KR20150089005A - H1n1에 대한 계산적으로 최적화되고 넓은 반응성의 항원 - Google Patents

H1n1에 대한 계산적으로 최적화되고 넓은 반응성의 항원 Download PDF

Info

Publication number
KR20150089005A
KR20150089005A KR1020157012693A KR20157012693A KR20150089005A KR 20150089005 A KR20150089005 A KR 20150089005A KR 1020157012693 A KR1020157012693 A KR 1020157012693A KR 20157012693 A KR20157012693 A KR 20157012693A KR 20150089005 A KR20150089005 A KR 20150089005A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
ser
asn
leu
influenza
Prior art date
Application number
KR1020157012693A
Other languages
English (en)
Inventor
테드 엠. 로스
도날드 엠. 카터 제이알.
코레이 제이. 크레바르
Original Assignee
유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 filed Critical 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Publication of KR20150089005A publication Critical patent/KR20150089005A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리물(influenza virus isolates)에 넓은 반응성 면역 반응(immune response) 유도에 대한 최적화된 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드(polypeptides)의 생성에 관한 것이다. 상기 최적화된 HA 폴리펩타이드는 HA 단백질 정렬(alignments), 그 후 1918-2012로부터 분리된 선별된 H1N1 바이러스에 기초하여 일치 서열(consensus sequence)의 생성의 시리즈를 통해 개발되었다. 본 발명은 최적화된 H1N1 HA 폴리펩타이드, 및 조성물(compositions), HA 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질(fusion proteins) 및 VLPs를 제공한다. 추가적으로 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 코돈-최적화된(codon-optmized) 핵산(nucleic acid) 서열을 제공한다. 또한 현 공개에 의해 개체(subject)에 인플루엔자 바이러스(virus)에 대항하여 면역 반응을 유도하는 방법도 제공한다.

Description

H1N1에 대한 계산적으로 최적화되고 넓은 반응성의 항원{Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2012년 11월 27일에 출원된, 미국 가출원 번호. 61/730,186의 우선권으로 하고, 전체적으로 참조로 통합된다.
본 발명은 H1N1 바이러스(virus) 분리물에 대한 넓은 반응성 면역 반응을 유도할 수 있는 최적화된 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질(influenza hemaglutinin proteins) 및 백신(vaccines)으로서의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae 과에 속한다. 인플루엔자 바이러스(influenza virus)에 대한 세 개의 아형(subtype)이 있는데, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 및 인플루엔자 C이다. 상기 인플루엔자 비리온(virion)은 하기의 단백질을 암호화하는 조각된 음성적-방향의 RNA 유전체(segmented negative-sense RNA genome)을 포함한다: 헤마글루티닌(hemaglutinin; HA), 뉴라미니다제(neuraminidase; NA), 매트릭스(matrix; M1), 양성자 이온-채널 단백질(proton ion-channel protein; M2), 뉴클리오단백질(nucleoprotein; NP), 폴리머라제 기본 단백질 1(polymerase basic protein 1; PB1), 폴리머라제 기본 단백질 2(polymerase basic protein 2; PB2), 폴리머라제 산성 단백질(polymerase acidic protein; PA), 및 비구조적 단백질 2(nonstructural protein 2; NS2). 상기 HA, NA, M1 및 M2는 막 연관적이고(membrane associated), 반면 NP, PB1, PB2, PA 및 NS2는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 연관된 단백질이다. 상기 M1 단백질은 인플엔자 조각(particle) 중 가장 풍부한 단백질이다. 상기 HA 및 NA 단백질은 외피 글리코단백질(envelope glycoproteins)로서, 바이러스의 접착 및 세포로의 바이러스 조각의 침투에 역할을 하고 바이러스 중화(virus neutralization) 및 예방적 면역(protective immunity)에 대한 주요한 면역우성(immunodominant) 에피토프(epitope)의 원천이다. HA 및 NA 단백질은 예방적(prophylactic) 인플루엔자 백신에 대한 가장 중요한 구성물로 여겨진다.
매년, 계절성 인플루엔자는 미국에서만 300,000 이상의 입원 및 36,000명의 죽음을 야기한다(Simonsen 등., Lancet Infect Dis 7: 658-66, 2007). 2009년의 신규한 H1N1 인플루엔자 바이러스의 출현은 얼마나 빠르게 새로운 인플루엔자 유행병이 전 세계를 휩쓰는지를 입증한다.
현재 미국에서 두 개의 인플루엔자 백신이 라이센스(license)를 얻기 위해 접근중이다- 불활성의(inactivated), 분리된(split) 백신 및 생존이-약화된(live-attenuated) 바이러스 백신이다. 불활성된 백신은 호르몬성의 면역 반응을 효과적으로 유도할 수 있으나 일반적으로 부실한 세포적 면역 반응을 유도한다. 살아있는 바이러스 백신은 감염에 대한 위험의 증가 때문에 면역력이 손상된(immunocompromised) 환자 또는 임산부에 투여할 수 없다. 따라서, 넓은 예방적 인플루엔자 바이러스 백신이 필요하다.
본 발명은 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리물(influenza virus isolates)에 대한 넓은 반응성 면역 반응을 유도하는 최적화된 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드(polypeptides)의 생성에 관한 것이다. 최적화된 HA 폴리펩타이드는 HA 단백질 정렬(alignment)의 시리즈 및, 그 후에 1918-2012로부터 분리된 선별된 H1N1 바이러스에 기초한, 일치 서열(consensus sequence)의 생성을 통해서 개발하였다.
본 발명에서 제공하는 재조합(recombinant) 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 H1N1 인플루엔자에 대항하여 넓은 반응성 면역 반응을 유도해 낼 수 있는 최적화된 아미노산 서열을 갖고 있다. 어떤 한 실시예에서, 상기 HA 폴리펩타이는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7에 대해 최소 95%, 최소 96%, 최소 97%, 최소 98%, 또는 최소 99%의 상동성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7에 대해 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하의 아미노산 치환체를 포함한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 HA 폴리펩타이드는 서열번호 8을 포함한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌 잔기(N-terminal methionine residue)가 결여되었다.
분리된 핵산 분자(nucleic acid molecules) 및 재조합 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 또한 본 발명으로 제공한다. 추가적으로 상기 벡터를 포함하는 분리된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명에 명시된 인플루엔자 바이러스-비슷한 조각(virus-like particles; VLPs) 및 최적화된 HA 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
추가적으로 약학적으로 허용 가능 한 담체(pharmaceutically acceptablecarrier)가 포함된 본 발명에 명시된 최적화된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 VLPs를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 조성물, 융합 단백질 또는 VLPs를 개체에 투여하여 인플루엔자 바이러스에 대항하는 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
또한 최적화된 HA 폴리펩타이드를 함유하는 VLP를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것으로 인플루엔자 바이러스에 대항하여 개체를 면역화하는 방법을 제공한다.
앞서 말한 것 및 본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 도면을 동반하는 참조와 함께 진행되는 하기의 구체적인 묘사로서 더 명확해 질 것이다.
도 1은 방법 X-1에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 방법 X-2에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 3는 방법 X-3에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 방법 X-4에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 5는 방법 X-5에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 6는 방법 X-6에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 7는 방법 A-5에 따른 H1N1 HA 일치 서열의 생성에 사용된 과정을 나타낸 도이다.
도 8A 내지 8B는 본 발명의 서열번호 1 내지 7과 H1N1 HA 단백질 세트의 서열 정렬을 나타낸 도이다.
도 9A 내지 9F는 H1N1 인플루엔자 분리물의 패널(panel)에 대항하여 백신화된(0, 4, 12 주) 마우스로부터의 헤마글루티네이션 억제(hemagglutination inhibition; HAI) 혈청 항체 역가(titer)를 나타낸 도이다. 각 백신 그룹에 대한 HAI 역가는 H1N1 인플루엔자 바이러스를 사용하여 14 주에 결정하였다. 방법 X-1 HA(도 9A), 방법 X-2 HA(도 9B), 방법 X-3 HA(도 9C), 방법 X-4 HA(도 9D), 방법 X-5 HA(도 9E) 및 방법 X-6 HA(도 9F)를 포함하는 VLPs로서 백신화된 마우스의 HAI 역가가 나타나있다. 값은 log2 변환된 역가의 기하 평균(geometric mean) 역가(+95% 신뢰성 간격)로 표현하였다.
서열목록
동반되는 서열 목록에 있는 핵산 및 아미노산 서열은 핵산 염기에 대한 기준 글자, 및 37 C.F.R. 1.822로 정의되는 아미노산에 대한 세 글자 코드로써 나타내었다. 각 핵산 서열의 오직 한 가닥을 나타내었고, 반면 상보적인 가닥(complementary strand)은 표시된 가닥에 대한 어느 참조에 의해 포함되는 것으로서 이해된다. 상기 서열목록은 본 명세서에 참조로써 포함된 2013년 11월 6일에 42.9 KB로 생성된 ASCII 문서 서류로서 제출되었다. 동반하는 서열 목록은:
서열목록 1-7은 최적화된 H1N1 HA 단백질의 아미노산 서열이다. 상기 서열은 또한 도 8에 나타나 있다.
서열목록 8은 최적화된 H1N1 HA 단백질의 일치 아미노산 서열이다.
I. 약어
COBRA: 계산적으로 최적화된 넓은 반응성의 항원(computationally optimized broadly reactive antigen);
HA: 헤마글루티닌(hemagglutinin);
HAL: 헤마글루티네이션 억제(hemagglutination inhibition);
HRP: 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase);
M1: 매트릭스 단백질 1(matrix protein 1);
NA: 뉴라미니다제(neuraminidase);
PFU: 플라그 형성 유닛(plaque form unit);
VLP: 바이러스-비슷한 조각(virus-like particle).
II. 용어 및 방법
다른 공지가 없는 한, 기술적인 용어는 관습적인 사용에 따른다.
분자생물학에서 일반적인 용어의 정의는 옥스퍼드 대학 출판, 1994(ISBN 0-19-854287-9)에 의해 발간된 Benjamin Lewin, Genes V; Blackwell Science Ltd., 1994(ISBN 0-632-02182-9)에 의해 발간된 Kendrew 등(eds), The Encyclopedia of Molecular Biology; VCH Publishers, Inc., 1995(ISBN 1-56081-569-8)에 의해 발간된 Robaert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference에서 발견할 수 있다.
본 명세서의 다양한 실시예의 용이한 검토를 위해서, 하기의 특정 용어에 대한 설명을 제공한다.
아주번트 (adjuvant): 항원에 대한 면역 반응을 비-특이적으로 증가시키는 물질 또는 전파체(vehicle). 아주번트는 항원이 흡수되거나; 또는 미네랄 오일에 항원 용액이 유화된(emulsified) 오일-안에-물 에멀전(emulsion)(예를들면, Freund의 불완전한 아주번트), 때때로 추가적으로 항원성을 증가시키기 위해 사멸한 마이코박테리아(Freud의 완전한 아주번트)를 포함하는 미네랄(백반(alum), 알루미늄하이드록시드(aluminiumhydroxide), 또는 포스페이트(phosphate))의 현탁액을 포함할 수 있다. 면역자극(immunostimulatory) 올리고뉴클레오티드(CpG 모티프를 포함하는 것과 같은) 또한 아주번트로서 사용할 수 있다(예를 들면, 미국 특허 번호. 6,194.388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705; 및 6,429,199). 아주번트는 또한 상호자극적인(costimulatory) 분자와 같은, 생물학적 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 생물학적 아주번트는 IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L 및 41BBL을 포함한다.
투여(administer): 본 명세서에서, 개체에게 조성물을 투여하는 것은 개체와 접촉하여 조성물을 주거나, 적용하거나 또는 가져다주는 것을 의미한다. 투여(administration)는 수많은 경로 중 어느 것으로 행해질 수 있는데, 예를 들면 국소(topical), 경구(oral), 피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 정맥내(intravenous), 척추 강내(intrathecal) 및 피내(intradermal)의 경로이다.
항체(antibody): 특정 아미노산 서열을 갖고 B 림프 세포(B lympoid cell)에 의해 생산되는 면역글로불린(immunoglobulin) 분자이다. 항체는 특정 항원(면역원(immunogen))에 의해서 인간 또는 다른 동물에서 유발된다. 항체는 항체 및 항원 둘 중 다른 하나에 대해서 정의되는, 어떤 증명할 수 있는 방법으로 항원에 대한 특이적인 반응에 의해서 묘사된다. "항체 반응의 도출"은 항원 또는 다른 분자가 항체의 생산을 유도하는 능력을 말한다.
항원(antigen): 항체의 생산 또는 동물에서 T-세포 반응을 자극하는 화합물(compound), 조성물(composition) 또는 물질로서, 동물에 주입되거나 흡수된 조성물을 포함한다. 항원은 특정 체액성(humoral) 또는 세포성(cellular) 면역의 생산물에 반응하는데, 이종의 면역원(heterologous immunogens)에 의해 유도되는 것들을 포함한다. 본 명세서의 조성물 및 방법에서, 항원은 인플루엔자(influenza) HA 단백질이다.
