MX2014009148A - Antigenos ampliamente reactivos computacionalmente optimizados para virus de influenza h3n2, h2n2 y b. - Google Patents

Abstract

Se describe en la presente la generación de polipéptidos HA de influenza H3N2, H2N2 y B optimizados para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva a aislados de virus de influenza. Los polipéptidos HA optimizados se desarrollaron a través de una serie de alineaciones de proteína HA, y la generación subsecuente de secuencias consenso, basadas en aislados de influenza H3N2, H2N2 y B. Se proporcionan en la presente polipéptidos HA de influenza H3N2, H2N2 y B optimizados, y composiciones, proteínas de fusión y VLPs que comprenden los polipéptidos HA. Se proporcionan además secuencias de ácido nucleico optimizadas con codón que codifican los polipéptidos HA. Los métodos para inducir una respuesta inmune contra el virus de influenza en un sujeto también se proporcionan por la presente descripción.

Description

ANTÍGENOS AMPLIAMENTE REACTIVOS COMPUTACIONALMENTE OPTIMIZADOS PARA VIRUS DE INFLUENZA H3N2 , H2N2 Y B CAMPO DE LA INVENCIÓN La descripción se refiere a proteínas de hemaglutinina de influenza optimizadas que inducen respuestas inmunes ampliamente reactivas a los virus de influenza H3N2, H2N2 o B y su uso como vacunas.

ANTECEDENTES El virus de influenza es un miembro de la familia Orthomyxoviridae . Existen tres subtipos de virus de influenza, designados influenza A, influenza B e influenza C. El virión de influenza contiene un genoma de RNA de sentido negativo segmentado, que codifica las siguientes proteínas: hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), matriz (MI), proteína del canal de iones de protones (M2), nucleoproteína (NP) , proteína 1 básica de polimerasa (PB1) , proteína 2 básica de polimerasa (PB2), proteína ácida de polimerasa (PA), y proteína 2 no estructural (NS2) . Las HA, NA, MI y M2 están asociadas a la membrana, mientras que las NP, PB1, PB2, PA, y NS2 son proteínas asociadas a nucleocápside . La proteína MI es la proteína más abundante en las partículas de influenza. Las proteínas HA y NA son glicoproteínas de envoltura, responsables de la unión y penetración del virus de las partículas virales en la célula, y las fuentes de los epítopos inmunodominantes principales para la neutralización del virus e inmunidad protectora. Ambas proteínas HA y NA se consideran los componentes más importantes para las vacunas de influenza profilácticas.

Cada año, la influenza estacional provoca más de 300,000 hospitalizaciones y 36,000 muertes solo en los Estados Unidos (Simonsen y colaboradores, Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). La emergencia del virus de influenza H1N1 novedosa en el 2009 mostró que tan rápido una nueva pandemia de influenza puede extenderse a través del mundo. Las cepas de influenza H3N2 pueden infectar tanto aves como mamíferos y la influenza H3N2 está siendo cada vez más abundante en la influenza estacionaria. La H2N2 es otro subtipo de influenza que ha provocado previamente pandemias humanas. Una cepa H2N2 provocó la pandemia de 1957 en Asia. El virus B de influenza es otro tipo de influenza que infecta humanos y representa una causa significativa de gripe estacionaria, pero no se sabe que provoque pandemias debido a su intervalo de hospedero limitado (humanos y focas) .

Existen actualmente dos procedimientos de vacuna de influenza autorizados en los Estados Unidos - la vacuna fraccionada inactivada y la vacuna del virus atenuada viva. Las vacunas inactivadas pueden inducir eficientemente respuestas inmunes humorales pero generalmente solo respuestas inmunes celulares deficientes. Las vacunas de virus vivo no se pueden administrar a pacientes inmunocomprometidos o embarazadas debido a su riesgo de infección incrementado. De esta manera, existe una necesidad por una vacuna de virus de influenza ampliamente protectora.

BREVE DESCRIPCIÓN Se describe en la presente la generación de polipéptidos HA de influenza H2N2, H3N2 y B computacionalmente optimizados para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva al virus de influenza. Los polipéptidos HA optimizados se desarrollaron a través de una serie de alineaciones de proteina HA, y generación subsecuente de secuencias consenso basadas en 1989 aislados de virus de influenza H2N2, H3N2 y B seleccionados.

Se proporcionan en la presente polipéptidos HA de influenza recombinantes que tienen una secuencia de aminoácidos optimizada para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva contra la influenza H2N2, H3N2 y B. En algunas modalidades, el polipéptido HA comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a SEQ ID NO: 1, por lo menos 99.4% idéntica a SEQ ID NO: 2, por lo menos 99.7% idéntica a SEQ ID NO: 4, por lo menos 99.6% idéntica a SEQ ID NO: 5, por lo menos 98.8% idéntica a SEQ ID NO: 6, por lo menos 99.7% idéntica a SEQ ID NO: 8, por lo menos 98.4% idéntica a SEQ ID NO: 9, por lo menos 97.8% idéntica a SEQ ID NO: 10, por lo menos 98.9% idéntica a SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende no más de 2 sustituciones de aminoácidos relativas con SEQ ID NO: 1; no más de 3 sustituciones de aminoácidos relativas a SEQ ID NO: 2; no más de 1 sustitución de aminoácido relativa a SEQ ID NO: 4: no más de 2 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 5; no más de 7 sustituciones de aminoácido relativa a SEQ ID NO: 6; no más de 10 sustituciones de aminoácido relativa a SEQ ID NO: 8; no más de 9 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 9; no más de 10 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 10; o no más de 6 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 11. En algunas modalidades, el polipéptido HA de influenza carece del residuo de metionina N-terminal.

Las moléculas y vectores de ácido nucleico aislados que codifican los polipéptidos HA recombinantes también se proporcionan por la presente descripción. Se proporcionan además células aisladas que comprenden tales vectores.

También se proporcionan partículas similares a virus de influenza (VLPs) y proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos HA optimizados descritos en la presente .

Se proporcionan adicionalmente composiciones que incluyen los polipéptidos HA de influenza optimizados, proteínas de fusión o VLPs descritas en la presente en un portador farmacéuticamente aceptable. Los métodos para inducir una respuesta inmune contra el virus de influenza en un sujeto al administrar las composiciones descritas, las proteínas de fusión o VLPs también se proporcionan por la presente descripción.

También se proporcionan métodos para inmunizar un sujeto contra el virus de influenza al administrar al sujeto una composición que comprende un VLP que contiene un polipéptido HA optimizado.

Los objetivos, características, y ventajas anteriores y otros de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia COBRA HA de influenza H2N2 de acuerdo con el Método 2 como se describe en el Ejemplo 1.

La FIG. 2 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una Secuencia COBRA HA de influenza H2N2 de acuerdo con el Método 3 como se describe en el Ejemplo 1.

La FIG. 3 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia COBRA HA de influenza B de acuerdo con el Método 2 como se describe en el Ejemplo 2.

La FIG. 4 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia COBRA HA de influenza B de acuerdo con el Método 3 como se describe en el Ejemplo 2.

La FIG. 5 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia de COBRA HA de influenza H3N2 de acuerdo con el Método 1 como se describe en el Ejemplo 3.

La FIG. 6 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia COBRA HA de influenza H3N2 de acuerdo con el Método 2 como se describe en el Ejemplo 3.

La FIG. 7 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia COBRA HA de influenza H3N2 de acuerdo con el Método 3 como se describe en el Ejemplo 3.

La FIG. 8 es una representación esquemática que resume el proceso para generar una secuencia COBRA HA de influenza H3N2 de acuerdo con el Método 4 como se describe en el Ejemplo 3.

LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos listadas en el listado de secuencia acompañante se muestra utilizando abreviaciones de letra estándar para bases de nucleótidos, y código de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Se muestra solo una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero la hebra complementaria se entiende como incluida por cualquier referencia a la hebra mostrada. El listado de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII, creado el 1 de Febrero de 2013, 14.7 KB, que se incorpora a manera de referencia en la presente. En el listado de secuencias acompañante: SEQ ID NOs : 1-4 son secuencias de aminoácidos COBRA para HA de influenza H2N2 SEQ ID NOs: 5-7 son secuencias de aminoácidos COBRA para el HA de influenza B HA.

SEQ ID NOs: 8-11 son secuencias de aminoácidos COBRA para el HA de influenza H3N2 DESCRIPCIÓN DETALLADA I . Abreviaciones COBRA: antígeno ampliamente reactivo computacionalmente optimizado HA: hemaglutinina HAI : inhibición de hemaglutinacion HRP: peroxidasa de rábano picante MI: proteína 1 de matriz NA: neuraminidasa PFU: unidad formadora de placas VLP: partícula similar a virus II . Términos y Métodos A menos que se indique de otra manera, los términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en la biología molecular se pueden encontrar en Benjamín Lewin, Genes V, publicada por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y colaboradores (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehénsive Desk Reference, publicada por VCH Publis ers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) .

