図７１中で提示する。
ＨＡ Ｂ／フロリダ／４／２００６（コンストラクト番号７９８）
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）を、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってＨＡ Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのＨＡ０コード配列に連結した。増幅の第１のラウンドにおいて、ＰＤＩＳＰに融合したプラストシアニンプロモーターの一部を、鋳型としてコンストラクト番号５４０（配列番号：６１；図５２）、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨＢＦ−ＳｐＰＤＩ．ｒ（配列番号：９１）を使用して増幅した。平行して、プラストシアニンターミネーターに融合したＨＢ Ｂ／Ｆｌｏのコード配列の一部を含有する別の断片を、鋳型としてコンストラクト番号７７９（配列番号：７３；図６４）を使用して、プライマーのＳｐＰＤＩ−ＨＢＦ．ｃ（配列番号：９２）およびＰｌａｓｔｅｒ８０ｒ（配列番号：９３）で増幅した。次いでＰＣＲ産物を混合し、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＰｌａｓｔｅｒ８０ｒ（配列番号：９３）と共に鋳型として第２の１ラウンドの増幅（組み立て反応）に使用した。もたらされた断片をＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中の）およびＡｆｌＩＩ（ＨＡ Ｂ／フロリダ／４／２００６コード配列中の）により消化し、同じ制限酵素により事前に消化したコンストラクト番号７７９（配列番号：７３；図６４）の中へクローン化して、コンストラクト番号７９８（配列番号：９４）を得た。もたらされた発現カセットを図７２中で提示する。
ＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットの組み立て
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットは、ｍＲＮＡの発現を制御するために３５Ｓプロモーターを使用し、位置１１５および１６１で、変異させたＡＴＧを持つササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２からのヌクレオチド１〜５１２が５’で隣接し、ＣＰＭＶ ＲＮＡ２からのヌクレオチド３３３０〜３４８１（３’ＵＴＲに対応する）が３’で隣接し、ＮＯＳターミネーターが続く、対象となるコード配列を含む。プラスミドｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣ（Sainsbury et al. 2008; Plant Biotechnology Journal 6: 82-92およびＰＣＴ公報ＷＯ２００７／１３５４８０）を、ＣＰＭＶ−ＨＴベースの赤血球凝集素発現カセットの組み立てに使用した。ＣＰＭＶ ＲＮＡ２の位置１１５および１６１でＡＴＧの変異は、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法を使用して行った。鋳型としてｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣを使用して、個別の２つのＰＣＲを行った。第１の増幅のためのプライマーは、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号：７７）およびＭｕｔ−ＡＴＧ１１５．ｒ（配列番号：７８）である。第２の増幅のためのプライマーは、Ｍｕｔ−ＡＴＧ１６１．ｃ（配列番号：７９）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号：８０）であった。次いで２つの得られた断片を混合し、プライマーとしてｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号：７７）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号：８０）を使用して、鋳型として第３の増幅に使用する。もたらされた断片をＰａｃＩおよびＡｐａＩにより消化し、同じ酵素により消化したｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣの中へクローン化する。８２８と命名した生成された発現カセットの配列を図６８（配列番号：８１）中で提示する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＳｐＰＤＩ−Ｈ１ Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（コンストラクト番号５８０）の組み立て。
Ｈ１ Ａ／ニューカレドニア／２０／９９からのＨＡ０に融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号５４０（配列番号：６１；図５２）を使用してプライマーのＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号：９５）およびＳｔｕＩ−Ｈ１（Ａ−ＮＣ）．ｒ（配列番号：９６）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（最初のＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号５８０（配列番号：９７）と命名した。
２×３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＳｐＰＤＩ−Ｈ１ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／２００９（コンストラクト番号５６０）の組み立て
Ｈ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９からのＨＡ０に融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする断片を、以下のように２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。
今までに使用した３５Ｓプロモーターの代りに、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中に２×３５Ｓプロモーターを含有する中間ベクターを最初に生成した。プロモーターの変更は、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法を使用して行われた。２×３５Ｓプロモーター配列番号：１２９（図９３）を含有する第１の断片を、鋳型として２×３５Ｓプロモーターを含有するプラスミドを使用して、プライマーの
および
によるＰＣＲによって増幅した。平行して、第２のＰＣＲを、鋳型としてコンストラクト６８５（配列番号：１００；図７４）を使用して、プライマーの
および
により行った。次いで得られた２つの断片を混合し、プライマーのＰａｃＩ−ＭＣＳ−２×３５Ｓ．ｃ（配列番号：１３０）およびＡｐａＩ−Ｍ ｐｒｏｔ．ｒ（配列番号：１３３）を使用する第２の１ラウンドのＰＣＲ（組み立て反応）のための鋳型として使用した。次いでもたらされた断片をＰａｃＩおよびＡｐａＩにより消化し、同じ制限酵素により消化したコンストラクト６８５（配列番号：１００；図７４）の中へクローン化した。９７２（配列番号：１３４）と命名した中間ベクターの配列を図９４中で提示する。
天然のＨ１ Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列をＧＩＳＡＩＤデータベース（アクセッション番号ＥＰＩ１７６４７０）から得て、図９５（配列番号：１３５）中で提示する。アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド（ＰＤＩＳＰ）（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）および変異させたＳａｃＩ制限部位およびＳｔｕＩ制限部位を持つＡ／カリフォルニア／４／２００９赤血球凝集素のＨＡ０と共に、ＤｒａＩＩＩ制限部位からＡｐａＩ制限部位のＣＰＭＶ Ｍタンパク質の一部（ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中の）を含むヌクレオチド配列を、図９６（配列番号：１３６）中で提示する。配列は３つの異なる断片でＤＮＡ２．０（メンローパーク、カリフォルニア、アメリカ）によって合成された。断片１（配列番号：１３７；図９７）、断片２（配列番号：１３８；図９７）および断片３（配列番号：１３９；図９７）を、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法を使用して組み立てた。増幅の第１のラウンドにおいて、３つの異なるＰＣＲを行った。第１の断片は、鋳型として断片１（配列番号：１３９）を含有するｐＪ２０１ベクター（ＤＮＡ２．０の専用のベクター）を使用して、プライマーの
および
Ｈ１ Ｃａｌ．３９０ｒ（配列番号：１４１）
ＧＣＴＴＡＡＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＡＧＣＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＧＡＴＧＡＡＡＴＣＴＣＣ
を使用して増幅した。第２の断片は、鋳型として断片２（配列番号：１３８）を含有するｐＪ２０１ベクター（ＤＮＡ２．０の専用のベクター）を使用して、プライマーの
Ｈ１ Ｃａｌ．３１０ｃ（配列番号：１４２）
ＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＡＧＴＴＣＡＧＡＣＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＴＴＡＣＣＣＡＧＧＡＧ
および
Ｈ１ Ｃａｌ．１１５９ｒ（配列番号：１４３）
ＣＴＧＣＡＴＡＴＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＴＴＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＡＣＣＧＴ
を使用して増幅した。最終的に、最後の断片は、鋳型として断片３（配列番号：１３９）を含有するｐＪ２０１ベクター（ＤＮＡ２．０の専用のベクター）を使用して、プライマーの
Ｈ１ Ｃａｌ．１０８１ｃ（配列番号：１４４）
ＴＴＧＡＡＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＣＧＧＴＴ
および
を使用して増幅した。第２の１ラウンドのＰＣＲ（組み立て反応）において、次いで３つの増幅断片を混合し、プライマーＤｒａＩＩＩ−ＭＰｒｏｔ＃２．ｃ（配列番号：１４０）およびＳｔｕＩ−Ｈ１ Ｃａｌ．ｒ（配列番号：１４５）と共に鋳型として使用した。もたらされた断片をＤｒａＩＩＩおよびＳｔｕＩにより消化し、同じ制限酵素により消化したコンストラクト９７２（配列番号：１３４）の中へ挿入した。もたらされたコンストラクトのヌクレオチド配列を５６０（配列番号：１４６；図９８）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＨ５ Ａ／インドネシア／５／２００５（コンストラクト番号６８５）の組み立て。
Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のコード配列を以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号６６０（配列番号：６０；図５１）を使用してプライマーのＡｐａＩ−Ｈ５ （Ａ−Ｉｎｄｏ）．１ｃ（配列番号：９８）およびＨ５ （Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号：９９）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号６８５（配列番号：１００）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＳｐＰＤＩ−Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／２００５（コンストラクト番号６８６）の組み立て。
Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨＡ０に融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号６６３（配列番号：８３）を使用してプライマーのＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号：９５）およびＨ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号：９９）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号６８６（配列番号：１０１）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＨ１ Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（コンストラクト番号７３２）の組み立て。
Ｈ１ Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨＡのコード配列を以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号７７４（配列番号：６２；図５３）を使用してプライマーのＡｐａＩ−Ｈ１Ｂ．ｃ（配列番号：１０２）およびＳｔｕＩ−Ｈ１Ｂ．ｒ（配列番号：１０３）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号７３２（配列番号：１０４）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＳｐＰＤＩ−Ｈ１ Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（コンストラクト番号７３３）の組み立て。
Ｈ１ Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨＡ０に融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号７８７（配列番号：８６）を使用してプライマーのＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号：９５）およびＳｔｕＩ−Ｈ１Ｂ．ｒ（配列番号：１０３）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号７３３（配列番号：１０５）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＨ３ Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（コンストラクト番号７３５）の組み立て。