코돈-최적화( codon -optimized): "코돈-최적화된" 핵산은 코돈이 특정 시스템(종(species)의 그룹의 특정 종과 같은)에서 발현에 대해 최적화되도록 변경된 핵산 서열을 말한다. 예를 들면, 핵산 서열은 포유류 세포(mammalian cells)에서 발현에 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 변경하지는 않는다.
융합 단백질(fusion protein): 최소 두 개의 다른(이종의) 단백질의 부분을 암호화하는 핵산 서열로부터 제작된 핵산 서열의 발현에 의해 생성된 단백질이다. 융합 단백질을 만들기 위해서, 상기 핵산 서열은 같은 해독틀(reading frame)에 있어야 하며 내부 종결(stop) 코돈을 포함해야 한다. 예를 들면, 융합 단백질은 이종의 단백질에 맞춰진 인플루엔자 HA를 포함한다.
헤마글루티닌 ( hemagglutinin ; HA): 인플루엔자 바이러스 표면 글리코단백질(glycoprotein). HA는 숙주 세포로 바이러스 조각의 결합 및 숙주 세포로의 그 다음 진입을 매개한다. 수많은 인플루엔자 HA 단백질의 뉴클레오티드(nucleotide) 및 아미노산 서열은 당업계에 알려져 있고, GenBank에 저장된 것들처럼 공개적으로 사용가능하다. HA(NA와 함께)는 두 개의 중한 인플루엔자 바이러스 항원성(antigenic) 결정원(determinants) 중에 하나이다.
면역 반응(immune response): 항원 또는 백신(vaccine)과 같은 자극원에 대한 B-세포, T-세포, 대식세포(macrophage) 또는 폴리몰포뉴클레오사이트(polymorphonucleocyte)와 같은 면역 시스템의 세포에 대한 반응이다. 면역 반응은 숙주 방어 반응에 관련되어있는 예를 들어, 인터페론(interferon) 또는 사이토카인(cytokine)을 분비하는 상피조직(epitherial) 세포를 포함하는, 신체의 어떠한 세포를 포함한다. 면역 반응은 체내 면역 반응 또는 염증을 포함하는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서, 예방적(protective) 면역 반응은 감염(감염 예방 또는 감염과 연관된 질환의 발전을 예방)으로부터 개체를 보호하는 면역 반응을 말한다. 면역 반응을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들면, 증식 및/또는 림프구(B 또는 T 세포와 같은)의 활성, 사이토카인 또는 케모카인(chemokines)의 분비, 감염, 항체 생성 및 이와 같은 것들을 측정하는 것이다.
면역원( immunogen ): 동물에게 주입되거나 흡수된 조성물을 포함하는, 동물에 대한 T-세포 반응 또는 항체의 생성과 같은, 적절한 조건하에서, 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물, 조성물 또는 물질이다. 본 명세서에서, "면역성의 조성물"은 면역원(HA 폴리펩타이드(polypeptide)와 같은)을 포함하는 조성물이다.
면역화(immunize): 백신화(vaccination)과 같이, 감염성 질환으로부터 개체가 보호되도록 하는 것.
인플루엔자 바이러스(influenza virus): 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과에 속하는 분절된 음성적-가닥 RNA 바이러스. A, B 및 C의 세 종류의 인플루엔자 바이러스가 존재한다. 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 말, 해양 포유류, 돼지, 페럿(ferrets), 및 닭을 포함하는 다양한 조류 및 포유류를 감염시킨다. 동물에서, 대부분의 인플루엔자 A 바이러스는 순환계 및 장내 관의 가벼운 국소적인 감염을 유발한다. 반면, H5N1과 같은, 높은 병원성 인플루엔자 A 종은 가금류에서 100%에 달하는 치사율을 갖는 전신에 영향을 주는 감염을 야기한다. 2009년, H1N1 인플루엔자는 인간 인플루엔자의 가장 일반적인 원인이었다. 2009년에 돼지-기원의 H1N1의 새로운 종이 발생하였고 세계 보건 기구에 의해서 대유행으로 선언되었다. 상기 종은 "돼지 독감(swine flu)"로 언급된다. H1N1 인플루엔자 A 바이러스는 1918년에 스페인 독감 대유행, 1976년에 Fort Dix 발병(outbreak) 및 1977-1978년에 러시아 독감 대유행에 대한 책임이 있다.
분리된(isolated): "분리된" 생물학적 요소(핵산, 단백질 또는 바이러스와 같은)는 다른 생물학적 요소들(세포 잔해(debris), 다른 단백질 또는 핵산과 같은)로부터 실질적으로 분해되거나 정제된 것이다. 생물학적 요소는 기준 정제 방법에 의해 정제된 상기 요소들을 포함하여 "분리된" 것이다. 상기 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산 또는 펩타이드와 마찬가지로, 재조합 핵산, 단백질 또는 바이러스(또는 VLPs)를 아우른다.
링커(linker): 융합 단백질의 두 개의 폴리펩타이드 사이의 지지재(spacer)로서 역할을 하는 하나 또는 그 이상의 아미노산.
매트릭스( M1 ) 단백질: 바이러스 껍질(viral envelope) 안에서 발견되는 인플루엔자 바이러스 구조의 단백질. M1는 구조 및 조립 및 출아(budding)의 기능을 한다고 여겨진다.
뉴라미니다제 ( neuraminidase ; NA): 인플루엔자 바이러스 막(membrane) 글리코단백질. NA는 감염된 세포의 표면에서, 카보하이드레이트(carbohydrate) 모이어티(moieties)로부터 말단 시알리산(sialic acid) 잔기의 절단에 의해 바이러스 HA에 대한 세포성 수용체의 건설에 연관되어있다. NA는 또한 바이러스의 응집을 막기위해 바이러스 단백질로부터 시알리산 잔기를 절단한다. NA(HA와 함께)는 두 개의 주요한 인플루엔자 바이러스 항원성 결정원 중에 하나이다.
작동가능하게 연결된(operable linked): 첫 번째 핵산 서열이 두 번째 핵산 서열와 기능적인 연관이 있게 위치할 때 상기 첫 번째 핵산 서열은 두 번째 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들면, 만약 프로모터(promoter)가 전사(transcription) 또는 암호화된 서열의 발현에 영향을 준다면, 프로모터는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, DNA에 작동가능하게 연결된 서열은 인접하였고, 두 개의 단백질-암호화 영역에 참여하는 것이 필요한, 같은 해독틀에 안에 있다.
최적화된 인플루엔자 HA 단백질: 본 명세서에서, "최적화된 인플루엔자 HA 단백질"은 1918-2012(하기 실험예 1에 묘사된 바와 같이) 사이에 분리된 선별된 H1N1 인플루엔자 바이러스의 서열 정렬에 의해 생성된 HA 단백질 공통 서열을 말한다. 최적화된 HA 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화 및 RNA 최적화(RNA 안정성을 증가시키는 것과 같은)를 통해서 포유류 세포내에서의 발현에 대해 추가적으로 최적화된(또는 할 수 있는) 것이다. 본 명세서에 명시된 최적화된 인플루엔자 HA 단백질(및 서열번호 1 내지 7로 본 명세서에 개시된 것)은 "COBRA" 서열을 말한다. 최적화된 HA 폴리펩타이드는 개체에서 넓은 반응성 면역 반응을 유도하도록 만들어졌다. 본 명세서의 문맥상에서, "넓은 반응성"은 개체 내에서 억제, 중화(neutralize) 또는 넓은 범위의 인플루엔자 바이러스(특정 아형(subtype)내의 대부분 또는 모든 인플루엔자와 같은)의 감염 예방에 충분한 면역 반응을 유도하는 단백질 서열을 의미한다. 어떤 예시에서, 상기 최적화된 인플루엔자 HA 단백질은 대부분 또는 모든 H1N1 인플루엔자 바이러스 분리물에 대항하는, 예방적 면역 반응과 같은, 면역 반응을 유도할 수 있다.
발생(outbreak): 본 명세서에서, 인플루엔자 바이러스 "발생"은 주어진 년도의 한 국가 안에서 바이러스 분리물의 무리를 말한다.
약학적으로 허용가능 한 전파체 (vehicle): 본 명세서에서 사용 가능 한 약학적으로 허용가능 한 담체(전파체)는 관습적이다. Mack Publishing Co., Easton, PA, 15번째 에디션(1975)인 E.W. Martin에 의한 Remington's Pharmaceutical Sciences에는 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 백신, 및 추가적인 약학적 시약(agents) 및 제형(formulation)에 관하여 기술되어 있다.
일반적으로, 담체의 본성은 적용되는 투여의 특정 방식에 의존할 것이다. 예를 들면, 비경구의 제형은 보통 물, 생리적 살린(physiological saline), 균형적인 염 용액, 수용성 텍스트로스(dextrose), 글리세롤 또는 전파체로서 그와 비슷한것과 같은 약학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 액체(fluids)를 포함하는 주입가능한 액체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들면, 파우더, 정제(pill), 알약(tablet), 또는 캡슐의 형태), 관습적인 무독성 고체 담체는, 예를 들면, 약학적 등급의 매니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 녹말(starch), 또는 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)를 포함할 수 있다. 생물학적으로-중립적인(biologically-neutral) 담체에 추가적으로 투여되기 위한 약학적 조성물은 습윤 또는 유화제, 보존제 및 pH 완충제 및 이와 비슷한 것, 예를 들면, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 또는 솔비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate)와 같은, 무독성 보조 물질들의 적은 양을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드: 모노머(monomer)가 아미드 결합(amide bond)을 통해 연결된 아미노산 잔기인 폴리머(polymer)이다. 아미노산이 알파-아미노산일 때, L-옵티컬(optical) 이성질체(isomer) 또는 D-옵티컬 이성질체 중 하나가 사용된다. "폴리펩타이드" 또는 "단백질"이라는 용어는 본 명세서에서 어떠한 아미노산 서열을 아우르고 글리코단백질과 같은 변형된 서열을 포함하는 것을 의도한다. 상기 용어 "폴리펩타이드"는 자연적으로 발생한 단백질뿐만 아니라 재조합적으로 또는 합성적으로 생산된 것들을 포함하도록 특히 의도된다. 상기 용어 "잔기" 또는 "아미노산 잔기"는 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드에 포함되는 아미노산에 대한 참고를 포함한다.
보존적인 아미노산 치환은 이러한 치환이 만들어졌을 때, 단백질의 구조 및 특히 기능이 보존되고 상기 치환으로 현저한 변화가 없는 것으로 원래의 단백질의 성질을 최소한으로 방해하는 것이다. 보존적인 치환의 예시는 하기에 나타내었다.
원래 잔기 보존적인 치환
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln, His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
보존적인 치환은 일반적으로 (a)치환의 영역에 있는 폴리펩타이트 백본의 구조, 예를 들면, 시트(sheet) 또는 나선의(helical) 형태, (b) 표적 지역에 있는 분자의 전하 또는 소수성(hydrophobicity), 또는 (c) 곁사슬의 대부분을 유지한다.
일반적으로 단백질 성질에 큰 변화를 생성하도록 예상되는 치환은 비-보존적이고, 예를 들면 (a) 친수성 잔기, 예를 들면, 세릴(seryl) 또는 쓰레오닐(threonyl), 루실(leucyl)이 이소루실(isoleucyl), 페닐알라닐(phenylalanyl), 발릴(valyl) 또는 알라닐(alanyl)과 같은 소수성 잔기로(또는 이것에 의해) 대체되는 것; (b) 시스테인(cystein) 또는 프롤린(proline)이 어떠한 다른 잔기로(또는 이것에 의해) 대체되는 것; (c) 양전하적 곁사슬을 가진 잔기, 예를 들면, 리실(lysyl), 알지닐(arginyl), 또는 히스타딜(histadyl)이 음전하적 잔기인, 예를 들면, 글루타밀(glutamyl) 또는 아스파틸(aspartyl) 잔기로(또는 이것에 의해) 대체되는 것; 또는 (d) 대규모의 곁사슬을 가진 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌(phenylalanine)이 글라이신(glycine)과 같은 곁사슬이 없는 잔기로(또는 이것에 의해) 대체되는 것이다.
질병의 예방, 치료 또는 개선: 질병의 "예방(preventing)"은 질병의 완전한 발달을 억제하는 것을 말한다. "치료"는 질병이나 병리적 환경이 발달하기 시작한 이후에 이들의 징후(sign) 또는 증상을 개선하는 치료상의 개입(therapeutic intervention)을 말한다. "개선"은 질병의 징후 또는 증상의 개수 또는 중증도의 감소를 말한다.
