CN101163714A - 流感病毒核酸、多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了编码流感病毒多肽的密码子优化的核酸以及该核酸和多肽在诱导免疫应答中的用途。

Description

流感病毒核酸、多肽及其用途
对相关申请的交叉引用
本申请要求2005年2月24日提交的美国临时申请号60/655,979的优先权，其内容在此全部引入作为参考。
技术领域
本发明涉及病毒核酸序列、蛋白质以及亚单位(核酸以及重组蛋白)疫苗，更详细地涉及已优化用于在哺乳动物宿主细胞中表达的病毒核酸序列。
背景技术
流感病毒为全球性的公共健康问题。仅在美国流感每年平均就使20,000人死亡，超过数千人住院治疗(Palese and Garcia-Sastre，J.Clin.Invest.，110(1)：9-12，2002)。近半数的美国人被推荐接种疫苗(Couch，Ann.Intern.Med.，133：992-998，2000)。流感病毒每年也引起数以千计的家畜死亡。
目前可利用的疫苗的有效性倚赖于疫苗抗原与那些流通的流感病毒毒株匹配的程度。对具体类型的流感病毒抗原的免疫应答可以是与另一种类型流感病毒编码的抗原微弱的交叉作用。流感病毒具有经受抗原变化的趋势，这使产生有效疫苗的努力变得复杂。抗原性转变-其当来自不同流感病毒类型的基因在感染的宿主中重配的时候发生，是显著的抗原变化发生的机制。抗原性转变发生于甲型流感病毒中，该类型流感病毒在人类和动物之间传播。B型流感病毒更限于人类并认为不经受抗原性转变(Palese andGarcia-Sastre，J.Clin.Invest.，110(1)：9-12，2002)。抗原性漂移为另一个较不激烈的机制，在该机制中病毒基因随着时间的推移积聚突变。这两种类型的抗原变化增加了产生有效防止范围宽广的流感病毒毒株的疫苗的难度。
概述
我们已发现编码流感病毒多肽如流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(Na)或膜离子通道(M2)的核酸的密码子优化形式对在适当的宿主细胞中表达此类多肽有用。密码子优化能比天然的病毒密码子产生更有效的表达。提高的表达对于产生大量治疗和诊断应用的多肽有益。编码在哺乳动物宿主细胞中有效表达的流感病毒抗原的核酸非常有用，例如对于诱导对宿主内抗原的免疫应答。在此所述的核酸序列当施用于动物时可以诱导更高水平的流感病毒抗原的特异抗体(与未密码子优化的核酸序列相比)。在各种实施例中，核酸序列当在哺乳动物受试者中表达时诱导血细胞凝集抑制和/或病毒中和抗体。
而且，在哺乳动物细胞内产生的病毒蛋白能正确的折叠与天然的结合伴侣寡聚化和/或能拥有转录后修饰如糖基化。这些特性能提高免疫原性，因此增加了用蛋白接种(或以编码蛋白的核酸)提供的保护性。通过合成的方式可以构建密码子优化的核酸，避免从活病毒中获得核酸的需要并增加序列操作的便利。
我们也已发现了用于免疫应答的新颖的多价组合物(polyvalentcompositions)和多组分组合物(Multi-component compositions)。多组分组合物包括或编码多种不同的流感病毒多肽或其抗原性片段，例如它们包括或编码HA、NA和/或M2。多价组合物包括或编码多种形式的来自不同亚型的单抗原，如来自亚型H1、H2、H3、H5、H7和/或H9的HA。
相应地，本发明一方面涉及分离的核酸分子，其包括编码流感病毒多肽或其抗原性片段的序列，其中，所述序列的全部或部分已得以密码子优化用于在宿主细胞(例如真核细胞，例如哺乳动物细胞，如人类细胞)中表达。在各种实施例中，相对于野生型病毒序列、普通的哺乳动物基因密码子，超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的序列中的密码子发生突变。
例如，在此提供包括编码流感病毒型血凝素(HA)多肽或其抗原性片段的密码子优化序列的分离的核酸分子。在一实施例中，序列为在人类细胞中表达进行了密码子优化。所述序列可编码例如B型流感病毒HA多肽或甲型流感病毒HA多肽，例如选自下列亚型的HA多肽：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14和H15。
所述序列可编码H1亚型的HA多肽，例如，其中序列与SEQ ID NO：1或与含有至少30个SEQ ID NO：1的连续核苷酸的SEQ ID NO：1的片段具有至少70％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。所述序列可编码H3亚型的HA多肽，例如，其中所述序列与SEQID NO：3或与含有至少30个SEQ ID NO：3的连续核苷酸的SEQ ID NO：3的片段具有至少70％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。所述序列可还编码前导肽，例如，自然地不与HA多肽结合的前导肽，例如哺乳动物前导肽，例如，组织纤溶酶原激活物(tissueplasminogen activator(tPA))前导肽。
所述序列编码的HA多肽片段包括，例如HA多肽的HA1结构域、HA多肽的HA2结构域或HA的胞外区。
编码HA多肽的序列不同于自然发生的病毒HA序列。例如，编码H1 HA的密码子优化序列通过至少5、10、15、20、25、50、100或150个核苷酸不同于SEQ ID NO：7。在某些实施例中，编码H1HA的密码子优化序列通过少于400、350、300或250个核苷酸不同于SEQ ID NO：7。在另一个实例中，编码H3 HA的密码子优化序列通过至少5、10、15、20、25、50、100或150个核苷酸不同于SEQ ID NO：8。在某些实施例中，编码H3HA的密码子优化的序列通过少于400、350、300或250个核苷酸不同于SEQ IDNO：8。密码子优化的序列可编码与自然发生的病毒序列编码的多肽具有95％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽。
在某些实施例中，编码甲型流感病毒HA多肽或其抗原性片段的分离的核酸分子包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：3。
本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其包括编码流感病毒神经氨酸酶(NA)多肽或其抗原性片段的序列，其中，所述序列已经得以密码子优化用于在人类细胞中表达。序列编码例如B型流感病毒NA多肽或甲型流感病毒NA多肽，例如选自下列亚型的NA多肽：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和N9。
在一实施例中，序列编码N2亚型的NA多肽，其中所述序列与SEQ IDNO：5具有至少70％、80％、85％、87％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％的同一性。所述序列能还编码前导肽，例如，自然地不与流感病毒NA多肽结合的前导肽，例如，哺乳动物前导肽，例如，组织纤溶酶原激活物(tPA)前导肽。
编码NA多肽的序列不同于自然发生的病毒NA序列。例如，编码NA的密码子优化的序列通过至少5、10、15、20、25、50、100或150个核苷酸不同于SEQ ID NO：9。在某些实施例中，编码NA的密码子优化的序列通过少于350、300、250或200个核苷酸不同于SEQ ID NO：9。
在一实施例中，编码NA多肽或其抗原性片段的分离的核酸分子包括SEQ ID NO：5。
在此也提供了分离的核酸分子，其包括编码两或多个拷贝的流感病毒M2多肽的胞外区的序列，例如，其中两或多个拷贝的流感病毒M2多肽的胞外区作为单融合的多肽得以表达。也提供了编码M2多肽以及含有两个或多个拷贝的M2多肽的融合物(fusions)的密码子优化的序列。M2序列可另外包括编码作为与两个或多个拷贝的M2多肽胞外区的融合物的流感病毒HA多肽或NA多肽的第二序列。
在此所述的核酸分子能可操作性地连接于启动子。在此也提供了核酸表达载体，其包括在此所述的一个或多分核酸分子。在此也提供了一个组合物，其包括在此所述的核酸分子以及可操作性地连接于核酸分子的哺乳动物启动子，其中，启动子指导编码流感病毒多肽的mRNA的转录(例如巨细胞病毒立即早期启动子)；以及可操作性地连接于核酸分子的哺乳动物多腺苷酸化信号(例如获得自牛生长激素基因的多腺苷酸化信号)。组合物还包括佐剂和/或可药用载体。在某些实施例中，组合物还包括核酸分子结合的微粒，例如，其中微粒适于基因枪、皮层内、肌肉内或粘膜施用。
在此也提供了含有一或多种在此所述的核酸的细胞。细胞是例如真核细胞，如哺乳动物细胞，如人类细胞。
本发明另一个方面涉及在此所述的核酸分子编码的多肽，例如，其中多肽在哺乳动物细胞如人类细胞中产生。也提供了特异地与多肽结合的抗体或其抗原结合片段。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
仍然在另一方面，本方面涉及包括各种序列组合的核酸组合物。例如，组合物可包括(a)编码第一个流感病毒亚型的第一类型流感病毒多肽(例如HA)的第一序列；以及(b)编码第二个流感病毒亚型的第一类型流感病毒多肽(例如HA)的第二序列。第一和第二序列编码，例如，HA多肽或其抗原性片段、NA多肽或其抗原性片段或M2多肽或其抗原性片段。在各种实施例中，第一和第二流感病毒亚型都是甲型流感病毒亚型(例如，第一个亚型是甲型流感病毒H1N1，第二个流感病毒亚型是甲型流感病毒H3N2)；第一和第二流感病毒亚型都是流感病毒B亚型；或第一流感病毒亚型是甲型流感病毒亚型而第二流感病毒亚型是流感病毒B亚型。一个或两个序列可得以密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。例如，组合物可包括与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5具有至少99％同一性的序列。在一实施例中，组合物可包括与SEQ ID NO：1具有至少90％、95％、97％或99％同一性的序列以及与SEQ ID NO：3具有至少90％、95％、97％或99％同一性的序列。在某些实施例中，组合物还含有编码第三流感病毒亚型的第一类型流感病毒多肽的序列。
在某些实施例中，组合物还含有编码第二类型流感病毒多肽的序列。例如，组合物可包括编码第一亚型和第二亚型的HA多肽(例如H1HA和H3HA)以及也包括编码NA多肽的序列。
在某些实施例中，核酸组合物还包括一或多种类型的流感病毒多肽(例如一或多种HA、NA以及M2)。在某些实施例中，组合物还包括含有流感病毒粒子的第二组合物，例如活的和/或失活的病毒粒子。在各种实施例中，第二组合物包括两个或多个类型的流感病毒粒子，例如，三种类型的流感病毒粒子，例如失活的甲型流感病毒H1 N1病毒粒子、失活的甲型流感病毒H3N2病毒粒子以及失活的流感病毒B病毒粒子。
也提供了包括在此所述的核酸组合物的药物组合物。该组合物可另外包括佐剂。
