JP5990207B2 - ヘマグルチニンを発現するトランスジェニック植物において産生された組換え型インフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ） - Google Patents

ヘマグルチニンを発現するトランスジェニック植物において産生された組換え型インフルエンザウイルス様粒子（ｖｌｐ） Download PDF

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Description

本願は、２００８年７月１１日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１２８１の継続出願であり、このＰＣＴ出願からの優先権を主張する。本願はまた、２００８年１月２１日に出願されたカナダ国出願２，６１５，３７２号、および２００８年１月２２日に出願された米国特許出願第６１／０２２，７７５号からの優先権を主張する。
発明の分野
本発明はウイルス様粒子の生産に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の生産に関する。
発明の背景
インフルエンザは、呼吸器系ウイルスによるヒトの主要死因である。一般的な症状には、特に、発熱、咽頭炎、息切れ、および筋痛が含まれる。インフルエンザ流行期中、インフルエンザウイルスは世界中で人口の１０〜２０％に感染し、毎年２５０〜５００，０００人の死者を出している。
インフルエンザウイルスは、感染した哺乳動物およびトリの細胞の原形質膜から出芽するエンベロープウイルスである。それらは、存在する核タンパク質およびマトリックスタンパク質抗原に基づいて、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型に分類される。インフルエンザＡ型ウイルスは、存在する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面糖タンパク質の組合せに従ってさらに亜型に分割される。ＨＡは、ウイルスが宿主細胞に結合し侵入する能力をつかさどる。ＮＡは、宿主細胞およびウイルス表面タンパク質のグリカン鎖から末端シアル酸残基を取り除き、これによりウイルス凝集が防止され、ウイルスの移動性が促進される。現在、１６種のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９種のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型が認識されている。各Ａ型インフルエンザウイルスは、１つの型のＨＡおよび１つの型のＮＡ糖タンパク質を提示している。一般的に、各亜型は種特異性を示す。例えば、すべてのＨＡおよびＮＡ亜型は、トリに感染することが公知である一方で、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ７亜型のみが、ヒトに感染することが示されている（Ｈｏｒｉｍｏｔｏ ２００６年；Ｓｕｚｕｋｉ ２００５年）。Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９を含むインフルエンザウイルスは、最も病原性の高い型のインフルエンザＡ型ウイルスと考えられており、将来大流行を引き起こす可能性が最も高い。
インフルエンザ大流行は、通常、高度に伝染性で病原性のあるインフルエンザウイルスによって引き起こされ、世界的に高いレベルの疾病および死亡に結びつく場合がある。新しいインフルエンザＡ亜型の出現は、結果として２０世紀において４回の主要な大流行をもたらした。Ｈ１Ｎ１ウイルスによって引き起こされた１９１８〜１９１９年のスペインかぜは、１９１７年から１９２０年の間に世界中で５０００万人以上の死亡の原因となった。現在、新しい亜型が出現するリスク、または動物の亜型がヒトに伝染するリスクは、常に存在している。高病原性型のトリインフルエンザ（「鳥インフルエンザ」とも呼ばれる）が、特に懸念されており、その発生は世界中のいくつかの国々で報告されている。多くの場合、この鳥インフルエンザは、結果として４８時間以内に１００％に近い死亡率をもたらす場合がある。トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）は、１９９７年に香港で最初に同定され、他のアジア諸国およびヨーロッパへと広がって行ったことは、野鳥の移動パターンと関連していると想定されている。
ヒトのインフルエンザと闘うための現行方法は、毎年のワクチン接種によるものである。ワクチンは、通常、来たるべき「インフルエンザ流行期」の主流菌株であると予測されるいくつかの菌株の組合せである。予測は世界保健機構が調整する。一般的に、各年生産されるワクチン用量数は、世界中の人口にワクチン接種をするほど十分にはない。例えば、カナダおよび合衆国は、それらの人口の約３分の１を免疫するのに十分なワクチン用量を取得するが、欧州連合は、人口の１７％が予防接種を受けることができるに過ぎない。インフルエンザワクチンの現在の世界的生産量は、世界的なインフルエンザ大流行に直面した場合に不十分であろうことは明白である。所与の年に必要な年間生産量をなんとかして満たすことができたとしても、主流菌株は年毎に変化し、したがってその年の低需要時に備蓄することは実際的ではない。有効なインフルエンザワクチンの経済的大量生産は、政府および民間産業にとっても同様に重要な関心事である。
ワクチンに使用されるウイルス株は、受精卵で生産される。ウイルス粒子を回収し、不活化ウイルスワクチンの場合は、表面活性剤で破壊して不活化する。弱毒化生ワクチンは、低温での増殖に適応していたインフルエンザウイルスから作製されており、それは、正常体温でワクチンが弱毒化されることを意味する。そのようなワクチンは、５から４９歳の個人における使用が合衆国で認可されている。不活化全ウイルスワクチンは、化学薬品で不活化することにより無害化され、それらは、胚性卵または哺乳動物細胞培養で生産されている。これらのタイプのワクチンはすべて、いくつかの特定の利点および欠点を示す。全ウイルスに由来するワクチンの１つの利点は、そのようなワクチンにより誘導される免疫のタイプである。一般的に、成分ワクチンは強力な抗体反応を誘導するが、全ウイルスから作製されるワクチンは、抗体（体液性）および細胞応答の両方を誘導する。たとえワクチンにより誘導される保護と相関する機能的な抗体応答が、許認可の基準であるとしても、Ｔ細胞応答もインフルエンザ免疫において重要であるという根拠が増加しつつあり、これも、より良好な保護を高齢者に提供することができる。
細胞性免疫応答を誘導するために、全ウイルスから作製されたワクチンが開発された。インフルエンザ菌株（例えば、Ｈ５Ｎ１）は病原性が高いため、これらのワクチンは、ＢＬ３＋施設で生産される。Ｈ５Ｎ１などの高病原性インフルエンザ菌株の場合、いくつかの製造業者は、インフルエンザ菌株の病原性を低減させ、ウイルスを非病原性にし、胚性卵または哺乳動物細胞培養でより容易に生産するために赤血球凝集素遺伝子配列を修飾している。他の製造業者も、高収量低病原性インフルエンザ供与体菌株（Ａ／ＰＲ／８／３４；Ｑｕａｎ Ｆ−Ｓら、２００７年）に、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質の遺伝子配列がクローニングされているリアソータントインフルエンザ菌株を使用している。これらの方法は、有用なワクチンを生産することができるが、通常の年の世界的な必要性を満たすのに必要な規模で、大量に低価格で迅速にワクチンを生産する必要性に対する解決策を提供しておらず、大流行に直面した場合に不足することはほとんど間違いないだろう。
この逆遺伝子工学を使用して、ウイルスを非病原性にするためにＨＡタンパク質の遺伝子配列を変異させる必要もある可能性がある。高病原性インフルエンザ菌株の場合、全ウイルスワクチンの生産には、封じ込め手順、またはその結果生じるワクチンが循環ウイルスの遺伝子配列と完全には一致しないことが必要とされる。弱毒化生ワクチンの場合、投与されたワクチンが、宿主に由来するインフルエンザウイルスと組換えを起こして、新しいインフルエンザウイルスに結びつく場合があるというリスクがさらに存在する。
この方法は、抗原性エピトープおよび翻訳後修飾を維持する一方で、この方法には、全ウイルスを使用することによる汚染のリスク、およびウイルス菌株に依存して収量が変動するというリスクを含む多数の欠点がある。保護が最適レベルを下まわるのは、ウイルスを卵に導入することによるウイルスの遺伝子異質性に起因する場合がある。他の欠点には、卵の取得には綿密な計画が必要であること、精製に使用される化学薬品による汚染リスクがあること、および生産時間が長期間にわたることが含まれる。また、卵タンパク質に過敏な人は、ワクチンを受けるのに適した候補ではない場合がある。
大流行の場合、成分ワクチン生産は、卵での増殖に菌株を適応させる必要性、および達成される生産収量の変動により制限を受ける。この技術は、季節性ワクチンの生産に何年も使用されてきたが、大流行に対して合理的な時間枠の中で対応することが非常に難しく、世界的な生産能力には制限がある。
卵の使用を回避するために、インフルエンザウイルスは、哺乳動物細胞培養、例えばＭＤＣＫまたはＰＥＲＣ．６細胞などでも生産されてきた。別の手法は、ウイルス遺伝子を有する細胞形質転換によりウイルスが生産される逆遺伝学である。しかしながら、これらの方法には、全ウイルスの使用、ならびに綿密な方法および特異的な培養環境が必要とされる。
いくつかの組換え産物が、組換えインフルエンザワクチン候補として開発されている。これらの手法は、インフルエンザＡ型ＨＡおよびＮＡタンパク質の発現、生産、および精製に注目しており、バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞を使用したインフルエンザＡ型ＨＡおよびＮＡタンパク質の発現（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、１９９９年；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、１９９９年）、ウイルスベクター、ならびにＤＮＡワクチン構築物（Ｏｌｓｅｎら、１９９７年）を含む。
インフルエンザウイルス感染の詳細は周知である。手短かに言えば、感染サイクルは、ビリオン表面ＨＡタンパク質が、シアル酸含有細胞受容体（糖タンパク質および糖脂質）に結合することにより開始される。ＮＡタンパク質は、シアル酸受容体のプロセシングを媒介し、細胞へのウイルス侵入は、ＨＡ依存性受容体媒介性エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを含有する内在化エンドソームの酸性限界では、ＨＡタンパク質は、ウイルスと細胞膜とが融合し、ウイルスが脱外被し、ヌクレオカプシド関連リボ核タンパク（ＲＮＰ）から、Ｍ２の媒介によりＭＩタンパク質が放出されて、それらがウイルスＲＮＡを合成するために細胞核へ移動することに結びつく構造変化を起こす。ＨＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス感染性を中和することによりウイルス感染を防止するが、ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス複製の初期段階に対するそれらの影響を媒介する。
Ｃｒａｗｆｏｒｄら（１９９９年）では、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるインフルエンザＨＡの発現が開示されている。発現されたタンパク質は、トリＨ５およびＨ７インフルエンザ亜型により引き起こされる致死性インフルエンザ疾患を予防可能であると記述されている。Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（１９９９年）では、バキュロウイルスで発現されたインフルエンザＨＡおよびＮＡタンパク質が、従来のワクチンによって誘導される免疫応答より優れた免疫応答を動物に誘導することが教示されている。バキュロウイルスで発現されたウマインフルエンザウイルス赤血球凝集素の免疫原性および効力が、相同性のＤＮＡワクチン候補と比較された（Ｏｌｓｅｎら、１９９７年）。まとめると、これらのデータは、インフルエンザウイルスによる免疫誘発に対する高度な保護が、種々の実験手法を使用して、異なる動物モデルにおいて、組換えＨＡまたはＮＡタンパク質を用いて誘導できることを実証する。
これまでの研究では、表面インフルエンザ糖タンパク質、ＨＡおよびＮＡが、インフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発の主要標的であり、Ｍ１がインフルエンザに対する細胞性免疫の保存標的を供給することが示されているため、新しいワクチン候補は、これらのウイルス抗原を、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質巨大分子粒子として含んでいてもよい。ワクチン製品として、ＶＬＰには、サブユニットまたは組換え抗原よりも免疫原性であるという利点があり、体液性および細胞性免疫反応の両方を刺激することができる（ＧｒｇａｃｉｃおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、２００６年）。さらに、これらのインフルエンザ抗原を有する粒子は、インフルエンザウイルスの複数の菌株に対する中和抗体を誘発する立体構造エピトープを提示していてもよい。
ワクチン目的用の非感染性インフルエンザウイルス菌株の生産は、偶発的な感染を回避する１つの方法である。あるいは、培養ウイルスの代替としてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が研究されている。ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するが、ゲノムを欠いており、したがって複製することができないか、または二次感染のための手段を準備することができない。
いくつかの研究により、組換えインフルエンザタンパク質は、哺乳動物発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用して、細胞培養中でＶＬＰへと自己組織化することが実証されている（Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら、１９９９年；Ｎｅｕｍａｎｎら、２０００年；ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ、２００１年）。Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら（１９９９年）では、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成が、いくつかのウイルスタンパク質の発現レベルに依存することが開示されている。Ｎｅｕｍａｎｎら（２０００年）では、クローニングされたｃＤＮＡのみに由来する伝染性インフルエンザウイルス様粒子を生成するための哺乳動物発現プラスミドに基づく系が確立された。ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ（２００１年）では、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成が報告されている。これらの研究により、インフルエンザビリオンタンパク質は、真核細胞中で共発現されると自己組織化することが実証された。
Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓら（２０００年）では、赤血球凝集素（ＨＡ）に加えて、インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）が、昆虫細胞からのＶＬＰ出芽に不可欠であることが教示されている。しかしながら、Ｃｈｅｎら（２００７年）では、Ｍ１がＶＬＰ形成に必要ではない可能性が教示されており、Ｍ１およびＶＬＰの効率的な放出には、ＨＡの存在およびＮＡにより提供されるシアリダーゼ活性の存在が必要であることが観察されている。ＮＡは、ＶＬＰを産生する細胞の表面にある糖タンパク質のシアル酸を切断し、培地中にＶＬＰを放出する。
Ｑｕａｎら２００７年では、バキュロウイルス発現系（昆虫細胞）で生産されたＶＬＰワクチンが、インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１））のいくつかの菌株に対する防御免疫を誘導することが教示されている。Ｑｕａｎにより研究されたＶＬＰは、原形質膜から出芽することが観察され、哺乳動物系（ＭＤＣＫ細胞）で得られたものと類似した、正しいサイズおよび形態であるとみなされた。
特許文献１および特許文献２では、培養中の形質転換ＮＴ−１（タバコ）細胞におけるニューカッスル病ウイルスＨＮまたはトリインフルエンザＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６８（Ｈ５Ｎ９）の発現が教示されている。植物細胞培養で発現されたポリペプチドを含む組成物は、ウサギおよびトリにおいてさまざまな免疫応答を誘発する。
エンベロープウイルスは、感染細胞から「出芽する」際に自身の脂質エンベロープを取得し、原形質膜からまたは細胞内小器官の膜から、その膜を取得することができる。インフルエンザウイルス粒子およびＶＬＰは、宿主細胞の原形質膜から出芽する。哺乳動物またはバキュロウイルス細胞系では、例えば、インフルエンザは原形質膜から出芽する（Ｑｕａｎら、２００７年）。ほんの少数のエンベロープウイルスしか植物に感染しないことが公知である（例えば、トポウイルス（Ｔｏｐｏｖｉｒｕｓ）およびラブドウイルスのメンバー）。公知の植物エンベロープウイルスのうち、それらは、原形質膜からではなく宿主細胞の細胞内膜から出芽することを特徴とする。少数の組換えＶＬＰが植物宿主で生産されているが、いずれも原形質膜由来ではなく、インフルエンザＶＬＰを含む原形質膜由来ＶＬＰを植物中で生産することができるかどうかという問題を提起する。
現行のインフルエンザＶＬＰ生産技術は、複数のウイルスタンパク質の共発現に依存しており、大流行および毎年の流行の場合ワクチン接種には対応時間が重要であるため、この依存性はこれらの技術の欠点を表している。ワクチン開発を加速させるためには、より単純なＶＬＰ生産系、例えば非構造性ウイルスタンパク質の発現を必要とせず、１つまたは少数のウイルスタンパク質だけの発現に依存するものが望ましい。
世界中の人々をインフルエンザから防御し将来の大流行を回避するために、ワクチン製造業者は、ワクチン用量を生産するための効率的で迅速な方法を開発する必要があるだろう。ワクチンを生産するために現在行われている受精卵の使用は、不十分であり、長い工程が伴う。
国際公開第２００４／０９８５３０号 国際公開第２００４／０９８５３３号
本発明の目的は、改良されたインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供することである。
本発明によると、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。抗原はインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）であってもよい。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
（項目２）
前記ＨＡが、天然または非天然シグナルペプチドを含む、項目１に記載の核酸。
（項目３）
前記非天然シグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、項目２に記載の核酸。
（項目４）
前記ＨＡが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザであるか、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザの亜型である、項目１に記載の核酸。
（項目５）
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、項目１に記載の核酸。
（項目６）
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、
ａ）項目１に記載の核酸を該植物または該植物の部分に導入する工程と、
ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該植物または該植物の部分をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程と
を含む方法。
（項目７）
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が、前記植物中で一過性に発現される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が、前記植物中で安定的に発現される、項目６に記載の方法。
（項目９）
ｃ）宿主を回収し、前記ＶＬＰを精製する工程
をさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸が、前記植物に導入される、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、
ａ）項目１に記載の核酸を含む植物または植物の部分を準備する工程と、
ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該植物または該植物の部分をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程と
を含む方法。
（項目１３）
項目１に記載の核酸を含む植物。
（項目１４）
植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、項目１３に記載の植物。
（項目１５）
前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、項目１４に記載の植物。
（項目１６）
インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質および植物に由来する１つまたは複数の脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目１７）
前記ＨＡが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である、項目１６に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目１８）
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、項目１７に記載のＶＬＰ。
（項目１９）
有効用量の項目１６に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目２０）
対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、項目１６に記載のウイルス様粒子を投与することを含む方法。
（項目２１）
前記ウイルス様粒子が、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを保持するインフルエンザウイルスＨＡを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目２３）
前記ＨＡが、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザであるか、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である、項目２２に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（項目２４）
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、項目２３に記載のＶＬＰ。
（項目２５）
有効用量の項目２２に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目２６）
対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、項目２５に記載の組成物を投与することを含む方法。
（項目２７）
前記組成物が、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与される、項目２６に記載の方法。
ＨＡは、天然または非天然シグナルペプチドを含んでいてもよく、非天然シグナルペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドであってもよい。
核酸によってコードされるＨＡは、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザであってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザの亜型である。本発明のいくつかの態様では、核酸によってコードされるＨＡは、Ａ型インフルエンザ由来であってもよく、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されてもよい。
本発明は、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、
ａ）植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原、例えばインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードする核酸を植物またはその部分に導入するステップと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で植物またはその部分をインキュベートし、それによりＶＬＰを生産するステップと
を含む方法も提供する。
この方法は、植物を回収し、植物組織からＶＬＰを精製または分離するステップをさらに含んでいてもよい。
この方法は、導入ステップ（ステップａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含んでいてもよい。
１つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択されてもよい。
本発明は、導入ステップ（ステップａ）において、核酸が植物中で一過性に発現されるか、または植物中で安定的に発現されるかのいずれかであってもよい上記の方法を含む。さらに、ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。
本発明の別の態様によると、インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルス由来の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物または植物の部分を準備するステップと、核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の部分をインキュベートし、それによりＶＬＰを生産するステップとを含む方法が提供される。
この方法は、植物を回収し、植物組織からＶＬＰを精製または分離するステップをさらに含んでいてもよい。
本発明は、準備ステップの後で、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入し、植物または植物の部分を、核酸の発現を可能にする条件下でインキュベートし、それによりＶＬＰを生産する上記の方法を含む。
１つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択されてもよい。
本発明は、導入ステップ（ステップａ）において、ＨＡをコードする核酸が、植物中で安定的に発現される上記の方法を含む。さらに、ＶＬＰは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。
本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および植物に由来する１つまたは複数の脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）も提供する。
ＶＬＰのＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ由来であってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である。本発明のいくつかの態様では、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である。
本発明には、有効用量のＶＬＰを含む組成物であって、ＶＬＰがインフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質、および薬学的に許容される担体を含む組成物も含まれる。
本発明は、植物においてＶＬＰを形成するＨＡタンパク質の断片または部分も企図する。
本発明は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを保持するインフルエンザウイルスＨＡを含むＶＬＰにも関する。ＶＬＰのＨＡタンパク質は、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ由来であってもよく、またはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザＨＡの亜型である。本発明のいくつかの態様では、ＨＡは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である。
ＶＬＰは、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、もしくはＨ１６またはそれらの断片もしくは部分を含む１つまたは複数の亜型のＨＡタンパク質を含んでいてもよい。そのようなＨＡタンパク質を含む亜型の例には、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））が含まれる。
本発明のある態様では、ＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、またはＨ９亜型であってもよい。別の態様では、Ｈ１タンパク質は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、またはＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）菌株由来であってもよい。また、Ｈ３タンパク質は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）またはＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）菌株由来であってもよい。本発明のさらなる態様では、Ｈ２タンパク質は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）菌株由来であってもよい。Ｈ５タンパク質は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５菌株由来であってもよい。本発明のある態様では、Ｈ６タンパク質は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）菌株由来であってもよい。Ｈ７タンパク質は、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）菌株由来であってもよい。本発明のある態様では、Ｈ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）菌株由来である。本発明のさらなる態様では、ＨＡタンパク質はインフルエンザウイルス由来であってもよく、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６を含むＢ型ウイルス由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ亜型に由来するＨＡタンパク質のアミノ酸配列の例には、配列番号４８〜５９が含まれる。
インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａであってもよい。
本発明は、ＨＡタンパク質をコードする配列を含む核酸分子も提供する。核酸分子は、ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたは複数の調節領域をさらに含んでいてもよい。核酸分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｂ、またはＣをコードする配列を含んでいてもよい。本発明の別の態様では、核酸分子によってコードされるＨＡタンパク質は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ亜型であってもよい。核酸分子によってコードされるＨ１タンパク質は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、またはＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）菌株由来である。本発明の別の態様では、核酸分子によってコードされるＨ３タンパク質は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、またはＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）菌株由来であってもよい。本発明のさらなる態様では、核酸分子によってコードされるＨ２タンパク質は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）菌株由来であってもよい。また、核酸分子によってコードされるＨ５タンパク質は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、またはＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５菌株由来であってもよい。本発明のある態様では、核酸分子によってコードされるＨ６タンパク質は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）菌株由来であってもよい。また、核酸分子によってコードされるＨ７タンパク質は、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）菌株由来であってもよい。加えて、核酸分子によってコードされるＨ９タンパク質は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）菌株由来であってもよい。核酸によってコードされるＢ亜型に由来するＨＡタンパク質は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６またはＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４菌株由来であってもよい。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ亜型に由来するそのようなＨＡタンパク質をコードする核酸分子の配列の例には、配列番号３６〜４７および６０〜７３が含まれる。
核酸配列は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａをコードしていてもよい。
ＨＡタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されていてもよい調節領域には、植物細胞、昆虫細胞、または酵母細胞において作動可能であるものが含まれる。そのような調節領域には、プラストシアニン調節領域、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の調節領域、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）、ＳＴ−ＬＳ１、ポリヘドリン調節領域、またはｇｐ６４調節領域が含まれていてもよい。他の調節領域には、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはターミネーター配列が含まれる。プラストシアニン調節領域は、アルファルファプラストシアニン調節領域を含んでいてもよく、また５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、またはターミネーター配列は、アルファルファ配列であってもよい。
対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法であって、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質、および薬学的に許容される担体を含むウイルス様粒子を投与することを含む方法も提供される。ウイルス様粒子は、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与されてもよい。
本発明は、インフルエンザ、麻疹、エボラ、マールブルク、およびＨＩＶからなる群から選択されるウイルスに由来する１つまたは複数のタンパク質と、非シアル酸付加宿主産生細胞に由来する１つまたは複数の脂質とを含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）にも関する。ＨＩＶタンパク質はｐ２４、ｇｐ１２０、またはｇｐ４１であってもよく、エボラウイルスタンパク質はＶＰ３０またはＶＰ３５であってもよく、マールブルグウイルスタンパク質はＧｐ／ＳＧＰであってもよく、麻疹ウイルスタンパク質はＨタンパク質またはＦタンパク質であってもよい。
加えて、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。例えば、宿主が昆虫の場合、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の昆虫脂質を含んでいてもよく、または宿主が酵母の場合、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の酵母脂質を含んでいてもよい。
本発明は、２つ以上のインフルエンザ菌株または亜型のＶＬＰを含む組成物にも関する。２つ以上の亜型または菌株は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ
Ｉｓｌａｎｄｓ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、またはＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））からなる群から選択されてもよい。ＶＬＰの２つ以上の亜型または菌株は、およそ等しい量で存在していてもよく、あるいは亜型または菌株の１つまたは複数は、代表的な菌株または亜型の大部分であってもよい。
本発明は、動物または標的生物においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するための方法であって、１つまたは複数のＶＬＰを含む有効用量のワクチンを投与することを含み、ＶＬＰが、非シアル酸付加宿主、例えば寄主植物、昆虫宿主、または酵母宿主を使用して生産される方法に関する。ワクチンは、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下に投与されてもよい。標的生物は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、鳥（トリ）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、犬（ｄｏｇ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、猫（ｃａｔ）、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ムナジロテン、フェレット、ハウスペット、家畜、マウス、ラット、アシカ、クジラなどを含む群から選択されてもよい。
本発明は、ＶＬＰを生産可能な好適な宿主、例えば植物、昆虫、酵母において、異なるインフルエンザ菌株に由来する赤血球凝集素（ＨＡ）を含有するＶＬＰを生産するための方法を提供する。植物中で生産されるＶＬＰは、植物に由来する脂質を含有し、昆虫細胞中で生産されるＶＬＰは、昆虫細胞の原形質膜に由来する脂質（一般的に「昆虫脂質」と呼ばれる）を含み、酵母中で生産されるＶＬＰは、酵母細胞の原形質膜に由来する脂質（一般的に「酵母脂質」と呼ばれる）を含む。
本発明は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、植物、植物組織または植物細胞にも関する。抗原は、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）であってもよい。
植物は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数シャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含んでいてもよい。１つまたは複数のシャペロンタンパク質は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を含む群から選択されてもよい。
植物中でのＶＬＰの生産は、昆虫細胞培養中のこれらの粒子の生産に対していくつかの利点を示す。植物脂質は特異的に免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を増強することができる。植物膜は、脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から作られており、植物およびいくつかの細菌および原生動物に特有のスフィンゴ糖脂質も含有する。スフィンゴ脂質は、それらが、グリセロール様ＰＣまたはＰＥのエステルではないが、１８個を超える炭素を含有する脂肪酸鎖にアミド結合を形成する長鎖アミノアルコールからなるという点で珍しい。ＰＣおよびＰＥならびにスフィンゴ糖脂質は、樹状細胞ならびにマクロファージならびに胸腺および肝臓のＢおよびＴリンパ球を含む他の細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの哺乳動物免疫細胞により発現されるＣＤ１分子と結合することができる（Ｔｓｕｊｉ Ｍ，． ２００６年）。さらに、植物脂質の存在の潜在的アジュバント効果に加えて、抗原提示細胞による糖タンパク質抗原の捕捉を容易にする植物Ｎ−グリカンの能力は、植物中でのＶＬＰ生産にとって有利である場合がある（Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ、２００７年）。
理論により束縛されることは望まないが、植物で作られたＶＬＰは、他の生産系で作製されたＶＬＰより強力な免疫反応を誘導し、生ウイルスワクチンまたは弱毒化全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応と比較して、これらの植物性ＶＬＰによって誘導された免疫反応は、より強力であるだろうと予期される。
全ウイルスから作製されたワクチンとは反対に、ＶＬＰは非感染性であるため利点を提供し、したがって制限的な生物学的封じ込めは、伝染性の全ウイルスと共に作業する場合ほど重要な問題ではなく、生産には必要とされていない。植物で作られたＶＬＰは、温室または畑で発現系を成長させることが可能になることにより、またさらなる利点を提供し、したがって著しくより経済的であり、スケールアップするのにより好適である。
加えて、植物は、シアル酸残基の合成およびタンパク質へのシアル酸残基の付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で生産することができ、植物中でのＶＬＰ生産を保証するために、ＮＡを共発現する必要はなく、または生産細胞をシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理するかもしくは抽出する必要はない。
本発明により生産されるＶＬＰは、ＲＮＡに結合することが公知であるＭ１タンパク質を含まない。ＲＮＡはＶＬＰ調製の不純物であり、ＶＬＰ生産の規制認可を取得する際に好ましくない。
この発明の概要には、本発明の特徴が必ずしもすべて記述されているわけではない。
本発明のこれらおよび他の特徴は、添付図面を参照して次の記載からより明らかになる。