프로모터(promoter): 프로모터는 핵산의 직접적인 전사(transcription)인 핵산 조절 서열의 집합체이다. 프로모터는 전사의 시작점 근처의 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 선택적으로 말단의 개선제(enhancer) 또는 억제(repressor) 요소를 포함한다. "구성 프로모터"는 연속적으로 활성적이고 외부의 신호 또는 분자에 의해 조절되지 않는 프로모터이다. 반면, "유도적인 프로모터(inducible promoter)"의 활성은 외부의 신호 및 분자(예를 들면, 전사 인자)에 의해 조절된다. 본 명세서의 어떤 한 실시예에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다.
정제된(purified): 용어 "정제된"은 완벽한 순도를 필요로 하지 않고; 대신, 상대적인 용어를 의도한다. 그러므로, 예를 들어, 정제된 펩타이드, 단백질, 바이러스, VLP 또는 다른 활성화된 조성물은 단백질 및 다른 오염 물질에 자연적으로 연관된 것으로부터 전체 또는 부분적으로 분리된 것이다. 특정 실시예에서, 용어 "상당히 정제된"은 세포, 세포 배양액, 또는 다른 미가공의 준비물로부터 분리되고 단백질, 세포 잔해물, 및 다른 요소들과 같은 초기 준비의 다양한 요소들을 제거하기 위한 분획과정에 주어지는 펩타이드, 단백질, 바이러스, VLP 또는 다른 활성화된 조성물을 말한다.
재조합(recombinant): 재조합 핵산, 단백질, 바이러스 또는 VLP는 자연적으로 발생하는 것이 아니거나 두 개의 다른 서열의 부분의 인공적인 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 상기 인공적인 조합은 종종 화학적 합성 또는, 더 일반적으로, 핵산의 분리된 조각의 인공적인 조작에 의해, 예를 들면, 유전적 공학 기술에 의해 동반되는 것이다.
서열 정체성(identity): 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 유사도는 서열간의 유사도로써 표현되었고, 그렇지 않으면 서열 정체성으로 언급되었다. 서열 정체성은 백분율 정체성(또는 유사성 또는 상동(homology)); 더 높은 백분율이, 두 서열의 더 높은 유사도를 나타내는 것으로서 빈번하게 측정된다. 주어진 유전자 또는 단백질의 상동체(homologs) 또는 이형체(variants)는 기준 방법을 사용하여 정렬되었을 때 비교적 높은 정도의 서열 정체성을 가질 수 있다.
비교에 대한 서열의 정렬 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 프로그램과 정렬 알고리즘이 하기에 기술되어 있다: Smith 및 Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman 및 Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Pearson 및 Lipman, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 85:2444. 1988; Higgins 및 Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins 및 Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; 및 Pearson 및 Lipman, Proc . Natl. Acad . Sci . U.S.A. 85: 2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119-129, 1994.
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST™)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)은 National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD) 및 인터넷을 포함하는 여러 자료들로부터 서열 분석 프로그램인 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx과 연관된 사용에 대해 이용이 가능하였다.
개체(subject): 살아있는 다수-세포성 척추 생물, 인간 및 비-인간 영장류(primates)와 같은 비-인간 포유류를 모두 포함하는 카테고리.
치료적으로 효과적인 양: 시약으로 치료되고 있는 개체에 원하는 효과를 달성하기 위해 충분한 구체적인 시약의 양. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 개체에서의 면역 반응을 유도하기 위해 및/또는 감염 또는 질병을 예방하기 위해 이용가능 한 인플루엔자 바이러스 백신의 양일 수 있다. 이상적으로, 본 명세서의 맥락에서, 인플루엔자 백신의 치료적으로 효과적인 양은 개체에서 상당한 세포독성 효과를 야기하지 않으면서 개체에서 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 감염에 대해 예방, 개선, 및/또는 치료에 저항성을 증가시키기에 충분한 양이다. 개체에서 감염에 대해 예방, 개선, 및/또는 치료하는 것에 저항성을 증가시키기에 유용한 인플루엔자 백신의 효과적인 양은 치료되고 있는 개체, 치료적 조성물의 투여의 방법 및 다른 요소들에 의존할 것이다.
변형된(transformed): 변형된 세포는 분자 생물학 기술에 의해서 핵산 분자가 세포 안으로 도입된 것이다. 본 명세서에서, 용어 변형은 바이러스 벡터의 형질주입(transfection), 플라스미드 벡터의 변형(transformation), 및 전기천공법(electroporation), 리포펙타민(lipofection), 및 조각 건 가속(particle gun acceleration)에 의한 날것의(naked) DNA의 도입을 포함하는 핵산 분자가 세포로 도입되는 것에 의한 모든 기술을 아우른다.
백신: 감염 질병과 같은 질병의 예방, 개선, 또는 치료를 위해 투여되는, 면역 반응을 자극할 수 있는 면역성 물질의 준비이다. 면역성 물질은, 예를 들면, 약화된 또는 죽은 미생물(약화된 바이러스와 같은), 또는 상기 미생물로부터 유래된 항원성 단백질, 펩타이드 또는 DNA를 포함한다. 백신은 예방적(prophylactic(preventative)) 및 치료적 반응 모두를 유도할 수 있다. 투여의 방법은 백신에 따라 다양하나, 접종, 섭취, 흡입 또는 다른 형태의 투여를 포함할 수 있다. 접종은 정맥의, 피하의 또는 근육내와 같은 비경구를 포함하는 수많은 경로 중의 어느 하나에 의해서 전달될 수 있다. 백신은 면역 반응을 촉진하기 위한 아주번트와 함께 투여될 수 있다.
벡터: 벡터는 숙주 세포에서 복제 및/또는 집적하기 위한 벡터의 능력을 방해하는 것 없이 외부의 핵산의 삽입을 허용하는 핵산 분자이다. 벡터는 복제의 기원(origin of replication)처럼, 숙주 세포에서 복제를 허용하게 하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 삽입성 벡터는 숙주 핵산으로 자기 자신을 삽입할 수 있는 능력이 있다. 벡터는 또한 하나 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자 및 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 삽입된 유전자 또는 유전자들의 전사 및 번역을 허용하는데 필요한 조절 서열을 포함하는 벡터이다. 본 명세서의 어떤 한 실시예에서, 상기 벡터는 pTR600 발현 벡터(미국 특허 출원 번호. 2002/0106798; Ross et al, Nat Immunol. 1(2): 102-103, 2000; Green et al, Vaccine 20: 242-248, 2001)이다.
바이러스-비슷한 조각( VLP ): 바이러스 조각은 하나 이상의 바이러스 구조 단백질로 구성되고, 바이러스 유전체는 결여된 것이다. VLPs가 바이러스 유전체가 결여되어 있기 때문에, 이들은 비-감염성이다. 추가적으로, VLPs는 종종 이형적인 발현에 의해 생산될 수 있고 쉽게 정제될 수 있다. 대부분의 VLPs는 숙주세포로부터의 조각의 해리 및 출아(budding)를 전개하는 최소 하나의 바이럴 핵심 단백질(viral core protein)을 포함한다. 상기 핵심 단백질의 하나의 예는 인플루엔자 M1이다. 본 명세서의 어떤 한 실시예에서, 인플루엔자 VLP는 HA, NA 및/또는 M1 단백질을 포함한다. 인플루엔자 VLPs는 HA 및 NA 단백질, 및 선택적으로 M1 단백질을 암호화하는 플라스미드를 숙주 세포에 형질주입하여 생산될 수 있다. 단백질 발현을 위해 허용가능 한 적당한 시간 동안(대락 72시간 동안과 같은) 형질주입된 세포를 배양한 후에, VLPs는 세포 배양 상층액으로부터 분리될 수 있다. 실험예 2는 세포 상층액으로부터 인플루엔자 VLPs를 정제하기 위한 예시적 프로토콜(protocol)을 제공한다. 상기 실험예에서, VLPs는 낮은 속도의 원심분리(세포 잔여물을 제거하기 위해), 진공 여과(vacuum filtration) 및 20% 글리세롤(glycerol)을 통한 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 분리되었다. 인플루엔자 VLPs를 생산하는 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들면, 미국 특허 출원 번호. 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769; 및 2010/0239610을 보라).
다른 설명을 하지 않는다면, 본 명세서에 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서가 속하는 당업계에 보편적인 기술에 의해 일반적으로 인식되는 것과 같은 의미를 갖는다. 단수 용어인 "단수어(a)", "단수어(an)", 및 "상기(the)"는 문맥에서 다른 것을 명확하게 표시하지 않는다면 복수 형태의 참조를 포함한다. 비슷하게, 단어 "또는"은 문맥에서 다른 것을 명확하게 표시하지 않는다면 "및"을 포함하는 의도이다. 그러므로 "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B 또는 A 및 B를 포함하는 의미이다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진, 염기(base) 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자의 중량 또는 분자의 양적 값은 대략적이고, 설명을 위해 제공된다는 것을 추가적으로 이해하여야 한다. 방법 및 재료가 본 명세서의 연습 또는 시험에 기술된 것과 비슷하거나 동등하더라도, 적합한 방법 및 재료를 하기에 기술하였다. 본 명세서에 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조들은 그들 전체의 참조에 의해 포함되었다. 용어의 설명을 포함하는 본 명세서에서, 논란의 경우에는 조절할 것이다. 추가적으로, 재료, 방법 및 실험예는 오직 설명적인 것이며 한정하려는 의도가 아니다.
III. 여러가지 실시예의 개요
본 명세서는 H1N1 인플루엔자에 대한 넓은 반응성 면역 반응을 유도하기 위한 최적화된 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드의 생성에 관한 것이다. 상기 최적화된 HA 폴리펩타이드는 HA 단백질 정렬의 단계, 및 그 후의 1918-2012로부터 분리되어 선별된 H1N1 바이러스에 기초한, 일치된 서열의 생성을 통해서 개발되었다. 7개의 HA 서열을 생성하는 데 사용된 방법은 실험예 1 및 도 1 내지 7에 나타내었다. 상기 7개의 최적화된 HA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 본 명세서의 서열번호 1 내지 7로 명시하였다. 추가적으로, 서열번호 1 내지 7의 아미노산 일치된 서열은 본 명세서의 서열번호 8로서 제공하였다.
본 명세서에 제공된 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 H1N1 인플루엔자에 대항하여 넓은 반응성 면역 반응을 유도하기 위한 최적화된 아미노산 서열을 갖고있다. 어떤 한 실시예에서, 상기 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 대해 최소 96%, 최소 96.5%, 최소 97%, 최소 97.5%, 최소 98%, 최소 98.5%, 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8에 대비하여 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하 또는 10개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시예에서, 제공된 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1에 대해 최소 96%, 최소 96.5%, 최소 97%, 최소 97.5%, 최소 98%, 최소 98.5%, 최소 99% 또는 최소 99.5% 동일성; 서열번호 2에 대해 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 3에 대해 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 4에 대해 최소 99%, 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 5에 대해 최소 98.4%, 최소 98.6%, 최소 98.8%, 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 6에 대하여 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 7에 대해 최소 97%, 최소 97.5%, 최소 98%, 최소 98.5%, 최소 99% 또는 99.5%의 동일성을 갖거나; 또는 서열번호 8을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
또 다른 특정 실시예에서, 상기 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1의 2-566 잔기에 대해 최소 96%, 최소 96.5%, 최소 97%, 최소 97.5%, 최소 98%, 최소 98.5%, 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 2의 2-566 잔기에 대해 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 3의 2-566 잔기에 대해 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 4의 2-566 잔기에 대해 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 5의 2-566 잔기에 대해 최소 98.4%, 최소 98.6%, 최소 98.8%, 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 6의 2-565 잔기에 대해 최소 99% 또는 최소 99.5%의 동일성; 서열번호 7의 2-566 잔기에 대해 최소 97%, 최소 97.5%, 최소 98%, 최소 98.5%, 최소 99% 또는 99.5%의 동일성을 갖거나; 또는 서열번호 8의 2-566 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 HA 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1과 비교하여 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들); (ii) 서열번호 2와 비교하여 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들); (iii) 서열번호 3과 비교하여 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들); (iv) 서열번호 4와 비교하여 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들); (v) 서열번호 5와 비교하여 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들); (vi) 서열번호 6과 비교하여 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들); (vii) 서열번호 7과 비교하여 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 치환체(들)를 포함한다.
어떤 한 실시예에서, 상기 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1의 2-566 잔기, 서열번호 2의 2-566 잔기, 서열번호 3의 2-566 잔기, 서열번호 4의 2-566 잔기, 서열번호 5의 2-566 잔기, 서열번호 6의 2-565 잔기, 서열번호 7의 2-566 잔기 또는 서열번호 8의 2-566 잔기의 아미노산 서열을 포함하거나 구성한다.
다른 실시예에서, 상기 재조합 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나 구성한다.
추가적으로 본 명세서에 개시된 재조합 HA 폴리펩타드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 액산 분자는 포유류 세포에서 발현에 대해 코돈-최적화된 것이다. 상기 핵산 분자는 선택적으로 RNA 안정성에 대해 더 최적화 될 수 있다.