A fin de facilitar la revisión de las diversas modalidades de la descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de los términos específicos: Adyuvante : Una sustancia o vehículo que no mejora específicamente la respuesta inmune a un antígeno. Los adyuvantes pueden incluir una suspensión de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio, o fosfato) en los cuales el antígeno se adsorbe; o emulsión de agua en aceite en la cual la solución de antígeno se emulsiona en aceite mineral (por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund) , algunas veces con la inclusión de micobacterias exterminadas (adyuvante completo de Freund) para mejorar adicionalmente la antigenicidad. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores (tales como aquellos que incluyen un motivo CpG) también se pueden utilizar como adyuvantes (por ejemplo, ver patentes de Estados Unidos Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239, 116; 6,339,068; 6, 406,705; y 6, 429, 199). Los adyuvantes también incluyen moléculas biológicas, tales como moléculas co-estimuladoras . Los adyuvantes biológicos ejemplares incluyen IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-?, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L y 41 BBL.

Administrar: Como se utiliza en la presente, la administración de una composición a un sujeto significa dar, aplicar o poner en contacto la composición con el sujeto. La administración se puede lograr por cualquiera de una variedad de vías, tales como, por ejemplo, tópica, oral, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, intratecal e intradérmica .

Anticuerpo: Una molécula de inmunoglobulina producida por células linfoides B con una secuencia de aminoácidos especifica. Los anticuerpos son provocados en humanos u otros animales por un antigeno especifico (inmunógeno) . Los anticuerpos se caracterizan al reaccionar específicamente con el antígeno en alguna vía demostrable, el anticuerpo y antígeno cada uno se define en términos del otro. "Inducir una respuesta de anticuerpo" se refiere a la capacidad de un antígeno u otra molécula para inducir la producción de anticuerpos.

Antigeno: Un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan o absorben en un animal. Un antigeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular especifica, incluyendo aquellas inducidas por inmunógenos heterólogos . En algunas modalidades de las composiciones y métodos descritos, el antigeno es una proteina HA de influenza.

Optimizado con codón: Un ácido nucleico "optimizado con codón" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se ha alterado tal que los codones son óptimos para la expresión en un sistema particular (tal como una especie o grupo particular de especies) . Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico se puede optimizar para la expresión en células de mamífero. La optimización con codón no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

Proteína de fusión: Una proteína generada por la expresión de una secuencia de ácido nucleico diseñada de secuencias de ácido nucleico que codifican por lo menos una porción de dos proteínas diferentes (heterólogas ) . Para crear una proteína de fusión, las secuencias de ácido nucleico pueden estar en el mismo marco de lectura y contienen codones de detección no internos. Por ejemplo, una proteína de fusión puede incluir una HA de influenza fusionada a una proteína heteróloga .

Hemaglutinina (HA) : Una glicoproteína superficial de virus de influenza. La HA media el enlace de la partícula de virus a células hospederas y la entrada subsecuente del virus en la célula hospedera. Las secuencias de nucleótido y aminoácidos de numerosas proteínas HA de influenza son conocidas en la técnica y son públicamente disponibles, tales como a través de la base de datos NCBI Influenza Virus Resource (Bao y colaboradores, J Virol 82:596-601, 2008) . La HA (junto con NA) es una de los dos determinantes antigénicos de virus de influenza principales.

Respuesta inmune : Una respuesta de una célula del sistema inmune, tal como una célula B, célula T, Macrófago o polimorfonucleocito, a un estímulo tal como un antígeno o vacuna. Una respuesta inmune puede incluir cualquier célula del cuerpo implicada en una respuesta de defensa del hospedero, incluyendo por ejemplo, una célula epitelial que secreta un interferón o una citoquina. Una respuesta inmune incluye, pero no se limita a, una respuesta inmune innata o inflamación. Como se utiliza en la presente, una respuesta inmune protectora se refiere a una respuesta inmune que protege un sujeto de infección (previene la infección o previene el desarrollo de enfermedad asociada con la infección) . Los métodos para medir las respuestas inmunes son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, medir la proliferación y/o actividad de linfocitos (tales como células B o células T) , secreción de citoquinas o quimiocinas, inflamación, producción de anticuerpos y similares .

Inmunógeno: Un compuesto, composición, o sustancia que es capaz, bajo condiciones apropiadas, de estimular una respuesta inmune, tal como la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan o absorben en un animal. Como se utiliza en la presente, una "composición inmunogénica" es una composición que comprende un inmunógeno (tal como un polipéptido HA) .

Inmunizar: Para que hacer que un sujeto se proteja de una enfermedad infecciosa, tal como por vacunación.

Virus de influenza: Un virus RNA de hebra negativa segmentado que pertenece a la familia Orthomyxoviridae. Existen tres tipos de virus de influenza, A, B y C. Los virus de influenza A infectan una amplia variedad de aves y mamíferos, incluyendo humanos, caballos, mamíferos marinos, cerdos, hurones o pollos. En los animales, la mayoría de virus de influenza A provocan infecciones localizadas leves del tracto respiratorio intestinal. Sin embargo, las cepas de influenza A sumamente patogénicas, tal como H5N1, provocan infecciones sistémicas en las aves de corral en las cuales la mortalidad puede alcanzar 100%. En el 2009, la influenza H1N1 fue la causa más común de influenza humana. Una nueva cepa de H1N1 de origen porcino surgió en el 2009 y se declaró pandemia por la organización de la salud mundial. Esta cepa fue referida como "gripe porcina". Los virus de influenza A H1N1 también fueron responsable por la pandemia de gripe española en 1918, el brote Fort Dix en 1976, y la epidemia de gripe rusa en 1977-1978. Los virus de influenza H2N2, H3N2 y B también infectan humanos y son agentes causantes de la influenza estacionaria.

Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico, proteina o virus) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos (tal como restos celulares, otras proteínas o ácidos nucleicos) . Los componentes biológicos que se han "aislado" incluyen aquellos componentes purificados por métodos de purificación estándares. El término también abarca ácidos nucleicos recombinantes, proteínas o virus (o VLPs) , así como ácidos nucleicos o péptidos químicamente sintetizados.

Enlazador: Uno o más aminoácidos que sirven como un espaciador entre dos polipéptidos de una proteína de fusión.

Proteina de matriz (MI) : Una proteína estructural de virus de influenza encontrada dentro de la envoltura viral. MI se cree que funciona en el ensamblaje y gemación.

Neuraminidasa (NA) : una glicoproteína de membrana de virus de influenza. NA se implica en la destrucción del receptor celular para la HA viral al escindir los residuos de ácido siálico terminales de las porciones de carbohidratos sobre las superficies de las células infectadas. NA también escinde los residuos de ácido siálico de las proteínas virales, previniendo la agregación de virus. NA (junto con HA) es uno de los dos determinantes antigénicos de virus de influenza principales.

Operablemente enlazado: Una primera secuencia de ácido nucleico se enlaza operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de' ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Generalmente, la secuencias de DNA operablemente enlazadas son contiguas y, donde e necesario se unen a dos regiones de codificación de proteína, en el mismo marco de lectura.

Proteina HA de influenza optimizada: Como se utiliza en la presente, "proteína HA de influenza optimizada" se refiere a una secuencia consenso de proteína HA generada por las alineaciones de secuencia de aislados de virus de influenza H3N2, H2N2 o B (como se describe en los ejemplos 1 y 3 posteriores). Las secuencias de nucleótido que codifican las proteínas optimizadas se optimizan adicionalmente para la expresión en células de mamífero a través de la optimización con codón y optimización de RNA (tal como para incrementar la estabilidad del RNA) . Las proteínas HA de influenza optimizadas y descritas en la presente (y expuestas en la presente como SEQ ID NO: 1-11) también son referidas como secuencias "COBRA" (antigeno ampliamente reactivo computacionalmente optimizado) . Los polipéptidos optimizados se diseñan para inducir respuestas inmunes ampliamente reactivas en un sujeto. En el contexto de la presente descripción "ampliamente reactivo" significa que la secuencia de proteina induce una respuesta inmune en un sujeto que es suficiente para inhibir, neutralizar o prevenir la infección de una amplia gama de virus de influenza (tal como mayoría o todos los virus de influenza dentro de un subtipo específico) . En algunos casos, la proteína HA de influenza optimizada es capaz de inducir una respuesta inmune, tal como una respuesta inmune protectora, contra la mayoría o todos los aislados de virus de influenza H3N2, la mayoría o todos los aislados de virus de influenza H2N2 o la mayoría o todos los aislados de virus de influenza B.

Brote : Como se utiliza en la presente, un "brote" de virus de influenza se refiere a una recolección de varios virus desde dentro de un solo país en un año dado.

Vehículos farmacéuticamente aceptables: Los portadores (vehículos) farmacéuticamente aceptables útiles en esta descripción son convencionales. Remington ' s Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para la administración farmacéutica de una o más composiciones terapéuticas, al como una o más vacunas de influenza y agentes farmacéuticos adicionales.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplea. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden usualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones de sal balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol o similar como un vehículo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, formas en polvo, pastilla, tableta o cápsula) , los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se administran pueden contener menores cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores, y agentes amortiguadores de pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitan.

Polipéptido: Un polímero en el cual los monómeros son residuos de aminoácido que se unen a través de enlaces de amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, ya sea el isómero L-óptico o el isómeros D-óptico se pueden utilizar. Los términos "polipéptido" o "proteína" como se utiliza en la presente se proponen para abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluye secuencias modificadas tales como glicoproteinas . El término "polipéptido" se propone específicamente para cubrir proteínas de origen natural, así como aquellas que se producen recombinante o sintéticamente. El término "residuo" o "residuo de aminoácido" incluye referencias a cualquier aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido.