図１Ａは、本発明の実施形態により、株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１の発現に使用されるアルファルファプラストシアニンに基づく発現カセットの配列を示す図である（配列番号８）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）シグナルペプチドは下線付きである。クローニングに使用されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限酵素部位が太字で示されている。 図１Ｂは、インフルエンザ赤血球凝集素の機能ドメインの概略図を示す。ＨＡ０、ＨＡ１およびＨＡ２の切断後、断片はジスルフィド架橋により依然として結合されている。 図２Ａは、株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からＨＡ亜型Ｈ１を発現させるために構築されたプラスミド５４０の表示を示す図である。 図２Ｂは、株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）からＨＡ亜型Ｈ５を発現させるために構築されたプラスミド６６０の表示を示す。 図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ａは、ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）の溶出プロファイルを示す。 図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）後のＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウェスタンブロット；抗Ｈ１）を示す。 図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ｃは、Ｈ５の溶出プロファイルを示す；ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）。 図３は、赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を生産する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示す図である。図３Ｄは、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）後のＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウェスタンブロット；抗Ｈ５）を示す。 図４Ａは、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＮ末端断片をコードする配列（配列番号１）を示す図である。図４Ｂは、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＣ末端断片をコードする配列（配列番号２）を示す。 図５は、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＨＡ０をコードする完全配列（配列番号２８）を示す図である。 図６は、最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位、およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位に隣接されたＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードする配列（配列番号３）を示す図である。 図７Ａは、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃの配列（配列番号４）を示す図である。図７Ｂは、プライマーＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒの配列（配列番号５）を示す図である。図７Ｃは、プライマー Ｐｌａｓｔｏ−ＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃの配列（配列番号６）を示す図である。図７Ｄは、プライマーＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒの配列（配列番号７）を示す図である。 図８Ａは、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））ペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。図８Ｂは、Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））ペプチド配列のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。天然シグナルペプチドが太字で示されている。 図９Ａは、Ａ型インフルエンザ亜型Ｈ７のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す図である。 図１０Ａは、Ａ型インフルエンザＨＡ、亜型Ｈ２のヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す図である。 図１０Ｂは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ３のヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。 図１０Ｃは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ４のヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。 図１０Ｄは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ５のヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。 図１０Ｅは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ６のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示す。 図１０Ｆは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ８のヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。 図１０Ｇは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ９のヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。 図１０Ｈは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１０のヌクレオチド配列（配列番号１９）を示す。 図１０Ｉは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１１のヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。 図１０Ｊは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１２のヌクレオチド配列（配列番号２１）を示す。 図１０Ｋは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１３のヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。 図１０Ｌは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１４のヌクレオチド配列（配列番号２３）を示す。 図１０Ｍは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１５のヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す。 図１０Ｎは、Ａ型インフルエンザＨＡ亜型Ｈ１６のヌクレオチド配列（配列番号２５）を示す。 図１０Ｏは、Ｂ型インフルエンザＨＡのヌクレオチド配列（配列番号２６）を示す。 図１０Ｐは、Ｃ型インフルエンザＨＡのヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す。 図１０Ｑは、プライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃのヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す。 図１０Ｒは、プライマーＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒのヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。 図１０Ｓは、プライマーＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。 図１０Ｔは、プライマーＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒのヌクレオチド配列（配列番号３２）を示す。 図１１は、本明細書で使用されるようないくつかの構築物の概略図を示す図である。構築物６６０は、プラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結されたＨＡ亜型Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み；構築物５４０は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ ＰＤＩ）と結合してＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み、ならびにプラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；ＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））を発現させるために構築された構築物５４４、Ｈ１をコードするヌクレオチド配列がアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ ＰＤＩ）およびＧＣＮ４ｐＩＩロイシンジッパー（Ｈ１の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の代わりに）と結合され、ならびにプラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；ならびにＡ型インフルエンザ／ＰＲ／８／３４に由来する領域をコードするＭ１を発現させるための構築物７５０は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲと結合され、ならび二重の３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターに作動可能に連結される。 図１２は、構築物６６０で形質転換されたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉からのタンパク質抽出物における、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）抗体を用いた、Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の免疫検出を示す図である（レーン３）。Ａ型インフルエンザ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４に由来する市販のＨ５が検出の陽性対照として使用され（レーン１）、および空ベクターで形質転換された葉からのタンパク質抽出物が陰性対照として使用された（レーン２）。 図１３は、サイズ排除クロマトグラフィーによる赤血球凝集素構造の特徴を示す図である。Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））を生産する別個のバイオマスからのタンパク質抽出物、Ｈ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、可溶性Ｈ１、またはＨ１およびＭ１がＳ−５００ＨＲでのゲル濾過により分離された。ロゼット形態での市販のＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））も分画された（Ｈ１ロゼット）。図１３Ａは、相対タンパク質含量について分析された溶出画分を示す（相対タンパク質レベル−バイオマス分画の標準タンパク質溶出プロファイルが示されている）。ブルーデキストラン２０００（２ＭＤ参照基準）溶出ピークが示されている。図１３Ｂは、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）抗体（Ｈ５に対する）で免疫ブロットして赤血球凝集素の存在について分析された溶出画分を示す。図１３Ｃは、Ｈ１に対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。図１３Ｄは、可溶性Ｈ１に対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。図１３Ｅは、Ｈ１ロゼットに対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。図１３Ｆは、Ｈ１＋Ｍ１に対する抗Ａ型インフルエンザ抗体について分析された溶出画分を示す。 図１４は、ショ糖勾配遠心分離によるインフルエンザＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））構造の濃度および血球凝集素濃縮画分の電子顕微鏡検査を示す図である。図１４Ａは、ショ糖密度勾配遠心分離からの画分の特徴を示す。各画分は、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）抗体を用いた免疫ブロットによりＨ５の存在（上のパネル）、ならびにこの相対タンパク質含量および赤血球凝集能力（グラフ）について分析された。図１４Ｂは、ショ糖勾配遠心分離からプールされた画分１７、１８および１９のネガティブ染色透過電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍを表す。 図１５は、インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示す図である。図１５Ａは、清澄化ステップ−レーン１、粗抽出；レーン２、ｐＨ６調整抽出；レーン３、加熱処理抽出；レーン４、ＤＥ濾過抽出；フェチュインアフィニティー精製ステップ：レーン５、添加；レーン６、フロースルー；レーン７、溶出（１０倍に濃縮）における、タンパク質含量のクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１５Ｂは、精製されたＨ５ ＶＬＰ試料のネガティブ染色透過電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍを表す。図１５Ｃは、構造の細部を示すために拡大された分離されたＨ５ ＶＬＰを示す。図１５Ｄは、株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨＡに対して産生されたウサギポリクローナル抗体を用いた、クマシー染色された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンＡ）およびウェスタンブロット（レーンＢ）におけるＨ５ ＶＬＰ産物を示す。 図１５は、インフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製を示す図である。図１５Ａは、清澄化ステップ−レーン１、粗抽出；レーン２、ｐＨ６調整抽出；レーン３、加熱処理抽出；レーン４、ＤＥ濾過抽出；フェチュインアフィニティー精製ステップ：レーン５、添加；レーン６、フロースルー；レーン７、溶出（１０倍に濃縮）における、タンパク質含量のクマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１５Ｂは、精製されたＨ５ ＶＬＰ試料のネガティブ染色透過電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍを表す。図１５Ｃは、構造の細部を示すために拡大された分離されたＨ５ ＶＬＰを示す。図１５Ｄは、株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨＡに対して産生されたウサギポリクローナル抗体を用いた、クマシー染色された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンＡ）およびウェスタンブロット（レーンＢ）におけるＨ５ ＶＬＰ産物を示す。 図１６は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子のヌクレオチド配列、完全ｃｄｓ．ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８９９２９（配列番号３３）を示す図である。 図１７は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのためのＭｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１４９９（配列番号３４）。 図１８は、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））断片７のヌクレオチド配列、完全配列を示す図である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０１６．１（配列番号３５）。 図１９は、Ｈ５産生組織のポジティブ染色透過電子顕微鏡観察によるＶＬＰ蓄積の局在化を示す図である。ＣＷ：細胞壁、ｃｈ：葉緑体、ｐｍ：原形質膜、ＶＬＰ：ウイルス様粒子。バーは１００ｎｍを表す。 図２０は、植物で作られたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加免疫１４日後の血清抗体反応の誘発を示す図である。図２０（Ａ）筋肉内注射により免疫化されたマウスの抗体反応。図２０（Ｂ）鼻腔内投与により免疫化されたマウスの抗体反応。抗体反応は、不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスに対し測定された（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。＊組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。 図２１は、植物で作られたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加免疫１４日後の赤血球凝集阻害抗体反応（ＨＡＩ）を示す図である。図２１（Ａ）筋肉内注射により免疫化されたマウスの抗体反応。図２１（Ｂ）鼻腔内投与により免疫化されたマウスの抗体反応。ＨＡＩ抗体反応は、不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルスに対し測定された（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。＊組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。 図２２は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＬＰの免疫原性に対するアジュバント効果を示す図である。図２２（Ａ）筋肉内注射により免疫化されたマウスに対するミョウバンの効果。図２２（Ｂ）鼻腔内投与により免疫化されたマウスに対するキトサンの効果。ＨＡＩ抗体反応は、不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）を用いて測定された。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。＊対応する組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。 図２３は、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））投与に対する抗体反応を示す図である。図２３（Ａ）追加免疫３０日後の、筋肉内投与により免疫化されたマウスにおける抗Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５免疫グロブリンアイソタイプ。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｏｇ２）である。ＥＬＩＳＡは、コーティング剤として全不活化Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５）ウイルスを用いて行った。バーは平均偏差を表す。＊対応する組換え可溶性Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））と比較したｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図２３（Ｂ）全不活化ウイルス（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）および（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１））に対する抗体力価。全群が陰性対照とは統計的に異なっている。 図２４は、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスからの、初回投与１４日週後（２週目）、追加免疫１４日後（５週目）または追加免疫３０日後（７週目）の、相同な全不活化ウイルス（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５）に対する抗体力価を示す図である。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。＊組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。 図２５は、追加免疫３０日後の、Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスからの血清抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ交差反応性を示す図である。（Ａ）全不活化ウイルスに対する抗体力価。（Ｂ）さまざまな全不活化ウイルスに対する赤血球凝集阻害力価。値は、１群当たり５匹のマウスの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表す。全群が陰性対照とは統計的に異なっている。＊対応する組換え可溶性Ｈ５と比較したｐ＜０．０５。１０未満の値はすべて、任意の値５（ｌｎに対して１．６）が与えられ、陰性とみなされる。 図２６は、植物で作られたＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の有効性を示す図である。（Ａ）インフルエンザ株Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１）の１０００ ＬＤ５０（４．０９×１０６ ＣＣＩＤ５０）による免疫誘発後のマウスの生存率。（Ｂ）免疫誘発後の免疫化マウスの体重。値は生存マウスの平均体重である。 図２７は、植物に由来するインフルエンザＶＬＰの由来を示す図である。（Ａ）精製インフルエンザＶＬＰの極性脂質組成物。タンパク質４０μｇ当量に含有された脂質が、記載の通りＶＬＰから抽出され、ＨＰ−ＴＬＣにより分離され、および高度に精製されたタバコ原形質膜（ＰＭ）から単離された脂質の移動プロファイルと比較された。脂質の略号は以下の通りである：ＤＧＤＧ、ジガラクトシルジアシルグリセロール；ｇｌｕＣＥＲ、グルコシル−セラミド；ＰＡ、リン酸；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＳＧ、ステリル−グリコシド。（Ｂ）精製インフルエンザＶＬＰの中性脂質組成物。タンパク質２０μｇ当量に含有された脂質が、記載の通りＶＬＰから抽出され、ＨＰ−ＴＬＣにより分離され、およびシトステロールの移動と比較された。（Ｃ）精製ＶＬＰおよびタバコ葉に由来する高度に精製されたＰＭ（ＰＭＬ）およびＢＹ２タバコ細胞（ＰＭＢＹ２）における原形質膜マーカープロトンポンプＡＴＰａｓｅ（ＰＭＡ）の免疫検出。１８マイクログラムのタンパク質が各レーンに添加された。 図２８は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）のクローン７７４ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３６）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図２９は、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）のクローン７７５ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３７）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３０は、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）のクローン７７６ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３８）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３１は、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）のクローン７７７ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号３９）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３２は、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４のクローン７７８ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４０）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３３は、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のクローン７７９ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４１）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３４は、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）のクローン７８０ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４２）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３５は、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）のクローン７８１ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４３）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３６は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）のクローン７８２ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４４）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３７は、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のクローン７８３ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４５）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３８は、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）のクローン７８４ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４６）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図３９は、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のクローン７８５ヌクレオチド配列のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（配列番号４７）を示す図である。コード配列の両端に、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限酵素部位から開始するプラストシアニン調節領域と、３’末端のストップコドンおよびＳａｃＩ部位とが隣接している。制限酵素部位は下線付きである；ＡＴＧは太字下線付きである。 図４０Ａは、クローン７７４（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４８）を示す図である。クローン７７４のオープンリーディングフレームは、図２８に示されたＡＴＧから開始する。図４０Ｂは、クローン７７５（Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４９）を示す。クローン７７５のオープンリーディングフレームは、図２９に示されたＡＴＧから開始する。 図４１Ａは、クローン７７６（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５０）を示す図である。クローン７７６のオープンリーディングフレームは、図３０に示されたＡＴＧから開始する。図４１Ｂは、クローン７７７（Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５１）を示す。クローン７７７のオープンリーディングフレームは、図３１に示されたＡＴＧから開始する。 図４２Ａは、クローン７７８（Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５２）を示す図である。クローン７７８のオープンリーディングフレームは、図３２に示されたＡＴＧから開始する。図４２Ｂは、クローン７７９（Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５３）を示す。クローン７７９のオープンリーディングフレームは、図３３に示されたＡＴＧから開始する。 図４３Ａは、クローン７８０（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５４）を示す図である。クローン７８０のオープンリーディングフレームは、図３４に示されたＡＴＧから開始する。図４３Ｂは、クローン７８１（Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５５）を示す。クローン７８１のオープンリーディングフレームは、図３５に示されたＡＴＧから開始する。 図４４Ａは、クローン７８２（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５６）を示す図である。クローン７８２のオープンリーディングフレームは、図３６に示されたＡＴＧから開始する。図４４Ｂは、クローン７８３（Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５７）を示す。クローン７８３のオープンリーディングフレームは、図３７に示されたＡＴＧから開始する。 図４５Ａは、クローン７８４（Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５８）を示す図である。クローン７８４のオープンリーディングフレームは、図３８に示されたＡＴＧから開始する。図４５Ｂは、クローン７８５（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５９）を示す。クローン７８５のオープンリーディングフレームは、図３９に示されたＡＴＧから開始する。 図４６は、サイズ排除クロマトグラフィー後の、植物で生産されたＶＬＰ溶出画分７〜１７の免疫検出（ウェスタンブロット）を示す図である。ブルーデキストランの溶出ピーク（画分１０）が矢印で示されている。赤血球凝集素亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６およびＨ９が示される。赤血球凝集素はＶＬＰ溶出に対応する画分７〜１４で検出される。 図４７は、毎年の流行株に由来する赤血球凝集素シリーズの発現の免疫ブロット分析を示す図である。さまざまなインフルエンザ株（免疫ブロットの一番上に示されている）に由来するＨＡを発現する植物に対し、１０および２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。 図４８Ａは、潜在的パンデミック株に由来するＨ５赤血球凝集素シリーズの発現の免疫ブロット分析を示す図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。図４８Ｂは、選択されたインフルエンザ株に由来するＨ２、Ｈ７およびＨ９赤血球凝集素の発現の免疫ブロット分析を示す。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。 図４８Ａは、潜在的パンデミック株に由来するＨ５赤血球凝集素シリーズの発現の免疫ブロット分析を示す図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。図４８Ｂは、選択されたインフルエンザ株に由来するＨ２、Ｈ７およびＨ９赤血球凝集素の発現の免疫ブロット分析を示す。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物が、それぞれレーン１および２に添加された。 図４９は、ＡＧＬ１／６６０でアグロインフィルトレーションされた、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ葉からのタンパク質抽出物における株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５の免疫ブロットを示す図である。２つの植物植物（植物１および植物２）がインフィルトレーションされ、各植物から抽出された１０および２０μｇの可溶性タンパク質が、それぞれレーン１および２に添加された。 図５０は、血清抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ交差反応性を示す図である。（Ａ）最初の免疫化１４日後および（Ｂ）植物で作られたインフルエンザＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））による２回目の追加免疫１４日後の、フェレット血清における赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価。ＨＡＩ抗体反応は、次の不活化全Ｈ５Ｎ１ウイルス：Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４、Ａ／Ａｎｈｕｉ／５／０５および相同株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５を用いて測定された。値は、１群当たり５匹のフェレットの逆数エンドポイント力価のＧＭＴ（ｌｏｇ２）である。斜線−Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／６／０６（クレード２．１．３）；格子縞−Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（クレード２．２）；白いバー−Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（クレード１）；黒いバー−Ａ／Ａｎｈｕｉ／５／０５。レスポンダーが示されている。バーは平均偏差を表す。 図５１は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５（構築物＃６６０）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６０）を示す図である。 図５２は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に由来するＨ１（構築物＃５４０）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６１）を示す図である。 図５３は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１（構築物＃７７４）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６２）を示す図である。 図５４は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨ１（構築物＃７７５）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６３）を示す図である。 図５５は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）に由来するＨ２（構築物＃７８０）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６４）を示す図である。 図５６は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨ５（構築物＃７８１）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６５）を示す図である。 図５７は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨ５（構築物＃７８２）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６６）を示す図である。 図５８は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）に由来するＨ６（構築物＃７８３）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６７）を示す図である。 図５９は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）に由来するＨ９（構築物＃７８５）の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６８）を示す図である。 図６０は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）に由来するＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号６９）を示す図である。 図６１は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）に由来するＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７０）を示す図である。 図６２は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）に由来するＨ７の赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７１）を示す図である。 図６３は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４に由来するＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７２）を示す図である。 図６４は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号７３）を示す図である。 図６５は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３によってコードされる）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４８）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４９）および配列番号９のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号７４）を示す図である。Ｘ１（３位）はＡまたはＶ；Ｘ２（５２位）はＤまたはＮ；Ｘ３（９０位）はＫまたはＲ；Ｘ４（９９位）はＫまたはＴ；Ｘ５（１１１位）はＹまたはＨ；Ｘ６（１４５位）はＶまたはＴ；Ｘ７（１５４位）はＥまたはＫ；Ｘ８（１６１位）はＲまたはＫ；Ｘ９（１８１位）はＶまたはＡ；Ｘ１０（２０３位）はＤまたはＮ；Ｘ１１（２０５位）はＲまたはＫ；Ｘ１２（２１０位）はＴまたはＫ；Ｘ１３（２２５位）はＲまたはＫ；Ｘ１４（２６８位）はＷまたはＲ；Ｘ１５（２８３位）はＴまたはＮ；Ｘ１６（２９０位）はＥまたはＫ；Ｘ１７（４３２位）はＩまたはＬ；Ｘ１８（４８９位）はＮまたはＤ。 図６６は、配列番号３３によってコードされるＨ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（ＡＡＰ３４３２４．１）のアミノ酸配列（配列番号７５）を示す図である。 図６７は、配列番号３５によってコードされるＨ１ Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ（ＮＣ＿０４０９８７８．１）のアミノ酸配列（配列番号７６）を示す図である。 図６８は、ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号８２８の一部の核酸配列を示す図である。ＣＰＭＶ ＨＴ ５’ＵＴＲ配列が、変異したＡＴＧで下線されている。ＡｐａＩ制限酵素認識（このケースＣ５−１カッパ軽鎖では、発現されるタンパク質コード配列のＡＴＧのすぐ上流。） 図６９は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号６６３の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来）コード配列は下線付きである。 図７０は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７８７の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ１（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７由来）コード配列は下線付きである。 図７１は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７９０の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ３（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７由来）コード配列は下線付きである。 図７２は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンプロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７９８の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合した、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６由来ＨＡコード配列は下線付きである。 図７３は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号５８０の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９由来）のコード配列は下線付きである。 図７４は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号６８５の一部の核酸配列を示す図である。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５のコード配列は下線付きである。 図７５は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号６８６の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５のコード配列は下線付きである。 図７６は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３２の一部の核酸配列を示す図である。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１のコード配列は下線付きである。 図７７は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３３の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１のコード配列は下線付きである。 図７８は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３５の一部の核酸配列を示す図である。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３のコード配列は下線付きである。 図７９は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３６の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３のコード配列は下線付きである。 図８０は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３８の一部の核酸配列を示す図である。Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡのコード配列は下線付きである。 図８１は、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号７３９の一部の核酸配列を示す図である。ＰＤＩ ＳＰと融合したＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡのコード配列は下線付きである。 図８２は、Ｍｓｊ１をコードする核酸配列（配列番号１１４）を示す図である。 図８３は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８５０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ４０コード配列は下線付きである。 図８４は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８６０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ７０コード配列は下線付きである。 図８５は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ４０コード配列の両端に下線されたイタリック体であり、およびＨＳＰ７０コード配列は下線付きである。Ａ）ヌクレオチド１〜５００３；Ｂ）ヌクレオチド５００４〜９４９３。 図８５は、ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの構築物番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示す図である。ＨＳＰ４０コード配列の両端に下線されたイタリック体であり、およびＨＳＰ７０コード配列は下線付きである。Ａ）ヌクレオチド１〜５００３；Ｂ）ヌクレオチド５００４〜９４９３。 図８６は、構築物Ｒ４７２の概略図を示す図である。 図８７は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに由来するシグナルペプチドを用いたＨＡの発現の免疫ブロット分析を示す図である。５マイクログラムが使用されたＨ１（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））を除いて、３つの別個の植物から得られた２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加された。示された対照（相同株の全不活化ウイルス（ＷＩＶ））は、５または２０マイクログラムの疑似インフィルトレーションされた植物においてスパイクされた。ａ）Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９に由来するＨ１の発現、ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１の発現、ｃ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３の発現、ｄ）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５の発現、ｅ）Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡの発現。矢印は、ＨＡ０に対応する免疫バンドを示す。ＳＰ ＷＴ：天然シグナルペプチド、ＰＳ ＰＤＩ：アルファルファＰＤＩシグナルペプチド。 図８８は、葉タンパク質抽出物の免疫ブロット分析によるＨＡ発現戦略の比較を示す図である。ＨＡは、プラストシアニン−またはＣＰＭＶ−ＨＴベースのカセットを用いて生産された。ＣＰＭＶ−ＨＴについては、野生型ＨＡシグナルペプチドおよびアルファルファＰＤＩに由来するシグナルペプチドも比較された。分析されたＨＡ亜型については、５マイクログラムのタンパク質が添加されたＨ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａを除いて、２０μｇのタンパク質抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加された。ａ）Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に由来するＨ１の発現、ｂ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１の発現、ｃ）Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３の発現、ｄ）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５の発現、およびｅ）Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＢの発現。矢印は、ＨＡ０に対応する免疫バンドを指す；ＨＡ発現に使用される特定のベクターを含む特定のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株がレーンの一番上に示されている。 図８９は、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０と共発現された場合のＨＡ蓄積の免疫ブロットを示す図である。Ｈ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（ＡＧＬ１／５４０）およびＨ３ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（ＡＧＬ１／７９０）は、単独で発現またはＡＧＬ１／Ｒ８７０と共発現された。ＨＡ蓄積レベルは、インフィルトレーションされた葉に由来するタンパク質抽出物の免疫ブロット分析により評価された。株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９またはＢｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７の全不活化ウイルス（ＷＩＶ）が対照として使用された。