또한, 본 명세서는 재조합 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 포유류 발현 벡터와 같은, HA 폴리펩타이드의 발현에 대해 어느 적합한 벡터가 될 수 있다. 특정 실험예에서, 상기 벡터는 pRT6000 발현 벡터(미국 특허 츨원 등록 번호. 2002-0106798, 본 명세서에 참조로서 포함되어있는; Ross et al, Nat Immunol . 1(2): 102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20: 242-248, 2001)이다.
어떤 한 실험예에서, 상기 벡터는 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 작용가능하게 결합된 프로모터를 포함한다. 특정 실험예에서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터이다.
또한 상기 벡터를 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 어떤 경우에, 상기 세포는 포유류 세포와 같은, VLPs의 생산 및 발현에 대하여 어느 적합한 세포의 종류이다.
추가적으로 본 명세서에 개시된 최적화된 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 VLPs를 제공한다. 상기 인플루엔자 VLPs는 바이러스 조각을 형성하기 위해 필요한 어떠한 추가적인 인플루엔자 단백질을 더 포함할 수 있다. 어떤 한 실시예에서, 상기 인플루엔자 VLPs는 추가적으로 인플루엔자 뉴라미다제(NA) 단백질, 인플루엔자 매트릭스(M1) 단백질, 또는 두 개 모두를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 HA, M1 및 NA 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 조건 하에서, HA 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터, 인플루엔자 NA 단백질을 암호화하는 벡터 및 인플루엔자 M1 단백질을 암호화하는 벡터를 숙주 세포에 형질 주입하는 것으로 생성되는, 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 VLPs를 제공한다.
본 발명은 최적화된 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 추가적으로 제공한다.
또한 본 발명은 최적화된 HA 단백질을 포함하는 조성물 또는 최적화된 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 융합 단백질 또는 VLP를 제공한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 아주번트를 추가적으로 포함한다. 예를 들면, 상기 아주번트는 백반(alum), Freund's 완벽한 아주번트, 생물학적 아주번트 또는 면역자극성의 올리고뉴클레오티드(CpG 올리고뉴클레오티드와 같은) 일 수 있다.
추가적으로 본 명세서에 개시된 최적화된 인플루엔자 HA 단백질, 최적화된 인플루엔자 HA를 포함하는 융합 단백질, 최적화된 인플루엔자 HA를 포함하는 VLPs, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의한 개체에서 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 어떤 한 실시예에서, 상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1 인플루엔자 바이러스이다. 어떤 한 실시예에서, 상기 HA 단백질, HA 융합 단백질 또는 VLP는 예를 들면, 근육내 같은, 투여의 어떠한 적합한 경로를 이용하여 투여될 수 있다. 어떤 한 실시예에서, 상기 HA 단백질, 융합 단백질 또는 VLP는 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 아주번트를 추가적으로 포함하는 조성물로서 투여된다. 예를 들면, 상기 아주번트는 백반(alum), Freund's 완벽한 아주번트, 생물학적 아주번트 또는 면역자극성의 올리고뉴클레오티드(CpG 올리고뉴클레오티드와 같은) 일 수 있다.
또한 본 명세서에 개시된 최적화된 인플루엔자 HA 단백질을 포함하는 VLPs를 개체에 투여하는 것으로서 인플루엔자 바이러스에 대항하여 개체를 면역화하거나, 또는 상기 조성물을 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 어떤 한 실시예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 아주번트를 추가적으로 포함한다. 예를 들면, 생물학적 아주번트 또는 면역자극성의 올리고뉴클레오티드(CpG 올리고뉴클레오티드와 같은) 일 수 있다. 어떤 한 실시예에서, 상기 VLPs(또는 이의 조성물)는 근육내로 투여된다.
개체에 대해 면역 반응을 유도하거나 면역화시키는 방법의 어떤 한 실시예에서, 개체에 최적화된 HA 단백질을 포함하는 약 1 내지 약 25 ㎍의 VLPs를 투여한다. 특정 실험예에서, 개체에 약 5 내지 20 ㎍의 VLPs, 또는 약 10 내지 15 ㎍의 VLPs를 투여한다. 한 특정 비-한정적인 실험예에서, 개체에 15 ㎍의 VLPs를 투여한다. 반면, 당업계의 한 기술자는 개체에 투여하기 위한 VLPs의 치료적으로 효과적인 양을 측정할 수 있는 능력이 있다(예를 들면 H1N1 인플루엔자 바이러스 감염에 대항하여 보호해줄 수 있는 양).
IV. 최적화된 H1N1 인플루엔자 HA 폴리펩타이드
본 발명은 7개의 서로 다른 최적화된 H1N1 HA 폴리펩타이드 서열을 제공한다. H1N1 HA 아미노산 서열은 NCBI 인플루엔자 바이러스 저장 데이터베이스(NCBI Influenza Virus Resource database)로부터 내려받았다. 1918-2012 기간 동안 분리된 인플루엔자 바이러스로부터 H1N1 HA 단백질은 일치 서열을 생성하기 위해 사용하였다. 실험예 1은 각각의 일치 서열을 생성하기 위해 사용한 방법에 대해 기술하였다(도 1-7 또한 참고).
H1N1 COBRA 방법 X-1 (서열번호 1)
MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGKCNIAGWILGNPECESLLSKRSWSYIVETPNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTKKNGSYPNLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPSNIEDQQSLYQNENAYVSVVSSNYNRRFTPEIAKRPKVRDQEGRMNYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMHECDTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
1918 이후-1947 H1N1 방법 X-2 (서열번호 2)
MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGKCNIAGWILGNPECESLLSKRSWSYIVETPNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPKHNTTRGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTEKDGSYPKLSNSYVNKKGKEVLVLWGVHHPSNIKDQQTLYQKENAYVSVVSSNYNRRFTPEIAERPKVRGQAGRMNYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMHECDTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKNQLRNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
"계절적인" 1978-2008 H1N1 COBRA 방법 X-3 (서열번호 3)
MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECESLFSKESWSYIAETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVTASCSHNGKSSFYRNLLWLTEKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPSNIGDQRAIYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
디글리코실레이티드 ( deglycosylated ) H1N1 COBRA 방법 X-4 (서열번호 4)
MKAKLLVLLCAFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGNCSIAGWILGNPECESLFSKESWSYIVETPNSENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPAHTVTKGVTASCSHNGKSSFYRNLLWLTEKNGSYPALSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPSNIGDQRAIYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
지난 30년간 H1N1 방법 X-5 (서열번호 5)
MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCKLKGIAPLQLGNCSIAGWILGNPECESLFSKESWSYIVETPNSENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVTASCSHNGKSSFYRNLLWLTEKNGSYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPSNIGDQRAIYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
지난 20년간 H1N1 COBRA 방법 X-6 (서열번호 6)
MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCLLKGIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAINSSLPFQNVHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
H1N1 COBRA 방법 A-5 (서열번호 7)
MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGNCSIAGWILGNPECESLLSKKSWSYIVETPNSENGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTEKNGSYPNLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHHPSNIGDQQALYQTENAYVSVVSSHYNRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMHECDTKCQTPQGAINSSLPFQNIHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLEKRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
서열번호 1 내지 7의 일치 서열 (서열번호 8)
MXAXLLVLLCAFXATXADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCXLKGIAPLQLGXCXXAGWILGNPECEXLXSKXSWSYIXETPNXENGTCYPGXFXDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPXHXXTXGVXAXCSHXGKSSFYRNLLWLTXKXGXYPXLSXSYXNXKXKEVLVLWGVHHPXNrXDQXXXYXXENAYVSVVSSXYXRXFTPEIAXRPKVRXQXGRXNYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPXYAFALSRGFGSGIITSNAXMXECDXKCQTPQGAINSSLPFQNXHPVTIGECPKYVRSXKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMXDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNXLEXRMENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKXQLXNNAKEIGNGCFEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
본 명세서에 개시된 어떤 한 실시예에서, 상기 HA 폴리펩타이드는 N-말단 메티오닌(methionine) 잔기가 결여되었다. 그러므로, 어떤 한 실험예에서, 서열번호 1 내지 5 및 8의 어느 하나의 2-566 잔기를 포함하거나, 또는 서열번호 6의 2-565 잔기를 포함하는 HA 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 COBRA 아미노산 서열은 포유류 세포에서 역 번역(reverse translated) 및 발현에 최적화할 수 있는데, 이는 코돈 사용 및 RNA 최적화(GeneArt; Regensburg, 독일)를 포함한다. 상기 최적화된 핵산 서열은 pTR6000 발현 벡터(미국 특허 출원 공개 번호. 2002/0106798; Ross et al, Nat Immunol, 1(2): 102-103, 2000; Green et al, Vaccine 20: 242-248, 2001)과 같은 적당한 발현 벡터로 삽입할 수 있다.
V. 인플루엔자
인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)과에 속하는 분절된 음성적-가닥 RNA 바이러스이다. A, B 및 C의 세 종류의 인플루엔자 바이러스가 존재한다. 인플루엔자 A 바이러스는 인간, 말, 해양 포유류, 돼지, 페럿(ferrets) 닭을 포함하는 다양한 조류 및 포유류를 감염시킨다. 동물에서, 대부분의 인플루엔자 A 바이러스는 순환계 및 장내 관의 가벼운 국소적인 감염을 유발한다. 반면, H5N1과 같은, 높은 병원성 인플루엔자 A 종은 가금류에서 100%에 달하는 치사율을 갖는 전신에 영향을 주는 감염을 야기한다. 인플루엔자 A에 감염된 동물은 종종 인플루엔자 바이러스에 대한 저장고로서 활동하고 특정 아형은 인간에 대한 종(species)간 장벽을 넘어가는 것으로 나타났다.
인플루엔자 A는 바이러스 결합 및 세포성 분리에 필요한 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)와 같은 표면 글리코단백질을 암호화하는 항원성 영역에 있는 두 개의 유전자의 대립형질 이형(allelic variations)에 기초한 아형으로 나눠질 수 있다. 현재, 인플루엔자 A 바이러스에 대해서 HA의 16 가지 아형(H1-H16) 및 9 개의 NA(N1-N9) 항원성 이형이 알려져 있다. 이전에, 인간에서 순환하는 오직 세 개의 아형이 알려져 있었다(H1N1, H1N2 및 H3N2). 반면, 최근 몇 년에는, 조류 인플루엔자 A의 병원성 H5N1 아형이 다수의 환자들을 사망에 이르게 한, 1997년 및 2003년 홍콩에서의 기록으로, 종 간 장벽을 넘고 인간을 감염시킬 수 있다는 것이 보고되었다.
동물에서, 대부분의 인플루엔자 A 바이러스는 순환계 및 장내 관의 가벼운 부위적인 감염을 유발한다. 반면, H5N1과 같은, 높은 병원성 인플루엔자 A 종은 가금류에서 100%에 달하는 치사율을 갖는 전신에 영향을 주는 감염을 야기한다. 2009년, H1N1 인플루엔자는 인간 인플루엔자의 가장 일반적인 원인이었다. 2009년에 돼지-기원의 H1N1의 새로운 종이 발생하였고 세계 보건 기구에 의해서 대유행으로 선언되었다. 상기 종은 "돼지 독감(swine flu)"로 언급된다. H1N1 인플루엔자 A 바이러스는 1918년에 스페인 독감 대유행, 1976년에 Fort Dix 발병(outbreak) 및 1977-1978년에 러시아 독감 대유행에 대한 책임이 있다.
인플루엔자 A 바이러스 유전체는 조절적인 기능과 함께 아홉개의 구조적 단백질 및 한 개의 비구조적(nonstructural; NS1) 단백질을 암호화한다. 상기 인플루엔자 바이러스의 분절된 유전체는 RNA-지시 RNA 폴리머라제 단백질(RNA-directed RNA polymerase proteins)(PB2, PB1 및 PA), 뉴클레오단백질(nucleoprotein)(NP), 뉴라미니다제(NA), 헤마글루티닌(서브유닌 HA1 및 HA2), 매트릭스 단백질(M1 및 M2) 및 비-구조적 단백질(NS1 및 NS2)을 포함하는 적어도 열 개의 폴리펩타이드를 암호화하는 여덟 개의 음성적-방향 RNA(negative-sense RNA; nsRNA) 유전자 분절체(PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA 및 NA)를 포함한다(Krug 등, "The Influenza Viruses," R. M. Krug, ed., Plenum Press, N. Y., 1989, pp.89-152).
광범위한 질병을 유발하는 인플루엔자 바이러스의 능력은 동물 인플루엔자 바이러스 및 인간 인플루엔자 바이러스 모두에 숙주가 동시에 감염되었을 때 발생한다고 여겨지는, 항원적 변화를 겪음으로써 면역 시스템을 회피하는 능력에 기인한다. 숙주 안에서 변형 및 재조합 동안에, 상기 바이러스는 그것의 유전체로 또다른 바이러스로부터 HA 및/또는 NA 표면 단백질 유전자를 포함할 수 있고, 이로써 새로운 인플루엔자 아형을 생산하고 면역 시스템을 회피할 수 있다.