Ｈ３ Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨＡのコード配列を以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号７７６（配列番号：６９）を使用してプライマーのＡｐａＩ−Ｈ３Ｂ．ｃ（配列番号：１０６）およびＳｔｕＩ−Ｈ３Ｂ．ｒ（配列番号：１０７）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片はＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号７３５（配列番号：１０８）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＳｐＰＤＩ−Ｈ３ Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（コンストラクト番号７３６）の組み立て。
Ｈ３ Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨＡ０に融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号７９０（配列番号：９０）を使用してプライマーのＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号：９５）およびＳｔｕＩ−Ｈ３Ｂ．ｒ（配列番号：１０７）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号７３６（配列番号：１０９）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＨＡ Ｂ／フロリダ／４／２００６（コンストラクト番号７３８）の組み立て。
Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのコード配列を以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号７７９（配列番号：７３；図６４）を使用してプライマーＡｐａＩ−ＨＢＦ．ｃ（配列番号：１１０）およびＳｔｕＩ−ＨＢＦ．ｒ（配列番号：１１１）によるＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号７３８（配列番号：１１２）と命名した。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット中のＳｐＰＤＩ−ＨＡ Ｂ／フロリダ／４／２００６（コンストラクト番号７３９）の組み立て。
Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡ０に融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号７９８（配列番号：９４）を使用してプライマーのＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号：９５）およびＳｔｕＩ−ＨＢＦ．ｒ（配列番号：１１１）でＰＣＲ増幅を行うことによって、制限部位のＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号８２８（配列番号：８１）の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号７３９（配列番号：１１３）と命名した。
シャペロン発現カセットの組み立て
２つの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）発現カセットを組み立てた。第１のカセットにおいて、シロイヌナズナ（生態型コロンビア）細胞質ＨＳＰ７０（Lin et al. (2001) Cell Stress and Chaperones 6: 201-208中のＡｔｈｓｐ７０−１）の発現は、アルファルファの亜硝酸還元酵素（Ｎｉｒ）プロモーターおよびアルファルファのプラストシアニンプロモーターのエレメントを組み合わせたキメラプロモーター（Ｎｉｒ／Ｐｌａｓｔｏ）によって制御される。キメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーターの制御下にアルファルファの細胞質ＨＳＰ４０（ＭｓＪ１；Frugis et al. (1999) Plant Molecular Biology 40: 397-408）のコード領域を含む第２のカセットも組み立てられた。
植物バイナリーベクター中でアルファルファの亜硝酸還元酵素プロモーター（Ｎｉｒ）、ＧＵＳレポーター遺伝子およびＮＯＳターミネーターを含有するアクセプタープラスミドを、最初に組み立てた。プラスミドｐＮｉｒ３Ｋ５１（米国特許第６，４２０，５４８号中で以前に記載される）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩにより消化した。もたらされた断片は、同じ制限酵素によって消化したｐＣＡＭＢＩＡ２３００（キャンビア社、キャンベラ、オーストラリア）の中へクローン化して、ｐＣＡＭＢＩＡ−Ｎｉｒ３Ｋ５１を得た。
Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０のコード配列を、Darveau et al. （Methods in Neuroscience 26:77-85 (1995)）中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってアクセプタープラスミドｐＣＡＭＢＩＡＮｉｒ３Ｋ５１中に別々にクローン化した。
Ｈｓｐ４０については、Ｍｓｊ１コード配列（配列番号：１１４）は、プライマーＨｓｐ４０Ｌｕｚ．１ｃ（配列番号：１１５）およびＨｓｐ４０Ｌｕｚ−ＳａｃＩ．１２７２ｒ（配列番号：１１６）を使用して、アルファルファ（生態型ランゲランダー（Ｒａｎｇｅｌａｎｄｅｒ））葉の全ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。第２の増幅は、鋳型としてコンストラクト６６０（配列番号：６０；図５１）と共にプライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨｓｐ４０Ｌｕｚ−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号：１１７）により行った。次いでＰＣＲ産物を混合し、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨｓｐ４０Ｌｕｚ−ＳａｃＩ．１２７２ｒ（配列番号：１１６）と共に鋳型として第３の増幅（組み立て反応）に使用した。もたらされた断片をＨｐａＩ（プラストシアニンプロモーター中の）により消化し、ＨｐａＩ（Ｎｉｒプロモーター中の）およびＳａｃＩにより事前に消化したｐＣＡＭＢＩＡＮｉｒ３Ｋ５１の中へクローン化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより埋めて平滑末端を生成した。得られたクローンを正確な向きについてスクリーニングし、配列全体性を配列決定した。Ｒ８５０と命名したもたらされたプラスミドを図８３（配列番号：１２１）中で提示する。Ａｔｈｓｐ７０−１のコード領域を、プライマーのＨｓｐ７０Ａｒａ．１ｃ（配列番号：１１８）およびＨｓｐ７０Ａｒａ−ＳａｃＩ．１９５６ｒ（配列番号：１１９）を使用して、シロイヌナズナ葉のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。第２の増幅は、鋳型としてコンストラクト６６０（配列番号：６０；図５１）、プライマーのＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨｓｐ７０Ａｒａ−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号：１２０）により行った。次いでＰＣＲ産物を混合し、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＨｓｐ７０ＡＲＡ−ＳａｃＩ．１９５６ｒ（配列番号：１１９）と共に、鋳型として第３の増幅（組み立て反応）に使用した。もたらされた断片をＨｐａＩ（プラストシアニンプロモーター中の）により消化し、ＨｐａＩ（Ｎｉｒのプロモーター中の）およびＳａｃＩにより消化したｐＣＡＭＢＩＡＮｉｒ３Ｋ５１の中へクローン化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより埋めて平滑末端を生成した。得られたクローンを正確な向きについてスクリーニングし、配列全体性を配列決定した。Ｒ８６０と命名したもたらされたプラスミドを図８４（配列番号：１２２）中で提示する。
二重Ｈｓｐ発現プラスミドを以下のように組み立てた。Ｒ８６０をＢｓｒＢＩ（ＮＯＳターミネーターの下流）により消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼにより処理して平滑末端を生成し、ＳｂｆＩ（キメラＮＩＲ／Ｐｌａｓｔｏプロモーターの上流）により消化した。もたらされた断片（キメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーター−ＨＳＰ７０コード配列−Ｎｏｓターミネーター）を、ＳｂｆＩおよびＳｍａＩ（両方はキメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中に位置する）により事前に消化したＲ８５０の中へクローン化した。Ｒ８７０と命名したもたらされたプラスミドを図８５（配列番号：１２３）中で提示する。
他の発現カセットの組み立て
可溶性Ｈ１発現カセット
Ｈ１の可溶性形態をコードするカセットは、５４０において膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をコードする領域を、ロイシンジッパーＧＣＮ４ ｐＩＩバリアントをコードする断片で置換することによって調製した（Harbury et al, 1993, Science 1993; 262: 1401-1407）。この断片は、クローニングを促進するために隣接するＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位を持って合成された。この置換からもたらされたプラスミドを５４４と命名し、発現カセットを図１１中で示す。
Ｍ１ Ａ／プエルトリコ／８／３４発現カセット
タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲとインフルエンザＡ型／ＰＲ／８／３４ Ｍ１遺伝子（アクセッション番号ＮＣ＿００２０１６）のオープンリーディングフレームとの間の融合は、終止コドンの下流に追加された隣接するＳａｃＩ部位を持って合成された。断片をＳｗａＩ（ＴＥＶ ５’ＵＴＲ中の）およびＳａｃＩにより消化し、ｐＣＡＭＢＩＡのバイナリープラスミド中の２×３５Ｓ／ＴＥＶベースの発現カセットの中へクローン化した。もたらされたプラスミドは、２×３５Ｓ／ＴＥＶプロモーターおよび５’ＵＴＲの制御下のＭ１をコードする領域ならびにＮＯＳターミネーターを持っていた（コンストラクト７５０；図１１）。
ＨｃＰｒｏ発現カセット
Hamilton et al. (2002)中で記載されるように、ＨｃＰｒｏコンストラクト（３５ＨｃＰｒｏ）を調製した。すべてクローンをコンストラクトの全体性を確認するために配列決定した。プラスミドを使用して、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＧＬ１；ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア２０１０８、アメリカ）を形質転換した（Mattanovich et al., 1989）。すべてのＡ．ツメファシエンス株の全体性を制限マッピングによって確認した。
Ｐ１９発現カセット
トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質のコード配列を、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))中に提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってアルファルファのプラストシアニン発現カセットに連結した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、鋳型としてコンストラクト６６０（配列番号：６０；図５１）によりプライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびｓｕｐＰ１９−ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号：１２４）を使用して増幅した。平行して、ｐ１９のコード配列を含有する別の断片を、Voinnet et al. (The Plant Journal 33: 949-956 (2003))中に記載されるように鋳型としてコンストラクト３５Ｓ：ｐ１９を使用して、プライマーのｓｕｐＰ１９−１ｃ（配列番号：１２５）およびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号：１２６）で増幅した。次いで増幅産物を混合し、プライマーのＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４；図７Ａ）およびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号：１２６）による第２の１ラウンドの増幅（集合させる反応）に鋳型として使用する。もたらされた断片をＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中の）およびＳａｃＩ（ｐ１９コード配列の端部で）により消化し、事前に同じ制限酵素により消化したコンストラクト番号６６０（配列番号：６０；図５１）の中へクローン化して、コンストラクト番号Ｒ４７２を得た。プラスミドＲ４７２を図８６中で提示する。
３．植物バイオマスの調製、接種物、アグロインフィルトレーションおよび収穫