本発明はウイルス様粒子の生産に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の生産に関する。
以下の説明は、好ましい実施形態についてである。
本発明は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスに由来する抗原、例えばインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
さらに、本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法を提供する。本方法は、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を植物または植物の部分に導入すること、および核酸の発現を可能にする条件下で植物または植物の部分をインキュベートし、それによりＶＬＰを生産することに関する。
ＶＬＰは、インフルエンザウイルスから生産することできるが、ＶＬＰは、これらに限定されないが、麻疹、エボラ、マールブルク、およびＨＩＶを含む他の原形質膜由来ウイルスから生産することもできる。
本発明は、例えば、これらに限定されないが、以下を含むヒトに感染することができるすべての型のインフルエンザウイルスのＶＬＰを含む：非常に蔓延しているＡ（Ｈ１Ｎ１）亜型（例えばＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（配列番号６０）、およびそれほど一般的でないＢ型（例えば配列番号２６、図１０Ｏ）、およびＣ型（配列番号２７、図１０Ｐ）、および他のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡ。他のインフルエンザ亜型のＶＬＰも本発明に含まれ、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１；配列番号４８）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１；配列番号４９）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２；配列番号５４）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１；配列番号５５）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；配列番号５６）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１；配列番号５７）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２；配列番号５９）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２；配列番号５０）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２；配列番号５１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７；配列番号５８）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（配列番号５２）、またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（配列番号５３）である。
本発明は、他の哺乳類または宿主動物、例えばヒト、霊長類、ウマ、ブタ、鳥、トリ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ、犬、ネコ、猫、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ムナジロテン、フェレット、ハウスペット、家畜、マウス、ラット、アシカ、クジラなどに感染するインフルエンザウイルスにも関する。
原形質膜由来ウイルスで発現することができる他の抗原の非限定的な例には、ＨＩＶのカプシドタンパク質−ｐ２４；ｇｐ１２０、ｇｐ４１−エンベロープタンパク質、構造タンパク質ＶＰ３０およびＶＰ３５；フィロウイルス、例えばエボラまたはマールブルクのＧｐ／ＳＧＰ（グリコシル化内在性膜タンパク質）、またはパラミクソウイルス、例えば麻疹のＨタンパク質およびＦタンパク質が含まれる。
本発明は、これらに限定されないが、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質エンベロープを取得するインフルエンザ由来ＶＬＰも含まれる。例えば、ＶＬＰが植物に基づく系で発現される場合、ＶＬＰは細胞の原形質膜から脂質エンベロープを取得することができる。
一般的に、「脂質」という用語は、脂溶性（親油性）の、天然に存在する分子を指す。この用語は、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリ−、ジ−、およびモノグリセリドならびにリン脂質）、ならびに他の脂溶性ステロール含有代謝産物またはステロールをより具体的に指すためにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロール、およびタンパク質と共に、あらゆる生体膜の主成分である。リン脂質の例には、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどが含まれる。ステロールの例には、動物ステロール（例えばコレステロール）および植物ステロール（例えばシトステロール）およびステリル−グルコシドが含まれる。２００種を超える植物ステロールが、種々の植物種で同定されており、最も一般的なものは、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラジカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロール、またはβ−シトステロールである。当業者であれば理解するであろうように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞または細胞が取得される生物の培養または成長条件に応じて変動する場合がある。
細胞膜は、一般的に、脂質二分子膜ならびに種々の機能を果たすタンパク質を含む。特定の脂質の局所的集中が、脂質二分子膜に見出される場合があり、「脂質ラフト」と呼ばれている。理論により束縛されることは望まないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の伝染性因子の進入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞内および細胞外マトリックスなどの細胞または生物の他の構造構成要素との相互作用に重要な役割を果たしている可能性がある。
インフルエンザウイルスに関して、「赤血球凝集素」または「ＨＡ」という用語は、本明細書中で使用される場合、インフルエンザウイルス粒子の外部に見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、一般的に、シグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、およびＣ末端膜の貫通アンカー部位および小型細胞質尾部を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体膜Ｉ型糖タンパク質である（図１Ｂ）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知および入手可能であり、例えば、両方が参照により本明細書に組み込まれる、生体防御公衆衛生データベース（ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｂａｓｅ）（インフルエンザウイルス；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照）または国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）を参照されたい。
「ホモ三量体」または「ホモ三量体の」という用語は、オリゴマーが、３つのＨＡタンパク質分子によって形成されていることを示す。理論により束縛されることは望まないが、ＨＡタンパク質は、約７５ｋＤａのモノマー前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、表面で構築されて細長い三量体タンパク質になる。三量体化が生じる前に、前駆体タンパク質は、保存された活性化切断部位（融合ペプチドとも呼ばれる）で切断されて、ジスルフィド結合により連結された２つのポリペプチド鎖、ＨＡ１およびＨＡ２（膜貫通領域を含む）になる。ＨＡ１セグメントは、長さが３２８アミノ酸であってもよく、ＨＡ２セグメントは長さが２２１アミノ酸であってもよい。この切断は、ウイルス感染性に重要である場合があるが、タンパク質の三量体化には不可欠ではない場合がある。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内へのＨＡの挿入、シグナルペプチド切断、およびタンパク質グリコシル化は、共翻訳事象である。ＨＡの正しいリフォールディングには、タンパク質のグリコシル化および６つの鎖内ジスルフィド結合の形成が必要である。ＨＡ三量体は、シスおよびトランスゴルジ複合体内で構築され、膜貫通ドメインは、三量体化プロセスに役割を果たす。膜貫通ドメインを欠くブロメライン処理ＨＡタンパク質の結晶構造は、インフルエンザ菌株の中で高度に保存された構造を示している。ＨＡは感染プロセス中に大きな構造変化を起こし、それは前駆体ＨＡ０が切断されて２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２になるのに必要であることも確立されている。ＨＡタンパク質は、プロセシングされてもよく（つまり、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインを含む）、またはプロセシングされなくともよい（つまり、ＨＡ０ドメインを含む）。
本発明は、膜貫通ドメインを含むＨＡタンパク質の使用に関し、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインを含み、例えば、ＨＡタンパク質はＨＡ０であってもよく、またはＨＡ１およびＨＡ２を含むプロセシングされたＨＡであってもよい。ＨＡタンパク質は、植物または植物細胞発現系を使用するＶＬＰの生産または形成に使用することができる。
本発明のＨＡは、任意の亜型から取得することができる。例えば、ＨＡは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６であってもよく、またはＢ型インフルエンザのものであってもよい。本発明の組換えＨＡは、当技術分野で公知である任意の赤血球凝集素の配列に基づくアミノ酸配列を含むこともできる。例えば、生体防御公衆衛生データベース（インフルエンザウイルス；ＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇを参照）または国立バイオテクノロジー情報センター（ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）を参照されたい。さらに、ＨＡは、１つまたは複数の顕現性インフルエンザウイルスまたは新たに同定されたインフルエンザウイルスから単離される赤血球凝集素の配列に基づいていてもよい。
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡを含むＶＬＰも含む。例えば、ＶＬＰは、以下のものに由来する１つまたは複数のＨＡを含んでいてもよい：亜型Ｈ１（配列番号２８によってコードされる）、Ｈ２（配列番号１２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号１３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号１４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号１５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号１６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号１１によってコードされる）、Ｈ８（配列番号１７によってコードされる）、Ｈ９（配列番号１８によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号１９によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号２０によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号２１によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号２７によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号２３によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号２４によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号２５によってコードされる）、またはＢ型インフルエンザ（配列番号２６によってコードされる）、またはそれらの組合せ。１つまたは複数のインフルエンザ亜型に由来する１つまたは複数のＨＡを、植物または昆虫細胞内で共発現させて、１つまたは複数のＨＡの合成が、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡの組合せを含むＶＬＰの形成に帰着することを確実にすることができる。ＨＡの組合せの選択は、ＶＬＰから調製されたワクチンの使用目的によって決定されてもよい。例えば、トリへの接種に使用されるワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組合せを含んでいてもよく、その一方でヒト接種に有用なＶＬＰは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、およびＮ７のうちの１つまたは複数の亜型を含んでいてもよい。しかしながら、接種材料の使用に依存して、他のＨＡ亜型の組合せが調製されてもよい。
したがって、本発明は、１つまたは複数のＨＡ亜型、例えば２、３、４、５または６つ以上のＨＡ亜型を含むＶＬＰに関する。
本発明は、植物で発現された際にＶＬＰを形成する赤血球凝集素をコードする核酸も提供する。
典型的な核酸は、インフルエンザ亜型の選択された菌株に由来する赤血球凝集素のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。例えば、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３）などのＡ（Ｈ１Ｎ１）亜型、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（構築物＃６６０を含む；配列番号６０）、およびそれほど一般的でないＢ型（例えば、配列番号２６、図１０Ｏ）、およびＣ型（配列番号２７、図１０Ｐ）、および他のインフルエンザ亜型から取得されるＨＡ。他のインフルエンザ亜型のＶＬＰも、本発明に含まれ、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１；配列番号３６）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１；配列番号３７）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２；配列番号４２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１；配列番号４３）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１；配列番号４４）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１；配列番号４５）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２；配列番号４７）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２；配列番号３８）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２；配列番号３９）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７；配列番号４６）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（配列番号４０）、またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（配列番号４１）である。
赤血球凝集素の正しいフォールディングは、インフルエンザ赤血球凝集素の他の特徴の中でも、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、およびＨＡの機能（赤血球凝集能力）にとって重要である場合がある。タンパク質のフォールディングは、これらに限定されないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集度、フォールディングした、部分的にフォールディングした、もしくはアンフォールディングしたタンパク質に結合もしくは一時的に結合することができる補助因子の利用可能性、または１つもしくは複数のシャペロンタンパク質の存在などの、１つまたは複数の要因により影響を受ける場合がある。
ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、タンパク質合成、細胞内輸送、ミスフォールディングの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体の構築および分解、タンパク質フォールディング、およびタンパク質脱凝集を含む種々の細胞プロセスに関与している場合がある。そのようなシャペロンタンパク質の例には、これらに限定されないが、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０〜３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００〜２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、サイクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼが含まれる。例えば、Ｍａｃａｒｉｏ， Ａ．Ｊ．Ｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓ．２５巻：５９〜７０頁、１９９５年；Ｐａｒｓｅｌｌ， Ｄ．Ａ． ＆ Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， Ｓ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．２７巻：４３７〜４９６頁（１９９３年）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照されたい。いくつかの例では、シャペロンタンパク質の特定の群には、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０が含まれる。
Ｈｓｐ７０の例には、哺乳動物細胞に由来するＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特にＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓなどのミコバクテリアに由来するＤｎａＫ（Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎなどの：本明細書中ではＨｓｐ７ｌと呼ぶ）が含まれる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、酵母、および他の原核生物に由来するＤｎａＫ、ならびにＡ．ｔｈａｌｉａｎａなどの真核生物に由来するＢｉＰおよびＧｒｐ７８（Ｌｉｎら、２００１年（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ
Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ６巻：２０１〜２０８頁））。Ｈｓｐ７０の特定の例は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ Ｈｓｐ７０（配列番号１２２または配列番号１２３によってコードされる）である。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰならびにアンフォールディングしたポリペプチドおよびペプチドと特異的に結合可能であり、それによりタンパク質のフォールディングおよびアンフォールディング、ならびにタンパク質複合体の構築および分解に関与する。
Ｈｓｐ４０の例には、Ｅ．ｃｏｌｉおよびミコバクテリアなどの原核生物に由来するＤｎａＪ、ならびにアルファルファなどの真核生物に由来するＨＳＪ１、ＨＤＪｌ、およびＨｓｐ４０が含まれる（Ｆｒｕｇｉｓら、１９９９年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻：３９７〜４０８頁）。Ｈｓｐ４０の特定の例は、Ｍ．ｓａｔｉｖａ ＭｓＪ１（配列番号１２１、１２３、または１１４によってコードされる）である。Ｈｓｐ４０は、分子シャペロンとして、他の細胞活性の中でも、タンパク質のフォールディング、熱耐性、およびＤＮＡ複製に役割を果たす。
Ｈｓｐの中でも、Ｈｓｐ７０およびそのコシャペロンＨｓｐ４０は、合成が完了する前の翻訳中である新規合成ポリペプチドの安定化に関与する。理論により束縛されることは望まないが、Ｈｓｐ４０は、アンフォールディングしている（新生、または新たに移動してきた）ポリペプチドの疎水性パッチに結合し、したがってＨｓｐ７０−ＡＴＰ複合体とポリペプチドとの相互作用を容易にする。ＡＴＰの加水分解は、ポリペプチドとＨｓｐ７０とＡＤＰとの間の安定した複合体の形成、およびＨｓｐ４０の放出に結びつく。ポリペプチドの疎水性パッチとＨｓｐ７０−ＡＤＰ複合体が結合すると、他の疎水性パッチとのそれらの相互作用が防止され、正しくないフォールディングおよび他のタンパク質との凝集体の形成が防止される（Ｈａｒｔｌ， ＦＵ．、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ ３８１巻：５７１〜５７９頁）。
また、理論により束縛されることは望まないが、組換えタンパク質発現系でのタンパク質産生が増加すると共に、組換えタンパク質発現に対する込み合い効果は、ミスフォールディングしたポリペプチドの凝集および／または分解に起因する組換えタンパク質の蓄積低減に帰着する場合がある。天然シャペロンタンパク質は、低レベルの組換えタンパク質の正しいフォールディングを容易にすることができる場合があるが、発現レベルが増加すると共に、天然シャペロンが限定要因になる場合がある。アグロインフィルトレーションされた（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ）葉中での赤血球凝集素の高レベル発現は、細胞質ゾルの赤血球凝集素ポリペプチドの蓄積に結びつく場合があり、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０、またはＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０の両方などの１つまたは複数のシャペロンタンパク質の共発現は、ポリペプチド細胞を発現する細胞の細胞質ゾル中での安定性を増加させることができ、したがってミスフォールディングまたは凝集した赤血球凝集素ポリペプチドのレベルを低減させること、およびポリペプチドの数を増加させることにより、赤血球凝集および／またはウイルス様粒子の形成を可能にする三次および四次構造の特徴を示す安定した赤血球凝集素が蓄積する。
したがって、本発明は、植物中でインフルエンザＶＬＰを生産する方法であって、インフルエンザＨＡをコードする第１の核酸が、シャペロンをコードする第２の核酸と共発現される方法も提供する。第１および第２の核酸は、同じステップにおいて植物に導入されてもよく、または順次植物に導入されてもよい。本発明は、植物中でインフルエンザＶＬＰを生産する方法であって、植物が第１の核酸を含み、第２の核酸がその後導入される方法も提供する。
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ赤血球凝集素をコードする核酸および１つまたは複数のシャペロンをコードする核酸を含む植物も提供する。
インフルエンザ赤血球凝集素の発現および／または分泌中のＮ末端シグナルペプチド（ＳＰ）配列のプロセシングは、フォールディングプロセスに役割を有することが提唱されている。「シグナルペプチド」という用語は、一般的に、新たに翻訳されたポリペプチドの特定細胞小器官への移動を指示することができるか、またはポリペプチドの特異的ドメインの位置決めを支援することができる赤血球凝集素ポリペプチドのＮ末端で一般的に見出されるアミノ酸の短い配列（約５〜３０個のアミノ酸）を指す。赤血球凝集素のシグナルペプチドは、小胞体へのタンパク質の移動を標的としており、Ｎ末端近位ドメインを新生赤血球凝集素ポリペプチドの膜アンカードメインに対して位置決めすることを支援して、成熟赤血球凝集素の切断およびフォールディングを支援すると提唱されている。シグナルペプチドの除去には（例えばシグナルペプチダーゼによる）、シグナルペプチドを正確に切断および除去して成熟赤血球凝集素を提供することが必要である場合があり、この正確な切断は、シグナルペプチドの部分もしくは全体、切断部位に隣接するアミノ酸配列、シグナルペプチドの長さ、またはこれらの組合せを含むいくつかの要因のいずれかに依存する場合があり、すべての要因が所与の配列に当てはまらなくてもよい。
シグナルペプチドは、発現されている赤血球凝集素に天然であってもよく、または組換え赤血球凝集素は、第１のインフルエンザ型、亜型、または菌株に由来するシグナルペプチドを、第２のインフルエンザ型、亜型、または菌株に由来する赤血球凝集素との均衡を保ちながら含む。例えば、ＨＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９、またはＢ型インフルエンザの天然ＳＰを、植物系でのＨＡ発現に使用することができる。
また、シグナルペプチドは非天然であってもよく、例えばインフルエンザ以外のウイルスの構造タンパク質または赤血球凝集素に由来するか、または植物、動物、もしくは細菌ポリペプチドに由来してもよい。典型的なシグナルペプチドは、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）（受託番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３；配列番号３４；図１７；アミノ酸配列ＭＡＫＮＶＡＩＦＧＬＬＦＳＬＬＬＬＶＰＳＱＩＦＡＥＥ）のシグナルペプチドである。
本発明は、天然または非天然シグナルペプチドを含むインフルエンザ赤血球凝集素、およびそのような赤血球凝集素をコードする核酸も提供する。
インフルエンザＨＡタンパク質は、分子量、等電点、サイズ、およびグリカン相補体などに関して、さまざまな範囲の類似性および差異を示す。種々の赤血球凝集素の物理化学的特性は、植物、昆虫細胞、または酵母系で発現されたＨＡ間の区別を可能にするのに有用であり得、複数のＨＡが単一の系で共発現される場合は特に有用であり得る。そのような物理化学的特性の例は、表１に提供されている。
本発明は、Ｈ１、Ｈ５、またはＨ７に由来するＨＡをコードするヌクレオチド配列、配列番号２８、配列番号３、配列番号１１も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２８、配列番号３、配列番号１１とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２８、配列番号３、配列番号１とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。配列番号にハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列または配列番号の相補体は、発現時にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは対象への投与時に抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、１つまたは複数のインフルエンザ型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
本発明は、以下のヌクレオチド配列も含む：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものとハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。以下のものにハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは対象への投与時に抗体の産生を誘導する：配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７、または配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７の相補体。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、１つまたは複数のインフルエンザ型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下のヌクレオチド配列も含む：Ａ型インフルエンザのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９亜型に由来するＨＡ、またはＢ型インフルエンザに由来するＨＡをコードする配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものとハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、以下のものの相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む：配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７。以下のものにハイブリダイズするこれらのヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは対象への投与時に抗体の産生を誘導する：配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７、または配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、もしくは配列番号４７の相補体。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、１つまたは複数のインフルエンザ型または亜型の成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下のハイブリダイゼーションは、当技術分野で公知である（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年および増補；Ｍａｎｉａｔｉｓら、ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版２００１年）。１つのそのようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃で約１６〜２０時間４×ＳＳＣでハイブリダイゼーションし、その後６５℃で１時間０．１×ＳＳＣで洗浄、または６５℃で各々２０分もしくは３０分間０．１×ＳＳＣで２回洗浄してもよい。あるいは、典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣで４２℃終夜（１６〜２０時間）、その後６５℃で１時間０．１×ＳＳＣで洗浄、または６５℃で各々２０分もしくは３０分間または終夜（１６〜２０時間）０．１×ＳＳＣで２回洗浄、あるいは、Ｃｈｕｒｃｈ社製リン酸緩衝水溶液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ
ＮａＰＯ４緩衝液 ｐＨ７．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中６５℃でハイブリダイゼーションし、５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０もしくは３０分間各々洗浄、または６５℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０もしくは３０分間各々２回洗浄であってもよい。
加えて、本発明は、Ｈ１（配列番号２８）、Ｈ５（配列番号３）、またはＨ７（配列番号１１）に由来するＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
加えて、本発明は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
加えて、本発明は、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７のヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％、またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
同様に、本発明は、以下の亜型Ｈ１（配列番号２８によってコードされる）、Ｈ２（配列番号１２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号１３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号１４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号１５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号１６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号１１によってコードされる）、Ｈ８（配列番号１７によってコードされる）、Ｈ９（配列番号１８によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号１９によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号２０によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号２１によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号２７によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号２３によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号２４によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号２５によってコードされる）、またはＢ型インフルエンザ（配列番号２６によってコードされる）；（図１０Ａ〜１０Ｏを参照）と結合するＨＡを含み、ならびにＨ１（配列番号２８）、Ｈ２（配列番号１２）、Ｈ３（配列番号１３）、Ｈ４（配列番号１４）、Ｈ５（配列番号１５）、Ｈ６（配列番号１６）、Ｈ７（配列番号１１）、Ｈ８（配列番号１７）、Ｈ９（配列番号１８）、Ｈ１０（配列番号１９）、Ｈ１１（配列番号２０）、Ｈ１２（配列番号２１）、Ｈ１３（配列番号２７）、Ｈ１４（配列番号２３）、Ｈ１５（配列番号２４）、Ｈ１６（配列番号２５）と、約７０〜１００％およびその間の任意の量、８０〜１００％およびその間の任意の量、９０〜１００％およびその間の任意の量、または９５〜１００％およびその間の任意の量の配列同一性を有することを特徴とするヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現時にＶＬＰ形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現によりＶＬＰが形成され、そのＶＬＰを使用して、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２を含むＨＡに結合可能な抗体を産生させることができる。ＶＬＰは、対象への投与時に免疫応答を誘導する。
「免疫応答」は、一般的に適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は、一般的に、体液性応答および細胞性応答を含む。体液性応答は、Ｂリンパ球系統（Ｂ細胞）の細胞で産生される抗体の分泌によって媒介される免疫の態様である。分泌された抗体は、侵入微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面にある抗原と結合し、それらに破壊用の目印をつける。体液性免疫は、一般的に、抗体産生およびそれに伴うプロセス、ならびにＴｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生を含む抗体のエフェクター機能、記憶細胞産生、食作用のオプソニン亢進、および病原体除去などを参照するために使用される。「調節する」または「調節」などという用語は、それらのいくつかが本明細書中で例示されている一般的に公知または使用されているいくつかのアッセイにより決定されるような、特定の応答またはパラメーターの増加または減少を指す。
細胞性応答は、抗体を伴わないが、むしろ抗原に応答してマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異性的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および種々のサイトカインの放出を伴う免疫応答である。細胞性免疫は、一般的に、ある程度のＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化、およびＴ細胞媒介性応答に言及するために使用される。細胞性免疫は、ウイルス感染に応答する際に特定に重要である。