HA는 일반적으로 대략 560 아미노산을 포함하고 총 바이러스 단백질의 25%를 나타내는 바이러스의 표면 글리코단백질이다. 이는 감염의 초기 단계에서 숙주 세포에 대한 바이러스 조각의 접착 및 상기 조각의 숙주세포로의 침투에 책임이 있다. 바이러스 HA0 전구체의 HA1 및 HA2 부-조각(sub-fragments)으로의 절단은 바이러스가 세포를 감염시키기 위해 필요한 단계이다. 그러므로, 절단은 숙주 세포에 있는 새로운 바이러스 조각들을 새로운 세포를 감염시킬 수 있는 비리온(virions)으로 전환 시키기 위해 필요하다. 절단은 감염된 세포의 골지체(endoplasmic reticulum)로부터 필수적인 HA0 맴브레인(membrane) 단백질을 플라즈마 맴브레인(plasma membrane)으로 이동시키는 동안에 발생한다고 알려져 있다. 이동의 과정에서, 헤마글루티닌은 아미노-말단(amino-terminal) 조각 HAI 및 카르복시 말단(carboxy terminal) HA2로의 전구체 HA의 단백질 가수분해의(proteolytic) 절단을 포함하는 동시-(co-) 및 후의-(post-) 번역적(translational) 변형 일련의 과정을 겪는다. 일차조직(primary tissue) 배양 또는 구축된 세포 주(established cell line)에서 인플루엔자 계통을 배양함에 있어 주된 문제점 중의 하나는 숙주세포에서 인플루엔자 헤마글루티닌의 단백질 가수분해성 절단의 활성화에 대한 필요로부터 발생한다.
비록 비절단된 HA가 세포 표면에 있는 그것의 뉴라미딕산을 포함하는 수용체에 바이러스를 부착하는 것을 중개할 수 있다는 것이 알려져 있지만, 감염 경로(infectious cycle)에서 그 다음의 단계, 융합에서는 불가능하다. 절단에 의한 HA2의 소수성 아미노 말단의 노출이 필요하다고 보고된 바 있으며 이로 인해 표적 세포로 삽입될 수 있으며, 이를 통해 바이러스와 표적 세포 맴브레인 사이에 가교를 형성할 수 있다. 상기 과정은 두 개의 맴브레인의 융합 및 표적 세포로의 바이러스의 침투로 이어진다.
HA의 단백질 가수분해적 활성화는 칼슘 의존적이고 중립적인 pH 최적도(neutral pH optimum)를 가지고 있는 보통 세포 내부의 효소인 트립신-비슷한 엔도프로테아제(trypsine-like endoprotease)에 의한 아르기닌(arginine) 잔기에서의 절단을 포함한다. 활성화하는 프로테아제가 세포성 효소이기 때문에, 감염된 세포의 종류가 HA가 절단되어 있는지의 여부를 결정한다. 포유류 인플루엔자 바이러스 및 비병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA는 오직 제한된 숫자의 세포 종류에서만 단백질 가수분해성 절단에 민감하다. 반면, H5 및 H7 아형 중 병원성 조류 바이러스의 HA는 다른 숙주 세포의 넓은 범위에 존재하는 프로테아제에 의해 절단된다. 그러므로, 바이러스의 병원성 성질과 일치하는 헤마글루티닌 절단성(cleavability)에서의 차이로부터 기인하는 숙주 범위에서의 차이가 존재한다.
뉴라미니다제(NA)는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 맴브레인 글리코단백질이다. 바이러스 NA의 존재는 감염 바이러스를 대항하는 다면적인(multi-faceted) 예방적 면역 반응을 생성하기 위해 중요한 것으로 나타났다. 대부분의 인플루엔자 A 바이러스에 대하여, NA는 413 아미노산 길이이고, 1413 뉴클레오티드의 유전자에 의해 암호화되어있다. 인플루엔자 바이러스에서 아홉 개의 다른 NA 아형(N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9)이 알려져 있고, 상기 아형들이 야생 조류에서 발견되었다. NA는 감염된 세포의 표면에서 카보하이드레이트(carbohydrate) 모이어티로부터 말단 뉴라미닉산(neuraminic acid)(또한 시알릭산(sialic acid)이라고 불리는)의 절단에 의한 바이러스 HA에 대한 세포성 수용체의 구축에 관여한다. NA는 또한 바이러스의 응집을 막으면서 바이러스 단백질로부터 시알릭산 잔기를 절단한다. 상기 메커니즘(mechanism)을 사용하여, NA가 세포 맴브레인을 따라서 축적하는 새롭게 형성되는 바이러스 조각을 억제하는 것과 마찬가지로 점막(mucosal) 표면에 존재하는 점액을 통한 바이러스의 이동을 촉진한다는 것으로서 바이러스의 자손(viral progeny)의 분리를 촉진한다는 것을 가정할 수 있다. NA는 항원성 이형의 대상이 되는 중요한 항원성 결정원이다.
표면 단백질 HA 및 NA에 추가적으로, 인플루엔자 바이러스는 폴리머라제 유전자 PB1, PB2 및 PA, 매트릭스 단백질 M1 및 M2, 뉴클레오단백질(NP) 및 비-구조적 단백질 NS1 및 NS2를 포함하는 여덟 개의 다른 단백질이 될 수 있는 6개의 추가적인 내부적 유전자를 포함한다(Horimoto 등., Clin Microbiol Rev. 14(1):129-149, 2001).
자손 비리온(progeny virions)으로 구성되기 위하여, 바이러스성 RNA는 세 개의 인플루엔자 바이러스 폴리머라제 단백질인, 뉴클레오단백질(NP), 및 인플루엔자 바이러스 매트릭스 1(M1) 단백질 및 핵 배출 단백질(nuclear export protein)과 연관된 바이러스성 RNA로 구성된 리보뉴클레오단백질(riboneucleoprotein; RNP) 복합체로서 핵으로부터 이동된다(Marsh 등., J Virol, 82:2295-2304, 2008). 세포 껍질 내에 존재하는 M1 단백질은 조립 및 출아의 기능을 한다고 여겨진다. M2 단백질의 제한된 개수는 비리온으로 포함된다(Zebedee, J. Virol. 62:2762-2772, 1988). 그들은 H+ 이온 채널 활성을 갖는 4량체(tetramer)를 형성하고, 엔도좀의 낮은 pH에 의해 활성화 되었을 때, 비리온 내부를 산성화하여, 바이러스 침입(virus uncoating)을 억제한다(Pinto et al., Cell 69:517-528, 1992). 아만타딘(amantadine)은 M2 이온 채널 활성을 방해하여 바이러스 침입을 억제함으로써 바이러스의 감염을 막는 항-인플루엔자 약물이다.
NS1, 비구조적 단백질은 접합(splicing)의 조절 및 세포성 mRNAs의 핵 배출뿐만 아니라 번역의 자극을 포함하는 다양한 기능을 갖는다. NS1의 주요 기능은 인터페론-비감지성(interferon-nondefective) 세포에서 모체 바이러스보다 낮은 효율로 자람에도 불구하고 NS1 넉아웃(knockout) 바이러스가 생균성(viable)이 있기 때문에, 숙주의 인터페론 활성에 대응하는 것으로 여겨진다(Garcia-Sastre, Virology 252:324-330, 1998).
NS2는 바이러스 조각에서 감지되었다(Richardson 등., Arch. Virol. 116:69-80, 1991; Yasuda 등., Virology 196:249-255, 1993). 바이러스 조각에서 NS2 단백질의 평균 개수는 130-200 분자로 추정된다. 시험관 내(in vitro) 결합 분석(binding assay)은 M1 및 NS2 사이의 직접적인 단백질-단백질 접촉을 보여준다. NS2-M1 복합체는 바이러스-감염된 세포의 용해물(lysates)에서 면역침강법(immunoprecipitation)에의해 감지되었다. NS2 단백질은 M1 단백질과의 작용을 통해 핵으로부터 RNP의 배출에 역할을 한다고 여겨진다(Ward 등., Arch. Virol. 140:2067-2073, 1995).
VI. 인플루엔자 VLPs 및 이의 투여
본 발명은 최적화된 HA(서열번호 1-8의 어떤 하나로 제시하는 아미노산 서열을 갖는 HA와 같은) 인플루엔자 VLPs를 제공한다. 상기 인플루엔자 VLPs는 일반적으로 HA, NA 및 M1 단백질로 구성된다. 인플루엔자 VLPs의 생산은 당업계에 개시되어 있고 당업계에서 평범한 기술의 하나의 능력에 속해 있다. 예를 들면, 인플루엔자 VLPs는 HA, NA 및 M1 단백질을 암호화하는 플라스미드를 숙주세포에 형질주입하여 생산할 수 있다. 단백질 발현을 위해 허용가능 한 적당한 시간 동안(대락 72시간 동안과 같은) 형질주입된 세포를 배양한 후에, VLPs는 세포 배양 상층액으로부터 분리될 수 있다. 실험예 2는 세포 상층액으로부터 인플루엔자 VLPs를 정제하기 위한 예시적 프로토콜을 제공한다. 상기 실험예에서, VLPs는 낮은 속도의 원심분리(세포 잔여물을 제거하기 위해), 진공 여과(vacuum filtration) 및 20% 글리세롤(glycerol)을 통한 초원심분리(ultracentrifugation)에 의해 분리되었다.
본 명세서에 개시된 인플루엔자 VLPs는 H1N1 인플루엔자 바이러스에 대항하는 예방적인 면역 반응을 유도하기 위한 인플루엔자 백신으로서 사용되었다.
인플루엔자 VLPs, 또는 이의 조성물은, 개체로 재조합 바이러스를 도입하기위한 일반적인 경로의 하나에 의해 개체에 투여될 수 있다. 투여의 방법은 피내(intradermal), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 비경구(parenteral), 정맥내(intravenous), 피하(subcutaneous), 질의(vaginal), 직장내(rectal), 비강내의(intranasal), 흡입(inhalation) 또는 경구(oral)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피하, 정맥 또는 근육내의 투여와 같은 비경구 투여는, 일반적으로 주사(injection)에 의해 이뤄진다. 주사제(injectables)는 액체 용액 또는 유제(emulsion)와 같은 평범한 형태, 용액 또는 주사에 앞서 액체 내 부유액으로 적합한 고체 형태, 또는 유제로써 분비될 수 있다. 주사 용액 및 부유액은 이전에 기술한 멸균 파우더, 과립(granules), 및 알약 종류로부터 준비될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소적일 수 있다.
인플루엔자 VLPs, 또는 이의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께인 것과 같은 어떤 적당한 방법으로 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 투여하는 특정 조성물뿐만 아니라 상기 조성물의 투여에 사용되는 특정 방법에 의해서 결정된다. 따라서, 본 명세서의 약학적 조성물의 적당한 형태는 매우 다양하다.
비경구 투여의 준비는 멸균 수용액 또는 비-수용성 용액, 부유액, 및 유액을 포함한다. 비-수용성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에딜렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레이트(ethyl oleate)와 같은 주사가능한 유기성 이스터(esters)이다. 수용성 담체는 물, 알콜(alcoholic)/수용성 용액, 유제 또는 살린 및 완충된 배지(buffered media)를 포함하는 부유액을 포함한다. 비경구 전파체는 소듐 클로라이드 용액, 링커의 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화된 링거(lactated Ringer's), 또는 고정된 기름을 포함한다. 정맥내의 전파체는 유체(fluid) 및 영양 보충물(nutrient replenishers), 전해질 보충물(eletrolyte replenishers)(링거의 덱스트로스에 기초한 것들과 같은), 및 이와 비슷한 것들을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제들은 예를 들면, 항균제(antimicrobials), 항산화제(anti-oxidants), 킬레이트 시약(chelating agents), 및 불활성 기체(inert gases) 및 이와 비슷한 것들로 존재할 수 있다.
상기 조성물의 일부는 하이드로클로릭 산(hydrochloric acid), 하이드로브로믹산(hydrobromic acid), 퍼클로릭산(perchloric acid), 니트릭산(nitric acid), 싸이오시아닉산(thiocyanic acid), 설퓨릭산(sulfuric acid), 및 포스포릭 산(phosphoric acid), 및 포름산(formic acid), 아세트산(acetic acid), 프로피오닉산(propionic acid), 글리콜릭산(glycolic acid), 락틱산(lactic acid), 피루빅산(pyruvic adic), 옥살릭산(oxalic acid), 말로닉산(malonic acid), 숙신산(succine acid), 말레익산(maleic adic), 및 퓨마릭산(fumaric acid)와 같은 무기성산과의 반응에 의해 형성되거나 소듐 하이드록시드(sodium hydroxide), 암모늄 하이드록시드(ammonium hydroxide), 포타슘 하이드록시드(potassium hydroxide), 및 모노-(mono-), 디-(di-), 트리알킬(trialkyl) 및 아릴 아민(aryl amines) 및 치환된 에탄올아민(ethanolamines)와 같은 유기성 염기와 반응하여 형성된 약학적으로 허용가능한 산- 또는 염기-추가 염으로서 잠재적으로 투여될 수 있다.