本方面的另一方面涉及包括下列序列的核酸组合物：(a)编码第一流感病毒亚型的第一流感病毒多肽的序列；以及(b)编码第一流感病毒亚型或第二流感病毒亚型的第二流感病毒多肽的序列；其中，(a)的序列以及(b)的序列已经得以密码子优化用于在哺乳动物细胞中表达。例如，第一和第二流感病毒多肽选自血凝素(HA)多肽或其抗原性片段、流感病毒神经氨酸酶(NA)多肽或其抗原性片段或流感病毒膜离子通道(M2)多肽。在某些实施例中，组合物还包括编码第三流感病毒多肽的序列。在一实施例中，第一多肽是带有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5具有至少90％例如95％、97％、98％，、9％或100％同一性的序列的流感病毒HA多肽。
组合物可另外包括一或多种类型的流感病毒多肽，例如，组合物还包括含有流感病毒粒子的组合物，例如活的和/或失活的病毒粒子。组合物可包括其它在此所述的特性。
本发明也涉及在受试者(例如需要治疗流感病毒的受试者或处于暴露于流感病毒危险中的受试者)体内诱导对一或多种流感病毒多肽的免疫应答的方法。该方法包括，例如，对受试者施用在此所述的组合物，其中施用足够量的组合物，以使得序列表达一或多种足够量的流感病毒多肽，以在受试者体内诱导免疫应答。该方法还包括对受试者施用含有流感病毒多肽的第二组合物。在一实施例中，第二组合物含有流感病毒粒子，例如活的和/或失活的病毒粒子，例如活的、衰减的病毒粒子。在一实施例中，施用两种类型或多种类型的流感病毒粒子，例如，三种类型的流感病毒粒子，例如失活的流感病毒粒子。在一实施例中，三种类型的流感病毒粒子是失活的甲型流感病毒H1N1病毒粒子、失活的甲型流感病毒H3N2病毒粒子以及失活的流感病毒B病毒粒子。可以与第一组合物同时、在第一组合物之前或之后施用第二组合物。
在此也提供了产生流感病毒多肽的方法。该方法包括提供在此所述的核酸分子；以及在核酸分子编码的流感病毒多肽产生的条件下在宿主细胞内(例如哺乳动物细胞，例如人类细胞)表达核酸。该方法可另外包括从细胞中分离含有流感病毒多肽的组合物。
为了更易于理解本方面，首先定义某些术语。其它的定义通过详细的描述提出。
“亚单位”疫苗是活性组分抗原仅仅是病原体的一部分的疫苗，例如，具有多种蛋白的病原体中的一种蛋白或此种蛋白的片段。
“核酸疫苗”是此类疫苗，即其活性组分是至少编码多肽抗原的一分离的核酸。
“重组蛋白疫苗”是这样一种疫苗，即其活性组分是至少一种通过重组体表达产生的蛋白抗原。
“分离的核酸”是在目的基因自然发生的有机体或病毒的基因组中，不含有位于目的基因两侧的基因的核酸，因此，术语包括结合至哺乳动物体系中自主表达的质粒的重组DNA。它也包括单个的分子例如cDNA、基因组片段、多聚酶裢式反应产生的片段或限制片段。它也包括重组核苷酸序列，其是杂交基因的部分，即编码融合蛋白的基因。分离的核酸当通过重组技术产生时基本上不含其它的细胞或病毒物质(例如，不含病毒载体的蛋白组分)或培养物培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它的化学物质。
当表达控制序列结合至其它的核酸时，将它们“可操作性地”连接至目的基因，以便它们能有效控制基因的表达。
“佐剂”为能增加核酸组合物和/多肽组合物在受试者体内产生免疫应答能力的化合物或化合物的混合物。
“哺乳动物启动子”是不管来源的任意核酸序列，其能在哺乳动物细胞中驱动编码多肽的mRNA的转录。
“哺乳动物多腺苷酸化信号”是不管来源的任意核酸序列，其能在哺乳动物细胞内终止编码多肽的mRNA的转录。
“蛋白质”与“多肽”交互适用，并包括在体外产生的多肽以及在核酸序列施用于宿主动物或人类的受试者后在体内表达的多肽。“多肽”至任一链氨基酸，不管其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。
“抗流感病毒抗体”是特异地与流感病毒抗原如HA或NA相互作用(例如特异性与之结合)的抗体。
如在此所用的，术语“治疗(treat或treatment)”定义为将编码流感病毒抗原或其片段或抗流感病毒抗体的核酸应用于或施用于受试者例如患者，或应用于或施用于来自受试者如病人的组织或细胞，将组织或细胞再返回至病人。治疗也包括施用核酸编码的多肽或特异地与多肽结合的抗体。核酸可以单独施用或与第二药剂组合施用。受试者可是患有流感病毒的、具有流感病毒症状、具有患流感病毒倾向的患者，或处于染上流感病毒感染的风险中的患者。治疗可治愈(cure)、愈合(heal)、缓和(alleviate)、缓解(relieve)、改变(alter)、治疗(remedy)、减轻(palliate)、改善(ameliorate)、改善(improve)或影响(affect)流感病毒的感染或症状。
如在此所用的，核酸、蛋白或抗流感病毒抗体有效治疗失调的量或“治疗上有效的量”指在治疗患有流感病毒的受试者中以单个或多个剂量对患者施用有效的量。如在此所用的，蛋白、抗流感病毒抗体有效阻止或抑制流感病毒感染和/或流感病毒引起的疾病的量或抗体的“预防疾病上有效的量”指以单个或多个剂量对患者施用在抑制或推迟流感病毒发作或复发的发生或减轻其症状(例如减轻症状的严重性)中有效的量。
除非另有说明，所有在此所用的技术和科学术语都与本发明所属的技术领域内的普通技术人员所理解的具有相同意思。尽管与在此所描述的那些相似或相同的材料和方法可用于本发明的实践或测试中，但适宜的材料和方法在下文描述。引入所有在此提及的出版物、专利申请、专利以及其它的参考文献的全部内容作为参考。如有冲突，以本发明的说明书，包括限定为准。另外，材料、方法以及实例仅是示例型的并非故意的限制。
本发明实施例的详细内容在下文与图示以及描述一同阐明。根据描述、图示以及权利要求，本发明其它的特色、目标以及优势是显而易见的。对于所有的目的，引入所有引用的专利、专利申请以及参考文献(包括对公用序列数据库条目的参考)的全部内容作为参考。对于所有的目的，引入美国临时申请号60/655,979的全部内容作为参考。
附图说明
图1A为密码子优化的甲型流感病毒H1的HA核酸序列(SEQ IDNO：1)。以下是这些序列内编码的每一个结构域的划界：核苷酸1-69编码前导肽；70-1032编码HA1结构域；1033-1695编码HA2结构域；1585-1653编码膜结构域；1654-1695编码胞质结构域。
图1B是图1A中的核酸序列编码的甲型流感病毒H1的HA氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。氨基酸1-23对应于前导序列；24-344对应于HA1结构域；345-565对应于HA2结构域；529-551对应于跨膜结构域；552-565对应于胞质结构域。
图2A是甲型流感病毒H3经密码子优化的HA核酸序列(SEQ IDNO：3)。以下为这些序列内编码的每一个结构域的划界：1-63编码前导肽；64-1035编码HA1结构域；1036-1695编码HA2结构域；1585-1653编码跨膜结构域；1654-1695胞质结构域。
图2B是甲型流感病毒H3的、由图2A中核酸序列编码的HA氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。氨基酸1-21对应于前导序列；22-345对应于HA1结构域；346-565对应于HA2结构域；529-551对应于跨膜结构域；552-565对应于胞质结构域。
图3A是在此所述的核酸构建体编码的流感病毒H1的各种HA多肽。“Wt”指与流感病毒多肽天然相关(naturally associated)的前导序列。“tPA”指组织纤溶酶原前导序列。“dTM”指缺少跨膜结构域以及胞质结构域的多肽。
图3B是在此所述的流感病毒H3的各种HA多肽。“dTM”指缺少跨膜结构域以及胞质结构域的多肽。
图4A是在293T细胞内表达的H1 HA多肽(泳道1)的SDS-PAGE以及Western印迹分析，与阴性对照(仅仅是载体；泳道2)比较。
图4B是在293T细胞内表达的H1HA多肽(泳道1)的SDS-PAGE以及Western印迹分析，与阴性对照(仅仅是载体；泳道2)比较。
图5A-5I是兔用编码流感病毒HA多肽的各种经密码子优化的DNA载体免疫后所得的抗血清的反应性的试验结果。兔以下列载体免疫：H1-wt.HA0、H1-tPA.HA0、H1-tPA.HA0.dTM(图5A)；H1-tPA.HA1、H1-tPA.HA2、H1-tPA-HA2.dTM(图5B)；H3-wt.HA0、H3-tPA.HA0、H3-tPA.HA0.dTM(图5D)；H3-tPA.HA1.H3-tPA.HA2、H3-tPA-HA2.dTM(图5E)；H1+H3 tPA.HA0.dTM、H1+H3tPA.HA1或空载体(图5C以及5F)。血清中HA特异性抗体在每一个时间点的量通过ELISA测定，并绘图。图5G显示经不同的H1 HA载体或空载体免疫的兔血清中的HA特异性IgG滴度。在第四次免疫的2周后，收集在这些试验中分析的血清。图5H显示经不同的H3HA载体或空载体免疫的兔血清中的HA特异性IgG滴度。在第四次免疫的2周后，收集在这些试验中分析的血清。图5I显示经以下两组载体免疫的兔血清中的HA特异性IgG滴度：H1-tPA.HA0.dTM和H3-tPA.HA0.dTM；H1-wt.HA0和H3-tPA.HA0.dTM。
图6A是经密码子优化的甲型流感病毒N2的NA核酸序列(SEQ IDNO：5)。
图6B是图6A中核酸序列编码的甲型流感病毒N2的NA氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图7是在此所述的各种流感病毒离子通道M2多肽。
图8是在此所述的各种流感病毒NA以及NA/M2融合多肽疫苗。
图9是编码甲型流感病毒New Caledonia/20/99的H1HA的序列(SEQID NO：7；也参阅Genbank登录号AJ344014.1、GI No.19849783)。
图10是编码甲型流感病毒/Panama/2007/99(H3N2)的流感病毒H3HA多肽(SEQ ID NO：8)的流感病毒序列。
图11是编码甲型流感病毒/Panama/2007/99(H3N2)的NA的序列(SEQID NO：9；参阅GenBank登录号AJ457937.1、GI No.22859354)。
图12是用经密码子优化的核酸序列(“opt”；泳道1)、野生型核酸序列(“wt”；泳道2)或仅仅载体(泳道3)转染的哺乳动物细胞中表达的H1HA多肽的SDS-PAGE以及Western印迹分析。
图13A是用经密码子优化或未经密码子优化(野生型)的流感病毒蛋白序列免疫的兔抗血清的反应性。血清中HA特异性抗体在每一时间点的量通过ELISA测定，并绘图。兔#316以及#317(实心符号)用编码H1HA的野生型DNA免疫。兔#381以及#382空心符号)用经密码子优化的编码H1HA的DNA免疫。
图13B是用经密码子优化或未经密码子优化(野生型)的流感病毒蛋白序列免疫的兔抗血清的反应性。在以编码H1HA的经密码子优化的DNA或野生型DNA第四次免疫的两周后，检测HA特异性IgG滴度。兔#316以及#317用编码H1HA的野生型DNA免疫。兔#381以及#382用编码H1HA的经密码子优化的DNA免疫。