Las sustituciones de aminoácido conservadora son aquellas sustituciones que, cuando se hacen, interfieren menos con las propiedades de la proteína original, es decir, la estructura y especialmente la función de la proteína se conserva y no se cambia significativamente por tales sustituciones. Ejemplos de sustituciones conservadoras se muestran a continuación.

Las sustituciones conservadoras mantienen generalmente (a) la estructura de la cadena principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral.

Las sustituciones que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la proteína no serán conservadoras, por ejemplo los cambios en los cuales (a) un resido hidrofílico, por ejemplo, serilo o treonilo, se sustituye por (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o por) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histadilo, se sustituye por (o por) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o por) uno que no tenga una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Prevenir, tratar o mejorar una enfermedad: "Prevenir" una enfermedad se refiere a la inhibición del desarrollo completo de una enfermedad. "Tratar" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. "Mejorar" se refiere a la reducción del número de gravedad de signos o síntomas de una enfermedad .

Promotor: Un promotor es un arreglo de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distantes. Un "promotor constitutivo" es un promotor que es continuamente activo y no está sujeto a la regulación por las señales o moléculas externas. En contraste, la actividad de un "promotor inducible" se regula por una señal o molécula externa (por ejemplo, un factor de transcripción) . En algunas modalidades en la presente, el promotor es un promotor CMV.

Purificado: El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se propone como un término relativo. De esta manera, por ejemplo, un péptido purificado, proteina, virus, VLP u otro compuesto activo es uno que se aisla en totalidad o en parte de las proteínas naturalmente asociadas y otros contaminantes. En ciertas modalidades, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, proteína, virus, VLP u otro compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo celular, u otra preparación cruda y sometida a fraccionamiento para remover varios componentes de la preparación inicial, tal como proteínas, puestos celulares y otros componentes.

Recombinante : Un ácido nucleico recombinante, proteína, virus o VLP es uno que tiene una secuencia que no es de origen natural o tiene una secuencia que se elabora por una combinación artificial de dos, de otra manera segmentos separados de secuencia. Esta combinación artificial se logra frecuentemente por síntesis química o por la manipulación artificial de los segmentos aislados de los ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética.

Identidad de secuencia: La similitud entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se expresa en términos de similitud entre las secuencias, de otra manera referida como identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología) ; entonces es más alto el porcentaje, son más similares las dos secuencias. Los homólogos o variantes de un gen o proteína dados poseerán relativamente un alto grado de identidad de secuencia cuando se alinean utilizando métodos estándares.

Lo métodos de alineación de las secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153, 1989; Corpet y colaboradores, Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; y Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:2444, 1988. Altschul y colaboradores, Nature Genet. 6: 119-129, 1994.

The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLASTMR) (Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) es disponible de varias fuentes, incluyendo National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, D) y en el Internet, para el uso en relación con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx.

Sujeto : Organismos vertebrados multi-celulares y vivos, una categoría que incluye tanto mamíferos humanos como no humanos, tales como primates no humanos.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Una cantidad de un agente especificado suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto que se trata con ese agente. Por ejemplo, esto puede ser la cantidad de una vacuna de virus de influenza útil para inducir una respuesta inmune en un sujeto y/o para prevenir la infección o enfermedad provocada por el virus de influenza. Idealmente, en el contexto de la presente descripción, una cantidad terapéuticamente efectiva de una vacuna de influenza es una cantidad suficiente para incrementar resistencia a, prevenir, mejorar, y/o tratar la infección provocada por el virus de influenza en un sujeto sin provocar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. La cantidad efectiva de una vacuna de influencia útil para incrementar la resistencia a, prevenir, mejorar, y/o tratar la infección de un sujeto dependerá en, por ejemplo, el sujeto que se trata, la manera de administración de la composición terapéutica y otros factores.

Transformada: Una célula transformada es una célula en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico por técnicas de biología molecular. Como se utiliza en la presente, el término transformación abarca todas las técnicas por las cuales una molécula de ácido nucleico se puede introducir en tal célula, incluyendo transfección con vectores virales, transformación con vectores plásmidos, e introducción de DNA desnudo por electroporacion, lipofección, y aceleración de pistola de partículas.

Vacuna: Una preparación de material inmunogénico capaz de estimular una respuesta inmune, administrada para la prevención, mejora, o tratamiento de la enfermedad, tal como una enfermedad infecciosa. El material inmunogénico puede incluir, por ejemplo, microorganismos atenuados o exterminados (tales como virus atenuados) , o proteínas antigénicas (incluyendo VLPs) , péptidos o DNA derivados de los mismos. Las vacunas pueden inducir respuestas tanto profilácticas (conservadoras) como terapéuticas. Los métodos de administración varían de acuerdo con la vacuna, pero pueden incluir inoculación, ingestión, inhalación u otras formas de administración. Las inoculaciones se pueden administrar por cualquiera de una variedad de vías, incluyendo parenteral, tal como intravenosa, subcutánea o intramuscular. Las vacunas se pueden administrar con un adyuvante para reforzar la respuesta inmune.

Vector: Un vector es una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin alterar la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula hospedera. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permite replicarse en una célula hospedera, tal como un origen de replicación. Un vector de inserción es capaz de insertarse en un ácido nucleico hospedero. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y traducción de un gen o genes insertados. En algunas modalidades de la presente descripción, el vector codifica una proteína HA, NA o Mi de influenza. En algunas modalidades, el vector es el vector de expresión pTR600 (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2002/0106798; Ross y colaboradores, Nat Immunol. 1(2): 102-103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine 20:242-248, 2001) .

Partícula similar a virus (VLP) : Las partículas de virus constituidas de una de más proteínas estructurales virales, pero que carecen del genoma viral, debido a que las VLPs carecen de un genoma viral, no son infecciosas. Además, las VLPs se pueden producir frecuentemente por expresión heteróloga y se pueden purificar fácilmente. La mayoría de VLPs comprenden por lo menos una proteína de núcleo viral que conduce la gemación y liberación de las partículas de una célula hospedera. Un ejemplo de tal proteína de núcleo es la Mi de influenza. En algunas modalidades en la presente, una VLP de influenza comprende las proteínas HA, NA y/o MI. Las VLPs de influenza se pueden producir por transfección de células hospederas con plásmidos que codifican las proteínas HA y NA, y opcionalmente la proteína MI. Después de la incubación de las células transíectadas por un tiempo apropiado para permitir la expresión de la proteina (tal como aproximadamente 72 hora) , las VLPs se pueden aislar de sobrenadantes de cultivo celular. El Ejemplo 5 proporciona un protocolo ejemplar para purificar las VLPs de influenza de los sobrenadantes celulares. En este ejemplo, las VLPs se aislan por centrifugación de baja velocidad (para remover los restos celulares) , filtración en vacio y ultracentrifugación a través de 20% de glicerol. Otros métodos para producir las VLPs de influenza son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos Nos. 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769; y 2010/0239610) .

A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica la cual está descripción pertenece. Los términos singulares "un" "uno", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. "Que comprende A o B" significa que incluye A, o B, o A y B. Se va a entender adicionalmente que todos los tamaños bases o tamaños de aminoácido, y todo el peso molecular o valores de masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente descripción, los métodos y materiales adecuados se describen a continuación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan a manera de referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo explicaciones de los términos, lo controlarán. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se proponen para ser limitantes .

III . Estudio General de Varias Modalidades Se describe en la presente la generación de polipéptidos HA de influenza H2N2, H3N2 y B computacionalmente optimizados para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva al virus de influenza. Los polipéptidos HA optimizados se desarrollaron a través de una serie de alineaciones de proteínas HA, y la generación subsecuente de las secuencias consenso basadas en aislados de virus de influenza H2N2, H3N2 y B. Los métodos utilizados para generar las secuencias consenso HA optimizadas se describen en los Ejemplos 1-3, y muestran en las FIGS. 1-7. Las secuencias de aminoácidos de 10 polipéptidos HA específicos se exponen en la presente como SEQ ID NO: 1-11.

Se proporcionan en la presente polipéptidos HA de influenza que tienen una secuencia de aminoácidos optimizada para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva contra la influenza H2N2, H3N2 y B. En algunas modalidades, el polipéptido HA comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 1; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.4% idéntica a los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 3; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.7% idéntica a los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 4; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a los residuos 2-584 de SEQ ID NO: 5; una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.8%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-585 de SEQ ID NO: 6; una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-585 de SEQ ID NO: 7; una secuencia de aminoácidos por lo menos 97.7%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8; una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.4%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 9; una secuencia de aminoácidos por lo menos 97.8%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 10; una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.9%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 11.

En ejemplos específicos, la secuencia de aminoácidos del polipéptido HA comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 1, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 2, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 3, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 4, residuos 2-584 de SEQ ID NO: 5, residuos 2-585 de SEQ ID NO: 6, residuos 2-585 de SEQ ID NO: 7, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 9 residuos 2-566 de SEQ ID NO: 10 o residuos 2-566 de SEQ ID NO: 11.

En algunas modalidades, el polipéptido HA de influenza comprende: una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a SEQ ID NO: 1; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.4% idéntica a SEQ ID NO: 2; la secuencia de aminoácidos de de SEQ ID NO: 3; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.7% idéntica a SEQ ID NO: 4; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a SEQ ID NO: 5; una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.8%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 6; la secuencia de aminoácidos de de SEQ ID NO: 7; una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.7% idéntica a SEQ ID NO: 8; una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.4%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 9; una secuencia de aminoácidos por lo menos 97.8%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 10; o una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.9%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 11.

