JP6336915B2 - 計算で最適化した広い反応性を示すh3n2、h2n2、およびb型インフルエンザウイルスの抗原 - Google Patents
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Description
本願は、2012年2月7日に出願された米国仮特許出願第61/596,014号への優先権の利益を主張し、その全体が参照によって本開示に援用される。
本開示は、H3N2、H2N2またはBのインフルエンザウイルスに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発する最適化したインフルエンザ血球凝集素タンパク質およびワクチンとしてのその使用に関する。
インフルエンザウイルスはオルトミクソウイルス科のメンバーである。インフルエンザウイルスには、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、およびC型インフルエンザと命名された3つのサブタイプが存在する。インフルエンザビリオンは、以下のタンパク質をコードするセグメント化ネガティブセンスRNAゲノムを含む:血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、マトリックス(M1)、プロトンイオンチャネルタンパク質(M2)、核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)、および非構造タンパク質2(NS2)。HA、NA、M1、およびM2が膜結合タンパク質であるのに対して、NP、PB1、PB2、PA、およびNS2はヌクレオカプシド結合タンパク質である。M1タンパク質は、インフルエンザ粒子の最も豊富なタンパク質である。HAおよびNAタンパク質は、ウイルス付着(attachment)およびウイルス粒子の細胞への侵入を担うエンベロープ糖タンパク質であり、ウイルス中和および防御免疫のための主な免疫優性エピトープの供給源である。HAおよびNAタンパク質の両方は、インフルエンザ予防ワクチンの最も重要な成分と見なされている。
インフルエンザウイルスに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するために計算で最適化したH2N2、H3N2およびBのインフルエンザHAポリペプチドの生成を本明細書中に開示する。最適化したHAポリペプチドを、選択されたH2N2、H3N2およびBのインフルエンザ分離株に基づいた一連のHAタンパク質アラインメントおよびその後のコンセンサス配列の生成によって作製した。
組換えインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドであって、
(i)配列番号8の残基2〜566と少なくとも97.7%同一のアミノ酸配列;
(ii)配列番号1の残基2〜562と少なくとも99.6%同一のアミノ酸配列;
(iii)配列番号2の残基2〜562と少なくとも99.4%同一のアミノ酸配列;
(iv)配列番号3の残基2〜562を含むアミノ酸配列;
(v)配列番号4の残基2〜562と少なくとも99.7%同一のアミノ酸配列;
(vi)配列番号5の残基2〜584と少なくとも99.6%同一のアミノ酸配列;
(vii)配列番号6の残基2〜585と少なくとも98.8%同一のアミノ酸配列;
(viii)配列番号7の残基2〜585を含むアミノ酸配列;
(ix)配列番号9の残基2〜566と少なくとも98.4%同一のアミノ酸配列;
(x)配列番号10の残基2〜566と少なくとも97.8%同一のアミノ酸配列;または
(xi)配列番号11の残基2〜566と少なくとも98.9%同一のアミノ酸配列;
を含む組換えインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド。
[本発明1002]
(i)配列番号8と少なくとも97.7%同一のアミノ酸配列;
(ii)配列番号1と少なくとも99.6%同一のアミノ酸配列;
(iii)配列番号2と少なくとも99.4%同一のアミノ酸配列;
(iv)配列番号3のアミノ酸配列;
(v)配列番号4と少なくとも99.7%同一のアミノ酸配列;
(vi)配列番号5と少なくとも99.6%同一のアミノ酸配列;
(vii)配列番号6と少なくとも98.8%同一のアミノ酸配列;
(viii)配列番号7のアミノ酸配列;
(ix)配列番号9と少なくとも98.4%同一のアミノ酸配列;
(x)配列番号10と少なくとも97.8%同一のアミノ酸配列;または
(xi)配列番号11と少なくとも98.9%同一のアミノ酸配列
を含む本発明1001のインフルエンザHAポリペプチド。
[本発明1003]
前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、
(i)配列番号8と比較して10個以下のアミノ酸置換;
(ii)配列番号1と比較して2個以下のアミノ酸置換;
(iii)配列番号2と比較して3個以下のアミノ酸置換;
(iv)配列番号4と比較して1個以下のアミノ酸置換;
(v)配列番号5と比較して2個以下のアミノ酸置換;
(vi)配列番号6と比較して7個以下のアミノ酸置換;
(vii)配列番号9と比較して9個以下のアミノ酸置換;
(viii)配列番号10と比較して10個以下のアミノ酸置換;または
(ix)配列番号11と比較して6個以下のアミノ酸置換
を含む、本発明1001または本発明1002のインフルエンザHAポリペプチド。
[本発明1004]