투여는 단일 또는 다수의 도스(dose)에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서의 문맥에서 개체에 투여되는 도스는 오랜 시간 개체에서 이로운 치료적 반응을 유도하거나, H1N1 인플루엔자 바이러스 감염을 억제 또는 예방할 수 있어야 한다. 필요한 도스는 종, 연령, 체중 및 치료하는 감염의 중증도, 사용되는 특정 조성물 및 이의 투여 방법과 같은 개체의 일반적인 조건에 따라 개체마다 다양할 것이다. 적당한 도스는 오직 규칙적인 실험(routine experimentation)을 사용하는 당업계의 일반적인 기술의 하나에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 인플루엔자 VLPs 단독 또는 약학적으로 허용가능한 담체와의 조합으로서의 치료적으로 효과적인 양을 제공한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 살린, 완충된 살린(buffered saline), 덱스트로스, 증류수, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 담체 및 조성물은 멸균, 및 투여의 방법에 적당한 형태일 수 있다. 상기 조성물은 또한 습윤 또는 유화제(emulsifying agents)의 소량, 또는 pH 완충제(pH buffering agents)를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체 용액, 부유액, 알약(tablet), 정제(pill), 캡슐(capsule), 정지된 배출 제제(sustained release formulation), 또는 파우더일 수 있다. 상기 조성물은 트리글리세라이드(triglycerides)와 같은 전통적인 결합제(binders) 및 담체와 함께 좌약(suppository)으로써 제조될 수 있다. 경구 제제는 약학적인 등급의 매니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 녹말(starch), 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소듐 사카린(sodium saccharine), 셀룰로스(cellulose), 및 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate)과 같은 표준 담체를 포함한다. 멸균 살린 용액 또는 참깨 기름과 같은 일반적 약학적 담체의 어떠한 것이 사용될 수 있다. 본 발명이 제공하는 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있는 다른 배지는 일반적인 살린 및 참깨 기름이다.
본 명세서에 기술된 상기 인플루엔자 VLPs는 단독 또는 항원성을 증가시키기 위한 다른 치료적 시약과 혼합하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 VLPs는 Freund 분완전 아주번트 또는 Freund's 완전 아주번트와 같은 아주번트와 함께 투여될 수 있다.
선택적으로, IL-2, IL-6, IL-12, RNATES, GM-CSF, TNF-α, 또는 IFN-γ와 같은 하나 또는 그 이상의 사이토카인(cytokines), GM-CSF 또는 G-CSP와 같은 하나 또는 그 이상의 성장 인자; OX-40L 또는 41 BBL과 같은 하나 또는 그 이상의 분자, 또는 이러한 분자들의 조합체들이 생물학적 아주번트로서 사용될 수 있다(예를 들면, Salgaller 등., 1998, J. Surg . Oncol . 68(2):122-38; Lotze 등., 2000, Cancer J. Sci . Am. 6(Suppl 1):S61-6; Cao 등., 1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper 등., 2000, Adv . Exp . Med . Biol. 465:381-90을 보라). 이러한 분자들은 숙주에 전신으로(systemically)(또는 국소적으로) 투여될 수 있다.
시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 모두에서, 세포성 반응을 포함에 대한 여러 의미가 알려져 있다. 지질(lipids)은 다양한 항원에 대항하는 생체 내의 CTL을 표지하는 것을 도울 수 있는 시약으로써 확인되었다. 예를 들면, 미국 특어 번호. 5,662,907에 기술된 것처럼, 팔미틱산(palmitic acid)는 리신(lysine) 잔기의 알파 및 입실론(epsilon) 아미노 그룹에 부착될 수 있고 면역성 펩타이드로 결합(예를 들면, 글리신(glycine), 글리신-글리신, 세린(serine), 세린-세린, 또는 이와 비슷한 것의 하나 또는 그 이상의 결합 잔기들을 통해)될 수 있다. 상기 지질화된(lipidated) 펩타이드는 교질 입자의(micellar) 형태, 리포솜(liposome)에 포함되더나 아주번트에 유화된 것으로 직접적으로 주입될 수 있다. 또 다른 예로서, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테인리세릴-세린(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)과 같은 E. coli 지단백질(lipoproteins)은 적당한 펩타이드로 공유결합으로 부착될 때 종양 특이적 CTL을 표지하는데 사용된다(Deres 등., Nature 342:561, 1989를 보라). 더 나아가, 중화(neutralizing)의 유도로서 항체는 적당한 에피토프(epitope)를 나타내는 펩타이드에 결합된 같은 분자와 함께 표지될 수 있고, 두 개의 조성물은 필요하다고 여겨지는 체액(humoral) 및 세포-중개된 반응 모두를 유도하기 위해 결합 될 수 있다.
본 명세서에 최적화된 HA 단백질을 포함하는 VLPs의 투여가 예시되었지만, 당업계의 기술의 하나는 개체에서 면역 반응을 유도하기 위해 최적화된 인플루엔자 HA 단백질 그 자체(바이러스 조각이 존재하지 않을 때) 또는 융합 단백질로서 투여하는 것 또한 가능하다는 것을 인식할 수 있을 것이다.
하기의 실험예는 어떤 특정한 특징 및/또는 실시예를 설명하기 위해 제공하였다. 상기 실험예는 기술된 특징 또는 실시예에 대한 밝혀진 내용을 한정하는 것으로 해석할 수 없다.
실험예
실험예 1: H1N1 인플루엔자에 대한 COBRA 서열의 생성
인플루엔자 A H1N1 HA 아미노산 서열은 NCBI 인플루엔자 바이러스 자료 데이터베이스로부터 내려받았다. 1918-2012로부터의 H1N1 HA 단백질의 분리물은 일치 서열을 생성하는 데 사용하였다. 7개의 서로 다른 일치 서열(서열번호 1-7)가 하기의 방법으로 생성되었다:
1. COBRA 방법 X-1 (1918-2012)
서열은 분리의 날짜에 의해 준비하였고 9개의 주요 일치 서열은 1918-1934(8), 1935-1947(13), 1948-1957(12), 1977-1983(69), 1984-1991(19), 1992-1999(59), 2000-2006(339), 2007-2008(722) 및 2009-2012(207)로부터의 분리물을 사용하여 생성하였다. 1948-1991로부터 분리된 바이러스의 두 번째 층(layer) 일치 서열은 1948-1957, 1977-1983 및 1984-1991 그룹으로부터의 세 개의 주요 일치 층을 사용하여 생성하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 최종 일치 서열(세 번째 층; 서열번호 1)은 여섯 개의 주요 층 일치 서열(1918-1934, 1935-1947, 1992-1999, 2000-2006, 2007-2008 및 2009-2012) 및 두 번째 층 일치 서열(1948-1991)의 정렬에 의해서 생성하였다.
2. COBRA 방법 X-2(1933-1947)
서열은 세 개의 주요 일치 서열을 생성하기 위해 분리의 날짜에 의해 준비하였다: 1933-1936(11), 1940-1946(8) 및 1947(1). 최종 일치 서열(서열번호 2)는 도 2에 나타난 대로, 세 개의 주요 일치 서열의 정렬에 의해 생성하였다.
3. COBRA 방법 X-3(1978-2008)
서열은 분리의 날짜 및 1978-1983(65), 1984-1991(19), 1992-1999(59), 2000-2006(339) 및 2007-2008(722)로부터의 분리물을 사용하여 생성된 다섯 개의 주요 일치 서열에 의해 준비하였다. 1978-1991로부터 분리된 바이러스의 두 번째 층 일치 서열은 1978-1983 및 1984-1991 그룹으로부터 두 개의 주요 일치 층을 사용하여 생성하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 최종 일치 서열(서열번호 3)은 세 개의 주요 층 일치 서열(1992-1999, 2000-2006 및 2007-2008) 및 두 번째 층 일치 서열(1978-1991)의 정렬에 의해 생성하였다.
4. COBRA 방법 X-4(1918-2005)
서열은 분리의 날짜 및 1918-1934(8), 1935-1947(13), 1948-1957(12), 1977-1983(68), 1984-1986(9), 1987-1991(12), 1992-1999(59) 및 2000-2005(263)으로부터의 분리물을 사용하여 생성된 여덟 개의 주요 일치 서열에 으해 준비하였다. 두 개의 두 번째 층 일치 서열(1918-1957 및 1978-1991)이 생성되었다. 1918-1957 두 번째의 일치 서열은 1918-1934, 1935-1947 및 1948-1957 그룹으로부터 세 개의 주요 일치 층을 사용하여 생성되었다. 1978-1991 두 번째 일치 서열은 1977-1983, 1984-1986 및 1987-1991 그룹으로부터 세 개의 주요 일치 층을 사용하여 생성되었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 최종 일치 서열(서열번호 4)는 두 개의 주요 층 일치 서열(1992-1999 및 2000-2005) 및 두 개의 두 번째 층 일치 서열(1918-1957 및 1978-1991)의 정렬에 의해 생성되었다. 상기 서열은 142 및 177 위치에 디-글리코실화(de-glycosylated) 되어있다.
5. COBRA 방법 X-5(1982-2012)
서열은 분리의 날짜 및 1982-1983(4), 1984-1986(9), 1987-1991(12), 1992-1999(27), 2000-2006(339), 2007-2008(722) 및 2009-2012(207)로부터의 분리물을 사용하여 생성된 일곱 개의 주요 일치 서열에 의해 준비하였다. 하나의 두 번째 층 일치 서열(1982-1986)은 1982-1983 및 1984-1986 그룹으로부터 두 개의 주요 일치 층을 사용하여 생성하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 최종 일치 서열(서열번호 5)는 다섯 개의 주요 층 일치 서열(1987-1991, 1992-1999, 2000-2006, 2007-2008 및 2009-2012) 및 두 번째 층 일치 서열(1982-1986)의 정렬에 의해 생성하였다.
6. COBRA 방법 X-6(1999-2012)
서열은 네 개의 주요 일치 서열을 생성하기 위해 분리의 날짜에 의해 준비하였다: 1999(5), 2000-2006(339), 2007-2008(722) 및 2009-2012(207). 최종 일치 서열(서열번호 6)은 도 6에 나타난 바처럼, 네 개의 주요 일치 서열에 의해 생성하였다.
7. COBRA 방법 A-5(1918-2008)
서열은 분리의 날짜 및 1918(1), 1976(4), 2009-2011(123), 1933-1934(8), 1935-1947(13), 1948-1957(12), 1977-1983(68), 1984-1986(9), 1987-1991(12), 1992-1999(27), 2000-2005(59) 및 2006-2008(798)로부터의 분리물을 사용하여 생성된 12개의 주요 일치 서열에 의해 준비하였다. 네 개의 두 번째 일치 서열은 도 7에 나타난 바처럼, "돼지(swine)" 서열에 따른 주요 일치 서열 또는 날짜(1933-1957, 1977-2005 및 2006-2008)에 의해 그룹화하여 생성하였다. 최종 일치 서열(세 번째 층 일치; 서열번호 7)은 네 개의 두 번째 일치 서열의 정렬에 의해 생성하였다.
두 개의 방법 중 어떤 것에 따라 생성된 COBRA 아미노산 서열은 역 번역화(reverse translated) 및 코돈 사용 및 RNA 최적화(GeneArt; Regensburg, 독일)를 포함하는 포유류 세포에서 발현에 대한 최적화 될 수 있다. 상기 최적화된 핵산 서열은 pTR 600 발현 벡터(미국 특허 출원 공개 번호. 2002/0106798; Ross 등., Nat Immunol . 1(2):102-103, 2000; Green 등., Vaccine 20:242-248, 2001), 또는 발현을 위한 어떠한 다른 적합한 벡터로 삽입될 수 있다.
실험예 2: 인플루엔자 VLPs 로의 면역화 및 이의 준비
하기 방법은 최적화된 HA를 포함하는 인플루엔자 VLPs를 생성하고 특징을 짓기위해 사용될 수 있다. 마우스, 퍼렛(ferrets) 및 원숭이(macaques)의 면역화를 위한 예시적 방법 또한 하기에 기술하였다(Giles 및 Ross, Vaccine 29(16):3043-3054, 2011 또한 보라).
백신 준비
293T 세포는 M1, NA 및 최적화된 HA를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 형질주입되었고, 37℃ 72시간 동안 배양하였다. M1, NA 및 HA 암호화 서열은 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통한 진공 여과 후에 낮은 속도 원심분리에 의해서 상층액은 수거하였고 세포 잔여물은 제거하였다. VLPs는 4℃에서 4시간 동안 초원심분리(체중당 부피의 20% 글리세롤을 통한 100,000 × g)로 정제하였다. 상기 침전물은 그 뒤에 pH 7.2의 PBS에 재부유하였고 단독 사용 부분표본(aliquots)으로 다음 사용 시까지 -80℃에 보관하였다. 총 단백질 농도는 Micro BCA™Protein Assay Reagent Kit(Pierce Biotechnology, Fockford, IL, 미국)으로 결정되었다.
