JP2016505538A - H1n1インフルエンザに対する計算で最適化した広い反応性を示す抗原 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年11月27日に出願された米国仮特許出願第61/730,186号の優先権の利益を請求し、その全体が参考として本明細書に援用される。
本開示は、H1N1ウイルス分離株に対して広い反応性を示す免疫応答を誘発する最適化したインフルエンザ血球凝集素タンパク質およびワクチンとしてのその使用に関する。
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科のメンバーである。インフルエンザウイルスには、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、およびC型インフルエンザと命名された3つのサブタイプが存在する。インフルエンザビリオンは、以下のタンパク質をコードするセグメント化ネガティブセンスRNAゲノムを含む:血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、マトリックス(M1)、プロトンイオンチャネルタンパク質(M2)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)、および非構造タンパク質2(NS2)。HA、NA、M1、およびM2が膜結合タンパク質であるのに対して、NP、PB1、PB2、PA、およびNS2はヌクレオカプシド結合タンパク質である。M1タンパク質は、インフルエンザ粒子の最も豊富なタンパク質である。HAおよびNAタンパク質は、ウイルス付着(attachment)およびウイルス粒子の細胞への侵入を担うエンベロープ糖タンパク質であり、ウイルス中和および防御免疫のための主な免疫優性エピトープの供給源である。HAおよびNAタンパク質の両方は、インフルエンザ予防ワクチンの最も重要な成分と見なされている。
H1N1インフルエンザウイルス分離株に対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したH1N1インフルエンザHAポリペプチドの生成を本明細書中に開示する。最適化したHAポリペプチドを、1918〜2012年に分離された選択H1N1ウイルスに基づいた一連のHAタンパク質アラインメントおよびその後のコンセンサス配列の生成によって作製した。
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列を、米国特許法施行規則1.822で定義のように、ヌクレオチド塩基については標準的な略語を使用し、アミノ酸については3文字表記を使用して示す。各核酸配列についてたった1つの鎖を示すが、表示の鎖を参照することによって相補鎖が含まれると理解される。本配列表を、2013年11月6日に作成したASCIIテキストファイル(42.9KB)として提出し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。添付の配列表では、以下を列挙する。
I.略語
COBRA:計算で最適化した広い反応性を示す抗原
HA:血球凝集素
HAI:赤血球凝集阻害
HRP:セイヨウワサビペルオキシダーゼ
M1:マトリックスタンパク質1
NA:ノイラミニダーゼ
PFU:プラーク形成単位
VLP:ウイルス様粒子
別途記載がない限り、技術用語を従来の用法にしたがって使用する。分子生物学における一般用語の定義を、Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Pressによる出版,1994(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら.(編集),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.による出版,1994(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A.Meyers(編集),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.による出版,1995(ISBN 1−56081−569−8)に見出すことができる。
214,806号;同第6,218,371号;同第6,239,116号;同第6,339,068号;同第6,406,705号;および同第6,429,199号を参照のこと)。アジュバントはまた、生体分子(共刺激分子など)を含む。例示的な生物学的アジュバントは、IL−2、RANTES、GM−CSF、TNF−α、IFN−γ、G−CSF、LFA−3、CD72、B7−1、B7−2、OX−40L、および41BBLを含む。
ロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを必要に応じて含む。「構成性プロモーター」は、持続的に活性であり、外部のシグナルまたは分子による調節を受けないプロモーターである。対照的に、「誘導性プロモーター」の活性は、外部のシグナルまたは分子(例えば、転写因子)によって調節される。本明細書中のいくつかの実施形態では、プロモーターはCMVプロモーターである。
およびNAタンパク質、ならびに必要に応じてM1タンパク質をコードするプラスミドでの宿主細胞のトランスフェクションによって産生させることができる。トランスフェクトした細胞の、タンパク質を発現させるのに適した期間(およそ72時間など)のインキュベーション後、VLPを細胞培養上清から単離することができる。実施例2は、細胞上清からのインフルエンザVLPの例示的な精製プロトコールを提供する。この実施例では、VLPを、低速遠心分離(細胞デブリ除去のため)、真空濾過、および20%グリセロールによる超遠心分離によって単離する。インフルエンザVLPの他の産生方法が当該分野で公知である(例えば、米国特許出願公開第2006/0263804号;同第2008/0031895号;同第2010/0166769号;および同第2010/0239610号を参照のこと)。
H1N1インフルエンザに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために最適化したH1N1インフルエンザHAポリペプチドの生成を本明細書中に開示する。最適化したHAポリペプチドを、1918〜2012年に分離された選択H1N1ウイルスに基づいた一連のHAタンパク質アラインメントおよびその後のコンセンサス配列の生成によって作製した。7種のHA配列を生成するために使用した方法を、実施例1および図1〜7に記載する。7種の最適化したHAポリペプチドのアミノ酸配列を、本明細書中に配列番号1〜7として示す。さらに、配列番号1〜7のアミノ酸コンセンサス配列を、配列番号8として本明細書中に提供する。
7種の異なる最適化したH1N1 HAポリペプチド配列を本明細書中に提供する。H1N1 HAアミノ酸配列を、NCBIインフルエンザウイルスリソースデータベースからダウンロードした。1918〜2012年に分離したインフルエンザウイルス由来のH1N1 HAタンパク質を、コンセンサス配列の生成のために使用した。実施例1は、各コンセンサス配列の生成のために使用した方法を記載している(図1〜7も参照のこと)。
基を欠く。したがって、いくつかの実施例では、配列番号1〜5および8のいずれか1つの残基2〜566を含むか、配列番号6の残基2〜565を含むHAポリペプチドを提供する。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するセグメント化負鎖RNAウイルスである。インフルエンザウイルスには3つの型が存在する(A型、B型、およびC型)。A型インフルエンザウイルスは、広範な種々の鳥類および哺乳動物(ヒト、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、フェレット、およびニワトリが含まれる)に感染する。動物では、ほとんどのA型インフルエンザウイルスは、気道および腸管に軽度の限局性感染を引き起こす。しかし、高病原性A型インフルエンザ株(H5N1など)は、家禽類において全身性感染を引き起こし、その死亡率は100%に達し得る。A型インフルエンザに感染した動物は、しばしば、インフルエンザウイルスの保有宿主として働き、一定のサブタイプがヒトへの種の壁を超えることが示されている。
最適化したHA(配列番号1〜8のいずれか1つとして記載のアミノ酸配列を有するHAなど)を含むインフルエンザVLPを本明細書中に提供する。インフルエンザVLPは、一般に、HA、NA、およびM1タンパク質から構成される。インフルエンザVLPの生成は当該分野で記載されており、当業者の能力の範囲内である。例えば、インフルエンザVLPを、HA、NA、およびM1タンパク質をコードするプラスミドでの宿主細胞のトランスフェクションによって生成することができる。タンパク質を発現させるのに適した期間(およそ72時間など)、トランスフェクトした細胞をインキュベートした後、VLPを細胞培養上清から単離することができる。以下の実施例2は、細胞上清からのインフルエンザVLPの例示的な精製プロトコールを提供する。この実施例では、VLPを、低速遠心分離(細胞デブリ除去のため)、真空濾過、および20%グリセロールによる超遠心分離によって単離する。
A型インフルエンザH1N1 HAアミノ酸配列を、NCBIインフルエンザウイルスリソースデータベースからダウンロードした。1918〜2012年の分離株のH1N1 HAタンパク質を、コンセンサス配列の生成のために使用した。7種の異なるコンセンサス配列(配列番号1〜7)を、以下の方法を使用して生成した。
配列を分離日順にまとめ、9種の一次コンセンサス配列を、1918−1934(8)、1935−1947(13)、1948−1957(12)、1977−1983(69)、1984−1991(19)、1992−1999(59)、2000−2006(339)、2007−2008(722)、および2009−2012(207)の分離株を使用して生成した。1948〜1991から分離したウイルスの第2層コンセンサス配列を、1948〜1957群、1977〜1983群、および1984〜1991群由来の3種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図2に示すように、最終コンセンサス配列(第3層;配列番号1)を、6種の一次層コンセンサス配列(1918〜1934、1935〜1947、1992〜1999、2000〜2006、2007〜2008、および2009〜2012)および第2層コンセンサス配列(1948〜1991)のアラインメントによって生成した。
配列を分離日順にまとめて、以下の3種の一次コンセンサス配列を生成した:1933〜1936(11)、1940〜1946(8)、および1947(1)。図2に示すように、最終コンセンサス配列(配列番号2)を、3種の一次コンセンサス配列のアラインメントによって生成した。
配列を分離日順にまとめ、5種の一次コンセンサス配列を、1978〜1983(65)、1984〜1991(19)、1992〜1999(59)、2000〜2006(339)、および2007〜2008(722)の分離株を使用して生成した。1978〜1991から分離したウイルスの第2層コンセンサス配列を、1978〜1983群および1984〜1991群由来の2種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図3に示すように、最終コンセンサス配列(配列番号3)を、3種の一次層コンセンサス配列(1992〜1999、2000〜2006、および2007〜2008)および第2層コンセンサス配列(1978〜1991)のアラインメントによって生成した。
配列を分離日順にまとめ、8種の一次コンセンサス配列を、1918〜1934(8)、1935〜1947(13)、1948〜1957(12)、1977〜1983(68)、1984〜1986(9)、1987〜1991(12)、1992〜1999(59)、および2000〜2005(263)の分離株を使用して生成した。2種の第2層コンセンサス配列(1918〜1957および1978〜1991)を生成した。1918〜1957二次コンセンサス配列を、1918〜1934群、1935〜1947群、および1948〜1957群由来の3種の一次コンセンサス層を使用して生成した。1978〜1991二次コンセンサス配列を、1977〜1983群、1984〜1986群、および1987〜1991群由来の3種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図4に示すように、最終コンセンサス配列(配列番号4)を、2種の一次層コンセンサス配列(1992〜1999および2000〜2005)および2種の第2層コンセンサス配列(1918〜1957および1978〜1991)のアラインメントによって生成した。この配列は、142位および177位で脱グリコシル化されている。
配列を分離日順にまとめ、7種の一次コンセンサス配列を、1982〜1983(4)、1984〜1986(9)、1987〜1991(12)、1992〜1999(27)、2000〜2006(339)、2007〜2008(722)、および2009〜2012(207)の分離株を使用して生成した。1種の第2層コンセンサス配列(1982〜1986)を、1982〜1983群および1984〜1986群由来の2種の一次コンセンサス層を使用して生成した。図5に示すように、最終コンセンサス配列(配列番号5)を、5種の一次層コンセンサス配列(1987〜1991、1992〜1999、2000〜2006、2007〜2008、および2009〜2012)および第2層コンセンサス配列(1982〜1986)のアラインメントによって生成した。
配列を分離日順にまとめて、以下の4種の一次コンセンサス配列を生成した:1999(5)、2000〜2006(339)、2007〜2008(722)、および2009〜2012(207)。図6に示すように、最終コンセンサス配列(配列番号6)を、4種の一次コンセンサス配列のアラインメントによって生成した。
配列を分離日順にまとめ、12種の一次コンセンサス配列を、1918(1)、1976(4)、2009〜2011(123)、1933〜1934(8)、1935〜1947(13)、1948〜1957(12)、1977〜1983(68)、1984〜1986(9)、1987〜1991(12)、1992〜1999(27)、2000〜2005(59)、および2006〜2008(798)の分離株を使用して生成した。図7に示すように、4種の二次コンセンサス配列を、「ブタ」配列または日付順(1933〜1957、1977〜2005、および2006〜2008)にしたがって一次コンセンサス配列をグループ化することによって生成した。最終コンセンサス配列(第3層コンセンサス;配列番号7)を、4種の二次コンセンサス配列のアラインメントによって生成した。
以下の方法を使用して、最適化したHAを含むインフルエンザVLPを生成し、特徴付けることができる。マウス、フェレット、およびマカクの例示的な免疫方法も以下に記載する(GilesおよびRoss,Vaccine 29(16):3043−3054,2011も参照のこと)。
293T細胞を、M1、NA、および最適化したHAを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトし、37℃で72時間インキュベートする。M1、NA、およびHAのコード配列を、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化することができる。上清を回収し、細胞デブリを低速遠心分離およびその後の0.22μmの滅菌フィルターによる真空濾過によって除去する。VLPを、超遠心分離(20%グリセロール(重量/容積)にて100,000×g)にて4℃で4時間精製した。次いで、ペレットをPBS(pH7.2)に再懸濁し、1回使用量のアリコートで使用するまで−80℃で保存する。総タンパク質濃度を、Micro BCA(商標)タンパク質アッセイ試薬キット(Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)によって決定する。
HA比含量(specific content)を、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって決定することができる。精製組換えCOBRA HAおよび精製VLPを標準的な総タンパク質量で調製し、10%SDS−PAGEゲルにて電気泳動し、PVDF膜に転写する。ブロットをインフルエンザ感染マウス由来のマウスポリクローナル抗血清で探索し、HA−抗体複合体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合体化したヤギ抗マウスIgG(Southern Biotech;Birmingham,AL,USA)を使用して検出する。HRPを化学発光基質(Pierce Biotechnology;Rockford IL,USA)によって検出し、X線フィルム(ThermoFisher;Pittsburgh,PA,USA)に感光する。バンド密度を、ImageJソフトウェア(NIH)を使用して決定する。組換えHAバンドの密度を使用して標準曲線を計算し、精製VLPの密度を、組換えHAからの結果を使用して内挿する。
BALB/cマウス(Mus musculis、雌、6〜8週齢)を、Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN,USA)から購入することができる。マウスを小型アイソレーターユニットに収容し、飼料および水を自由に利用させ、実験動物のためのUSDAガイドラインにしたがって飼育する。マウスにデンシトメトリーアッセイ由来のHA含量に基づいた3用量の精製COBRA HA VLP(1.5μg、0.3μg、または0.06μg)のうちの1つを筋肉内注射によって0週目にワクチン接種し、次いで、3週目に同一用量で追加免疫する。各用量のワクチンを、ミョウバンアジュバント(Imject Alum,Pierce Biotechnology;Rockford,IL,USA)、CpGオリゴヌクレオチド、またはビヒクルのみを使用して調合する。各ワクチン接種の14〜21日後、麻酔したマウスの後眼窩叢(retro−orbital plexus)から採血し、微量遠心チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−80±5℃で凍結する。各ワクチン群についての赤血球凝集阻害(HAI)血清抗体価を、5週目に代表的な再集合体ウイルスまたはCOBRA HA VLPを使用して決定する。
フィッチフェレット(Mustela putorius furo、雌、6〜12月齢)(インフルエンザナイーブおよび臭腺除去済み)を、Marshall Farms(Sayre,PA,USA)から購入することができる。フェレットをSani−chips実験動物用床敷(P.J.Murphy Forest Products,Montville,NJ,USA)を含むステンレススチール製ケージ(Shor−line,Kansas City,KS,USA)に対で収容する。フェレットに、Teklad Globalフェレット飼料(Harlan Teklad,Madison,WI,USA)および新鮮な水を自由に与える。COBRA HA VLPをPBS(pH7.2)で希釈して最終濃度にする。フェレットに、デンシトメトリーアッセイによって決定したHA含量に基づいた2用量の精製COBRA VLP(15μg、3μg)のうちの1つを筋肉内注射によって0週目に0.25mlの体積で大腿四頭筋にワクチン接種し、次いで、3週目に同一用量で追加免疫する。ワクチンを使用前に−80℃で保存し、使用直前にミョウバンアジュバント(Imject Alum;Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)を使用して調合する。動物をワクチン接種レジメンの間、有害事象(体重減少、熱(temperature)、活動の低下、鼻汁、くしゃみ、および下痢が含まれる)について毎週モニタリングする。ワクチン接種前に、動物をHAIアッセイによって循環A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスについて血清陰性であることを確認する。各ワクチン接種の14〜21日後、麻酔したフェレットの前大静脈から採血し、微量遠心チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−80±5℃で凍結する。各ワクチン群についてのHAI血清抗体価を、5週目に代表的な再集合体ウイルスまたはCOBRA HA VLPを使用して決定する。
カニクイザル(Macaca fascicularis、雄、3〜5歳)を、Harlan Sprague Dawley(Indianapolis、IN、USA)から購入することができる。マカクにデンシトメトリーアッセイ由来のHA含量に基づいた精製COBRA HA VLP(15μg)を筋肉内注射によって0週目にワクチン接種し、次いで、3週目および6週目に同一用量で追加免疫する。ワクチンを、使用直前にミョウバンアジュバント(Imject Alum,Pierce Biotechnology;Rockford,IL,USA)を使用して調合する。各ワクチン接種の21日後、麻酔したマカクの大腿静脈から採血し、血清分離チューブに移す。チューブについて凝固を活性化させ、その後に遠心分離し、血清を取り出し、−80±5℃で凍結する。各ワクチン群についてのエンドポイントIgG力価およびHAI血清抗体価を、5週目に代表的な再集合体ウイルスまたはCOBRA HA VLPを使用して決定する。
COBRA HAを含むインフルエンザVLPを、実施例2に記載のように生成した。雌BALB/cマウス(6〜8週齢)に、方法X−1(配列番号1)、方法X−2(配列番号2)、方法X−3(配列番号3)、方法X−4(配列番号4)、方法X−5(配列番号5)、または方法X−6(配列番号6)のCOBRA HAを含む3μgのVLPを筋肉内にワクチン接種した。マウスに、0週目にワクチン接種し(初回抗原刺激用量(prime dose))、4週目および12週目に追加免疫した。ワクチンを、ミョウバンアジュバント(Imject Alum、Pierce Biotechnology;Rockford、IL、USA)を使用して調合した。0、4、8、12、および14週目に、麻酔したマウスの後眼窩叢(retro−orbital plexus)から血液サンプルを採取した。14週目に、インフルエンザウイルスパネルに対する赤血球凝集阻害(HAI)力価を決定した。また、14週目に、マウスを病原性H1N1ウイルスにて鼻腔内でチェレンジ(challenge)した。
実施形態は本発明の好ましい例を示すことのみを目的とし、本発明の範囲を制限すると見
なすべきではないと認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲に
よって定義される。したがって、本発明者らは、本特許請求の範囲の範囲および精神の範
囲内に入る全てを本発明者らの発明と主張する。
Claims (22)
- 組換えインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドであって、