植物のニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）またはニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）を、市販のピートモス基質で満たした低地において種子から育てた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。種まきの３週間後に、個別の苗木を選び、ポットに移植し、同じ環境条件下の温室中でさらに３週間成長させた。形質転換前に、頂芽および腋芽を、植物から芽をはさむことによってまたは化学的に植物を処理することによってのいずれかで、様々な時間で以下に示すように除去した。
各々のコンストラクトによりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、それらが０．６乃至１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６により補足されたＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁物を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６））中で再懸濁した。Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348)によって記載されるように、シリンジインフィルトレーションを行った。バキュームインフィルトレーションのために、Ａ．ツメファシエンス懸濁物を遠心分離し、インフィルトレーション培地中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。Ｎ．ベンサミアナまたはＮ．タバカムの全植物体を、２０〜４０トルの真空下で気密性ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中で転倒させて２分間置いた。シリンジインフィルトレーションまたはバキュームインフィルトレーションに続いて、収穫までの２〜６日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、ＣＰＭＶ−ＨＴカセットを持つ株（株ＡＧＬ１／Ｒ４７２と１：１比で共インフィルトレーションした）を除いて、すべてのインフィルトレーションをＡＧＬ１／３５Ｓ−ＨｃＰｒｏと１：１比で共インフィルトレーションとして行った。
４．葉サンプリングおよび全タンパク質抽出
インキュベーションに続いて、植物の地上構造の部分を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。冷却した５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドの３体積中で、凍結破砕した各々の植物材料のサンプルをホモジナイズ（ポリトロン）することによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で２０分間２０，０００ｇで遠心分離し、清澄化した粗抽出物（上清）を分析のために保存した。清澄化した粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード分析（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、ヘラクレス、カリフォルニア）によって決定した。
５．タンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー
３２ｍｌのセファクリル（商標）Ｓ−５００高分解能ビーズのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓ−５００ ＨＲ：ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、ウプサラ、スウェーデン、カタログ番号１７−０６１３−１０）を充填し、平衡／溶出緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）により平衡化した。１．５ミリリットルの粗タンパク質抽出物をカラムにロードし、続いて４５ｍＬの平衡／溶出緩衝液による溶出工程を行う。溶出を１．５ｍＬの画分で回収し、溶出画分の相対的タンパク質含有量は、１０μＬの画分を２００μＬの希釈したバイオ・ラッド社プロテインダイリエージェント（ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（バイオ・ラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア）と混合することによってモニターした。２カラム体積の０．２Ｎ ＮａＯＨ、続いて１０カラム体積の５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％のエタノールによりカラムを洗浄した。各々の分離の後に、ブルーデキストラン２０００（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス社（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．）、ピスカタウェイ、ニュージャージー、アメリカ）によるカラムのキャリブレーションが続いた。使用したカラム間の溶出プロフィールの均一性を保証するために、ブルーデキストラン２０００および宿主可溶性タンパク質の溶出プロフィールを各々の分離間で比較した。
６．タンパク質分析およびイムノブロット
タンパク質濃度はＢＣＡプロテインアッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）（ピアース・バイオケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社ロックポート、イリノイ）によって決定した。タンパク質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーにより染色した。染色したゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用してデンシトメトリー解析を行った。
ＳＥＣからの溶出画分からのタンパク質をアセトンにより沈殿させ（Bollag et al., 1996）、１／５体積の平衡／溶出緩衝液中で再懸濁し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ロッシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、インディアナポリス、インディアナ）上に電気的に転写した。イムノブロット前に、膜は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン２０により４℃で１６〜１８時間ブロックした。
イムノブロットは、ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で適切な抗体（表６）を２μｇ／ｍｌで用いたインキュベーションによって行った。化学発光検出に使用された二次抗体を、表４中で示されるように、ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で示されるように希釈した。基質としてルミノールを使用して、免疫反応性複合体を化学発光によって検出した（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）。ヒトＩｇＧ抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素へのコンジュゲーションは、ＥＺ−リンクプラス（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ）（登録商標）アクティベーティッドペルオキシダーゼコンジュゲーションキット（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ピアース社、ロックフォード、イリノイ）の使用によって実行した。Ｈ１、Ｈ３およびＢ亜型の検出の対照として使用した非活性化全ウイルス（ＷＩＶ）は、国立生物学的製剤研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＮＩＢＳＣ）から購入した。
表６：発現させたタンパク質のイムノブロットのための電気泳動条件、抗体および希釈。

ＦＩＩ：フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、コンコード、マサチューセッツ、アメリカ；
ＮＩＢＳＣ：国立生物学的製剤研究所；
ＪＩＲ：ジャクソン・イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）社、ウエストグローブ、ペンシルバニア、アメリカ；
ＢＥＩ ＮＲ：バイオテロ防衛・新興感染症研究リソースリポジトリ（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）；
ＩＴＣ：イミューン・テクノロジー社（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウッドサイド、ニューヨーク、アメリカ；
ＴＧＡ：保健省薬品・医薬品行政局（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｇｏｏｄｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、オーストラリア。
Ｈ５についての赤血球凝集分析はNayak and Reichl (2004)によって記載された方法に基づいた。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続的な２倍希釈を、１ウェルあたり１００μＬの希釈サンプルを残して、１００μＬのＰＢＳを含むＶ底の９６ウェルマイクロタイタープレート中で作製した。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁物（バイオ・リンク社（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．）、シラキュース、ニューヨーク）を各々のウェルに追加し、プレートを室温で２時間インキュベーションした。完全な赤血球凝集を示す最高希釈の逆数をＨＡ活性として記録した。平行して、組換えＨＡスタンダードをＰＢＳ中で希釈し、各々のプレートで対照として使用した。
７．ショ糖勾配超遠心
Ｈ５含有バイオマスのゲル濾過クロマトグラフィーから溶出された画分９、１０および１１の１ミリリットルをプールし、２０〜６０％（ｗ／ｖ）の不連続ショ糖密度勾配上にロードし、１２５０００ｇ（４℃）で１７．５時間遠心分離した。この勾配はトップから開始して１９個の３ｍＬの画分で分画し、免疫学的分析および赤血球凝集分析の前にショ糖を除去するために透析した。
８．電子顕微鏡
検査される１００マイクロリットルのサンプルを、エアフュージ（Ａｉｒｆｕｇｅ）超遠心チューブ（ベックマン・インスツルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、パロアルト、カリフォルニア、アメリカ）中に置いた。グリッドをチューブの底に置き、次いで１２００００ｇで５分間遠心分離した。グリッドを取り出し、穏やかに乾燥し、染色のためにｐＨ６の３％リンタングステン酸のドロップを上に置いた。グリッドを日立７１００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で検査した（図１４Ｂ、１５Ｂおよび１５Ｃ中の像について）。
図１９中の像については、およそ１ｍｍ3の葉のブロックを２．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ中で固定し、１．３３％四酸化オスミウム中での後固定工程前に３％ショ糖含有ＰＢＳ中で洗浄した。固定したサンプルを、スパー（Ｓｐｕｒｒ）樹脂中に包埋し、超薄層をグリッド上に置いた。サンプルを観察の前に５％酢酸ウラニルおよび０．２％クエン酸鉛によりポジティブ染色した。グリッドを日立７１００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で検査した。
９．原形質膜脂質解析
Mongrand et al.に従う細胞分画法後に、原形質膜（ＰＭ）を、ポリエチレングリコール３３５０／デキストランＴ−５００（各６．６％）による水性ポリマー二相系における分配によって、タバコ葉および培養されたＢＹ２細胞から得た。工程はすべて４℃で行った。
脂質はBligh and Dyerに従って異なる画分から抽出され精製された。極性脂質および中性脂質を、Lefebvre et al.中に記載される溶媒システムを使用して、一次元ＨＰ−ＴＬＣによって分離した。ＰＭ画分の脂質は、Macala et al.によって記載される酢酸銅による染色後に検出された。脂質は、それらの移動時間をスタンダードのものと比較することによって同定した（すべてのスタンダードはシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、セントルイス、ミズーリ、アメリカから得たが、ＳＧはマトレヤ（Ｍａｔｒｅｙａ）社、プレザント・ギャップ、ペンシルバニア、アメリカから得た）。
１０．Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５）精製
６６０をインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナの凍結葉を、市販のブレンダーを使用して、１．５体積の５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０４％メタ重亜硫酸ナトリウム中でホモジナイズした。生じた抽出物に１ｍＭ ＰＭＳＦを補足し、１Ｍ酢酸でｐＨ６に調節し、５分間４２℃で加熱した。ｐＨシフトおよび熱処理によって沈殿させた混入物を吸着するために珪藻土（ＤＥ）を熱処理した抽出物に追加し、スラリーをワットマンの濾紙を通して濾過した。生じた清澄化抽出物は残りのＤＥを除去するために室温で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．８／０．２μｍアクロパック（Ａｃｒｏｐａｃｋ）２０フィルターを通し、フェチュイン−アガロース親和性カラム（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ、アメリカ）上にロードした。４００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス（ｐＨ６）中での洗浄工程に続いて、結合タンパク質を１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）により溶出した。溶出されたＶＬＰは、０．０００５％（ｖ／ｖ）の最終濃度までツイーン８０で補足した。ＶＬＰを１００ｋＤａ分子量カットオフアミコンの膜で濃縮し、４℃で３０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．０１％ツイーン８０および０．０１％チメロサールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で再懸濁した。懸濁したＶＬＰを使用前にフィルター滅菌した。