例えば、抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔリンパ球の誘導は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して測定することができ、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の刺激は、増殖アッセイを使用して測定することができる。抗インフルエンザ抗体の力価は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量することができ、抗原特異的または交差反応性抗体のアイソタイプは、抗アイソタイプ抗体（例えば、抗ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）を使用して測定することもできる。そのようなアッセイを実施する方法および技術は、当技術分野において周知である。
赤血球凝集阻害（ＨＩ、またはＨＡＩ）アッセイを使用して、ワクチンまたはワクチン組成物により誘導された抗体の効力が、組換えＨＡによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集反応を阻害することができることを実証することもできる。血清試料の血球凝集阻害性抗体力価は、マイクロタイターＨＡＩにより評価することができる（Ａｙｍａｒｄら、１９７３年）。例えば、ウマ、シチメンチョウ、またはニワトリなど、いくつかの種のいずれかに由来する赤血球を使用することができる。このアッセイは、ＶＬＰ表面でのＨＡ三量体構築に関する間接的な情報をもたらし、ＨＡの抗原性部位の適切な提示を確認する。
交差反応ＨＡＩ力価を使用して、ワクチン亜型と関係するウイルスの他の菌株に対する免疫応答の効力を実証することもできる。例えば、第１の菌種のワクチン組成物（例えば、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ５／０５のＶＬＰ）で免疫された対象に由来する血清を、第２の菌株（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４）の全ウイルスまたはウイルス粒子と共にＨＡＩアッセイで使用し、ＨＡＩ力価を決定することができる。
サイトカインの存在またはレベルを定量化することもできる。例えば、Ｔヘルパー細胞応答（Ｔｈ１／Ｔｈ２）は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社ＯｐｔＥＩＡキット）を使用してＩＦＮ−γおよびＩＬ−４分泌細胞を測定することにより特徴づけられるだろう。対象から得られる末梢血単核球（ＰＢＭＣ）または脾細胞を培養し、上清を分析することができる。Ｔリンパ球は、マーカー特異的蛍光標識および当技術分野で公知の方法を使用して、蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）により定量化することもできる。
マイクロ中和アッセイを実施して、対象における免疫応答を特徴づけることもできる。例えば、Ｒｏｗｅら、１９７３年の方法を参照されたい。ウイルス中和力価は、以下を含むいくつかの方法で取得することができる：１）細胞のクリスタルバイオレット固定／着色後の溶解プラークの計数（プラーク検定）；２）培養中の細胞融解に関する微視的観察；３）ＮＰウイルスタンパク質（宿主細胞のウイルス感染と相関する）のＥＬＩＳＡおよび分光光度的な検出。
配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されているものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して（例えば、これらに限定されないが、以下のパラメーターを使用して：ギャップペナルティ ５、トップ対角線の数（＃ ｏｆ ｔｏｐ ｄｉａｇｏｎａｌｓ）５、固定ＧＡＰペナルティ １０、ｋ−タプル ２、遊動ギャップ １０、および窓サイズ ５）決定することができる。しかしながら、比較用の配列アラインメントの他の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２巻：４８２頁）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻：４４３頁、１９７０年）、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁）のアルゴリズムであり、これらのアルゴリズムのコンピューター化実装（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＡＳＴ）により、または手動アラインメントおよび目視検査による。
「赤血球凝集素ドメイン」という用語は、ＨＡ０ドメイン、またはＨＡ１およびＨＡ２ドメイン（あるいはＨＡ１およびＨＡ２断片と呼ばれる）のいずれかを含むペプチドを指す。ＨＡ０は、ＨＡ１およびＨＡ２断片の前駆体である。ＨＡモノマーは、一般的に、２つの機能的ドメイン、基部ドメインおよび球状頭部または頭部ドメインに細分化することができる。基部ドメインは、酸性ｐＨに免疫誘発されると起こす場合がある構造変化を介して、ウイルスの感染力および病原性に関与する。基部ドメインは、４つのサブドメインまたは断片：融合サブドメインまたはペプチド（酸性ｐＨ立体構造において宿主膜との融合に関与するアミノ酸の疎水性伸長）、基部サブドメイン（２つ以上の立体構造をとることができる）、膜貫通ドメインまたはサブドメイン（ＴｍＤ）（脂質ラフトに対するＨＡの親和性に関与する）、および細胞質尾部（細胞質尾部サブドメイン）（Ｃｔａｉｌ）（ＨＡの分泌に関与する）にさらに細分化することができる。球状頭部は、２つのサブドメイン、ＲＢサブドメイン、および痕跡エステラーゼドメイン（Ｅ）に分割される。Ｅサブドメインは、部分的にまたは完全に埋没しており、球状頭部の表面に露出していなくともよく、したがって、ＨＡに対するいくつかの抗体は、ＲＢサブドメインに結合する。
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）または「ウイルス様粒子（複数）」または「ＶＬＰ（複数）」という用語は、自己組織化し、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰは、一般的に、感染に際して産生されるビリオンと形態学的および抗原性的に類似するが、複製するのに十分な遺伝情報を欠除しており、したがって非感染性である。いくつかの例では、ＶＬＰは、単一タンパク質種を含んでいてもよく、または複数タンパク質種を含んでいてもよい。複数のタンパク質種を含むＶＬＰの場合、タンパク質種は同じ種のウイルス由来であってもよく、または異なる種、属、亜科、または科のウイルス（ＩＣＴＶ命名法により命名されるような）に由来するタンパク質を含んでいてもよい。他の例では、ＶＬＰを構成するタンパク質種の１つまたは複数は、天然に存在する配列から修飾されていてもよい。ＶＬＰは、植物および昆虫宿主細胞を含む好適な宿主細胞中で生産することができる。宿主細胞からの抽出後、単離し、好適な条件下でさらに単離すると、ＶＬＰは完全な構造で精製することができる。
本発明に従ってインフルエンザ由来タンパク質から生産されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含んでいない。Ｍ１タンパク質は、ＶＬＰ調製の不純物であるＲＮＡと結合することが公知である（ＷａｋｅｆｉｅｌｄおよびＢｒｏｗｎｌｅｅ、１９８９年）。ＲＮＡの存在は、ＶＬＰ生産の規制認可を取得する場合に望ましくなく、したがって、ＲＮＡを欠くＶＬＰ調製は有利であり得る。
本発明のＶＬＰは、タンパク質にシアル酸を付加する能力を欠くことを特徴とする宿主細胞中、例えば、植物細胞、昆虫細胞、真菌、および他の生物、海綿、腔腸動物（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｒａ）、環形動物、節足動物（ａｒｔｈｏｒｏｐｏｄａ）、軟体動物、線形動物、輪形動物（ｔｒｏｃｈｅｌｍｉｎｔｅｓ）、扁形動物、毛顎動物、半索動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、または古細菌などで生産することができる。例えば、Ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ（ＵＲＬ：ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ．ｇｒ．ｊｐ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｗｏｒｄ／ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＥＳ−Ａ０３Ｅ．ｈｔｍｌ）；またはＧｕｐｔａら、１９９９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７巻：３７０〜３７２頁；またはＴｏｕｋａｃｈら、２００７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３５巻：Ｄ２８０〜Ｄ２８６頁；またはＵＲＬ：ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．ｊｐ（Ｎａｋａｈａｒａら、２００８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６巻：Ｄ３６８〜Ｄ３７１頁；ｄｏｉ：１０．１０９３／ＮＡＲ／ｇｋｍ８３３で２００７年１０月１１日にオンライン公表された）を参照されたい。本明細書中に記載のように生産されたＶＬＰは、典型的にはノイラミンダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｄａｓｅ）（ＮＡ）を含んでいない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望の場合、ＮＡをＨＡと共発現させることができる。
本発明のいくつかの態様により植物中で生産されたＶＬＰは、植物由来脂質と複合体化していてもよい。ＶＬＰは、ＨＡ０、ＨＡ１、またはＨＡ２ペプチドを含んでいてもよい。植物由来脂質は、脂質二分子膜の形態であってもよく、ＶＬＰを包み込むエンベロープをさらに含んでいてもよい。植物由来脂質は、植物の原形質膜の脂質成分を含んでいてもよく、その場合、これらに限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質、植物ステロール、またはそれらの組合せを含むＶＬＰが生産される。植物由来脂質は、あるいは「植物脂質」と呼ばれる場合がある。植物ステロールの例は当技術分野で公知であり、例えば、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロール、およびコレステロールが含まれる。例えば、Ｍｏｎｇｒａｎｄら、２００４年を参照されたい。
ＶＬＰは、例えば、血球凝集アッセイ、電子顕微鏡法、またはサイズ排除クロマトグラフィーにより、構造およびサイズを評価することができる。
サイズ排除クロマトグラフィーの場合、凍結粉砕された植物物質の試料を抽出緩衝液中でホモジナイズし（Ｐｏｌｙｔｒｏｎで）、不溶性物質を遠心分離により取り除くことによって、総可溶性タンパク質を植物組織から抽出することができる。ＰＥＧを用いた析出も有用であり得る。可溶性タンパク質を定量化し、抽出物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）カラムに流す。ブルーデキストラン２０００を検量基準として使用することができる。クロマトグラフィー後、画分を免疫ブロット法によりさらに分析して、画分のタンパク質補体を決定する。
理論により束縛されることは望まないが、異なる動物に由来するＲＢＣに結合するＨＡの能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡの親和性、およびＲＢＣ表面のこれらのシアル酸の存在により決定される。インフルエンザウイルスに由来するウマおよびトリＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマ、およびウシを含むいくつかの種すべてに由来する赤血球を凝集させるが、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、モルモット、ヒト、およびヒツジの赤血球に結合するだろう（Ｉｔｏ Ｔ．ら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２２７巻、４９３〜４９９頁；およびＭｅｄｅｉｒｏｓ Ｒら、２００１年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２８９巻、７４〜８５頁）。異なるインフルエンザ菌株のＨＡの種反応性の例は、表２Ａおよび２Ｂに示されている。
タンパク質、融合タンパク質、またはポリペプチドの断片または部分は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、特定のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸相補体のサブセットを含むペプチドまたはポリペプチドを含む。断片は、例えば、抗原性領域、ストレス応答誘導領域、またはタンパク質もしくはポリペプチドの機能的ドメインを含む領域を含んでいてもよい。断片は、同じ一般ファミリーのタンパク質に共通した領域またはドメインも含むこともでき、または断片は、それが由来する全長タンパク質を特異的に識別するのに十分なアミノ酸配列を含むことができる。
例えば、断片または部分は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、タンパク質の全長の長さの約６０％から約１００％まで、またはその間の任意の量を含んでいてもよい。例えば、タンパク質の全長の長さの約６０％から約１００％まで、約７０％から約１００％まで、約８０％から約１００％まで、約９０％から約１００％まで、約９５％から約１００％まで、またはその間の任意の量。あるいは、断片または部分は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、ＨＡに依存して、約１５０から約５００個のアミノ酸またはその間の任意の量であってもよい。例えば、断片は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、ＨＡに依存して、約１５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約２００から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約２５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約３００から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約３５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約４００から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量、約４５０から約５００個までのアミノ酸またはその間の任意の量であってもよい。例えば、約５、１０、２０、３０、４０、もしくは５０個のアミノ酸またはその間の任意の量は、断片が発現時にＶＬＰを形成することができれば、ＨＡのタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方から取り除かれてもよい。
任意の所与配列のアミノ酸の付番は特定の配列と比べてであるが、当業者であれば、構造および／または配列に基づき配列の特定のアミノ酸の「同等性」を容易に決定することができる。例えば、結晶学用のクローンを構築する際に、６個のＮ末端アミノ酸が取り除かれたとすると、これによりアミノ酸の特定の番号同一性が変更されるだろうが（例えばタンパク質の全長と比べて）、構造中のアミノ酸の相対的地位は変更されないだろう。
配列（複数可）の比較は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行うことができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５巻：４０３〜４１０頁）。ＢＬＡＳＴ探索により、クエリー配列を、特定の配列または配列の群と、または配列のより大きなライブラリーもしくはデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋまたはＧｅｎＰｅｐｔ）と比較することが可能であり、１００％の同一性を示す配列だけでなく、より低い度合いの同一性を有する配列も識別される。核酸またはアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して比較することができる。さらに、２つ以上の配列間の同一性は、配列を共にアラインさせ、配列間の％同一性を決定することにより決定することができる。アラインメントは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ／から利用可能なような；以下の初期設定パラメーターを使用：プログラム：ｂｌａｓｔｎ；データベース：ｎｒ；完全一致（Ｅｘｐｅｃｔ）１０；フィルター：初期設定；アラインメント：対毎；クエリー遺伝子コード：標準（１））、または初期設定パラメーター：マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２；フィルター：初期設定、エコーフィルター：オン、完全一致：１０、カットオフ：初期設定；鎖：両方；説明：５０、アラインメント：５０を使用した、ＥＭＢＬ ＵＲＬ：ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌからのＢＬＡＳＴ２；または初期設定パラメーターを使用するＦＡＳＴＡ）、または手動での配列比較および％同一性の計算によって、実行することができる。
本発明は、これらに限定されないが、ＨＡをコードする核酸を植物発現ベクターにクローニングすること、およびワクチン生産に好適な植物からインフルエンザＶＬＰを生産することを記述する。そのような核酸の例には、例えば、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：インフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ（例えば配列番号６１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号６０）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（例えば配列番号３６、４８、６２）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（例えば配列番号３７、４９、６３）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）（例えば配列番号４２、５４、６４）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号４３、５５、６５）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）（例えば配列番号４４、５６、６６）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）（例えば配列番号４５、５７、６７）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）（例えば配列番号４７、５９、６８）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）（例えば配列番号３８、５０、６９）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）（例えば配列番号３９、５１、７０）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）（例えば配列番号４６、５８、７１）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（例えば配列番号４０、５２、７２）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（例えば配列番号４１、５３、７３）。 これらの菌株の対応するクローンまたは構築物番号は、表１に提供されている。配列番号３６〜４７に対応する核酸配列は、図２８〜３９に例示されているように、型または亜型の各々のＨＡのコード配列に作動可能に連結された上流のプラストシアニンを含む。配列番号６０〜７３に対応する核酸配列は、図５１〜６４に例示されているように、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、ＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲ、ならびにターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットを含む。
ＶＬＰを使用して、形質転換された宿主細胞、例えば植物細胞または昆虫細胞において、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む機能的および免疫原性の同型巨大分子タンパク質構造へと自己組織化する組換えインフルエンザ構造タンパク質で構成される試薬を生産することもできる。
したがって、本発明は、ＶＬＰおよび、植物発現系において単一エンベロープタンパク質の発現からウイルスＶＬＰを生産するための方法を提供する。ＶＬＰは、インフルエンザＶＬＰ（複数可）あるいは、これらに限定されないが、麻疹、エボラ、マールブルク、およびＨＩＶを含む他の原形質膜由来ウイルスから生産されるＶＬＰ（複数可）であってもよい。
これらに限定されないが、当業者であれば公知であるように、以下の他のエンベロープウイルスに由来するタンパク質も使用することができる：フィロウイルス科（例えばエボラウイルスまたはマールブルグウイルスなど）、パラミクソウイルス科（例えば、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、ＲＳウイルス、またはニューモウイルスなど）、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、またはヒトＴ細胞性白血病ウイルス１など）、フラビウイルス科（例えば、西ナイル脳炎、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、または黄熱ウイルスなど）、ブンヤウイルス科（例えばハンタウイルスなど）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス、またはＳＡＲＳなど）。原形質膜由来ウイルスで発現することができる抗原の非限定的な例には、ＨＩＶのカプシドタンパク質−ｐ２４；ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０もしくはｇｐ４１、エボラウイルスのＶＰ３０およびＶＰ３５、またはマールブルクのＧｐ／ＳＧＰ、または麻疹パラミクソウイルスのＨタンパク質もしくはＦタンパク質を含むフィロウイルスタンパク質が含まれる。例えば、ＨＩＶのＰ２４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：１９１７２９４８）は、ＨＩＶウイルスゲノムのｇａｇ配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：９６２９３５７）の翻訳および切断により得られるタンパク質であり、ＨＩＶのｇｐ１２０およびｇｐ４１は、ＨＩＶウイルスゲノムのｅｎｖによってコードされるｇｐ１６０タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：９６２９３６３）の翻訳および切断により得られる糖タンパク質である。エボラウイルスのＶＰ３０（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：５５７７０８１３）は、エボラウイルスゲノムのｖｐ３０配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：５５７７０８０７）の翻訳により得られるタンパク質であり、エボラウイルスのＶＰ３５（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：５５７７０８０９）は、エボラウイルスゲノムのｖｐ３５配列の翻訳により得られるタンパク質である。マールブルグウイルスのＧｐ／ＳＧＰ（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：２９６９６５）は、マールブルグウイルスゲノムの（配列）（ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：１５８５３９１０８）の翻訳により得られるタンパク質である。Ｈタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：９６２６９５１）は、麻疹ウイルスゲノムのＨ配列（ＧｅｎＢａｎｋ参照ｇｉ：９６２６９４５）のタンパク質であり、Ｆタンパク質（ＧｅｎＰｅｐｔ参照ｇｉ：９６２６９５０）は、麻疹ウイルスゲノムのＦ配列のタンパク質である。
しかしながら、当業者であれば公知であるように、他のエンベロープタンパク質を、本発明の方法内で使用することができる。
したがって、本発明は、ＨＩＶ−ｐ２４、ＨＩＶ−ｇｐ１２０、ＨＩＶ−ｇｐ４１、エボラウイルス−ＶＰ３０、エボラウイルス−ＶＰ３５、マールブルグウイルＧｐ／ＳＧＰ、麻疹ウイルス−Ｈタンパク質または−Ｆタンパク質をコードする配列を含む核酸分子を提供する。核酸分子は、昆虫、酵母、または植物細胞において、または特定の植物組織において活性のある調節領域に作動可能に連結されていてもよい。
本発明は、ＨＡ、例えばこれらに限定されないが、ヒトインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ウイルスＨＡ（Ｈ５Ｎ１）をコードする核酸を、植物または昆虫の発現ベクター（例えば、バキュロウイルス発現ベクター）にクローニングすること、および形質転換された植物細胞または形質転換された昆虫細胞において、機能的および免疫原性の同型巨大分子タンパク質構造へと自己組織化する、サブウイルスインフルエンザ粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む組換えインフルエンザ構造タンパク質を含むインフルエンザワクチン候補または試薬の生産をさらに提供する。
インフルエンザ亜型、例えば、これらに限定されないが、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６のＨＡをコードする核酸は、例えば、適切な細胞系統、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（例えば、Ｓｆ−９細胞系統；ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４０４７）においてバキュロウイルス発現系を使用して発現することができる。他の昆虫細胞系統も使用することができる。
あるいは、ＨＡをコードする核酸は、植物細胞または植物において発現することができる。ＨＡをコードする核酸は、ＨＡ ＲＮＡを使用する逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成することができる。一例として、ＲＮＡは、ヒトインフルエンザＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスもしくはヒトインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルス、または他のインフルエンザウイルス、例えばＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６から単離されてもよく、またはインフルエンザウイルスに感染した細胞から単離されてもよい。逆転写およびＰＣＲの場合、ＨＡ ＲＮＡ、例えば、これらに限定されないが、ヒトインフルエンザＡ／Ｎｅｗ
Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ配列もしくはヒトインフルエンザＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスＨＡ０配列、またはインフルエンザ亜型Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。加えて、ＨＡをコードする核酸は、当業者であれば公知である方法を使用して、化学的に合成することができる。
その結果生じるこれらの遺伝子のｃＤＮＡコピーを、宿主発現系により必要とされる好適な発現ベクターにクローニングすることができる。植物用の適切な発現ベクターの例は下記に記載されており、あるいは公知の方法を使用してｐＦａｓｔＢａｃｌに基づくプラスミドに帰着するバキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＦａｓｔＢａｃｌ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社製）であり、製造業者の説明書により提供される情報を使用してもよい。
本発明は、上述のように、植物において活性のある調節エレメントに作動可能に連結されたＨＡをコードする核酸を含む遺伝子構築物に関する。植物細胞において作動可能であり、本発明により使用することができる調節エレメントの例には、これらに限定されないが、プラストシアニン調節領域（米国特許第７，１２５，９７８号；参照により本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；米国特許第４，９６２，０２８号；参照により本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Ｌｅｕｔｗｉｌｅｒら；１９８６年；参照により本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と結合、Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、１９８７年、１９８９年に記載；参照により本明細書に組み込まれる）の調節領域が含まれていてもよい。プラストシアニン調節領域の一例は、配列番号３６のヌクレオチド１０〜８５を含む配列、または配列番号３７〜４７のいずれか１つの類似領域である。調節エレメントまたは調節領域は、それが作動可能に連結されているヌクレオチド配列の翻訳を増強することができ、ヌクレオチド配列はタンパク質またはポリペプチドをコードしていてもよい。調節領域の別の例は、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳領域に由来する調節領域であり、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列を優先的に翻訳するために使用することができる。このＣＰＭＶ調節領域は、ＣＭＰＶ−ＨＴ系を含む。例えば、Ｓａｉｎｓｂｕｒｙら、２００８年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４８巻：１２１２〜１２１８頁を参照されたい。
構築物が昆虫細胞で発現される場合、昆虫細胞で作動可能な調節エレメントの例には、これらに限定されないが、ポリヘドリンプロモーター（ＰｏｓｓｅｅおよびＨｏｗａｒｄ１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５巻：１０２３３〜１０２４８頁）、およびｇｐ６４プロモーター（Ｋｏｇａｎら、１９９５年、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９巻：１４５２〜１４６１頁）などが含まれていてもよい。
したがって、本発明の態様は、調節領域とインフルエンザＨＡをコードする配列とを含む核酸を含む。調節領域は、プラストシアニン調節エレメントであってもよく、インフルエンザＨＡは、以下を含むインフルエンザ菌株または亜型の群から選択されてもよい：Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５亜型（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／９９ （Ｈ９Ｎ２）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６。プラストシアニン調節エレメントおよびインフルエンザＨＡを含む核酸配列は、配列番号３６〜４７により本明細書中に例示されている。
インフルエンザウイルスが卵または哺乳動物細胞（例えばＭＤＣＫ細胞）で培養される場合、または感染した対象から単離される場合、インフルエンザ赤血球凝集素アミノ酸配列またはそれらをコードする核酸の配列には配列差がある場合があることは公知である。そのような差異の非限定的な例は、実施例１８を含めて、本明細書中に例示されている。さらに、当業者であれば理解するだろうが、追加的な突然変異は生じ続けるため、追加的な変異が、新しい菌株から得られるインフルエンザ赤血球凝集素内に観察される場合がある。異なるインフルエンザ赤血球凝集素間の公知の配列変異のため、本発明は、本明細書中に記載されているような宿主中で発現される際に、インフルエンザ赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）がＶＬＰを形成しさえすれば、いかなるインフルエンザ赤血球凝集素を使用して作製されてもよいＶＬＰを含む。
配列アラインメントおよびコンセンサス配列は、当技術分野で公知のいくつかのソフトウェアパッケージのいずれか、例えば、ＭＵＬＴＡＬＩＮ（Ｆ． ＣＯＲＰＥＴ、１９８８年、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６巻（２２号）、１０８８１〜１０８９０頁）を使用して決定してもよく、または配列は、手動でアラインして配列間の類似性および差異を決定してもよい。
赤血球凝集素の構造は十分に研究されており、構造は高度に保存されていることが公知である。赤血球凝集素構造を重ね合わせると、高度な構造保存が観察される（ｒｍｓｄ＜２Ａ）。この構造保存は、アミノ酸配列がいくつかの位置で異なる場合があっても観察されている（例えば、ＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ、２０００年、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９巻：５３１〜６９頁；Ｖａｃｃａｒｏら、２００５年）。赤血球凝集素の領域も十分に保存されており、以下がその例である：
・構造ドメイン：ＨＡ０ポリタンパク質は切断されて成熟ＨＡを提供する。ＨＡは、単一のジスルフィド結合により連結された受容体結合ドメイン（ＨＡ１）および膜アンカードメイン（ＨＡ２）を含む各モノマーを有するホモ三量体であり、ＨＡ２サブユニットのＮ末端２０残基は、ＨＡ融合ドメインまたは配列と呼ばれる場合もある。また、「尾部」領域（膜エンベロープの内部）も存在する。各赤血球凝集素は、これらの領域またはドメインを含む。個々の領域またはドメインは、典型的には長さが保存されている。
・赤血球凝集素はすべて、同じ数および位置の分子内および分子間ジスルフィド架橋を含有している。ジスルフィド架橋ネットワークに関与するシステインの、アミノ酸配列における数および位置は、ＨＡ中で保存されている。特徴的な分子内および分子間ジスルフィド架橋ならびに他の保存されたアミノ酸ならびにそれらの相対的地位を例示する構造の例は、例えばＧａｍｂｌｉｎら、２００４年（Ｓｃｉｅｎｃｅ３０３巻：１８３８〜１８４２頁）に記載されている。典型的な構造および配列には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋから入手可能な１ＲＶＺ、１ＲＶＸ、１ＲＶＴ、１ＲＶ０、１ＲＵＹ、１ＲＵ７が含まれる（Ｂｅｒｍａｎら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０巻：９８０頁；ＵＲＬ：ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）。
・細胞質尾部−大多数の赤血球凝集素は保存された位置に３つのシステインを含む。これらのシステインの１つまたは複数は、翻訳後修飾としてパルミトイル化される場合がある。
アミノ酸変異は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素では許容されている。この変異は、絶えず同定されている新しい菌株を提供する。新しい菌株間の感染力は変動する場合がある。しかしながら、その後にＶＬＰが形成される赤血球凝集素三量体の形成は、維持される。したがって、本発明は、植物中でＶＬＰを形成する赤血球凝集素アミノ酸配列または赤血球凝集素アミノ酸配列をコードする核酸を提供するものであり、公知の配列および発生する場合のある変異配列を含む。
図６５は、そのような公知の変異の例を例示している。この図は、以下のＨ１Ｎ１菌株のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号７４）を示す：
Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３によってコードされる）、
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４８）、
Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４９）、
および
配列番号９。ここでＸ１（３位）はＡまたはＶでありＸ２（５２位）はＤまたはＮであり、Ｘ３（９０位）はＫまたはＲであり、Ｘ４（９９位）はＫまたはＴであり、Ｘ５（１１１位）はＹまたはＨであり、Ｘ６（１４５位）はＶまたはＴであり、Ｘ７（１５４位）はＥまたはＫであり、Ｘ８（１６１位）はＲまたはＫであり、Ｘ９（１８１位）はＶまたはＡであり、Ｘ１０（２０３位）はＤまたはＮであり、Ｘ１１（２０５位）はＲまたはＫであり、Ｘ１２（２１０位）はＴまたはＫであり、Ｘ１３（２２５位）はＲまたはＫであり、Ｘ１４（２６８位）はＷまたはＲであり、Ｘ１５（２８３位）はＴまたはＮであり、Ｘ１６（２９０位）はＥまたはＫであり、Ｘ１７（４３２位）はＩまたはＬであり、Ｘ１８（４８９位）はＮまたはＤである。
そのような変異の別の例として、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３３によってコードされる）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４８）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４９）、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、および配列番号９のＨＡの配列アラインメントおよびコンセンサス配列は、下記の表３に示されている。
コンセンサス配列は、指定の位置ですべての配列に共通の大文字アミノ酸で示されており、小文字は、配列の少なくとも半分または大多数に共通のアミノ酸を示し、！という記号はＩまたはＶのいずれか１つであり、＄という記号はＬまたはＭのいずれか１つであり、％という記号はＦまたはＹのいずれか１つであり、＃という記号は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｂ、またはＺのいずれか１つであり、「．」という記号はアミノ酸がないことであり（例えば、欠失）、３位のＸはＡまたはＶのいずれか１つであり、５２位のＸはＥまたはＮのいずれか１つであり、９０位のＸはＫまたはＲであり、９９位のＸはＴまたはＫであり、１１１位のＸはＹまたはＨのいずれか１つであり、１４５位のＸはＶまたはＴのいずれか１つであり、１５７位のＸはＫまたはＥであり、１６２位のＸはＲまたはＫであり、１８２位のＸはＶまたはＡであり、２０３位のＸはＮまたはＤであり、２０５位のＸはＲまたはＫであり、２１０位のＸはＴまたはＫであり、２２５位のＸはＫまたはＹであり、３３３位のＸはＨまたは欠失であり、４３３位のＸはＩまたはＬであり、４９位のＸはＮまたはＤである。
そのような変異の別の例として、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（配列番号５５）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）（配列番号１０）のＨＡの配列アラインメントおよびコンセンサス配列が、下記の表４に示されている。
コンセンサス配列は、指定の位置ですべての配列に共通の大文字アミノ酸で示されており、小文字は、配列の少なくとも半分または大多数に共通のアミノ酸を示し、！という記号はＩまたはＶのいずれか１つであり、＄という記号はＬまたはＭのいずれか１つであり、％という記号はＦまたはＹのいずれか１つであり、＃という記号は、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｂ、またはＺのいずれか１つであり、１０２位のＸはＴ、Ｖ、またはＡのいずれかであり、１１０位のＸはＳ、Ｄ、またはＮのいずれかであり、１５６位のＸはＳ、Ｋ、またはＴのいずれかである。
上記で例示および記載されているアラインメントおよびコンセンサス配列は、本発明の種々の実施形態で、植物中におけるＶＬＰの生産に使用することができる赤血球凝集素アミノ酸配列の変異体の非限定的な例である。
アミノ酸配列をコードする核酸は、各アミノ酸のコドンが当技術分野で公知であるため、容易に決定することができる。したがって、アミノ酸配列が提供されることにより、それをコードする縮重核酸配列が教示される。したがって、本発明は、本明細書中に記載されているそれらのインフルエンザ菌株および亜型（例えば、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））の赤血球凝集素をコードする核酸配列、ならびに上記の赤血球凝集素をコードする縮重配列を提供する。
さらに、核酸によってコードされるアミノ酸配列は、各アミノ酸の１つまたは複数のコドンが当技術分野で公知であるため、容易に決定することができる。したがって、核酸が提供されることにより、それによってコードされるアミノ酸配列が教示される。したがって、本発明は、本明細書中で開示されているそれらのインフルエンザ菌株および亜型（例えば、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））の赤血球凝集素のアミノ酸配列を提供する。
したがって、植物では、インフルエンザＶＬＰは原形質膜から出芽し（例５および図１９を参照）、ＶＬＰの脂質組成はそれらの由来を反映する。本発明により生産されたＶＬＰは、植物由来脂質と複合体化した、１つまたは複数の型または亜型のインフルエンザのＨＡを含む。植物脂質は特定の免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を増強することができる。植物膜は、脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から作られており、スフィンゴ糖脂質、サポニン、および植物ステロールも含有している。加えて、脂質ラフトは植物原形質膜中でも見出されており、これらの微小領域は、スフィンゴ脂質およびステロール中で豊富である。植物では、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロール、およびコレステロールを含むさまざまな植物ステロールが公知である（Ｍｏｎｇｒａｎｄら、２００４年）。
ＰＣおよびＰＥならびにスフィンゴ糖脂質は、樹状細胞ならびにマクロファージならびに胸腺および肝臓のＢおよびＴリンパ球を含む他の細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）などの哺乳動物免疫細胞により発現されるＣＤ１分子と結合することができる（Ｔｓｕｊｉ Ｍ，． ２００６年）。ＣＤ１分子は、クラスＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と構造的に類似しており、それらの役割は、ＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）に対して糖脂質抗原を提示することである。活性化に際して、ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞および樹状細胞などの先天性免疫細胞を活性化し、抗体を産生するＢ細胞およびＴ細胞のような適応免疫細胞も活性化する。
さまざまな植物ステロールを原形質膜中に見出すことができ、特定の補体は、要因をいくつか挙げれば、種、増殖条件、栄養源、または病原体状態に依存して変動する。一般的に、ベータ−シトステロールは最も豊富にある植物ステロールである。
原形質膜由来エンベロープなどの脂質二分子膜と複合体化したインフルエンザＶＬＰに存在する植物ステロールは、有利なワクチン組成物を提供することができる。理論により束縛されることは望まないが、原形質膜由来エンベロープなどの脂質二分子膜と複合体化した植物由来ＶＬＰは、他の発現系で作製されたＶＬＰより強力な免疫応答を誘導することができ、生菌ウイルスワクチンまたは弱毒化全ウイルスワクチンにより誘導される免疫応答と類似していてもよい。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、植物由来脂質二分子膜と複合体化したＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態では、植物由来脂質二分子膜は、ＶＬＰのエンベロープを構成していてもよい。