En algunos ejemplos, la secuencia de aminoácidos de los péptidos HA es más idéntica que los porcentajes de identidades descritos en lo anterior. En otros ejemplos, la secuencia de aminoácidos comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

En algunas modalidades, el polipéptido HA comprende: no más de 2 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 1; no más de 3 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 2; no más de 1 sustitución de aminoácido relativa a SEQ ID NO: 4; no más de 2 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 5; no más de 7 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 6; no más de 10 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 8 ; no más de 9 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 9; no más de 10 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 10; o no más de 6 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 11. En algunos ejemplos, la sustitución de aminoácido es una sustitución conservadora. En algunos ejemplos, la sustitución de aminoácido es una sustitución no conservadora. En otros ejemplos, el número de sustituciones relativas con las secuencias identificadas es menor que el número de sustituciones identificadas en lo anterior .

Se proporcionan adicionalmente moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido HA de influenza recombinante descrito en la presente. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico es optimizada por codón para la expresión en células de mamífero. La molécula de ácido nucleico se optimiza opcionalmente además para la estabilidad del RNA.

Los vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos HAs recombinantes también se proporcionan por la presente descripción. El vector puede ser cualquier vector adecuados para la expresión del polipéptido HA, tal como un vector de expresión de mamífero. En ejemplos particulares, el vector es el vector de expresión pTR600 (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2002/0106798, incorporado en la presente a manera de referencia; Ross y colaboradores, Nat Immunol. 1(2): 102-103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine 20:242-248, 2001) .

En algunos ejemplos, el vector incluye un promotor operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido HA. En ejemplos particulares, el promotor es un promotor CMV.

También se proporcionan células aisladas que comprenden los vectores descritos. En algunos casos, la célula es cualquier tipo de célula adecuada para la producción y expresión de las VLPs, tal como una célula de mamífero.

Se proporcionan además VLPs de influenza que comprenden un polipéptido HA descrito en la presente. Las VLPs de influenza pueden incluir además cualquiera de las proteínas de influenza adicional necesarias para formar la partícula de virus. En algunas modalidades, las VLPs de influenza incluyen además la proteína neuraminidasa (NA) de influenza, la proteína de matriz de influenza (MI) o ambas.

También se proporcionan VLPs de influenza que comprenden un polipéptido HA de influenza descrito en la presente, producido al transfectar una célula hospedera con un vector que codifica el polipéptido HA, un vector que codifica una proteína NA de influenza y un vector que codifica una proteína MI de influenza bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de las proteínas HA, MI y NA.

Las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido HA de influenza optimizado se proporcionan además por la presentes descripción.

También se proporcionan en la presente composiciones que comprenden una proteína HA de influenza optimizada como se describe en la presente, o una proteina de fusión o VLP que comprende la proteina HA de influenza optimizada. En algunas modalidades, las composiciones comprenden además un portador y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el adyuvante puede ser alumbre, adyuvante completo de Freund, un adyuvante biológico u oligonucleótidos inmunoestirauladores (tales como oligonucleótidos CpG) .

Se proporciona además un método para inducir una respuesta inmune al virus de influenza en un sujeto al administrar una proteina HA de CpG influenza optimizada, una proteina de fusión que comprende una HA de influenza optimizada, VLPs que contienen una HA de influenza optimizada, o composiciones de las mismas, como se describen en la presente. En algunas modalidades, el virus de influenza es un virus de influenza H3N2, H2N2 o B. En algunas modalidades, la proteina HA, la proteina de fusión HA o VLP se pueden administrar utilizando cualquier vía de administración adecuada, tal como por ejemplo, intramuscular, intranasal u oral. En algunas modalidades, la proteina HA, la proteina de fusión o VLP se administra como una composición que comprende además un portador y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el adyuvante puede ser alumbre, adyuvante completo de Freund, un adyuvante biológico u oligonucleótidos inmunoestimuladores (tal como oligonucleótidos CpG) .

También se proporciona un método para inmunizar un sujeto contra el virus de influenza al administrar al sujeto VLPs que contienen una proteina HA de influenza optimizada descrita en la presente, o al administrar una composición de la misma. En algunas modalidades del método, la composición comprende además un portador y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el adyuvante puede ser alumbre, adyuvante completo de Freund, adyuvante biológico u oligonucleótidos inmunoestimuladores (tales como oligonucleótidos CpG) . En algunas modalidades, las VLPs (o composiciones de las mismas) se administran intramuscularmente .

En algunas modalidades de los métodos para inducir una respuesta inmune o inmunizar un sujeto, al sujeto se le administra aproximadamente 1 a aproximadamente 25 g de las VLPs que contienen una proteina HA optimizada. En ejemplos particulares, al sujeto se le administra aproximadamente 5 a aproximadamente 20 µg de las VLPs, o aproximadamente 10 a aproximadamente 15yg de las VLPs. En un ejemplo no limitante especifico, el sujeto se le administra aproximadamente 15 pg de las VLPs. Sin embargo, una persona de experiencia en la técnica es capaz de determinar una cantidad terapéuticamente efectiva (por ejemplo una cantidad que proporciona protección contra la infección por virus de influenza H3N2, H2N2 o B) de las VLPs para administrarlas a un sujeto.

IV . Influenza Los virus de influenza son virus de RNA de hebra negativa segmentados que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae . Existen tres tipos de virus de influenza, A, B y C. Los virus de influenza A infectan una variedad de aves y mamíferos, incluyendo humanos, caballos, mamíferos marinos, cerdos, hurones y pollos. En los animales, la mayoría de virus de influenza A provocan infecciones localizadas leves del tracto respiratorio e intestinal. Sin embargo, las cepas de influenza A sumamente patogénicas, tal como H5N1, provocan infecciones sistémicas en las aves de corral en las cuales la mortalidad puede alcanzar 100%. Los animales infectados con influenza A actúan frecuentemente como un depósito para los virus de influenza y ciertos subtipos han mostrado que cruzan la barrera de especie a humanos .

Los virus de influenza A se pueden clasificar en subtipos basados en variaciones alélicas en las regiones antigénicas de dos genes que codifican las glicoproteínas superficiales, particularmente, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que son requeridas para la unión viral y liberación celular. Actualmente, dieciséis subtipos de variantes antigénicas HA (H1-H16) y nueve NA (N1-N9) son conocidos para el virus de influenza A. previamente, solo tres subtipos son conocidos para circular en los humanos (H1N1, H1N2, y H3N2) . Sin embargo, en años recientes, el subtipo H5N1 patogénico de la influenza aviar A se ha reportado que cruza la barrera de las especies se infecta a humanos como es documentado en Hong Kong en 1997 y 2003, conduciendo la muerte de varios pacientes.

Los virus de influenza B provocan el mismos espectro de la enfermedad como los virus de influenza A. sin embargo, los virus de influenza B no provocan pandemias, que es probable la consecuencia del intervalo de hospederos limitado de este virus (humanos y focas) , lo cual limita la generación de nuevas cepas por reordenamiento. Los virus de influenza B provocan morbidez significativa; en los Estados Unidos en el 2008, aproximadamente un tercio de todos los casos confirmados por laboratorio de influenza fueron provocados por influenza B. De esta manera, la vacuna de influenza trivalente estacionaria actual contiene un componente de influenza B.

En el 2009, la influenza H1N1 fue la causa más común de influenza humana. Una nueva cepa de H1N1 de origen porcino surgió en el 2009 y se declaró pandémica por the World Health Organization . Esta cepa fue referida como "fiebre porcina". Los virus de influenza A H1N1 también fueron responsables por la pandemia de gripe española en 1918, el brote Fort Dix en 1976, y la epidemia de gripe Rusa en 1977-1978.

El genoma segmentado de virus de influenza contiene ocho segmentos del gen de RNA de sentido negativo (nsRNA) (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) que codifican por lo menos diez polipéptidos, incluyendo las proteínas de RNApolimerasa dirigida a RNA ( PB2 , PBl y PA) , nucleoproteína (NP) , neuraminidasa (NA), hemaglutinina (subunidades HA1 y HA2 ) , las proteínas de matriz (MI y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2) (Krug y colaboradores, In "The Influenza Viruses", R. M. Krug, ed., Plenum Press, N.Y., 1989, pp. 89 152) .

La capacidad del virus de influenza para provocar la enfermedad propagada es debido a su capacidad de evadir el sistema inmune al someterse al cambio antigénico, que se cree que se presenta cuando un hospedero se infecta simultáneamente con tanto un virus de influenza animal como un virus de influenza humano. Durante la mutación y redistribución en el hospedero, el virus puede incorporar un gen de proteína superficial HA y/o NA de otro virus en su genoma, produciendo de esta manera un nuevo subtipo de influenza y evadiendo el sistema inmune.