１１．動物試験
マウス
インフルエンザＶＬＰ投与に対する免疫応答に関する試験を、６〜８週間齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社）により行った。７０匹のマウスを、５匹の動物の１４群へとランダムに分けた。８群を筋肉内免疫のために使用し、６群を鼻腔内経路の投与を試験するために使用した。すべての群は、２用量のレジメン（追加接種免疫は第１の免疫の３週間後に行われる）で免疫された。
後肢中の筋肉内投与のために、麻酔していないマウスを、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５）（Ｈ５Ｎ１）ワクチン（０．１、１、５または１２μｇ）、または対照の赤血球凝集素（Ｈ５）抗原のいずれかで免疫した。対照Ｈ５は、株Ａ／インドネシア／５／０５ Ｈ５Ｎ１に基づいており、２９３細胞の培養（イミューン・テクノロジー社（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク、アメリカ）から精製された、産生組換え可溶性赤血球凝集素を含んでいた（特別の指示の無い限り１注射あたり５μｇで使用された）。緩衝液の対照はＰＢＳであった。この抗原はＨＡタンパク質のアミノ酸１８〜５３０からなり、Ｈｉｓタグおよび修飾された切断部位を有する。電子顕微鏡により、この商品がＶＬＰの形態をしていないことを確認した。
アジュバントの効果を測定するために、２群の動物を、５μｇの植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５ワクチン＋１体積の２％アルハイドロゲル（ミョウバン、アキュレイト・ケミカル＆サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストベリー、ニューヨーク、アメリカ）、または５μｇの２９３細胞の培養から精製された組換え赤血球凝集素＋１体積ミョウバンで免疫した。７０匹のマウスを、５匹の動物の１４群へとランダムに分けた。８群を筋肉内免疫のために使用し、６群を鼻腔内経路の投与を試験するために使用した。すべての群は、初回−追加接種のレジメン（追加接種免疫は第１の免疫の３週間後に行われる）に従って免疫された。
後肢中の筋肉内投与のために、麻酔していないマウスを、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰ（０．１、１、５または１２μｇ）、または対照の赤血球凝集素（ＨＡ）抗原（５μｇ）もしくはＰＢＳで免疫した。すべての抗原調製物は、免疫の前に１：１体積比で、１％のアルハイドロゲル（ミョウバン、アキュレイト・ケミカル＆サイエンティフィック社、ウェストベリー、ニューヨーク、アメリカ）と混合した。アジュバントの効果を測定するために、２群の動物を、５μｇの植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５ワクチン、または５μｇのアジュバントのない対照のＨＡ抗原のいずれかで免疫した。
鼻腔内投与のために、自動化誘導チャンバーを使用して、イソフルランの吸入によって、マウスに短時間麻酔した。次いで、マウスを、植物で作製されたＶＬＰワクチン（０．１または１μｇ）、または対照のＨＡ抗原（１μｇ）もしくはＰＢＳで、４μｌ滴／鼻孔の追加によって免疫した。すべての抗原調製物を、免疫の前に１％グルタミン酸キトサン（プロトサン（Ｐｒｏｔｏｓａｎ）、ノバマトリックス／ＦＭＣバイオポリマー（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ／ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）社、ノルウェー）と混合した。次いでマウスは溶液中で呼吸させた。鼻腔内経路の投与によるアジュバントの効果を確認するために、２群の動物を、１μｇの植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５ワクチン、または１μｇの対照のＨＡ抗原で免疫した。
フェレット
５匹のフェレット（オス、１８〜２４週齢、おおよそ１ｋｇの重量）の１０群を使用した。各々の群についての処理を表７中に記載する。使用されるアジュバントは、２％（最終的＝１％）のアルハイドロゲル（ミョウバン）（スーパーフォス・バイオセクター（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）社、デンマーク）であった。ワクチン組成物は、記載されるようにＶＬＰで産生された膜結合Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）であった。ワクチンの対照（陽性対照）は、イミューン・テクノロジー社（ＩＴＣ）による２９３細胞の培養においてアデノウイルスを使用して産生されたインドネシア株からの完全に糖鎖付加された膜結合型組換えＨ５であった。
表７．処理群
*ｉ．ｍ．：筋肉内
フェレットは、試験の間の全般的な健康および外観（体重、直腸温、姿勢、毛皮、動作パターン、呼吸、排泄物）について定期的に評価された。動物を、０、１４および２８日目に大腿四頭筋における筋肉内注射（０．５〜１．０の全体積）によって免疫した。アジュバントを組み込んだプロトコールのために、ワクチン組成物を１：１体積比で免疫の直前にアルハイドロゲルと組み合わせた。血清サンプルを、０日目の免疫する前に、ならびに２１および３５日目に得た。動物を４０〜４５日目で屠殺し（放血／心臓穿刺）、脾臓を採取し、剖検を行った。
抗インフルエンザの抗体力価は、同種または異種の不活性化Ｈ５Ｎ１ウイルスを使用して、ＥＬＩＳＡ分析で定量することができる。
血清サンプル（免疫前、２１日目および３５日目）の赤血球凝集阻害抗体力価を、記載されるように（Aymard et al 1973）の、マイクロタイターＨＡＩによって評価した。簡潔には、血清は受容体破壊酵素で前処理し、非動化し、赤血球（洗浄赤血球−ＲＢＣ）の懸濁物と混合した。ランピレー（Ｌａｍｐｉｒｅ）社からのウマ洗浄ＲＢＣ（１０％）が推奨され、ＲＢＣのソースに依存して分析が変動すること（ウマ依存性）が考慮され、１０匹のウマからの洗浄ＲＢＣを試験して最も感受性のあるバッチを選択した。あるいは、シチメンチョウＲＢＣを使用することができる。抗体力価を、完全に赤血球凝集を阻害する最も高い希釈の逆数として表現した。
交差反応性ＨＡＩ力価：Ａ／インドネシア／５／０５（クレード２．１）のためのワクチンで免疫されたフェレットのＨＡＩ力価を、別のサブクレードまたはクレード（クレード１ベトナム株Ａ／ベトナム／１２０３／２００４およびＡ／ベトナム／１１９４／２００４またはＡ／アンホイ／０１／２００５（サブクレード２．３）もしくはＡ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（サブクレード２．２）などの）からの不活性化Ｈ５Ｎ１インフルエンザ株を使用して測定した。分析はすべて個別のサンプルで行われた。
データ分析：群間の差異が統計的に有意かどうかを立証するために、すべてのデーターで統計分析（分散分析）を行った。
致死性攻撃感染のための実験デザイン（マウス）
１２８匹のマウスを８匹の動物の１６群へとランダムに分け、１群は免疫および攻撃感染されない（陰性対照）ものであった。すべての群は、２用量のレジメン（第２の免疫は第１の免疫の２週間後に行われる）で筋肉内投与を介して免疫された。
後肢中の筋肉内投与のために、麻酔していないマウスを、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰ（１、５または１５μｇ）、または１５μｇの対照のＨＡ抗原もしくはＰＢＳで免疫した。すべての抗原調製物は、免疫の前に１体積の１％アルハイドロゲル（ミョウバン、アキュレイト・ケミカル＆サイエンティフィック社、ウェストベリー、ニューヨーク、アメリカ）と混合した。
免疫期間の間に、マウスは週に１回重量測定し、注射部位の局所反応について観察およびモニターした。
第２の免疫の２２日後に、麻酔したマウスに、インフルエンザＡ型／トルコ／５８２／０６ウイルス（Ｄｒ．Ｂｒｕｎｏ Ｌｉｎａ、リヨン大学、リヨン、フランスによって快く提供された）の４．０９×１０6の５０％細胞培養感染用量（ＣＣＩＤ５０）で、ＢＬ４封じ込め実験室（Ｐ４−ジャン・メリュー−フランス国立衛生医学研究所（Ｊｅａｎ Ｍｅｒｉｅｕｘ−ＩＮＳＥＲＭ）、リヨン、フランス）の中で、鼻腔内（ｉ．ｎ．）攻撃感染を行った。攻撃感染に続いて、マウスは、１４日間毎日病気の臨床症状について観察および体重測定された。深刻な感染病徴および２５％以上の体重減少のあるマウスは麻酔後に安楽死させた。
血液採取、肺および鼻洗浄、ならびに脾臓採取
麻酔しない動物で、外側伏在静脈血液採取を第１の免疫の１４日後および第２の免疫の１４日後に行った。血清は１０分間８０００ｇの遠心分離によって回収した。
第２の免疫の４週間後に、ＣＯ2ガスでマウスを麻酔し、終了と同時に直ちに心臓穿刺を使用して血液を採取した。
最終採血後に、カテーテルを肺に向かって気管へと挿入し、１ｍｌの冷ＰＢＳ−プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液をカテーテルに添付された１ｃｃのシリンジの中へ入れ、肺の中へ注入し、次いで解析のために取り出した。この洗浄手順を２回行った。肺洗浄物を遠心分離して細胞残屑を除去した。鼻洗浄のために、鼻腔領域に向かってカテーテルを挿入し、０．５ｍｌのＰＢＳ−プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液をカテーテルを通して鼻通路の中へ押し出し、次いで回収した。鼻洗浄物を遠心分離し、細胞残屑を除去した。アジュバントを添加した５μｇの植物で作製されたワクチンまたはアジュバントを添加した５μｇの組換えＨ５抗原で筋肉内で免疫されたマウスに加えて、アジュバントを添加した１μｇの植物で作製されたワクチンまたはアジュバントを添加した１μｇの組換えＨ５抗原で鼻腔内免疫されたマウスで、脾臓採取を行った。採取された脾臓をゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ中に置き、１０ｍｌのシリンジからプランジャーにより５０ｍｌのコニカルチューブ中につぶした。つぶした脾臓を２回リンスし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＡＣＫ溶解緩衝液中に室温で５分間再懸濁した。脾細胞をＰＢＳ−ゲンタマイシン中で洗浄し、５％ＲＰＭＩ中に再懸濁し、カウントした。脾細胞を増殖分析のために使用した。
抗体力価
血清の抗インフルエンザの抗体力価を、第１の免疫の１４日後に加えて、第２の免疫の１４および２８日後に測定した。力価は、コーティング抗原として非活性化ウイルスＡ／インドネシア／５／０５を使用する酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。終了点力価は、陰性対照サンプルのＯＤ値の少なくとも０．１以上のＯＤ値に達した最高希釈の逆数値として表現した。
抗体クラス決定（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）のために、力価は以前に記載されるようにＥＬＩＳＡによって評価された。
赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価
血清の赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価は、以前に記載されるように第２の免疫の１４および２８日後に測定された（WHO 2002; Kendal 1982）。株Ａ／インドネシア／５／０５またはＡ／ベトナム／１２０３／２００４からの非活性化ウイルス調製物を使用して、ＨＩ活性についてマウス血清サンプルを試験した。血清は、コレラ菌から調製された受容体破壊酵素ＩＩ（ＲＤＥ ＩＩ）（デンカ生研社（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．）、東京、日本）で前処理した（Kendal 1982）。ＨＩ分析は０．５％シチメンチョウ赤血球で行った。ＨＩ抗体力価は、凝集の完全阻害を引き起こす最高希釈の逆数として定義された。
実施例１：Ｎ．ベンサミアナ植物におけるアグロインフィルトレーションによるインフルエンザウイルスＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）赤血球凝集素の一過性発現
一過性発現システムによりインフルエンザ赤血球凝集素が産生される能力は、株Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）からのＨ５亜型の発現を介して決定した。図１１中に提示されるように、赤血球凝集素遺伝子コード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ５４１３９４）を、その天然のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインと共に、プラストシアニン発現カセット（アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列）中で最初に組み立て、組み立てたカセット（６６０）をｐＣＡＭＢＩＡのバイナリープラスミドに挿入した。次いでこのプラスミドをアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）の中へトランスフェクションし、組換え株ＡＧＬ１／６６０を生成し、それを一過性発現のために使用した。
Ｎ．ベンサミアナ植物をＡＧＬ１／６６０によりインフィルトレーションし、葉は６日のインキュベーション期間後に収穫した。アグロインフィルトレーションされた葉中にＨ５が蓄積したかどうかを決定するために、最初にタンパク質をインフィルトレーションした葉組織から抽出し、抗Ｈ５（ベトナム）ポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロッティングによって分析した。およそ７２ｋＤａのユニークなバンドが抽出物中で検出され（図１２）、インフルエンザ赤血球凝集素の未切断のＨＡ０形態のサイズに対応する。陽性対照（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４；プロテイン・サイエンス社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．）、メリデン、コネチカット、アメリカ）として使用した市販のＨ５は、約４８ｋＤａおよび約２８ｋＤａの２つのバンドとして検出され、それぞれＨＡ１断片およびＨＡ２断片の分子量に対応する。このことは、インフィルトレーションした葉中でＨ５の発現が未切断の翻訳産物の蓄積をもたらすことを実証した。