配列番号8の残基2〜566、配列番号1の残基2〜562、配列番号2の残基2〜562、配列番号4の残基2〜562、配列番号5の残基2〜584、配列番号6の残基2〜585、配列番号9の残基2〜566、配列番号10の残基2〜566、または配列番号11の残基2〜566のアミノ酸配列を含む本発明1001のインフルエンザHAポリペプチド。
[本発明1005]
配列番号8の残基2〜566、配列番号1の残基2〜562、配列番号2の残基2〜562、配列番号3の残基2〜562、配列番号4の残基2〜562、配列番号5の残基2〜584、配列番号6の残基2〜585、配列番号7の残基2〜585、配列番号9の残基2〜566、配列番号10の残基2〜566、または配列番号11の残基2〜566のアミノ酸配列からなる本発明1001のインフルエンザHAポリペプチド。
[本発明1006]
配列番号8、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、または配列番号11のアミノ酸配列を含む本発明1002のインフルエンザHAポリペプチド。
[本発明1007]
配列番号8、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、または配列番号11のアミノ酸配列からなる本発明1002のインフルエンザHAポリペプチド。
[本発明1008]
本発明1001〜1007のいずれかのインフルエンザHAポリペプチドをコードする単離核酸分子。
[本発明1009]
前記核酸分子を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化する、本発明1008の単離核酸分子。
[本発明1010]
本発明1008または本発明1009の核酸分子を含むベクター。
[本発明1011]
前記インフルエンザHAポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む本発明1010のベクター。
[本発明1012]
本発明1010または本発明1011のベクターを含む単離細胞。
[本発明1013]
本発明1001〜1007のいずれかのインフルエンザHAポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)。
[本発明1014]
インフルエンザノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、インフルエンザマトリックス(M1)タンパク質、またはその両方をさらに含む本発明1013のインフルエンザVLP。
[本発明1015]
前記HAポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザNAタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザM1タンパク質をコードするベクターで宿主細胞を該HAタンパク質、該M1タンパク質、および該NAタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって生成される、本発明1001〜1007のいずれかのインフルエンザHAポリペプチドを含むインフルエンザVLP。
[本発明1016]
本発明1001〜1007のいずれかのインフルエンザHAポリペプチドを含む融合タンパク質。
[本発明1017]
本発明1001〜1007のいずれかのインフルエンザHAポリペプチド、本発明1013〜1015のいずれかのVLP、または本発明1016の融合タンパク質、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
[本発明1018]
被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する方法であって、本発明1001〜1007のいずれかのインフルエンザHAポリペプチド、本発明1013〜1015のいずれかのVLP、本発明1016の融合タンパク質、または本発明1017の組成物を投与するステップを含む、方法。
[本発明1019]
インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫する方法であって、本発明1013〜1015のいずれかのVLPおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物を前記被験体に投与するステップを含む、方法。
[本発明1020]
前記組成物がアジュバントをさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記組成物を筋肉内投与する、本発明1019または本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記組成物が約1〜約25μgの前記VLPを含む、本発明1019〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記組成物が約15μgの前記VLPを含む、本発明1022の方法。
上記および他の発明の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な記載からより明らかとなる。
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列を、米国特許法施行規則1.822で定義のように、ヌクレオチド塩基については標準的な略語を使用し、アミノ酸については3文字表記を使用して示す。各核酸配列についてたった1つの鎖を示すが、表示の鎖を参照することによって相補鎖が含まれると理解される。本配列表はASCII text ファイル形式として提出され、2013年1月30日に作成され、53.7KBであり、本明細書中に参考として援用される。添付の配列表では、以下を列挙する:
I.略語
COBRA:計算で最適化した広い反応性を示す抗原
HA:血球凝集素
HAI:赤血球凝集阻害
HRP:セイヨウワサビペルオキシダーゼ
M1:マトリックスタンパク質1
NA:ノイラミニダーゼ
PFU:プラーク形成単位
VLP:ウイルス様粒子
別途記載がない限り、技術用語を従来の用法にしたがって使用する。分子生物学における一般用語の定義を、Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Pressによる出版,1994(ISBN 0−19−854287−9);Kendrewら.(編集),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.による出版,1994(ISBN 0−632−02182−9);およびRobert A.Meyers(編集),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.による出版,1995(ISBN 1−56081−569−8)に見出すことができる。
本明細書中で開示されるのは、インフルエンザウイルスに対して広い反応性を示す免疫応答を誘発するための計算で最適化したH2N2、H3N2およびBインフルエンザHAポリペプチドの生成である。上記最適化したHAポリペプチドを、一連のHAタンパク質アラインメント、ならびに選択されたH2N2、H3N2およびBインフルエンザウイルス分離株に基づいて、コンセンサス配列のその後の生成を介して作製した。上記最適化されたHAコンセンサス配列を生成するために使用される方法は、実施例1〜3に記載され、図1〜7に示される。10個の特異的HAポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号1〜11として本明細書に示される。
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するセグメント化負鎖RNAウイルスである。インフルエンザウイルスには3つの型が存在する(A型、B型、およびC型)。A型インフルエンザウイルスは、広範な種々の鳥類および哺乳動物(ヒト、ウマ、海洋哺乳動物、ブタ、フェレット、およびニワトリが含まれる)に感染する。動物では、ほとんどのA型インフルエンザウイルスは、気道および腸管に軽度の限局性感染を引き起こす。しかし、高病原性A型インフルエンザ株(H5N1など)は、家禽類において全身性感染を引き起こし、その死亡率は100%に達し得る。A型インフルエンザに感染した動物は、しばしば、インフルエンザウイルスの保有宿主として働き、一定のサブタイプがヒトへの種の壁を超えることが示されている。
最適化したHA(配列番号1〜11のいずれか1つとして記載のアミノ酸配列を有するHAなど)を含むインフルエンザVLPを本明細書中に提供する。インフルエンザVLPは、一般に、HA、NA、およびM1タンパク質から構成される。インフルエンザVLPの生成は当該分野で記載されており、当業者の能力の範囲内である。例えば、インフルエンザVLPを、HA、NA、およびM1タンパク質をコードするプラスミドでの宿主細胞のトランスフェクションによって生成することができる。タンパク質を発現させるのに適した期間(およそ72時間など)、トランスフェクトした細胞をインキュベートした後、VLPを細胞培養上清から単離することができる。以下の実施例5は、細胞上清からのインフルエンザVLPの例示的な精製プロトコールを提供する。この実施例では、VLPを、低速遠心分離(細胞デブリ除去のため)、真空濾過、および20%グリセロールによる超遠心分離によって単離する。
本明細書中で開示されるCOBRAアミノ酸配列は、逆翻訳され得、コドン使用法およびRNA最適化(GeneArt; Regensburg, Germany)を含め、哺乳動物細胞における発現のために最適化され得る。最適化された核酸配列は、適切な発現ベクター(例えば、pTR600発現ベクター(米国特許出願公開第2002/0106798号; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102−103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242−248, 2001)へと挿入され得る。コドン最適化されたCOBRA遺伝子配列をコードする発現ベクターは、例えば、COBRA HAを含むVLPを生成するために使用され得る。
以下の方法を使用して、COBRA HAを含むインフルエンザVLPを生成し、特徴付けることができる。マウス、フェレット、およびマカクの例示的な免疫方法も以下に記載する(GilesおよびRoss,Vaccine 29(16):3043−3054,2011も参照のこと)。
293T細胞を、M1、NA、および最適化したHAを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトし、37℃で72時間インキュベートする。M1、NA、およびHAのコード配列を、哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化することができる。上清を回収し、細胞デブリを低速遠心分離およびその後の0.22μmの滅菌フィルターによる真空濾過によって除去する。VLPを、超遠心分離(20%グリセロール(重量/容積)にて100,000×g)にて4℃で4時間精製した。次いで、ペレットをPBS(pH7.2)に再懸濁し、1回使用量のアリコートで使用するまで−80℃で保存する。総タンパク質濃度を、Micro BCA(商標)タンパク質アッセイ試薬キット(Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)によって決定する。
HA比含量(specific content)を、ウェスタンブロットおよびデンシトメトリーによって決定することができる。精製組換えCOBRA HAおよび精製VLPを標準的な総タンパク質量で調製し、10%SDS−PAGEゲルにて電気泳動し、PVDF膜に転写する。ブロットをインフルエンザ感染マウス由来のマウスポリクローナル抗血清で探索し、HA−抗体複合体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合体化したヤギ抗マウスIgG(Southern Biotech;Birmingham,AL,USA)を使用して検出する。HRPを化学発光基質(Pierce Biotechnology;Rockford IL,USA)によって検出し、X線フィルム(ThermoFisher;Pittsburgh,PA,USA)に感光する。バンド密度を、ImageJソフトウェア(NIH)を使用して決定する。組換えHAバンドの密度を使用して標準曲線を計算し、精製VLPの密度を、組換えHAからの結果を使用して内挿する。
BALB/cマウス(Mus musculis、雌、6〜8週齢)を、Harlan Sprague Dawley(Indianapolis,IN,USA)から購入することができる。マウスを小型アイソレーターユニットに収容し、飼料および水を自由に利用させ、実験動物のためのUSDAガイドラインにしたがって飼育する。マウスにデンシトメトリーアッセイ由来のHA含量に基づいた3用量の精製COBRA HA VLP(1.5μg、0.3μg、または0.06μg)のうちの1つを筋肉内注射によって0週目にワクチン接種し、次いで、3週目に同一用量で追加免疫する。各用量のワクチンを、ミョウバンアジュバント(Imject Alum,Pierce Biotechnology;Rockford,IL,USA)、CpGオリゴヌクレオチド、またはビヒクルのみを使用して調合する。各ワクチン接種の14〜21日後、麻酔したマウスの後眼窩叢(retro−orbital plexus)から採血し、微量遠心チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−80±5℃で凍結する。各ワクチン群についての赤血球凝集阻害(HAI)血清抗体価を、5週目に代表的な再集合体ウイルスまたはCOBRA HA VLPを使用して決定する。
フィッチフェレット(Mustela putorius furo、雌、6〜12月齢)(インフルエンザナイーブおよび臭腺除去済み)を、Marshall Farms(Sayre,PA,USA)から購入することができる。フェレットをSani−chips実験動物用床敷(P.J.Murphy Forest Products,Montville,NJ,USA)を含むステンレススチール製ケージ(Shor−line,Kansas City,KS,USA)に対で収容する。フェレットに、Teklad Globalフェレット飼料(Harlan Teklad,Madison,WI,USA)および新鮮な水を自由に与える。COBRA HA VLPをPBS(pH7.2)で希釈して最終濃度にする。フェレットに、デンシトメトリーアッセイによって決定したHA含量に基づいた2用量の精製COBRA VLP(15μg、3μg)のうちの1つを筋肉内注射によって0週目に0.25mlの体積で大腿四頭筋にワクチン接種し、次いで、3週目に同一用量で追加免疫する。ワクチンを使用前に−80℃で保存し、使用直前にミョウバンアジュバント(Imject Alum;Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)を使用して調合する。動物をワクチン接種レジメンの間、有害事象(体重減少、熱(temperature)、活動の低下、鼻汁、くしゃみ、および下痢が含まれる)について毎週モニタリングする。ワクチン接種前に、動物をHAIアッセイによって循環A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスについて血清陰性であることを確認する。各ワクチン接種の14〜21日後、麻酔したフェレットの前大静脈から採血し、微量遠心チューブに移す。チューブを遠心分離し、血清を取り出し、−80±5℃で凍結する。各ワクチン群についてのHAI血清抗体価を、5週目に代表的な再集合体ウイルスまたはCOBRA HA VLPを使用して決定する。
カニクイザル(Macaca fascicularis、雄、3〜5歳)を、Harlan Sprague Dawley(Indianapolis、IN、USA)から購入することができる。マカクにデンシトメトリーアッセイ由来のHA含量に基づいた精製COBRA HA VLP(15μg)を筋肉内注射によって0週目にワクチン接種し、次いで、3週目および6週目に同一用量で追加免疫する。ワクチンを、使用直前にミョウバンアジュバント(Imject Alum,Pierce Biotechnology;Rockford,IL,USA)を使用して調合する。各ワクチン接種の21日後、麻酔したマカクの大腿静脈から採血し、血清分離チューブに移す。チューブについて凝固を活性化させ、その後に遠心分離し、血清を取り出し、−80±5℃で凍結する。各ワクチン群についてのエンドポイントIgG力価およびHAI血清抗体価を、5週目に代表的な再集合体ウイルスまたはCOBRA HA VLPを使用して決定する。
Claims (20)
- 組換えインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドであって、
(i)配列番号8の残基2〜566のアミノ酸配列;
(ii)配列番号9の残基2〜566のアミノ酸配列;
(iii)配列番号10の残基2〜566のアミノ酸配列;
(iv)配列番号11の残基2〜566のアミノ酸配列;
(v)配列番号1の残基2〜562のアミノ酸配列;
(vi)配列番号2の残基2〜562のアミノ酸配列;
(vii)配列番号3の残基2〜562を含むアミノ酸配列;
(viii)配列番号4の残基2〜562のアミノ酸配列;
(ix)配列番号5の残基2〜584のアミノ酸配列;
(x)配列番号6の残基2〜585のアミノ酸配列;または
(xi)配列番号7の残基2〜585を含むアミノ酸配列;
を含む組換えインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド。 - (i)配列番号8のアミノ酸配列;
(ii)配列番号9のアミノ酸配列;
(iii)配列番号10のアミノ酸配列;
(iv)配列番号11のアミノ酸配列;
(v)配列番号1のアミノ酸配列;
(vi)配列番号2のアミノ酸配列;
(vii)配列番号3のアミノ酸配列;
(viii)配列番号4のアミノ酸配列;
(ix)配列番号5のアミノ酸配列;
(x)配列番号6のアミノ酸配列;または
(xi)配列番号7のアミノ酸配列;
を含む請求項1に記載のインフルエンザHAポリペプチド。 - 配列番号8の残基2〜566、配列番号9の残基2〜566、配列番号10の残基2〜566、配列番号11の残基2〜566、配列番号1の残基2〜562、配列番号2の残基2〜562、配列番号3の残基2〜562、配列番号4の残基2〜562、配列番号5の残基2〜584、配列番号6の残基2〜585、または配列番号7の残基2〜585のアミノ酸配列からなる請求項1に記載のインフルエンザHAポリペプチド。
- 配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列からなる請求項2に記載のインフルエンザHAポリペプチド。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドをコードする単離核酸分子。
- 前記核酸分子を哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化する、請求項5に記載の単離核酸分子。
- 請求項5または請求項6に記載の核酸分子を含むベクター。
- 前記インフルエンザHAポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結したプロモーターをさらに含む請求項7に記載のベクター。
- 請求項7または請求項8に記載のベクターを含む単離細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドを含むインフルエンザウイルス様粒子(VLP)。
- インフルエンザノイラミニダーゼ(NA)タンパク質、インフルエンザマトリックス(M1)タンパク質、またはその両方をさらに含む請求項10に記載のインフルエンザVLP。
- 前記HAポリペプチドをコードするベクター、インフルエンザNAタンパク質をコードするベクター、およびインフルエンザM1タンパク質をコードするベクターで宿主細胞を該HAタンパク質、該M1タンパク質、および該NAタンパク質を発現させるのに十分な条件下でトランスフェクトすることによって生成される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドを含むインフルエンザVLP。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチドを含む融合タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチド、請求項10〜12のいずれか1項に記載のVLP、または請求項13に記載の融合タンパク質、および薬学的に許容され得るキャリアを含む組成物。
- 被験体におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発するための薬学的組成物であって、請求項1〜4のいずれか1項に記載のインフルエンザHAポリペプチド、請求項10〜12のいずれか1項に記載のVLP、請求項13に記載の融合タンパク質、または請求項14に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
- インフルエンザウイルスに対して被験体を免疫するための薬学的組成物であって、請求項10〜12のいずれか1項に記載のVLPおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む、薬学的組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 筋肉内投与される、請求項16または請求項17に記載の薬学的組成物。
- 約1〜約25μgの前記VLPを含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の薬学的組成物。
- 約15μgの前記VLPを含む、請求項19に記載の薬学的組成物。
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