JP5921884B2 - 赤血球凝集素を含むインフルエンザウイルス様粒子(vlps) - Google Patents
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Description
本発明はウイルス様粒子の産生に関する。より具体的には、本発明はインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
a)植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、エンベロープウイルスからの抗原、例えば株A/カリフォルニア/04/09からのインフルエンザ赤血球凝集素(HA)をコードする核酸を、植物またはその一部の中へ導入することと、
b)核酸の発現を可能にする条件下で植物またはその一部をインキュベーションし、それによってVLPを産生することと
を含む方法も提供する。
表1:インフルエンザ赤血球凝集素の物理化学的特性
表2A:選択された季節性インフルエンザ株のHAによって結合されるRBCの種。
・構造的ドメイン:HA0ポリタンパク質は切断されて成熟HAを提供する。HAは、単一のジスルフィド結合によって連結される受容体結合ドメイン(HA1)および膜アンカードメイン(HA2)を含む各単量体を持つホモ三量体であり;HA2サブユニットのN末端20の残基はHA融合ドメインまたはHA融合配列とも呼ばれる。「尾部」領域(膜エンベロープに対して内面)も存在する。各々の赤血球凝集素はこれらの領域またはドメインを含む。個別の領域またはドメインの長さは典型的には保存される。
・すべての赤血球凝集素は、同じ数および位置の分子内ジスルフィド架橋および分子間ジスルフィド架橋を含有する。ジスルフィド架橋ネットワークに参加するシステインのアミノ酸配列上での量および位置はHAの間で保存される。特徴的な分子内ジスルフィド架橋および分子間ジスルフィド架橋を示す構造ならびに他の保存されたアミノ酸およびそれらの相対的位置の実例は、例えばGamblin et al 2004 (Science 303:1838-1842)中で記載される。例示的な構造および配列は1RVZ、1RVX、1RVT、1RV0、1RUY、1RU7を含み、プロテインデータバンク(Berman et al. 2003. Nature Structural Biology 10:980;URL: rcsb.org)から利用可能である。
・細胞質尾部。大多数の赤血球凝集素は保存部位に3つのシステインを含む。1つまたは複数のこれらのシステインは翻訳後修飾としてパルミトイル化されうる。
A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)(配列番号:33によってコードされる)、
A/ブリズベーン/59/2007(H1N1)(配列番号:48)、
A/ソロモン諸島/3/2006(H1N1)(配列番号:49)および
配列番号:9。X1(位置3)はAまたはVであり;X2(位置52)はDまたはNであり;X3(位置90)はKまたはRであり;X4(位置99)はKまたはTであり;X5(位置111)はYまたはHであり;X6(位置145)はVまたはTであり;X7(位置154)はEまたはKであり;X8(位置161)はRまたはKであり;X9(位置181)はVまたはAであり;X10(位置203)はDまたはNであり;X11(位置205)はRまたはKであり;X12(位置210)はTまたはKであり;X13(位置225)はRまたはKであり;X14(位置268)はWまたはRであり;X15(位置283)はTまたはNであり;X16(位置290)はEまたはKであり;X17(位置432)はIまたはLであり;X18(位置489)はNまたはDである。
表3:選択されたH1N1株のHAについての配列アライメントおよびコンセンサス配列
表4:選択されたH1N1株のHAについての配列アライメントおよびコンセンサス配列
表5は、本発明の様々な実施形態において提供される配列をリストする。
表5:配列識別名のための配列記載。
1.天然のHAのためのプラストシアニンベースの発現カセットの組み立て
すべての操作は、Sambrook and Russell(2001;参照として本明細書に組み込まれる)の一般的な分子生物学プロトコールを使用して行われた。第1のクローニング工程は、アルファルファのプラストシアニン遺伝子の上流および下流の調節エレメントを含有するレセプタープラスミドを組み立てることであった。プラストシアニンプロモーターおよび5’UTR配列は、オリゴヌクレオチドプライマーのXmaI−pPlas.c(配列番号:29;図10Q)およびSacI−ATG−pPlas.r(配列番号:30;図10R)を使用して、アルファルファゲノムDNAから増幅した。もたらされた増幅産物をXmaIおよびSacIで消化し、事前に同じ酵素で消化したpCAMBIA2300(キャンビア(Cambia)社、キャンベラ、オーストラリア)の中へライゲーションして、pCAMBIApromo Plastoを生成した。同様に、プラストシアニン遺伝子の3’UTR配列およびターミネーターを、プライマーのSacI−PlasTer.c(配列番号:31;図10S)およびEcoRI−PlasTer.r(配列番号:32;図10T)を使用してアルファルファゲノムDNAから増幅し、産物をSacIおよびEcoRIで消化した後にpCAMBIApromoPlastoの同じ部位の中へ挿入して、pCAMBIAPlastoを生成した。
H1 A/ニューカレドニア/20/99(コンストラクト番号540)
インフルエンザ株A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)のH1遺伝子からのオープンリーディングフレームは、2つの断片で合成された(プラント・バイオテクノロジー・インスティテュート(Plant Biotechnology Institute)、国立研究評議会(National Research Council)、サスカトゥーン、カナダ)。合成された第1の断片は、5’末端のシグナルペプチドコード配列および3’末端の膜貫通ドメインコード配列を欠損する、野生型H1コード配列(GenBankアクセッション番号AY289929;配列番号:33;図16)に対応する。BglII制限部位をコード配列の5’末端で追加し、2重のSacI/StuI部位を終止コドンのすぐ下流の断片の3’末端端部で追加し、配列番号:1を得た(図5A)。KpnI部位から終止コドンのH1タンパク質のC末端(膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む)をコードし、SacI制限部位およびStuIの制限部位が3’で隣接した第2の断片も合成された(配列番号:2;図5B)。
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド(PDISP)(ヌクレオチド32〜103;アクセッション番号Z11499;配列番号:34;図17)を、A/インドネシア/5/2005からのH5のHA0コード配列に以下のように連結した。H5コード配列は、鋳型としてコンストラクト番号660(配列番号:60;図51)を使用して、プライマーのSpPDI−HA(Ind).c(配列番号:82)およびHA(Ind)−SacI.r(配列番号:7;図7D)で増幅した。もたらされた断片は、PDISPをコードする最後のヌクレオチド(BglII制限部位を含む)が5’で隣接し、SacI制限部位が3’で隣接したH5コード配列であった。断片をBglIIおよびSacIにより消化し、事前に同じ制限酵素により消化したコンストラクト番号540(配列番号:61;図52)の中へクローン化した。コンストラクト番号663(配列番号:83)と命名した最終カセットを図69中で提示する。
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド(PDISP)(ヌクレオチド32〜103;アクセッション番号Z11499;配列番号:34;図17)を、A/ブリズベーン/59/2007からのH1のHA0コード配列に以下のように連結した。H1コード配列は、鋳型としてコンストラクト774(配列番号:62;図53)を使用して、プライマーSpPDI−H1B.c(配列番号:84)およびSacI−H1B.r(配列番号:85)により増幅した。もたらされた断片は、PDISPをコードする最後のヌクレオチド(BglII制限部位を含む)が5’で隣接し、SacI制限部位が3’で隣接したH1コード配列であった。断片をBglIIおよびSacIにより消化し、事前に同じ制限酵素により消化したコンストラクト番号540(配列番号:61;図52)の中へクローン化した。コンストラクト番号787(配列番号:86)と命名した最終カセットを図70中で提示する。