La HA es una glicoproteína superficial viral que comprende generalmente de aproximadamente 560 aminoácidos y representa 25% de la proteína de virus total. Es responsable por la adhesión por la partícula viral a, y su penetración en, una célula hospedera en las etapas tempranas de infección. La escisión del precursor del virus HAO en los sub-fragmentos HA1 y HA2 es una etapa necesaria a fin de que el virus infecte una célula. De esta manera, es requerida la escisión a fin de convertir nuevas partículas de virus en una célula hospedera en los viriones capaces de infectar nuevas células. La escisión se sabe que se presenta al transporte de la proteína de membrana HAO integral del retículo endoplásmico de la célula infectada a la membrana plasmática. En el curso del transporte, la hemaglutinina se somete a una serie de modificaciones co- y pos-traduccionales incluyendo escisión proteolítica de la HA precursora en el fragmento amino-terminal HA1 y el HA2 de carboxi-terminal . Una de las principales dificultades en el crecimiento de las cepas de influenza en el cultivo de tejido primario en las líneas de células establecidas surge del requisito para la activación de la escisión proteolítica de la hemaglutinina de influenza en la célula hospedera.

Aunque se sabe que una HA no escindida puede mediar la unión del virus a sus receptores que contienen ácido neuramínico sobre una superficie celular, no es capaz de la siguiente etapa en el ciclo infeccioso, que es la fusión. Se ha reportado que la exposición de la aminoterminal hidrofóbica de HA2 por la escisión es requerida de modo que se puede insertar en la célula objetivo, formando de esta manera un puente entre el virus y la membrana de célula objetivo. Este proceso seguido por la fusión de las dos membranas y la entrada del virus en la célula objetivo.

La activación proteolitica de la HA implica la escisión en un residuo de arginina por una endoproteasa similar a tripsina, que es frecuentemente una enzima intracelular que es dependiente de calcio y tiene un pH neutro óptimo. Puesto que las proteasas de activación son enzimas celulares, el tipo de célula infectada determina si la HA es escindida. La HA de los virus de influenza de mamífero y los virus de influenza aviar no patogénicos son susceptibles a la escisión proteolitica solo en un número restringido de tipos de células. Por otra parte, la HA de los virus aviar patogénicos entre los subtipos H5 y H7 se escinden por las proteasas presentes en una amplia gama de diferentes células hospederas. De esta manera, existen diferencias en el intervalo hospedero que resulta de las diferencias en la capacidad de escisión de la hemaglutinina que se correlaciona con las propiedades patogénicas del virus.

La neuraminidasa (NA) es una segunda glicoproteínas de membrana de los virus de influenza. La presencia de la NA viral se ha mostrado que es importante para generar una respuesta inmune protectora de múltiples facetas contra un virus infeccioso. Para la mayoría de virus de influenza A, la NA es de 413 aminoácidos en longitud, y se codifica por un gen de 1413 nucleótidos. Nueve subtipos diferentes de NA se han identificado en los virus de influenza (Ni, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y N9) , todos de los cuales se han encontrado entre las aves silvestres. La NA se implica en la destrucción del receptor celular para la HA viral al escindir los residuos de ácido neuraminico terminal (también llamado ácido siálico) de porciones de carbohidratos sobre las superficies de las células infectadas. La NA también escinde los residuos de ácido siálico de las proteínas virales, previniendo la agregación de virus. Utilizando este mecanismo, se hipotetiza que la NA facilita la liberación de la progenie viral al prevenir que las partículas virales recientemente formadas se acumulen a lo largo de la membrana celular, así como al promover el transporte del virus a través de la mucosa presente sobre la superficie de la mucosa. La NA es un determinante antigénico importante que se somete a variación antigénica .

Además de las proteínas superficiales HA y NA, el virus de influenza comprende seis genes internos adicionales, que dan origen a ocho proteínas diferentes, incluyendo genes de polimerasa PB1, PB2 y PA, proteínas de matriz MI y M2, nucleoproteína (NP) , proteínas no estructurales NS1 y NS2 (Horimoto y colaboradores, Clin Microbiol Rev. 14 (1) : 129-149, 2001) .

A fin de ser empacado en viriones de progenie, el RNA se transporta del núcleo como un complejo de ribonucleoproteina (RNP) compuesto de tres proteínas de polimerasa de virus de influenza, la nucleoproteína (NP) , y el RNA viral, en asociación con la proteina de matriz 1 (MI) del virus de influenza y la proteína de exportación nuclear (Marsh y colaboradores, J Virol, 82:2295-2304, 2008). La proteína MI que se sitúa dentro de la envoltura se cree que funciona en el ensamblaje y gemación. Un número limitado de proteínas M2 se integran en los viriones (Zebedee, J. Viroi. 62:2762-2772, 1988). Forman tetrámeros que tienen actividad de canal de ión H+ y se activan por el pH bajo en los endosomas, acidifican el interior del virión, facilitando su descubrimiento (Pinto y colaboradores, Cell 69:517-528, 1992) . La amantadina es un fármaco anti-influenza que previene la infección viral al interferir con la actividad de canal de ión M2 inhibiendo de esta manera el descubrimiento del virus.

La NSl, una proteína no estructural, tiene múltiples funciones, incluyendo la regulación del empalme y exportación nuclear de los mRNAs celulares así como la estimulación de la traducción. La función principal de la NSl parece que es contrarrestar la actividad del interferón del hospedero, puesto que un virus desactivado NSl fue viable aunque se desarrolló menos eficientemente que el virus precursor en las células no defectuosas de interferón (García-Sastre, Virology 252 : 324-330, 1998).

La NS2 se ha detectado en las partículas de virus (Richardson y colaboradores, Arch. Virol. 116:69-80, 1991; Yasuda y colaboradores, Virology 196:249-255, 1993). El número promedio de las proteínas NS2 en una partícula de virus se estimó que es 130-200 moléculas. Un ensayo de enlace in vitro muestra el contacto de proteína-proteína directo entre MI y NS2. Los complejos NS2-M1 también se han detectado por la inmunoprecipitación en los lisados de células infectadas por virus. La proteína NS2 se cree que desempeña una función en la exportación de RNP del núcleo a través de la interacción con la proteína MI (Ward y colaboradores, Arch. Virol. 140:2067-2073, 1995).

VI. VLPs de Influenza y Administración de las Mismas Las VLPs de influenza que comprenden una HA optimizada (tal como la HA que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como cualquiera de SEQ ID NO: 1-11) se proporcionan en la presente. Las VLPs de influenza están generalmente constituidas de las proteínas HA, NA y MI . La producción de las VLPs de influenza se ha descrito en la técnica y está dentro de las capacidades de una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, las VLPs de influenza se puede producir por la transfección de las células hospederas con los plásmidos que codifican las proteínas HA, NA y Mi. Después de la incubación de las células transíectadas por un tiempo apropiado para permitir la expresión de la proteína (tal como por aproximadamente 72 horas) , las VLPs se pueden aislar de los sobrenadantes de cultivo celular. El Ejemplo 5 a continuación proporciona un protocolo ejemplar para purificar las VLPs de influenza de los sobrenadantes celulares. En este ejemplo, las VLPs se aislan por centrifugación de baja velocidad (para remover los restos celulares) , filtración al vacío y ultracentrifugación a través de 20% de glicerol.

Las VLPs de influenza descritas en al presente se pueden utilizar como vacunas de influenza para inducir una respuesta inmune protectora contra los virus de influenza H3N2, H2N2, así como virus de influenza B.

Las VLPs de influenza, o composiciones de las mismas, se pueden administrar a un sujeto mediante cualquiera de las vías normalmente utilizadas para introducir un virus recombinante en un sujeto. Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , parenteral, intravenosa, subcutánea, vaginal, rectal, intranasal, por inhalación u oral. La administración parenteral, tal como subcutánea, administración intravenosa o intramuscular, se logra generalmente por inyección. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones liquidas o suspensiones, formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en liquido antes de la inyección, o como emulsiones. Las soluciones y suspensiones de inyección se pueden preparar de polvos estériles, gránulos, y tabletas de la clase previamente descrita. La administración puede ser sistémica o local.

Las VLPs de influenza, o composiciones de las mismas, se administran en cualquier manera adecuada, tal como con portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente descripción.

Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ásteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluye reabastecedores de fluido y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer) , y similares. Los conservadores y otros aditivos también se pueden estar presentes tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, y gases inertes y similares.

Algunas de las composiciones se pueden administrar potencialmente como una sal de adición ácida o base farmacéuticamente aceptable, formada por la reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico, y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido fumárico, o por la reacción con una base inorgánica tal como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, y bases orgánicas tal como mono-, di-, trialquil-y aril-aminas y etanolaminas sustituidas.

La administración se puede lograr por una sola o múltiples dosis. La dosis administrada a un sujeto en el contexto de la presente descripción debe ser suficiente para inducir una respuesta terapéutica benéfica en un sujeto a través del tiempo, o para inhibir o prevenir la infección por virus de influenza H3N2, H2N2 o B. La dosis requerida variará de sujeto a sujeto a sujeto dependiendo de la especie, edad, peso y condición general del sujeto, la gravedad de la infección que se trata, la composición particular que se utiliza y su modo de administración. Una dosis apropiada se puede determinar por una persona de experiencia ordinaria en la técnica utilizando solo experimentación de rutina.

Se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de las VLPs de influenza solas o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. El portador y composición pueden ser estériles, y la formulación se adapta al modo de administración. La composición también puede contener menores cantidades de agentes de humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores de pH. La composición puede ser una solución liquida, suspensión, emulsión, tableta, pastilla, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos . Las formulaciones orales pueden incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, y carbonato de magnesio. Cualquiera de los portadores farmacéuticos comunes, tal como solución salina estéril o aceite de ajonjolí, se pueden utilizar. El medio también puede contener materiales adjuntos farmacéuticos convencionales tales como, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la presión osmótica, soluciones amortiguadoras, conservadores y similares. Otros medios que se pueden utilizar con las composiciones y métodos proporcionados en la presente son solución salina normal y aceite de ajonjolí.