活性ＨＡ三量体の形成は、ＡＧＬ１／６６０で形質転換した葉からの粗タンパク質抽出物がシチメンチョウ赤血球を凝集する能力によって実証された（データー不掲載）。
実施例２：サイズ排除クロマトグラフィーを使用する植物抽出物中の赤血球凝集素含有構造の特性評価
植物で産生されたインフルエンザ赤血球凝集素の高分子量構造への集合を、ゲル濾過によって評価した。ＡＧＬ１／６６０をインフィルトレーションした植物（１．５ｍＬ）からの粗タンパク質抽出物を、セファクリル（商標）Ｓ−５００ ＨＲカラム（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス社（ピスカタウェイ、ニュージャージー、アメリカ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分画した。溶出画分は、抗ＨＡの抗体による免疫検出を使用して、全タンパク質含有量およびＨＡ存在量について分析した（図１３Ａ）。図１３Ａ中で示されるように、ブルーデキストラン（２ＭＤａ）溶出は画分１０中で早くにピークに達したが、宿主タンパク質のバルクはカラム中で保持され、画分１４乃至２２との間で溶出された。２００μＬの各々のＳＥＣ溶出画分からのタンパク質をアセトン沈殿によって濃縮し（５倍）、ウエスタンブロッティングによって分析したときに（図１５Ａ、Ｈ５）、赤血球凝集素（Ｈ５）は主として画分９乃至１４中で見出された（図１３Ｂ）。理論に束縛されるものではないが、これは、ＨＡタンパク質が大きな超構造へと集合したか、または高分子量構造に付着していることのいずれかを示唆する。
第２の発現カセットを、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：３３；図１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２８９９２９）からのＨ１核酸配列により組み立てて、コンストラクト５４０を産生した（図１１）。シグナルペプチドが植物タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子から生じ、Ｈ１の膜貫通ドメインがＧＣＮ４ロイシンジッパーのｐＩＩバリアント（三量体へと自己集合することが示されるペプチド（Harbury et al., 1993)）によって置換されたＨ１の可溶性三量体形態を産生するように、キメラ遺伝子コンストラクトはデザインされた。（カセット５４４、図１１）。この可溶性三量体形態は、膜貫通ドメインを欠損するが赤血球凝集が可能であった（データー不掲載）。
ＡＧＬ１／５４０またはＡＧＬ１／５４４によりインフィルトレーションした植物からのタンパク質抽出物をＳＥＣによって分画し、Ｈ１の溶出された画分の存在を、抗インフルエンザＡ型の抗体（フィッツジェラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）社、コンコード、マサチューセッツ、アメリカ）によるウエスタンブロッティングによって検討した。ＡＧＬ１／５４０をインフィルトレーションした葉において、Ｈ１は主として非常に高分子構造として蓄積され、ピークはより小さなサイズ構造へ移動した（Ｈ１；図１３Ｃ）。ＡＧＬ１／５４４をインフィルトレーションした葉において、Ｈ１の可溶性形態は、宿主タンパク質溶出プロフィールに匹敵するゲル濾過からの溶出パターンによって実証されるように、単離された三量体として蓄積された（可溶性Ｈ１；図１３Ｄ）。比較では、画分１２乃至１６で溶出された（図１３Ｅ）赤血球凝集素の５〜６の三量体のミセルであるＨ１ロゼット（プロテイン・サイエンス社、メリデン、コネチカット、アメリカ）は、Ｈ１の可溶性形態（図１３Ｄ）よりも早く、天然のＨ１（図１３Ｃ）よりも遅く溶出される。
赤血球凝集素の構造への集合に対するＭ１共発現の影響を評価するために、Ｍ１発現カセットは、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）Ｍ１のコード配列に対応する核酸（配列番号：３５；図１８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０１６）を使用して組み立てた。コンストラクトを７５０と命名し、図１１中で提示する。Ｍ１およびＨ１の共発現のために、ＡＧＬ１／５４０およびＡＧＬ１／７５０の懸濁物をインフィルトレーションの前に等容量で混合した。複数のアグロバクテリウム懸濁物の共インフィルトレーションは、複数の導入遺伝子の共発現を可能にする。ＳＥＣ溶出画分のウエスタンブロット解析から、Ｍ１の共発現はＨ１構造の溶出プロフィールを修飾しないが、アグロインフィルトレーションされた葉中のＨ１蓄積の減少をもたらすことが示される（図を１３Ｆ参照）。
実施例３：ショ糖勾配における遠心分離によるＨ５構造の単離および電子顕微鏡下の観察 電子顕微鏡（ＥＭ）下の赤血球凝集素構造の観察は、葉タンパク質の粗抽出物のＳＥＣから得られたものよりも高い濃度および純度レベルを必要とした。Ｈ５構造のＥＭ観察を可能にするために、葉タンパク質の粗抽出物は、ＰＥＧ沈殿（２０％ＰＥＧ）によって最初に濃縮し、続いて抽出緩衝液の１／１０体積中に再懸濁した。濃縮したタンパク質抽出物をＳ−５００ ＨＲゲル濾過によって分画し、溶出画分９、１０および１１（カラムのボイド容量に対応する）をプールし、２０〜６０％のショ糖密度勾配で超遠心によって宿主タンパク質からさらに単離した。ショ糖勾配をトップから開始して分画し、画分は透析し、解析の前に１００ＮＭＷＬ遠心濾過ユニットで濃縮した。ウエスタンブロットおよび赤血球凝集の結果で示されるように（図１４Ａ）、Ｈ５は〜６０％ショ糖を含有する画分１６乃至１９中に主として蓄積したが、大部分の宿主タンパク質は画分１３でピークに達した。画分１７、１８および１９をプールし、ネガティブ染色し、ＥＭ下で観察した。サンプルの検査から、インフルエンザＶＬＰの形態的特徴に一致した、８０乃至３００ｎｍのサイズにわたる、スパイクのある球状構造の存在が明らかに実証された（図１４Ｂ）。
実施例４：植物バイオマスからのインフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製
可溶性タンパク質の豊富な含有量に加えて、植物葉抽出物は、可溶性糖質および核酸および脂質の複雑な混合物を含有する。粗抽出物をｐＨシフトおよび熱処理によって清澄化し、続いて珪藻土で濾過した（清澄化方法の詳細な記載については材料および方法のセクションを参照）。図１５Ａ（レーン１−４）は、清澄化の様々な工程でタンパク質含有量を比較する、クマシーブルー染色ゲルを提示する。粗抽出物（レーン１）と清澄化された抽出物（レーン４）中のタンパク質含有量の比較から、全体的なタンパク質含有量を低下させ、葉の粗抽出物中で５０ｋＤａの目視可能な主要な混入物の大部分を除去する、清澄化工程の能力が示される。５０ｋＤａバンドはＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットに相当し、全葉タンパク質の最大３０％を占める。
インフルエンザＨ５ ＶＬＰをフェチュインカラムの親和性クロマトグラフィーによって清澄化した抽出物から精製した。フロースルー（図１５Ａ、レーン６）および溶出されたＶＬＰ（図１５Ａ、レーン７）とロード画分（図１５Ａ、レーン５）の比較から、植物中のインフルエンザＨ５ ＶＬＰのためのフェチュイン親和性カラムの特異性により抽出物が清澄化されたことが実証される。
クマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリーによって決定されるように、精製手順はＨ５の７５％以上の純度をもたらした（図１５Ａ、レーン７）。精製された産物の構造品質を評価するために、精製Ｈ５を１００ＮＭＷＬ（公称分子量限界）遠心濾過ユニットで濃縮し、ネガティブ染色後にＥＭ下で調査した。図１５Ｂは、ＶＬＰが非常に豊富に存在することを示す代表的なセクターを示す。より接近した調査からＶＬＰ上でのスパイクの存在が確認された（図１５Ｃ）。
図１５Ｄ中で示されるように、Ｈ５ ＶＬＰは、クマシーブルー染色したＨ５赤血球凝集素の密度およびＢＣＡ方法による全タンパク質含有量定量に基づいて、フェチュインカラムの親和性クロマトグラフィーによる清澄化された葉抽出物から、およそ８９％の純度まで精製された。
ＨＡ ＶＬＰの生物活性は、シチメンチョウ赤血球を凝集する能力によって確認した（データー不掲載）。
図１５Ｄから、抗Ｈ５のポリクローナル血清（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）によるウエスタンブロッティングおよび免疫検出によって可視化された精製ＶＬＰの同一性も確認される。およそ７２ｋＤａのユニークなバンドが検出され、インフルエンザ赤血球凝集素の未切断のＨＡ０形態のサイズに対応する。図１５ｃは、構造を覆う赤血球凝集素スパイクを持つワクチンのＶＬＰ構造を示す。
ＶＬＰを０．２２μｍフィルターを通して濾過することによってマウスの免疫のために製剤化し、エンドトキシン含有量は、エンドトキシンＬＡＬ（カブトガニ血球抽出成分）検出キット（ロンザ社、ウォーカーズビル、ＭＳ、アメリカ）を使用して測定した。濾過ワクチンは１０５．８±１１．６％ＥＵ／ｍｌ（エンドトキシンユニット／ｍｌ）を含んでいた。
実施例５：植物中のインフルエンザＶＬＰの局在
ＶＬＰを局在しそれらの原形質膜起原を確認するために、Ｈ５産生植物の葉の薄切片を固定し、ポジティブ染色後にＴＥＭ下で調査した。葉細胞の観察から、原形質膜の陥入によって形成された細胞外空洞中のＶＬＰの存在が示された（図１９）。観察されたＶＬＰの形状および位置から、細胞壁上での原形質膜の付着にもかかわらず、植物細胞がそれらの原形質膜に由来するインフルエンザＶＬＰを産生し、アポプラスト空間中にそれらを蓄積するのに必要な可塑性を有することが実証された。
実施例６：原形質膜脂質解析
植物インフルエンザＶＬＰの組成物および起原のさらなる確認は、脂質含量の分析から得られた。脂質を精製ＶＬＰから抽出し、それらの組成物を高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）によって高度に精製されたタバコ原形質膜のものと比較した。ＶＬＰおよび対照の原形質膜からの極性脂質および中性脂質の移動パターンは類似していた。精製ＶＬＰは、原形質膜中で見出される主要なリン脂質（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン）およびスフィンゴ脂質（グルコシルセラミド）を含有し（図２７Ａ）、両者は独特の中性脂質として遊離ステロールを含有していた（図２７Ｂ）。しかしながら、精製ＶＬＰ抽出物中の原形質膜タンパク質マーカー（ＡＴＰアーゼ）の免疫検出から、ＶＬＰ脂質二重層は植物原形質膜と関連する主要なタンパク質の１つを含有しないことが示され、植物細胞からのＶＬＰ出芽のプロセスの間に宿主タンパク質が膜から除外されたことを示唆する（図２７Ｃ）。
実施例７：Ｈ５ ＶＬＰの免疫原性および投与経路の効果
マウスに筋肉内注射または鼻腔内（吸入）によって植物で作製されたＨ５ ＶＬＰを投与した。０．１乃至１２μｇのＶＬＰを記載した方法に従ってアジュバントとしてミョウバンと共にマウスの中へ筋肉内で注入した。ピーク抗体力価は、５μｇの組換え可溶性赤血球凝集素（Ｈ５）のものに類似する大きさで、最低の抗原量で観察された（図２０Ａ）。
０．１乃至１μｇの植物で作製されたＨ５ ＶＬＰをキトサンアジュバントと共に鼻腔内投与し、ミョウバンアジュバントと組換え可溶性Ｈ５よりも高い抗体応答が提供された（図２０Ｂ）。
両方の投与経路について、および様々な抗原量にわたって、試験されたマウスのすべてにおいてセロコンバージョンが観察された。組換えＨ５可溶性抗原のＨＩ力価は、低いか（＜１／４０）、または無視できる（アジュバントを添加していない組換えＨ５については１＜１／１０）ものであった。
実施例８：赤血球凝集阻害抗体力価（ＨＡＩ）Ｈ５ ＶＬＰ
図２１Ａ、Ｂは、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰまたは組換え可溶性Ｈ５による「追加接種」の１４日後の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）抗体応答を示す。最低用量の抗原（０．１μｇ）を筋肉内で投与した場合、組換え可溶性Ｈ５の投与（５μｇ）の１０倍高い優れたＨＡＩ応答を産生した。Ｈ５ ＶＬＰの用量が増加すると、最低用量を上回ってＨＡＩはわずかに増加した。
鼻腔内投与後のＨＡＩ応答は、１μｇの組換え可溶性Ｈ５を投与されたもの（陰性対照に類似する）と比較して、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰ（１．０または０．１μｇ）を投与したマウスにおいて有意に増加した。Ｈ５ ＶＬＰ（０．１乃至１２μｇ）の筋肉内注射によって免疫したすべてのマウスは、対照Ｈ５抗原により免疫したマウスよりも高いＨＡＩ力価を有した（図２１Ａ）。５μｇの同じ用量については、ＶＬＰは対照Ｈ５抗原の対応する用量よりも２０倍高いＨＡＩ力価を誘導した。鼻腔内経路を介して送達された場合も、ＶＬＰは対照ＨＡ抗原よりも有意に高いＨＡＩ力価を誘導した（図２１ｂ）。Ｈ５ ＶＬＰの規定の用量については、ＨＡＩ力価のレベルは筋肉内免疫したマウスよりも鼻腔内免疫したマウスにおいて低かった。ｉ．ｍ．投与した場合１μｇのＶＬＰは２１０の平均ＨＡＩ力価を誘導したが、ｉ．ｎ．投与した場合同じ用量は３４の平均ＨＡＩ力価を誘導した。
筋肉内投与した場合、すべての用量のＶＬＰは、同種の非活性化全ウイルスを結合可能な抗体を高レベルで誘導した（図２０ａおよび２４）。両方の抗原調製物が同種株に対する高結合抗体力価を誘導するので、有意な差異は、植物で作製されたＶＬＰワクチンと対照Ｈ５抗原との間で見出されなかった（追加接種１４日後の１２μｇのＶＬＰ群以外は）。しかしながら、鼻腔内投与した場合、ＶＬＰは対照のＨ５抗原よりも高い結合抗体力価を誘導した（図２０ｂ）。キトサンと混合された場合、１マイクログラムのＶＬＰによる免疫は５５００の逆数平均抗体力価(reciprocal mean Ab titer)を誘導し、１μｇの対照ＨＡ抗原により免疫されたマウスにおいて見出されるレベル（９２０の逆数平均抗体力価）よりも８．６倍高い。