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド(PDISP)(ヌクレオチド32〜103;アクセッション番号Z11499;配列番号:34;図17)を、A/ブリズベーン/10/2007からのH3のHA0コード配列に以下のように連結した。PDISPを、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))中で提示されたPCRベースのライゲーション法によってH3コード配列に連結した。PCRの第1のラウンドにおいて、PDISPに融合したプラストシアニンプロモーターのセグメントを、鋳型としてコンストラクト540(配列番号:61;図52)、プライマーのPlasto−443c(配列番号:4;図7A)およびH3B−SpPDI.r(配列番号:87)を使用して増幅した。平行して、H3 A/ブリズベーン/10/2007のコード配列の一部を含有する別の断片(コドン17からSpeI制限部位)を、鋳型としてコンストラクト776(配列番号:69;図60)を使用してプライマーのSpPDI−H3B.c(配列番号:88)およびH3(A−Bri).982r (配列番号:89)で増幅した。次いで増幅産物を混合し、プライマーのPlasto−443c(配列番号:4;図7A)およびH3(A−Bri).982r(配列番号:89)と共に鋳型として第2の1ラウンドの増幅(組み立て反応)に使用した。もたらされた断片をBamHI(プラストシアニンプロモーター中の)およびSpeI(H3コード配列中の)により消化し、同じ制限酵素により事前に消化したコンストラクト番号776(配列番号:69;図60)の中へクローン化して、コンストラクト番号790(配列番号:90)を得た。コンストラクトを図71中で提示する。
アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのシグナルペプチド(PDISP)(ヌクレオチド32〜103;アクセッション番号Z11499;配列番号:34;図17)を、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))中で提示されたPCRベースのライゲーション法によってHA B/フロリダ/4/2006からのHAのHA0コード配列に連結した。増幅の第1のラウンドにおいて、PDISPに融合したプラストシアニンプロモーターの一部を、鋳型としてコンストラクト番号540(配列番号:61;図52)、プライマーのPlasto−443c(配列番号:4;図7A)およびHBF−SpPDI.r(配列番号:91)を使用して増幅した。平行して、プラストシアニンターミネーターに融合したHB B/Floのコード配列の一部を含有する別の断片を、鋳型としてコンストラクト番号779(配列番号:73;図64)を使用して、プライマーのSpPDI−HBF.c(配列番号:92)およびPlaster80r(配列番号:93)で増幅した。次いでPCR産物を混合し、プライマーのPlasto−443c(配列番号:4;図7A)およびPlaster80r(配列番号:93)と共に鋳型として第2の1ラウンドの増幅(組み立て反応)に使用した。もたらされた断片をBamHI(プラストシアニンプロモーター中の)およびAflII(HA B/フロリダ/4/2006コード配列中の)により消化し、同じ制限酵素により事前に消化したコンストラクト番号779(配列番号:73;図64)の中へクローン化して、コンストラクト番号798(配列番号:94)を得た。もたらされた発現カセットを図72中で提示する。
CPMV−HT発現カセットは、mRNAの発現を制御するために35Sプロモーターを使用し、位置115および161で、変異させたATGを持つササゲモザイクウイルス(CPMV)RNA2からのヌクレオチド1〜512が5’で隣接し、CPMV RNA2からのヌクレオチド3330〜3481(3’UTRに対応する)が3’で隣接し、NOSターミネーターが続く、対象となるコード配列を含む。プラスミドpBD−C5−1LC(Sainsbury et al. 2008; Plant Biotechnology Journal 6: 82-92およびPCT公報WO2007/135480)を、CPMV−HTベースの赤血球凝集素発現カセットの組み立てに使用した。CPMV RNA2の位置115および161でATGの変異は、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85 (1995))中で提示されたPCRベースのライゲーション法を使用して行った。鋳型としてpBD−C5−1LCを使用して、個別の2つのPCRを行った。第1の増幅のためのプライマーは、pBinPlus.2613c(配列番号:77)およびMut−ATG115.r(配列番号:78)である。第2の増幅のためのプライマーは、Mut−ATG161.c(配列番号:79)およびLC−C5−1.110r(配列番号:80)であった。次いで2つの得られた断片を混合し、プライマーとしてpBinPlus.2613c(配列番号:77)およびLC−C5−1.110r(配列番号:80)を使用して、鋳型として第3の増幅に使用する。もたらされた断片をPacIおよびApaIにより消化し、同じ酵素により消化したpBD−C5−1LCの中へクローン化する。828と命名した生成された発現カセットの配列を図68(配列番号:81)中で提示する。
H1 A/ニューカレドニア/20/99からのHA0に融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号540(配列番号:61;図52)を使用してプライマーのApaI−SpPDI.c(配列番号:95)およびStuI−H1(A−NC).r(配列番号:96)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(最初のATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号580(配列番号:97)と命名した。
H1 A/カリフォルニア/4/2009からのHA0に融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする断片を、以下のように2×35S−CPMV−HTの中へクローン化した。
および
によるPCRによって増幅した。平行して、第2のPCRを、鋳型としてコンストラクト685(配列番号:100;図74)を使用して、プライマーの
および
により行った。次いで得られた2つの断片を混合し、プライマーのPacI−MCS−2×35S.c(配列番号:130)およびApaI−M prot.r(配列番号:133)を使用する第2の1ラウンドのPCR(組み立て反応)のための鋳型として使用した。次いでもたらされた断片をPacIおよびApaIにより消化し、同じ制限酵素により消化したコンストラクト685(配列番号:100;図74)の中へクローン化した。972(配列番号:134)と命名した中間ベクターの配列を図94中で提示する。
および
H1 Cal.390r(配列番号:141)
GCTTAATTGCTCTCTTAGCTCCTCATAATCGATGAAATCTCC
を使用して増幅した。第2の断片は、鋳型として断片2(配列番号:138)を含有するpJ201ベクター(DNA2.0の専用のベクター)を使用して、プライマーの
H1 Cal.310c(配列番号:142)
TGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAG
および
H1 Cal.1159r(配列番号:143)
CTGCATATCCTGACCCCTGCTCATTTTGATGGTGATAACCGT
を使用して増幅した。最終的に、最後の断片は、鋳型として断片3(配列番号:139)を含有するpJ201ベクター(DNA2.0の専用のベクター)を使用して、プライマーの
H1 Cal.1081c(配列番号:144)
TTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTT
および
を使用して増幅した。第2の1ラウンドのPCR(組み立て反応)において、次いで3つの増幅断片を混合し、プライマーDraIII−MProt#2.c(配列番号:140)およびStuI−H1 Cal.r(配列番号:145)と共に鋳型として使用した。もたらされた断片をDraIIIおよびStuIにより消化し、同じ制限酵素により消化したコンストラクト972(配列番号:134)の中へ挿入した。もたらされたコンストラクトのヌクレオチド配列を560(配列番号:146;図98)と命名した。
A/インドネシア/5/2005からのH5のコード配列を以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号660(配列番号:60;図51)を使用してプライマーのApaI−H5 (A−Indo).1c(配列番号:98)およびH5 (A−Indo)−StuI.1707r(配列番号:99)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号685(配列番号:100)と命名した。
H5 A/インドネシア/5/2005からのHA0に融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号663(配列番号:83)を使用してプライマーのApaI−SpPDI.c(配列番号:95)およびH5(A−Indo)−StuI.1707r(配列番号:99)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号686(配列番号:101)と命名した。
H1 A/ブリズベーン/59/2007からのHAのコード配列を以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号774(配列番号:62;図53)を使用してプライマーのApaI−H1B.c(配列番号:102)およびStuI−H1B.r(配列番号:103)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号732(配列番号:104)と命名した。