图13C是用经密码子优化的H1HA DNA(H1-HA.opt)、未经密码子优化的H1 HA DNA(H1-HA.wt)或DNA空载体免疫的小鼠抗血清的反应性。测量的是在在第四次免疫的2周后收集的血清中的HA-特异性IgG滴度。
图14A显示，动物用下列经密码子优化的H1HA DNA载体免疫后，其血清中抗甲型流感病毒H1N1/NewCaledonia/20/99毒株的血凝抑制抗体滴度的测定结果：H1-wt.HA0、H1-tPA.HA0、H1-tPA.HA0.dTM；H1-tPA.HA1、H1-tPA.HA2、H1-tPA-HA2.dTM。对未经免疫的动物的血清样品(预采血)也进行了测试。
图14B显示，动物用下列经密码子优化的H3 HA DNA载体免疫后，其血清中抗甲型流感病毒H3N2/Panama/2007/99毒株的血凝抑制抗体滴度的测定结果：H3-wt.HA0、H3-tPA.HA0、H3-tPA.HA0.dTM、H3-tPA.HA1、H3-tPA.HA2以及H3-tPA-HA2.dTM。对未经免疫的动物的血清样品(预采血)也进行了测试。
图15A显示，动物用下列经密码子优化的H1HA DNA载体免疫后，其血清中抗甲型流感病毒H1N1/NewCaledonia/20/99毒株的中和抗体滴度的测定结果：H1-wt.HA0、H1-tPA.HA0、H1-tPA.HA0.dTM；H1-tPA.HA1、H1-tPA.HA2、H1-tPA-HA2.dTM。对未经免疫的动物的血清样品(预采血)也进行了测试。
图15B显示，动物用下列经密码子优化的H3 HA DNA载体免疫后，其血清中抗甲型流感病毒H3N2/Moscow/10/99毒株的中和抗体滴度的测定结果：H3-wt.HA0、H3-tPA.HA0、H3-tPA.HA0.dTM、H3-tPA.HA1、H3-tPA.HA2以及H3-tPA-HA2.dTM。对未经免疫的动物的血清样品(预采血)也进行了测试。
图16A以及16B显示，动物用下列经密码子优化的DNA的一种双价组合免疫后，其血清中抗甲型流感病毒H1N1/NewCaledonia/20/99毒株(图16A)以及甲型流感病毒H3N2/Panama/2007/99毒株(图16B)的血凝抑制抗体滴度的测定结果：H1-tPA.HA0.dTM+H3-tPA.HA0.dTM；H1-wt.HA0+H3-tPA.HAO.dTM。对未经免疫的动物的血清样品(预采血)也进行了测试。
图16C和16D显示，动物用下列经密码子优化的DNA的一种双价组合免疫后，其血清中抗甲型流感病毒H1N1/NewCaledonia/20/99毒株(图16C)以及甲型流感病毒H3N2/Moscow/10/99毒株(图16D)的血凝抑制抗体滴度的测定结果：H1-tPA.HA0.dTM和H3-tPA.HA0.dTM；以及H1-wt.HA0和H3-tPA.HA0.dTM。对未经免疫的动物的血清样品(预采血)也进行了测试。
图17A和l7B显示，经不同药剂组合免疫的兔血清的HA特异性IgG滴度测试结果。“Fluzone X2”指用流感病毒疫苗Fluzone进行初次免疫和加强免疫的兔。“DNA+Fluzone”是指，在第0周用编码H1 HA和H3 HA抗原的经密码子优化的DNA的双价组合进行初次免疫，然后在第4周用Fluzone进行加强免疫的兔。
各图中类似的参考标记表示类似的元素。
发明详述
流感病毒是人类死亡率的重要原因。对于免疫幼稚(
Figure S2006800138566D00111
)群体和高风险群体，如老年人、年幼者以及卫生保健专业人士，流感病毒感染特别危险。在传播的流感病毒毒株中频繁的抗原变化使设计有效疫苗变得复杂。我们在此描述了对流感病毒提供有效以及范围广泛的免疫的组合物和方法。
大多数人类流感病毒病例是由甲型流感病毒或B型流感病毒引起的。通过两个表面抗原HA以及NA的表达，将流感病毒类型进一步分类。如今在人类中传播的亚型的一个实例是甲型流感病毒H1N1(血凝素1，神经氨酸酶1)。上世纪，在人类中传播的其它甲型流感病毒亚型包括H2N2以及H3N2。发现在甲型流感病毒病毒中有15个HA亚型以及9个NA亚型。许多在非人类的储存宿主中得以供养并且具有在人类居群中引起大流行病的潜力(Wright et al.，Fields Virology，4th Ed.，Knipe and Howley，Eds.，Lippincott，Williams & Wilkins，1：1533-1579，2001；Katz，ASM News，70(9)：412-491，2004)。在最近的120年中引起人类大流行病的亚型包括H2N2、H3N8、H1N1以及H3N2(Wright et al.，Fields Virology，4th Ed.，Knipe andHowley，Eds.，Lippincott，Williams & Wilkins，1：1533-1579，2001)。近年来，H5N1以及H7N7亚型已在家禽中引起疾病的爆发。这些亚型的传播也在人类中引起有限数量的灾难(Webby and Webster，Science，302(5650)：1519-22，2003)。H9N2亚型已在人类中得到检测，并且因此是引起关注的另一个原因(Peiris et al.，Lancet，354(9182)：916-917)。
流感病毒抗原
血凝素(HA)
流感病毒HA是保护的免疫应答定向防御的主要的糖蛋白抗原。在病毒进入之前，被覆流感病毒粒子的HA突起(HA spikes)介导对宿主表面受体的附着以及对寄主细胞膜的融合(参阅：Shaw et al.，Clin.Microbio.Rev.，5(1)：74-92，1992)。天然的HA是作为大约570个氨基酸的单一多肽而合成的，在成熟过程中，其经历了两个翻译后切割。一个切割除去氨基末端的前导肽。另一个切割将多肽分成HA1以及HA2结构域，两者通过二硫键保持彼此连接。对于天然病毒粒子，HA突起形成于HA1-HA2结构域的三聚体。HA的外部结构域经由羟基末端的疏水膜结构域连接于病毒的膜。受体结合位点位于HA1的膜远侧末端。抗原变异区域也在多肽的膜远侧末端形成丛。在一既定的亚型中，HA的氨基酸序列可最多至20％的变异。在不同亚型的HA之间，氨基酸序列的同一性有30％-70％的变异(Skehel and Wiley，Annu.Rev.Biochem.，69：531-569，2000)。编码甲型流感病毒NewCaledonia/20/99的H1 HA多肽的病毒核酸序列(即天然的、非密码子优化的流感病毒序列)显示于图9中(也可参阅SEQ ID NO：7以及Genbank登录号AJ344014.1、GI No.19849783)。编码甲型流感病毒/Panama/2007/99(H3N2)的H3 HA多肽的病毒核酸序列显示于图10中(也可参阅SEQ ID NO：8)。
神经氨酸酶(NA)
流感病毒NA为外切糖苷酶，其从糖蛋白中水解末端的唾液酸残基(sialic residues)。NA多肽的四聚体经由氨基末端的疏水结构域结合于流感病毒粒子的表面。NA的酶促部分位于多肽的膜远侧羧基末端。编码甲型流感病毒/Panama/2007/99(H3N2)NA多肽的病毒核酸序列显示于图11中(也可参阅SEQ ID NO：9以及GenBank登录号AJ457937.1、GI No.22859354)。
膜离子通道(M2)
M2是甲型流感病毒编码的整合型膜蛋白。M2含有23个氨基末端胞外氨基酸残基、19个跨膜残基以及54个胞质残基(Lamb et al.，Cell，40：627-633，1985)。其在感染的宿主细胞表面大量表达，但其仅仅是流感病毒粒子的次要组分。M2具有离子通道活性，该活性受抗病毒药金刚烷胺(amantidine)的抑制(Wang et al.，J.Virol.，67(9)：5585-5594，1993)。M2中的突变，通常是在跨膜区中的突变，引起对金刚烷胺的抗性。
具有氨基酸取代的抗原
可以理解在此所述的流感病毒多肽以及其片段可具有保守的或非必须的氨基酸取代，其对多肽的功能不具有实质的影响。无论具体的取代是否可容忍，即对期望的生物学特性不产生不利的影响，例如结合活性，都可用Bowie et al.，(1990)Science，247：1306-1310所述的方法测定。“保守的氨基酸取代”是这样一种取代，即在该取代中，氨基酸残基为具有相似侧链的氨基酸残基替换(replaced)。具有相似侧链的氨基酸残基家族以及在本领域已得以阐述。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有无电荷的极性侧链的氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
“非必须”氨基酸残基是在基本上没有改变生物学活性的情况下可以从多肽的野生型序列改变的氨基酸残基，例如，作为结合剂，例如抗体，反之，“必须”氨基酸导致此类变化。
构建经过优化的序列
病毒蛋白以及以低水平自然表达的蛋白向重组方式的高效表达提出了挑战。另外，病毒蛋白经常显示在宿主细胞(哺乳动物细胞以及鸟类细胞)中无效翻译的密码子的使用。原产于病毒序列的密码子的改变可以促进这些蛋白更强的表达。已在许多种类中证实了大量表达蛋白的密码子的嗜好(preference)，且能为密码子取代提供指导。密码子优化的序列的合成可通过病毒密码子在克隆序列中的取代实现，例如，通过定点突变或通过利用化学合成构建对应于优化序列的寡核苷酸。参阅例如Mirzabekov et al.，J.Biol.Chem.，274(40)：28745-50，1999。
优化也应该包括考虑其它因素，例如可在体外合成序列(例如，如同寡核苷酸片段)的效率以及影响核酸在细胞内表达的其它特性。例如，应该避免导致预测具有较高的二级结构的RNAs的序列。干扰DNA合成的AT-以及GC-丰富的序列也应该避免。对表达不利的其它基元(motif)包括内部TATA盒、chi-位点、核糖体进入位点、procarya抑制基元、隐蔽剪接供体位点和隐蔽剪接受体位点以及分支点(branch points)。这些特性可手工鉴定也可通过计算机软件鉴定，并且它们可从优化的序列中排除。
密码子优化的核酸编码的流感病毒多肽(例如HA或NA)或其抗原性片段是与自然发生的流感病毒多肽例如HA或NA多肽共享表位的任何多肽。在此提供的流感病毒多肽可通过在氨基酸序列内的添加或取代不同于野生型序列并且保持流感病毒多肽的生物学功能(例如受体结合)。基于在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或有关残基的两亲性方面的相似性，可获得氨基酸取代。
非极性氨基酸(疏水的)包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸以及甲硫氨酸。极性中性的氨基酸(Polar neutralamino acids)包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带有正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。带有负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸以及谷氨酸。