Las VLPs de influenza descritas en la presente se pueden administrar solas o en combinación con otros agentes terapéuticos para mejorar la antigenicidad. Por ejemplo, las VLPs de influenza se pueden administrar con un adyuvante, tal como adyuvante incompleto de Freund o adyuvante completo de Freund .

Opcionalmente, una o más citoquinas, tales como IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-a, o IFN-?, uno o más de factores de crecimiento, tales como GM-CSF o G-CSF; una o más moléculas tales como OX-40L o 41 BBL, o combinaciones de estas moléculas, se pueden utilizar como adyuvantes biológicos (ver, por ejemplo, Salgaller y colaboradores, 1998, J. Surg. Oncol. 68(2): 122-38; Lotze y colaboradores, 2000, Cáncer J. Sci. Am. 6(Suppl l):S61-6; Cao y colaboradores, 1998, Stem Cells 16(Suppl l):251-60; Kuiper y colaboradores, 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Estas moléculas se pueden administrar sistémicamente (o localmente) al hospedero.

Una variedad de medios para inducir las respuestas celulares, tanto in vitro como in vivo, son conocidos. Los lipidos se han identificado como agentes capaces de ayudar en el cebado de CTL in vivo contra varios antigenos. Por ejemplo, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,662,907, los residuos de ácido palmitico se pueden unir a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo de lisina y luego enlazarse (por ejemplo, a través de uno o más residuos de enlace, tal como glicina, gliciona-glicina, serina, serina-serina, o similares) a un péptido inmunogénico . El péptido lipidado luego se puede inyectar directamente en una forma micelar, incorporada en un liposoma, o emulsificado en un adyuvante. Como otro ejemplo, las lipoproteinas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina se pueden utilizar para cebar la CTL especifica de tumor cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (ver, Deres y colaboradores, Natura 342:561, 1989). Ya que la inducción de los anticuerpos neutralizantes también se puede cebar con la misma molécula conjugada a un péptido que muestra un epitopo apropiado, se pueden combinar dos composiciones para inducir respuestas tanto humorales como mediadas por células donde se considere deseable.

Aunque la administración de las VLPs que contienen una proteina COBRA HA se ejemplifica en la presente, una persona de experiencia en la técnica entendería que es posible administrar la proteína HA de influenza sola (en ausencia de una partícula viral) o como una proteína de fusión para inducir una respuesta inmune a un sujeto. En algunas modalidades, un fragmento de la proteína HA se administra tal como el sub-fragmento HAl o HA2.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características particulares y/o modalidades descritas .

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Generación de secuencias COBRA de Influenza H2N2 Este ejemplo describe la generación de cuatro secuencias HA COBRA de influenza H2N2 que utiliza cuatro métodos diferentes.

Para generar la secuencia HA COBRA de influenza H2N2 acuerdo con el Método 1, se generó una secuencia consenso HA utilizando las cepas 59 H2N2 aisladas de 1957-1968. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 1 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 1: MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHA DILEKTHN GKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLRVPEWSYIMEKENPRDGLC YPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSF FRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDETEQRTLYQN VGTYVSVSTSTLNKRSTPEIATRPKVNGLGSRMEFSWTLLDMWDTINFESTG NLIAPE YG FKIS KRGS SGIMKTEGTLGNCET CQTPLG AINTTLPFHN VHPLTI GECPKYVKSE LVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG YHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITN VNSVIEICMNTQFEAVGKEFSNLE RRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYD VR MQLRDNV ELGNGCFEFYH CDDECMNSVKNGTYDYP YEEESKLNRNEI KGV LSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI En el Método 2, se generaron dos capas de la secuencia consenso (ver FIG. 1) . En la primera capa, cuatro secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 21 cepas aisladas en 1957, (2) 12 cepas aisladas de 1958-1960, (3) 8 cepas aisladas de 1961-1964 y (4) 18 cepas aisladas de 1965-1968. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las cuatro secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 2 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 2 : MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTE VDTILERNVTVTHAKDILEKTHN GKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIME ENPRYSIX YPGSFNDYEEL HLLSSVKHFEKV ILP DRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSF FRNMVWLT GSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDETEQRTLYQN VGTYVSVSTSTLN RSTPDIATRPKVNGLGSRMEFSWTLLDMWDTINFESTG NLIAPEYGFKIS RGSSGIMKTEGTLGNCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTI GECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYG YHHSNDQGSGYAADKESTQ AFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLE RLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVR MQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEI KGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI En el método 3, dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 98 aislados de H2N2 humana y aviar (ver FIG. 2) . En la primera capa, seis secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 21 cepas aisladas en 1957, (2) 12 cepas aisladas de 1958-1960, (3) 8 cepas aisladas de 1961-1964, (4) 18 cepas aisladas de 1965-1968, (5) 1 cepa aislada en 2005, y (6) 38 cepas aviares aisladas de 1961-2007. EN la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las seis secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 3 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 3: MAUYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILEKTHN GKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRDGLC YPGSFNDYEELKHLLSSV HFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSF FRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDETEQRTLYQN VGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRP VNGLGSRMEFSWTLLDMWDTINFEST GNLIAPEYGF IS RGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPL TIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWY GYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIE MNTQFEAVGKEFSNL ERRLENLNKKMEDGFLD VWTYNAELLYLMENERTLDFHDSNVKNLYD V RMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSV NGTYDYPKYEEESKLNRN EIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI En el método 4, una secuencia consenso individual se generó utilizando 98 cepas H2N2 humanas y aviares de 1957-2007. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 4 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 4: MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHA DILEKTHN G LCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRNGLC YPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSF FRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDEAEQRTLYQN VGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRPKVNGLGGRMEFSWTLLDMWDTINFEST GNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPL TIGECPKYVKSE LVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWY GYHHSNDQGSGYAADKESTQ AFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNL ERRLENLN MEDGFLDVWTYNAELLVL ENERTLDFHDSNVKNLYD V RMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRN EI GVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI Ejemplo 2 : Generación de las Secuencias COBRA de Influenza B Este ejemplo describe la generación e tres secuencias HA COBRA de influenza B utilizando tres métodos diferentes .

Para generar la secuencia HA COBRA de influenza B' de acuerdo con el Método 1, una secuencia consenso HA se generó utilizando 318 cepas de influenza B aisladas de 1940-2011. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 1 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 5: M AnVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVV TATQGEVNVTGVIPLTTTPT SHFANLKGT TRGKLCPNCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSA ASILHEVRP VTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVINAEKAPGGPYRLGTSGS CPNVTSRSGFFATMAWAVPRDNNKTATNPLTVEVPYICTKGEDQITVWGFH SDNKTQMK LYGDSNPQ FTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGR rVVDYM VQKPG TGTIV YQRG VLLPQ VWC ASGRS K VIKGS LPLIGE ADCL HEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKER GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKIT NLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLS NEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKH CNQTCLDRIAAG TFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIV YMVSRDNVSCSICL En el método 2, dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 318 aislados de influenza B (ver FIG. 3) . En esta primera capa, die secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 15 cepas aisladas de 1940-1986, (2) 3 cepas aisladas en 1987, (3) 5 cepas aisladas de 1988-1989, (4) 17 cepas aisladas de 1990-1992, (5) 61 cepas aisladas de 1993-1998, (6) 52 cepas aisladas de 1999-2000, (7) 39 cepas aisladas de 2002-2003, (8) 29 cepas aisladas de 2004-2005; (9) 36 cepas aisladas de 2006-2007, y (10) 61 cepas aisladas de 2008-2011. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando diez secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 2 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 6: MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVV TATQGEVNVTGVIPLTTTPTK SHFANLKGT TRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCMGTIPSAKASILHEVRPV TSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTHNVINAEKAPGGPYRIGTSGSC PNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGF HSDNETQMKKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSG RIVVDY VQ SGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRS VIKGSLPLIGEADCL HE YGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPA LLKER GFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKTTK NLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLS NEGIINSEDEHLLALERKL KMLGPSAVDIGNGCFET HKCNQTCLDRIAAG TFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIV YMVSRDNVSCSICL En el método 3, dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 318 aislados de influenza B (ver FIG. 4) . En la primera capa, cinco secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 52 cepas aisladas de 1999-2001, (2) 39 cepas aisladas de 2002-2003, (3) 29 cepas aisladas de 2004-2005, (4) 36 cepas aisladas de 2006-2007 y (5) 61 cepas aisladas de 2008-2011. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las cinco secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia COBRA generada de acuerdo con el Método 3 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 7: MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVV TATQGEVNVTGVIPLTTTPTK SHFANLKGTKTRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSAKVSILHEVRPV TSGCFPIMHDRT IRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAE APGGPY IGTSGSC PNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFH SDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGR IVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLH EKYGGLNKSKPYYTGEHA AIGNCPIWVKTPL LANGTKYRPPAKLLKERG FFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKN LNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSN EGIINSEDEHLLALER L KMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGT FDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFVV YMVSRDNVSCSICL E emplo 3 : Generación de las Secuencias COBRA de Influenza H3N2 Este ejemplo describe la generación de cuatro secuencias HA COBRA de influenza H3N2 que utiliza cuatro métodos diferentes.