도스 결정
HA 특정 함량(content)은 웨스턴 블롯(western blot) 및 농도계(densitometry)에 의해 결정할 수 있다. 정제된 재조합 COBRA HA 및 정제된 VLPs는 기준 총 단백질 양으로 준비되었고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동되고(electrophoresed) PVDF 맴브레인으로 이동되었다. 상기 블롯은 인플루엔자 감염된 마우스로부터 마우스 다클론성의 항혈청으로 검출되었고 상기 HA-항체 복합체는 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase; HRP)(Southern Biotech; Birmingham, AL, 미국)에 결합한 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 검출하였다. HRP는 화학발광성(chemiluminescent) 물질(Pierce Biotechnology; Rockford IL, 미국)에 의해 검출되었고 X-ray 필름(ThermoFisher; Pittsburgh, PA, 미국)에 노출되었다. 밴드의 밀도(density)는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 이용하여 결정하였다. 재조합 HA 밴드의 밀도는 표준 곡선(standard curve)을 계산하기 위해 사용하였고 정제된 VLPs의 밀도는 재조합 HA로부터의 결과를 사용하여 삽입되었다.
마우스 시험
BALB/c 마우스(Mus musculis, 여성, 608 주령)는 Harlan Sprague Dawley(Indianapolis, IN, 미국)으로부터 구입할 수 있다. 마우스는 소형격리체(microisolator) 유닛에서 음식 및 물에 자유롭게 접근하도록 허용하며 사육하였고 실험실 동물에 대한 USDA 지침(guidelines)을 따라 돌보았다. 마우스는 농도계 분석으로부터의 HA 함량에 기초한 정제된 COBRA HA VLPs의 세 개의 도스(1.5 ㎍, 0.3 ㎍ 또는 0.06 ㎍) 중 하나로 0 주에 근육내 주사를 통해 백신화하였고, 3 주에 같은 도스로 촉진(boost)되었다. 각 도스의 백신은 백반 아주번트(Imject Alum, Pierce Biotechnology; Rockford, IL, 미국), CpG 올리코뉴클레오티드, 또는 전파체 단독으로 제제화되었다. 각 백신화 후 14 내지 21일 후에, 혈액은 역-궤도 신경층(retro-orbital plexus)을 통해 마우스를 마취시키는 것으로 수집하였고 마이크로퓨즈(microfuse) 튜브로 이동하였다. 튜브는 원심분리되었고 혈청(sera)은 제거되었으며 -80±5℃에서 동결하였다. 각 백신 그룹에 대한 헤마글루티네이션 억제(hemagglutination inhibition; HAI) 혈청 항체 역가(titer)는 대표적인 재조합체(reassortant) 바이러스 또는 COBRA HA VLPs를 사용하여 5 주에 결정되었다.
최종 백신화 후 3 주 이후에, 마우스는 50 ㎕ 양의 고 병원성 H1N1 바이러스와 함께 비강내로 시험되었다. 감염 이후에, 마우스는 감염 후 14일 동안 체중 감소, 질병 징후, 죽음에 대해서 매일 추적감찰하였다. 각각의 신체 질량, 질병 점수(sickness scores)(Toapanta 및 Ross, Respiratiory Research 10(1):112, 2009) 및 죽음은 접종 이수에 각 날에 각 그룹에 대해서 기록되었다.
퍼렛 시험
핏치 퍼렛(fitch ferrets)(Mustela putorius furo, 여성, 6-12달의 연령)은, 인플루엔자 나이브(naive) 및 향-제거된(de-scented), Marshall Farms(Sayre, PA, 미국)으로부터 구입하였다. 퍼렛은 Sani-chips Laboratory Animal Bedding(P.J. Murphy Foresst Product, Montville, NJ, 미국)을 포함하는 강철 케이지(Shor-line, Kansas City, KS, 미국)에서 쌍으로 사육하였다. 퍼렛은 Teklad Global Ferret Diet(harlan Teklad, Madison, WI, 미국) 및 신선한 물을 임의로 제공하였다. 상기 COBRA HA VLPs는 최종 농도를 달성하기 위해 pH 7.2의 PBS에 희석되었다. 퍼렛은 농도계 분석으로부터의 HA 함량에 기초한 정제된 COBRA HA VLPs의 두 개의 도스(15 ㎍, 3 ㎍) 중 하나로 0 주에 0.25 ml 양으로 사두근(quadriceps) 근육으로 근육내 주사를 통해 백신화하였고, 3 주에 같은 도스로 촉진(boost)되었다. 백신은 사용에 앞서 -80℃에 보관하였고 사용 전에 즉시 백반 아주번트(Imject Alum; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, 미국)으로 제제화하였다. 동물은 백식화 양생법(regimen)동안 매주 체중 감소, 온도, 활동량의 감소, 코의 배출(nasal discharge), 재채기 및 설사를 포함하는 부정적인 현상에 대해 추적감찰하였다. 백신화에 앞서, 동물은 순환하는 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스에 대해 HAI 분석에 의해 혈청반응음성(seronegative)을 확인받았다. 각 백신화 후 14 내지 21일 후에, 혈액은 앞쪽 대정맥(anterior vena cava)을 통해 퍼렛를 마취시키는 것으로 수집하였고 마이크로퓨즈 튜브로 이동하였다. 튜브는 원심분리되었고 혈청은 제거되었으며 -80±5℃에서 동결하였다. 각 백신 그룹에 대한 HAI 혈청 항체 역가는 대표적인 재조합체 바이러스 또는 COBRA HA VLPs를 사용하여 5 주에 결정되었다.
최종 백신화 후 3 주 이후에, 퍼렛은 1 ml 양의 고 병원성 H1N1 바이러스와 함께 비강내로 시험되었다. 감염 이후에, 퍼렛은 감염 후 14일 동안 체중 감소, 질병 징후, 죽음에 대해서 매일 추적감찰하였다. 각각의 신체 질량, 질병 점수 및 죽음은 접종 이후 각 날에 각 그룹에 대해서 기록되었다. 코의 세척은 접종 이후 7일 동안 각각의 날에 마취된 퍼렛의 콧구멍(nares)으로 3 ml의 PBS를 서서히 주입시킴으로서 수행하였다. 세척물은 수집하였고 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.
영장류 백신화
게먹이원숭이(cynomolgus macaques(Macaca fascicularis, 남성, 3-5살))는 Halan sprague Dawley(Indianapolis, IN, 미국)으로부터 구입하였다. 원숭이(macaques)는 농도계 분석으로부터의 HA 함량에 기초한 정제된 COBRA HA VLPs(15 ㎍)로 0 주에 근육내 주사를 통해 백신화하였고, 3 주 및 6 주에 같은 도스로 촉진되었다. 백신은 사용에 앞서 -80℃에 보관하였고 사용 전에 즉시 백반 아주번트(Imject Alum; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, 미국)으로 제제화하였다. 각 백신화 후 21일 후에, 혈액은 대퇴부의 정맥(femoral vein)을 통해 원숭이를 마취시키는 것으로 수집하였고 혈청 분리기(separator) 튜브로 이동하였다. 튜브는 원심분리 이후에 응고를 활성화하도록 허용되었으며 혈청은 제거되었고 -80±5℃에서 동결하였다. 각 백신 그룹에 대한 최종점 IgG 역가 및 HAI 혈청 항체 역가는 대표적인 재조합체 바이러스 또는 COBRA HA VLPs를 사용하여 5 주에 결정되었다.
최종 백신화 후 3 주 이후에, 원숭이는 1 ml 양의 고 병원성 H1N1 바이러스와 함께 비강내, 기관내(intratracheal, 및 오비탈(orbital) 접종으로 시험되었다. 감염 이후에, 원숭이는 감염 후 5일 동안 체중 감소, 질병 징후, 죽음에 대해서 추적감찰하였다. 각각의 신체 질량, 질병 점수 및 죽음은 접종 이후 각 날에 각 그룹에 대해서 기록되었다.
실험예 3: COBRA HA-포함하는 VLPs 으로 마우스를 면역화한 후 HAI 시험
COBRA HA를 포함하는 인플루엔자 VLPs는 실험예 2에 기술한 대로 생성하였다. 여성 BALB/c 마우스(6-8 주령)는 방법 X-1(서열번호 1), 방법 X-2(서열번호 2), 방법 X-3(서열번호 3), 방법 X-4(서열번호 4), 방법 X-5(서열번호 5), 방법 X-6(서열번호 6) COBRA HA를 포함하는 VLPs의 3 ㎍으로 근육내로 백신화하였다. 마우스는 0 주(주요 도스)에 백신화하였고 4 주 및 12 주에 촉진되었다. 백신은 백반 아주번트(Imject Alum; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, 미국)으로 제제화하였다. 0, 4, 8, 12 및 14 주에, 혈액은 역-궤도 신경층을 통해 마우스를 마취시키는 것으로 수집하였다. 14 주에, 인플루엔자 바이러스의 패널(panel)에 대항하는 헤마글루티닌 억제(HAI) 역가를 결정하였다. 또한 14 주에, 마우스는 병원성 H1N1 바이러스와 함께 비강내로 시험하였다.
H1N1 인플루엔자 종(strains)(푸에르토 리코(Puerto Rico)/8/1934, 포트 먼마우스(Fort Monmouth)/1/1947, 브라질/1978, 칠레/1983, 싱가포르/6/1986, 텍사스/36/1991, 베이징/1995, 뉴 칼레도니아/20/1999, 솔로몬 아일랜드/2006, 브리즈번/59/2007 및 캘리포니아/07/2009)의 패널에 대항하는 HAI 혈청 항체 역가는 14 주에 결정하였다. 상기 결과는 도 9A-9F에 나타내었다.
개시된 발명의 원리가 적용될 수 있는 많은 가능한 실시예의 관점에서, 기술된 실시예는 오직 본 발명의 선호되는 예시로써 인식되어야 하고 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 받아들이면 안 된다. 대신에, 본 발명의 범위는 하기의 청구항으로 정의된다. 본 발명자들은 그러므로 상기 범위 및 이들 청구항의 사상 내에 들어가는 모든 것을 우리의 발명으로 주장한다.