残基的改变优选是保守的改变，例如碱性氨基酸被不同的碱性氨基酸替换，如在此所述的。
核酸、载体以及宿主细胞
在此提供可用于例如优化的流感病毒核酸序列(例如HA、NA或M2)重组表达以及疫苗的分离的核酸、载体以及宿主细胞组合物。
原核或真核宿主细胞可用于流感病毒多肽的表达。术语“宿主细胞”以及“重组宿主细胞”在此交互使用。此类术语不但指具体的受试者细胞(subject cell)也指此类细胞的后裔或潜在的后裔。因为由于突变或环境影响，可在后代(succeeding generations)中发生某些修饰，此类后裔实际上可与亲本细胞不同，但仍然包括于在此所用的术语范围内。宿主细胞可以为任何原核细胞，例如细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞，例如昆虫细胞、酵母、鸟类细胞(例如鸡细胞、鸭子细胞)或哺乳动物细胞(例如培养的细胞或细胞系，例如灵长类细胞如Vero细胞，或人类细胞)。其它适宜的宿主细胞对本领域技术人员而言是已知的。
在此提供的重组表达载体适用于流感病毒多肽(例如HA、NA)、抗流感病毒抗体或其抗原结合片段在原核或真核细胞中的表达。例如在此所述的新多肽可在大肠杆菌、昆虫细胞(例如用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、鸟类细胞或哺乳动物细胞中表达。适宜的寄主细胞在Goeddel，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA，1990中得以进一步的讨论。可选地，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如，用T7启动子调节序列以及T7聚合酶。
蛋白在原核生物中的表达通常用含有指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成性或诱导性启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体将许多氨基酸加入蛋白或在那编码的抗体，通常加入至重组抗体的恒定区域。
用于哺乳动物细胞表达的密码子优化的核酸可使用哺乳动物表达载体在哺乳动物中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.Nature 329：840，1987)以及pMT2PC(Kaufman et al.，EMBO J.6：187-195，1987)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常通过病毒调节元件提供。例如，通常所用的启动子来自多瘤病毒(polyoma)、腺病毒2(Adenovirus 2)、巨细胞病毒以及猿病毒40(cytomegalovirus and Simian Virus40)。对于其它适宜原核细胞和真核细胞的表达系统，参阅例如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989的第16章和17章。
在一实施例中，重组表达载体(例如重组哺乳动物表达载体)能指导核酸优先在具体的细胞类型中表达(例如，在组织特异性调节元件用于表达核酸的细胞类型中)。组织特异性调节元件在本领域内是已知的。组织特异性调节元件的非限制性实例包括清蛋白启动子(肝特异性；Pinkert et al.，GenesDev.，1：268-277，1987)、淋巴特异性启动子(Calame and Eaton，Adv.Immunol.，43：235-275，1988)、特别是T细胞受体启动子(Winoto and Baltimore，EMBO J.，8：729-733，1989)和免疫球蛋白启动子(Banerji et al.，Cell，33：729-740，1983；Queen and Baltimore，Cell，33：741-748，1983)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne and Ruddle，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 86：5473-5477，1989)、胰腺特异性启动子(Edlund et al.，Science，230：912-916，1985)和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316以及欧洲申请公布号264,166)。也包括发展调节启动子(Developmentally-regulated promoters)，例如鼠同源框启动子(Kessel and Gruss，Science，249：374-379，1990)以及胎蛋白启动子(Campes and Tilghman，Genes Dev.，3：537-546，1989)。
除编码序列外，在此所述的新的表达载体携带可操作性地连接于宿主细胞基因并可控制其表达。
如在此所用的，“基本上相同”(或”基本上同源”)指含有与第二个氨基酸序列或核苷酸序列相同或相当的(例如具有相似的侧链，例如保守的氨基酸取代)足够数量的氨基酸残基或核苷酸的第一氨基酸序列或核苷酸序列，以致第一和第二氨基酸序列或核苷酸序列具有相似的活性。在是抗体的情况下，第二抗体具有相同的特异性并且具有至少50％的第一抗体的亲和性。
按如下进行两个序列之间“同源性”或“同一性”的计算。排列序列用于最佳的比较目的(例如，对于最佳排列，可以在一个或两个第一以及第二氨基酸序列或核酸序列中引入缝隙，且对于比较目的可以忽视非同源序列)。在不同的实施例中，为了比较目的而排列的参考序列的长度是参考序列长度的至少60％，例如至少70％、80％、90％或100％。接着可以比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置由与第二个序列中相应位置相同的氨基酸残基所占据，那么分支在该位置是相同的(如在此所用的，氨基酸或核酸的“同一性”与氨基酸或核酸的“同源性”相当)。两个序列之间百分比同一性是序列共有的相同位置的数量的函数，考虑缝隙的数目以及每一缝隙的长度，对于两个序列的最佳排列需要将其引入。
使用数学运算法则，可以实现序列的比较以及两个序列之间的百分比同一性的测定。使用Needleman以及Wunsch运算法则(J.Mol.Biol.，48：444-453，1970)测定两个氨基酸序列之间的百分比同一性，使用具有缝隙罚分(gap penalty)12、缝隙延伸罚分(gap extend penalty)4以及移码缝隙罚分(frameshift gap penalty)5的Blossum 62得分矩阵，该运算法则已结合至GCG软件包中的GAP程序。
如在此所用的，术语“在低严紧、中度严紧、高严紧或很高严紧条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。可在Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6中获得进行杂交反应的指导，其在此引入作为参考。与水性有关以及无关的方法描述于上述文献中，并且可以使用任何一个。以下是在此涉及的具体的杂交条件：1)低严紧杂交条件为在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下，紧随着在至少50℃下(在低严紧条件下洗涤温度可增至55℃)在0.2×SSC、0.1％SDS中；2)中度严紧杂交条件是在6×SSC中在约45℃下，紧随着在60℃在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严紧杂交条件是在6×SSC在约45℃下，紧接着在65℃下在0.2×SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；以及4)很高的严紧杂交条件是0.5M磷酸钠、7％SDS在65℃下，紧接着在65℃下在0.2×SSC、1％SDS中洗涤一次或多次。
核酸疫苗
对诱导免疫应答有益的核酸包括至少三个组分：(1)从起始密码子开始并编码流感病毒多肽或其抗原性片段的核酸序列，(2)可操作性地连接于编码流感病毒多肽或其抗原性片段的转录启动子，以及(3)可操作性地连接于编码序列以终止启动子驱动的转录的多腺苷酸化信号。在本文中，“哺乳动物”启动子或多腺苷酸化信号不是必须的获得自哺乳动物的核酸序列。例如，哺乳动物启动子以及多腺苷酸化信号可获得自病毒是已知的。
核酸载体可任选地包括另外的序列如增强子元件、剪接信号、终止和多腺苷酸化信号、病毒复制子以及细菌质粒序列。可通过本领域已知的方法产生此类载体。例如，可将编码所期望的流感病毒多肽的核酸插入至各种商业上可利用的表达载体。参阅例如：Invitrogen Catalog，1998。另外，特别构建的核酸疫苗的载体描述于Yasutomi et al.，J.Virol.，70：678-681，1996中。
施用核酸
可将在此所述的新的核酸施用于个体，例如，以无装饰的形式、与载体组合或与能促进核酸吸收或补充(recruit)免疫系统细胞至接种位置的物质组合使用。例如已显示密封于微颗粒(microparticle)中的核酸促进核酸载体中轮状病毒蛋白在体内的表达(美国专利号5,620,896)。
可以通过任何非肠道途径使哺乳动物接种核酸，例如静脉内途径、腹膜内途径、皮层内途径、皮下途径、肺内途径或肌肉内途径。利用基因枪通过微粒轰击或通过其它的无针送递系统，新的核酸组合物也可口服施用。肌肉是送递编码流感病毒多肽的核酸的有用组织，因为哺乳动物有相称的大量肌肉质量(muscle mass)，其通过直接注射穿过皮肤方便地接近。通过多重和/或重复注射，相当大的剂量的核酸可以储存于肌肉中。可在延长期(overextended periods of time)进行多重注射。
常规的微粒轰击可用于将表达病毒多肽的核酸送递至粘膜内或粘膜上，例如用商用装置。例如，Accell II(PowderJectVaccines，Inc.，Middleton，WI)微粒轰击装置，几个商业上可利用的“基因枪”之一，可用于送递包有金珠外膜的核酸(nucleic acid-coated gold beads)。也可用Helios Gene Gun(Bio-Rad)施用DNA微粒。有关微粒轰击装置和方法的信息可在包括以下文献的资源中发现：Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：9568，1990；Yang，CRC Crit.Rev.Biotechnol.，12：335，1992；Richmond et al.，Virology，230：265-274，1997；Mustafa et al.，Virology，229：269-278，1997；Livingston etal.，Infect.Immun.，66：322-329，1998；以及Cheng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：4455，1993.
在某些实施例中，将个体通过粘膜途径接种。可通过多种方法包括含有核酸的滴鼻药水、吸入剂、栓剂或微球体(microsphere)，将密码子优化的核酸或组合物施用于粘膜表面。可选择性地，可用溶剂提取技术，例如描述于Jones et al.，Infect.Immun.，64：489，1996；and Jones et al.，Vaccine，15：814，1997中的技术，将含有密码子优化的核酸载体密封于多聚(lactide-co-glycolide)(PLG)微颗粒中。例如，可用溶解于二氯甲(dichloromethane)的PLG将核酸乳化，且这种油包水乳状液用含水的聚乙烯醇(乳化稳定剂)乳化以形成水包油包水的双乳化液。将这种双乳化液加至大量水中以使二氯甲散开，其导致微小滴(microdroplet)变硬形成微颗粒。通过离心收获这些微小滴或微颗粒，洗涤几次以除去聚乙烯醇和残余的溶剂，最后使之冷冻干燥。含有核酸的微颗粒的平均直径为0.5μm。
为了测试核酸的含量，在100EC将微颗粒溶解于0.1M NaOH10分钟。测量A260并且根据标准曲线计算核酸的量。核酸与微颗粒的结合在每毫克PLG1.76 g-2.7g核酸之间。将含有约1-100μg核酸的微颗粒悬浮于约0.1-1mlpH8.5的01.M重碳酸钠中并对小鼠或人类口服施用。
为了测试核酸的含量，将微颗粒溶解于0.1M的氢氧化钠中10分钟测量A260，以及根据标准曲线计算核酸的量。合并至微颗粒的核酸是在1.76-2.7g核酸/mg PLG的范围内。在约0.1至1ml pH8.5的重碳酸盐中悬浮含有约1-100μg核酸的微颗粒，并口服施用于小鼠或人类。
不管施用途径(administration route)，可在施用编码流感病毒多肽的密码子优化的核酸之前、施用期间或施用之后，施用佐剂。佐剂可增加核酸进入细胞的吸收、增加细胞内根据核酸的多肽的表达、诱导抗原呈递细胞(antigen presenting cells)渗透至多肽正在表达的组织区域或增加淋巴细胞提供的抗原特异性应答。
评价疫苗的功效
在将在此所述的核酸、多肽和/或抗体施用于人类之前，用动物进行功效测试。在功效测试的实施例中，通过肌肉内注射将小鼠接种。在最初接种或在随意的强化接种(booster vaccinations)后，监控小鼠的(以及阴性对照)疫苗诱导的流感病毒特异性免疫应答的迹象(indication)。测量免疫应答的方法描述于Townsend et al.，J.Virol.，71：3365-3374，1997；Kuhober et al.，J.Immunol.，156：3687-3695，1996；Kuhrober et al.，Int.Immunol.，9：1203-1212，1997；Geissler et al.，Gastroenterology，112：1307-1320，1997以及Sallberg et al.，J.Virol.，71：5295-5303，1997中。
可通过已知的方法测定接种动物中抗流感病毒血清抗体的量。对照易于利用的参考标准，抗体的浓度可标准化。可测量抗体的功能活性，例如利用血细胞凝集抑制试验和/或病毒中和试验(描述于下文实施例5中)。
可按以下进行细胞毒性试验。来自免疫小鼠的脾细胞悬浮于具有10％小牛胎儿血清的以及5×10-5M2巯基乙醇的完全的MEM中。培养5天后收获细胞毒性效应物淋巴细胞居群，并且用靶标细胞在圆底的96孔板中进行5个小时的51Cr释放试验。效应物对靶标细胞的比是变化的。百分比溶胞定义为(试验的释放减去自发的释放)/(最大释放减去自发释放)×100。
抗体
本发明也特别提供了流感病毒多肽例如HA、NA、M2和/或多肽的抗原性片段如缺少跨膜结构域的多肽部分的抗体或其抗原结合片段。
如在此所用的，“特异结合”或“特异地结合于”指抗体的如下能力(1)与如同通过具体的化学分析如Western印迹分析中特异性条带所显示的，与流感病毒多肽结合的能力，或(2)以反应性和流感病毒多肽结合的能力，该反应性是与抗原结合(例如BSA、酪蛋白)而不是流感病毒多肽结合的反应性的至少两倍。
如在此所用的，术语“抗体”指包括至少一个且优选两个重(heavy，H)链可变区(在此简写为VH)以及至少一个且优选两个轻(light，L)链可变区(在此简写为VL)的蛋白。VH以及VL区可进一步细分为高变区(regions ofhypervariability)，术语称为“互补性决定区”(complementarity determiningregions，CDR)，由更保守的区域点缀(interspersed)，术语称为“构架区”(framework regions，FR)。每一个VH以及VL都有3个CDRs以及4个FRS组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体的VH或VL链可进一步包括所有的或部分重链或轻链的恒定区。在一实施例中，抗体是两个重链免疫球蛋白和两个轻链免疫球蛋白的四聚体，其中重链和轻链免疫球蛋白通过例如二硫键交互连接(inter-connected)。重链的恒定区包括CH1、CH2以及CH3三个结构域。轻链的恒定区有一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子(factor)的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应物细胞)以及经典的补体系统(classical complementsystem)的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型的完整的(以及其亚型)的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ类型或λ类型。
如在此所用的，“同种型”指重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
如在此所用的，术语抗原(或简单地说“抗体部分”或“片段”)的“抗原结合片段”指与流感病毒多肽(例如HA或NA)特异性结合的抗体的一部分，例如一个分子，在该分子中一或多种免疫球蛋白不是全长的，但其仍然能与流感病毒多肽特异性地结合。抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，由通过二硫键在铰链区结合的两个Fab组成的二价片段；(iii)由VH以及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.，Nature 341：544-546，1989)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)，其具有足够的特异性地与例如可变区的抗体结合部分结合的构架。可将轻链可变区的抗原结合部分以及重链可变区的结合部分例如Fv片段的两个结构域VL以及VH连接，用重组的方法，通过能使VL和VH变成单个蛋白链的合成的连接体，在单个蛋白链中，VL和VH区域配对形成单价分子(被认为是单链FV(scFv)；参阅例如Bird etal.，Science，242：423-426，1988；以及Huston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883，1988)。此类单链抗体也包括于术语抗体的“抗原结合片段”中。用本领域技术人员已知的常规方法，获得抗体片段，并以与完整抗体相同的方式筛选其效用。
术语“单一特异性抗体”指对具体的靶标显示了单一的结合特异性和亲和性的抗体，例如抗原决定部位。这个术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，如在此所用的，其指单分子组合物的抗体或其片段的制剂。
术语“多克隆抗体”指抗体制剂，或如人类或动物的血清或如通过体外生产所制备的，其能与一个抗原上的多于一个的抗原决定部位结合或与多于一个的抗原上的多重抗原决定部位结合。
如在此所用的，术语“重组体”抗体，指通过重组的方式制备、表达、产生或分离的抗体，例如用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、分离自重组的组合抗体文库的抗体、分离自转移了人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)的抗体或通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列和其它DNA序列剪接的任何其它的方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类抗体包括人源化的抗体、CDR移植的抗体、嵌合抗体以及体外产生(例如通过噬菌体显示)的抗体，以及可包括获得自人类种系免疫球蛋白(human germlineimmunoglobulin)序列的抗体。
许多类型的抗流感病毒抗体或其抗原结合片段可用于在此所述的方法。抗体可以是各种同种型，包括：IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA、IgD或IgE。优选，抗体为IgG的同种型，例如IgG1。抗体分子可以为全长度(例如IgG1或IgG4抗体)或可包括仅抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段)。这些包括单克隆抗体、重组抗体、嵌合抗体、人类抗体、人源化抗体以及上述抗体的抗原结合片段。
单克隆抗体可用于在此所述的新方法。可通过多种技术产生单克隆抗体，包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler & Milstein，Kohler andMilstein，Nature 256：495，1975的标准的体细胞杂交技术。可以通过动物或人类受试者的免疫产生多克隆抗体。多克隆抗体的优势包括对具体病原体的广泛抗原特异性。通常参阅Harlow，E.and Lane，D.(1988)Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。
在此所述的所用的有用免疫原包括在此所述的流感病毒多肽，例如从密码子优化的核酸序列中表达的流感病毒多肽。
可用于在此所述的方法中的抗流感病毒抗体或其片段也可以是通过用DNA转化的宿主细胞产生的重组抗体，该DNA编码所期望的抗体的免疫球蛋白的轻链和重链。可通过已知的基因工程技术产生重组抗体。例如，可通过编码所期望的抗体的免疫球蛋白的重链和轻链的核苷酸序列产生重组抗体，例如cDNA或基因组DNA。接着将编码这些多肽的核苷酸序列插入表达载体，以便两个基因都可操作性地连接于它们自己的转录和翻译表达控制序列。选择与所用的表达宿主细胞兼容的表达载体以及表达控制序列。通常，两个基因都插入至相同的表达载体。可以使用真核或原核宿主细胞。
在真核细胞中的表达是有益的，因为此类细胞比原核细胞更可能组装且分泌正确折叠且具有免疫学活性的抗体。然而，所产生的由于不正确的折叠而失活的任何抗体可依据熟知的方法(Kim and Baldwin，″SpecificIntermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism ofProtein Folding，″Ann.Rev.Biochem.，51，pp.459-89(1982))再复性。宿主细胞产生完整抗体的一部分是可能的，如轻链的二聚体或重链的二聚体，它们也是抗体同源物。
可以理解有关上述步骤的变化是有益的。例如，可期望用编码抗体的或轻链或重链(但不是两者)的DAN转化宿主细胞。也可用重组DNA技术除去一些或所有的编码对结合非必须的轻链和重链或两者中任一个的DNA，例如，可修饰恒定区，例如通过删除具体的氨基酸。从此类平截的DNA分子中表达的分子可用于在此所述的方法中。另外，可产生双功能抗体，在该抗体中，一个重链以及一个轻链是抗流感病毒抗体以及其它的重链和轻链是对抗原具有特异性而不是对流感病毒多肽或相同流感病毒的或另一个流感病毒多肽的另一个抗原决定部位具有特异性。
可通过本领域已知的重组DNA技术产生嵌合抗体。例如，用限制酶消化编码小鼠(或其它的种类)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因以除去编码小鼠Fc的区域，且取代编码人类Fc恒定区域的基因的相当部分(参阅Robinson等国际专利公布PCT/US86/02269；Akira等欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.欧洲专利申请171,496；Morrison等欧洲专利申请173,494；Neuberger等国际申请WO 86/01533；Cabilly等美国专利号4,816,567；Cabilly等欧洲专利申请125,023；Better et al.，Science，240：1041-1043，1988；Liu et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.，84：3439-3443，1987；Liu et al.，J.Immunol.，139：3521-3526，1987；Sun et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，84：214-218，1987；Nishimura et al.，Canc.Res.，47：999-1005，1987；Wood et al.，Nature，314：446-449，1985；以及Shaw et al.，J. Natl Cancer Inst.，80：1553-1559，1988)。
可通过本领域已知的方法人源化抗体或免疫球蛋白链。例如，一旦获得小鼠抗体，可对可变区测序。可测定CDRs以及框架残基的位置(参阅Kabat et al.，the sequence of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，1991，以及Chothia，C.et al.，J. Mol.Biol.，196：901-917，1987，其在此引入作为参考)。可将轻链和重链的可变区可选择性地连接与相应的恒定区。
用公认的专业技术(art-recognized techniques)可对小鼠抗体测序。可通过CDR移植(CDR-grafting)或CDR取代，产生人源化的或CDR移植的抗体或免疫球蛋白，其中一个、两个或所有的免疫球蛋白链的CDR被替换。参阅例如美国专利申请号5,225,539；Jones et al.，Nature，321：552-525，1986；Verhoeyan et al.，Science，239：1534，1988；Beidler et al.，J.Immunol，141：4053-4060，1988；以及Winter的美国专利号5,225,539，上述文献的全部内容在此特别引入作为参考。
Winter描述了CDR移植方法，该方法可用于制备人源化的抗流感病毒抗体(Winter美国专利号5,225,539)其内容在此特别引入作为参考。可用至少非人类CDR的一部分替换所有的具体的人类抗体的CDRs，或用非人类的CDRs仅仅替换某些CDRs。替换一定量的人源化的抗体与预测定的抗原的结合所需要的CDRs是非常必须的。
可通用人类Fv可变区的相当的序列替换不直接与抗原结合有关的Fv可变区的序列，产生人源化的抗体。产生人源化抗体的普通方法由Morrison，Science，229：1202-1207，1985；Oi et al.BioTechniques，4：214，1986)以及Queen等美国专利号5,585,089和5,693,761提供，所有这些文献的内容在此引入作为参考。这些方法包括分离、操控以及表达编码所有或部分来自至少一个重链或轻链的免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。此类核酸资源对本领域技术人员而言是熟知的，例如，如上所述，可从产生防御预处理靶标的抗体的杂交瘤中获得。接着将编码人源化的抗体的重组DNA或其片段克隆至适当的表达载体。
在此也包括人源化的抗体，在该抗体中，已取代、删除或加入了具体的氨基酸。特别是，优选的人缘化抗体在框架区具有氨基酸取代，以便提高与抗原的结合。例如，可通过相应的供体氨基酸替换选择的小量人缘化免疫球蛋白链的受体框架残基。优选的取代位置包括邻近于CDR的氨基酸残基或能与CDR相互作用的氨基酸残基(参阅例如美国专利号5,585,089)。从供体中选择氨基酸的标准描述于美国专利号5,585,089中(例如12-16行)，其内容在此引入作为参考。受体框架可以是成熟的人类抗体框架序列或共有序列。
如在此所用的，术语“共有序列”指从相关的家族中最频繁发生的氨基酸(或核苷酸)中形成的序列(参阅例如Winnaker，From Genes to Clones，Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在蛋白质家族中，共有序列的每个位置由家族中在该位置最频繁发生的氨基酸占据。如果两个氨基酸以相同的频率发生，任一个都可包括在共有序列中。“共有构架(″consensusframework)”指共有免疫球蛋白序列的构架区。人缘化抗体的其它技术描述于Padlan等的1992年12约23日公布的欧洲专利519596A1。
在此也提供了在小鼠中产生的抗体，该小鼠具有编码免疫球蛋白重链或轻链的一或多种片段的转基因。参阅如美国专利公布号20030138421。也提供了在转基因小鼠中产生的完全人类的抗体(100％人类蛋白序列)，在该小鼠中，小鼠抗体基因表达受到抑制并且用人类抗体基因表达有效替换(此类小鼠例如可从Medarex，Princeton，N.J.获得)。参阅例如美国专利公布号20030031667。
抗体或其抗原结合片段可标记(derivatized)于或连接于另一个功能分子(例如另一个肽或蛋白质)。例如，蛋白或抗体从功能上(例如通过化学耦联、基因融合、非共价结合或另外方式)可连接于一或多种其它的分子实体，如可介导与另一个分子(如链霉抗生物素核心区域或多聚组氨酸标签)结合的另一个抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或蛋白或可介导与另一个分子(例如链霉抗生物素核心区或多聚组氨酸标签)结合的肽。
一种类型的标记的(derivatized)蛋白可通过交联两个或多个蛋白(相同类型或不同类型的)产生。适宜的交联剂包括具有两个清晰的由适宜的间隔区分开的基团(group)的异基双功能交联剂(例如m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)或同基双功能交联剂(disuccinimidyl suberate)。此类连接体可从Pierce Chemical Company，Rockford，IL获得。
可标记(derivatized)(或标记)蛋白的有用的可检测剂包括荧光化合物(fluorescent compounds)、各种酶(enzymes)、辅基(prosthetic groups)、发光物质(luminescent materials)、生物发光物质(bioluminescent materials)以及放射性物质(radioactive materials)。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)以及藻红蛋白(phycoerythrin)。蛋白或抗体也可用可检测的酶如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)及其类似物标记(derivatized)。当蛋白以可检测的酶标记时(derivatized)，可通过加入另外的酶用来产生可检测反应产物的试剂检测。例如，当可检测剂(agent)辣根过氧化物酶存在时，过氧化氢以及二氨基联苯胺的加入导致可检测的有色反应产物。也可以用辅基(例如链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)标记(derivatized)蛋白。例如，抗体可用生物素标记(derivatized)，并通过间接的测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素的结合检测。
标记的蛋白以及抗体可例如诊断性地和/或实验性地用于许多环境(contexts)中，包括(i)通过标准技术分离预测定的抗原，例如亲和层析或免疫沉淀法；(ii)检测预处理的抗原(例如流感病毒离子，例如细胞溶解产物或血清样品)以便评价蛋白表达的多度和模式；以及(iii)作为临床测试步骤的一部分监控组织中蛋白的量，例如测定既定的治疗养生法(given treatmentregimen)的功效。
抗流感病毒抗体或其抗原性片段可与另一个分子分子实体连接，通常为标记或治疗剂(细胞毒性的或抑制细胞的)或一部分(moiety)。
放射性同位素可用于诊断或治疗应用。可与蛋白或抗体耦联的放射性同位素包括但不限于α-、β-或γ-发射体或β-以及γ-发射体。
药物组合物
另一方面，提供组合物，例如制药学上可接受的组合物，其包括在此所述的多肽或抗体分子，与可药用载体一起设计(formulated)。
如在此所用的，“可药用载体”包括任何或所有生理上相容的溶剂、分散剂、等渗和吸收延迟剂以及类似物。载体可适于静脉内、肌肉内、皮下、非肠道、直肠、脊髓或表皮施用(例如通过注射或灌输)。
组合物可为多种形式。这些形式包括，例如，液体、半固体以及固体剂量形式，例如液体溶液(例如注射以及灌输溶液)、分散体或悬浮液、脂质体以及栓剂。优选的形式依赖于既定的施用方式以及治疗用途。有益的组合物是以注射溶液或灌输溶液的形式。可用的施用模式是非肠道的(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。例如，可通过静脉内灌输或注射施用蛋白或抗体。在另一个实施例中，通过肌肉内或皮下注射施用蛋白或抗体。
通常，在制造和保存的条件下，施用动物和人类的组合物应该是无菌且稳定的。组合物可设计为溶液、微乳状液(microemulsion)、分散体、脂质体或其它适宜高抗体浓度的有序结构。可通过将所需要量的活性化合物(例如密码子优化的核酸或多肽)合并至适当的具有一种上述组分或上述组分的组合的溶液中，制备无菌的注射溶液，如需要，紧随着过滤灭菌。通常分散体通过将活性化合物合并至无菌的赋形剂(vehicle)上而制备，该赋形剂含有基本的分散剂以及所需要的其它上述组分。在制备注射溶液的无菌粉的情况下，优选的制备方法是真空干燥以及冷冻干燥，其产生活性组分粉末，外加任何另外所期望的来自其以前的无菌过滤溶液的组分。可以维持溶液的适当流动性，例如，通过使用外膜例如卵磷脂、通过在分散体的情况下维持所需要的微粒的大小以及通过使用表面活性剂。可通过在组合物中包括推迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐或明胶，获得注射组合物的延迟的吸收。
尽管对于许多治疗和预防疾病的用途而言，可通过本领域已知的多种方法施用组合物。正如本领域熟练的技术人员所理解的，施用途径和/或方式依赖于所期望的结果而变化。
在某些实施例中，组合物(例如密码子优化的核酸组合物)可与例如惰性稀释剂(inert diluent)或可同化的可食载体(assimilable edible carrier)一起口服施用。化合物(compoud)(以及其它的组分，如果需要)也可以装入硬的或软的壳状明胶胶囊、压制成片剂或直接合并至受试者的饮食。对于口服治疗施用，化合物可与赋形剂合并以及以可消化的片剂、口含片剂(buccaltablets)、片剂(troches)、胶囊、elixirs、悬浊液、糖浆(syrups)、干胶片(wafers)以及其类似形式使用。通过非肠道的施用方式施用化合物，必需用能阻止其失活的物质给化合物包上外膜或与该物质一起施用。治疗组合物可与本领域已知的医疗装置一起施用。
调节剂量疗法(dosage regimens)以提供所期望的最适宜反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单个大丸药(bolus)，随着时间的推移可施用几个分成几部分的剂量或剂量可以成比例的减少或增加，如同治疗形式紧急事件所显示的。对于便于剂量施用和剂量一致，以剂量单位的形式设计非肠道组合物非常有利。如在此所用的剂量单位指物理上不连续的适宜作为治疗的受试者的单一剂量单位；每一个单位含有计算的预定数量的活性化合物以便与所需要的药物载体一起产生所期望的治疗效果。剂量单位形式的规格(specification)受控于并且倚赖于(a)活性化合物独特的特性以及将要获得的具体的治疗效果，以及(b)在配置治疗个体敏感性的此类活性化合物领域中固有的限制。
多肽或其抗原性片段治疗或预防上有效量的示例性、非限制性的范围是0.1-100mg/kg，例如1-10mg/kg。可进一步理解，对于任何具体的受试者，具体的剂量疗法应该随着时间的推移依据个体需要以及施用组合物或监督组合物的施用的人员的专业判断而调整，并且在此提出的剂量范围仅仅是示例性的非是有意限制所主张的组合物范围和实行。依赖于施用途径，精确的剂量可以不同。对于肌肉内注射，剂量范围可以是每次注射100μg(微克)至10mg(毫克)。可能需要多重注射。
用于人类的核酸组合物的适宜剂量范围为1μg/kg至1mg/kg总核酸，例如5μg/kg-500mg/kg(可能有误)的总DNA、10μg/kg-250μg/kg的总DNA或10μg/kg-170μg/kg的总DNA。在一实施例中，给人类受试者(18-50岁，45-75kg)施用了1mg-10mg的DNA。“总DNA”以及“总核酸”指编码不同抗原的核酸的集合。例如编码5中不同流感病毒HA抗原的50mg剂量的总DNA可具有1mg每一种抗原。可多次施用DNA疫苗，例如，2-6次，例如3次。在示例性的方法中，100μg的DNA组合物在0周、4周、12周施用于人类受试者(每次施用100μg)。
在此所述的药物组合物包括治疗上或预防上有效量的核酸、多肽、抗体或抗体部分。根据因素如疾病状态、个体年龄、性别和体重以及组合物在个体中引起所希望的反应的能力，密码子优化的核酸疫苗、多肽或抗体或抗体片段在治疗上有效的量可以不同。治疗上有效的量也是这样的一个量，即在该量中，治疗上有益的效果在价值上超过有毒或有害的效果。可以在预言目标受试者(例如人类受试者)的功效的动物模式系统中评价化合物抑制可测量参数的能力。可选择性的，可通过检测化合物的调节能力评价组合物的特性，此类通过试验的体外调节对熟练的技术人员而言是已知的。
“预防上有效量”指在剂量以及必须的时间期内有效获得期望的预防结果的量，即保护的免疫性防御随后的流感病毒的挑战。通常，因为预防剂量在疾病之前或疾病的早期阶段用于受试者，因此预防上的有效量小于治疗上的有效量。在此也提供了含有一或多种编码流感病毒多肽的密码子优化的核酸、核酸编码的多肽和/或抗流感病毒抗体或其抗原结合片段的试剂盒。试剂盒可以包括一或多种其它的元素，包括：使用说明书；其它的试剂，例如标记，治疗剂或对使抗体与标记或治疗剂或辐射保护组合物鳌合否则耦联有利的药剂；制备施用的组合物的装置或其它材料；可药用载体以及施用于受试者的装置或其它材料。
使用说明书可包括核酸序列、多肽或抗体(或其抗原结合片段)在体外例如在样品中例如来自患者的生物活组织检查或细胞或在体内检测流感病毒的诊断应用的指示。说明书可包括对治疗或预防应用的说明，包括建议剂量和/或施用方式，例如在处于流感病毒症状风险中或正受累于流感病毒症状的患者。
试剂盒可进一步包括至少一个另外的试剂，如诊断或治疗剂，例如一或多种编码流感病毒多肽的密码子优化的核酸和/或一或多种单独的药物制剂中的抗病毒剂。
治疗使用
在此所述的新的核酸疫苗、多肽以及抗体在体外以及体内具有诊断、治疗以及预防的效用。例如，核酸疫苗可施用于培养的细胞例如在体外或离体(ex vivo)或在受试者中，例如在体内，以治疗、阻止和/或诊断流感病毒。
如在此所用的，术语“受试者”意指包括人类和非人类动物。术语“非人类动物”包括所有的脊椎动物(vertebrates)，例如哺乳动物以及非哺乳动物，如非人类的灵长类(primates)、猪(pigs)、鸡(chickens)以及其它的鸟(birds)、鼠(mice)、狗(dogs)、猫(cats)、牛(cows)以及马(horses)。
以上描述了施用核酸疫苗、多肽以及抗体组合物的方法。所用分子的适宜剂量依赖于受试者的年龄和体重以及所用的具体药物(drug)。通过在接种的受试者中诱导保护的免疫，核酸疫苗可用于阻止流感病毒感染，或用于治疗已存的流感病毒感染，如果改善的免疫应答在控制病毒感染中有效。抗体分子可用于减少或缓和急性流感病毒感染。
在另外的实施例中，提供了免疫原性组合物和疫苗，其包括免疫原性上有效的量的流感病毒多肽或其抗原性片段。可通过本领域已知的方法鉴定多肽序列中免疫原性抗原决定部，并且在疫苗组合物中含有这些抗原决定部位的蛋白或片段可通过各种方式送递。
在此所述的多肽以及核酸组合物可与用于诱导人类对流感病毒的免疫应答的药剂组合使用，如三价失活的流感病毒疫苗(例如包括H1N1、H3N2以及流感病毒B毒株的三价疫苗)。其它的适宜与在此所述的新颖的核酸和多肽组合物组合使用的组合物包括活的流感病毒疫苗例如冷适应流感病毒疫苗(cold-adapted influenza vaccines)(参阅例如Wareing and Tannock，Vaccine，19(25-26)：3320-3330，2001)以及通过反求遗传学产生的疫苗(参阅例如Hoffmann et al.，Vaccine，20(25-26)：3165-3170，2002)。这些组合物可与在此所述的组合物同时、在其之前或之后施用。
适宜的组合物包括，例如，脂肽(例如，Vitiello et al.，J.Clin.Invest.，95：341，1995)、装入poly(DL-lactide-co-glycolide)(“PLG”)微球体胶囊的肽组合物(参阅例如Eldridge et al.，Molec.Immunol.，28：287-94，1991；Alonso etal.，Vaccine，12：299-306，1994；Jones et al.，Vaccine，13：675-81，1995)、包含于免疫刺激复合物的肽组合物(immune stimulating complexes，ISCOMS)(参阅例如akahashi et al.，Nature，344：873-75，1990；Hu et al.，Clin.Exp.Immunol.，113：235-43，1998)以及多重抗原肽系统(multiple antigen systems，MAPs)(参阅例如Tam，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，85：5409-13，1988；Tam，J.Immunol.Methods，196：17-32，1996)。毒素标记的送递技术，也称为受体介导定位(receptor-mediated targeting)，如Avant Immunotherapeutics，Inc.(AvantImmunotherapeutics，Inc.，Needham，Massachusetts)的那些也可使用。
可与免疫原性组合物以及疫苗一起使用的有用载体是熟知的，包括例如甲状腺球蛋白(thyroglobulin)、清蛋白(albumins)如人类血清清蛋白、破伤风类毒素(tetanus toxoid)、聚氨基酸(polyamino acids)例如聚L-赖氨酸(聚L-赖氨酸)、聚L-谷氨酸(poly L-glutamic acid)、流感病毒、B型肝炎核心蛋白(hepatitis B virus core protein)以及类似物。组合物和疫苗可含有生理上可以忍受的(即可接受的)稀释剂如水或盐，通常为磷酸缓冲盐溶液。通常组合物以及疫苗也可包括佐剂。佐剂如不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’sadjuvant)、磷酸铝(aluminum phosphate)、氢氧化铝(aluminum hydroxide)或明矾(alum)是本领域熟知材料的实例。另外，将多肽(或片段、其衍生物或类似物)连接于脂质如tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serine(P3CSS)能启动CTLs应答。
用含有蛋白组合物的组合物或疫苗免疫，例如经由注射的、气雾剂的、口服的、皮肤内(transdermal)、粘膜内(transmucosal)、胸膜内(intrapleural)、鞘内(intrathecal)或其它适宜的途径，诱导宿主免疫系统通过产生大量CTLs和/或对所期望的抗原具有特异性的抗体对组合物或疫苗作出应答。因此宿主通常变得对以后的感染(例如，流感病毒感染)至少部分免疫或对发展的正在进行的慢性感染至少具有部分抵抗性或获得至少一些治疗益处。换句话说，受试者得到防御随后的流感病毒感染的保护。
实施例
在以下实施例中一进步对本发明做了描述，其并非限制在权利要求中所述的本发明的范围。
构建编码流感病毒HA以及NA多肽的密码子优化的序列
为了产生流感病毒HA和NA多肽以及各种这些多肽的片段有效表达的DNA，构建了密码子优化的核酸。这些密码子优化的核酸适用于表达具有与天然流感病毒多肽编码的序列相同或几乎相同的氨基酸序列的多肽，但带有已知在哺乳动物细胞中高效翻译的密码子。病毒密码子对哺乳动物密码子的取代能促进病毒蛋白在重组体系中高水平表达。
对照人(Homo sapiens)基因组的密码子使用，通过MacVector软件(版本7.2，Accelrys，San Diego，CA)分析了来自甲型流感病毒H1N1和H3N2毒株的HA编码序列的密码子使用以及来自H3N2的NA编码序列的密码子使用。产生了这样一种序列，即在所述序列中，对于哺乳动物的表达是次最佳的流感病毒序列中的密码子变成了在哺乳动物系统中更优选的密码子。所述序列也适用于避免不想要的RNA基元，例如内TATA-盒(internalTATA-boxes)、chi-位点、核糖体进入位点、AT-丰富或GC-丰富序列延伸、重复序列、可能编码具有二级结构的RNA的序列、(隐藏的)剪接供体位点和受体位点或分支点。
编码H1 HA、H3 HA以及N2 NA多肽的密码子优化的核酸是化学合成的。密码子优化的核酸序列以及核酸编码的氨基酸序列分别显示于图1A、1B、2A、2B、6A以及6B中。衍生SEQ ID NO：1的病毒序列作为SEQ ID NO：7显示于图9中。衍生SEQ ID NO：3的病毒序列作为SEQ IDNO：8显示于图10中。衍生SEQ ID NO：5的病毒序列作为SEQ ID NO：9显示于图11中。
我们构建了编码6种不同形式的HA多肽的表达载体，示意性地显示于图3A以及3B中。这些形式为：野生型，含有编码天然HA前导肽的全长HA序列(wt.HA0)；编码tPA前导肽的全长HA序列(tPA.HA0)；编码具有tPA前导肽的HA外部部分的HA序列(tPA.HA0.dTM)；编码具有tPA前导肽的HA的HA1结构域的序列(tPA.HA1)；编码具有tPA前导肽的HA的HA2结构域的序列(tPA.HA2)以及编码缺少跨膜区域也具有tPA前导肽的HA多肽的HA2结构域的序列(tPA.HA2.dTM)。
我们设计了编码4种不同形式的NA多肽的表达载体，示意性地显示于图8种。这些形式是：野生型，含有编码天然NA前导肽的序列的全长NA序列(wt.NA)；编码tPA前导肽全长的NA序列(tPA.NA)；编码具有tPA前导肽的NA的外部部分的NA序列(tPA.NA.dTM)；编码M2多肽胞外区域(M2-ex)和具有tPA前导肽的NA的外部部分(tPA.M2-NA.dTM)的融合蛋白的序列。