Para generar la secuencia HA COBRA de influenza H3N2 de acuerdo con el Método 1 (secuencia consenso década), dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 935 aislados de H3N2 (ver FIG. 5) . En la primera capa, cuatro secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 61 cepas aisladas de 168-1979; (2) 33 cepas aisladas de 1980-1990; (3) 288 cepas aisladas de 1991-1999; y (4) 553 cepas aisladas de 2000-2011. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las cuatro secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia H3N2 COBRA generad de acuerdo con el Método 1 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 8: MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVT NATELVQSSSTGRICDSPHRILDGENCTLIDALLGDPHCDGFQNKKWDLFVE RSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINESFNWTGVTQNGGSSACK RGSVNSFFSRLNWLTKL Y YPALNVTMPNNDKFD LYIWGVHHPSTDQD QTSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILL INSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGTCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNR ITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDG WYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSE VEGRIQDLEKYVEDTKE)LWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTR KQLRENAEDMGNGCFKIYH CDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIK GVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI En el método 2 (consenso de era antigénica) , dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 909 aislados de H3N2 (ver FIG. 6) . En la primera capa, 12 secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 23 cepas aisladas de 1968-1972; (2) 8 cepas aisladas de 1973-1974; (3) 21 cepas aisladas de 1975-19780; (4) 9 cepas aisladas de 1979-1981; (5) 19 cepas aisladas de 1982-1985; (6) 14 cepas aisladas de 1986-1988; (7) 13 cepas aisladas de 1989-1992; (8) 275 cepas aisladas de 1993-1998; (9) 294 cepas aisladas de 1999-2003; (10) 57 cepas aisladas en 2004; (11) 80 cepas aisladas de 2005-2006; y (12) 96 cepas aisladas de 2007-2008. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las 12 secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia H3N2 COBRA generada de acuerdo con el Método 2 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 9: MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLV TITNDQIEVT NATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNK WDLFVE RSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINESFNWTGVTQNGGSYACK RGSVNSFFSRLNWLHKSES YPALNVTMPNNDKFD LYIWGVHHPSTDQE OTSLYVOASGRVTVSTKRSOOTVIPNIGSRPWVRG SSRTSTYWTTVKPGDTLL INSTGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNK ITYGACPRYV QNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDG WYGFRHQNSEGTGQAADL STQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSE VEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTR QLRENAEDMGNGCFKr/HKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIK GVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI En el método 3 (1968-2011), dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 935 aislados de H3N2 (ver FIG. 7) . En la primera capa, 13 secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 23 cepas aisladas de 1968-1972; (2) 8 cepas aisladas de 1973-1974; (3) 21 cepas aisladas de 1975-1978; (4) 9 cepas aisladas de 1979-1981; (5) 19 cepas aisladas de 1982-1985; (6) 14 cepas aisladas de 1986-1988; (7) 13 cepas aisladas de 1989-1992; (8) 275 cepas aisladas de 1993-1998; (9) 294 cepas aisladas de 1999-2003; (10) 57 cepas aisladas en 2004; (11) 80 cepas aisladas de 2005-2006; (12) 96 cepas aisladas de 2007-2008; y (13) 26 cepas aisladas de 2009-2011. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las 13 secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia H3N2 COBRA generada de acuerdo con el Método 3 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 10: MKTIIALSYILCLVFAQ LPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVT NATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKKWDLFVE RSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINESFNWTGVTQNGGSYACK RGSNNSFFSRLNWLTKSESKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPSTDKEQ TSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLI NSTGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI TYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGW YGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQING LNRLIE TNE FHQIEKEFSEV EGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFE TR QLRENAEDMGNGCF IYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKG VELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQ GNIRCNICI En el método 4 (1968-2004), dos capas de las secuencias consenso se generaron utilizando 733 aislados de H3N2 (ver FIG. 8). En la primera capa, 10 secuencias consenso individuales se generaron utilizando (1) 23 cepas aisladas de 1968-1972; (2) 8 cepas aisladas de 1973-1974; (3) 21 cepas aisladas de 1975-1978; (4) 9 cepas aisladas de 1979-1981; (5) 19 cepas aisladas de 1982-1985; (6) 14 cepas aisladas de 1986-1988; (7) 13 cepas aisladas de 1989-1992; (8) 275 cepas aisladas de 1993-1998; (9) 294 cepas aisladas de 1999-2003; y (10) 57 cepas aisladas en 2004. En la segunda capa, una secuencia consenso final se produjo utilizando las 10 secuencias consenso individuales generadas en la primera capa. La secuencia H3N2 COBRA generada de acuerdo con el Método 4 se muestra a continuación y se expone en la presente como SEQ ID NO: 11: MKTIIALSYIFCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVT NATELVQSSSTGRICDSPHRILDG NCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVE RSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQNGGSYAC RGSVNSFFSRLNWLHKSESKYPVLNVTMPNNDKFD LYIWGVHHPSTDKE QTSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILL INSTGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNK ITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDG WYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSE VEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTR KQLREN AEDMGNGCFKIYHKCDN ACIGS IRNGTYDHD V YRDEALNNRFQIK GVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI Ejemplo 4: Secuencias del gen COBRA optimizadas con codón Las secuencias de aminoácidos COBRA descritas en la presente pueden ser traducidas y optimizadas e manera cruzada para la expresión en las células de mamífero, incluyendo el uso de codón y optimización de RNA (Gene Art; Regensburg, Alemania) . Las secuencias de ácido nucleico optimizadas se pueden insertar en un vector de expresión apropiado, tal como el vector de expresión pTR600 (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2002/0106798; Ross y colaboradores, Nat Immunol. 1(2): 102-103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine 20:242-248, 2001). Los vectores de expresión que codifican las secuencias del gen COBRA optimizadas con codón se pueden utilizar, por ejemplo, para generar las VLPs que contienen el COBRA HA.

Ejemplo 5 : Preparación de una inmunización con VLPs de influenza Los siguientes métodos se pueden utilizar para producir y caracterizar las VLPs de influenza que comprenden un COBRA HA. Métodos ejemplares para la inmunización de ratones, hurones y macacos también se describen a continuación (ver también, Giles and Ross, Vaccine 29 (16) :3043-3054, 2011) .

Preparación de la Vacuna Las células 293T se transfectan transcientemente con plásmidos que expresan MI, NA y una HA optimizada, y se incuban durante 72 horas a 37 °C. Las secuencias de codificación MI, NA y HA se pueden optimizar con codón para la expresión en las células de mamífero. Los sobrenadantes se recolectan y los restos celulares se remueven por centrifugación de baja velocidad seguido por filtración al vacío a través de un filtro estéril de 0.22 pm. Las VLPs se purifican a través de ultracentrifugación (100,000 x g a través de 20% de glicerol, peso por volumen) durante 4 horas a 4°C. Las pelotillas se vuelven a suspender subsecuentemente en PBS de pH 7.2 y se almacena en alícuotas de un solo uso a -80°C hasta el uso. La concentración de la proteína total se determina por el Equipo de Reactivo de Ensayo de Proteína Micro BCAMR (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) .

Determinación de la dosis El contenido específico de HA se puede determinar por la tinción de western y la densitometría . La COBRA HA recombinante purificada y las VLPs purificadas se preparan en cantidades de proteína total estándar y se someten a electroforesis en un gel SDS-PAGE al 10% y se transfieren a una membrana PVDF. La tinción se sondea con antisueros policlonales de ratón de ratones infectados con influenza y los complejos de HA-anticuerpo se detectan utilizando una IgG anti-ratón de cabra conjugada a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotech; Birmingham, AL, EUA) . La HRP se detecta por el sustrato quimioluminiscente (Pierce Biotechnology; Rockford IL, EUA) y se expone a una película de rayos X (ThermoFisher; Pittsburgh, PA, EUA) . La densidades de las bandas se determina utilizando el software ImageJ (NIH) . La densidad de las bandas de HA recombinante se utilizan para calcular una curva estándar y la densidad de las VLPs se interpola usando resultados de HA recombinante. Estudios de ratón Ratones BALB/c {Mus musculis, hembras, de 6-8 semanas de edad) se adquirieron de Harían Sprague Dawley ( Indianapolis , IN, EUA). Los ratones se alojan en unidades microaisladoras y se les permite libre acceso al alimento y agua y se cuidan bajo las directrices de USDA para animales de laboratorio. Los ratones se vacunan con una de tres dosis de COBRA HA VLPs purificadas (1.5 \iq, 0.3 \ig o 0.06 \ig) , basado en el contenido de HA de un ensayo de densitometria, a través de inyección intramuscular en la semana 0 y luego se refuerzan con la misma dosis en la semana 3. Las vacunas en cada dosis se formulan con adyuvante de alumbre (Imject Alum, Pierce Biotechnology; Rockford, IL, EUA) , oligonucleótidos CpG, o vehículo solo. Catorce a veintiún día después de cada vacunación, la sangre se recolecta de los ratones anestesiados a través del plexo retro-orbital y se transfieren a un tubo de microfuga. Los tubos se centrifugan y los sueros se remueven y se congelan a -80 + 5°C. El titulo de anticuerpo de suero de inhibición de hemaglutinación (HAI) para cada grupo de vacuna se determina en la semana 5 utilizando virus reordenados representativos o COBRA HA VLPs.