(i)配列番号1と少なくとも96%同一または配列番号1の残基2〜566と少なくとも96%同一;
(ii)配列番号2と少なくとも99%同一または配列番号2の残基2〜566と少なくとも99%同一;
(iii)配列番号3と少なくとも99%同一または配列番号3の残基2〜566と少なくとも99%同一;
(iv)配列番号4と少なくとも99%同一または配列番号4の残基2〜566と少なくとも99%同一;
(v)配列番号5と少なくとも98.4%同一または配列番号5の残基2〜566と少なくとも98.4%同一;
(vi)配列番号6と少なくとも99%同一または配列番号6の残基2〜565と少なくとも99%同一;
(vii)配列番号7と少なくとも97%同一または配列番号7の残基2〜566と少なくとも97%同一;あるいは
(viii)配列番号8を含む、
アミノ酸配列を含む、組換えインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド。 - 組換えインフルエンザHAポリペプチドであって、
(i)配列番号1と比較して10個以下のアミノ酸置換;
(ii)配列番号2と比較して8個以下のアミノ酸置換;
(iii)配列番号3と比較して6個以下のアミノ酸置換;
(iv)配列番号4と比較して7個以下のアミノ酸置換;
(v)配列番号5と比較して9個以下のアミノ酸置換;
(vi)配列番号6と比較して6個以下のアミノ酸置換;または
(vii)配列番号7と比較して10個以下のアミノ酸置換
を含む、組換えインフルエンザHAポリペプチド。 - 配列番号1の残基2〜566、配列番号2の残基2〜566、配列番号3の残基2〜566、配列番号4の残基2〜566、配列番号5の残基2〜566、配列番号6の残基2〜565、または配列番号7の残基2〜566のアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
- 配列番号1の残基2〜566、配列番号2の残基2〜566、配列番号3の残基2〜566、配列番号4の残基2〜566、配列番号5の残基2〜566、配列番号6の残基2〜565、または配列番号7の残基2〜566のアミノ酸配列からなる、請求項1または請求項2に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列からなる、請求項1または請求項2に記載の組換えインフルエンザHAポリペプチド。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドをコードする単離核酸。
- 前記核酸を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化する、請求項7に記載の単離核酸。
- 請求項7または請求項8に記載の核酸を含むベクター。
- 前記インフルエンザHAポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項9に記載のベクター。
- 請求項9または請求項10に記載のベクターを含む単離細胞。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)。
- インフルエンザノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、インフルエンザマトリックス(M1)タンパク質、またはその両方をさらに含む、請求項12に記載のインフルエンザVLP。
- 前記HAポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザNAタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザM1タンパク質をコードするベクターで宿主細胞を該HAタンパク質、該M1タンパク質、および該NAタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって生成される、請求項1〜6のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドを含むインフルエンザVLP。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチド、請求項15に記載の融合タンパク質、または請求項13〜15のいずれか1項に記載のVLP、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
- 被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項1〜7のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチド、請求項16に記載の融合タンパク質、請求項12〜14のいずれか1項に記載のVLP、または請求項16に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
- インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、請求項12〜14のいずれか1項に記載のVLPおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
- 前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項18に記載の方法。
- 前記組成物を筋肉内投与する、請求項18または請求項19に記載の方法。
- 前記組成物が約1〜約25μgの前記VLPを含む、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が約15μgの前記VLPを含む、請求項21に記載の方法。
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