<110> UNIVERSITY OF PITTSBURGH - OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION <120> COMPUTATIONALLY OPTIMIZED BROADLY REACTIVE ANTIGENS FOR H1N1 INFLUENZA <130> 8123-90161-03 <150> US 61/730,186 <151> 2012-11-27 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Leu Ser Lys Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Asn 130 135 140 Thr Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Ala Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Lys Lys Asn Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Glu Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser Asn Tyr Asn 210 215 220 Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met His Glu Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Leu Ser Lys Arg Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Lys His Asn 130 135 140 Thr Thr Arg Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Ala Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asp Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Asn Ser Tyr Val Asn Lys Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Lys Asp Gln Gln Thr Leu 195 200 205 Tyr Gln Lys Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser Asn Tyr Asn 210 215 220 Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Glu Arg Pro Lys Val Arg Gly Gln 225 230 235 240 Ala Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met His Glu Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 3 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Ala Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Leu Tyr Pro 165 170 175 Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Ile 195 200 205 Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser 210 215 220 Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415 Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 4 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Met Lys Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Ala His Thr 130 135 140 Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 Ala Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Ile 195 200 205 Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser 210 215 220 Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415 Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 5 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Phe Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Ile 195 200 205 Tyr His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser 210 215 220 Arg Arg Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415 Leu Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 6 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 6 Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe 145 150 155 160 Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 165 170 175 Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu 180 185 190 Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asp Gln Arg Ala Leu Tyr 195 200 205 His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 210 215 220 Lys Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 225 230 235 240 Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile 245 250 255 Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 260 265 270 Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Pro Met 275 280 285 Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser 290 295 300 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro 305 310 315 320 Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 325 330 335 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340 345 350 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 7 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 7 Met Glu Ala Arg Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Ala Ala Thr Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Arg Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Leu Ser Lys Lys Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Asn Ser Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Ser His Ala Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Ser Tyr Pro 165 170 175 Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Ser Asn Ile Gly Asp Gln Gln Ala Leu 195 200 205 Tyr Gln Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Asn 210 215 220 Arg Lys Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Ser 275 280 285 Met His Glu Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 8 <211> 566 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Glu or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) <223> Xaa = Arg or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13) <223> Xaa = Ala or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16) <223> Xaa = Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (60) <223> Xaa = Arg, Lys or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71) <223> Xaa = Asn or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (73) <223> Xaa = Asn or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (86) <223> Xaa = Ser or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88) <223> Xaa = Phe or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (91) <223> Xaa = Lys, Glu or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (97) <223> Xaa = Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (102) <223> Xaa = Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (111) <223> Xaa = Asp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (113) <223> Xaa = Ile or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (142) <223> Xaa = Asn, Ala or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (144) <223> Xaa = Thr or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (145) <223> Xaa = Thr or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (147) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (150) <223> Xaa = Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (152) <223> Xaa = Ala or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (156) <223> Xaa = Ala or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (170) <223> Xaa = Glu, Gly or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (172) <223> Xaa = Asn or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (174) <223> Xaa = Ser or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (177) <223> Xaa = Asn, Ala or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (180) <223> Xaa = Lys or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (183) <223> Xaa = Val or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (185) <223> Xaa = Asn or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (187) <223> Xaa = Gly or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (200) <223> Xaa = Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (203) <223> Xaa = Gly, Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (206) <223> Xaa = Gln or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (207) <223> Xaa = Ser, Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (208) <223> Xaa = Leu or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (210) <223> Xaa = Gln or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (211) <223> Xaa = Thr, Lys or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (222) <223> Xaa = Asn or His <220> <221> MISC_FEATURE <222> (224) <223> Xaa = Asn or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (226) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (233) <223> Xaa = Lys or Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (239) <223> Xaa = Asp or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (241) <223> Xaa = Glu or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (244) <223> Xaa = Ile or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (269) <223> Xaa = Trp or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (288) <223> Xaa = Ser or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (290) <223> Xaa = His or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (294) <223> Xaa = Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (312) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (327) <223> Xaa = Thr or Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (362) <223> Xaa = Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (416) <223> Xaa = Lys or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (419) <223> Xaa = Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (468) <223> Xaa = Ser or Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (471) <223> Xaa = Lys or Arg <400> 8 Met Xaa Ala Xaa Leu Leu Val Leu Leu Cys Ala Phe Xaa Ala Thr Xaa 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Xaa Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Xaa Leu Xaa Ser Lys Xaa Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Xaa Glu Thr Pro Asn Xaa Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Xaa Phe 100 105 110 Xaa Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Xaa His Xaa 130 135 140 Xaa Thr Xaa Gly Val Xaa Ala Xaa Cys Ser His Xaa Gly Lys Ser Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Xaa Lys Xaa Gly Xaa Tyr Pro 165 170 175 Xaa Leu Ser Xaa Ser Tyr Xaa Asn Xaa Lys Xaa Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Val His His Pro Xaa Asn Ile Xaa Asp Gln Xaa Xaa Xaa 195 200 205 Tyr Xaa Xaa Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser Xaa Tyr Xaa 210 215 220 Arg Xaa Phe Thr Pro Glu Ile Ala Xaa Arg Pro Lys Val Arg Xaa Gln 225 230 235 240 Xaa Gly Arg Xaa Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr 245 250 255 Ile Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Xaa Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Thr Ser Asn Ala Xaa 275 280 285 Met Xaa Glu Cys Asp Xaa Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Ser Ser Leu Pro Phe Gln Asn Xaa His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Arg Ser Xaa Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Xaa Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Xaa 405 410 415 Leu Glu Xaa Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Lys Xaa Gln Leu Xaa Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565

Claims (22)

  1. 하기의 아미노산(amino acid) 서열을 포함하는 재조합 인플루엔자(influenza) 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 폴리펩티드(polypeptide):
    (i) 서열번호 1에 대해 최소 96%의 상동성 또는 서열번호 1의 2-566 잔기에 대해 최소 96%의 상동성을 갖고;
    (ii) 서열번호 2에 대해 최소 99%의 상동성 또는 서열번호 2의 2-566 잔기에 대해 최소 99%의 상동성을 갖고;
    (iii) 서열번호 3에 대해 최소 99%의 상동성 또는 서열번호 3의 2-566 잔기에 대해 최소 99%의 상동성을 갖고;
    (iv) 서열번호 4에 대해 최소 99%의 상동성 또는 서열번호 4의 2-566 잔기에 대해 최소 99%의 상동성을 갖고;
    (v) 서열번호 5에 대해 최소 98.4%의 상동성 또는 서열번호 5의 2-566 잔기에 대해 최소 98.4%의 상동성을 갖고;
    (vi) 서열번호 6에 대해 최소 99%의 상동성 또는 서열번호 6의 2-565 잔기에 대해 최소 99%의 상동성을 갖고;
    (vii) 서열번호 7에 대해 최소 97%의 상동성 또는 서열번호 7의 2-566 잔기에 대해 최소 97%의 상동성을 갖고; 또는
    (viii) 서열번호 8을 포함.
  2. 하기를 포함하는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩티드:
    (i) 서열번호 1에 관하여 10개 이하의 아미노산의 치환;
    (ii) 서열번호 2에 관하여 8개 이하의 아미노산의 치환;
    (iii) 서열번호 3에 관하여 6개 이하의 아미노산의 치환;
    (iv) 서열번호 4에 관하여 7개 이하의 아미노산의 치환;
    (v) 서열번호 5에 관하여 9개 이하의 아미노산의 치환;
    (vi) 서열번호 6에 관하여 6개 이하의 아미노산의 치환; 또는
    (vii) 서열번호 7에 관하여 10개 이항의 아미노산의 치환.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1의 2-566 잔기, 서열번호 2의 2-566 잔기, 서열번호 3의 2-566 잔기, 서열번호 4의 2-566 잔기, 서열번호 5의 2-566 잔기, 서열번호 6의 2-565 잔기 또는 서열번호 7의 2-566 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 서열번호 1의 2-566 잔기, 서열번호 2의 2-566 잔기, 서열번호 3의 2-566 잔기, 서열번호 4의 2-566 잔기, 서열번호 5의 2-566 잔기, 서열번호 6의 2-565 잔기 또는 서열번호 7의 2-566 잔기의 아미노산 서열로 구성되는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 재조합 인플루엔자 HA 폴리펩타이드.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산(nucleic acid).
  8. 제 7항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 포유동물 세포에서 발현하는 코돈(codon)-최적화된 것을 특징으로 하는 핵산.
  9. 제 7항 또는 제 8항의 핵산을 포함하는 벡터(vector).
  10. 제 9항에 있어서, 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 프로모터(promoter)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  11. 제 9항 또는 제 10항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  12. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 바이러스-비슷한 조각(virus-like particle, VLP).
  13. 제 12항에 있어서, 인플루엔자 뉴라미니다제(neuraminidase, NA) 단백질, 인플루엔자 매트릭스(matrix, MI) 단백질, 또는 두 가지 모두를 추가적으로 포함하는 인플루엔자 VLP.
  14. HA, MI 및 NA 단백질의 발현을 충분히 허용하는 조건에서 HA 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터, 인플루엔자 NA 단백질을 암호화하는 벡터 및 인플루엔자 MI 단백질을 암호화하는 벡터를 숙주 세포에 형질주입(transfection)하여 제조된 제 1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 HA 폴리펩타이드를 포함하는 인플루엔자 VLP.
  15. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  16. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 제 15항의 융합 단백질, 또는 제 13항 내지 제 15항의 어느 한 항의 VLP, 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항의 인플루엔자 HA 폴리펩타이드, 제 16항의 융합 단백질, 제 12항 내지 제 14항의 어느 한 항의 VLP, 또는 제 16항의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  18. 제 12항 내지 제 14항의 어느 한 항의 VLP를 포함하는 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스에 대항하여 개체의 면역화 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 조성물은 아주번트(adjuvant)를 추가적으로 포함하는 방법.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 상기 조성물은 근육내(intramuscularly)로 투여하는 방법.
  21. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 1 내지 약 25 ㎍의 VLP를 포함하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 조성물은 약 15 ㎍의 VLP를 포함하는 방법.
KR1020157012693A 2012-11-27 2013-11-27 H1n1에 대한 계산적으로 최적화되고 넓은 반응성의 항원 KR20150089005A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261730186P 2012-11-27 2012-11-27
US61/730,186 2012-11-27
PCT/US2013/072279 WO2014085616A1 (en) 2012-11-27 2013-11-27 Computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150089005A true KR20150089005A (ko) 2015-08-04

Family

ID=50773495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157012693A KR20150089005A (ko) 2012-11-27 2013-11-27 H1n1에 대한 계산적으로 최적화되고 넓은 반응성의 항원

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9309290B2 (ko)
EP (1) EP2925773B1 (ko)
JP (2) JP2016505538A (ko)
KR (1) KR20150089005A (ko)
CN (1) CN104797594A (ko)
AU (2) AU2013352179B2 (ko)
CA (1) CA2891682A1 (ko)
HK (1) HK1212708A1 (ko)
IN (1) IN2015DN03070A (ko)
MX (1) MX2015005056A (ko)
RU (1) RU2015124805A (ko)
SG (1) SG11201503989PA (ko)
WO (1) WO2014085616A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8883171B2 (en) * 2010-09-14 2014-11-11 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
AU2012273039B2 (en) * 2011-06-20 2016-12-01 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
IN2014DN07399A (ko) 2012-03-30 2015-04-24 Univ Pittsburgh
EP3233116A4 (en) * 2014-12-19 2018-05-30 Oregon Health & Science University Synergistic co-administration of computationally optimized broadly reactive antigens for h1n1 influenza
CN108290932A (zh) 2015-06-09 2018-07-17 圣诺菲·帕斯图尔公司 优化编码工程改造的流感蛋白的核苷酸序列的方法
CN115746107A (zh) 2016-06-03 2023-03-07 圣诺菲·帕斯图尔公司 经改造的流感血凝素多肽的修饰

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0111830B8 (pt) * 2000-06-23 2021-05-25 American Cyanamid Co método de produção de partículas semelhantes ao vírus da influenza (vlps), vlps da influenza, vlps quiméricas, composições imunogênica e farmacêutica, e, usos de vlps da influenza e de vlps quiméricas
US20050181459A1 (en) 2002-06-11 2005-08-18 Matthew Baker Method for mapping and eliminating T cell epitopes
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US7566454B2 (en) 2005-02-24 2009-07-28 University Of Massachusetts Influenza nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
CN101227920A (zh) 2005-07-19 2008-07-23 陶氏环球技术公司 重组流感疫苗
EP1969510A2 (en) 2005-12-19 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Methods of clustering gene and protein sequences
US20080045472A1 (en) 2006-03-31 2008-02-21 Council Of Scientific And Industrial Research Bharat Biotech Targets for human micro rnas in avian influenza virus (h5n1) genome
MY170607A (en) 2006-09-07 2019-08-20 Crucell Holland Bv Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h5n1 and uses thereof
WO2009022236A2 (en) 2007-08-16 2009-02-19 Tripep Ab Immunogen platform
KR101255419B1 (ko) 2007-11-12 2013-04-17 이노비오 파마수티컬즈, 인크. 인플루엔자 바이러스의 다중 아형에 대한 신규 백신
SG187500A1 (en) * 2008-01-21 2013-02-28 Medicago Inc Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
US7981428B2 (en) 2008-01-23 2011-07-19 Academia Sinica Flu vaccines and methods of use thereof
WO2010036970A2 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
WO2010036948A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus
CA2757030C (en) 2009-04-03 2019-01-15 Merial Limited Vectors comprising newcastle disease viruses and compositions thereof
NZ597401A (en) * 2009-06-24 2013-09-27 Medicago Inc Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
US20110184160A1 (en) * 2010-01-26 2011-07-28 Weiner David B Nucleic acid molecule encoding consensus influenza a hemagglutinin h1
CN102373184A (zh) * 2010-08-09 2012-03-14 中山大学 禽流感和传染性支气管炎混合病毒样颗粒、制备方法和应用
US8883171B2 (en) * 2010-09-14 2014-11-11 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
AU2012273039B2 (en) * 2011-06-20 2016-12-01 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
IN2014DN05805A (ko) 2012-02-07 2015-05-15 Univ Pittsburgh
US9566327B2 (en) 2012-02-13 2017-02-14 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian H5N1 influenza
IN2014DN07399A (ko) * 2012-03-30 2015-04-24 Univ Pittsburgh

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018183149A (ja) 2018-11-22
US20140147459A1 (en) 2014-05-29
EP2925773A4 (en) 2016-06-08
IN2015DN03070A (ko) 2015-10-02
AU2013352179B2 (en) 2017-12-21
JP2016505538A (ja) 2016-02-25
EP2925773B1 (en) 2018-12-26
WO2014085616A1 (en) 2014-06-05
CN104797594A (zh) 2015-07-22
US20160166677A1 (en) 2016-06-16
US20170114102A1 (en) 2017-04-27
AU2018201876A1 (en) 2018-04-12
HK1212708A1 (zh) 2016-06-17
US10017544B2 (en) 2018-07-10
AU2013352179A1 (en) 2015-05-14
SG11201503989PA (en) 2015-06-29
US9309290B2 (en) 2016-04-12
MX2015005056A (es) 2015-07-23
AU2013352179A8 (en) 2015-05-28
CA2891682A1 (en) 2014-06-05
EP2925773A1 (en) 2015-10-07
RU2015124805A (ru) 2017-01-13
US9566328B2 (en) 2017-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10562940B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
US10865228B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for human and avian H5N1 influenza
US9234008B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for H3N2, H2N2, and B influenza viruses
US10017544B2 (en) Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination