MX2015005056A - Antigenos ampliamente reactivos computacionalmente optimizados para influenza h1n1. - Google Patents

Abstract

Se describe en la presente la generación de polipéptidos HA de influenza H1N1 optimizados para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva a los aislados de virus de influenza H1N1. Los polipéptidos HA optimizados se desarrollaron a través de una serie de alineaciones de proteína HA, y la generación subsecuente de secuencias de consenso, en base a los virus H1N1 seleccionados aislados desde 1918-2012. Se proporcionan en la presente polipéptidos HA de H1N1 optimizados, y composiciones, proteínas de fusión y VLPs que comprenden los polipéptidos HA. Además se proporcionan secuencias de ácidos nucleico optimizadas en codón que codifican los polipéptidos HA. También se proporcionan métodos para inducir una respuesta inmune contra el virus de influenza en un sujeto por la presente descripción.

Description

ANTÍGENOS AMPLIAMENTE REACTIVOS COMPUTACIONALMENTE OPTIMIZADOS PARA INFLUENZA HlNl CAMPO Esta descripción se relaciona a proteínas de hemaglutinina de influenza optimizadas que inducen respuestas inmunes ampliamente reactivas a aislados de virus HlNl y su uso como vacunas.

ANTECEDENTES El virus de influenza es un miembro de la familia Orthomyxoviridae. Hay tres subtipos de virus de influenza designados influenza A, influenza B e influenza C. El virión de influenza contiene un genoma de RNA de sentido negativo segmentado, que codifica las siguientes proteínas: hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA), matriz (MI), proteína de canal de ion de protón (M2), nucleoproteína (NP), proteína 1 básica de polimerasa (PB1), proteína 2 básica de polimerasa (PB2), proteína acídica de polimerasa (PA) y proteína no estructural 2 (NS2). Las HA, NA, MI y M2 están asociadas con la membrana, mientras que NP, PB1, PB2, PA y NS2 son proteínas asociadas con la nucleocápsida. La proteína Mi es la proteína más abundante en las partículas de influenza. Las proteínas HA y NA son glicoproteínas de envoltura, responsables para la unión del virus y la penetración de las partículas virales en la célula, y las fuentes de los epítopos inmunodominantes mayores para la neutralización de virus y la inmunidad protectora. Ambas proteínas HA y NA se consideran los componentes más importantes para vacunas de influenza profilácticas.

Cada año, la influenza estacional causa arriba de 300,000 hospitalizaciones y 36,000 muertes en los Estados Unidos únicamente (Simonsen y colaboradores, Lancet Infect Dis. 7:658-66, 2007). La emergencia del virus de influenza H1N1 novedoso en 2009 demostró que tan rápidamente una nueva pandemia de influenza puede extenderse a través del mundo.

Hay actualmente dos procedimientos de vacuna de influenza con licencia en los Estados Unidos - la vacuna de división inactivada y la vacuna de virus atenuado vivo. Las vacunas inactivadas pueden inducir eficientemente respuestas inmunes humorales pero generalmente solo pobres respuestas inmunes celulares. La vacunas de virus vivos no se pueden administrar a pacientes inmunocomprometidos o embarazadas debido a su riesgo de infección incrementado. De esta manera, existe una necesidad por una vacuna de virus de influenza ampliamente protectora.

BREVE DESCRIPCIÓN Se describe en la presente la generación de polipéptidos HA de influenza H1N1 optimizados para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva a los aislados de virus de influenza H1N1. Los polipéptidos HA optimizados se desarrollaron a través de una serie de alineaciones de proteína HA, y la generación subsecuente de secuencias de consenso, en base a virus H1N1 seleccionados aislados desde 1918-2012.

Se proporcionan en la presente polipéptidos HA de influenza recombinante que tienen una secuencia de aminoácidos optimizada para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva contra la influenza H1N1. En algunas modalidades, el polipéptido HA comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende no más de 5, no más de 6, no más de 7, no más de 8, no más de 9 o no más de 10 sustituciones de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el polipéptido HA comprende la SEQ ID NO: 8. En algunas modalidades, el polipéptido HA de influenza carece del residuo de metionina N-terminal.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas y vectores que codifican los polipéptidos HA recombinantes también se proporcionan por la presente descripción. Además se proporcionan células aisladas que comprenden tales vectores.

También se proporcionan partículas similares a virus de influenza (VLPs) y proteínas de fusión que comprenden los polipéptidos HA optimizados descritos en la presente.

Además se proporcionan composiciones que incluyen los polipéptidos HA de influenza optimizados, proteínas de fusión o VLPs descritos en la presente en un portador farmacéuticamente aceptable. Métodos para inducir una respuesta inmune contra el virus de influenza en un sujeto al administrar las composiciones descritas, proteínas de fusión o VLPs también se proporcionan por la presente descripción.

También se proporcionan métodos para inmunizar a un sujeto contra el virus de influenza al administrar al sujeto una composición que comprende una VLP que contiene un polipéptido HA optimizado.

Lo anterior y otros objetivos, características y ventajas de la invención llegarán a ser más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras acompañantes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-l.

La FIG. 2 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-2.

La FIG. 3 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-3.

La FIG. 4 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-4.

La FIG. 5 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-5.

La FIG. 6 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-6.

La FIG. 7 es una representación esquemática del proceso utilizado para generar una secuencia de consenso HA de H1N1 de acuerdo con el Método X-A-5.

Las FIGS.8A-8B muestran una alineación de secuencia de las proteínas HA de H1N1 expuestas en la presente como SEQ ID NOs: 1-7.

Las FIGS.9A-9F son gráficas que muestran los títulos de anticuerpo de suero de inhibición de hemaglutinación (HAI) de ratones vacunados (semanas 0, 4, 12) contra un panel de aislado de influenza H1N1. El titulo HAI para cada grupo vacunado se determinó en la semana 14 utilizando virus de influenza H1N1. Se muestran títulos HAI de ratones vacunados con VLPs que contienen HA del Método X-l (FIG.9 A), HA del Método X-2 (FIG. 9B), HA del Método X-3 (FIG. 9C), HA del Método X-4 (FIG. 9D), HA del Método X-5 (FIG. 9E) y HA del Método X-6 (FIG.9F). Los valores representan el título medio geométrico (+95% de intervalo de confidencia) de títulos transformados log2.

LISTADO DE SECUENCIAS Las secuencias de ácidos nucleico y aminoácidos listadas en el listado de secuencias acompañantes se muestran utilizando abreviaciones de letras estándar para bases de nucleótidos, y código de tres letras para aminoácidos, como es definido en 37 C.F.R. 1.822. Únicamente una hebra de cada secuencia de ácido nucleico es mostrada, pero la hebra complementaria se entiende como que incluye por cualquier referencia a la hebra exhibida. El listado de secuencias se envío como un archivo de texto ASCII, creado el 6 de Noviembre de 2013, 42.9 KB, que se incorpora en la presente por referencia. En el listado de secuencias acompañantes: SEQ ID NOS: 1-7 son las secuencias de aminoácidos de proteínas HA de H1N1 optimizadas. Estas secuencias también se muestran en la FIG.8.

SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos de consenso de las proteínas HA de H1N1 optimizadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Abreviaciones COBRA: antígeno ampliamente reactivo computacionalmente optimizado HA: hemaglutinina HAI: Inhibición de hemaglutinación HRP: peroxidasa de rábano picante Mi: proteína 1 de matriz NA: neuraminidasa PFU: unidad de forma de placa VLP: partícula similar a virus II. Términos y Métodos A menos que se mencione de otra manera, los términos téenicos se utilizan de acuerdo con la utilización convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamín Lewin, Cenes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew y colaboradores. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Mcyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicada por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Con el fin de facilitar la revisión de las diversas modalidades de la descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos: Adyuvante: Una sustancia o vehículo que aumenta no específicamente la respuesta inmune a un antígeno. Los adyuvantes pueden incluir una suspensión de minerales (alumbre, hidróxido de aluminio o fosfato) en el cual se adsorbe el antígeno; o emulsión de agua-en-aceite en el cual la solución de antígeno se emulsifica en aceite mineral (por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund), algunas veces con la inclusión de micobacterias exterminadas (adyuvante completo de Freund) para aumentar adicionalmente la antigenicidad. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores (tales como aquellos que incluyen un motivo CpG) también se pueden utilizar como adyuvantes (por ejemplo, ver las Patentes de los Estados Unidos No. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; 6,339,068; 6,406,705; y 6,429,199). Los adyuvantes también incluyen moléculas biológicas, tales como moléculas coestimuladoras. Los adyuvantes biológicos ejemplares incluyen IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-g, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L y 41 de BBL.

Administrar: Como se utiliza en la presente, la administración de una composición a un sujeto significa proporcionar, aplicar o llevar la composición en contacto con el sujeto. La administración se puede realizar mediante cualquiera de un número de rutas, tales como, por ejemplo, tópica, oral, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intratecal e intradérmica.

Anticuerpo: Una molécula de inmunoglobulina producida por células linfoides B con una secuencia de aminoácidos especifica. Los anticuerpos son evocados en humanos u otros animales por un antígeno especifico (inmunógeno). Los anticuerpos se caracterizan al hacer reaccionar específicamente con el antigeno de manera demostrable, el anticuerpo y el antigeno cada uno que es definido en términos del otro. "Inducción de una respuesta de anticuerpo" se refiere a la habilidad de un antigeno u otra molécula para inducir la producción de anticuerpos.

Antigeno: Un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de célula T en un animal, que incluye composiciones que se inyectan o se absorben en un animal. Un antigeno reacciona con los productos de inmunidad humoral o celular especifica, incluyendo aquellos inducidos por inmunógenos heterólogos. En algunas modalidades de las composiciones y métodos descritos, el antigeno es una proteina HA de influenza.

Optimizado en codón: Un ácido nucleico "optimizado en codón" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se ha alterado tal que los codones son óptimos para la expresión en un sistema particular (tal como una especie particular de grupo de especies). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico se puede optimizar para la expresión en células de mamífero. La optimización de codón no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

Proteina de fusión: Una proteína generada por la expresión de una secuencia de ácido nucleico diseñada a partir de secuencias de ácidos nucleico que codifican por lo menos una porción de dos diferentes proteínas (heterólogas). Para crear una proteína de fusión, las secuencias de ácidos nucleico deben estar en la misma estructura de lectura y contener a los codones de detención internos. Por ejemplo, una proteína de fusión incluye una HA de influenza fusionada a una proteína heteróloga.

Hemaglutinina (HA): una glicoproteína de superficie de virus de influenza. HA media el enlace de la partícula de virus a las células hospederas y la entrada subsecuente del virus en la célula hospedera. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de numerosas proteínas HA de influenza son conocidas en la téenica y son públicamente disponibles, como aguellos depositadas con GenBank. HA (junto con NA) es uno de los dos determinantes antigénicos de virus influenza mayores.

Respuesta inmune: Una respuesta de una célula del sistema inmune, tal como célula B, células T, macrófago o polimorfonucleocito, a un estímulo tal como un antígeno o vacuna. Una respuesta inmune puede incluir cualquier célula del cuerpo involucrada en la respuesta de defensa del hospedero, incluyendo por ejemplo, una célula epitelial que secreta un interferóna o una citoquina. Una respuesta inmune incluye, pero no está limitada a, una respuesta inmune innata o inflamación. Como se utiliza en la presente, una respuesta inmune protectora se refiere a una respuesta inmune que protege a un sujeto de la infección (previene la infección o previene el desarrollo de la enfermedad asociada con la infección). Los métodos para medir respuestas inmunes son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la medición de proliferación y/o actividad de linfocitos (tales como células B o T) secreción de citoquinas o quimioquinas, inflamación, producción de anticuerpos y los similares.

Inmunógeno: Un compuesto, composición o sustancia que es capaz, bajo condiciones apropiadas, de estimular una respuesta inmune, tal como la producción de anticuerpos o una respuesta de células T en un animal, que incluyen composiciones que se inyectan o se absorben en un animal. Como se utiliza en la presente, una "composición inmunogénica" es una composición que comprende un inmunógeno (tal como un polipéptido HA).

Inmunizar: Volver a un sujeto protegido de una enfermedad infecciosa, tal como mediante vacunación.

Virus de influenza: Un virus de RNA de hebra negativa segmentado que pertenece a la familia Orthomyxoviridae. Hay tres tipos de virus de influenza, A, B y C. Los virus de influenza A infectan una amplia variedad de aves y mamíferos, incluyendo humanos, caballos, mamíferos marinos, cerdos, hurones y pollos. En animales, la mayoría de virus de influenza A causan infecciones localizadas leves del tracto respiratorio e intestinal. Sin embargo, las cepas de influenza A altamente patogénicas, tal como H5N1, causan infecciones sistémicas en aves de corral en las cuales la mortalidad puede alcanzar 100%. En el 2009, la influenza HlNl fue la causa más común de influenza humana. Una nueva cepa de HlNl de origen de cerdos emergió en el 2009 y se declaró pandémica por la Organización Mundial de la Salud. Esta cepa fue referida como "gripe porcina". Los virus de influenza A H1N1 también fueron responsables para la gripe española pandémica en 1918, el brote de Fort Dix en 1976 y la gripe Rusa epidémica en 1977-1978.

Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico, proteina o virus) se ha separado sustancialmente o purificado lejos de otros componentes biológicos (tales como restos celulares, u otras proteínas o ácidos nucleicos). Los componentes biológicos que se han "aislado" incluyen aquellos componentes purificados mediante métodos de purificación estándares. El término también abarca ácidos nucleicos recombinantes, proteínas o virus (VLPs), así como ácidos nucleicos o péptidos químicamente sintetizados.

Enlazador: Uno o más aminoácidos que sirven como un espaciador entre dos polipéptidos de una proteína de fusión.

Proteina de matriz (MI): Una proteína estructural de virus de influenza encontrada dentro de la envoltura viral. MI se cree que funciona en el ensamblaje y la propagación.

Neuraminidasa (NA): Una glicoproteína de membrana de virus de influenza. NA está involucrada en la destrucción del receptor celular para el HA viral a segmentado los residuos de ácido siálico terminales de las porciones de carbohidrato en la superficie de células infectadas. NA también segmenta los residuos de ácido siálico de proteínas virales, previniendo la agregación de virus. NA (junto con HA) es uno de los dos determinantes antigénicos de virus influenza mayores.

Operablemente enlazado: Una primera secuencia de ácido nucleico se enlaza operablemente con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor se enlaza operablemente a una secuencia de codificación si el promotor afecta a la transcripción o expresión de secuencia de codificación. Generalmente, las secuencias de DNA operablemente enlazadas están contiguas y, donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteina, en la misma estructura de lectura.

Proteina HA de influenza optimizada: Como se utiliza en la presente, "proteina HA de influenza optimizada" se refiere a la secuencia de consenso de proteina HA generada por alineaciones de secuencias de los virus de influenza H1N1 seleccionados aislados entre 1918-2012 (como es descrito en el Ejemplo 1 enseguida) . Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas HA optimizadas además fueron (o pueden ser) optimizadas para la expresión en células de mamífero por la vía de la optimización de codón y la optimización de RNA (tal como para incrementar la estabilidad del RNA). Las proteínas HA de influenza optimizadas descritas en la presente (dispuestas en la presente como SEQ ID NOs: 1-7) también son referidas como secuencias "COBRA". Los polipéptidos HA optimizados se diseñan para inducir respuestas inmunes ampliamente reactivas en un sujeto. En el contexto de la presente descripción, "ampliamente reactivo" significa que la secuencia de proteina induce una respuesta inmune en un sujeto que es suficiente para inhibir, neutralizar o prevenir la infección de una amplia gama de virus de influenza (tal como la mayoría o todos los virus de influenza dentro de una subtipo específico). En algunos casos, la proteína HA de influenza optimizada es capaz de inducir una respuesta inmune, tal como una respuesta inmune protectora, contra la mayoría o todos los aislados de virus de influenza H1N1.

Brote: Como se utiliza en la presente, un "brote" de virus de influenza se refiere a una recolección de aislados de virus de dentro de un solo país en un año dado.

Vehículos farmacéuticamente aceptables: Los portadores (vehículo) farmacéuticamente aceptables útiles en esta descripción son convencionales. Remington ' s Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para suministro farmacéutico de una o más composiciones terapéuticas, tales como una o más vacunas de influenza, y agentes farmacéuticos adicionales.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que es empleado. Por ejemplo, las formulaciones parenterales usualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones de sal balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol o los similares como un vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, polvo, píldora, tableta o forma de cápsula) los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que son administradas puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores y agentes amortiguadores del pH y los similares, por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Polipéptido: Un polímero en el cual los monómeros son residuos de aminoácidos que se unen conjuntamente a través de enlaces de amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, se puede utilizar ya sea el isómero L-óptico o el isómero D-óptico. Los términos "polipéptido" o "proteína" como se utiliza en la presente se proponen para abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluyen secuencias modificadas tales como glicoproteínas. El término "polipéptido" se propone específicamente para cubrir proteínas que ocurren naturalmente, así como aquellas que se producen recombinantemente o sintéticamente. El término "residuo" o "residuo de aminoácido" incluye la referencia a un aminoácido que se incorpora en una proteina, polipéptido o péptido.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas sustituciones que, cuando se hace, por lo menos interfieren las propiedades de la proteina original, es decir, la estructura y especialmente la función de la proteina se conserva y no se cambia significativamente por tales sustituciones. Ejemplos de sustituciones conservativas se muestran enseguida.

Residuo Original Sustituciones Conservativas Ala Ser Arg Lys Asn Gin, Su Asp Glu Cys Ser Asn Gin Glu Asp His Asn; Gin lie Leu, Val Leu lie; Val Lys Arg; Gin; Glu Met Leu; lie Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Las sustituciones conservativas generalmente mantienen (a) la estructura de la cadena principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral.

Las sustituciones que en general se esperan que produzcan los cambios más grandes en las propiedades de la proteina no serán conservativas, por ejemplo, cambios en los cuales (a) un residuo hidrofilico, por ejemplo, serilo o treonilo se sustituye para (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina se sustituye para (o por) cualquier otro residuo; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo, o histadilo, se sustituye para (o por) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa,· por ejemplo, fenilalanina, se sustituye para (o por) uno que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Prevención, tratamiento o aminoramiento de una enfermedad: "Prevención" de una enfermedad se refiere a la inhibición del desarrollo completo de una enfermedad. "Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que aminora un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. "Aminoración" se refiere a la reducción del número o severidad de signos o síntomas de una enfermedad.

Promotor: Un promotor es un arreglo de secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de transcripción. Un promotor también opcionalmente incluye elementos aumentadores o represores distantes. Un "promotor constitutivo" es un promotor que es continuamente activo y no se somete a la regulación por señales o moléculas externas. En contraste, la actividad de un "promotor inducidle" es regulada por una señal externa o molécula (por ejemplo, un factor de transcripción). En algunas modalidades en la presente, el promotor es un promotor CMV.

Purificado: El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se propone como un término relativo. De esta manera, por ejemplo, un péptido, proteínas, virus, VLP u otro compuesto activo purificado es uno que se aísla por completo o en parte de proteínas naturalmente asociadas y otros contaminantes. En ciertas modalidades, el término ''sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, proteína, virus, VLP u otro compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo de células, u otra preparación cruda y sometido a fraccionamiento para remover varios componentes de la preparación inicial, tales como proteínas, restos celulares, y otros componentes.

Recombinante: Un ácido nucleico, proteína, virus o VLP recombinante es uno que tiene una secuencia que no está ocurriendo naturalmente o tiene una secuencia que se hace mediante una combinación artificial de dos segmentos de otra manera separados de la secuencia. Esta combinación artificial es frecuentemente realizada por síntesis química o, más comúnmente, por la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante téenicas de ingeniería genética.

Identidad de secuencia: La similitud entre las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico se expresa en términos de la similitud entre las secuencias, de otra manera referida como identidad de secuencia. La identidad de secuencia frecuentemente se mide en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología). Entre más alto es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos o variantes de un gen dado o proteína poseerá un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alinean utilizando métodos estándar.

Métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la téenica. Varios programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443, 1970; Pearson y Lip an, Proc. Nati . Acad. Sel . U. S.A. 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet y colaboraderes , Nucleic Acids Research 16:10.881-10890, 1988; y Pearson y Lipman, Proc. Nati . Acad. Sci . U. S.A. 85:2444, 1988. Altschul y colaboradores. , Nature Genet. 6:119-129, 1994.

La Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica de NCBI (BLAST™) (Altschul y colaboradores, J. Mol . Biol . 215: 403-410, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD) y en la Internet, para el uso de una conexión con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx.

Sujeto: Organismos vertebrados multi-celulares vivientes, una categoría que incluye mamíferos tanto humanos como no humanos, tales como los primates no humanos.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Una cantidad de un agente especificado suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto que es tratado con ese agente. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad de una vacuna de virus de influenza útil para inducir una respuesta inmune en un sujeto y/o para prevenir la infección o enfermedad causada por el virus de influenza. Idealmente, en el contexto de la presente descripción, una cantidad terapéuticamente efectiva de una vacuna de influenza es una cantidad suficiente para incrementar la resistencia a, prevenir, aminorar y/o tratar la infección causada por el virus de influenza en un sujeto sin causar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. La cantidad efectiva de una vacuna de influenza útil para incrementar la resistencia a, prevenir, aminorar y/o tratar la infección en un sujeto será dependiente de, por ejemplo, el sujeto que es tratado, la manera de administración de la composición terapéutica y otros factores.

Transformado: Una célula transformada es una célula en la cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante téenicas de biología molecular. Cómo se utiliza en la presente, el término transformación abarca todas las técnicas mediante las cuales una molécula de ácido nucleico podría ser introducida en tal célula, incluyendo la transfección con vectores virales, la transformación con vectores de plásmido y la introducción de DNA desnudo mediante electroporación, lipofección y la aceleración con pistola de partículas.

Vacuna: Una preparación de material inmunogénico capaz de estimular una respuesta inmune, administrada para la prevención, aminoración o tratamiento de la enfermedad, tal como una enfermedad infecciosa. El material inmunogénico puede incluir, por ejemplo, microorganismos atenuados o exterminados (tales como virus atenuados) o proteínas antigénicas, péptidos o DNA derivados de estos. Las vacunas pueden inducir respuestas tanto profilácticas (preventivas) como terapéuticas. Los métodos de administración varían de acuerdo con la vacuna, pero pueden incluir inoculación, ingestión, inhalación u otras formas de administración. Las inoculaciones se pueden suministrar mediante cualquiera de un número de rutas, incluyendo la administración parenteral, tal como intravenosa, subcutánea o intramuscular. Las vacunas se pueden administrar con un adyuvante para reforzar la respuesta inmune.

Vector: Un vector es una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin interrumpir la habilidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula hospedera. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula hospedera, tal como un origen de replicación. Un vector de inserción es capaz de insertarse por si mismo en un ácido nucleico hospedero. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y traducción de un gen o genes insertados. En algunas modalidades de la presente descripción, el vector codifica una proteína HA, NA o Mi de influenza. En algunas modalidades, el vector es el vector de expresión pTR600 (Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0106798; Ross y colaboradores, Nat Immunol 1(2):102-103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine 20:242-248, 2001).

Partícula similar a virus (VLP): Las partículas de virus están constituidas de una o más proteínas estructurales virales, pero carecen del genoma viral. Debido a que las VLPs carecen de un genoma viral, ellas no son infecciosas. Además, las VLPs frecuentemente ser pueden producir mediante la expresión heteróloga y fácilmente se pueden purificar. La mayoría de VLPs comprenden por lo menos una proteína del núcleo viral que induce la propagación y liberación de partículas desde una célula hospedera. Un ejemplo de tal proteína del núcleo es la Mi de influenza. En algunas modalidades en la presente, una VLP de influenza comprende las proteínas HA, NA y/o MI. Las VLPs de influenza se pueden producir mediante transfección de células hospedadoras con plásmidos que codifican las proteínas HA y NA, y opcionalmente la proteína MI. Después de la incubación de las células transfectadas durante un tiempo apropiado para permitir la expresión de proteína (tal como durante aproximadamente 72 horas), las VLPs se pueden aislar de los sobrenadantes del cultivo de células. El Ejemplo 2 proporciona un protocolo ejemplar para purificar de VLPs de influenza a partir de sobrenadantes de células. En este ejemplo, las VLPs se aíslan mediante la centrifugación de baja velocidad (para remover los restos celulares) la filtración de vacio y ultracentrifugación a través de glicerol a 20%. Otros métodos para producir VLPs de influenza son conocidos en la téenica (ver, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos. Nos. 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769; y 2010/0239610).

A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por un de habilidad ordinaria en la técnica a la cual está descripción pertenece. Los términos singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente los indique de otra manera. De manera similar, la palabra "o" se propone para incluir "y" a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. Por consiguiente "que comprende A o B" significa que incluye A, o B, o A y B. Además se entiende que todos los tamaños de base o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para descripción. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente descripción, métodos y materiales adecuados se describen enseguida. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo la descripción de términos, lo controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se proponen para ser limitantes.

III. Revisión General de Varias Modalidades Se describe en la presente la generación de polipéptidos HA de influenza H1N1 optimizados para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva a la influenza H1N1. Los polipéptidos HA optimizados se desarrollaron a través de una serie de alineaciones de proteínas HA, y la generación subsecuente de secuencias de consenso, en base a los virus H1N1 seleccionados aislados desde 1918-2012. Los métodos utilizados para generar las 7 secuencias HA se describen en el Ejemplo 1 y las FIGS. 1-7. Las secuencias de aminoácidos de los 7 polipéptidos HA optimizados se exponen en la presente como SEQ ID NOs: 1-7. Además, una secuencia de consenso de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1-7 se proporciona en la presente como SEQ ID NO: 8.

Se proporcionan en la presente polipéptidos HA de influenza recombinantes que tienen una secuencia de aminoácidos optimizada para inducir una respuesta inmune ampliamente reactiva contra la influenza H1N1. En algunas modalidades, el polipéptido HA comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 96%, por lo menos 96.5%, por lo menos 97%, por lo menos 97.5%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende no más de 2, no más de 3, no más de 4, no más de 5, no más de 6, no más de 7, no más de 8, no más de 9 o no más de 10 sustituciones de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

En modalidades particulares, se proporciona un polipéptido HA de influenza recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 96%, por lo menos 96.5%, por lo menos 97%, por lo menos 97.5%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 1; por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 2; por lo menos 99% o por lo menos 99,5% idéntica a SEQ ID NO: 3; por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 4; por lo menos 98.4%, por lo menos 98.6%, por lo menos 98,8%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 5; por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 6; por lo menos 97%, por lo menos 97.5%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a SEQ ID NO: 7; o que comprende SEQ ID NO: 8.

En otras modalidades particulares, el polipéptido HA de influenza recombinante comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 96%, por lo menos 96.5%, por lo menos 97%, por lo menos 97.5%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 1/ por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 2; por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 3; por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 4; por lo menos 98.4%, por lo menos 98.6%, por lo menos 98.8%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 5; por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-565 de SEQ ID NO: 6; por lo menos 97%, por lo menos 97.5%, por lo menos 98%, por lo menos 98.5%, por lo menos 99% o por lo menos 99.5% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 7; o que comprenden los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8.

En otras modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido HA comprende (i) no más de 10, no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 sustitución(s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 1; (ii) no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más 1 sustitución(s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 2; (iii) no más de 6, no más de 5 no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 sustitución(s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 3; (iv) no más de 7, no más de 6, no más de 5 no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 sustitución(s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 4 ; (v) no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5 no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 sustitución (s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 5; (vi) no más de 6, no más de 5 no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 sustitución(s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 6; o (vii) no más de 10, no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5 no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 sustitución(s) de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 7.

En algunos ejemplos, el polipéptido HA de. influenza comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 1, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 2, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 3, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 4, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 5, residuos 2-565 de SEQ ID NO: 6, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 7 o residuos 2-566 de SEQ ID NO: 8.

En otros ejemplos, el polipéptido HA recombinante comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.

Además se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los polipéptidos HA recombinantes descritos en la presente. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico es optimizada en codón para la expresión en células de mamífero. La molécula de ácido nucleico además opcionalmente se optimiza para la estabilidad del RNA.

Los vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos HA recombinantes también se proporcionan por la presente descripción. El vector puede ser cualquier vector adecuado para la expresión del polipéptido HA, tal como un vector de expresión de mamífero. En ejemplos particulares, el vector es el vector de expresión pTR600 (Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0106798, incorporada en la presente por referencia; Ross y colaboradores, Nat Immunol 1(2):102-103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine. 20:242-248, 2001).

En algunos ejemplos, el vector incluye un promotor operablemente enlazado a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido HA. En ejemplos particulares, el promotor es un promotor CMV.

También se proporcionan células aisladas que comprenden los vectores descritos. En algunos casos, la célula es cualquier tipo de célula adecuada para la producción y expresión de VLPs, tal como una célula de mamífero.

Además se proporcionan VLPs de influenza que comprenden un polipéptido HA optimizado descrito en la presente. Las VLPs de influenza además pueden incluir cualquiera de las proteínas de influenza adicionales necesarias para formar la partícula del virus. En algunas modalidades, las VLPs de influenza además incluyen proteína neuraminidasa (NA) de influenza, proteína de matriz (MI) de influenza, o ambas.

También se proporcionan VLPs de influenza que comprenden un polipéptido HA de influenza descritos en la presente, producido al transfectar una célula hospedera con un vector que codifica el polipéptido HA, un vector que codifica una proteína NA de influenza y un vector que codifica una proteína MI de influenza bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de las proteínas HA, Mi y NA.

Las proteínas de fusión que comprenden un polipéptido HA de influenza optimizado además se proporcionan por la presente descripción.

También se proporcionan en la presente composiciones que comprenden una proteína HA de influenza optimizada como es descrito en la presente, o una proteína de fusión o VLP que comprende la proteína HA de influenza optimizada. En algunas modalidades, las composiciones además comprenden un portador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el adyuvante puede ser alumbre, adyuvante completo de Freund, un adyuvante biológico u oligonucleótidos inmunoestimuladores (tales como oligonucleótidos CpG).

Además se proporciona un método de inducir una respuesta inmune al virus de influenza en un sujeto al administrar una proteina HA de influenza optimizada, proteínas de fusión que contienen una HA de influenza optimizada, VLPs que contiene una HA de influenza optimizada, o composiciones de las mismas, como es descrito en la presente. En algunas modalidades, el virus de influenza es un virus de influenza HlNl. En algunas modalidades, la proteína HA, la proteína de fusión HA o VLP se pueden administrar utilizando cualquier ruta adecuada de administración, tal como, por ejemplo, intramuscular. En algunas modalidades, la proteína HA, o proteína de fusión o VLP se administra como una composición que además comprende un portador y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el adyuvante puede ser alumbre, adyuvante completo de Freund, un adyuvante biológico u oligonucleótidos inmunoestimulantes (tales como oligonucleótidos CpG).

También se proporciona un método para inmunizar un sujeto contra el virus de influenza al administrar al sujeto VLPs que contienen una proteína HA de influenza optimizada descrita en la presente, o al administrar una composición de la misma. En algunas modalidades del método, la composición además comprende un portador y/o un adyuvante o farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, el adyuvante puede ser alumbre, adyuvante completo de Freund, un adyuvante biológico u oligonucleótidos inmunoestimuladores (tales como oligonucleótidos CpG). En algunas modalidades, las VLPs (o composiciones de las mismas) se administran intramuscularmente.

En algunas modalidades de los métodos para inducir una respuesta inmune o inmunizar a un sujeto, al sujeto se administra aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg de las VLPs que contienen una proteina HA optimizada. En ejemplos particulares, al sujeto se administra aproximadamente 5 a aproximadamente 20 pg de las VLP, o aproximadamente 10 a aproximadamente 15pg de las VLPs. En un ejemplo no limitante especifico, el sujeto se administra con aproximadamente 15 pg de las VLPs. Sin embargo, uno de habilidad en la téenica es capaz de determinar una cantidad terapéuticamente efectiva (por ejemplo una cantidad que proporciona protección contra la infección de virus de influenza H1N1) de VLPs para administrar a un sujeto.

IV. Polipéptidos HA de Influenza H1N1 Optimizados Se proporcionan en la presente 7 diferentes secuencias de polipéptidos HA de H1N1 optimizados. Las secuencias de aminoácidos HA de H1N1 se descargan de la base de datos de Recursos de Virus de Influenza NCBI. Las proteínas HA de HlNl de virus de influenza aisladas desde 1918-2012 se utilizaron para generar secuencias de consenso. El Ejemplo 1 describe los métodos que se utilizaron para generar cada secuencia de consenso (ver también las FIGS.1-7).

COBRA HlNl Método XI (SEQ ID NO: 1) MEARLLVLLCAl AATNADI R’IG YUANNS I’D PVD l’VLEKNV IVn IS VNELEDSI 1NGKLGK I.KGIAP1 -Qí.GKCNI AGWII GNPECFSI.I .SKRSWSYIVRTPNSnNGTCYPGDFIDYnT.I ,RFQI .S SVSSFERFEIFPKESSWPNHNTTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTKKNGSYPNLSKSYVN NKGKEVLVLWGVIUIPSNIEDQQSLYQNENAYVSVVSSNYNRRFTPEIAKRPKVRDQEGR MNYYWTLLEPGDTriFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGHTSNASMHECDTKCQTPQGAINS SLI’FQNIIIPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYG YHHQNHQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVrn MNTQITAVGKnrNNT.nKRMHNI.NK KVDDGFLDIWTYNAELLVELENFRTFDFnDSNVKNFYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYH KCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVIXVSL GAISFWMCSNGSLQCRICl H1N1 de post 1918-1947 Método X-2 (SEQ ID NO: 2) MHARI.EVI.ECAFAATNADTTClGYIlANNSTDTVDTVLEKNVTVmsVNLLEDSIlNGKI.CR I.KGlAPI.QI.GKCNIAr.Wri.riNPl'.CF.SI.l.SKRSWSYIVli l'PNSFNG I CYFGDFIDYFF.I.RFQES SVSSFERFEIFPKE.SSWPKHNTTRGVTAACSIIAGKSSFYRNI.EWI.TEKDGSYPKI.SNSYVN KKGKl'VI.VI.WGVIllIPSNtKDQQTLYQKENAYVSWSSNYNRRFTPEIAERPKVRGQAGR NYYWTLLEPCfDI'flFEANGNLIAPWYAFALSRGFG.SGUTSNASMHECDTKCQTPQGAINS SLPFQNIIIPVTTGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYG YHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNNLEKRMENLNK KVL)L)G1'LUIWTYNAKU.VI.LENERTI .DFIIDSNVKNEYEKVKNQLRNNAKEIGNGCFEFYH KCNNHCMHSVKNGTYDYPKYSGESKLNREK.lDGVKLESMGVYyiLAIYSTVASSEVLLV\SL GAkSl WMCSNGSLQCRICL COBRA de H1N1 "estacional" 1978-2008 Método X-3 (SEQ ID NO: 3) MEARLLVLLCAFAATNADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDvSHNGKLCR Í GIAPLQLGNCSVAGWILGNPFCHSLFSKESWSYIAETPNPENGTCYPGYFADYEELREQL SSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVTASCSHNGKSSFYRNLLWLTEK.NGLYPNLSKSYV NNKEKEVLVLWGVIIIIPSNIGDQRAIYÍITENAYVSVVSSIIYSRRFTPEIAKRPKVRDQEÜRI NYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGlITSNASMDECDAKCQTPQGAlNSvS LPFQNVHPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGWYG YHHQNEQGSGYAADQKSTQNArNGITNKVNSVtFKMNTQrTAVGKEFNKFERRMENI.NK KVDnGFl.DIWl YNAHLI.VT.LENERTI.DFHDSNVKNI YFKVKSQFKNNAKEIGNGCFEFYH .

COBRA H1N1 Desglicosilado Método X-4 (SEQ ID NO: 4) MKAKLLVLLCAFIATYADTICIGYHANNSTDTVDTVI.EKNVTVTHSVNLEHDSHNGKLCR EKGlAPLyLGNGSIACiWlLCiNPECESLl'SKESWSYlVETPNSENGTCYPCÍYFADYEELREQL S.SVSSFFRFFIFPKF.SSWPAHTVTKGVTASCSHNGKSSFYRNI.I.WI.TF.KNGSYPAI.SKSYVN NKEKKVI.VLWGVHHPSNIGDQRAIYHTENAYVSVVSSMYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRIN YYW TLLEPGD1HFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNASMDECDAKCQTPQGAINSSL PFQNVHPVnGECPKYVRSTKLRMVTGLKNlPSiQSRGLFGAlAGFIEGGWTGMIDGWYGY IHIQNHQGS YAADyKSTQNAlNGITNKVNSVlEKMNTQFTAVGKEFNKLERR ENLNKK VnDGFI.r>lWTYNAEI,I.VT.I.ENERTI,DniDSNVKNI.YEKVKSQI,KNNAKF.ir,NGGFFFY[IK CNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKEESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLG AISFWMCSNGS LQCRÍCr H1N1 de Duración de 30 Años Método X-5 (SEQ ID NO: 5) MFARIEVELCAFAATNADTlCIGYHANNSTD rVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSIINGKLCK LKGIAPEQIXÍNCSIAGWILGNPECESLF8KESWSYIVETPNSENGTCYPGYFADYEELREQL SSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTKGVTASCSIINGKSSFYRNLLWLTEKNGSYPNLSKSYVN NKEKEVLVLWGVHIIPSNIGDQRAIYFITENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQHGRIN YYWTI.LEPGDTUFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGUTSNAS DHCDAKCQTPGGAINSSL PFQNVIIPVTIGECPKYVRSTKLRMVTGI.RNIPSIQSRGEFGAIAGPIEGGWTGMIDGWYGY HKQNEQGSGYAADQKS I QNAINGHNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKLERRMENLNKK VI)l)GI EDIWTYNAEr,I,VI,Í.ENERTI.DrHDSNVKNEYEKVKSQEKNNAKEIGNGCFEFYHK CNNErMESVKNGTYDYPKYSEESKENRF.KIDGVKEESMGVYQrT.AfYSTVASSEVEEVSEG AISFWMCSNGSLQCRICI COBRA H1N1 de Duración de 20 Años Método X-6 (SEQ ID NO : 6) MEARLLVLLCAFAATNADTlClGYllANNSTDl VDTVLHKNVTVi MSVNLLED8FINGKI.CL LKGIAPEQEGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYEADYEELREQL SSVSSFERFEirPKESSWPNIITVTGVSASCSIlNGKSSFYRNLLWLTOKNGLYPNESKvSYAN NKEKEVEVLWGVIIIIPPNIGDQRALYIITF.NAYVSVVSSIIYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRI NYYWT7,I.EPGDTIirEANGNEIAPRYAFAESRGFGSGIITSNAPMDECDAKCQTPQGAIN8SI.

Pl QNVHPV IIGHCPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGW TGMVDGWYG YIII1QNEQG8GYAADQK8 rQNAINGn'NKVNSVlEKMN l’QFI'AVGKEFNKLERRMENENK KVDrXiFl .DIWTYNAHI .1.V 1.1 J ÍNHR G1.DFHD8N VKNL YEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYH KCNNECMESVKNGTYDYPKYSFESKENREKIDGVKEESMGVYQIEA1 YSTVASSLVLLVSL GAISFWMCSNGSLQCRICI COBRA H1N1 Método A-5 (SEQ ID NO : 7) MEARELVLLCAFAATNAL>TlClGYHANNSTDTViyrVI .KNVTVTIISVNI.I.EDSHNGKLOR EKGIAPI.QEGNCSrAGWTEGNPFCESLLSKKSWSYIVETPNSENGTCYPGDFIDYEELREQLS SVSSFERFEIFrKESSWPNHTVTKGVTAACSHAGKSSFYRNLLWLTEKNCÍSYPNLSKSYVN N K( i KEV i I ,WGVHHPSNIGDQQALYQTEN AYVSVVSSHYNRKFTPEÍA KRPKVRDQEGRI NYYWTLEEPGDTUFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGnTSNASMIIECDTKCQTPQGALNSS LPFQNUIPVTLGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGIVUDGWYGY HHQNHQGSGYAADQKSTQNAINGnNKVNSVlEKMNTQFTAVOKEFNKLEKRMENLNKK VDDGFEDIW rYNAF.Í.T.VEEF.NF.RTEDFIIDSNVKNEYEKVKSQEKNNAKHIGNGCFEFYlIK CNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLG AISFWMCSNGSLQCRICI Secuencia de Consenso de SEQ ID NOs: 1-7 (SEQ ID NO: 8) MXAXEEVEI.CAFXATXADTICIGYI IANNSTDTVI)TVIEKNVTVTHSVNEI.HI)8IINGKLCX I.KfÍlAPEQEGXCXXAG ri.GNPECEXEXSKXSWSYÍXFTPNXJ'NGTCYPGXFXDYnnERE QESSVSSFERFEIFPKESSWPXHXXTXGVXAXCSHXGKSSFYRNEEWETXKXGXYPXESXS YXNXKXKEVLVLWGVHHPXN1XDQXXXYXXENAYVSVVSSXYXRXFI PHIAXRPKVRX yXGRXNYYWTI.l.HPGDTUFEANGNtlAPXYAFAESRGFGSGUTSNAXMXECDXKCQTPQ GAINSSI.PFQNXIIPVTK iHCPKYVRSXKERMVTGERNIPSlQSRGEFGAIAGFIEGGWTGMX DGWYGYIIHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNXLEXR HNENKKVDDGFLDIW rYNAELLVLLENERi'LDl 1IDSNVKNLYEKVKXQI.XNNAKEIGN GCTEFYHKCNNECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASS EVLLVSLGA1SFWMCSNGSLQCRIC1 En algunas modalidades descritas en la presente, los polipéptidos HA carecen del residuo de metionina N-terminal. De esta manera, en algunos ejemplos, se proporcionan polipéptidos HA que comprenden los residuos 2-566 de cualquiera de SEQ ID NOs : 1-5 y 8, o que comprenden loa residuos 2-565 de SEQ ID NO: 6 .

Las secuencias de aminoácidos COBRA se pueden traducir inversamente y optimizar para la expresión en células de mamífero, incluyendo la utilización del codón y la optimización de RNA (GeneArt; Regensburg, Alemania). Las secuencias de ácidos nucleico optimizadas se pueden insertar en un vector de expresión apropiado, tal como el vector de expresión pTR600 (Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No.2002/0106798; Ross y colaboradores, Na t Immunol . 1(2):102—103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine 20: 242-248, 2001).

V. Influenza Los virus de influenza son virus de RNA de hebra negativa segmentados que pertenecen a la familia Orthomyxoviridae. Hay tres tipos de virus de influenza, A, B y C. Los virus de influenza A infectan una amplia variedad de aves y mamíferos, incluyendo humanos, caballos, mamíferos marinos, cerdos, hurones y pollos. En los animales, la mayoría de virus de influenza A causan infecciones localizadas leves del tracto respiratorio e intestinal. Sin embargo, las cepas de influenza A altamente patogénicas, tal como HlNl, causan infecciones sistémicas en aves de corral en las cuales la mortalidad puede alcanzar 100%. Los animales infectados con influenza A frecuentemente actúan como un depósito para los virus de influenza y ciertos subtipos se has mostrado que cruzan la barrera de especies a los humanos.

Los virus de influenza A se pueden clasificar en subtipos en base a las variaciones alélicas en las regiones antigénicas de dos genes que codifican glicoproteinas de superficie, específicamente, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que se requieren para la unión viral y la liberación celular. Actualmente, dieciséis subtipos de HA (H1-H16) y nueve variantes antigénicas NA (N1-N9) son conocidos para el virus de influenza A. Previamente, sólo tres subtipos se conocieron que circulan en humanos (H1N1, H1N2 y H3N2). Sin embargo, en años recientes, el subtipo H5N1 patogénico de la influenza A aviar se ha reportado que cruza la barrera de especie e infecta a humanos como es documentado en Hong Kong en 1997 y en 2003, conduciendo a la muerte de varios pacientes.

En animales, la mayoría de virus de influenza A causan infecciones localizadas leves del tracto respiratorio e intestinal. Sin embargo, las cepas de influenza A altamente patogénicas, tal como H5N1, causan infecciones sistémicas en aves de corral en las cuales la mortalidad puede alcanzar 100%. En el 2009, la influenza H1N1 fue la causa más común de influenza humana. Una nueva cepa de HlNl de origen de cerdos emergió en el 2009 y fue declarada pandémica por la Organización Mundial de la Salud. Esta cepa fue referida como "gripe porcina". Los virus de influenza A de H1N1 también fueron responsables para la pandemia de gripe española en 1918, el brote de Fort Dix en 1976 y la gripe Rusa epidémica en 1977-1978.

El geno a de virus de influenza A codifica nueve proteínas estructurales y una proteína no estructural (NS1) con funciones de reguladoras. El genoma segmentado del virus de influenza contiene ocho segmentos de gen (nsRNA) de RNA de sentido negativo RNA (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA) que codifican por lo menos diez polipéptidos, incluyendo las proteínas de RNA de polimerasa dirigida a RNA (PB2, PB1 y PA), nucleoproteína (NP), neuraminidasa (NA), hemaglutinina (subunidades HA1 y HA2), las proteínas de matriz (MI y M2) y las proteínas no estructurales (NS1 y NS2) (Krug y colaboradores, en "The Influenza, "R. M. Krug, ed., Plenum Press, N. Y., 1989, pp.89 152).

La habilidad del virus de influenza para causar enfermedad dispersa es debido a su habilidad para evadir el sistema inmune al someterse al cambio antigénico, que se cree que ocurre cuando un hospedero es infectado simultáneamente con un virus de influenza de animal con un virus de influenza humana. Durante la mutación y reclasificación en el hospedero, el virus puede incorporar un gen de proteína de superficie HA y/o NA de otro virus en su genoma, para de esta manera producir un nuevo subtipo de influenza y evadir el sistema inmune.

HA es una glicoproteina de superficie viral que comprende en general aproximadamente 560 aminoácidos y que representa 25% de la proteina de virus total. Es responsable para la adhesión de la partícula viral a, y su penetración en, una célula hospedera en las etapas tempranas de infección. La segmentación del precursor HAO de virus en los sub-frag entos HA1 y HA2 es una etapa necesaria con el fin de que el virus se infecte a una célula. De esta manera, se requiere segmentación con el fin de convertir nuevas partículas de virus en una célula hospedera en viriones capaces de infectar nuevas células. La segmentación se sabe que ocurre durante el transporte de la proteína de membrana HAO integral del retículo endoplásmico de la célula infectada a la membrana de plasma. En el curso del transporte, la hemaglutinina se somete a una serie de modificaciones co- y post-transduccionales que incluye la segmentación proteolítica del HA precursor en el fragmento amino-terminal Hal y el HA2 carboxi terminal. Una de las dificultades primarias en cultivar cepas de influenza en el cultivo de tejido primario o líneas de células establecidas surge del requerimiento para la activación de segmentación proteolítica de la hemaglutinina de influenza en la célula hospedera.

Aunque se sabe que una HA no segmentada puede mediar la unión del virus a sus receptores que contienen ácido neuramínico en una superficie de célula, no es capaz de la siguiente etapa en el ciclo infeccioso, que es la fusión. Se ha reportado que la exposición del amino terminal hidrofóbico de HA2 mediante segmentación es requerido de modo que se puede insertar en la célula objetivo, para de esta manera formar un puente entre el virus y la membrana en la célula objetivo. Este proceso es seguido por la fusión de las dos membranas y la entrada del virus en la célula objetivo.

La activación proteolitica de HA involucra la segmentación en un residuo de arginina mediante una endoproteasa similar a tripsina, que es frecuentemente una enzima intracelular que es dependiente de calcio y tiene un pH neutro óptimo. Puesto que las proteasas de activación son enzimas celulares, el tipo de célula infectada determina si la HA es segmentada. La HA de los virus de influenza de mamífero y de los virus de influenza aviar no patogénicos son susceptibles a la segmentación proteolitica solamente en un número restringido de tipo de célula. Por otra parte, la HA de virus aviares patogénicos entre los subtipos H5 y H7 son segmentados por proteasas presentes en una amplia gama de diferentes células hospederas. De esta manera, hay diferencias en el intervalo de hospederos que resultan de las diferencias en la segmentabilidad hemaglutinina que se correlacionan con las propiedades patogénicas del virus.

La neuraminidasa (NA) es una segunda glicoproteína de membrana de los virus de influenza. La presencia de la NA viral se ha mostrado que es importante para generar una respuesta inmune protectora multifacética contra un virus de infección. Para la mayoría de los virus de influenza A, NA es 413 aminoácidos en longitud, y es codificada por un gen de 1413 nucleótidos. Nueve subtipos NA diferentes se han identificado en virus de influenza (NL, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 y N9), todos los cuales han encontrado entre las aves salvajes. La NA está involucrada en la destrucción del receptor celular para el HA viral al segmentar el ácido neuramínico terminal (también llamado ácido siálico) de las porciones de carbohidratos en las superficies de las células infectadas. NA también segmenta los residuos de ácido siálico de las proteínas virales, previniendo la agregación de los virus. Utilizando este mecanismo, se plantea como hipótesis de que NA facilita la liberación de progenie viral al prevenir a las partículas virales recientemente formadas de acumularse a lo largo de la membrana de célula, así como al promover la transportación del virus a través del moco presente en la superficie de la mucosa. NA es determinante antigénico importante que se somete a la variación antigénica.

Además de las proteínas de superficie HA y NA, el virus de influenza comprende seis genes internos adicionales, que dan origen a ocho proteínas diferentes, incluyendo los genes de polimerasa PB1, PB2 y PA, proteínas de matriz Mi y M2, nucleoproteína (NP) y proteínas no estructurales NS1 y NS2 (Horimoto y colaboradores , Clin Microbiol Rev. 14(1):129-149, 2001) .

Con el fin de ser empaquetado en viriones de progenie, el RNA viral se transporta del núcleo como un complejo de ribonucleoproteína (RNP) compuesto de tres proteínas de polimerasa de virus de influenza, la nucleoproteína (NP) y el RNA viral, en asociación con la proteína de matriz 1 de virus de influenza (MI) y la proteína de exportación nuclear (Marsh y colaboradores, J Virol, 82:2295-2304, 2008). La proteína Mi que se encuentra dentro de la envoltura se cree que funciona en el ensamblaje y propagación. Un número limitado de proteínas M2 se integran en los viriones (Zebedeo, J. Virol 62:2762-2772, 1988). Ellas forman tetrámeros que tienen actividad de canal de ión H+, y cuando se activan por el bajo pH en endosomas, acidifican el interior del virión, facilitando su no recubrimiento (Pinto y colaboradores, Cell 69:517-528, 1992). La amantadina es un fármaco anti-influenza que previene la infección viral al interferir con la actividad del canal de ión de M2, para de esta manera inhibir el no recubrimiento del virus.

NS1, una proteína no estructural, tiene múltiples funciones, que incluyen la regulación del empalme y la exportación nuclear de mRNAs celulares así como la estimulación de la traducción. La función mayor de NS1 se observa que es contrarrestar la actividad de interferona del hospedero, puesto que un virus de inactivación NS1 fue viable aunque creció menos eficiente que el virus parental en las células no defectuosas de interferona (García-Sastre, Virology 252:324-330, 1998).

NS2 se ha detectado en partículas de virus (Richardson y colaboradores, Arch Virol 116:69-80, 1991; Yasuda y colaboradores, Virology 196:249-255, 1993). El número promedio de proteínas NS2 en una partícula de virus se estimó que es 130-200 moléculas. Un ensayo de enlace in vitro muestra el contacto de proteína-proteína directo entre Mi y NS2. Los complejos NS2-M1 también se han detectado mediante la inmunoprecipitación en U sados de células infectados con virus. La proteína NS2 se cree que desempeñan una función de exportación de RNP desde el núcleo a través de la interacción con la proteína MI (Ward y colaboradores, Arch Virol 140:2067-2073, 1995).

VI. VLPs de Influenza y Administración de las Mismas Las VLPs de influenza que comprenden un HA optimizado (tal como la HA que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como cualquiera de SEQ ID NOs: 1-8) se proporcionan en la presente. Las VLPs influenza generalmente son constituidas de las proteínas HA, NA y MI. La producción de VLPs de influenza se ha descrito en la téenica y está dentro de las habilidades de un experto ordinario en la técnica. Por ejemplo, las VLPs de influenza se pueden producir mediante la transfección de células hospedadoras con plásmidos que codifican las proteínas HA, NA y Mi. Después de la incubación de las células transfectadas por un tiempo apropiado para permitir la expresión de proteína (tal como, durante aproximadamente 72 horas), las VLPs se pueden aislar de los sobrenadantes de cultivo de células. El Ejemplo 2 enseguida proporciona un protocolo ejemplar para purificar VLPs de influenzas a partir de sobrenadantes de células. En este ejemplo, las VLPs se aíslan mediante la centrifugación de baja velocidad (para remover los restos celulares), la filtración al vacío y ultracentrifugación a través de glicerol al 20%.

Las VLPs de influenza descritas en la presente se pueden utilizar como vacunas de influenza para inducir una respuesta inmune protectora contra los virus de influenza H1N1.

Las VLPs de influenza, o composiciones de las mismas, se pueden administrar a un sujeto mediante cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir virus recombinante en un sujeto. Los métodos de administración incluyen, pero no están limitados a, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, subcutáneo, vaginal, rectal, intranasal, inhalación u oral. La administración parenteral, tal como la administración subcutánea, intravenosa o intramuscular, generalmente se logran por inyección. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones oo suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en liquido antes de la inyección, o como emulsiones. Las soluciones y suspensiones para inyección se pueden preparar de polvos estériles, gránulos y tabletas de la clase previamente descrita. La administración puede ser sistémica o local.

Las VLPs de influenza, o composiciones de las mismas, se administran de cualquier manera adecuada, tal como con portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que es administrada, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente descripción.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medios amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado, o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen renovadores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolito (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y los similares. Los conservadores y otros aditivos también se pueden presentar tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y los similares.

Algunas de las composiciones se pueden administrar potencialmente como una sal de adición de ácido o de base farmacéuticamente aceptable, formada mediante la reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociánico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico y ácido fumárico, o mediante la reacción con una base inorgánica tal como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio y bases orgánicas tales como mono-, di-, trialquil y aril aminas y etanolaminas sustituidas.

La administración se puede realizar mediante dosis individuales o múltiples. La dosis administrada a un sujeto en el contexto de la presente descripción debe ser suficiente para inducir una respuesta terapéutica benéfica en un sujeto a través del tiempo o para inhibir o prevenir la infección del virus de influenza H1N1. La dosis requerida variará de sujeto a sujeto dependiendo de la especie, edad, peso y condición general del sujeto, la severidad de la infección que es tratada, la composición particular que es utilizada y su modo de administración. Una dosis apropiada se puede determinar por uno de habilidad ordinaria en la téenica utilizando únicamente la experimentación de rutina.

Se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de las VLPs de influenza solas o en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. El portador y la composición puede ser estériles, y la formulación se adapta al modo de administración. La composición también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores de pH. La composición puede ser una solución líquido, suspensión, emulsión, tableta, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa y carbonato de magnesio. Cualquiera de los portadores farmacéuticos comunes, tal como solución salina estéril o aceite de ajonjolí, se puede utilizar. El medio también puede contener materiales adjuntos farmacéuticos convencionales tales como, por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables para ajustar la presión osmótica, amortiguadores, conservadores y los similares. Otros medios que se pueden utilizar con las composiciones y métodos proporcionados en la presente son solución salina normal y aceite de ajonjolí.

Las VLPs de influenza descritas en la presente se pueden administrar solas o en combinación con otros agentes terapéuticos para aumentar la antigenicidad. Por ejemplo, las VLPs de influenza se pueden administrar con un adyuvante, tal como un adyuvante incompleto de Freund o el adyuvante completo de Freund.

Opcionalmente, una o más citoquinas, tales como IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-a, o IFN-g, uno o más factores de crecimiento, tales como GM-CSF o G-CSF; una o más moléculas tales como OX-40L o 41 BBL, o combinaciones de estas moléculas, se pueden utilizar como adyuvantes biológicos (ver, por ejemplo, Salgaller y colaboradores, 1998, J. Surg Oncol 68(2):122-38; Lotze y colaboradores, 2000, Cáncer J. Sel Am. 6(Suppl l):S61-6; Cao y colaboradores, 1998, Stem Cells 16(Suppl l):251-60; Kuiper y colaboradores, 2000, Adv. Exp. Med. Biol . 465:381-90). Estas moléculas se pueden administrar sistémicamente (o localmente) al hospedero.

Un número de medios para inducir respuestas celulares, tanto in vitro como in vivo, son conocidos. Los lipidos se han identificado como agentes capaces de ayudar en el cebado de CTL in vivo contra varios antigenos. Por ejemplo, como es descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 5,662,907, los residuos de ácido palmitico se pueden unir a los grupos amino alfa y épsilon de un residuo de lisina y luego enlazados (por ejemplo, por la vía de uno o más residuos de enlace, tales como glicina, glicina-glicina, serina, serina-serina o los similares) a un péptido inmunogénico. El péptido lipidado luego se puede inyectar directamente en una forma micelar, incorporado en un liposoma o emulsificar en un adyuvante. Como otro ejemplo, las lipoproteinas de E. coli, tal como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina se pueden utilizar para cebar el CTL especifico de tumor cuando se une covalentemente a un péptido apropiado (ver, Deres y colaboradores, Nature 342:561, 1989). Además, como la inducción de anticuerpos neutralizantes también se puede cebar con la misma molécula conjugada a un péptido que exhibe un epitopo apropiado, dos composiciones se pueden combinar para inducir respuestas tanto humorales como mediadas por célula donde lo que se considera es deseable.

Aunque la administración de VLPs que contienen una proteina HA optimizada es ejemplificada en la presente, uno de habilidad en la téenica entendería que también es posible administrar la proteína HA de influenza optimizada por si misma (en la ausencia de una partícula viral) o como una proteina de fusión para inducir una respuesta inmune en un sujeto.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o modalidades particulares. Estos ejemplos no se deben considerar que limiten la descripción a las características o modalidades particulares descritas.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de secuencias COBRA para influenza H1N1 Las secuencias de aminoácidos HA de H1N1 de influenza A se descargaron de la base de datos de Recursos de Virus de Influenza NCBI. Las proteínas HA de H1N1 de los aislados desde 1918-2012 se utilizaron para generar secuencias de consenso. Siete secuencias de consenso diferentes (SEQ ID NOS: 1-7) se generaron utilizando los siguientes métodos: 1. COBRA Método XI (1918-2012) Las secuencias se organizaron por la fecha de aislamiento y nueve secuencias de consenso primarias se generaron utilizando los aislados de 1918-1934 (8), 1935-1947 (13), 1948-1957 (12), 1977-1983 (69), 1984-1991 (19), 1992-99 (59), 2000-2006 (339), 2007-2008 (722) y 2009-2012 (207). Una segunda secuencia de consenso de capa de los virus aislados de 1948-1991 se generó utilizando las tres capas de consenso primarias de los grupos 1948-1957, 1977-1983 y 1984-1991. Como se muestra en la FIG. 2, la secuencia de consenso final (tercera capa; SEQ ID NO: 1) se generó mediante la alineación de seis secuencias de consenso de capa primaria (1918-1934, 1935-1947, 1992-1999, 2000-2006, 2007-2008 y 2009-2012) y la segunda secuencia de consenso de capa (1948-1991). 2. COBRA Método X-2 (1933-1947) Las secuencias se organizaron por la fecha de aislamiento para generar tres secuencias de consenso primarias: 1933-1936 (11), 1940-1946 (8) y 1947 (1). La secuencia de consenso final (SEQ ID NO: 2) se generó al alinear las tres secuencias de consenso primarias, como se muestra en la FIG.2. 3. COBRA Método X-3 (1978-2008) Las secuencias se organizaron por la fecha de aislamiento y cinco secuencias de consenso primarias se generaron utilizando los aislados de 1978-1983 (65), 1984-1991 (19), 1992-1999 (59), 2000-2006 (339) y 2007-2008 (722). Una segunda secuencia de consenso de capa de los virus aislados de 1978-1991 se generó utilizando las dos capas de consenso primarias de los grupos 1978-1983 y 1984-1991 grupos. Como se muestra en la FIG.3, la secuencia de consenso final (SEQ ID NO: 3) se generó mediante la alineación de tres secuencias de consenso de capas primarias (1992-1999, 2000-2006 y 2007-2008) y la segunda secuencia de consenso de capa (1978-1991). 4. COBRA Método X-4 (1918-2005) Las secuencias se organizaron por la fecha de aislamiento y ocho secuencias de consenso primarias se generaron utilizando los aislados de 1918-1934 (8), 1935-1947 (13), 1948-1957 (12), 1977-1983 (68), 1984-1986 (9), 1987-1991 (12), 1992-1999 (59) y 2000-2005 (263). Dos segundas secuencias de consenso de capa (1918-1957 y 1978-1991) se generaron. La secuencia de consenso secundaria de 1918-1957 se generó utilizando las tres capas de consenso primarias de los grupos 1918-1934, 1935-1947 y 1948-1957. La secuencia de consenso secundaria 1978-1991 se generó utilizando las tres capas de consenso primarias de los grupos 1977-1983, 1984-1986 y 1987- 1991. Como se muestra en la FIG.4, la secuencia de consenso final (SEQ ID NO: 4) se generó mediante la alineación de dos secuencias de consenso de capas primarias (1992-1999 y 2000-2005) y las dos segundas secuencias de consenso de capa (1918-1957 y 1978-1991). Esta secuencia es de-glicosilada en las posiciones 142 y 177. 5. COBRA Método X-5 (1982-2012) Las secuencias se organizaron por la fecha de aislamiento y siete secuencias de consenso primarias se generaron utilizando los aislados de 1982-1983 (4), 1984-1986 (9), 1987-1991 (12), 1992-1999 (27), 2000-2006 (339), 2007-2008 (722) y 2009-2012 (207). Una segunda secuencia de consenso de capa (1982-1986) se generó utilizando las dos capas de consenso primarias de los grupos 1982-1983 y 1984-1986. Como se muestra en la FIG.5, la secuencia de consenso final (SEQ ID NO: 5) se generó por la alineación de cinco secuencias de consenso de capas primarias (1987-1991, 1992-1999, 2000-2006, 2007-2008 y 2009-2012) y la segunda secuencia de consenso de capa (1982— 1986) . 6. COBRA Metodo X-6 (1999-2012) Las secuencias se organizaron por la fecha de aislamiento para generar cuatro secuencias de consenso primarias: 1999 (5), 2000-2006 (339) 2007-2008 (722) y 2009- 2012 (207). La secuencia de consenso final (SEQ ID NO: 6) se generó al alinear las cuatro secuencias de consenso primarias, como se muestra en la FIG.6. 7. Método COBRA A-5 (1918-2008) Las secuencias se organizaron por fecha de aislamiento y 12 secuencias de consenso primarias se generaron utilizando los aislados de 1918 (1), 1976 (4), 2009-2011 (123), 1933-1934 (8), 1935-1947 (13), 1948- 1957 (12), 1977-1983 (68), 1984-1986 (9), 1987-1991 (12), 1992-1999 (27), 2000-2005 (59) y 2006-2008 (798). Cuatro secuencias de consenso secundarias se generaron al agrupar las secuencias de consenso primarias de acuerdo con las secuencias de "cerdo" o por la fecha (1933-1957, 1977-2005 y 2006-2008), como se muestra en la FIG.7. La secuencia de consenso final (el tercer consenso de capa; SEQ ID NO: 7) se generó mediante la alineación de las cuatro secuencias de consenso secundarias.

La secuencia de aminoácidos COBRA generada de acuerdo con cualquiera de los ambos métodos se puede traducir inversamente y optimizar para la expresión en células de mamífero, incluyendo la utilización de codón y la optimización de RNA (GeneArt; Regensburg, Alemania). Las secuencias de ácidos nucleicos optimizadas se pueden insertar en el vector de expresión pTR600 (Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2002/0106798; Ross y colaboradores, Nat Immunol . 1(2):102-103, 2000; Green y colaboradores, Vaccine 20:242-248, 2001) o cualquier otro vector adecuado para la expresión.

Ejemplo 2: Preparación de e inmunización con VLPs de influenza Los siguientes métodos se pueden utilizar para producir y caracterizar VLPs de influenza que comprenden una HA optimizada. Métodos ejemplares para inmunización de ratones, hurones y macacos también se describen enseguida (ver también, Giles y Ross, Vaccine 29(16):3043-3054, 2011).

Preparación de la Vacuna Las células 293T se transfectan transientemente con plásmidos que expresan MI, y NA y una HA optimizada, y se incuban durante 72 horas a 37°C. Las secuencias de codificación de Mi, NA y HA pueden ser optimizadas en codón para la expresión en células de mamífero. Los sobrenadantes se recolectan y los restos celulares se remueven mediante centrifugación de baja velocidad seguida por filtración al vacio a través de un filtro estéril de 0.22 pm. Las VLPs se purifican por la vía de la ultracentrifugación (100,000 xg a través de glicerol al 20%, peso por volumen) durante 4 horas a 4°C. Los pelotillas se resuspenden subsecuentemente en PBS pH 7.2 y se almacenan en alícuotas de un solo uso a -80°C hasta el uso. La concentración de proteína total se determina por el Equipo de Reactivo de Ensayo de Proteína Micro BCA™ (Pierce Bioteenología, Rockford, II, USA).

Determinación de la dosis El contenido específico de HA se puede determinar mediante el manchado de Western y densitometría. La HA de COBRA recombinante purificada y la VLPs purificadas se preparan en cantidades de proteínas totales estándar y se someten a electroforesis en gel SDS-PAGE al 10% y se transfirieren a una membrana de PVDF. La mancha se sondea con antisuero policlonal de ratón a partir de los ratones infectados con influenza y los complejos de HA anticuerpo se detectan utilizando IgG antiratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotech; Birmingham, AL, USA). HRP se detecta mediante el sustrato quimioluminiscente (Pierce Biotechnology, Rockford IL, USA) y se expone a la película de rayos X (ThermoFisher; Pittsburgh, PA, USA). La densidad de las bandas se determina utilizando el software ImageJ (N1H). La densidad de las bandas HA recombinante se utiliza para calcular una curva estándar y la densidad de las VLPs purificadas se interpola utilizando los resultados de la HA recombinante.

Estudios en ratón Ratones BALB/c {Mus musculis , hembras, de 6-8 semanas de edad) se pueden comprar de Harían Sprague Dawlcy (Indianapolis, IN, USA). Los ratones se alojan en unidades micro aisladoras y se les permite el libre acceso al alimento y al agua y se cuidan bajo las guias de USDA para animales de laboratorio. Los ratones se vacunan con una de tres dosis de VLPs de HA de COBRA purificadas (1.5 mg, 0.3 mg o 0.06 pg), en base al contenido de HA de un ensayo de densitometría, por la vía de la inyección intramuscular en la semana 0 y luego reforzada con la misma dosis en la semana 3. Las vacunas en cada dosis se formulan con adyuvante de alumbre (Alumbre Imject, Pierce Bioteenología; Rockford, IL, USA), oligonucleótidos CpG o el vehículo únicamente. Catorce a veintiún días después de cada vacunación, la sangre se recolecta de los ratones anestesiados por la vía del plexo retro-orbital y se transfieren a un tubo de microcentrífuga. Los tubos se centrifugaron y el suero se remueve y se congela a -80 ± 5°C. El título de anticuerpo de suero de inhibición de hemoaglutinación (HAI) para cada grupo con vacuna se determina en la semana 5 utilizando virus reclasificantes representativos o VLPs de HA de COBRA.

Tres semanas después de la vacunación final, los ratones se estimulan intranasalmente con un virus HlNl altamente patogénico en un volumen de 50pl. Después de la infección, los ratones se monitorean diariamente para la pérdida de peso, signos de enfermedad y muerte por 14 días después de la infección. Los pesos corporales individuales, registros de malestar (Toapanta y Ross, Respiratory Research 10(1):112, 2009) y muerte se registran para cada grupo en cada día después de la inoculación.

Estudios en hurón Hurones Fitch ( Mustela putorius furo, hembra, 6-12 meses de edad), naive de influenza y desperfumados, se pueden comprar de Marshall Farms (Sayre, PA, USA). Los hurones se alojan por pares en jaulas de acero inoxidable (Shor-line, Kansas City, KS, USA) que contiene cama de Animal de Laboratorio Sani-ch.ips (P.J. Murphy Forest Products, Montville, NJ, USA). Los hurones se proporcionan con Dieta de Hurón Global Teklad (Harían Teklad, Madison, WI, USA) y agua fresca ad libitum. La VLPs de HA COBRA se diluye en PBS, pH 7.2 para lograr la concentración final. Los hurones se vacunaron con una de dos dosis de VLPs COBRA purificadas (15 mg, 3 pg), en base al contenido de HA como es determinado por el ensayo de densitometría, por la vía de la inyección intramuscular en el músculo cuádriceps en un volumen de 0.25 mi en la semana 0 y luego reforzado con la misma dosis en la semana 3. Las vacunas se almacenar a -80°C antes del uso y formulan con adyuvantes de alumbre (Alumbre Imject; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) inmediatamente antes del uso. Los animales se monitorean para eventos adversos incluyendo la pérdida de peso, temperatura, disminución de la actividad, descarga nasal, estornudos y diarrea semanalmente durante el régimen de vacunación. Antes de la vacunación, los animales se confirman mediante el ensayo de HAI que con seronegativos para circular virus de influenza A e influenza B. Catorce a veintiún dias después de alcanzar la vacunación, la sangre se recolecta de los hurones anestesiados por la vía de vena cava anterior y se transfiere a un tubo de microcentrifuga . Los tubos se centrifugan y el suero se remueve y se congelaron a -80 ± 5°C. El titulo de anticuerpo de suero HAI para cada grupo con vacuna se determina en la semana 5 utilizando virus reclasificantes representativos o VLPs de HA de COBRA.

Tres semanas después de la vacunación final, los hurones se estimulan intranasalmente con un virus H1N1 altamente patogénico en un volumen de 1 mi. Después de la infección, los hurones se monitorean diariamente para la pérdida de peso, signos de enfermedad y muerte por 14 dias después de la infección. Los pesos corporales individuales, registros de malestar y muerte se registran para cada grupo en cada día después de la inoculación. Los lavados nasales se realizan al instilar 3 mi de PBS en las fosas nasales de los hurones anestesiados cada día durante 7 dias después de la inoculación. Los lavados se recolectan y se almacenan a -80°C hasta el uso.

Inmunizaciones en primate Macacos cinomolgus ( Macaca fascicularis, machos, 3-5 años de edad) se pueden comprar de Harían Sprague Dawlcy (Indianapolis, IN, USA). Los macacos se vacunan con VLPs de HA COBRA purificada (15 pg) en base al contenido de HA a partir de un ensayo de densitometria, por la vía de inyección intramuscular en la semana 0 y luego reforzadas con la misma dosis en las semanas 3 y 6. Las vacunas se formulan con adyuvante de alumbre (Alumbre Imject, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) inmediatamente antes del uso. Veintiún dias después de cada vacunación, la sangre se recolecta de los macacos anestesiados por la via de la vena femoral y se transfieren a un tubo separador de suero. Los tubos se dejan activar la coagulación seguido por la centrifugación y el suero se remueve y se congela a -80 ± 5°C. Los títulos IgG de punto final y el título de anticuerpos en suero HAI para cada grupo con vacuna se determina en la semana 5 utilizando virus reclasificantes representativos o VLPs de HA COBRA.

Tres semanas después de la vacunación final, los macacos se estimulan mediante inoculación intranasal, intratraqueal, y orbital, con un virus H1N1 altamente patogénico en un volumen de 1 mi. Después de la infección, los macacos se monitorean diariamente para la pérdida de peso, los signos de enfermedad y muerte durante 5 días después de la infección. Los pesos corporales individuales, registros de malestar y muerte se registran para cada grupo en cada día después de la inoculación.

Ejemplo 3: Estudios H?I después de la inmunización de ratones con VLPs que contienen HA COBRA Las VLPs de influenza que contienen HA COBRA se generaron como es descrito en el Ejemplo 2. Ratones BALB/c hembras (6-8 semanas de edad) se vacunaron intramuscularmente con 3 mg de VLPs que contienen HA COBRA del Método X-l (SEQ ID NO: 1), Método X-2 (SEQ ID NO: 2), Método X-3 (SEQ ID NO: 3), Método X-4 (SEQ ID NO: 4), Método X-5 (SEQ ID NO: 5) o Método X-6 (SEQ ID NO: 6). Los ratones se vacunaron en la semana 0 (dosis de inicio) y se reforzaron en las semanas 4 y 12. Las vacunas se formularon con adyuvante de alumbre (Alumbre Imject, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). En las semanas 0, 4, 8, 12 y 14, muestras de sangre se recolectaron de los ratones anestesiados por la vía del plexo retro-orbital. En la semana 14, los títulos de inhibición de hemaglutinación (HAI) contra un panel de virus de influenza se determinaron. También en la semana 14, los ratones se estimularon intranasalmente con el virus H1N1 patogénico.

Los títulos de anticuerpos de suero de HAI contra un panel de cepas de influenza H1N1 (Puerto Rico/8/1934, Fort Monmouth/1/1947, Brasil/1978, Chile/1983, Singapur/6/1986, Texas/36/1991, Beijing/1995, Nueva Caledonia/20/1999, Solomon Island/2006, Brisbane/59/2007 y California/07/2009) se determinaron en la semana 14. Los resultados se muestran en las FIG. 9A-9F.

En vista de las muchas modalidades posibles a los cuales los principios de la invención descrita se pueden aplicar, se debe reconocer que las modalidades ilustradas son uncialmente ejemplos preferidos de la invención y no se deben tomar como limitantes del alcance de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto los inventores reclaman como su invención todo lo que viene dentro del alcance y espíritu de estas reivindicaciones.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de hemaglutinina (HA) de influenza recombinante, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos: (i) por lo menos 96% idéntica a SEQ ID NO: 1 o por lo menos 96% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 1; (ii) por lo menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 2 o por lo menos 99% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 2; (iii) por lo menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 3 o por lo menos 99% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 3; (iv) por lo menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 4 o por lo menos 99% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 4; (v) por lo menos 98.4% idéntica a SEQ ID NO: 5 o por lo menos 98.4% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 5; (vi) por lo menos 99% idéntica a SEQ ID NO: 6, o por lo menos 99% idéntica a los residuos 2-565 de SEQ ID NO: 6; (vii) por lo menos 97% idéntica a SEQ ID NO: 7 o por lo menos 97% idéntica a los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 7; o (viii) que comprende la SEQ ID NO: 8.

2. Un polipéptido HA de influenza recombinante, caracterizado porque comprende: (i) no más de 10 sustituciones de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 1/ (ii) no más de 8 sustituciones de aminoácido con relación a SEQ ID NO : 2 ; (iii) no más de 6 sustituciones de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 3; (iv) no más de 7 sustituciones de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 4; (v) no más de 9 sustituciones de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 5; (vi) no más de 6 sustituciones de aminoácidos con relación a SEQ ID NO: 6; o (vii) no más de 10 sustituciones de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 7.

3. El polipéptido HA de influenza recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 1, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 2, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 3, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 4, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 5, residuos 2-565 de SEQ ID NO: 6 o residuos 2-566 de SEQ ID NO: 7.

4. El polipéptido HA de influenza recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos de los residuos 2-566 de SEQ ID NO: 1, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 2, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 3, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 4, residuos 2-566 de SEQ ID NO: 5, residuos 2-565 de SEQ ID NO: 6 o residuos 2-566 de SEQ ID NO: 7.

5. El polipéptido HA de influenza recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

6. El polipéptido HA de influenza recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 7.

7. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica el polipéptido HA de influenza de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ácido nucleico es optimizado en codón para la expresión en células de mamífero.

9. Un vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7 o reivindicación 8.

10. El vector de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende un promotor operablemente enlazado al ácido nucleico que codifica el polipéptido HA de influenza.

11. Una célula aislada, caracterizada porque comprende el vector de la reivindicación 9 o reivindicación 10.

12. Una partícula similar a virus (VLP) de influenza, caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

13. La VLP de influenza de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque además comprende una proteina neuraminidasa (NA) de influenza, una proteina de matriz (Mi) de influenza, o ambas.

14. Una VLP de influenza, caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, producida al transfectar una célula hospedera con un vector que codifica el polipéptido HA, un vector que codifica una proteina NA de influenza y un vector que codifica una proteina Mi de influenza bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de las proteínas HA, MI y NA.

15. Una proteina de fusión, caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

16. Una composición, caracterizada porque comprende el polipéptido HA de influenza de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, la proteina de fusión de la reivindicación 15, o la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 13-15 y un portador farmacéuticamente aceptable.

17. Un método para inducir una respuesta inmune al virus de influenza en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar el polipéptido HA de influenza de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, la proteina de fusión de la reivindicación 16, la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 12-14 o la composición de la reivindicación 16.

18. Un método para inmunizar a un sujeto contra el virus de influenza, caracterizado porque comprende administrar al sujeto una composición que comprende la VLP de cualquiera de las reivindicaciones 12-14 y el portador farmacéuticamente aceptable.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la composición además comprende un adyuvante.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o reivindicación 19, caracterizado porque la composición se administra intramuscularmente.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque la composición comprende aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg de la VLP.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la composición comprende aproximadamente 15 pg de la VLP.