H1 A/ブリズベーン/59/2007からのHA0に融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号787(配列番号:86)を使用してプライマーのApaI−SpPDI.c(配列番号:95)およびStuI−H1B.r(配列番号:103)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号733(配列番号:105)と命名した。
H3 A/ブリズベーン/10/2007からのHAのコード配列を以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号776(配列番号:69)を使用してプライマーのApaI−H3B.c(配列番号:106)およびStuI−H3B.r(配列番号:107)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片はApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号735(配列番号:108)と命名した。
H3 A/ブリズベーン/10/2007からのHA0に融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号790(配列番号:90)を使用してプライマーのApaI−SpPDI.c(配列番号:95)およびStuI−H3B.r(配列番号:107)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号736(配列番号:109)と命名した。
B/フロリダ/4/2006からのHAのコード配列を以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号779(配列番号:73;図64)を使用してプライマーApaI−HBF.c(配列番号:110)およびStuI−HBF.r(配列番号:111)によるPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号738(配列番号:112)と命名した。
B/フロリダ/4/2006からのHA0に融合したアルファルファPDIシグナルペプチドをコードする配列を、以下のようにCPMV−HTの中へクローン化した。鋳型としてコンストラクト番号798(配列番号:94)を使用してプライマーのApaI−SpPDI.c(配列番号:95)およびStuI−HBF.r(配列番号:111)でPCR増幅を行うことによって、制限部位のApaI(ATGのすぐ上流)およびStuI(終止コドンのすぐ下流)を赤血球凝集素コード配列に追加した。もたらされた断片をApaIおよびStuIの制限酵素により消化し、同じ酵素により消化したコンストラクト番号828(配列番号:81)の中へクローン化した。もたらされたカセットをコンストラクト番号739(配列番号:113)と命名した。
2つの熱ショックタンパク質(Hsp)発現カセットを組み立てた。第1のカセットにおいて、シロイヌナズナ(生態型コロンビア)細胞質HSP70(Lin et al. (2001) Cell Stress and Chaperones 6: 201-208中のAthsp70−1)の発現は、アルファルファの亜硝酸還元酵素(Nir)プロモーターおよびアルファルファのプラストシアニンプロモーターのエレメントを組み合わせたキメラプロモーター(Nir/Plasto)によって制御される。キメラNir/Plastoプロモーターの制御下にアルファルファの細胞質HSP40(MsJ1;Frugis et al. (1999) Plant Molecular Biology 40: 397-408)のコード領域を含む第2のカセットも組み立てられた。
可溶性H1発現カセット
H1の可溶性形態をコードするカセットは、540において膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をコードする領域を、ロイシンジッパーGCN4 pIIバリアントをコードする断片で置換することによって調製した(Harbury et al, 1993, Science 1993; 262: 1401-1407)。この断片は、クローニングを促進するために隣接するKpnIおよびSacI部位を持って合成された。この置換からもたらされたプラスミドを544と命名し、発現カセットを図11中で示す。
タバコエッチウイルス(TEV)5’UTRとインフルエンザA型/PR/8/34 M1遺伝子(アクセッション番号NC_002016)のオープンリーディングフレームとの間の融合は、終止コドンの下流に追加された隣接するSacI部位を持って合成された。断片をSwaI(TEV 5’UTR中の)およびSacIにより消化し、pCAMBIAのバイナリープラスミド中の2×35S/TEVベースの発現カセットの中へクローン化した。もたらされたプラスミドは、2×35S/TEVプロモーターおよび5’UTRの制御下のM1をコードする領域ならびにNOSターミネーターを持っていた(コンストラクト750;図11)。
Hamilton et al. (2002)中で記載されるように、HcProコンストラクト(35HcPro)を調製した。すべてクローンをコンストラクトの全体性を確認するために配列決定した。プラスミドを使用して、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)(AGL1;ATCC、マナッサス、バージニア20108、アメリカ)を形質転換した(Mattanovich et al., 1989)。すべてのA.ツメファシエンス株の全体性を制限マッピングによって確認した。
トマトブッシースタントウイルス(TBSV)のp19タンパク質のコード配列を、Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77-85(1995))中に提示されたPCRベースのライゲーション法によってアルファルファのプラストシアニン発現カセットに連結した。PCRの第1のラウンドにおいて、プラストシアニンプロモーターのセグメントを、鋳型としてコンストラクト660(配列番号:60;図51)によりプライマーPlasto−443c(配列番号:4;図7A)およびsupP19−plasto.r(配列番号:124)を使用して増幅した。平行して、p19のコード配列を含有する別の断片を、Voinnet et al. (The Plant Journal 33: 949-956 (2003))中に記載されるように鋳型としてコンストラクト35S:p19を使用して、プライマーのsupP19−1c(配列番号:125)およびSupP19−SacI.r(配列番号:126)で増幅した。次いで増幅産物を混合し、プライマーのPlasto−443c(配列番号:4;図7A)およびSupP19−SacI.r(配列番号:126)による第2の1ラウンドの増幅(集合させる反応)に鋳型として使用する。もたらされた断片をBamHI(プラストシアニンプロモーター中の)およびSacI(p19コード配列の端部で)により消化し、事前に同じ制限酵素により消化したコンストラクト番号660(配列番号:60;図51)の中へクローン化して、コンストラクト番号R472を得た。プラスミドR472を図86中で提示する。
植物のニコチアナ・ベンサミアナ(Nicotiana benthamiana)またはニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)を、市販のピートモス基質で満たした低地において種子から育てた。16/8の光周期および25℃昼/20℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。種まきの3週間後に、個別の苗木を選び、ポットに移植し、同じ環境条件下の温室中でさらに3週間成長させた。形質転換前に、頂芽および腋芽を、植物から芽をはさむことによってまたは化学的に植物を処理することによってのいずれかで、様々な時間で以下に示すように除去した。
インキュベーションに続いて、植物の地上構造の部分を収穫し、−80℃で凍結し、破砕して細かくした。冷却した50mMトリス(pH7.4)、0.15M NaClおよび1mMフェニルメタンスルホニルフルオリドの3体積中で、凍結破砕した各々の植物材料のサンプルをホモジナイズ(ポリトロン)することによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを4℃で20分間20,000gで遠心分離し、清澄化した粗抽出物(上清)を分析のために保存した。清澄化した粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード分析(バイオ・ラッド(Bio−Rad)社、ヘラクレス、カリフォルニア)によって決定した。
32mlのセファクリル(商標)S−500高分解能ビーズのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(S−500 HR:GEヘルスケア(GE Healthcare)社、ウプサラ、スウェーデン、カタログ番号17−0613−10)を充填し、平衡/溶出緩衝液(50mMトリス(pH8)、150mM NaCl)により平衡化した。1.5ミリリットルの粗タンパク質抽出物をカラムにロードし、続いて45mLの平衡/溶出緩衝液による溶出工程を行う。溶出を1.5mLの画分で回収し、溶出画分の相対的タンパク質含有量は、10μLの画分を200μLの希釈したバイオ・ラッド社プロテインダイリエージェント(protein dye reagent)(バイオ・ラッド社、ヘラクレス、カリフォルニア)と混合することによってモニターした。2カラム体積の0.2N NaOH、続いて10カラム体積の50mMトリス(pH8)、150mM NaCl、20%のエタノールによりカラムを洗浄した。各々の分離の後に、ブルーデキストラン2000(GEヘルスケア・バイオ−サイエンス社(GE Healthcare Bio−Science Corp.)、ピスカタウェイ、ニュージャージー、アメリカ)によるカラムのキャリブレーションが続いた。使用したカラム間の溶出プロフィールの均一性を保証するために、ブルーデキストラン2000および宿主可溶性タンパク質の溶出プロフィールを各々の分離間で比較した。
タンパク質濃度はBCAプロテインアッセイ(protein assay)(ピアース・バイオケミカルズ(Pierce Biochemicals)社ロックポート、イリノイ)によって決定した。タンパク質を還元条件下でSDS−PAGEによって分離し、クマシーブルーにより染色した。染色したゲルをスキャンし、ImageJソフトウェア(NIH)を使用してデンシトメトリー解析を行った。
FII:フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル(Fitzgerald Industries International)社、コンコード、マサチューセッツ、アメリカ;
NIBSC:国立生物学的製剤研究所;
JIR:ジャクソン・イムノリサーチ(Jackson ImmunoResearch)社、ウエストグローブ、ペンシルバニア、アメリカ;
BEI NR:バイオテロ防衛・新興感染症研究リソースリポジトリ(Biodefense and emerging infections research resources repository);
ITC:イミューン・テクノロジー社(Immune Technology Corporation)、ウッドサイド、ニューヨーク、アメリカ;
TGA:保健省薬品・医薬品行政局(Therapeutic Goods Administration)、オーストラリア。
H5含有バイオマスのゲル濾過クロマトグラフィーから溶出された画分9、10および11の1ミリリットルをプールし、20〜60%(w/v)の不連続ショ糖密度勾配上にロードし、125000g(4℃)で17.5時間遠心分離した。この勾配はトップから開始して19個の3mLの画分で分画し、免疫学的分析および赤血球凝集分析の前にショ糖を除去するために透析した。
検査される100マイクロリットルのサンプルを、エアフュージ(Airfuge)超遠心チューブ(ベックマン・インスツルメンツ(Beckman Instruments)社、パロアルト、カリフォルニア、アメリカ)中に置いた。グリッドをチューブの底に置き、次いで120000gで5分間遠心分離した。グリッドを取り出し、穏やかに乾燥し、染色のためにpH6の3%リンタングステン酸のドロップを上に置いた。グリッドを日立7100透過型電子顕微鏡(TEM)で検査した(図14B、15Bおよび15C中の像について)。
Mongrand et al.に従う細胞分画法後に、原形質膜(PM)を、ポリエチレングリコール3350/デキストランT−500(各6.6%)による水性ポリマー二相系における分配によって、タバコ葉および培養されたBY2細胞から得た。工程はすべて4℃で行った。
660をインフィルトレーションしたN.ベンサミアナの凍結葉を、市販のブレンダーを使用して、1.5体積の50mMトリス(pH8)、150mM NaClおよび0.04%メタ重亜硫酸ナトリウム中でホモジナイズした。生じた抽出物に1mM PMSFを補足し、1M酢酸でpH6に調節し、5分間42℃で加熱した。pHシフトおよび熱処理によって沈殿させた混入物を吸着するために珪藻土(DE)を熱処理した抽出物に追加し、スラリーをワットマンの濾紙を通して濾過した。生じた清澄化抽出物は残りのDEを除去するために室温で10分間10,000×gで遠心分離し、0.8/0.2μmアクロパック(Acropack)20フィルターを通し、フェチュイン−アガロース親和性カラム(シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ、アメリカ)上にロードした。400mM NaCl、25mMトリス(pH6)中での洗浄工程に続いて、結合タンパク質を1.5M NaCl、50mM MES(pH6)により溶出した。溶出されたVLPは、0.0005%(v/v)の最終濃度までツイーン80で補足した。VLPを100kDa分子量カットオフアミコンの膜で濃縮し、4℃で30分間10,000×gで遠心分離し、0.01%ツイーン80および0.01%チメロサールを含むPBS(pH7.4)中で再懸濁した。懸濁したVLPを使用前にフィルター滅菌した。
マウス
インフルエンザVLP投与に対する免疫応答に関する試験を、6〜8週間齢のメスBALB/cマウス(チャールズ・リバー・ラボラトリーズ(Charles River Laboratories)社)により行った。70匹のマウスを、5匹の動物の14群へとランダムに分けた。8群を筋肉内免疫のために使用し、6群を鼻腔内経路の投与を試験するために使用した。すべての群は、2用量のレジメン(追加接種免疫は第1の免疫の3週間後に行われる)で免疫された。
5匹のフェレット(オス、18〜24週齢、おおよそ1kgの重量)の10群を使用した。各々の群についての処理を表7中に記載する。使用されるアジュバントは、2%(最終的=1%)のアルハイドロゲル(ミョウバン)(スーパーフォス・バイオセクター(Superfos Biosector)社、デンマーク)であった。ワクチン組成物は、記載されるようにVLPで産生された膜結合A/インドネシア/5/05(H5N1)であった。ワクチンの対照(陽性対照)は、イミューン・テクノロジー社(ITC)による293細胞の培養においてアデノウイルスを使用して産生されたインドネシア株からの完全に糖鎖付加された膜結合型組換えH5であった。
表7.処理群
128匹のマウスを8匹の動物の16群へとランダムに分け、1群は免疫および攻撃感染されない(陰性対照)ものであった。すべての群は、2用量のレジメン(第2の免疫は第1の免疫の2週間後に行われる)で筋肉内投与を介して免疫された。
麻酔しない動物で、外側伏在静脈血液採取を第1の免疫の14日後および第2の免疫の14日後に行った。血清は10分間8000gの遠心分離によって回収した。
血清の抗インフルエンザの抗体力価を、第1の免疫の14日後に加えて、第2の免疫の14および28日後に測定した。力価は、コーティング抗原として非活性化ウイルスA/インドネシア/5/05を使用する酵素結合免疫吸着分析(ELISA)によって決定した。終了点力価は、陰性対照サンプルのOD値の少なくとも0.1以上のOD値に達した最高希釈の逆数値として表現した。
血清の赤血球凝集阻害(HI)力価は、以前に記載されるように第2の免疫の14および28日後に測定された(WHO 2002; Kendal 1982)。株A/インドネシア/5/05またはA/ベトナム/1203/2004からの非活性化ウイルス調製物を使用して、HI活性についてマウス血清サンプルを試験した。血清は、コレラ菌から調製された受容体破壊酵素II(RDE II)(デンカ生研社(Denka Seiken Co.)、東京、日本)で前処理した(Kendal 1982)。HI分析は0.5%シチメンチョウ赤血球で行った。HI抗体力価は、凝集の完全阻害を引き起こす最高希釈の逆数として定義された。
一過性発現システムによりインフルエンザ赤血球凝集素が産生される能力は、株A/インドネシア/5/05(H5N1)からのH5亜型の発現を介して決定した。図11中に提示されるように、赤血球凝集素遺伝子コード配列(GenBankアクセッション番号EF541394)を、その天然のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインと共に、プラストシアニン発現カセット(アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、5’UTR、3’UTRおよび転写終結配列)中で最初に組み立て、組み立てたカセット(660)をpCAMBIAのバイナリープラスミドに挿入した。次いでこのプラスミドをアグロバクテリウム(AGL1)の中へトランスフェクションし、組換え株AGL1/660を生成し、それを一過性発現のために使用した。
植物で産生されたインフルエンザ赤血球凝集素の高分子量構造への集合を、ゲル濾過によって評価した。AGL1/660をインフィルトレーションした植物(1.5mL)からの粗タンパク質抽出物を、セファクリル(商標)S−500 HRカラム(GEヘルスケア・バイオ−サイエンス社(ピスカタウェイ、ニュージャージー、アメリカ)のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分画した。溶出画分は、抗HAの抗体による免疫検出を使用して、全タンパク質含有量およびHA存在量について分析した(図13A)。図13A中で示されるように、ブルーデキストラン(2MDa)溶出は画分10中で早くにピークに達したが、宿主タンパク質のバルクはカラム中で保持され、画分14乃至22との間で溶出された。200μLの各々のSEC溶出画分からのタンパク質をアセトン沈殿によって濃縮し(5倍)、ウエスタンブロッティングによって分析したときに(図15A、H5)、赤血球凝集素(H5)は主として画分9乃至14中で見出された(図13B)。理論に束縛されるものではないが、これは、HAタンパク質が大きな超構造へと集合したか、または高分子量構造に付着していることのいずれかを示唆する。
電子顕微鏡(EM)下の赤血球凝集素構造の観察は、葉タンパク質の粗抽出物のSECから得られたものよりも高い濃度および純度レベルを必要とした。H5構造のEM観察を可能にするために、葉タンパク質の粗抽出物は、PEG沈殿(20%PEG)によって最初に濃縮し、続いて抽出緩衝液の1/10体積中に再懸濁した。濃縮したタンパク質抽出物をS−500 HRゲル濾過によって分画し、溶出画分9、10および11(カラムのボイド容量に対応する)をプールし、20〜60%のショ糖密度勾配で超遠心によって宿主タンパク質からさらに単離した。ショ糖勾配をトップから開始して分画し、画分は透析し、解析の前に100NMWL遠心濾過ユニットで濃縮した。ウエスタンブロットおよび赤血球凝集の結果で示されるように(図14A)、H5は〜60%ショ糖を含有する画分16乃至19中に主として蓄積したが、大部分の宿主タンパク質は画分13でピークに達した。画分17、18および19をプールし、ネガティブ染色し、EM下で観察した。サンプルの検査から、インフルエンザVLPの形態的特徴に一致した、80乃至300nmのサイズにわたる、スパイクのある球状構造の存在が明らかに実証された(図14B)。
可溶性タンパク質の豊富な含有量に加えて、植物葉抽出物は、可溶性糖質および核酸および脂質の複雑な混合物を含有する。粗抽出物をpHシフトおよび熱処理によって清澄化し、続いて珪藻土で濾過した(清澄化方法の詳細な記載については材料および方法のセクションを参照)。図15A(レーン1−4)は、清澄化の様々な工程でタンパク質含有量を比較する、クマシーブルー染色ゲルを提示する。粗抽出物(レーン1)と清澄化された抽出物(レーン4)中のタンパク質含有量の比較から、全体的なタンパク質含有量を低下させ、葉の粗抽出物中で50kDaの目視可能な主要な混入物の大部分を除去する、清澄化工程の能力が示される。50kDaバンドはRuBisCO大サブユニットに相当し、全葉タンパク質の最大30%を占める。
VLPを局在しそれらの原形質膜起原を確認するために、H5産生植物の葉の薄切片を固定し、ポジティブ染色後にTEM下で調査した。葉細胞の観察から、原形質膜の陥入によって形成された細胞外空洞中のVLPの存在が示された(図19)。観察されたVLPの形状および位置から、細胞壁上での原形質膜の付着にもかかわらず、植物細胞がそれらの原形質膜に由来するインフルエンザVLPを産生し、アポプラスト空間中にそれらを蓄積するのに必要な可塑性を有することが実証された。
植物インフルエンザVLPの組成物および起原のさらなる確認は、脂質含量の分析から得られた。脂質を精製VLPから抽出し、それらの組成物を高性能薄層クロマトグラフィー(HP−TLC)によって高度に精製されたタバコ原形質膜のものと比較した。VLPおよび対照の原形質膜からの極性脂質および中性脂質の移動パターンは類似していた。精製VLPは、原形質膜中で見出される主要なリン脂質(ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン)およびスフィンゴ脂質(グルコシルセラミド)を含有し(図27A)、両者は独特の中性脂質として遊離ステロールを含有していた(図27B)。しかしながら、精製VLP抽出物中の原形質膜タンパク質マーカー(ATPアーゼ)の免疫検出から、VLP脂質二重層は植物原形質膜と関連する主要なタンパク質の1つを含有しないことが示され、植物細胞からのVLP出芽のプロセスの間に宿主タンパク質が膜から除外されたことを示唆する(図27C)。
マウスに筋肉内注射または鼻腔内(吸入)によって植物で作製されたH5 VLPを投与した。0.1乃至12μgのVLPを記載した方法に従ってアジュバントとしてミョウバンと共にマウスの中へ筋肉内で注入した。ピーク抗体力価は、5μgの組換え可溶性赤血球凝集素(H5)のものに類似する大きさで、最低の抗原量で観察された(図20A)。
図21A、Bは、植物で作製されたH5 VLPまたは組換え可溶性H5による「追加接種」の14日後の赤血球凝集阻害(HAI)抗体応答を示す。最低用量の抗原(0.1μg)を筋肉内で投与した場合、組換え可溶性H5の投与(5μg)の10倍高い優れたHAI応答を産生した。H5 VLPの用量が増加すると、最低用量を上回ってHAIはわずかに増加した。
植物で作製されたH5 VLPは原形質膜起原である(図19、実施例5)。理論に束縛されるものではないが、エンベロープウイルスまたはエンベロープウイルスのVLPは、一般的にはそれらが出芽する膜からそれらのエンベロープを取得する。植物原形質膜は、動物細胞において、あるとしてもめったに見出されない植物性ステロール相補物を有し、これらのステロールのいくつかのものは免疫刺激効果を示すことが実証されている。
追加アジュバントとしてミョウバンの存在または非存在下において、植物で作製されたH5 VLPまたは組換え可溶性H5を投与したマウスは、様々な免疫グロブリンアイソタイプを示す(図23A)。
H5 VLPによって誘導された血清抗体の交差反応性を、異なる株の不活性化したインフルエンザの全ウイルスに対して評価した。5μgの対照のHA抗原に加えて、すべてのVLP用量(0.1乃至12μg)は、クレード1株(A/ベトナム/1194/04)、クレード2.1の同種株A/インドネシア/5/05、およびクレード2.2株A/シチメンチョウ/トルコ/1/05に対する高い結合する抗体力価を誘導した(図25A)。
先に記載されるようにA/インドネシア/5/05 H5 VLPの2用量のレジメンを投与したマウスを、続いて、インフルエンザA型/トルコ/582/06(H5N1)(「トルコH5N1」)感染性ウイルスで鼻腔内攻撃感染し、観察した。投与した用量は、1匹の動物あたり、10LD50(4.09×105CCID50)であった。
植物で産生された異なる亜型のインフルエンザ赤血球凝集素の高分子量構造への集合を、ゲル濾過によって評価した。AGL1/660、AGL1/540、AGL1/783、AGL1/780、AGL1/785、およびAGL1/790をインフィルトレーションした植物(1.5 mL)からの粗タンパク質抽出物または濃縮タンパク質抽出物を、セファクリル(商標)S−500 HRカラム(GEヘルスケア・バイオ−サイエンス社(ピスカタウェイ、ニュージャージー、アメリカ)のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分画した。図46中で示されるように、ブルーデキストラン(2MDa)溶出は、画分10中で早くにピークに達した。200μLの各々のSEC溶出画分からのタンパク質をアセトン沈殿によって濃縮し(5倍)、ウエスタンブロッティングによって分析した場合(図46)、赤血球凝集素は画分7乃至14中で主として見出され、VLPの中へのHAの取り込みを示す。理論に束縛されるものではないが、これは、HAタンパク質が大きな超構造へと集合したか、または産生された亜型に関係なく高分子量構造に付着していることのいずれかを示唆する。図46では、株A/ニューカレドニア/20/1999からのH1および株A/ブリズベーン/10/2007からのH3を、PDIシグナルペプチド含有するカセットを使用して産生した。得られた結果は、アルファルファPDIのシグナルペプチドによる天然のシグナルペプチドの置換が、HAが粒子へと集合する能力に影響しないことを示す。
一過性発現システムが季節性インフルエンザ赤血球凝集素を産生する能力は、株A/ブリズベーン/59/2007(H1N1)(プラスミド番号774)、A/ニューカレドニア/20/1999(H1N1)(プラスミド番号540)およびA/ソロモン諸島/3/2006(H1N1)(プラスミド番号775)からのH1亜型、株A/ブリズベーン/10/2007(プラスミド番号776)およびA/ウィスコンシン/67/2005(プラスミド番号777)からのH3亜型、ならびに株B/マレーシア/2506/2004(ビクトリア系列)(プラスミド番号778)およびB/フロリダ/4/2006(ヤマガタ系列)(プラスミド番号779)からのB型の発現を介して決定した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット(アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、5’UTR、3’UTRおよび転写終結配列)中で最初に組み立て、組み立てたカセットをpCAMBIAのバイナリープラスミドに挿入した。次いで、プラスミドはアグロバクテリウム(AGL1)へとトランスフェクションし、アグロバクテリウム株のAGL1/774、AGL1/540、AGL1/775、AGL1/776、AGL1/777、AGL1/778およびAGL1/779をそれぞれ産生した。
一過性発現システムが可能性のあるインフルエンザ赤血球凝集素を産生する能力は、株A/アンホイ/1/2005(H5N1)(プラスミド番号781)、A/インドネシア/5/2005(H5N1)(プラスミド番号660)およびA/ベトナム/1194/2004(H5N1)(プラスミド番号782)からのH5亜型、株A/シンガポール/1/1957(H2N2)(プラスミド番号780)からのH2亜型、株A/コガモ/香港/W312/1997(H6N1)(プラスミド番号783)からのH6、株A/ウマ/プラハ、/1956(H7N7)(プラスミド番号784)のH7ならびに最後に株A/香港/1073/1999(H9N2)(プラスミド番号785)からのH9の発現を介して決定した。赤血球凝集素遺伝子コード配列を、プラストシアニン発現カセット(アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、5’UTR、3’UTRおよび転写終結配列)中で最初に組み立て、組み立てたカセットをpCAMBIAのバイナリープラスミドに挿入した。次いでプラスミドをアグロバクテリウム(AGL1)へとトランスフェクションし、アグロバクテリウム株のAGL1/781、AGL1/660、AGL1/782、AGL1/780、AGL1/783、AGL1/784およびAGL1/785を産生した。
一過性発現システムがニコチアナ・タバカムの葉中のインフルエンザ赤血球凝集素を産生する能力は、株A/インドネシア/5/2005(H5N1)(プラスミド番号660)からのH5亜型の発現を介して分析された。赤血球凝集素遺伝子コード配列は、プラストシアニン発現カセット(アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、5’UTR、3’UTRおよび転写終結配列)中で最初に組み立て、組み立てたカセットをpCAMBIAのバイナリープラスミドに挿入した。次いで、プラスミドをアグロバクテリウム(AGL1)へとトランスフェクションし、株AGL1/660を産生した。
植物に由来するVLPの免疫原性を評価するためにフェレットにおける用量増量試験は行った。3用量(1、5および15μg)のH5 VLPワクチンによって誘導された血清抗体のインビトロ交差反応性を、ワクチンの第1の投薬14日後(図50A)および第2の投薬14日後(図50B)に採取した血清を使用して、3つの他のH5N1株(A/シチメンチョウ/トルコ/1/05(クレード2.2)、A/ベトナム/1194/04(クレード1)およびA/アンホイ/5/05(すべて非活性化全ウイルス))の赤血球凝集阻害によって評価した。3つの用量濃度すべてについて、交差反応性は観察される。
EMEAのヒト用医薬品委員会(CHMP)(http://www.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.html)は、ワクチン有効性についての3つの基準(第2の投薬後に適用される)を設定する。1−セロコンバージョン数またはHI力価中の有意な増加(4倍)があったものが40%以上;2−少なくとも2.5の平均幾何学的増加;3−1/40のHI力価を達成する被験体の比率が少なくとも70%である。フェレットモデルにおけるこれらの基準の解析は表8〜11中で示される。(*)CHMP基準を満たすかまたは越えることを表す。認可のためのCHMP基準に関連する交差免疫原性の解析の要約は、表12中に示される。
表8:同種株(A/インドネシア/5/05)についてのデータ
HAのヌクレオチド配列は、インフルエンザ配列データベース(URL: flu.lanl.govを参照)、またはNCBIインフルエンザウイルスリソース(Bao et al., 2008. J. Virology 82(2): 596-601;URL: ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.htmlを参照)から検索された。HA核酸配列のいくつかについて、複数のエントリーがデータベース中にリストされる(表13)。いくつかの変動は主として培養系に関連し(起原−MDCK、卵、未知のウイルスRNA/臨床単離物)、例えば、B型インフルエンザウイルスが卵の尿膜腔液中で発現される場合、HAの位置194(成熟タンパク質の番号付け)での糖鎖付加部位は存在しない(Chen et al., 2008も参照)。いくつかの配列について、ドメインは欠損してもよい(例えば不完全なクローン、配列決定の際の人工物など)。インフルエンザ赤血球凝集素のドメインおよびサブドメインは、記載において一般的に論じられる。第1の配列のドメインまたはサブドメインは第2の既存の配列からのドメインと組み合わせることができ、例えば第1の株の配列のシグナルペプチドは、完全なコード配列を提供するために第2の株からの赤血球凝集素コード配列とバランスをとって組み合わせることができる。
Y、N−それぞれ、あり、なし
SP−シグナルペプチド配列の存在Y/N
HA1−完全なHA1ドメインY/N
HA2−完全なHA2ドメインY/N
DTm−完全な膜貫通ドメインY/N
8アミノ酸配列を比較し、変動を同定した(表14)。位置171は、いくつかの配列においてグリシン(G)またはアルギニン(R)の変動を示した。
表14:A/ソロモン諸島/3/2006のアミノ酸の変動
位置203は、アスパラギン酸(D)、イソロイシン(I)またはアスパラギン(N)の変動を示した。
配列変動は5つの位置で観察された(表15)。位置215において、欠失は2つのサンプリングされた配列中で観察される。
表15:A/ブリズベーン/10/2007からのH3のアミノ酸の変動
この株における配列変動は4つの位置で観察された(表16)。表16:A/ウィスコンシン/67/2005からのH3のアミノ酸の変動
2つの位置での変動が観察される(表17)。位置120は糖鎖付加部位ではなく、位置210は糖鎖付加に関与し、卵中の培養後にこの糖鎖付加は消失する。
表17:B/マレーシア/2506/2004からの赤血球凝集素のアミノ酸の変動
観察された変動は、培養系に依存して、位置211のアミノ酸配列変動を含む。アスパラチン(Asparatine)(N)はMDCK細胞から単離した配列中で見出されるが、グルタミン酸(D)は卵から単離した配列中で見出される。位置211は糖鎖付加部位であり、卵における培養の後に消失する。
これらのH5株のいずれかの一次配列のアライメントでアミノ酸配列において観察される変動はなかった。
1エントリーのみが株(AF250179)について利用可能であった。
合計2つの配列エントリーがデータベース中に見出された。エントリーAB298877は実験室での再集合体であるので除外された。
合計2つの配列エントリーがデータベース中に見出された。1つのみが完全であった。
他の赤血球凝集素についてのHA蓄積レベルに対するシグナルペプチド修飾の効果も、アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼからのシグナルペプチド(SP;ヌクレオチド32〜103)(PDI;アクセッション番号Z11499;配列番号:34;図17)と融合した、株A/ブリズベーン/59/2007(H1N1)(プラスミド番号787)、A/ニューカレドニア/20/1999(H1N1)(プラスミド番号540)、株A/ブリズベーン/10/2007(H3N2)(プラスミド790)およびA/インドネシア/5/2005(H5N1)(プラスミド番号663からのA亜型HA、ならびに株B/フロリダ/4/2006(プラスミド番号798)からのB型の発現を介して調査された。PDI SP−赤血球凝集素遺伝子融合をプラストシアニン発現カセット(アルファルファのプラストシアニン遺伝子からのプロモーター、5’UTR、3’UTRおよび転写終結配列)中で組み立て、組み立てたカセットをpCAMBIAのバイナリープラスミドに挿入した。次いでプラスミドをアグロバクテリウム(AGL1)へとトランスフェクションし、アグロバクテリウム株AGL1/787、AGL1/540、AGL1/790、AGL1/663およびAGL1/798をそれぞれ産生した。
ササゲモザイクウイルス(CPMV)RNA2からの非翻訳配列を含む発現カセットCPMV−HT(Sainsbury et al. 2008 Plant Physiology 148: 1212-1218;WO 2007/135480も参照)を、トランスジェニック植物におけるいくつかの赤血球凝集素の発現のために使用した。A/ニューカレドニア/20/1999(H1)、A/ブリズベーン/59/2007(H1)、A/ブリズベーン/10/2007(H3)、A/インドネシア/5/2005(H5)およびB/フロリダ/4/2006(B)からのHAを、記載されるようにアグロインフィルトレーションして、N.ベンサミアナ植物中でCPMV−HTの制御下で発現させた。インキュベーション後に、葉を収穫し、抽出し、タンパク質抽出物中のHA含有量をウエスタンブロットによって比較した。図88中に示されるように、CPMV−HT発現カセットは、使用されるシグナルペプチドに関係なくプラストシアニンカセットよりも高いHA発現レベルをもたらした。さらに、B/フロリダ/4/2006からの株Bについては、CPMV−HT発現カセットの使用により、プラストシアニンカセット下で発現させた時これらの免疫検出条件下で検出不能なままだったHA蓄積の検出が可能になった。
植物起原の細胞質Hsp70およびHsp40(コンストラクト番号R870)を、両方とも植物起原のシグナルペプチド(アルファルファPDIシグナルペプチド)を持つH1ニューカレドニア(コンストラクト番号540)またはH3ブリズベーン(コンストラクト番号790)と共発現させた。共発現は、AGL1/540、AGL1/R870、AGL1/35SHcPro(H1について)またはAGL1/790、AGL1/R870およびAGL1/35SHcPro(H3について)の混合物(1:1:1比)を含有する細菌懸濁液によるN.ベンサミアナ植物のアグロインフィルトレーションによって行った。対照植物は、AGL1/540、AGL1/35SHcPro(H1について)またはAGL1/790、AGL1/35SHcPro(H3について)の混合物(1:2比)によりアグロインフィルトレーションした。インキュベーション後に、葉を収穫し、抽出し、タンパク質抽出物中のHA含有量をウエスタンブロットによって比較した(図89)。試験された条件において、得られた結果は、Hsp70およびHsp40の共発現がH1ニューカレドニアについての赤血球凝集素蓄積レベルを増加させなかったことを示す。しかしながら、H3ブリズベーンについては、ウエスタンブロットから、細胞質Hsp70およびHsp40の共発現が赤血球凝集素蓄積レベルの有意な増加をもたらすことが明らかに示された。
CPMV−HT発現カセットも、記載されるようにアグロインフィルトレーションして、N.ベンサミアナ植物中でのH1 A/カリフォルニア04/09(コンストラクト番号560、図90、98)の発現のために使用した。2日のインキュベーション後に、葉を収穫し、抽出し、タンパク質抽出物中のHA含有量をウエスタンブロットによって比較した。図91中で示されるように、CPMV−HT発現カセットはインフィルトレーション2日後にHAの有意な発現をもたらした。植物中のHAの発現から産生されたVLPは、赤血球の凝集を実証する。
本発明の一態様として、例えば以下のものがある。
〔1〕植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されたA型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素(HA)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
〔2〕前記HAが、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含む、前記〔1〕に記載の核酸。
〔3〕前記非天然のシグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、前記〔2〕に記載の核酸。
〔4〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、
a)前記〔1〕に記載の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程と、
b)核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってVLPを産生する工程と
を含む方法。
〔5〕前記導入工程(工程a)において、前記核酸が一過性様式で植物中に導入される、前記〔4〕に記載の方法。
〔6〕前記導入工程(工程a)において、前記核酸が安定的であるように植物中に導入される、前記〔4〕に記載の方法。
〔7〕c)宿主を採取しVLPを精製する工程
をさらに含む、前記〔4〕に記載の方法。
〔8〕前記導入工程(工程a)において、1つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸が植物に導入される、前記〔4〕に記載の方法。
〔9〕前記1つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Hsp40およびHsp70からなる群から選択される、前記〔8〕に記載の方法。
〔10〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、
a)前記〔1〕に記載の核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程と、
b)核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってVLPを産生する工程と
を含む方法。
〔11〕前記〔1〕に記載の核酸を含む植物。
〔12〕植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された1つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む、前記〔11〕に記載の植物。前記1つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Hsp40およびHsp70からなる群から選択される前記植物。
〔13〕A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザウイルス赤血球凝集素(HA)タンパク質と、植物に由来する1つまたは複数の脂質とを含むウイルス様粒子(VLP)。
〔14〕効果的な用量の前記〔13〕に記載のVLPと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔15〕前記〔13〕に記載のウイルス様粒子を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
〔16〕前記ウイルス様粒子が、経口的に、皮内に、鼻内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に被験体に投与される、前記〔15〕に記載の方法。
〔17〕植物特異的N−グリカンまたは修飾されたN−グリカンを持つA型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザウイルスHAを含むウイルス様粒子(VLP)。
〔18〕効果的な用量の前記〔17〕に記載のVLPと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔19〕前記〔18〕に記載の組成物を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
〔20〕前記組成物が、経口的に、皮内に、鼻内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に又は皮下に被験体に投与される、前記〔19〕に記載の方法。
〔1’〕植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、配列番号28と少なくとも70%の配列同一性を有する、インフルエンザ赤血球凝集素(HA)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、植物中で発現させた場合にウイルス様粒子(VLP)を産生する前記核酸。
〔2’〕前記HAが、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含む、前記〔1’〕に記載の核酸。
〔3’〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、
a)前記〔1’〕に記載の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程と、
b)核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってVLPを産生する工程と
を含む方法。
〔4’〕前記導入工程(工程a)において、前記核酸が一過性様式で植物中に導入されるか、又は前記核酸が安定的であるように植物中に導入される、前記〔3’〕に記載の方法。
〔5’〕c)宿主を採取しVLPを精製する工程
をさらに含む、前記〔3’〕に記載の方法。
〔6’〕前記導入工程(工程a)において、1つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸が植物に導入される、前記〔3’〕〜〔5’〕のいずれか1項に記載の方法。
〔7’〕植物においてインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、
a)前記〔1’〕に記載の核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程と、
b)核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってVLPを産生する工程と
を含む方法。
〔8’〕前記〔1’〕に記載の核酸を含む植物。
〔9’〕該植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された1つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸をさらに含む、前記〔8’〕に記載の植物。
〔10’〕植物において産生されるウイルス様粒子(VLP)であって、前記〔1’〕に記載の核酸によってコードされるインフルエンザウイルス赤血球凝集素(HA)と、植物に由来する1つまたは複数の脂質とを含む、前記ウイルス様粒子(VLP)。
〔11’〕免疫応答を誘導するための効果的な用量の前記〔10’〕に記載のVLPと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔12’〕インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、前記〔10’〕に記載のウイルス様粒子(VLP)又は前記〔11’〕に記載の組成物。
〔13’〕植物特異的N−グリカンまたは修飾されたN−グリカンを持つ、前記〔10’〕に記載のウイルス様粒子(VLP)。
〔14’〕免疫応答を誘導するための効果的な用量の前記〔13’〕に記載のVLPと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
〔15’〕インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、前記〔13’〕に記載のウイルス様粒子又は前記〔14’〕に記載の組成物。
Claims (22)
- 植物においてインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、前記VLPが、インフルエンザタンパク質を含み、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素(HA)からなり、