植物内で生産されたＶＬＰは、植物特異的なＮ−グリカンを含むＨＡを含んでいてもよい。したがって、本発明は、植物特異的なＮ−グリカンを有するＨＡを含むＶＬＰも提供する。
さらに、植物におけるＮ−グリカンの修飾は公知であり（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第６０／９４４，３４４号を参照）、修飾Ｎ−グリカンを有するＨＡが生産されてもよい。例えば、フコシル化、キシロシル化、またはその両方、フコシル化およびキシロシル化、Ｎ−グリカンが低減された修飾グリコシル化パターンを含むＨＡが取得されてもよく、またはタンパク質がフコシル化、キシロシル化、または両方を欠き、増加したガラトシル化（ｇａｌａｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を含む修飾グリコシル化パターンを有するＨＡが取得されてもよい。さらに、翻訳後修飾、例えば末端ガラクトースの付加の調節は、野生型植物発現ＨＡと比較して、発現されたＨＡのフコシル化およびキシロシル化の低減に帰着する場合がある。
例えば、限定とみなすべきではないが、修飾されたグリコシル化パターンを有するＨＡの合成は、ベータ−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、例えば、これらに限定されないが、哺乳動物ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴをコードするヌクレオチド配列と共に目的タンパク質を共発現させることにより達成することができる。しかしながら、別の供給源に由来するＧａｌＴを使用することもできる。ＧａｌＴの触媒ドメインは、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧＮＴ１）のＣＴＳドメイン（つまり、細胞質尾部、膜貫通ドメイン、基部領域）と融合して、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を生成することもでき、ハイブリッド酵素はＨＡと共発現されてもよい。ＨＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｓｎｆｅｒａｓｅ）ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）、例えば、これらに限定されないが、哺乳動物ＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩをコードするヌクレオチド配列と共に共発現させることもでき、他の供給源に由来するＧｎＴ−ＩＩＩも使用することができる。加えて、ＧｎＴ−ＩＩＩと融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素も使用することができる。
したがって、本発明は、修飾Ｎ−グリカンを有するＨＡを含むＶＬＰも含む。
理論により束縛されることは望まないが、ＨＡに植物Ｎ−グリカンが存在することは、抗原提示細胞によるＨＡの結合を促進することにより、免疫応答を刺激することができる。植物Ｎグリカンを使用した免疫応答の刺激は、Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓら（２００７年）により提唱されている。さらに、ＶＬＰ立体構造は、抗原提示に有利であり、植物由来脂質層と複合体化するとＶＬＰのアジュバント効果を増強することができる。
「調節領域」、「調節エレメント」、または「プロモーター」とは、典型的には、常にそうであるとは限らないが、遺伝子のタンパク質コード領域の上流にある核酸の部分を意味し、それは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方で構成されていてもよい。調節領域が活性であり、目的遺伝子と作動可能に結合しているかまたは作動可能に連結している場合、これにより、その結果として目的遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介可能であってもよく、または発生的または一時的な遺伝子活性化を制御可能であってもよい。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基本プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答して誘導可能なエレメント、負の調節エレメントまたは転写エンハンサーなどのプロモーター活性を媒介するエレメントを含む。「調節領域」は、本明細書中で使用される場合、転写後に活性であるエレメント、例えば翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性決定因子などの遺伝子発現を調節する調節エレメントを含む。これらの後期エレメントのいくつかは、コード領域の近位に位置していてもよい。
本開示の状況では、典型的には、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、通常はしかし必ずしも常にではないが構造遺伝子のコード配列の上流（５’）にあるＤＮＡの配列を指し、ＲＮＡポリメラーゼの認識および／または特定部位で転写を開始するのに必要な他の因子を提供することにより、コード領域の発現を制御する。しかしながら、配列のイントロン内または３’に位置する他のヌクレオチド配列も、目的コード領域の発現調節に寄与することができる。ＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子の認識を提供して特定部位での開始を保証する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。すべてではないがほとんどの真核生物プロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス、通常は転写開始部位の上流およそ２５塩基対に位置するアデノシンおよびチミジンヌクレオチド塩基対で構成される保存された核酸配列を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始を担う基本プロモーターエレメント、ならびに遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント（上記で列挙されているような）を含む。
発達的に調節されるもの、誘導可能であるもの、または基礎的であるものを含むいくつかのタイプの調節領域がある。発生的に調節されるか、またはその制御下にある遺伝子の発現差異を制御する調節領域は、特定の器官または器官の組織内で、その器官または組織の発生中の特定の時点で活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特定の発生段階にある特定の器官または組織内で優先的に活性であってもよく、また、植物内の他の器官または組織内でも同様に、発生的に調節された様式で活性があるかまたは基礎レベルであってもよい。組織特異的調節領域の例には、例えば、特異的な調節領域を参照して、ｎａｐｉｎプロモーターおよびクルシフェリンプロモーター（ｃｒｕｃｉｆｅｒｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（Ｒａｓｋら、１９９８年、Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １５２巻：５９５〜５９９頁；Ｂｉｌｏｄｅａｕら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １４巻：１２５〜１３０頁）が含まれる。葉特異的プロモーターの一例は、プラストシアニンプロモーター（図１ｂまたは配列番号２３；米国特許第７，１２５，９７８号；参照により本明細書に組み込まれる）を含む。
誘導可能な調節領域とは、誘導因子に応答して１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接的にまたは間接的に活性化可能なものである。誘導因子の非存在下では、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されないだろう。典型的には、誘導可能な調節領域に特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は、不活発型で存在していてもよく、後で誘発因子により直接的または間接的に活性型に変換される。しかしながら、タンパク質因子が存在しない場合もある。誘導因子は、タンパク質、代謝産物、成長調節物質、除草剤、またはフェノール化合物などの化学薬剤であってもよく、あるいは加熱、冷却、塩、もしくは有毒物質により直接的に、またはウイルスなどの病原体または病因物質の作用により間接的に課される生理学的ストレスであってもよい。誘導可能な調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、潅水、加熱、または類似の方法などにより誘導因子を細胞または植物に外部的に適用することによって、誘導因子に免疫誘発することができる。誘導可能な調節エレメントは、植物または非植物遺伝子のいずれに由来していてもよい（例えば、参照により組み込まれるＧａｔｚ， Ｃ．およびＬｅｎｋ， Ｉ．Ｒ．Ｐ．、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ． ３巻、３５２〜３５８頁）。可能性のある誘導可能なプロモーターの例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：テトラサイクリン誘導可能なプロモーター（参照により組み込まれるＧａｔｚ， Ｃ．ら、１９９７年、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８巻、８９〜１０８頁）、ステロイド誘導可能なプロモーター（参照により組み込まれるＡｏｙａｍａ， Ｔ． ａｎｄ Ｃｈｕａ， Ｎ．Ｈ．、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２巻、３９７〜４０４頁）、エタノール誘導可能なプロモーター（参照により組み込まれるＳａｌｔｅｒ， Ｍ．Ｇ．ら、１９９８年、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １６巻、１２７〜１３２頁；Ｃａｄｄｉｃｋ、Ｍ．Ｘ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６巻、１７７〜１８０頁）、サイトカイニン誘導可能なＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（参照により組み込まれるＢｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ、Ｉ．およびＫｉｅｂｅｒ、Ｊ．Ｊ．、１９９８年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １０巻、１００９〜１０１９頁；Ｋａｋｉｍｏｔｏ、Ｔ．、１９９６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４巻、９８２〜９８５頁）、およびオーキシン誘導可能なエレメントＤＲ５（参照により組み込まれるＵｌｍａｓｏｖ、Ｔ．ら、１９９７年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９巻、１９６３〜１９７１頁）。
構成的調節領域は、植物の種々の部分の全体にわたる遺伝子の発現、および植物発生中の全体にわたる連続的な遺伝子の発現を指図する。公知の構成的調節エレメントの例に以下のものが含まれる：ＣａＭＶ３５Ｓ転写に関連するプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１３巻：８１０〜８１２頁）、イネアクチン１（Ｚｈａｎｇら、１９９１年、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、３巻：１１５５〜１１６５頁）、アクチン２（Ａｎら、１９９６年、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１０巻：１０７〜１２１頁）、またはｔｍｓ２（米国特許第５，４２８，１４７号；参照により本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕら、１９９４年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０６巻：４５９〜４６７頁）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏら、１９９３年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９巻：６３７〜６４６頁）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆら、１９９５年、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９巻：６３７〜６４６頁）、およびタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌら、１９９５年Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９巻：９９５〜１００４頁）。本明細書中で使用される場合、「構成的」という用語は、構成的調節領域の制御下にある遺伝子が、すべての細胞タイプにおいて同じレベルで発現されることを必ずしも示さないが、存在量の変動が観察されることが多くとも、その遺伝子が広範囲の細胞タイプで発現されることを示す。構成的調節エレメントは、他の配列と結合して、それらが作動可能に連結されたヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに増強することができる。例えば、ＣＭＰＶ−ＨＴ系（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙら、２００８年、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４８巻：１２１２〜１２１８頁）は、カウピーモザイクウイルス（ＣＯＭＶ）の非翻訳領域に由来し、関連コード配列の翻訳増強を示す。
「天然」とは、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在すること、または「野生型」であることを意味する。
「作動可能に連結された」とは、特定の配列、例えば調節エレメントと目的のコード領域とが直接的または間接的のいずれかで相互作用して、遺伝子発現の媒介または調節などの目的機能を果たすことを意味する。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質により媒介されてもよい。
本発明の１つまたは複数のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、構築物、またはベクターにより形質転換されている好適な植物宿主中で発現することができる。好適な宿主の例は、これらに限定されないが、アルファルファ、キャノーラ、Ｂｒａｓｓｉｃａ種、トウモロコシ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種、アルファルファ、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウマメ、オートムギ、イネ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、およびワタなどを含む農産物が含まれる。
本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝構築物は、３’非翻訳領域をさらに含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現を達成可能な任意の他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子のその部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端部へのポリアデニル酸連続体の付加を達成することを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、一般的に、変異は珍しくないが標準形の５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同体の存在によって認識される。本発明のキメラ遺伝構築物の１つまたは複数は、必要とされる場合は、エンハンサー、翻訳または転写エンハンサーのいずれかをさらに含むこともできる。これらのエンハンサー領域は、当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。開始コドンは、配列全体の翻訳を保証するために、コード配列のリーディングフレームと同相になければならない。
好適な３’領域の非限定的な例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子およびダイズ貯蔵タンパク質遺伝子などの植物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写非翻訳領域、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小型サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６２，０２８号）遺伝子、プラストシアニン発現を制御するのに使用されるプロモーター（ＰｗｅｅおよびＧｒａｙ １９９３年；参照により本明細書に組み込まれる）である。プラストシアニンプロモーターの一例は、米国特許第７，１２５，９７８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本明細書中に記載されているように、葉発現での効率が実証されているエンハンサー配列を含むプロモーターは、一過性発現に有効であることが見出された。理論により束縛されることは望まないが、核マトリックスへの結合による光合成遺伝子の上流調節エレメントの結合は、強力な発現を媒介することができる。例えば、エンドウマメプラストシアニン遺伝子の翻訳開始部位から−７８４までを、強力なレポーター遺伝子発現を媒介するために使用することができる。
形質転換された植物細胞の識別を支援するため、植物選択マーカーを含むように本発明の構築物をさらに操作することができる。有用な選択マーカーには、抗生物質、例えばゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、またはホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｙｃｉｎ）、グリフォサート、クロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｕｒｏｎ）などなどの除草剤などの耐化学薬品性を提供する酵素が含まれる。同様に、ＧＵＳ（ベータ‐グルクロニダーゼ）などの色変化またはルシフェラーゼもしくはＧＦＰなどの発光により識別可能な化合物の産生を提供する酵素を使用してもよい。
本発明のキメラ遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物、植物細胞、または種子も本発明の一部とみなされる。植物細胞から植物全体を再生する方法も、当技術分野で公知である。一般的に、形質転換された植物細胞は、適切な培地で培養され、培地は抗生物質などの選択剤を含有してもよく、形質転換された植物細胞の識別を容易にするために選択マーカーが使用される。カルスが形成されると、公知の方法に従って適切な植物ホルモンを使用することにより芽形成を促進させることができ、芽を植物再生用の発根培地に移植する。その後、その植物を使用して、種子からまたは栄養繁殖技術を使用した反復世代を確立することができる。トランスジェニック植物は、組織培養を使用せずに生成することもできる。
本発明によるＶＬＰ生産用の組換えＨＡ０をコードする核酸を含むキメラ遺伝子構築物を含有するトランスジェニック植物、樹木、酵母、細菌、真菌、昆虫、および動物細胞も、本発明の一部とみなされる。
本発明の調節エレメントは、形質転換が可能である一連の宿主生物内での目的コード領域の発現または一過性発現と組み合わせることもできる。そのような生物には、これらに限定されないが、植物、単子葉植物および双子葉植物の両方、例えばこれらに限定されないが、トウモロコシ、穀物用植物、コムギ、オオムギ、オートムギ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種、Ｂｒａｓｓｉｃａ種、ダイズ、マメ、エンドウマメ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、チョウセンニンジン、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓが含まれる。
これらの生物の安定した形質転換および再生のための方法は、当技術分野で確立されており、当業者に公知である。形質転換および再生された植物を取得する方法は、本発明にとって重要ではない。
「形質転換」とは、遺伝子型、表現型、またはその両方で明らかにされる遺伝子情報（ヌクレオチド配列）の安定的な異種間移動を意味する。キメラ構築物から宿主への遺伝子情報の異種間移動は遺伝可能であってもよく、その場合遺伝子情報の移動は安定的とみなされ、または移動は一過性であってもよく、その場合遺伝子情報の移動は遺伝可能ではない。
「植物物質」という用語は、植物に由来する任意の物質を意味する。植物物質は、植物全体、組織、細胞、またはそれらの任意の画分を含んでいてもよい。さらに、植物物質は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体または固形抽出物、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。さらに、植物物質は、植物葉、茎、果実、根、またはそれらの組合せからの、植物、植物細胞、組織、液体抽出物、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。植物物質は、いかなる処理ステップにも供されていない植物またはその部分を含んでいてもよい。植物の一部が植物物質を構成していてもよい。しかしながら、植物材料は、下記で定義されるような最小限の処理ステップに供されてもよく、またはこれらに限定されないが、クロマトグラフィーおよび電気泳動などを含む当技術分野内で一般的に公知である技術を使用してタンパク質を部分的にまたは実質的に精製することを含む厳密な処理に供されていてもよいことも企図される。
「最小限の処理」という用語は、目的タンパク質を含む植物またはその部分が、植物物質、例えば植物抽出液、破砕物、または植物破砕物の画分を産出するために部分的に精製（すなわち、最小限に処理）されていることを意味する。部分的精製には、これらに限定されないが、植物細胞組織を破砕して、それにより可溶性植物成分、および例えばこれらに限定されないが、遠心分離、濾過、またはそれらの組合せによって分離することができる不溶性植物成分を含む組成物を生成することが含まれる。これに関して、葉または他の組織の細胞外空間内に分泌されるタンパク質は、減圧または遠心抽出を使用して容易に取得することができ、またはローラーを通過させることまたはすりつぶしにより圧力下で組織を抽出して、タンパク質を細胞外空間内から圧搾または放出させることができる。最小限の処理は、これらの調製物が有するであろう二次植物産物からの不純物が無視できる程度であるため、可溶性タンパク質の粗抽出液を調製をすることを含む場合もある。さらに、最小限の処理は、葉に由来する可溶性タンパク質を水性抽出し、その後任意の好適な塩を用いて析出することを含む場合がある。他の方法には、抽出物の直接使用を可能にするための大規模浸軟および果汁抽出が含まれていてもよい。
植物物質は、植物材料または組織の形態で、対象に経口送達することができる。植物物質は、他の食品と共に栄養補助食品の一部として、またはカプセル化されて投与することができる。植物物質または組織は、嗜好性を向上または増加させるために濃縮することもでき、または必要に応じて、他の物質、成分、または医薬賦形剤と共に提供することもできる。
本発明のＶＬＰを投与することができる対象または標的生物の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：ヒト、霊長類、鳥、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、ウマ（ｈｏｒｓｅ）、ラクダ、イヌ、犬、ネコ、猫、トラ、ヒョウ、シベット、ミンク、ムナジロテン、フェレット、ハウスペット、家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、または他のげっ歯動物、アザラシ、およびクジラなど。そのような標的生物は例示であり、本発明の応用および使用を限定するとみなされるべきではない。
目的タンパク質を含むか、または目的タンパク質を含むＶＬＰを発現する植物は、必要性および状況に依存してさまざまな方法で対象または標的生物に投与できることが企図される。例えば、植物から得られる目的タンパク質は、その使用に先立って、粗製、部分的精製、または精製形態のいずれに抽出されていてもよい。タンパク質が精製される場合、食用または非食用植物中のいずれで生産されてもよい。さらに、タンパク質が経口で投与される場合、植物組織を回収し対象に直接食べさせてもよく、回収した組織を食べさせる前に乾燥させてもよく、またはまだ回収していない植物を動物に食べさせてもよい。回収した植物組織が動物飼料内の栄養補助食品として提供されることも、本発明の範囲内であるとみなされる。植物組織が、ほとんど処理されずにまたはさらなる処理をされずに動物に与えられている場合、投与されている植物組織は食用であることが好ましい。
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、植物中での導入遺伝子発現の制限に関与している場合があり、ジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）に由来するサイレンシングの抑制因子の共発現を使用して、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解に対抗することができる（Ｂｒｉｇｎｅｔｉら、１９９８年）。代替的なサイレンシングの抑制因子は、当技術分野で周知であり、本明細書中に記載されているように使用することができ（Ｃｈｉｂａら、２００６年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４６巻：７〜１４頁；参照により本明細書に組み込まれる）、例えば、これらに限定されないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ；ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルス（Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｃｏｒｃｈ ｖｉｒｕｓ）のｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウリーフロール関連ウイルス−２（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｌｅａｆｒｏｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−２）のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム潜在ウイルス（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）のｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク共通潜在ウイルス（Ｇａｒｌｉｃ ｃｏｍｍｏｎ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）である。したがって、サイレンシングの抑制因子、例えばこれらに限定されないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣＰｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６、またはＧＶＡ−ｐ１０を、目的タンパク質をコードする核酸配列と共に共発現させて、植物内での高レベルのタンパク質産生をさらに保証することができる。
さらに、ＨＡ亜型の組合せを含むＶＬＰを生産することができる。例えば、ＶＬＰは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｂ型、またはそれらの組合せに由来する１つまたは複数のＨＡを含むことができる。ＨＡの組合せの選択は、ＶＬＰから調製されたワクチンの使用目的によって決定されてもよい。例えば、トリへの接種に使用されるワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組合せを含んでいてもよく、その一方でヒト接種に有用なＶＬＰは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、またはＢのうちの１つまたは複数の亜型を含んでいてもよい。しかしながら、ＶＬＰの使用に依存して、他のＨＡ亜型の組合せが調製されてもよい。ＨＡ亜型の組合せを含むＶＬＰを生産するために、所望のＨＡ亜型を同じ細胞、例えば植物細胞内で共発現させることができる。
さらに、本明細書中に記載されているように生産されたＶＬＰは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望の場合、ＮＡをＨＡと共発現させることができる。
したがって、本発明は、安定的な発現系または一過性発現系のいずれかを用いる使用に好適なキメラ構築物を含む好適なベクターをさらに含む。遺伝子情報は、１つまたは複数の構築物内に提供することもできる。例えば、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、１つの構築物に導入されてもよく、目的タンパク質のグリコシル化を修飾するタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列は、別の構築物を使用して導入されてもよい。その後、これらのヌクレオチド配列を植物内で共発現させることができる。しかしながら、目的タンパク質、および目的タンパク質のグリコシル化特性を修飾するタンパク質の両方をコードするヌクレオチド配列を含む構築物を使用することもできる。この場合、ヌクレオチド配列は、プロモーターまたは調節領域に作動可能に連結された目的タンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の配列、および目的タンパク質のグリコシル化特性を修飾するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２の配列を含み、第２の配列はプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結されているだろう。
「共発現される」とは、２つまたは２つを超えるヌクレオチド配列が、植物内および植物の同じ組織内でほぼ同時に発現されることを意味する。しかしながら、ヌクレオチド配列は、正確に同時に発現される必要はない。より正確に言えば、２つ以上のヌクレオチド配列は、コード産物が相互作用する機会を有するように発現される。例えば、目的タンパク質のグリコシル化を修飾するタンパク質は、目的タンパク質のグリコシル化の修飾が生じるように、目的タンパク質が発現される期間の前またはその期間中のいずれかで発現させることができる。２つまたは２つを超えるヌクレオチド配列は、両配列が発現される条件下で２つ以上の配列がほぼ同時に植物内に導入される一過性発現系を使用して共発現させることができる。あるいは、ヌクレオチド配列、例えば目的タンパク質のグリコシル化特性を修飾するタンパク質をコードする配列の１つを含むプラットフォーム植物を、目的タンパク質をコードする追加的な配列を用いて、一過性または安定的な方法のいずれかで形質転換することができる。この場合、目的タンパク質のグリコシル化特性を修飾するタンパク質をコードする配列は、所望の発育期中に所望の組織内で発現させることができるか、または誘導可能なプロモーターを使用してその発現を誘導することができ、目的タンパク質をコードする追加的な配列は、ヌクレオチド配列が共発現されることを保証するために同様の条件下で同じ組織で発現させることができる。
本発明の構築物は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および浸潤などを使用して、植物細胞に導入することができる。そのような技術の概説は、例えば、ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＶＩＩＩ、４２１〜４６３頁（１９８８年）；ＧｅｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８８年）；およびＭｉｋｉおよびＩｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓを参照されたい。Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版、ＤＴ． Ｄｅｎｎｉｓ、ＤＨ Ｔｕｒｐｉｎ、ＤＤ Ｌｅｆｅｂｒｖｅ、ＤＢ Ｌａｙｚｅｌｌ編、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ， Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ． Ｌｏｎｄｏｎ、５６１〜５７９頁（１９９７年）中。他の方法には、例えばプロトプラスト、マイクロインジェクション、微粒子またはウイスカー、および減圧浸潤を使用した直接ＤＮＡ取込、リポソームの使用、エレクトロポレーションが含まれる。例えば、Ｂｉｌａｎｇら（Ｇｅｎｅ １００巻：２４７〜２５０頁（１９９１年）、Ｓｃｈｅｉｄら（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２８巻：１０４〜１１２頁、１９９１年）、Ｇｕｅｒｃｈｅら（Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ ５２巻：１１１〜１１６頁、１９８７年）、Ｎｅｕｈａｕｓｅら（Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ． ７５巻：３０〜３６頁、１９８７年）、Ｋｌｅｉｎ ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２７巻：７０〜７３頁（１９８７年）；Ｈｏｗｅｌｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８巻：１２６５頁、１９８０年）、Ｈｏｒｓｃｈ ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２７巻：１２２９〜１２３１頁、１９８５年）、ＤｅＢｌｏｃｋら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ９１巻：６９４〜７０１頁、１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＳｃｈｕｌｅｒおよびＺｉｅｌｉｎｓｋｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、１９８９年）、ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈ、１０５巻：３４３〜３４８頁、２００２年）、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；第５，１００，７９２号；第６，４０３，８６５号；第５，６２５，１３６号（これによりそれらのすべては参照により組み込まれる）を参照されたい。
一過性発現方法を使用して、本発明の構築物を発現することができる（ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５巻：３４３〜３４８頁；参照により本明細書に組み込まれる）。あるいは、Ｋａｐｉｌａら、１９９７年（参照により本明細書に組み込まれる）により記載されているような、減圧に基づく一過性発現方法を使用してもよい。これらの方法には、例えばこれらに限定されないが、アグロ接種またはアグロインフィルトレーションの方法が含まれるが、上記のような他の一過性方法を使用することもできる。アグロ接種またはアグロインフィルトレーションのいずれかを用いて、所望の核酸を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａの混合物を、組織の細胞空間、例えば葉、植物の地上部分（茎、葉、および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、または植物全体に進入させる。表皮を交差させると、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは細胞に感染してｔ−ＤＮＡコピーを細胞に移動させる。ｔ−ＤＮＡがエピゾームで転写され、ｍＲＮＡが翻訳され、感染細胞中で目的タンパク質の産生に結びつくが、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
目的のヌクレオチド配列が、植物に直接的または間接的に毒性である産物をコードしている場合、本発明の方法を使用することにより、所望の組織内でまたは植物の所望の発育期において目的のヌクレオチド配列を選択的に発現することにより、そのような毒性を植物全体にわたって低減することができる。加えて、植物中で毒性産物を産生する場合、一過性発現に起因する期間限定の発現は、その影響を低減することができる。誘導可能なプロモーター、組織特異的プロモーター、または細胞特異的プロモーターを使用して、目的配列の発現を選択的に指図することができる。
本発明の組換えＨＡ ＶＬＰを既存のインフルエンザワクチンと共に使用して、そのワクチンを補完し、それらをより効果的にし、必要な投与量を減らすことができる。当業者であれば公知であるように、ワクチンは１つまたは複数のインフルエンザウイルスに向けられていてもよい。好適なワクチンの例には、これらに限定されないが、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ社、ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社、Ｍｅｒｉａｌ社、Ｓｉｎｏｖａｃ社、Ｃｈｉｒｏｎ社、Ｒｏｃｈｅ社、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ社、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社、Ｎｏｖａｒｔｉｓ社、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ社、Ｓｅｒｏｎｏ社、およびＳｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社などから市販されているものが含まれる。
所望の場合、本発明のＶＬＰは、当業者であれば公知であるような好適なアジュバントと混合されていてもよい。さらに、ＶＬＰは、上記で定義されているように、有効用量の標的生物治療用ＶＬＰを含むワクチン組成物に使用することができる。さらに、本発明により生産されるＶＬＰは、異なるインフルエンザタンパク質、例えばノイラミニダーゼ（ＮＡ）を使用して得られるＶＬＰと混合されていてもよい。
したがって、本発明は、動物または標的生物においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するための方法であって、１つまたは複数のＶＬＰを含む有効用量のワクチンを投与することを含む方法を提供する。ワクチンは、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下に投与されてもよい。
本発明により生産されるＶＬＰの投与は、実施例６に記載されている。植物で作られたＨ５ ＶＬＰの投与は、可溶性ＨＡの投与と比較すると、著しくより高い応答に帰着した（図２１Ａおよび２１Ｂを参照）。
図２６Ａおよび２６Ｂに示されているように、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ Ｈ５ ＶＬＰを投与された対象には、インフルエンザＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１；「シチメンチョウＨ５Ｎ１」）による免疫誘発に対する交差防御能が提供される。免疫誘発前のＩｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５ ＶＬＰの投与は、体重のいかなる喪失にも帰着しなかった。しかしながら、Ｈ５ ＶＬＰは投与されていないがＴｕｒｋｅｙ Ｈ５Ｎ１で免疫誘発された対象では、体重の著しい喪失が示され、いくつかの対象は死亡した。
したがって、これらのデータは、Ｈ５赤血球凝集素ウイルスタンパク質を含む植物で作られたインフルエンザＶＬＰが、病原性インフルエンザ菌株に特異的な免疫応答を誘導し、ウイルス様粒子が植物原形質膜から出芽できることを実証する。
したがって、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質、および薬学的に許容される担体を含む有効用量のＶＬＰを含む組成物を提供する。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５ Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５０／２００７、Ａ／Ｓｏｌｏｌｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００５、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６、またはＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９であってもよい。対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法も提供される。その方法は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質、および薬学的に許容される担体を含むウイルス様粒子を投与することを含む。ウイルス様粒子は、経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与されてもよい。
本発明の種々の実施形態による組成物は、２つ以上のインフルエンザ菌株または亜型のＶＬＰを含んでいてもよい。「２つ以上」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種以上の菌株または亜型を指す。示されている菌株または亜型は、単一の亜型（例えばすべてがＨ１Ｎ１、またはすべてがＨ５Ｎ１）であってもよいし、または亜型の組合せであってもよい。例示的な亜型または菌株には、それらに限定されないが、本明細書中で開示されているものが含まれる（例えば、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００６（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／１９９５、Ａ／ｈｅｒｒｉｎｇ ｇｕｌｌ／ＤＥ／６７７／８８（Ｈ２Ｎ８）、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３２／２００３、Ａ／ｍａｌｌａｒｄ／ＭＮ／３３／００、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／１／２０００、Ａ／ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｐｉｎｔａｉｌ／ＴＸ／８２８１８９／０２、Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／６８（Ｈ８Ｎ４）、Ａ／ｓｈｏｖｅｌｅｒ／Ｉｒａｎ／Ｇ５４／０３、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｎ／１９４９（Ｈ１０Ｎ７）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／５６（Ｈ１１Ｎ６）、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｌｂｅｒｔａ／６０／７６（Ｈ１２Ｎ５）、Ａ／Ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／７７（Ｈ１３Ｎ６）、Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ｇｕｒｊｅｖ／２６３／８２、Ａ／ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）、Ａ／ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ ｇｕｌｌ／Ｓｗｅｄｅｎ／５／９９（Ｈ１６Ｎ３）、Ｂ／Ｌｅｅ／４０、Ｃ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／６６、Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ ３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ １０／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ｔｅａｌ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）、Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６（Ｈ７Ｎ７）、Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））。
菌株および亜型の組合せの選択は、インフルエンザと接触する可能性が高い対象の地理的区域、免疫されるヒト集団の近隣にいる動物種（例えば、水鳥、ブタなどのような農業用動物種）、および接触しているまたは接触する可能性の高いそれらが保持する菌株、亜型または菌株内の抗原連続変異の予測、またはこれらの要因の組合せに依存する場合がある。過去数年で使用された組合せの例は、入手可能である（ＵＲＬ：ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｄｉｅｅａｓｅ／ｉｎｆｌｕｅｎｚａ／ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ１／ｅｎを参照）。これらの菌株のいくつかまたはすべては、示されている組合せまたは他の組合せで、ワクチン組成物の生産に使用することができる。
より詳しくは、例示的な組合せには、以下のものを含む群から選択される２つ以上の菌株または亜型に由来するＶＬＰが含まれていてもよい：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）様ウイルス、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、またはＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６様ウイルス。
別の例示的な組合せには、以下のものを含む群から選択される２つ以上の菌株または亜型に由来するＶＬＰが含まれていてもよい：Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５様ウイルス、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４様ウイルス、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／０５様ウイルス、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６、Ａ／ｇｏｏｓｅ／Ｇｕｉｙａｎｇ／３３７／２００６様ウイルス、Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｘｉ／２／２００６、またはＡ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｓｈａｎｘｉ／２／２００６様ウイルス。
別の例示的な組合せには、Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／１３４７４／９９（Ｈ７型）またはＡ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ／０４（Ｈ７Ｎ３）インフルエンザ菌種のＶＬＰが含まれていてもよい。
別の例示的な組合せには、Ａ／Ｃｈｉｃｋｅｎ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／Ｇ９／９７またはＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１０７３／９９のＶＬＰが含まれていてもよい。別の例示的な組合せは、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６のＶＬＰを含んでいてもよい。別の例示的な組合せは、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７のＶＬＰを含んでいてもよい。別の例示的な組合せは、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５のＶＬＰを含んでいてもよい。別の例示的な組合せは、Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６、またはＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／３／２００７菌株または亜型のＶＬＰを含んでいてもよい。
２つ以上のＶＬＰを個々に発現させ、その後、精製または半精製されたＶＬＰを混合してもよい。あるいは、ＶＬＰは、同じ宿主、例えば植物中で共発現させてもよい。ＶＬＰは、所望の比率、例えばほぼ同じ比率で混合または生産されてもよく、または１つの亜型または菌株が組成物中の大多数のＶＬＰを構成するように混合されてもよい。
したがって、本発明は、２つ以上の菌株または亜型のＶＬＰを含む組成物を提供する。
エンベロープウイルスのＶＬＰは、一般的に、それらが出芽する膜から自身のエンベロープを獲得する。植物原形質膜は、免疫賦活性効果を示すことができる植物ステロール補体を有する。この可能性を調査するために、植物で作られたＨ５ ＶＬＰを、アジュバントの存在下または非存在下で動物に投与し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体応答）を決定した（図２２Ａ、２２Ｂ）。添加アジュバントの非存在下では、植物で作られたＨ５ ＶＬＰは、抗原投与に対する全身性免疫応答を表す著しいＨＡＩを示す。さらに、アジュバントの存在下または非存在下で投与されたＶＬＰの抗体アイソタイプ特性は類似している（図２３Ａ）。
表５は、本発明の種々の実施形態で提供される配列を列挙する。
以下の非限定的な例への言及目的でのみ、本発明をこれから詳細に説明する。
方法および物質
１．プラストシアニンに基づく天然ＨＡ用発現カセットの構築
操作はすべて、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年；参照により本明細書に組み込まれる）の一般的な分子生物学プロトコールを使用して行った。最初のクローニングステップは、アルファルファプラストシアニン遺伝子の上流調節エレメントおよび下流調節エレメントを含有する受容プラスミドを構築することにあった。プラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ配列は、オリゴヌクレオチドプライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃ（配列番号２９；図１０Ｑ）およびＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒ（配列番号３０；図１０Ｒ）を使用して、アルファルファゲノムＤＮＡから増幅した。その結果生じた増幅産物を、ＸｍａＩおよびＳａｃＩで消化し、同じ酵素ですでに消化されたｐＣＡＭＢＩＡ２３００（Ｃａｍｂｉａ社、Ｃａｎｂｅｒｒａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にライゲーションし、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏ Ｐｌａｓｔｏを生成した。同様に、３’ＵＴＲ配列およびプラストシアニン遺伝子のターミネーターは、以下のプライマー：ＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃ（配列番号３１；図１０Ｓ）およびＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒ（配列番号３２；図１０Ｔ）を使用してアルファルファゲノムＤＮＡから増幅し、産物をＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化してから、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏの同じ部位に挿入し、ｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏを生成した。
インフルエンザ菌株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１；受託番号ＬＡＮＬ
ＩＳＤＮ１２５８７３）に由来する赤血球凝集素をコードする断片は、Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ社（Ｓｕｇａｒ Ｌａｎｄ、ＴＸ、ＵＳＡ）により合成された。先頭ＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位および終止（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位が隣接する天然シグナルペプチドを含む完全Ｈ５コード領域を含有する生成された断片は、配列番号３（図６）に示されている。Ｈ５コード領域を、Ｄａｒｖｅａｕら（１９９５年）に示されているＰＣＲに基づくライゲーション法により、プラストシアニンに基づく発現カセットにクローニングした。手短かに言えば、プライマーＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）―Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号５；図７Ｂ）、ならびに鋳型としてｐＣＡＭＢＩＡ ｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏを使用して、第１のＰＣＲ増幅物を取得した。並行して、プライマーＰｌａｓｔｏ−ＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃ（配列番号６；図７Ｃ）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号７；図７Ｄ）を用いて、Ｈ５コード断片を鋳型として用いて、第２の増幅を実施した。両反応から得られた増幅物を共に混合し、混合物は、Ｐｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号７；図７Ｄ）をプライマーとして使用した第３の反応（構築反応）用の鋳型として機能した。その結果生じた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）およびＳａｃＩ（断片の３’末端にある）で消化し、同じ酵素ですでに消化されたｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏにクローニングした。その結果生じたプラスミドを６６０と称し、図２Ｂに示す（図１１も参照）。
赤血球凝集素発現カセット番号７７４〜７８５を、以下のように構築した。プラストシアニンＡＴＧ上流の最初の８４個のヌクレオチドに対応し、ＤｒａＩＩＩ制限酵素部位で終わるアルファルファプラストシアニン遺伝子配列が３’側に隣接する完全赤血球凝集素コード配列（ＡＴＧから終止まで）を含む合成断片を合成した。合成断片は、終止コドンの直後にＳａｃＩ部位も含んでいた。
合成赤血球凝集素断片は、Ｔｏｐ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＱＣ、Ｃａｎａｄａ）およびＥｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ社（Ｓｕｇａｒ Ｌａｎｄ、ＴＸ、ＵＳＡ）により合成された。合成された断片は、図２８〜３９に示されており、配列番号３６〜配列番号４７に対応する。完全発現カセットを構築する場合、合成断片をＤｒａＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、同じ酵素ですでに消化されたｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏにクローニングした。表６は、対応するＨＡを用いて生成されたカセットおよび本文中の他の参照を示す。

プラストシアニンに基づくＰＤＩＳＰ／ＨＡ融合発現カセットの構築
Ｈ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（構築物番号５４０）
インフルエンザ菌株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）のＨ１遺伝子に由来するオープンリーディングフレームを、２つの断片に合成した（植物バイオテクノロジー研究所（Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、国立学術研究会議（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、Ｃａｎａｄａ）。合成された第１の断片は、野生型Ｈ１コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８９９２９；配列番号３３；図１６）に対応し、５’末端のシグナルペプチドコード配列および３’末端の膜貫通領域コード配列を欠失している。ＢｇｌＩＩ制限酵素部位をコード配列の５’末端に付加し、ＳａｃＩ／ＳｔｕＩ二重部位を、断片の３’末端側終端にある終止コドンのすぐ下流に付加して、配列番号１（図５Ａ）を産出した。Ｈ１タンパク質のＣ末端側終端（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む）をＫｐｎＩ部位から終止コドンまでコードし、ＳａｃＩおよびＳｔｕＩ制限酵素部位が３’側に隣接する第２の断片も合成した（配列番号２；図５Ｂ）。
第１のＨ１断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化し、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）遺伝子（ヌクレオチド３２〜１０３；受託番号Ｚ１１４９９；配列番号３４；図１７）のシグナルペプチドに融合されたプラストシアニンプロモ
ーターおよび５’ＵＴＲを含有するバイナリーベクター（ｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏ）の同じ部位にクローニングし、その結果としてプラストシアニン調節エレメントの下流のＰＤＩ−Ｈ１キメラ遺伝子がもたらされた。ＰＤＩシグナルペプチドを含有するプラストシアニンに基づくカセットの配列は、図１に示されている（配列番号８）。その結果生じたプラスミドは、ＰＤＩシグナルペプチドと融合された、プラストシアニン調節エレメントが隣接するＨ１コード領域を含有していた。Ｃ末端側終端コード領域（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をコードする）の付加は、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩですでに消化された合成断片（配列番号２；図５Ｂ）をＨ１発現プラスミドに挿入することにより取得した。その結果生じたプラスミドを５４０と称し、図１１に示す（図２Ａも参照）。
Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（構築物番号６６３）
アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）のシグナルペプチド（ヌクレオチド３２〜１０３；受託番号Ｚ１１４９９；配列番号３４；図１７）を、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５のＨＡ０コード配列と以下のように連結した。プライマーＳｐＰＤＩ−ＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃ（配列番号８２）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号７；図７Ｄ）を用い、構築物番号６６０（配列番号６０；図５１）を鋳型として使用して、Ｈ５コード配列を増幅した。その結果生じた断片は、ＰＤＩＳＰ（ＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含む）をコードする最後のヌクレオチドが５’側に、ＳａｃＩ制限酵素部位が３’側に隣接するＨ５コード配列であった。断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化し、同じ制限酵素ですでに消化された構築物番号５４０（配列番号６１；図５２）にクローニングした。最終カセットを構築物番号６６３（配列番号８３）と称し、図６９に示す。
Ｈ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（構築物７８７）
アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）のシグナルペプチド（ヌクレオチド３２〜１０３；受託番号Ｚ１１４９９；配列番号３４；図１７）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１のＨＡ０コード配列と以下のように連結した。プライマーＳｐＰＤＩ−Ｈ１Ｂ．ｃ（配列番号８４）およびＳａｃＩ−Ｈ１Ｂ．ｒ（配列番号８５）を用い、構築物７７４（配列番号６２；図５３）を鋳型として使用して、Ｈ１コード配列を増幅した。その結果生じた断片は、ＰＤＩＳＰ（ＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含む）をコードする最後のヌクレオチドが５’側に、ＳａｃＩ制限酵素部位が３’側に隣接するＨ１コード配列であった。断片をＢｇｌＩＩおよびＳａｃＩで消化し、同じ制限酵素ですでに消化された構築物番号５４０（配列番号６１；図５２）にクローニングした。最終カセットを構築物番号７８７（配列番号８６）と称し、図７０に示す。
Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（構築物番号７９０）
アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）のシグナルペプチド（ヌクレオチド３２〜１０３；受託番号Ｚ１１４９９；配列番号３４；図１７）を、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３のＨＡ０コード配列と以下のように連結した。ＰＤＩＳＰを、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））に示されているＰＣＲに基づくライゲーション法により、Ｈ３コード配列に連結した。１巡目のＰＣＲでは、ＰＤＩＳＰに融合されたプラストシアニンプロモーターのセグメントを、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨ３Ｂ−ＳｐＰＤＩ．ｒ（配列番号８７）を使用し、構築物５４０（配列番号６１；図５２）を鋳型として用いて増幅した。並行して、Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７のコード配列の一部（コドン１７からＳｐｅＩ制限酵素部位まで）を含有する別の断片を、プライマーＳｐＰＤＩ−Ｈ３Ｂ．ｃ（配列番号８８）およびＨ３（Ａ−Ｂｒｉ）．９８２ｒ（配列番号８９）を用い、構築物７７６（配列番号６９；図６０）を鋳型として使用して増幅した。その後、増幅産物を混合し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨ３（Ａ−Ｂｒｉ）．９８２ｒ（配列番号８９）を用いる２巡目の増幅（構築反応）用の鋳型として使用した。その結果生じた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）およびＳｐｅＩ（Ｈ３コード配列中）で消化し、同じ制限酵素ですでに消化された構築物番号７７６（配列番号６９；図６０）にクローニングして、構築物番号７９０（配列番号９０）を生成した。構築物を図７１に示す。
ＨＡ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（構築物番号７９８）
アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）のシグナルペプチド（ヌクレオチド３２〜１０３；受託番号Ｚ１１４９９；配列番号３４；図１７）を、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６巻：７７〜８５（１９９５年））に示されているＰＣＲに基づくライゲーション法により、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡのＨＡ０コード配列に連結した。１巡目の増幅では、ＰＤＩＳＰに融合されたプラストシアニンプロモーターの部分を、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨＢＦ−ＳｐＰＤＩ．ｒ（配列番号９１）を使用し、構築物番号５４０（配列番号６１；図５２）を鋳型として使用して増幅した。並行して、プラストシアニンターミネーターに融合されたＨＢ Ｂ／Ｆｌｏのコード配列の部分を含有する別の断片を、プライマーＳｐＰＤＩ−ＨＢＦ．ｃ（配列番号９２）およびＰｌａｓｔｅｒ８０ｒ（配列番号９３）を用い、構築物番号７７９（配列番号７３；図６４）を鋳型として使用して増幅した。その後、ＰＣＲ産物を混合し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＰｌａｓｔｅｒ８０ｒ（配列番号９３）を用いる２巡目の増幅（構築反応）用の鋳型として使用した。その結果生じた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）およびＡｆｌＩＩ（ＨＡ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６コード配列中）で消化し、同じ制限酵素ですでに消化された構築物番号７７９（配列番号７３；図６４）にクローニングして、構築物番号７９８（配列番号９４）を生成した。その結果生じた発現カセットを図７２に示す。
ＣＰＭＶ−ＨＴに基づく発現カセットの構築
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットでは、１１５位および１６１位において変異ＡＴＧを有するカウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２に由来するヌクレオチド１〜５１２により５’において、およびＣＰＭＶ ＲＮＡ２に由来するヌクレオチド３３３０〜３４８１（３’ＵＴＲに対応する）により３’において隣接され、ＮＯＳターミネーターがその後に続く目的コード配列を含むｍＲＮＡの発現を制御するために３５Ｓプロモーターが使用される。プラスミドｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣ（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙら、２００８年；Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ６巻：８２〜９２頁、および国際公開第２００７／１３５４８０号）を、ＣＰＭＶ−ＨＴに基づく赤血球凝集素発現カセットの構築に使用した。ＣＰＭＶ ＲＮＡ２の１１５位および１６１位におけるＡＴＧの変異は、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））に示されているＰＣＲに基づくライゲーション法を使用して行った。ｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣを鋳型として使用して、２つの別々のＰＣＲを実施した。第１の増幅用のプライマーは、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号７７）およびＭｕｔ−ＡＴＧ１１５．ｒ（配列番号７８）である。第２の増幅用のプライマーは、Ｍｕｔ−ＡＴＧ１６１．ｃ（配列番号７９）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号８０）だった。その後、２つの取得された断片を混合し、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号７７）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号８０）をプライマーとして使用する第３の増幅用の鋳型として使用する。その結果生じた断片をＰａｃＩおよびＡｐａＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣにクローニングする。８２８と称する生成された発現カセットの配列は、図６８（配列番号８１）に示されている。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット（構築物番号５８０）におけるＳｐＰＤＩ−Ｈ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９の構築
Ｈ１ Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９に由来するＨＡ０に融合されたアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（先頭ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号９５）およびＳｔｕＩ−Ｈ１（Ａ−ＮＣ）．ｒ（配列番号９６）を用い、構築物番号５４０（配列番号６１；図５２）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号５８０（配列番号９７）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＨ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５の構築（構築物番号６８５）
Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨ５のコード配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−Ｈ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）．１ｃ（配列番号９８）およびＨ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号９９）を用い、構築物番号６６０（配列番号６０；図５１）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号６８５（配列番号１００）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＳｐＰＤＩ−Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５の構築（構築物番号６８６）
Ｈ５ Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５に由来するＨＡ０に融合されたアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号９５）およびＨ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号９９）を用い、構築物番号６６３（配列番号８３）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号６８６（配列番号１０１）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＨ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７の構築（構築物番号７３２）
Ｈ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨＡのコード配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−Ｈ１Ｂ．ｃ（配列番号１０２）およびＳｔｕＩ−Ｈ１Ｂ．ｒ（配列番号１０３）を用い、構築物番号７７４（配列番号６２；図５３）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号７３２（配列番号１０４）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＳｐＰＤＩ−Ｈ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７の構築（構築物番号７３３）
Ｈ１ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨＡ０に融合されたアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号９５）およびＳｔｕＩ−Ｈ１Ｂ．ｒ（配列番号１０３）を用い、構築物番号７８７（配列番号８６）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号７３３（配列番号１０５）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＨ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７の構築（構築物番号７３５）
Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨＡのコード配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−Ｈ３Ｂ．ｃ（配列番号１０６）およびＳｔｕＩ−Ｈ３Ｂ．ｒ（配列番号１０７）を用い、構築物番号７７６（配列番号６９）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号７３５（配列番号１０８）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＳｐＰＤＩ−Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７の構築（構築物番号７３６）
Ｈ３ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨＡ０に融合されたアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号９５）およびＳｔｕＩ−Ｈ３Ｂ．ｒ（配列番号１０７）を用い、構築物番号７９０（配列番号９０）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号７３６（配列番号１０９）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＨＡ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６の構築（構築物番号７３８）
Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡのコード配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−ＨＢＦ．ｃ（配列番号１１０）およびＳｔｕＩ−ＨＢＦ．ｒ（配列番号１１１）を用い、構築物番号７７９（配列番号７３；図６４）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号７３８（配列番号１１２）と称する。
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＳｐＰＤＩ−ＨＡ Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６の構築（構築物番号７３９）
Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡ０に融合されたアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにＣＰＭＶ−ＨＴへクローニングした。制限酵素部位ＡｐａＩ（ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（終止コドンのすぐ下流）を、プライマーＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（配列番号９５）およびＳｔｕＩ−ＨＢＦ．ｒ（配列番号１１１）を用い、構築物番号７９８（配列番号９４）を鋳型として使用してＰＣＲ増幅を実施することにより、赤血球凝集素コード配列に付加した。その結果生じた断片を、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化された構築物番号８２８（配列番号８１）にクローニングした。その結果生じたカセットを構築物番号７３９（配列番号１１３）と称する。
シャペロン発現カセットの構築
２つのヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ）発現カセットを構築した。第１のカセットでは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（生態型コロンビア）細胞質ＨＳＰ７０（Ｌｉｎら（２００１年）Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ６巻：２０１〜２０８頁のＡｔｈｓｐ７０−１）の発現を、アルファルファ亜硝酸レダクターゼ（Ｎｉｒ）およびアルファルファプラストシアニンプロモーターのエレメントを組み合わせたキメラプロモーター（Ｎｉｒ／Ｐｌａｓｔｏ）により制御する。キメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーターの制御下にあるアルファルファ細胞質ＨＳＰ４０（ＭｓＪ１；Ｆｒｕｇｉｓら（１９９９年）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻：３９７〜４０８頁）のコード領域を含む第２のカセットも構築した。
植物バイナリーベクター中にアルファルファ亜硝酸レダクターゼプロモーター（Ｎｉｒ）、ＧＵＳレポーター遺伝子、およびＮＯＳターミネーターを含有する受容プラスミドを最初に構築した。プラスミドｐＮｉｒ３Ｋ５１（米国特許第６，４２０，５４８号に既述されている）を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。その結果生じた断片を、同じ制限酵素により消化されたｐＣＡＭＢＩＡ２３００（Ｃａｍｂｉａ社、Ｃａｎｂｅｒｒａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にクローニングして、ｐＣＡＭＢＩＡ−Ｎｉｒ３Ｋ５１を生成した。
Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０のコード配列を、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））に示されているＰＣＲに基づくライゲーション法により、受容プラスミドｐＣＡＭＢＩＡＮｉｒ３Ｋ５１中に別々にクローニングした。
Ｈｓｐ４０の場合、Ｍｓｊ１コード配列（配列番号１１４）は、プライマーＨｓｐ４０Ｌｕｚ．１ｃ（配列番号１１５）およびＨｓｐ４０Ｌｕｚ−ＳａｃＩ．１２７２ｒ（配列番号１１６）を使用して、アルファルファ（生態型レンジランダー（Ｒａｎｇｅｌａｎｄｅｒ））の葉の全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。第２の増幅は、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨｓｐ４０Ｌｕｚ−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号１１７）を使用し、構築物６６０（配列番号６０；図５１）を鋳型として用いて実施した。その後、ＰＣＲ産物を混合し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨｓｐ４０Ｌｕｚ−ＳａｃＩ．１２７２ｒ（配列番号１１６）を用いる第３の増幅（構築反応）用の鋳型として使用した。その結果生じた断片を、ＨｐａＩ（プラストシアニンプロモーター中）で消化し、ＨｐａＩ（Ｎｉｒプロモーター中）およびＳａｃＩですでに消化され、平滑末端を生成するためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで仕上げられたｐＣＡＭＢＩＡＮｉｒ３Ｋ５１にクローニングした。取得されたクローンを、方向性の正しさについてスクリーニングし、配列完全性について配列決定した。その結果生じたプラスミドをＲ８５０と称し、図８３に示す（配列番号１２１）。Ａｔｈｓｐ７０−１のコード領域は、プライマーＨｓｐ７０Ａｒａ．１ｃ（配列番号１１８）およびＨｓｐ７０Ａｒａ−ＳａｃＩ．１９５６ｒ（配列番号１１９）を使用して、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの葉のＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨｓｐ７０Ａｒａ−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号１２０）を使用し、構築物６６０（配列番号６０；図５１）を鋳型として用いて、第２の増幅を実施した。その後、ＰＣＲ産物を混合し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＨｓｐ７０ＡＲＡ−ＳａｃＩ．１９５６ｒ（配列番号１１９）を用いる第３の増幅（構築反応）用の鋳型として使用した。その結果生じた断片を、ＨｐａＩ（プラストシアニンプロモーター中）で消化し、ＨｐａＩ（Ｎｉｒプロモーター中）およびＳａｃＩで消化され、平滑末端を生成するためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで仕上げられたｐＣＡＭＢＩＡＮｉｒ３Ｋ５１にクローニングした。取得されたクローンを、方向性の正しさについてスクリーニングし、配列完全性について配列決定した。その結果生じたプラスミドをＲ８６０と称し、図８４に示す（配列番号１２２）。
Ｈｓｐ発現２重プラスミドを以下のように構築した。Ｒ８６０をＢｓｒＢＩ（ＮＯＳターミネーターの下流）で消化し、平滑末端を生成するためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＳｂｆＩ（キメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーターの上流）で消化した。その結果生じた断片（キメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーター−ＨＳＰ７０コード配列−Ｎｏｓターミネーター）を、ＳｂｆＩおよびＳｍａＩ（両方ともキメラＮｉｒ／Ｐｌａｓｔｏプロモーター上流のマルチクローニング部位に位置する）ですでに消化されたＲ８５０にクローニングした。その結果生じたプラスミドをＲ８７０と称し、図８５に示す（配列番号１２３）。
他の発現カセットの構築
可溶性Ｈ１発現カセット
可溶性型のＨ１をコードするカセットは、５４０の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をコードする領域を、ロイシンジッパーＧＣＮ４ ｐＩＩ変異体をコードする断片で置換することにより調製した（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３年；２６２巻：１４０１〜１４０７頁）。この断片は、クローニングを促進するためにＫｐｎＩおよびＳａｃＩ部位を隣接させて合成された。この置換から生じるプラスミドを５４４と称し、発現カセットを図１１に例示した。
Ｍ１ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４発現カセット
タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲとインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ Ｍ１遺伝子（受託番号ＮＣ＿００２０１６）のオープンリーディングフレームとの間の融合物は、隣接ＳａｃＩ部位を終止コドンに下流に付加して合成した。断片をＳｗａＩ（ＴＥＶ ５’ＵＴＲ中）およびＳａｃＩで消化し、ｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミド中の２Ｘ３５Ｓ／ＴＥＶに基づく発現カセットにクローニングした。その結果生じたプラスミドは、２Ｘ３５Ｓ／ＴＥＶプロモーターおよび５’ＵＴＲならびにＮＯＳターミネーターの制御下でＭ１コード領域を保持した（構築物７５０；図１１）。
ＨｃＰｒｏ発現カセット
Ｈａｍｉｌｔｏｎら（２００２年）に記載されているように、ＨｃＰｒｏ構築物（３５ＨｃＰｒｏ）を調製した。クローンはすべて構築物の完全性を確認するために配列決定した。これらのプラスミドを使用して、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＧＬ１；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１０８、ＵＳＡ）をエレクトロポレーションにより形質転換した（Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈ、１９８９年ら）。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株の完全性はすべて、制限酵素マッピングにより確認した。
Ｐ１９発現カセット
トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質のコード配列を、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２６巻：７７〜８５頁（１９９５年））に示されているＰＣＲに基づくライゲーション法により、アルファルファプラストシアニン発現カセットに連結した。１巡目のＰＣＲでは、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびｓｕｐＰ１９−ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号１２４）を使用し、構築物６６０（配列番号６０；図５１）を鋳型として用いて増幅した。並行して、ｐ１９のコード配列を含有する別の断片を、プライマーｓｕｐＰ１９−１ｃ（配列番号１２５）およびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号１２６）を用い、Ｖｏｉｎｎｅｔら（Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３巻：９４９〜９５６頁（２００３年））に記載されているような構築物３５Ｓ：ｐ１９を鋳型として使用して増幅した。その後、増幅産物を混合し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ（配列番号４；図７Ａ）およびＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号１２６）を用いる２巡目の増幅（構築反応）用の鋳型として使用した。その結果生じた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）およびＳａｃＩ（ｐ１９コード配列の末端にある）で消化し、同じ制限酵素ですでに消化された構築物番号６６０（配列番号６０；図５１）にクローニングして、構築物番号Ｒ４７２を生成した。プラスミドＲ４７２は図８６に示されている。
３．植物バイオマス、接種材料、アグロインフィルトレーション、および回収の準備
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ植物は、市販の泥炭コケ基質で満たされた平箱で種から栽培した。植物は、１６／８光周期および日中２５℃／夜間２０℃の温度レジメンの下で温室栽培した。播種の３週間後に、個々の小植物を選び出し、鉢に移植し、同じ環境条件下でさらに３週間温室で成長させておいた。形質転換に先立って、頂芽および腋芽を、植物から芽を摘むことによりまたは化学的に植物を処理することにより、下記に示されている種々の時点で植物から取り除いた。
各構築物で形質移入されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを、それらが０．６から１．６のＯＤ６００に達するまで、１０ｍＭの２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭのアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、および２５μｇ／ｍｌのカルベニシリン ｐＨ５．６で補完されたＹＥＢ培地で栽培した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁した。ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１０５巻：３４３〜３４８頁）により記載されているように、注射器浸潤を実施した。減圧浸潤の場合、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ懸濁液を遠心分離し、浸潤培地中に再懸濁し、４℃で終夜保管した。浸潤した日に、培養バッチを２．５培養容積に希釈し、使用前に暖めておいた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａまたはＮ．ｔａｂａｃｕｍｗｅｒｅの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの減圧下の気密ステンレス鋼タンク中で、２分間細菌懸濁液に上下逆さまにして設置した。注射器浸潤または減圧浸潤をした後、植物を温室に戻して、回収まで４〜５日間インキュベーションした。別段の定めがない限り、１：１比率の菌株ＡＧＬ１／Ｒ４７２で共浸潤したＣＰＭＶ−ＨＴカセット保持菌株を除いて、浸潤はすべて、１：１比率のＡＧＬ１／３５Ｓ−ＨｃＰｒｏを用いた共浸潤として実施した。
４．葉試料採取および全タンパク質抽出
インキュベーションした後、植物の地上部を回収し、−８０℃で凍結し、粉々に粉砕した。全可溶性タンパク質を、３容積分の冷却５０ｍＭトリスｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中で、凍結粉砕された植物材料の各試料をホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎで）により抽出した。ホモジナイズした後、スラリーを４℃、２０，０００ｇで２０分間遠心分離し、清澄化された粗抽出液（上清）を分析用に保管した。清澄化された粗抽出液の全タンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを標準物質として使用して、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）により決定した。
５．タンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー
３２ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−５００高分解能ビーズのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（Ｓ−５００ＨＲ：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、カタログ番号１７−０６１３−１０）を充填し、平衡／溶出緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化した。１．５ミリリットルの粗タンパク質抽出物をカラムに添加し、その後４５ｍＬの平衡／溶出緩衝液を用いた溶出ステップが続いた。溶出液を１．５ｍＬの画分で収集し、１０μＬの画分を２００μＬのＢｉｏ−Ｒａｄ社製希釈タンパク質染色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）と混合することにより、溶出画分の相対的タンパク質含有量をモニターした。カラムを、２カラム容積の０．２Ｎ ＮａＯＨ、その後１０カラム容積の５０ｍＭトリスｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０％エタノールで洗浄した。各分離の後で、ブルーデキストラン２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いてカラムを較正した。ブルーデキストラン２０００および宿主可溶性タンパク質の溶出特性を各分離間で比較して、使用したカラム間の溶出特性が均一だったことを保証した。
６．タンパク質分析およびイムノブロッティング
タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｒｏｃｋｐｏｒｔ、ＩＬ）により決定した。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、クマシーブルーで染色した。染色されたゲルを走査し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ製）を使用してデンシトメトリー分析を実施した。
ＳＥＣからの溶出画分に由来するタンパク質をアセトンで析出させ（Ｂｏｌｌａｇら、１９９６年）、平衡／溶出緩衝液中１／５容積に再懸濁し、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、免疫検出用のポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）にエレクトロトランスファーした。イムノブロッティングに先立ち、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）中５％スキムミルクおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて、１６〜１８時間４℃で膜をブロックした。
イムノブロッティングは、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中の２％キムミルク中で、２μｇ／ｍｌの好適な抗体（表６）と共にインキュベーションすることにより実施した。化学発光検出用に使用された二次抗体は、表４に示されており、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％中の２％スキムミルクで指示通りに希釈した。免疫応答性複合体を、ルミノールを基質として使用した化学発光により検出した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）。ヒトＩｇＧ抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素との抱合は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ（登録商標）活性化ペルオキシダーゼ抱合キット（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）の使用により実施した。Ｈ１、Ｈ３、およびＢ亜型の検出用対照として使用した全不活化全ウイルス（ＷＩＶ）は、国立生物学的製剤研究所（ＮＩＢＳＣ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）から購入した。
Ｈ５用の血球凝集アッセイは、ＮａｙａｋおよびＲｅｉｃｈｌ（２００４年）により記載されている方法に基づいていた。手短かに言えば、Ｖ底型９６ウエルマイクロタイタープレートで、試験試料（１００μＬ）を連続２倍希釈し、プレートは１ウエル当たり１００μＬのＰＢＳを含有し、１００μＬの希釈試料が残った。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁液（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ社（Ｓｙｒａｃｕｓｅ、ＮＹ）を各ウエルに添加し、プレートを室温で２時間インキュベーションした。完全な血球凝集を示す最も高い希釈の逆数を、ＨＡ活性として記録した。並行して、組換えＨＡ標準物質（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）を、ＰＢＳで希釈し、各プレートの対照として実行した。
７．ショ糖勾配超遠心分離
Ｈ５含有バイオマスのゲル濾過クロマトグラフィーから溶出した１ミリリットルの画分９、１０、および１１をプールし、２０〜６０％（質量／容積）不連続ショ糖密度勾配に添加し、１２５０００ｇ（４℃）で１７．５時間遠心分離した。勾配を、上から始めて１９ ３ｍＬ画分に分画し、免疫学的分析および血球凝集アッセイに先立ち、透析してショ糖を取り除いた。
８．電子顕微鏡
１００マイクロリットルの検討試料を、Ａｉｒｆｕｇｅ超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に入れた。チューブの底にグリッドを設置し、その後それを１２００００ｇで５分間遠心分離した。グリッドを取り除き、穏やかに乾燥させ、染色のために一滴の３％リンタングステン酸ｐＨ６上に置いた。グリッドを、Ｈｉｔａｃｈｉ社製７１００型透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で検討した（画像は、図１４Ｂ、１５Ｂ、および１５Ｃ）。
図１９の画像の場合、およそ１ｍｍ３の葉ブロックを、２．５％グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳで固定し、１．３３％四酸化オスミウムでの固定後ステップの前に、３％ショ糖を含有するＰＢＳで洗浄した。固定化試料をスパー樹脂に埋め込み、極薄層をグリッドにかぶせた。試料を、５％酢酸ウラニルおよび０，２％クエン酸鉛で観察前に陽染した。グリッドを、Ｈｉｔａｃｈｉ社製７１００型透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で検討した。
９．原形質膜脂質分析
原形質膜（ＰＭ）を、ポリエチレングリコール３３５０／デキストランＴ−５００（各６．６％）を有する水性高分子二相系で分配することにより、Ｍｏｎｇｒａｎｄらによる細胞分画後にタバコ葉および培養ＢＹ２細胞から取得した。ステップはすべて４℃で実施した。
脂質を、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒにより、異なる画分から抽出および精製した。極性脂質および中性脂質を、Ｌｅｆｅｂｖｒｅらに記載されている溶剤系を使用して、単次元ＨＰ−ＴＬＣにより分離した。ＰＭ画分の脂質を、Ｍａｃａｌａらにより記載されているように、酢酸銅による染色後に検出した。それらの移動時間を標準物質と比較することにより、脂質を識別した（Ｍａｔｒｅｙａ社、Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ、ＰＡ、ＵＳＡから取得されたＳＧを除いて、標準物質はすべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから所得した）。
１０． Ｈ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５）の精製
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの凍結６６０浸潤葉を、１．５容積の５０ｍＭトリスｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０４％メタ重亜硫酸ナトリウム中で、市販のブレンダーを使用してホモジナイズした。その結果生じた抽出物を１ｍＭ ＰＭＳＦで補完し、４２℃で５分間加熱する前に１Ｍ酢酸でｐＨ６に調整した。熱処理した抽出物にケイソウ土（ＤＥ）を添加して、ｐＨ変化および熱処理により析出した不純物を吸着させ、スラリーをＷｈａｔｍａｎ社製のろ紙で濾過した。その結果生じた清澄化抽出液を室温で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離して、残留ＤＥを取り除き、０．８／０．２μｍのＡｃｒｏｐａｃｋ２０フィルターで濾過し、フェチュイン−アガロースアフィニティーカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に添加した。４００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ６での洗浄ステップ後、結合しているタンパク質を、１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６で溶出した。溶出したＶＬＰをＴｗｅｅｎ−８０で補完して、０．０００５％（容積／容積）の終濃度にした。ＶＬＰを１００ｋＤａ ＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎ膜で濃縮し、４℃で３０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０および０．０１％チメロサールを有するＰＢＳ ｐＨ７．４に再懸濁した。懸濁ＶＬＰを、使用前にフィルター滅菌した。
１１．動物研究
マウス
インフルエンザＶＬＰ投与に対する免疫応答に関する研究を、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で実施した。７０匹のマウスを、動物５匹ずつの１４群に無作為に分割した。８群を筋肉内免疫に使用し、６群を鼻腔内投与経路の試験用に使用した。全群を２回投与のレジメンで免疫し、初回免疫の３週間後に追加免疫を行った。
後肢の筋内投与の場合、非麻酔下のマウスを、植物で作られたＨ５ ＶＬＰ（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）ワクチン（０．１、１、５、または１２μｇ）、または対照赤血球凝集素（Ｈ５）抗原のいずれかで免疫した。対照Ｈ５は、菌株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ Ｈ５Ｎ１に基づいて生産され、２９３細胞培養（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）から精製された組換え可溶性赤血球凝集素を含んでいた（そうでないと指示されていない限り、１回の注射当たり５μｇで使用された）。緩衝液対照はＰＢＳだった。この抗原は、ＨＡタンパク質のアミノ酸１８から５３０からなり、Ｈｉｓタグおよび修飾切断部位を有する。電子顕微鏡により、この製品はＶＬＰの形態をしていないことを確認した。
アジュバントの影響を測定するために、２群の動物を、１容積のアルハイドロゲル２％（ミョウバン、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳ）と５μｇの植物で作られたＶＬＰ Ｈ５ワクチンで、または１容積のミョウバンと、２９３細胞培養から精製された５μｇの組換え赤血球凝集素で免疫した。７０匹のマウスを、動物５匹ずつの１４群に無作為に分割した。８群を筋肉内免疫に使用し、６群を鼻腔内投与経路の試験用に使用した。全群をプライムブーストレジメンにより免疫し、初回免疫の３週間後に追加免疫を実施した。
後肢の筋内投与の場合、非麻酔下のマウスを、植物で作られたＨ５ ＶＬＰ（０．１、１、５、または１２μｇ）、または対照赤血球凝集素（Ｈ５）抗原（５μｇ）もしくはＰＢＳで免疫した。抗原調製物はすべて、免疫に先立って、１％アルハイドロゲル（ミョウバン、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳ）と１：１容積比で混合した。アジュバントの効果を測定するために、２群の動物を、５μｇの植物で作られたＶＬＰ Ｈ５ワクチン、またはいかなるアジュバントも有していない５μｇの対照ＨＡ抗原のいずれかで免疫した。
鼻腔内の投与の場合、手短かに言えば、自動導入チャンバーを使用したイソフルランの吸入によりマウスに麻酔をかけた。その後、植物で作られたＶＬＰワクチン（０．１または１μｇ）、またはＨＡ抗原（１μｇ）もしくはＰＢＳを有する４μｌの液滴／鼻孔の付加によりマウスを免疫した。抗原調製物はすべて、免疫に先立って、グルタミン酸キトサン１％（プロトサン（Ｐｒｏｔｏｓａｎ）、Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ／ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ社、Ｎｏｒｗａｙ）と混合した。その後、マウスは溶液中で呼吸した。鼻腔内投与経路でのアジュバントの効果を測定するために、２群の動物を、１μｇの植物で作られたＶＬＰ Ｈ５ワクチン、または１μｇの対照ＨＡ抗原で免疫した。
フェレット
フェレット（雄、１８〜２４週齢、体重およそ１ｋｇ）５匹ずつの１０群を使用した。各群の処理は、表７に説明されている。使用されたアジュバントは、２％アルハイドロゲル（ミョウバン）（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）だった（最終＝１％）。ワクチン組成物は、記載されているように生産された、膜関連Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ＶＬＰだった。ワクチン対照（陽性対照）は、Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＩＴＣ）社による２９３細胞培養中でアデノウイルスを使用して生産したインドネシア菌株に由来する完全グリコシル化膜結合型組換えＨ５だった。
フェレットは、健康全般および外観（体重、直腸温、姿勢、毛皮、運動パターン、呼吸、排泄）を研究中定期的に評価した。０、１４、および２８日目に大腿四頭筋に筋肉内注射（全容積０．５〜１．０）することにより動物を免疫し、アジュバントを組み込んだプロトコールの場合、ワクチン組成物を１：１の容積比で免疫直前にアルハイドロゲルと混合した。血清試料は、免疫前の０日目、ならびに２１および３５日目に取得した。４０〜４５日目に動物を犠牲にし（放血／心穿刺）、脾臓を収集し、剖検を実施した。
抗インフルエンザ抗体力価は、相同性または異種性不活化Ｈ５Ｎ１ウイルスを使用してＥＬＩＳＡで定量化することができる。
血清試料の血球凝集阻害性抗体力価（免疫前、２１日目、および３５日目）は、記載されているようにマイクロタイターＨＡＩにより評価することができる（Ａｙｍａｒｄら、１９７３年）。手短かに言えば、血清を受容体破壊酵素で前処理し、加熱不活化し、赤血球の懸濁液（洗浄赤血球−ＲＢＣ）と混合した。Ｌａｍｐｉｒｅ社製のウマ洗浄ＲＢＣ（１０％）が推奨されており、アッセイがＲＢＣの供給源に依存して変動すること（ウマ依存性）を考慮して、１０頭のウマに由来する洗浄ＲＢＣを試験して最も感受性の高いバッチを選択した。あるいは、シチメンチョウＲＢＣを使用してもよい。抗体力価は、完全に血球凝集を阻害する最も高い希釈の逆数として表した。
交差反応性ＨＡＩ力価：Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（クレード２．１）のワクチンで免疫されたフェレットのＨＡＩ力価は、クレード１ベトナム菌株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４またはＡ／Ａｎｈｕｉ／０１／２００５（サブクレード２．３）またはＡ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（サブクレード２．２）などの別のサブクレードまたはクレードに由来する不活化Ｈ５Ｎ１インフルエンザ菌株を使用して測定した。すべての分析を個々の試料について実施した。
データ分析：統計分析（ＡＮＯＶＡ）を全データで実施して、群間の差異が統計学的に有意かどうかを確立した。
致死的免疫誘発の実験設計（マウス）
１２８匹のマウスを、動物８匹ずつの１６群に無作為に分割し、１つの群は免疫されず、免疫誘発されなかった（陰性対照）。全群を２回投与のレジメンで筋肉内投与により免疫し、初回免疫の２週間後に２回目の免疫を行った。
後肢の筋内投与の場合、非麻酔下のマウスを、植物で作られたＨ５ ＶＬＰ（１、５、または１５μｇ）、または１５μｇの対照ＨＡ抗原もしくはＰＢＳで免疫した。抗原調製物はすべて、免疫に先立って、１％アルハイドロゲル（ミョウバン、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳ）と混合した。
免疫期間中、週１回マウスの体重を測定し、注射部位の局所反応を観察およびモニターした。
２回目の免疫の２２日後、ＢＬ４封じ込め実験室（Ｐ４−Ｊｅａｎ Ｍｅｒｉｅｕｘ−ＩＮＳＥＲＭ社、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）内で、麻酔下のマウスを、４．０９×１０６
５０％細胞培養感染量（ＣＣＩＤ５０）のインフルエンザＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／５８２／０６ウイルス（Ｂｒｕｎｏ Ｌｉｎａ博士の好意により提供された、リヨン大学、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で鼻腔内（ｉ．ｎ．）で免疫誘発した。免疫誘発後、１４日間にわたってマウスの病的臨床症状を観察し、体重を毎日測定した。重度の感染症症状および２５％以上の体重減少を示したマウスを麻酔後に安楽死させた。
血液採取、肺および鼻の洗浄、および脾臓収集
側方伏在静脈血液採取は、初回免疫の１４日後および２回目の免疫の１４日後に非麻酔下の動物で実施した。８０００ｇで１０分間遠心分離することにより血清を収集した。
２回目の免疫の４週間後に、マウスをＣＯ２ガスで麻酔にかけ、終了後直ちに心穿刺を使用して血液を採取した。
最終出血後、カテーテルを肺に向かって気管に挿入し、１ｍｌの冷却ＰＢＳ−プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を、カテーテルに装着された１ｃｃ注射器に充填し、肺に注入し、その後分析用に取り出した。この洗浄手順を２回実施した。肺洗浄液を遠心分離して、細胞残屑を取り除いた。鼻洗浄の場合、カテーテルを鼻腔領域に向けて挿入し、０．５ｍｌのＰＢＳ−プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を、カテーテルにより鼻通に押し出し、その後収集した。鼻洗浄液を遠心分離して、細胞残屑を取り除いた。アジュバントされた５μｇの植物で作られたワクチンまたはアジュバントされた５μｇの組換えＨ５抗原で筋肉内免疫されたマウスに対して、ならびにアジュバントされた１μｇの植物で作られたワクチンまたはアジュバントされた１μｇの組換えＨ５抗原を鼻腔内免疫したマウスに対して脾臓収集を実施した。収集した脾臓を、ゲンタマイシンで補完されたＲＰＭＩに入れ、１０ｍｌ注射器のプランジャーを用いて５０ｍｌの円錐管中ですりつぶした。すりつぶした脾臓を２回すすぎ、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、室温で５分間ＡＣＫ溶解緩衝液に再懸濁した。脾細胞をＰＢＳ−ゲンタマイシンで洗浄し、５％ＲＰＭＩに再懸濁し、計数した。脾細胞を増殖アッセイに使用した。
抗体力価
血清の抗インフルエンザ抗体力価は、初回免疫の１４日後、ならびに２回目の免疫の１４および２８日後に測定した。力価は、不活化ウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５をコーティング抗原として使用して、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。エンドポイント力価は、陰性対照試料のそれより少なくとも０．１高いＯＤ値に達した最も高希釈の逆数値として表した。
抗体クラス決定（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）の場合、力価は、以前に記述されているようにＥＬＩＳＡにより評価された。
赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価
血清の赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価は、以前に記述されているように（ＷＨＯ ２００２年；Ｋｅｎｄａｌ １９８２年）、２回目の免疫の１４および２８日後に測定した。菌株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４に由来する不活化ウイルス調製物を使用して、マウス血清試料をＨＩ活性について検査した。血清を、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ（Ｋｅｎｄａｌ １９８２年）から調製された受容体破壊酵素ＩＩ（ＲＤＥＩＩ）（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．社、東京、日本）で前処理した。ＨＩアッセイは、０．５％シチメンチョウ赤血球を用いて実施した。ＨＩ抗体力価は、凝集反応の完全な阻害を引き起こす最も高希釈の逆数として定義された。
（実施例１）
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるアグロインフィルトレーションによるインフルエンザウイルスＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）赤血球凝集素の一過性発現
インフルエンザ赤血球凝集素を生産する一過性発現系の能力は、株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨ５亜型の発現により判定した。図１１に示されている通り、天然シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを有する赤血球凝集素遺伝子コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ５４１３９４）を、プラストシアニン発現カセット−アルファルファプラストシアニン遺伝子に由来するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列−で最初に構築し、および構築したカセット（６６０）をｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドに挿入した。このプラスミドを、次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＡＧＬ１）にトランスフェクトし、一過性発現に使用する組換え株ＡＧＬ１／６６０を生産した。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物はＡＧＬ１／６６０をインフィルトレーションし、６日間のインキュベーション期間後に葉を回収した。アグロインフィルトレーションした葉にＨ５が蓄積しているかどうかを判定するため、タンパク質をインフィルトレーションした葉組織から最初に抽出し、抗Ｈ５（Ｖｉｅｔｎａｍ）ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。インフルエンザ赤血球凝集素の非切断ＨＡ０形態とサイズが対応する、約７２ｋＤａの固有のバンドが抽出物において検出された（図１２）。陽性対照として使用した市販のＨ５（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）が、ＨＡ１およびＨＡ２断片の分子量とそれぞれ対応する、約４８および２８ｋＤａの２つのバンドとして検出された。これは、インフィルトレーションした葉におけるＨ５の発現が、非切断翻訳産物の蓄積をもたらすことを示した。
活性ＨＡ三量体の形成は、ＡＧＬ１／６６０で形質転換した葉からの粗タンパク質抽出物の、シチメンチョウ赤血球細胞を凝集する能力により示された（データ不図示）。
（実施例２）
サイズ排除クロマトグラフィーを用いた植物抽出物における血球凝集素含有構造の特性化
植物で生産されたインフルエンザ赤血球凝集素の高分子量構造への集合は、ゲル濾過により評価した。ＡＧＬ１／６６０をインフィルトレーションした植物からの粗タンパク質抽出物（１．５ｍＬ）を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−５００ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分画した。溶出画分を、総タンパク質含量およびＨＡ存在量について抗ＨＡ抗体による免疫検出によりアッセイした（図１３Ａ）。図１３Ａに示されている通り、大部分の宿主タンパク質がカラムに保持され、および画分１４から２２の間で溶出されたのに対し、ブルーデキストラン（２ＭＤａ）溶出は、画分１０で早期にピークに達した。各ＳＥＣ溶出画分２００μＬからのタンパク質を、アセトン沈殿により濃縮し（５倍）、ウェスタンブロッティングにより分析した場合（図１５Ａ、Ｈ５）、赤血球凝集素（Ｈ５）は主に画分９から１４で見出された（図１３Ｂ）。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、ＨＡタンパク質が、大きな上部構造に集合したか、または高分子量構造に付着したことを示唆する。
第２の発現カセットを、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）に由来するＨ１核酸配列（配列番号３３；図１６；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２８９９２９）により構築して構築物５４０を生産した（図１１）。キメラ遺伝子構築物は、シグナルペプチドが植物タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子に由来するＨ１の可溶性三量体形態を生産するように設計し、およびＨ１の膜貫通ドメインを、三量体への自己組織化が示されたペプチドである、ＧＣＮ４ロイシンジッパーのｐＩＩバリアントにより置換した（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３年）（カセット５４４、図１１）。膜貫通ドメインを欠くものの、この可溶性三量体形態は赤血球凝集することができた（データ不図示）。
ＡＧＬ１／５４０またはＡＧＬ１／５４４をインフィルトレーションした植物からのタンパク質抽出物はＳＥＣにより分画し、およびＨ１溶出画分の存在は抗Ａ型インフルエンザ抗体によるウェスタンブロッティングにより調べた（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）。ＡＧＬ１／５４０をインフィルトレーションした葉では、Ｈ１は極めて高分子量の構造として蓄積し、ピークはより小さなサイズ構造の方に偏っていた（Ｈ１；図１３Ｃ）。ＡＧＬ１／５４４をインフィルトレーションした葉では、宿主タンパク質溶出プロファイルに匹敵するゲル濾過からの溶出パターンにより示されたように、Ｈ１の可溶型は単離三量体として蓄積した（可溶性Ｈ１；図１３Ｄ）。相対的に、赤血球凝集素の５〜６三量体からなる（ミセルで）Ｈ１ロゼット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）は、Ｈ１の可溶型より早く（図１３Ｄ）および天然Ｈ１より遅い（図１３Ｃ）、画分１２から１６で溶出された（図１３Ｅ）。
構造への赤血球凝集素集合に対するＭ１共発現の影響を評価するため、Ｍ１発現カセットを、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）Ｍ１のコード配列（配列番号３５；図１８；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０１６）に対応する核酸を用いて構築した。構築物は７５０と命名され、図１１に示されている。Ｍ１およびＨ１の共発現については、ＡＧＬ１／５４０およびＡＧＬ１／７５０の懸濁液を、インフィルトレーション前に等容量で混合した。複数のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液の共インフィルトレーションは、複数の導入遺伝子の共発現を可能にする。ＳＥＣ溶出画分のウェスタンブロット分析は、Ｍ１の共発現は、Ｈ１構造の溶出プロファイルを改変しなかったが、アグロインフィルトレーションした葉におけるＨ１蓄積の減少をもたらしたことを示す（図１３Ｆ参照）。
（実施例３）
ショ糖勾配での遠心分離によるＨ５構造の単離および電子顕微鏡下の観察
電子顕微鏡（ＥＭ）下の赤血球凝集素構造の観察は、粗葉タンパク質抽出物でのＳＥＣから得られたものより高い濃度および純度レベルを必要とした。Ｈ５構造のＥＭ観察を可能にするため、粗葉タンパク質抽出物を、最初にＰＥＧ沈殿（２０％ＰＥＧ）により、続いて１／１０容量の抽出緩衝液での再懸濁により濃縮した。濃縮したタンパク質抽出物をＳ−５００ＨＲゲル濾過により分画し、溶出画分９、１０、および１１（カラムの空隙容量に対応）をプールし、ならびに２０〜６０％ショ糖密度勾配での超遠心分離により宿主タンパク質からさらに単離した。ショ糖勾配は、最上部から開始して分画し、画分を透析し、および分析前に１００ＮＭＷＬ遠心分離フィルターユニットで濃縮した。ウェスタンブロットおよび赤血球凝集結果に示されている通り（図１４Ａ）、Ｈ５が、約６０％ショ糖を含有する画分１６から１９に主に蓄積したのに対し、ほとんどの宿主タンパク質は画分１３でピークに達した。画分１７、１８、および１９をプールし、ネガティブ染色し、ならびにＥＭ下で観察した。試料の検査は、インフルエンザＶＬＰの形態学的特徴と一致する、８０から３００ｎｍのサイズ範囲のスパイクされた球体構造の存在を明らかに示した（図１４Ｂ）。
（実施例４）
植物バイオマスに由来するインフルエンザＨ５ ＶＬＰの精製
豊富な可溶性タンパク質含量に加えて、植物葉抽出物は、可溶性の糖、核酸および脂質の複合混合物を含有する。粗抽出物をｐＨシフトにより清澄化し、加熱処理した後、珪藻土で濾過した（清澄化方法の詳細な記載については材料および方法の項参照）。図１５Ａ（レーン１〜４）は、清澄化のさまざまなステップでのタンパク質含量を含むクマシーブルー染色されたゲルを表す。粗抽出物（レーン１）および清澄化抽出物（レーン４）におけるタンパク質含量の比較は、全体のタンパク質含量を減少させる、および粗葉抽出物において５０ｋＤａで可視可能な大きな汚染のほとんどを除去する、清澄化ステップの能力を明らかにする。５０ｋＤａバンドは、総葉タンパク質の最大３０％を表す、ＲｕＢｉｓＣＯ大サブユニットに対応する。
インフルエンザＨ５ ＶＬＰは、フェチュインカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによりこれらの清澄化された抽出物から精製した。フロースルー（図１５Ａ、レーン６）および溶出ＶＬＰ（図１５Ａ、レーン７）との添加画分（図１５Ａ、レーン５）の比較は、植物清澄化抽出物におけるインフルエンザＨ５ ＶＬＰに対するフェチュインアフィニティーカラムの特異度を示す。
精製手順は、クマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでのデンシメトリーにより判定した通り、Ｈ５において７５％を超える純度をもたらした（図１５Ａ、レーン７）。精製産物の構造品質を評価するため、精製したＨ５を、１００ＮＭＷＬ（分画分子量）遠心分離フィルターユニットで濃縮し、およびネガティブ染色後にＥＭ下で調べた。図１５Ｂは、大量のＶＬＰの存在を示す代表的セクターを示す。より詳しい検査は、ＶＬＰ上のスパイクの存在を確認した（図１５Ｃ）。
図１５Ｄに示されている通り、Ｈ５ ＶＬＰを、クマシーブルー染色したＨ５赤血球凝集素の密度、およびＢＣＡ法による総タンパク質含量判定に基づき、フェチュインカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより清澄化葉抽出物から約８９％純度に精製した。 ＨＡ ＶＬＰの生物活性は、シチメンチョウ赤血球細胞を凝集する能力により確認した（データ不図示）。
図１５Ｄも、ウェスタンブロッティングおよび抗Ｈ５ポリクローナル血清（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４）による免疫検出により可視化した精製ＶＬＰの同一性を確認する。約７２ｋＤａの固有のバンドが検出され、およびインフルエンザ赤血球凝集素の非切断ＨＡ０形態にサイズが対応する。図１５ｃは、赤血球凝集素スパイクが構造を覆っている、ワクチンのＶＬＰ構造を示す。
ＶＬＰを、０．２２μｍフィルターを介した濾過によりマウスの免疫化用に調製した。内毒素含量は内毒素ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（Ｌｉｍｕｌｕｓ変形細胞溶解物））検出キット（Ｌｏｎｚａ社、Ｗａｌｋｓｅｒｖｉｌｌｅ、ＭＳ、ＵＳＡ）を用いて測定した。濾過したワクチンは、１０５．８±１１．６％ＥＵ／ｍｌ（内毒素単位／ｍｌ）を含有した。
（実施例５）
植物におけるインフルエンザＶＬＰの局在化
ＶＬＰを局在化し、およびこの原形質膜起源を確認するため、Ｈ５生産植物の薄い葉の切片を固定化し、およびポジティブ染色後にＴＥＭ下で調べた。葉細胞の観察は、原形質膜の陥入により形成された細胞外腔におけるＶＬＰの存在を示した（図１９）。観察されたＶＬＰ形状および位置は、細胞壁上の原形質膜の並値にもかかわらず、植物細胞がこの原形質膜に由来するインフルエンザＶＬＰを生産し、およびアポプラスチックスペース（ａｐｏｐｌａｓｔｉｃ ｓｐａｃｅ）にこれを蓄積させるのに必要な可塑性を有することを示した。
（実施例６）
原形質膜脂質分析
植物インフルエンザＶＬＰの組成物および起源のさらなる確認は、脂質含量の分析から得た。脂質を精製ＶＬＰから抽出物し、この組成物を、高性能薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）により高度に精製したタバコ原形質膜の組成物と比較した。ＶＬＰおよび対照原形質膜からの極性脂質および中性脂質の移動パターンは類似していた。精製ＶＬＰは、原形質膜で見出される主なリン脂質（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン）およびスフィンゴ脂質（グルコシル−セラミド）を含有し（図２７Ａ）、両方とも唯一の中性脂質として遊離ステロールを含有した（図２７Ｂ）。しかし、精製ＶＬＰ抽出物における原形質膜タンパク質マーカー（ＡＴＰａｓｅ）の免疫検出は、ＶＬＰ脂質二重層が、植物原形質膜に関連する主なタンパク質の１つを含有しないことを示した。これは、宿主タンパク質が、植物細胞からのＶＬＰ出芽過程の間に膜から排除された可能性があることを示唆する（図２７Ｃ）。
（実施例７）
Ｈ５ ＶＬＰの免疫原性および投与経路の影響
マウスに、植物で作られたＨ５ ＶＬＰを筋肉内注射、または鼻腔内（吸入）により投与した。記載された方法により、ミョウバンをアジュバントとして、０．１から１２ｕｇのＶＬＰをマウスに筋肉注射した。ピーク抗体力価は、５ｕｇ組換え可溶性赤血球凝集素（Ｈ５）の大きさと同様の大きさで、最低抗原量により観察した（図２０Ａ）。
０．１から１ｕｇの、植物で作られたＨ５ ＶＬＰに、ミョウバンアジュバントによる組換え可溶性Ｈ５の抗体反応より大きな抗体反応のために提供されたキトサンアジュバントを鼻腔内投与した（図２０Ｂ）。
両方の投与経路について、およびさまざまな抗原量にわたり、テストしたマウスのすべてでセロコンバージョンが観察された。組換えＨ５可溶性抗原は、低い（＜１／４０）または無視できる（非アジュバント組換えＨ５に対する１＜１／１０）ＨＩ価を与えた。
（実施例８）
赤血球凝集阻害抗体力価（ＨＡＩ）Ｈ５ ＶＬＰ
図２１Ａ、Ｂは、植物で作られたＨ５ ＶＬＰ、または組換え可溶性Ｈ５による「追加免疫」１４日後の赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）抗体反応を図示する。筋肉内投与した場合の抗原の最低用量（０．１ｕｇ）は、組換え可溶性Ｈ５を１０倍多く投与（５ｕｇ）するよりも優れたＨＡＩ反応を生んだ。Ｈ５ ＶＬＰの用量増加は、最低用量を上回るＨＡＩの中程度の増加を提供した。
鼻腔内投与後のＨＡＩ反応は、１ｕｇ組換え可溶性Ｈ５を投与したマウスと比べて、植物で作られたＨ５ ＶＬＰを投与したマウスにおいて有意に増加した（１．０または０．１ｕｇ）。これは、陰性対照と類似していた。Ｈ５ ＶＬＰ（０．１から１２μｇ）の筋肉内注射により免疫化したすべてのマウスは、対照Ｈ５抗原により免疫化したマウスよりも高いＨＡＩ力価を有した（図２１Ａ）。同じ用量の５μｇについては、ＶＬＰは、対照Ｈ５抗原の対応する用量よりも２０倍高いＨＡＩ力価を誘導した。ＶＬＰはまた、鼻腔内経路を介して送達した場合、対照ＨＡ抗原よりも有意に高いＨＡＩ力価を誘導した（図２１ｂ）。特定用量のＨ５ ＶＬＰについては、ＨＡＩ力価のレベルは、筋肉内筋肉内免疫化マウスよりも鼻腔内免疫化マウスにおいて低かった；筋肉内投与した場合、１μｇ ＶＬＰは２１０の平均ＨＡＩ力価を誘導したのに対し、鼻腔内投与した場合、同じ用量は３４の平均ＨＡＩ力価を誘導した。
筋肉内投与した場合、ＶＬＰのすべての用量が、相同な全不活化ウイルスに結合することができる高レベルの抗体を誘導した（図２０ａおよび２４）。植物で作られたＶＬＰワクチンと対照Ｈ５抗原の両方の抗原製剤は、相同株に対する高い結合抗体力価を誘導することから、植物で作られたＶＬＰワクチンと対照Ｈ５抗原との間に有意差は見出されなかった（追加免疫１４日後の１２μｇＶＬＰ群を除く）。しかし、鼻腔内投与した場合、ＶＬＰは対照Ｈ５抗原よりも高い結合抗体力価を誘導した（図２０ｂ）。キトサンと混合した場合、１マイクログラムＶＬＰによる免疫化は、１μｇの対照ＨＡ抗原により免疫したマウスにおいて見出されるレベルよりも８．６倍高い（逆数平均Ａｂ力価９２０）、逆数平均Ａｂ力価５５００を誘導した。
植物に由来するインフルエンザＶＬＰの免疫原性を、次いでマウスにおける用量決定試験により調べた。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス群を、ミョウバンにおいて調製したＡ型インフルエンザ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）に由来するＨＡを含有する０．１μｇから１２μｇのＶＬＰにより（１：１比）、３週間間隔で２回筋肉内免疫化した。赤血球凝集阻害力価（ＨＩまたはＨＡＩ）は、全不活化ウイルス抗原（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１））を用いて、２回目の免疫化１４日後に回収した血清で測定した。０．１μｇという低いＶＬＰ用量による免疫化は、ウイルスが高希釈で赤血球を凝集するのを阻害する抗体の産生を誘導した（図２１Ａ）。５μｇの非ＶＬＰミョウバンアジュバントを添加した対照Ｈ５抗原（同じくＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５由来）によるマウスの同時免疫化は、最低ＶＬＰ用量で達成したものより２〜３ｌｏｇ低いＨＩ反応を誘導した。
両方の投与経路について、およびさまざまな抗原量にわたり、ＨＡＩ反応は、ＶＬＰを投与したマウスにおいて優れている。
（実施例９）
Ｈ５ ＶＬＰの免疫原性に対するアジュバントの影響
植物で作られたＨ５ ＶＬＰは、原形質膜起源を有する（図１９、実施例５）。理論に拘束されることを望むものではないが、エンベロープウイルスまたはエンベロープウイルスのＶＬＰは、一般に、これらが出芽する膜からエンベロープを獲得する。植物の原形質膜は、哺乳類細胞では稀にしか見出されないフィトステロール補体（ｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有し、これらのステロールのいくつかは免疫刺激効果を示すことが示されている。
植物で作られたＨ５ ＶＬＰを、アジュバントの存在下または非存在下でマウスに筋肉内投与（図２２Ａ）または鼻腔内投与（図２２Ｂ）し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体反応）を判定した。ＶＬＰは、投与のどちらかの系において添加アジュバント（これらの例の場合、ミョウバンまたはキトサン）の有無にかかわらず、組換え可溶性Ｈ５よりも有意に高いＨＡＩ赤血球凝集素阻害を示した。添加アジュバント（すなわちミョウバンまたはキトサン）の非存在下でさえ、植物で作られたＨ５ ＶＬＰは、有意なＨＡＩを示し、抗原の投与に対する全身免疫反応を示している。
ミョウバンは、ＨＡＩ力価の平均レベルをＶＬＰの筋肉内投与については５倍、および対照Ｈ５抗原については３．７倍に高めた（図２２ａ）。筋肉内投与した場合、５μｇＶＬＰは、対応する対照Ｈ５抗原用量よりも１２倍高い平均ＨＡＩ力価を誘導した。キトサンは、対照Ｈ５抗原の平均ＨＡＩレベルを増加させなかった（図２２ｂ）が、鼻腔内投与した１μｇＶＬＰにより免疫化したマウスの平均ＨＡＩレベルを５倍に増加させた。
（実施例１０）
抗体アイソタイプ
植物で作られたＨ５ ＶＬＰまたは組換え可溶性Ｈ５を投与されたマウスは、添加アジュバントとしてのミョウバンの有無にかかわらず、さまざまな免疫グロブリンアイソタイプを示す（図２３Ａ）。
添加アジュバントの存在下では、ＶＬＰの抗体アイソタイププロファイルおよび組換えＨ５が類似しており、ＩｇＧ１が主要なアイソタイプである。ＶＬＰまたは組換えＨ５を添加アジュバント無しで投与した場合、ＩｇＧ１反応は低下するが、ＶＬＰに対する主要なアイソタイプ反応は残り、ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ＢおよびＩｇＧ３は添加アジュバントの存在下と類似した力価を維持する。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂ力価は、組換えＨ５を添加アジュバント無しで投与した場合、著しく減少した（図２３Ａ）。
したがって、これらのデータは、植物で作られたＶＬＰが、宿主における抗体反応を誘発するのに添加アジュバントを必要としないことを示している。
添加抗原の存在下、植物で作られたＶＬＰまたは可溶性組換えＨＡを筋肉内投与したマウスにおける全不活化インフルエンザウイルス株（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５；Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）Ｉに対する抗体力価を、図２３Ｂに図示する。１ｕｇもしくは５ｕｇのＶＬＰまたは５ｕｇの可溶性ＨＡを投与したマウスにおけるこれらのインフルエンザ株に対する抗体力価では、有意差は観察されない。