Tres semanas después de la vacunación final, los ratones se estimulan intranasalmente con un virus de influenza (tal como un aislado de virus de influenza H2N2, H3N2 y B patogénico) en un volumen de 50µ1. Después de la infección, los ratones se monitorean diariamente para la pérdida de peso, signos de enfermedad y muerte durante 14 días después de la infección. Los pesos corporales individuales, registros de enfermedad (Toapanta y Ross, Respiratory Research 10(1) : 112, 2009) y muerte se registran para cada grupo en cada día después de la inoculación.

Estudios de Hurones Urones Fitch (Mustela putorius furo, hembras, 6-12-meses de edad) , sin tratamiento de influenza y sin olor, se pueden adquirir de Marshall Farms (Sayre, PA, EUA) . Los hurones se alojan en pares en jaulas de acero inoxidable (Shor-line, Kansas City, KS, EUA) que contienen Sani-chips Laboratory Animal Bedding (P.J. Murphy Forest Products, Montville, NJ, EUA) . A los hurones se les administra con dieta de uron Teklad Global (Harían Teklad, Madison, WI, EUA) y agua dulce ad libitum. Las COBRA HA VLPs se diluyen en PBS, pH 7.2 para lograr la concentración final. Los hurones se vacunan con una de dos dosis de COBRA VLPs purificadas (15 µg, 3 ]iq) , basado en el contenido de HA como se determina por el ensayo de citometria a través de inyección intramuscular en el músculo cuádriceps en un volumen de 0.25 mi en la semana 0 y luego se refuerzan con la misma dosis en la semana 3. Las vacunas se almacenan a -80 °C antes del uso y se formulan con adyuvante de alumbre (Imject Alum; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA) inmediatamente antes del uso. Los animales se monitorearon para eventos adversos incluyendo pérdida de peso, temperatura, disminución en la actividad, descarga nasal, estornudo y diarrea semanalmente durante el régimen de vacunación. Antes de la vacunación, los animales se confirman por el ensayo HAI que son cero negativos para los virus de influenza A e influenza B circulantes. Catorce a veintiún dias después de cada vacunación, la sangre se recolecta de los hurones anestesiados a través de la vena anterior cava y se transfieren a un tubo de microfuga. Los tubos se centrifugan y los sueros se remueven y se congelan a -80 + 5°C. El titulo del anticuerpo de suero HAI para cada grupo de vacuna se determina en la semana 5 utilizando un virus reordenado representativo o COBRA HA VLPs.

Tres semanas después de la vacunación final, los hurones se estimulan intranasalmente con un virus de influenza (tal como un aislado de virus de influenza H2N2, H3N2 y B patogénico) en un volumen de 1 mi. Después de la infección, los hurones se monitorean diariamente para la pérdida de peso, signos de diarrea y muerte durante 14 dias después de la infección. Los pesos corporales individuales, registros de enfermedad, y muerte se registran para cada grupo en cada dia después de la inoculación. Los lavados nasales se llevan a cabo al instilar 3 mi de PBS en las fosas nasales de los hurones anestesiados cada dia durante 7 dias después de la inoculación. Los lavados se recolectan y se almacenan a -80°C hasta el uso.

Inmunizaciones de primates - Macacos Cynomolgus (Macaca fascicularis, machos, de 3-5 años de edad) se pueden adquirir de Harían Sprague Dawley ( Indianapolis , IN, EUA) . Los macacos se vacunan con COBRA HA VLPs purificadas (15 iq) , basado en el contenido de HA de un ensayo de densitometria, a través de la inyección intramuscular en la semana 0 y luego se refuerzan con la misma dosis en la semana 3 y 6. Las vacunas se formulan con adyuvante de alumbre (Imject Alum, Pierce Biotechnology; Rockford, IL, EUA) inmediatamente antes del uso. Veintiún dia después de cada vacunación, la sangre se recolecta de los macacos anestesiados a través de la vena femoral y se transfiere a un tubo separador de suero. Los tubos se dejan para activar la coagulación seguido por la centrifugación y los sueros se remueven y se congelan a -80 + 5°C. Los títulos de IgG de punto final y el título de anticuerpo de suero HAI para cada grupo de vacuna se determina en la semana 5 utilizando virus reordenados representativos o COBRA HA VLPs.

Tres semanas después de la vacunación final, los macacos se estimulan por inoculación intranasal, intratraqueal, y orbital con un virus de influenza patogénico (tal como un aislado de virus de influenza H2N2, H3N2 y B patogénico) en un volumen de 1 mi. Después de la infección, los macacos se monitorean diariamente para pérdida de peso, signos de enfermedad y muerte durante cinco días después de la infección. Los pesos corporales individuales, registros de enfermedad y muerte se registran para cada grupo en cada dia después de la inoculación.

En vista de las muchas modalidades posibles a las cuales los principios de la invención descritas se pueden aplicar, se debe reconocer que las modalidades ilustradas son solo ejemplos preferidos de la invención y no se deben tomar como limitantes del alcance de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones. Los inventores por lo tanto reclaman como su invención todo lo que se encuentra dentro del alcance y espíritu de estas reivindicaciones.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de hemaglutinina (HA) de influenza recombinante, caracterizado porque comprende: (i) una secuencia de aminoácidos por lo menos.97.7% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8; (ii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 1; (iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.4% idéntica a los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 2; (iv) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 3; (v) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.7% idéntica a los residuos 2-562 de SEQ ID NO: 4; (vi) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a los residuos 2-584 de SEQ ID NO: 5; (vii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.8% idéntica a los residuos 2-585 de SEQ ID NO: 6; (viii) una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 2-585 de SEQ ID NO: 7 ; (ix) una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.4% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 9; (x) una secuencia de aminoácidos por lo menos 97.8% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 10; o (xi) una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.9% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 11.

2. El polipéptido HA de influenza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (i) una secuencia de aminoácidos por lo menos 97.7% idéntica a SEQ ID NO: 8 (ii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a SEQ ID NO: 1 (iii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.4% idéntica a SEQ ID NO: 2 (iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (v) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.7% idéntica a SEQ ID NO: 4; (vi) una secuencia de aminoácidos por lo menos 99.6% idéntica a SEQ ID NO: 5; (vii) una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.8% idéntica a SEQ ID NO: 6; (viii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; (ix) una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.4% idéntica a SEQ ID NO: 9; (x) una secuencia de aminoácidos por lo menos 97.8% idéntica a SEQ ID NO: 10; o (xi) una secuencia de aminoácidos por lo menos 98.9% idéntica a SEQ ID NO: 11.

3. El polipéptido HA de influenza de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende: (i) no más de 10 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 8; (ii) no más de 2 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 1; (iü) no más de 3 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 2; (iv) no más de 1 sustitución de aminoácido relativa a SEQ ID NO: 4 ; (v) no más de 2 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 5; (vi) no más de 7 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 6; (vii) no más de 9 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 9; (viii) no más de 10 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 10; o (ix) no más de 6 sustituciones de aminoácido relativas a SEQ ID NO: 11.

4. El polipéptido HA de influenza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 1, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 2, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 4, residuos 2-584 de SEQ ID NO: 5, residuos 2-585 de SEQ ID NO: 6, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 9, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 10 o residuos 2- 566 de SEQ ID NO: 11.

5. El polipéptido HA de influenza de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 1, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 2, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 3, residuos 2-562 de SEQ ID NO: 4, residuos 2-584 de SEQ ID NO: 5, residuos 2-585 de SEQ ID NO: 6, residuos 2-585 de SEQ ID NO: 7, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 9, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 10 o residuos 2-566 de SEQ ID NO: 11.

6. El polipéptido HA de influenza de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

7. El polipéptido HA de influenza de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.

8. Una molécula de ácido- nucleico aislada, caracterizada porque codifica el polipéptido HA de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se optimiza con codón para la expresión en las células de mamífero.

10. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 8 o reivindicación 9.

11. El vector de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque además comprende un promotor enlazado operablemente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido HA de influenza.

12. Una célula aislada, caracterizada comprende el vector de conformidad con la reivindicación 10 o reivindicación 11.

13. Una partícula similar a virus de influenza (VLP) , caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

14. La VLP de influenza de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque además comprende una proteína neuraminidasa (NA) de influenza, una proteína de matriz (MI) de influenza, o ambas.

15. Una VLP de influenza que comprende el polipéptido HA de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque se produce al transfectar una célula hospedera con un vector que codifica el polipéptido HA, un vector que codifica una proteina NA de influenza y un vector que codifica una proteina MI de influenza bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de las proteínas HA, MI y NA.

16. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

17. Una composición, caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 13-15 o la proteína de fusión de la reivindicación 16, y un portador farmacéuticamente aceptable.

18. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de influenza en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar el polipéptido HA de influenza de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, la proteína de fusión de la reivindicación 16 o la composición de la reivindicación 17.

19. Un método para inmunizar a un sujeto contra el virus de influenza, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende la VLP de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la composición comprende además un adyuvante .

21. El método de conformidad con la reivindicación 19 o reivindicación 20, caracterizado porque la composición se administra intramuscularmente .

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque la composición comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 25 de la VLP.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la composición comprende aproximadamente 15 µ? de la VLP.