a)インフルエンザHAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号135のヌクレオチド52〜1701により定義される、A型/カリフォルニア/04/09のHAをコードする配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結され、前記調節領域が、ササゲモザイクウイルス(CPMV)−HTを含む工程と、
b)前記核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってA型/カリフォルニア/04/09のHAからなるインフルエンザタンパク質を含むVLPを産生する工程と
を含むことを特徴とする、方法。 - 植物においてインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、前記VLPが、インフルエンザタンパク質を含み、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素(HA)からなり、
a)インフルエンザ赤血球凝集素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号135のヌクレオチド52〜1701により定義される、A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素をコードする配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結され、かつ植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されている工程と、
b)前記核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってA型/カリフォルニア/04/09のHAからなるインフルエンザタンパク質を含むVLPを産生する工程と
を含むことを特徴とする、方法。 - 前記ヌクレオチド配列が、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記非天然のシグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記導入工程(工程a)において、前記核酸が一過性様式で植物中に導入されるか、又は前記核酸が安定的であるように植物中に導入される、請求項1または2に記載の方法。
- c)植物を採取しVLPを精製する工程であって、前記VLPが80乃至300nmのサイズの範囲である、当該工程
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記導入工程(工程a)において、1つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸が植物に導入され、前記1つまたは複数のシャペロンタンパク質が、Hsp40およびHsp70からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 植物においてインフルエンザタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素(HA)からなり、
a)インフルエンザHAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号135のヌクレオチド52〜1701により定義される、A型/カリフォルニア/04/09のHAをコードする配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されており、前記調節領域が、ササゲモザイクウイルス(CPMV)−HTを含む工程と、
b)核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってA型/カリフォルニア/04/09の赤血球凝集素(HA)からなるインフルエンザタンパク質を含むVLPを産生する工程と
を含むことを特徴とする、方法。 - 植物においてインフルエンザタンパク質を含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を産生する方法であって、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素(HA)からなり、
a)インフルエンザ赤血球凝集素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号135のヌクレオチド52〜1701により定義される、A型/カリフォルニア/04/09のインフルエンザ赤血球凝集素をコードする配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結され、かつ植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されている工程と、
b)核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってA型/カリフォルニア/04/09の赤血球凝集素(HA)からなるインフルエンザタンパク質を含むVLPを産生する工程と
を含むことを特徴とする、方法。 - 前記ヌクレオチド配列が、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と連結されている、請求項8に記載の方法。
- 前記非天然のシグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、請求項10に記載の方法。
- インフルエンザ赤血球凝集素(HA)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号135のヌクレオチド52〜1701により定義される、A型/カリフォルニア/04/09のHAをコードする配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結されており、前記調節領域が、ササゲモザイクウイルス(CPMV)−HTを含み、前記核酸が、前記植物中で発現された場合にインフルエンザタンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)を生じ、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09のHAからなることを特徴とする、植物。
- インフルエンザ赤血球凝集素(HA)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む植物であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号135のヌクレオチド52〜1701により定義される、A型/カリフォルニア/04/09のHAをコードする配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、前記ヌクレオチド配列が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に連結されており、前記核酸が、前記植物中で発現された場合にインフルエンザタンパク質を含むウイルス様粒子(VLP)を生じ、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09のHAからなることを特徴とする、植物。
- 前記ヌクレオチド配列が、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列と連結されている、請求項12に記載の植物。
- 前記非天然のシグナルペプチドが、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドである、請求項14に記載の植物。
- 前記植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された1つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2の核酸をさらに含む、請求項12または13に記載の植物。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法に従って植物において産生されるウイルス様粒子(VLP)であって、前記VLPが、インフルエンザタンパク質と、植物に由来する1つまたは複数の脂質とを含み、前記インフルエンザタンパク質が、A型/カリフォルニア/04/09の赤血球凝集素(HA)からなることを特徴とする、ウイルス様粒子(VLP)。
- 免疫応答を誘導するための効果的な用量の請求項17に記載のVLPと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、請求項17に記載のウイルス様粒子又は請求項18に記載の組成物。
- 植物特異的N−グリカンまたは修飾されたN−グリカンを持つ、請求項17に記載のウイルス様粒子(VLP)。
- 免疫応答を誘導するための効果的な用量の請求項20に記載のVLPと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、請求項20に記載のウイルス様粒子又は請求項21に記載の組成物。
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