（実施例１１）
Ｈ５ ＶＬＰワクチンにより誘導された血清抗体の交差反応性
Ｈ５ ＶＬＰにより誘導された血清抗体の交差反応性を、さまざまな株の全不活化インフルエンザウイルスに対して評価した。すべてのＶＬＰ用量（０．１から１２μｇ）および５μｇの対照ＨＡ抗原は、クレード１株（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４）、クレード２．１の相同株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５、およびクレード２．２株Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５に対する高い結合抗体力価を誘導した（図２５Ａ）。
しかし、植物で作られたＶＬＰのみが、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５株に対するＨＡＩ力価を誘導した（図２５ｂ）。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５に対するＨＡＩ力価は、ＶＬＰが高かった。
（実施例１２）
植物で作られたＨ５ ＶＬＰによる免疫化により与えられた交差防御
記載の通りＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ Ｈ５ ＶＬＰの２用量レジメンを予め投与したマウスを、この後、Ａ型インフルエンザ／Ｔｕｒｋｅｙ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１）（「Ｔｕｒｋｅｙ Ｈ５Ｎ１」）感染ウイルスによって鼻腔内で免疫誘発し、および観察した。投与量は、動物１匹当たり、１０ＬＤ５０（４．０９×１０５ ＣＣＩＤ５０）であった。
免疫誘発後７日までは、ＰＢＳワクチン対照を投与したマウスの３７．５％のみが、Ｔｕｒｋｅｙ Ｈ５Ｎ１によって免疫誘発して生存した（図２６Ａ）。実験が終了したとき、対照抗原（ＨＡ）または１、５もしくは１５ｕｇのＩｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５ ＶＬＰを投与した動物の１００％が、免疫誘発後１７日まで生存した。
実験期間中にマウスの体重もモニターし、生存マウスの平均体重をプロットした（図２６Ｂ）。免疫誘発前に１、５もしくは１５ｕｇのＩｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５ ＶＬＰを投与したマウスは、実験経過中に大幅に体重を減らすことはなく、特に５ｕｇのＶＬＰを投与したマウスは、著しく体重が増加したように見える。陰性対照マウス（Ｔｕｒｋｅｙ Ｈ５Ｎ１による免疫誘発なし）が、体重を大幅に増加するまたは減らすことはなかった。陽性対照マウス（ＶＬＰは投与していないが、Ｔｕｒｋｅｙ Ｈ５Ｎ１によって免疫誘発した）は、実験経過中に著しい体重の減少を示し、これらのマウスのうち３匹が死亡した。体重は、コホート中の全マウスの平均であり、「最も重病の」マウス（死亡した３匹）の排除は、体重の見かけの全体的増加をもたらす可能性があるが、陽性対照コホートの平均体重は、陰性またはＶＬＰ処置したコホートの平均体重より依然として有意に低いことに注意すべきである。
したがって、これらのデータは、Ｈ５赤血球凝集素ウイルスタンパク質を含む植物で作られたインフルエンザＶＬＰが、病原性インフルエンザ株に特異的な免疫反応を誘導すること、およびウイルス様粒子が植物原形質膜から出芽する可能性があることを示している。
したがって、これらのデータは、植物がインフルエンザウイルス様粒子を生産できること、および初めて、ウイルス様粒子が植物原形質膜から出芽し得ることも示している。
さらに、現行の一過性発現技術を用いて、最初の抗原ロットを、標的ＨＡの配列が得られたわずか１６日後に生産した。Ｈ５ ＶＬＰの現行の収量下、および被験者当たり５μｇの例示的用量で、インフィルトレーションした葉ｋｇにつき、〜２０，０００回分のワクチンを生産することができる。プラットフォームの単純さ、サージ能力および強力な免疫原性というこの固有の組合せは、いくつかの実施形態の中でも特に、パンデミックとの関連で新たな方法反応（ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を提供する。
（実施例１３）
サイズ排除クロマトグラフィーを用いた植物抽出物における赤血球凝集素含有（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６およびＨ９）構造の特性化
植物で生産された、さまざまな亜型のインフルエンザ赤血球凝集素の高分子量構造への集合は、ゲル濾過により評価した。ＡＧＬ１／６６０、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７８３、ＡＧＬ１／７８０、ＡＧＬ１／７８５、およびＡＧＬ１／７９０をインフィルトレーションした植物（１．５ｍＬ）からの粗または濃縮タンパク質抽出物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−５００ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分画した。図４６に示されている通り、ブルーデキストラン（２ＭＤａ）溶出は、画分１０で早期にピークに達した。２００μＬの各ＳＥＣ溶出画分からのタンパク質を、アセトン沈殿により濃縮し（５倍）、およびウェスタンブロッティングにより分析した場合（図４６）、赤血球凝集素は主に画分７から１４で見出された。これは、ＨＡのＶＬＰへの組み込みを示している。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、ＨＡタンパク質が、生産された亜型に関係なく、大きな上部構造に集合したか、または高分子量構造に付着したことを示唆する。図４６では、株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９に由来するＨ１および株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３を、ＰＤＩシグナルペプチド含有カセットを用いて生産した。得られた結果は、アルファルファＰＤＩのシグナルペプチドによる天然シグナルペプチドの置換が、粒子へ集合するＨＡの能力に影響しないことを示している。
（実施例１４）
野生型ヌクレオチド配列を用いた、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるアグロインフィルトレーションによる季節性インフルエンザウイルス赤血球凝集素の一過性発現
一過性発現系の、季節性インフルエンザ赤血球凝集素を生産する能力は、株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド＃７７４）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド＃５４０）およびＡ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド＃７７５）に由来するＨ１亜型、株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（プラスミド＃７７６）およびＡ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（プラスミド＃７７７）に由来するＨ３亜型、ならびに株Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）（プラスミド＃７７８）およびＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｙａｍａｇａｔａ系統）（プラスミド＃７７９）に由来するＢ型の発現により判定した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット−アルファルファプラストシアニン遺伝子に由来するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列−で最初に構築し、および構築したカセットをｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドに挿入した。プラスミドを、次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＡＧＬ１）にトランスフェクトし、それぞれ、株ＡＧＬ１／７７４、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７７５、ＡＧＬ１／７７６、ＡＧＬ１／７７７、ＡＧＬ１／７７８およびＡＧＬ１／７７９を生産した。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、ＡＧＬ１／７７４、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７７５、ＡＧＬ１／７７６、ＡＧＬ１／７７７、ＡＧＬ１／７７８およびＡＧＬ１／７７９をインフィルトレーションし、６日間のインキュベーション期間後に葉を回収した。アグロインフィルトレーションした葉にＨ１が蓄積しているかどうかを判定するため、タンパク質をインフィルトレーションした葉組織から最初に抽出し、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した（各ＨＡ亜型の検出に使用した抗体および条件については表６参照）。Ｈ１株に由来するＨＡについては、インフルエンザ赤血球凝集素の非切断ＨＡ０形態とサイズが対応する、約７２ｋＤａの固有のバンドが抽出物において検出された（図４７）。これは、インフィルトレーションした葉における赤血球凝集素のさまざまな毎年の流行株の発現が、非切断翻訳産物の蓄積をもたらすことを示した。これらの発現および免疫検出戦略を用いた、Ｈ３亜型またはＢ型に由来するインフルエンザＨＡの発現は、粗タンパク質抽出物においては検出されなかった（図４７）。
（実施例１５）
野生型ヌクレオチド配列を用いた、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるアグロインフィルトレーションによる潜在的パンデミックなインフルエンザウイルス赤血球凝集素の一過性発現
一過性発現系の、潜在的インフルエンザ赤血球凝集素を生産する能力は、株Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド＃７８１）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド＃６６０）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド＃７８２）に由来するＨ５亜型、株Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７（Ｈ２Ｎ２）（プラスミド＃７８０）に由来するＨ２亜型、株Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／１９９７（Ｈ６Ｎ１）（プラスミド＃７８３）に由来するＨ６、株Ａ／Ｅｑｕｉｐｅ／Ｐｒａｇｕｅ／１９５６（Ｈ７Ｎ７）（プラスミド＃７８４）に由来するＨ７ならびに最後は株Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９９９（Ｈ９Ｎ２）（プラスミド＃７８５）に由来するＨ９の発現により判定した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット−アルファルファプラストシアニン遺伝子に由来するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列−で最初に構築し、および構築したカセットをｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドに挿入した。プラスミドを、次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＡＧＬ１）にトランスフェクトし、株ＡＧＬ１／７８１、ＡＧＬ１／６６０、ＡＧＬ１／７８２、ＡＧＬ１／７８０、ＡＧＬ１／７８４およびＡＧＬ１／７８５を生産した。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、ＡＧＬ１／７８１、ＡＧＬ１／６６０、ＡＧＬ１／７８２、ＡＧＬ１／７８０、ＡＧＬ１／７８４およびＡＧＬ１／７８５をインフィルトレーションし、６日間のインキュベーション期間後に葉を回収した。アグロインフィルトレーションした葉にＨ５が蓄積しているかどうかを判定するため、タンパク質をインフィルトレーションした葉組織から最初に抽出し、適切な抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した（各ＨＡ亜型の検出に使用した抗体および条件については表６参照）。インフルエンザ赤血球凝集素の非切断ＨＡ０形態とサイズが対応する、約７２ｋＤａの固有のバンドが、Ｈ５およびＨ２発現構築物で形質転換した植物の抽出物において検出された（図４８ａおよびｂ）。これは、インフィルトレーションした葉における赤血球凝集素のさまざまな潜在的パンデミック株の発現が、非切断翻訳産物の蓄積をもたらすことを示した。これらの発現および免疫検出戦略を用いた、Ｈ７およびＨ９に由来するインフルエンザＨＡの発現は、粗タンパク質抽出物においては検出されなかった（図４８ｂ）。
（実施例１６）
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物におけるアグロインフィルトレーションによるＨ５の一過性発現
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの葉において一過性発現系の、潜在的インフルエンザ赤血球凝集素を生産する能力は、株Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド＃６６０）に由来するＨ５亜型の発現により分析した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット−アルファルファプラストシアニン遺伝子に由来するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列−で最初に構築し、および構築したカセットをｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドに挿入した。プラスミドを、次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＡＧＬ１）にトランスフェクトし、株ＡＧＬ１／６６０を生産した。
Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ植物は、ＡＧＬ１／６６０をインフィルトレーションし、６日間のインキュベーション期間後に葉を回収した。アグロインフィルトレーションした葉にＨ５が蓄積しているかどうかを判定するため、タンパク質をインフィルトレーションした葉から最初に抽出し、抗Ｈ５抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。インフルエンザ赤血球凝集素の非切断ＨＡ０形態とサイズが対応する、約７２ｋＤａの固有のバンドが抽出物において検出された（図４９）。これは、インフィルトレーションしたＮ．ｔａｂａｃｕｍ葉における赤血球凝集素の発現が、非切断ＨＡ０前駆物質の蓄積をもたらすことを示した。
（実施例１７）
フェレットにおけるＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５（Ｈ５Ｎ１）に由来する、植物で作られたＨ５Ｎ１ ＶＬＰワクチンの免疫原性
フェレットにおける用量漸増試験を行い植物由来ＶＬＰの免疫原性を評価した。３用量（１、５および１５ｕｇ）での、Ｈ５ ＶＬＰワクチンにより誘導された血清抗体のｉｎ
ｖｉｔｒｏ交差反応性は、ワクチンの初回投与の１４日後（図５０Ａ）、および２回目の投与（図５０Ｂ）の１４日後に採取した血清を用いて、３つの他のＨ５Ｎ１株−Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｔｕｒｋｅｙ／１／０５（クレード２．２）、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／０４（クレード１）およびＡ／Ａｎｈｕｉ／５／０５（すべて全不活化ウイルス）の赤血球凝集阻害により評価した。３用量濃度すべてについて、交差反応性が観察された。
（実施例１８）
ＣＨＭＰ基準による免疫原性結果の分析
欧州医薬品審査庁のヒト用医薬品委員会（ＥＭＥＡ’ｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ
Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ（ＣＨＭＰ））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｈｔｍｓ／ｇｅｎｅｒａｌ／ｃｏｎｔａｃｔｓ／ＣＨＭＰ／ＣＨＭＰ．ｈｔｍｌ）は、ワクチンの有効性に関する３つの基準（２回目の投与後に適用）：１−セロコンバージョン数またはＨＩ力価の有意な増加（４倍）＞４０％；２−少なくとも２．５の平均幾何的増加；３−１／４０のＨＩ力価を達成する被験者の割合が少なくとも７０％であるべきこと、を設定している。フェレットモデルにおけるこれらの基準の分析が、表８〜１１に示されている。（＊）は、ＣＨＭＰ基準を満たしているまたは超えていることを示す。認可のためのＣＨＭＰ基準に関連する交差免疫原性分析の概要が、表１２に示されている。
動物は、毎日体重、体温および全身状態を評価した。試験中に病気または不快の徴候を記録した。体重および体温は、試験中は正常範囲内であった。ワクチンは安全であり動物に許容された。
（実施例１９）
赤血球凝集素ヌクレオチド配列の選択
ＨＡのヌクレオチド配列は、インフルエンザ配列データベース（ＵＲＬ：ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ参照）、またはＮＣＢＩインフルエンザウイルスリソース（Ｂａｏら、２００８年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８２巻（２号）：５９６〜６０１頁；ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ参照）から検索した。ＨＡ核酸配列のいくつかについては、複数のエントリがデータベースにリストされている（表１３）。いくつかのバリエーションは、主に培養系（由来−ＭＤＣＫ、卵、不明、ウイルスＲＮＡ／臨床分離株）と関連する。例えば、タイプＢインフルエンザウイルスが卵の尿膜腔液で発現される場合、ＨＡの１９４位のグリコシル化部位（成熟タンパク質ナンバリング）は欠けている（Ｃｈｅｎら、２００８年も参照）。いくつかの配列については、ドメインが欠けている場合がある（例えば不完全クローン、配列決定人工物等）。インフルエンザ赤血球凝集素のドメインおよびサブドメインは、Ｄｅｓｃｒｉｔｉｏｎに概説されている。第１の配列のドメインまたはサブドメインは、第２の既存の配列からのドメインと組み合わされ得、例えば第１の株配列のシグナルペプチドは、完全コード配列を提供するため第２の株に由来する赤血球凝集素コード配列のバランスと組み合わされ得る。
株：Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６に由来するＨ１
８つのアミノ酸配列を比較し、バリエーションを同定した（表１４）。１７１位は、いくつかの配列におけるグリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）のバリエーションを示した。
株：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来するＨ１
２０３位は、アスパラギン酸（Ｄ）、イソロイシン（Ｉ）またはアスパラギン（Ｎ）のバリエーションを示した。
株：Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７に由来するＨ３
配列バリエーションが５つの位置で観察された（表１５）。２１５位では、欠失が２つの標本抽出した配列で観察された。
株：Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５に由来するＨ３
この株における配列バリエーションは、位置４で観察された（表１６）。

株：Ｂ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４に由来するＢ
２つの位置のバリエーションが観察された（表１７）。１２０位はグリコシル化部位ではない；２１０位はグリコシル化に含まれる；このグリコシル化は卵での培養後に消失される。
株：Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来する赤血球凝集素；ＩＳＤＮ２６１６４９
観察されたバリエーションには、培養系によっては２１１位でアミノ酸配列バリエーションを含む。アスパラギン（Ａｓｐａｒａｔｉｎｅ）（Ｎ）がＭＤＣＫ細胞から単離した配列で見出されるのに対し、グルタミン酸（Ｄ）は卵から単離した配列で見出される。２１１位はグリコシル化部位であり、卵での培養後に消失される。
株：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／１９５７に由来するＨ２
配列バリエーションは６つの位置で観察された（表１８）。
株：Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４に由来するＨ５およびＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５に由来するＨ５
これらのＨ５株のどちらかの一次配列を整列させる際に、アミノ酸配列で観察されたバリエーションはなかった。
株：Ａ／Ｔｅａｌ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｗ３１２／１９９７に由来するＨ６
１つのエントリのみが株に利用可能であった（ＡＦ２５０１７９）。
株：Ａ／Ｅｑｕｉｎｅ／Ｐｒａｇｕｅ／５６に由来するＨ７
合計２配列エントリがデータベースに見出された。エントリＡＢ２９８８７７は、実験室再集合体であるため除外した。
株：Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１０７３／１９９９；ＡＪ４０４６２６に由来するＨ９
合計２配列エントリがデータベースに見出された。１つのみが完全であった。
（実施例２０）
植物に由来するシグナルペプチドに融合されたインフルエンザウイルス赤血球凝集素の一過性発現は、タンパク質を分泌した。
他の赤血球凝集素についてのＨＡ蓄積レベルに対するシグナルペプチド修飾の影響も、株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド＃７８７）、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）（プラスミド＃５４０）由来、株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）（プラスミド ７９０）およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）（プラスミド＃６６３）に由来する亜型ＨＡ、ならびにアルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；受託番号Ｚ１１４９９；配列番号３４；図１７）に由来するシグナルペプチド（ＳＰ；ヌクレオチド３２〜１０３）に融合された株Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（プラスミド＃７９８）に由来するＢ型の発現により調べた。ＰＤＩ ＳＰ−赤血球凝集素遺伝子融合は、プラストシアニン発現カセット−アルファルファプラストシアニン遺伝子に由来するプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよび転写終結配列−で構築し、および構築したカセットをｐＣＡＭＢＩＡバイナリープラスミドに挿入した。プラスミドを、次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＡＧＬ１）にトランスフェクトし、それぞれ、株ＡＧＬ１／７８７、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／６６３およびＡＧＬ１／７９８を生産した。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物は、ＡＧＬ１／７８７、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／６６３およびＡＧＬ１／７９８をインフィルトレーションした。並行して、比較目的のため、一連の植物にＡＧＬ１／７７４、ＡＧＬ７７６、ＡＧＬ１／６６０およびＡＧＬ１／７７９をインフィルトレーションした。６日間のインキュベーション期間後に葉を回収し、タンパク質をインフィルトレーションした葉組織から抽出し、適切な抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。Ｈ１／ＢｒｉｓｂａｎｅおよびＨ３／Ｂｒｉｓｂａｎｅに由来するＨＡの発現は、天然シグナルペプチドを有する同じＨＡについて観察された発現と比べて、ＰＤＩに由来するＳＰによりかなり改善した（それぞれ、図８７ｂおよびｃ）。亜型Ｈ１（株Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９）に由来する第３のＨＡの発現は、このＳＰ置換戦略により確認した（図８７ａ）。シグナル（ｓｏｇｎａｌ）ペプチドの修飾は、Ｈ５（Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５）についてはＨＡ蓄積の十分な増加をもたらさず（図８７ｄ）、株Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来するＨＡについては発現に使用したシグナルペプチドにかかわりなく、シグナルが検出されなかった（図８７ｅ）。ＨＡの発現が検出されたすべての条件について、非切断ＨＡ０前駆物質とサイズが対応する、分子量約７２ｋＤａでの固有の免疫反応バンドが観察された（図８７ａからｄ）。
（実施例２１）
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセット制御下のＨＡ発現
Ｃｏｗｐｅａモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２に由来する未翻訳配列を含む発現カセットＣＰＭＶ−ＨＴ（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙら ２００８年Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １４８巻：１２１２〜１２１８頁；国際公開第２００７／１３５４８０号も参照のこと）を、トランスジェニック植物でのいくつかの赤血球凝集素の発現に使用した。Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１）、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｈ３）、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５（Ｈ５）およびＢ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６（Ｂ）に由来するＨＡは、記載の通りにアグロインフィルトレーションしたＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物におけるＣＰＭＶ−ＨＴ制御下で発現された。インキュベーション後、葉を回収し、抽出し、およびタンパク質抽出物中のＨＡ含量をウェスタンブロットにより比較した。図８８に示されている通り、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットは、使用したシグナルペプチドにかかわりなく、プラストシアニンカセットよりも高いＨＡ発現レベルをもたらした。さらに、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６に由来する株Ｂについて、プラストシアニンカセット下で発現された場合、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットの使用は、これらの免疫検出条件下で依然として検出できなかったＨＡ蓄積の検出を可能にした。
（実施例２２）
シグナルペプチド修飾と併用したＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０との共発現
植物に由来する細胞質Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０（構築物番号Ｒ８７０）は、Ｈ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ（構築物番号５４０）またはＨ３ Ｂｒｉｓｂａｎｅ（構築物番号７９０）と共発現され、両方とも植物に由来するシグナルペプチド（アルファルファＰＤＩシグナルペプチド）を有した。共発現は、ＡＧＬ１／５４０、ＡＧＬ１／Ｒ８７０、ＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ１に対し）またはＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／Ｒ８７０およびＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ３に対し）の混合物（１：１：１比）を含有する細菌懸濁液によるＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物のアグロインフィルトレーションにより行った。対照植物は、ＡＧＬ１／５４０，ＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ１に対し）またはＡＧＬ１／７９０、ＡＧＬ１／３５ＳＨｃＰｒｏ（Ｈ３に対し）の混合物（１：２比）をアグロインフィルトレーションした。インキュベーション後、葉を回収し、抽出し、およびタンパク質抽出物中のＨＡ含量をウェスタンブロットにより比較した（図８９）。テストした条件では、得られた結果は、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０の共発現がＨ１ Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａの赤血球凝集素蓄積レベルを増加させなかったことを示す。しかし、Ｈ３ Ｂｒｉｓｂａｎｅについては、ウェスタンブロットは、細胞質Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０の共発現が赤血球凝集素蓄積レベルの有意な増加をもたらしたことを明らかに示した。
すべての引用は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、１つまたは複数の実施形態に関して記載されている。しかし、特許請求の範囲に記載されている通り、本発明の範囲から逸脱することなく、多くのバリエーションおよび変更が行われ得ることが当業者には明らかであろう。

Claims (47)

  1. Ａ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該ＨＡは、シグナルペプチドを含み、かつ、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結されており、該調節領域は、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）調節領域を含む、核酸。
  2. Ｂ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、該ＨＡは、シグナルペプチドを含み、かつ、カウピーモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）調節領域に作動可能に連結されている、核酸。
  3. 前記シグナルペプチドが、天然または非天然シグナルペプチドである、請求項１または２に記載の核酸。
  4. 前記非天然シグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、請求項３に記載の核酸。
  5. 前記Ａ型インフルエンザＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
  6. 前記Ａ型インフルエンザＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択される、請求項１に記載の核酸。
  7. 前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６または配列番号４７のヌクレオチド配列と９０％〜１００％の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記ＨＡタンパク質が血球凝集活性を有する、請求項１に記載の核酸。
  8. インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、
    ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸を該植物または該植物の部分に導入する工程と、
    ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該植物または該植物の部分をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程と
    を含む方法。
  9. 前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が、前記植物中で一過性に発現される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が、前記植物中で安定的に発現される、請求項８に記載の方法。
  11. 前記導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸が、前記植物に導入される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. インフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において生産する方法であって、
    ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸を含む植物または植物の部分を準備する工程と、
    ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該植物または該植物の部分をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程と
    を含む方法。
  14. ｃ）前記植物を回収し、前記ＶＬＰを精製する工程
    をさらに包含する、請求項８または１３に記載の方法。
  15. 前記ＶＬＰは、８０〜３００ｎｍのサイズ範囲である、請求項１４に記載の方法。
  16. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸を含む植物。
  17. 植物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、請求項１６に記載の植物。
  18. 前記１つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される、請求項１７に記載の植物。
  19. インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質および植物に由来する１つまたは複数の脂質を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＶＬＰは８０〜３００ｎｍのサイズ範囲である、ＶＬＰ。
  20. 前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザに由来する、請求項１９に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  21. 前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、請求項２０に記載のＶＬＰ。
  22. 対象においてインフルエンザウイルスに対する免疫を誘導するための有効用量の請求項１９に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
  23. 対象においてインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するための組成物であって、請求項１９に記載のウイルス様粒子を含む組成物。
  24. 経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記インフルエンザウイルスＨＡタンパク質が、植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを含む、請求項１９に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  26. 前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６からなる群から選択されるＡ型インフルエンザに由来する、請求項２５に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
  27. 前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、およびＨ９からなる群から選択されるＡ型インフルエンザ由来である、請求項２６に記載のＶＬＰ。
  28. 対象においてインフルエンザウイルスに対する免疫を誘導するための有効用量の請求項２５に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
  29. 経口、皮内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、静脈内、または皮下で、対象に投与されることを特徴とする、請求項２８に記載の組成物。
  30. 医薬の製造における請求項１９または２５に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
  31. 前記１つまたは複数の脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴ脂質、およびそれらの組み合わせの群に由来する、請求項１９に記載のＶＬＰ。
  32. １つまたは複数のフィトステロール、ステロール、サポニン、およびそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１９または２５のいずれか１項に記載のＶＬＰ。
  33. 前記フィトステロールは、スチグマステロール、シトステロール、β−シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールおよびそれらの組み合わせの群に由来する、請求項３２に記載のＶＬＰ。
  34. 前記インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列が、配列番号６０〜７３、８１、８３、８６、９０、９４、９７、１００、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１２または１１３に記載の配列である、請求項１に記載の核酸。
  35. 前記配列番号が配列番号６０または６１である、請求項３４に記載の核酸。
  36. トランスジェニック植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生産する方法であって、
    ａ）請求項３４または３５に記載の核酸を該植物に、または該植物の一部に、遺伝子形質転換によって導入し、それにより該トランスジェニック植物を生産する工程と、
    ｂ）該核酸の発現を可能にする条件下で該トランスジェニック植物または該植物の一部をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程と
    を包含する、方法。
  37. トランスジェニック植物においてインフルエンザウイルス用粒子（ＶＬＰ）を生産する方法であって、
    ａ）請求項３４に記載の核酸および配列番号１２２または１２３に記載の配列を有する核酸を該植物に、または該植物の一部に、遺伝子形質転換によって導入し、それにより該トランスジェニック植物を生産する工程と、
    ｂ）該核酸の共発現を可能にする条件下で該トランスジェニック植物または該植物の一部をインキュベートし、それにより該ＶＬＰを生産する工程と
    を包含する、方法。
  38. 前記導入工程（工程ａ）において、サイレンシングの抑制因子をコードするさらなる核酸が前記植物に導入される、請求項８〜１５、３６または３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記サイレンシングの抑制因子は、ジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）、タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルス−２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモウイルスＸ−ｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭ−ｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳ−ｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルス−ｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザウイルス−ｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウリーフロール関連ウイルス−２−ｐ２４（ＧＶＢ−ｐ２４）、ブドウウイルスＡ−ｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢ−ｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム潜在ウイルス−ｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、およびニンニク共通潜在ウイルス−ｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）から選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記導入工程（工程ａ）において、ベータ−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）、ＧａｌＴ−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧａｌＴ−ＧＮＴ１）ハイブリッド酵素、またはＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素をコードするさらなる核酸が、前記植物に導入される、請求項８〜１５、３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）に対して特異的な抗体を含む血清を調製するための、請求項１９〜２１、２５〜２７および３１〜３３のいずれか１項に記載のＶＬＰの使用。
  42. 請求項１９〜２１、２５〜２７および３１〜３３のいずれか１項に記載のＶＬＰを含む、植物抽出物。
  43. 請求項１９〜２１、２５〜２７および３１〜３３のいずれか１項に記載のＶＬＰを含む植物抽出物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  44. 請求項１９〜２１、２５〜２７および３１〜３３のいずれか１項に記載のＶＬＰを含む植物。
  45. 被験体におけるインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するための、請求項４２に記載の植物抽出物、請求項４３に記載の組成物、または請求項４４に記載の植物。
  46. 被験体におけるインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導するための、請求項４２に記載の植物抽出物、請求項４３に記載の組成物、または請求項４４に記載の植物であって、前記ＶＬＰが経口投与に適している、植物抽出物、組成物、または植物。
  47. 請求項４２に記載の植物抽出物または請求項４４に記載の植物を含む、栄養補助食品。
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