次いで、植物に由来するインフルエンザＶＬＰの免疫原性をマウスにおける用量を変化させる試験によって調査した。ミョウバン（１：１比）中で製剤化されインフルエンザＡ型／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）からのＨＡを含有する０．１μｇ乃至１２μｇのＶＬＰにより、５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を３週間の間隔で２回筋肉内で免疫した。非活性化全ウイルス抗原（Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１））を使用する赤血球凝集阻害力価（ＨＩまたはＨＡＩ）を、第２の免疫の１４日後に採取した血清で測定した。０．１μｇと低い用量のＶＬＰによる免疫は、ウイルスの赤血球凝集を高希釈で阻害する抗体の産生を誘導した（図２１Ａ）。平行して行われた非ＶＬＰのミョウバンアジュバントを添加した５μｇの対照のＨ５抗原（同様にＡ／インドネシア／５／０５から）によるマウスの免疫は、最低のＶＬＰ用量により達成されたものより２〜３ｌｏｇ少ないＨＩ応答を誘導した。
両方の投与経路について、および様々な抗原量にわたって、ＨＡＩ応答はＶＬＰを投与されたマウスにおいて勝っている。
実施例９：Ｈ５ ＶＬＰの免疫原性に対するアジュバントの効果
植物で作製されたＨ５ ＶＬＰは原形質膜起原である（図１９、実施例５）。理論に束縛されるものではないが、エンベロープウイルスまたはエンベロープウイルスのＶＬＰは、一般的にはそれらが出芽する膜からそれらのエンベロープを取得する。植物原形質膜は、動物細胞において、あるとしてもめったに見出されない植物性ステロール相補物を有し、これらのステロールのいくつかのものは免疫刺激効果を示すことが実証されている。
植物で作製されたＨ５ ＶＬＰを、アジュバントの存在または非存在下においてマウスに筋肉内（図２２Ａ）または鼻腔内（図２２Ｂ）で投与し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体応答）を決定した。投与のいずれのシステムでも、追加アジュバントの存在または非存在下において（これらの実施例においてミョウバンまたはキトサン）、ＶＬＰは組換え可溶性Ｈ５よりも有意に高いＨＡＩ赤血球凝集素阻害を実証した。追加アジュバント（すなわちミョウバンまたはキトサン）の非存在においてでさえ、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰは有意なＨＡＩを実証し、抗原の投与に対する全身性免疫応答を示す。
ミョウバンは、ＶＬＰの筋肉内投与については５倍（図２２ａ）、対照Ｈ５抗原については３．７倍でＨＡＩ力価の平均レベルを増した。筋肉内注射で投与した場合、５μｇのＶＬＰは対照のＨ５抗原の対応する用量よりも１２倍高い平均ＨＡＩ力価を誘導した。キトサンは、対照Ｈ５抗原の平均ＨＡＩレベルを高めなかった（図２２ｂ）が、１μｇのＶＬＰをｉ．ｎ．投与して免疫したマウスの平均ＨＡＩレベルを５倍増加させた。
実施例１０：抗体アイソタイプ
追加アジュバントとしてミョウバンの存在または非存在下において、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰまたは組換え可溶性Ｈ５を投与したマウスは、様々な免疫グロブリンアイソタイプを示す（図２３Ａ）。
追加アジュバントの存在下において、ＶＬＰおよび組換えＨ５の抗体アイソタイププロフィールは、ＩｇＧ１が主要なアイソタイプであることで類似している。ＶＬＰまたは組換えＨ５を追加アジュバントなしに投与する場合、ＩｇＧ１の応答は減少するが、ＶＬＰに対する主要なアイソタイプ応答のままであり、追加アジュバントの存在下と類似するＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ＢおよびＩｇＧ３の力価を維持する。組換えＨ５を追加アジュバントなしに投与する場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ力価は著しく減少する（図２３Ａ）。
これらのデーターは、したがって、植物で作製されたＶＬＰは、宿主中で抗体応答を誘発するために追加アジュバントを必要としないことを実証する。
植物で作製されたＶＬＰまたは可溶性組換えＨＡを追加の抗原の存在下において筋肉内投与したマウスにおける、不活性化したインフルエンザの全ウイルス株（Ａ／インドネシア／５／０５；Ａ／ベトナム／１２０３／０４）Ｉに対する抗体力価を図２３Ｂ中に示す。１μｇもしくは５μｇのＶＬＰまたは５μｇの可溶性ＨＡを投与したマウスにおけるこれらのインフルエンザ株に対する抗体力価では、有意な差異は観察されない。
実施例１１：Ｈ５ ＶＬＰワクチンによって誘導された血清抗体の交差反応性
Ｈ５ ＶＬＰによって誘導された血清抗体の交差反応性を、異なる株の不活性化したインフルエンザの全ウイルスに対して評価した。５μｇの対照のＨＡ抗原に加えて、すべてのＶＬＰ用量（０．１乃至１２μｇ）は、クレード１株（Ａ／ベトナム／１１９４／０４）、クレード２．１の同種株Ａ／インドネシア／５／０５、およびクレード２．２株Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５に対する高い結合する抗体力価を誘導した（図２５Ａ）。
しかしながら、植物で作製されたＶＬＰのみが、Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５株に対するＨＡＩ力価を誘導した（図２５ｂ）。Ａ／インドネシア／５／０５についてはＨＡＩ力価はＶＬＰで高かった。
実施例１２：植物で作製されたＨ５ ＶＬＰによる免疫によって付与された交差防御
先に記載されるようにＡ／インドネシア／５／０５ Ｈ５ ＶＬＰの２用量のレジメンを投与したマウスを、続いて、インフルエンザＡ型／トルコ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１）（「トルコＨ５Ｎ１」）感染性ウイルスで鼻腔内攻撃感染し、観察した。投与した用量は、１匹の動物あたり、１０ＬＤ50（４．０９×１０5ＣＣＩＤ50）であった。
攻撃感染の７日後までに、ＰＢＳワクチン対照を投与したマウスの３７．５の％のみが、トルコＨ５Ｎ１への暴露に生存していた（図２６Ａ）。対照抗原（ＨＡ）または１、５または１５μｇのインドネシアＨ５ ＶＬＰを投与した動物の１００％は、攻撃感染の１７日後（実験終了時）まで生存した。
マウスの体重も実験の間にモニターし、生存マウスの平均重量をプロットした（図２６Ｂ）。１、５または１５μｇのインドネシアＨ５ ＶＬＰを投与したマウスは、攻撃感染の前の実験経過の間に大きな重量減少はなく、５μｇのＶＬＰを投与した特定のマウスでは重量が有意に増したようであった。陰性対照のマウス（トルコＨ５Ｎ１の攻撃感染はなし）は有意な体重の増加または減少はなかった。陽性対照マウス（ＶＬＰを投与しなかったがトルコＨ５Ｎ１により攻撃感染した）は、実験の経過の間に体重の有意な減少を示し、これらのマウスのうちの３匹は死亡した。体重はコホート中のすべてのマウスの平均であるので、「最も病気の」マウス（死亡した３匹）の除去は重量の全体的な明らかな増加をもたらしうるが、陽性対照コホートの平均体重が、それでもなお陰性コホートまたはＶＬＰ処理コホートのものの有意に下であることに注目せよ。
これらのデータは、したがって、Ｈ５赤血球凝集素ウイルスタンパク質を含む植物で作製されたインフルエンザＶＬＰが病原性インフルエンザ株に対する特異的免疫応答を誘導し、ウイルス様粒子が植物原形質膜から出芽することを実証する。
これらのデータはしたがって、植物がインフルエンザウイルス様粒子を産生することができることを実証し、ウイルス様粒子は植物原形質膜から出芽できることも初めて実証する。
さらに、標的ＨＡの配列が得られたわずか１６日後、現行の一過性発現テクノロジーを使用して第１の抗原ロットが産生された。Ｈ５ ＶＬＰの現行の収率下で、および１つの被験体あたり例示的な用量５μｇで、インフィルトレーションした葉の１ｋｇにつき〜２０，０００ワクチン用量を産生することができる。プラットフォームの単純性、急増能力および強力な免疫原性のこのユニークな組み合わせは、他の実施形態の中でも、パンデミックの情況における新方式の応答を提供する。
実施例１３：サイズ排除クロマトグラフィーを使用する植物抽出物中の赤血球凝集素を含有する（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６およびＨ９）構造の特性評価
植物で産生された異なる亜型のインフルエンザ赤血球凝集素の高分子量構造への集合を、ゲル濾過によって評価した。ＡＧＬ１／６６０、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７８３、ＡＧＬ１／７８０、ＡＧＬ１／７８５、およびＡＧＬ１／７９０をインフィルトレーションした植物（１．５ ｍＬ）からの粗タンパク質抽出物または濃縮タンパク質抽出物を、セファクリル（商標）Ｓ−５００ ＨＲカラム（ＧＥヘルスケア・バイオ−サイエンス社（ピスカタウェイ、ニュージャージー、アメリカ）のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分画した。図４６中で示されるように、ブルーデキストラン（２ＭＤａ）溶出は、画分１０中で早くにピークに達した。２００μＬの各々のＳＥＣ溶出画分からのタンパク質をアセトン沈殿によって濃縮し（５倍）、ウエスタンブロッティングによって分析した場合（図４６）、赤血球凝集素は画分７乃至１４中で主として見出され、ＶＬＰの中へのＨＡの取り込みを示す。理論に束縛されるものではないが、これは、ＨＡタンパク質が大きな超構造へと集合したか、または産生された亜型に関係なく高分子量構造に付着していることのいずれかを示唆する。図４６では、株Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からのＨ１および株Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３を、ＰＤＩシグナルペプチド含有するカセットを使用して産生した。得られた結果は、アルファルファＰＤＩのシグナルペプチドによる天然のシグナルペプチドの置換が、ＨＡが粒子へと集合する能力に影響しないことを示す。
実施例１４：野生型ヌクレオチド配列を使用する季節性インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＮ．ベンサミアナ植物におけるアグロインフィルトレーションによる一過性発現
一過性発現システムが季節性インフルエンザ赤血球凝集素を産生する能力は、株Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド番号７７４）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド番号５４０）およびＡ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド番号７７５）からのＨ１亜型、株Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（プラスミド番号７７６）およびＡ／ウィスコンシン／６７／２００５（プラスミド番号７７７）からのＨ３亜型、ならびに株Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４（ビクトリア系列）（プラスミド番号７７８）およびＢ／フロリダ／４／２００６（ヤマガタ系列）（プラスミド番号７７９）からのＢ型の発現を介して決定した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット（アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列）中で最初に組み立て、組み立てたカセットをｐＣＡＭＢＩＡのバイナリープラスミドに挿入した。次いで、プラスミドはアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）へとトランスフェクションし、アグロバクテリウム株のＡＧＬ１／７７４、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７７５、ＡＧＬ１／７７６、ＡＧＬ１／７７７、ＡＧＬ１／７７８およびＡＧＬ１／７７９をそれぞれ産生した。
Ｎ．ベンサミアナ植物を、ＡＧＬ１／７７４、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７７５、ＡＧＬ１／７７６、ＡＧＬ１／７７７、ＡＧＬ１／７７８およびＡＧＬ１／７７９によりインフィルトレーションし、葉を６日のインキュベーション期間後に収穫した。Ｈ１がアグロインフィルトレーションした葉中に蓄積したかどうかを決定するために、最初にタンパク質をインフィルトレーションした葉組織から抽出し、抗ＨＡの抗体を使用して、ウエスタンブロッティングによって分析した（各々のＨＡ亜型の検出のために使用した抗体および条件については表６を参照）。Ｈ１株からのＨＡについては、およそ７２ｋＤａのユニークなバンドが抽出物中に検出され（図４７）、インフルエンザ赤血球凝集素の未切断のＨＡ０形態のサイズに対応した。これは、インフィルトレーションした葉中での赤血球凝集素の異なる各年の流行株の発現が、未切断の翻訳産物の蓄積をもたらすことを実証した。これらの発現および免疫検出のストラテジーを使用して、Ｈ３亜型またはＢ型からのインフルエンザＨＡの発現は、粗タンパク質抽出物中に検出されなかった（図４７）。
実施例１５：野生型ヌクレオチド配列を使用する可能性のあるパンデミックインフルエンザウイルス赤血球凝集素のＮ．ベンサミアナ植物におけるアグロインフィルトレーションによる一過性発現
一過性発現システムが可能性のあるインフルエンザ赤血球凝集素を産生する能力は、株Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド番号７８１）、Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド番号６６０）およびＡ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド番号７８２）からのＨ５亜型、株Ａ／シンガポール／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）（プラスミド番号７８０）からのＨ２亜型、株Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／１９９７（Ｈ６Ｎ１）（プラスミド番号７８３）からのＨ６、株Ａ／ウマ／プラハ、／１９５６（Ｈ７Ｎ７）（プラスミド番号７８４）のＨ７ならびに最後に株Ａ／香港／１０７３／１９９９（Ｈ９Ｎ２）（プラスミド番号７８５）からのＨ９の発現を介して決定した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット（アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列）中で最初に組み立て、組み立てたカセットをｐＣＡＭＢＩＡのバイナリープラスミドに挿入した。次いでプラスミドをアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）へとトランスフェクションし、アグロバクテリウム株のＡＧＬ１／７８１、ＡＧＬ１／６６０、ＡＧＬ１／７８２、ＡＧＬ１／７８０、ＡＧＬ１／７８３、ＡＧＬ１／７８４およびＡＧＬ１／７８５を産生した。
Ｎ．ベンサミアナ植物を、ＡＧＬ１／７８１、ＡＧＬ１／６６０、ＡＧＬ１／７８２、ＡＧＬ１／７８０、ＡＧＬ１／７８４およびＡＧＬ１／７８５によりインフィルトレーションし、葉を６日のインキュベーション期間後に収穫した。Ｈ５がアグロインフィルトレーションした葉中に蓄積したかどうかを決定するために、最初にタンパク質をインフィルトレーションした葉組織から抽出し、適切な抗ＨＡ抗体を使用して、ウエスタンブロッティングによって分析した（各々のＨＡ亜型の検出のために使用した抗体および条件については表６を参照）。およそ７２ｋＤａのユニークなバンドが、Ｈ５およびＨ２の発現コンストラクトにより形質転換した植物の抽出物中に検出され（図４８ａおよびｂ）、インフルエンザ赤血球凝集素の未切断のＨＡ０形態のサイズに対応した。これは、インフィルトレーションした葉中での赤血球凝集素の異なる可能性のあるパンデミック株の発現が、未切断の翻訳産物の蓄積をもたらすことを実証した。これらの発現および免疫検出のストラテジーを使用して、Ｈ７およびＨ９からのインフルエンザＨＡの発現は、粗タンパク質抽出物中に検出されなかった（図４８ｂ）。
実施例１６：アグロインフィルトレーションによるＨ５のＮ．タバカム植物における一過性発現
一過性発現システムがニコチアナ・タバカムの葉中のインフルエンザ赤血球凝集素を産生する能力は、株Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド番号６６０）からのＨ５亜型の発現を介して分析された。赤血球凝集素遺伝子コード配列は、プラストシアニン発現カセット（アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列）中で最初に組み立て、組み立てたカセットをｐＣＡＭＢＩＡのバイナリープラスミドに挿入した。次いで、プラスミドをアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）へとトランスフェクションし、株ＡＧＬ１／６６０を産生した。
Ｎ．タバカム植物をＡＧＬ１／６６０によりインフィルトレーションし、葉を６日のインキュベーション期間後に収穫した。Ｈ５がアグロインフィルトレーションした葉中に蓄積したかどうか決定するために、最初にタンパク質をインフィルトレーションした葉から抽出し、抗Ｈ５の抗体を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。およそ７２ｋＤａのユニークなバンドが抽出物中に検出され（図４９）、インフルエンザ赤血球凝集素の未切断のＨＡ０形態のサイズに対応した。これは、インフィルトレーションしたＮ．タバカム葉中の赤血球凝集素の発現が、未切断のＨＡ０前駆体の蓄積をもたらすことを実証した。
実施例１７：フェレットにおけるＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）からの植物で作製されたＨ５Ｎ１ ＶＬＰワクチンの免疫原性
植物に由来するＶＬＰの免疫原性を評価するためにフェレットにおける用量増量試験は行った。３用量（１、５および１５μｇ）のＨ５ ＶＬＰワクチンによって誘導された血清抗体のインビトロ交差反応性を、ワクチンの第１の投薬１４日後（図５０Ａ）および第２の投薬１４日後（図５０Ｂ）に採取した血清を使用して、３つの他のＨ５Ｎ１株（Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（クレード２．２）、Ａ／ベトナム／１１９４／０４（クレード１）およびＡ／アンホイ／５／０５（すべて非活性化全ウイルス））の赤血球凝集阻害によって評価した。３つの用量濃度すべてについて、交差反応性は観察される。
実施例１８：ＣＨＭＰ基準に従う免疫原性結果の解析。
ＥＭＥＡのヒト用医薬品委員会（ＣＨＭＰ）（ｈttp://www.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.html）は、ワクチン有効性についての３つの基準（第２の投薬後に適用される）を設定する。１−セロコンバージョン数またはＨＩ力価中の有意な増加（４倍）があったものが４０％以上；２−少なくとも２．５の平均幾何学的増加；３−１／４０のＨＩ力価を達成する被験体の比率が少なくとも７０％である。フェレットモデルにおけるこれらの基準の解析は表８〜１１中で示される。（＊）ＣＨＭＰ基準を満たすかまたは越えることを表す。認可のためのＣＨＭＰ基準に関連する交差免疫原性の解析の要約は、表１２中に示される。
動物は、体重、温度および全体的な状態について毎日評価した。病気または不調の徴候は試験の間に記録されなかった。体重および温度は試験の間で正常範囲内であった。ワクチンは安全で、動物によって耐容された。
表８：同種株（Ａ／インドネシア／５／０５）についてのデータ
表９：異種株（Ａ／ベトナム／１１９４／０４）についてのデータ
表１０：異種株（Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５）についてのデータ
表１１：異種株（Ａ／アンホイ／５／０５）についてのデータ
表１２：認可のためのＣＨＭＰ基準に関連する交差免疫原性の解析の要約。
実施例１９：赤血球凝集素ヌクレオチド配列の選択
ＨＡのヌクレオチド配列は、インフルエンザ配列データベース（URL: flu.lanl.govを参照）、またはＮＣＢＩインフルエンザウイルスリソース（Bao et al., 2008. J. Virology 82(2): 596-601；URL: ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.htmlを参照）から検索された。ＨＡ核酸配列のいくつかについて、複数のエントリーがデータベース中にリストされる（表１３）。いくつかの変動は主として培養系に関連し（起原−ＭＤＣＫ、卵、未知のウイルスＲＮＡ／臨床単離物）、例えば、Ｂ型インフルエンザウイルスが卵の尿膜腔液中で発現される場合、ＨＡの位置１９４（成熟タンパク質の番号付け）での糖鎖付加部位は存在しない（Chen et al., 2008も参照）。いくつかの配列について、ドメインは欠損してもよい（例えば不完全なクローン、配列決定の際の人工物など）。インフルエンザ赤血球凝集素のドメインおよびサブドメインは、記載において一般的に論じられる。第１の配列のドメインまたはサブドメインは第２の既存の配列からのドメインと組み合わせることができ、例えば第１の株の配列のシグナルペプチドは、完全なコード配列を提供するために第２の株からの赤血球凝集素コード配列とバランスをとって組み合わせることができる。
表１３：選択されたＨＡコード配列についてのインフルエンザ亜型の変動








Ｙ、Ｎ−それぞれ、あり、なし
ＳＰ−シグナルペプチド配列の存在Ｙ／Ｎ
ＨＡ１−完全なＨＡ１ドメインＹ／Ｎ
ＨＡ２−完全なＨＡ２ドメインＹ／Ｎ
ＤＴｍ−完全な膜貫通ドメインＹ／Ｎ
株：Ａ／ソロモン諸島／３／２００６からのＨ１
８アミノ酸配列を比較し、変動を同定した（表１４）。位置１７１は、いくつかの配列においてグリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）の変動を示した。
表１４：Ａ／ソロモン諸島／３／２００６のアミノ酸の変動
開始Ｍからの番号付け
株：Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１
位置２０３は、アスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）またはアスパラギン（Ｎ）の変動を示した。
株：Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３
配列変動は５つの位置で観察された（表１５）。位置２１５において、欠失は２つのサンプリングされた配列中で観察される。
表１５：Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３のアミノ酸の変動
＊ 開始Ｍからの番号付け
株：Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５からのＨ３
この株における配列変動は４つの位置で観察された（表１６）。表１６：Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５からのＨ３のアミノ酸の変動
＊成熟タンパク質からの番号付け
株：Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４からのＢ
２つの位置での変動が観察される（表１７）。位置１２０は糖鎖付加部位ではなく、位置２１０は糖鎖付加に関与し、卵中の培養後にこの糖鎖付加は消失する。
表１７：Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４からの赤血球凝集素のアミノ酸の変動
＊ ＳＰの中央からの番号付け
株：Ｂ／フロリダ／４／２００６からの赤血球凝集素；ＩＳＤＮ２６１６４９
観察された変動は、培養系に依存して、位置２１１のアミノ酸配列変動を含む。アスパラチン（Ａｓｐａｒａｔｉｎｅ）（Ｎ）はＭＤＣＫ細胞から単離した配列中で見出されるが、グルタミン酸（Ｄ）は卵から単離した配列中で見出される。位置２１１は糖鎖付加部位であり、卵における培養の後に消失する。
株：Ａ／シンガポール／１／１９５７からのＨ２
配列変動は６つの位置において観察された（表１８）。
表１８：Ａ／シンガポール／１／１９５７からのＨ２のアミノ酸の変動
1成熟タンパク質からの番号付け
株：Ａ／ベトナム／１１９４／２００４からのＨ５およびＡ／アンホイ／１／２００５からのＨ５
これらのＨ５株のいずれかの一次配列のアライメントでアミノ酸配列において観察される変動はなかった。
株：Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／１９９７からのＨ６
１エントリーのみが株（ＡＦ２５０１７９）について利用可能であった。
株：Ａ／ウマ／プラハからのＨ７／５６
合計２つの配列エントリーがデータベース中に見出された。エントリーＡＢ２９８８７７は実験室での再集合体であるので除外された。
株：Ａ／香港／１０７３／１９９９からのＨ９；ＡＪ４０４６２６
合計２つの配列エントリーがデータベース中に見出された。１つのみが完全であった。
実施例２０．植物の分泌タンパク質からのシグナルペプチドと融合したインフルエンザウイルス赤血球凝集素の一過性発現。
他の赤血球凝集素についてのＨＡ蓄積レベルに対するシグナルペプチド修飾の効果も、アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼからのシグナルペプチド（ＳＰ；ヌクレオチド３２〜１０３）（ＰＤＩ；アクセッション番号Ｚ１１４９９；配列番号：３４；図１７）と融合した、株Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド番号７８７）、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド番号５４０）、株Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）（プラスミド７９０）およびＡ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド番号６６３からのＡ亜型ＨＡ、ならびに株Ｂ／フロリダ／４／２００６（プラスミド番号７９８）からのＢ型の発現を介して調査された。ＰＤＩ ＳＰ−赤血球凝集素遺伝子融合をプラストシアニン発現カセット（アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列）中で組み立て、組み立てたカセットをｐＣＡＭＢＩＡのバイナリープラスミドに挿入した。次いでプラスミドをアグロバクテリウム（ＡＧＬ１）へとトランスフェクションし、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１／７８７、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／６６３およびＡＧＬ１／７９８をそれぞれ産生した。
Ｎ．ベンサミアナ植物をＡＧＬ１／７８７、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／６６３およびＡＧＬ１／７９８によりインフィルトレーションした。平行して、一連の植物を、比較目的のためにＡＧＬ１／７７４、ＡＧＬ７７６、ＡＧＬ１／６６０およびＡＧＬ１／７７９によりインフィルトレーションした。葉を６日のインキュベーション期間後に収穫し、タンパク質をインフィルトレーションした葉から抽出し、適切な抗ＨＡ抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。Ｈ１／ブリズベーンおよびＨ３／ブリズベーンからのＨＡの発現は、それらの天然のシグナルペプチドを持つ同じＨＡについて観察された発現と比較して、ＰＤＩからのＳＰを使用して大幅に改善された（それぞれ、図８７ｂおよびｃ）。亜型Ｈ１（株Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９）からの第３のＨＡの発現はこのＳＰ置換ストラテジーを使用して確認した（図８７ａ）。シグナルペプチドの修飾はＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５）のＨＡ蓄積の実質的増加をもたらさず（図８７ｄ）、発現のために使用されたシグナルペプチドに関係なく、株Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのシグナルは検出されなかった（図８７ｅ）。ＨＡの発現が検出されたすべての条件については、ユニークな免疫反応性バンドがおよそ７２ｋＤａの分子量で観察され（図８７ａ乃至ｄ）、未切断のＨＡ０前駆体にサイズに対応する。
実施例２１．ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットの制御下でのＨＡ発現。
ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２からの非翻訳配列を含む発現カセットＣＰＭＶ−ＨＴ（Sainsbury et al. 2008 Plant Physiology 148: 1212-1218；ＷＯ ２００７／１３５４８０も参照）を、トランスジェニック植物におけるいくつかの赤血球凝集素の発現のために使用した。Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９（Ｈ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１）、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３）、Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５）およびＢ／フロリダ／４／２００６（Ｂ）からのＨＡを、記載されるようにアグロインフィルトレーションして、Ｎ．ベンサミアナ植物中でＣＰＭＶ−ＨＴの制御下で発現させた。インキュベーション後に、葉を収穫し、抽出し、タンパク質抽出物中のＨＡ含有量をウエスタンブロットによって比較した。図８８中に示されるように、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットは、使用されるシグナルペプチドに関係なくプラストシアニンカセットよりも高いＨＡ発現レベルをもたらした。さらに、Ｂ／フロリダ／４／２００６からの株Ｂについては、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットの使用により、プラストシアニンカセット下で発現させた時これらの免疫検出条件下で検出不能なままだったＨＡ蓄積の検出が可能になった。
表１９：天然またはＰＤＩのシグナルペプチドを持つインフルエンザ赤血球凝集素の発現のために使用された発現カセット。
実施例２２．シグナルペプチド修飾と組み合わせた、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０との共発現。
植物起原の細胞質Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０（コンストラクト番号Ｒ８７０）を、両方とも植物起原のシグナルペプチド（アルファルファＰＤＩシグナルペプチド）を持つＨ１ニューカレドニア（コンストラクト番号５４０）またはＨ３ブリズベーン（コンストラクト番号７９０）と共発現させた。共発現は、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／Ｒ８７０、ＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ１について）またはＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／Ｒ８７０およびＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ３について）の混合物（１：１：１比）を含有する細菌懸濁液によるＮ．ベンサミアナ植物のアグロインフィルトレーションによって行った。対照植物は、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ１について）またはＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ３について）の混合物（１：２比）によりアグロインフィルトレーションした。インキュベーション後に、葉を収穫し、抽出し、タンパク質抽出物中のＨＡ含有量をウエスタンブロットによって比較した（図８９）。試験された条件において、得られた結果は、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０の共発現がＨ１ニューカレドニアについての赤血球凝集素蓄積レベルを増加させなかったことを示す。しかしながら、Ｈ３ブリズベーンについては、ウエスタンブロットから、細胞質Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０の共発現が赤血球凝集素蓄積レベルの有意な増加をもたらすことが明らかに示された。
実施例２３．２×３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットの制御下でのＨ１ Ａ／カリフォルニア０４／０９の発現。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットも、記載されるようにアグロインフィルトレーションして、Ｎ．ベンサミアナ植物中でのＨ１ Ａ／カリフォルニア０４／０９（コンストラクト番号５６０、図９０、９８）の発現のために使用した。２日のインキュベーション後に、葉を収穫し、抽出し、タンパク質抽出物中のＨＡ含有量をウエスタンブロットによって比較した。図９１中で示されるように、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットはインフィルトレーション２日後にＨＡの有意な発現をもたらした。植物中のＨＡの発現から産生されたＶＬＰは、赤血球の凝集を実証する。
表２０：図９１中で示されたウエスタンブロットの各々のレーンのためのサンプル。
すべての引用は参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は１つまたは複数の実施形態に関して記載された。しかしながら、請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなしに、多数の変形および修飾を行うことができることは当業者に明らかだろう。
本発明の一態様として、例えば以下のものがある。
〔１〕植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されたＡ型／カリフォルニア／０４／０９のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
〔２〕前記ＨＡが、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含む、前記〔１〕に記載の核酸。
〔３〕前記非天然のシグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、前記〔２〕に記載の核酸。
〔４〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）前記〔１〕に記載の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む方法。
〔５〕前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が一過性様式で植物中に導入される、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が安定的であるように植物中に導入される、前記〔４〕に記載の方法。
〔７〕ｃ）宿主を採取しＶＬＰを精製する工程
をさらに含む、前記〔４〕に記載の方法。
〔８〕前記導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸が植物に導入される、前記〔４〕に記載の方法。
〔９〕前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）前記〔１〕に記載の核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む方法。
〔１１〕前記〔１〕に記載の核酸を含む植物。
〔１２〕植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、前記〔１１〕に記載の植物。前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される前記植物。
〔１３〕Ａ型／カリフォルニア／０４／０９のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質と、植物に由来する１つまたは複数の脂質とを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
〔１４〕効果的な用量の前記〔１３〕に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔１５〕前記〔１３〕に記載のウイルス様粒子を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
〔１６〕前記ウイルス様粒子が、経口的に、皮内に、鼻内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に被験体に投与される、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾されたＮ−グリカンを持つＡ型／カリフォルニア／０４／０９のインフルエンザウイルスＨＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
〔１８〕効果的な用量の前記〔１７〕に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔１９〕前記〔１８〕に記載の組成物を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
〔２０〕前記組成物が、経口的に、皮内に、鼻内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に被験体に投与される、前記〔１９〕に記載の方法。
〔１’〕植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、配列番号２８と少なくとも７０％の配列同一性を有する、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、植物中で発現させた場合にウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する前記核酸。
〔２’〕前記ＨＡが、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含む、前記〔１’〕に記載の核酸。
〔３’〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）前記〔１’〕に記載の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む方法。
〔４’〕前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が一過性様式で植物中に導入されるか、又は前記核酸が安定的であるように植物中に導入される、前記〔３’〕に記載の方法。
〔５’〕ｃ）宿主を採取しＶＬＰを精製する工程
をさらに含む、前記〔３’〕に記載の方法。
〔６’〕前記導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸が植物に導入される、前記〔３’〕〜〔５’〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７’〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）前記〔１’〕に記載の核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む方法。
〔８’〕前記〔１’〕に記載の核酸を含む植物。
〔９’〕該植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸をさらに含む、前記〔８’〕に記載の植物。
〔１０’〕植物において産生されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記〔１’〕に記載の核酸によってコードされるインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）と、植物に由来する１つまたは複数の脂質とを含む、前記ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
〔１１’〕免疫応答を誘導するための効果的な用量の前記〔１０’〕に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔１２’〕インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、前記〔１０’〕に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）又は前記〔１１’〕に記載の組成物。
〔１３’〕植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾されたＮ−グリカンを持つ、前記〔１０’〕に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
〔１４’〕免疫応答を誘導するための効果的な用量の前記〔１３’〕に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔１５’〕インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、前記〔１３’〕に記載のウイルス様粒子又は前記〔１４’〕に記載の組成物。
参照文献：

Claims (4)

  1. インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１３５のヌクレオチド５２〜１７０１により定義されるＡ型／カリフォルニア／０４／０９のＨＡをコードする配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結され、前記調節領域が、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）−ＨＴを含み、前記植物における前記核酸の発現が、前記インフルエンザＨＡを含むウイルス様粒子の産生をもたらすことを特徴とする、核酸。
  2. 前記ＨＡをコードするヌクレオチド配列が、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結されている、請求項１に記載の核酸。
  3. 前記非天然のシグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、請求項２に記載の核酸。
  4. インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１３５のヌクレオチド５２〜１７０１により定義されるＡ型／カリフォルニア／０４／０９のＨＡをコードする配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結され、かつ植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されており、前記植物における前記核酸の発現が、前記インフルエンザＨＡを含むウイルス様粒子の産生をもたらすことを特徴とする、核酸。
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