将上述序列亚克隆至DNA疫苗载体pSW3891中(Wang et al.，Journal ofVirology，79：1906-1910，2005)，该载体是pJW4303(Lu et al.，Methods inMolecular Medicine，29：355-74，1998)载体的修饰型。pSW3891载体含有带有抑制真核基因插入片段转录的巨细胞病毒下游内含子A序列的巨细胞病毒即时早期(cytomegalovirus immediate early，CMV-IE)启动子，以及终止转录的牛生长激素(bovine growth hormone，BGH)多腺苷酸化信号。对于某些构建体，诱导人类组织纤溶酶原激活物(tPA)前导序列以指导分泌蛋白的表达。载体也含有原核复制的ColE1复制起点以及在含有抗生素培养基中选择性生长的卡那霉素抵抗基因。
在从大肠杆菌(HB101菌株)中用Mega纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)大量制备用于体外转染和体内动物免疫研究的质粒前，每一单个质粒通过测序得以确认。
实施例2.密码子优化的HA多肽在体外的表达以及免疫原性在体内的 表达
HA的体内表达将细胞(293T)用编码全长的野生型H1 HA的密码子优化的wt.HA0载体转染。通过Western印迹法评价HA抗原的表达。用商用的抗HA的单克隆抗体检测HA。如在图4A以及图4B中所显示的，HA抗原在293T细胞中得以表达。用空载体(empty vector)(作为对照)转染的细胞未表达HA抗原。
免疫  从Millbrook Farms(Millbrook，MA)购买NZW兔(雌性，每一个～2kg)并且依照IACUC许可协议圈养(housed)于Department of AnimalMedicine at the University of Massachusetts Medical School(UMMS)。按以前的报道(Wang et al.，Methods Mol.Biol.，245：185-96，2004)，在刮过的腹部的皮肤处，用Helios基因枪(Bio-Rad，Hercules，CA)将兔免疫。总共36μg的质粒DNA对每一单个兔施用，用于在0周、2周、4周以及8周的每一次免疫。每一次免疫后，在0周、2周、4周、6周、8周以及10周，采集血清样品用于分析HA特异性抗体的应答。将兔用编码H1或H3亚型HA抗原的wt.HA0、tPA.HA0、tPA.HA0.dTM、tPA.HA1、tPA.HA2、tPA.HA2.dTM载体免疫。一子集兔(A subset of animals)既用H1 tPA.HA0又用H3 tPA.HA0载体免疫或既用H1 tPA.HA1又用H3 tPA.HA1载体免疫。
ELISA测定抗HA抗体的应答  在免疫的兔中，实施ELISA试验以测量抗HA抗体的应答。ELISA平板涂有100μl/孔或200μl/孔的来自以tPA.HA0.dTM隔夜在4℃短暂转染的293T细胞的上清液的H1或H3 HA抗原(pH7.2的PBS中1μg/ml)。用含有0.1％Triton X-100的PBS将平板洗涤5次并用200μl/孔的封闭缓冲液(在PBS中，pH7.2，5％的无脂奶粉、4％的乳清、0.5％的吐温-20)封闭1小时。洗涤5次后，将在乳清稀释缓冲液(PBS中，4％乳清、0.5％吐温-20)中按1∶5000稀释的100μl的兔血清加入至副本孔(duplicate wells)中并在室温下温育1小时。在另一组洗涤后，用在乳清稀释缓冲液中按1∶1000稀释的100μl生物素化的抗兔IgG(VectorLaboratories)在室温下将平板温育1小时。接着将在乳清缓冲液中以1∶2000稀释的100μl链霉抗生物素共轭的辣根过氧化物酶(Vector Laboratories)加入至每一孔并温育1小时。最终洗涤后，用3，3’，5，5’四甲基联苯胺(3，3’，5，5’Tetramethybenzidine，Tetramethylbenzidine)溶液以100μl/孔(Sigma，St.Louis，MO)将平板显影(developed)3.5分钟。通过加入25μl的2M H2SO4终止反应，并在OD 450nm读取平板。这些试验的结果描绘于图5A-51中。
所有测试的HA编码的DNA构建体在兔中诱导了HA抗原的抗体。因此，密码子优化的序列在兔中得以表达，并且它们表达的多肽是免疫原性的。用既编码H1抗原又编码H3 HA抗原的构建体免疫的兔(图5C、5F以及5I)既增加(mounted)了对H1抗原的应答又增加了对H3 HA抗原的应答，即未显示用两个DNA的免疫危及任何一个应答。同时诱导对多种亚型的抗原强烈应答的能力比由用单价构建体免疫产生的能力表达更广泛的保护。
实施例3.构建流感病毒M2 DNA载体
在细胞外结构域，流感病毒M2多肽含有大约23个氨基酸。多肽的这个区域是最近报道的保护抗体的潜在靶标(Neirynck et al.，Nature Medicine，5：1157-1163，1999；Fan，et al.，Vaccine，22：2993-3003，2005)。然而，由于表达M2蛋白的困难，在以前的研究中，使用短的合成的肽，而不是重组肽。通过将M2的细胞外结构域的多拷贝表达为融合物，我们能提高了M2的免疫原性，如在图7中示意性地所显示的。可将表达这些M2融合物的DNA或DNA表达的多肽施用于动物以诱导防御这种抗原的免疫应答。表达融合于另一种类型的流感病毒抗原(例如HA或NA或其片段)或其自身的融合多肽的M2的DNA也可用于在动物中诱导免疫应答。参阅例如描绘于图8中的tPA.M2-NA.dTM构建体。
实施例4.比较密码子优化的流感病毒核酸序列诱导的免疫应答与野生 型流感病毒核酸序列诱导的免疫应答
HA体外表达  为了在体外比较密码子优化的序列以及非密码子优化的序列(野生型)，或用编码H1 HA的密码子优化的核酸序列或用编码H1HA的野生型的核酸序列转染哺乳动物细胞。通过Western印迹法评价HA抗原的表达。用商用的抗HA单克隆抗体检测HA。如图2中所示，与以野生型序列转染的细胞相比，H1 HA抗原在用密码子优化的序列转染的细胞中得以更强烈的表达，以空载体转染的细胞(作为阴性对照)未表达HA抗原。
密码子优化的序列以及野生型序列诱导的抗体应答用密码子优化的H1HA序列或野生型H1HA序列免疫兔并用来自免疫兔的血清实施ELISA试验。免疫和ELISA方案描述于上文的实施例2中。在0周、2周、4周以及8周免疫兔。以1∶5000的血清稀释物，用ELISA测试在0周、2周、4周、6周以及8周收集的血清样品。试验的结果描绘于图13A中。兔R#316和R#317用野生型的H1HA DNA免疫，而兔R#381和R#382则用密码子优化的H1HA DNA免疫。0周后，在所有检查的时间点上，用密码子优化的H1HA DNA免疫的兔中的抗体滴度比用野生型的H1HA DNA免疫的兔中的滴度高。图13显示了来自第四次免疫2周后收集的兔血清中抗HAIgG滴度。这些数据显示密码子优化的DNA诱导的抗HA滴度比野生型流感病毒DNA序列诱导的滴度高的多，平均的滴度大约分别为3,500,000和500,000，表明密码子优化的DNAs比非密码子优化的DNAs以更高的水平表达。
在小鼠中进行了相似的免疫试验。将小鼠用密码子优化的H1HA DAN或野生型H1HA DAN免疫四次。将一组小鼠也用空载体免疫作为对照。测试第四次免疫后两周收集的血清的抗HA IgG滴度。组平均滴度描绘于图13C中。图13C中显示的结果显示密码子优化的DNA诱导的抗HA滴度比野生型流感病毒DNA序列诱导的滴度高的多，平均滴度大约分别为2,000,000和200,000。以空载体免疫的小鼠的血清不含有任何可检测的起反应的HAIgG。
实施例5.用密码子优化的DNA免疫的动物的血清介导血凝素抑制以 及病毒中和
血细胞凝集抑制在A/NewCaledonia/20/99(H1N1)流感病毒毒株以及A/Panama/2007/99(H3N2)流感病毒毒株存在时，在标准的血细胞凝集抑制试验(HAI或HI)中，测试以各种编码H1HA或H3HA的密码子优化的DNA免疫的动物血清。
用血清进行血细胞凝集抑制试验，该血清已经用细菌神经氨酸酶/Receptor Destroying Enzyme(RDE)预处理以除去病毒血细胞凝集的非特异性抑制剂。将25μl的流感病毒制剂(血细胞凝集滴度＝8)与25μl特异性的RDE处理的血清2倍稀释物在V-型底的96-孔板中的PBS中简单混合。4℃温育30分钟后，将50μl 0.5％的鸡红细胞加入至混合物中。将平板在4℃温育直到血细胞凝集在含有非血清的对照孔中出现。HI滴度定义为抑制血细胞凝集的血清的最高稀释物。
HI抗体滴度描绘于图14A以及图14B中。来自以编码全长H1HA，wt.HA0的密码子优化的DNA免疫的动物的血清显示了对H1N1A/NewCaledonia/20/99毒株的最高水平的血细胞凝集活性(图14A)。
来自以编码具有tPA前导序列(tPA-HA0)的全长H3HA的密码子优化的DNA以及编码缺少跨膜区的H3HA(tPA.HA0.dTM)的DNA免疫的动物的血清显示了最高水平的血细胞凝集活性(图14B)。在来自以编码具有野生型前导序列的全长H3HA(wt.HA0)的DNA以及编码HA1、HA2以及H3 HA的部分HA2结构域(分别为PA.HA1、tPA.HA2以及tPA.HA2.dTM)的DNA免疫的动物血清中，也观察到了活性。
中和抗体应答  测定了各种编码H1HA或H3HA的密码子优化的DNA诱导的中和抗体应答。该试验用病毒进行，该病毒能感染细胞并表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，但其不能增殖(复制限定为单循环)。为了产生用于这些试验的复制限制病毒，用8个病毒RNA表达质粒以及5个病毒蛋白表达质粒转染293个细胞。将GFP病毒RNA表达质粒替换HA病毒RNA表达质粒，如以前所述，RNA表达质粒含有复制、转录以及将这种RNA包装成流感病毒所需的3′以及5′HA特异性区域。将转染的293个细胞用表达所期望的流感病毒HA蛋白的MDCK细胞系共培养。获得HA基因被GFP基因替换的病毒并在表达HA的MDCK细胞系中增殖。在HA中和抗体存在时，这些病毒引起感染和GFP表达受到抑制。
测试用各种密码子优化的H1HA载体免疫的动物的血清对H1N1甲型流感病毒/NewCaledonia/20/99的防御(图15A)。在用编码全长H1HA的载体，wt.HA0，免疫的动物的血清中，检测到了中和抗体滴度的最高水平。
测试用各种密码子优化的H3HA载体免疫的动物的血清对H3N2甲型流感病毒/Moscow/10/99的防御。用编码具有tPA前导序列的全长H3 HA，(tPA.HA)的DNA免疫的动物的血清显示了中和活性的最高水平。在用wt.HA0、tPA.HA0.dTM、tPA.HA1以及tPA.HA2载体免疫的动物的血清中，观察到了活性。
总之，这些数据显示不同的载体诱导不同水平的功能抗体应答，尽管当通过ELISA测量时，它们诱导相似水平的结合抗体的应答。
血细胞凝集抑制以及二价免疫测定由编码H1HA或H3 HA的两个不同的密码子优化的DNAs免疫的动物血清的血细胞凝集抑制。用H1N1甲型流感病毒/NewCaledonia/20/99以及H3N2流感病毒，测试用密码子优化的H1HA载体的组合免疫的动物的血清(图16A以及16B)。将动物或用H1-tPA.HA0.dTM  和H3-tPA.HA0.dTM免疫或用H1-wt.HA0和H3-tPA.HA0.dTM免疫。用后者的组合免疫的动物的血清显示了最高水平的防御两个病毒毒株的细胞凝集抑制活性。在用前者的组合免疫的动物的血清中，活性更加适中，并且可以看到较高水平的防御H3N2 Panama毒株的活性。
中和以及二价免疫  也检查了二价免疫诱导的中和活性。测试了以前段落中描述的相同的二价组合。在这些试验中，检查了对H1N1甲型流感病毒/NewCaledonia/20/99以及H3N2甲型流感病毒/Moscow/10/99的中和活性。用第一个组合(H1-tPA.HA0.dTM+H3-tPA.HA0.dTM)免疫的动物的血清显示了对H1N1 New Caledonia毒株的低滴度，然而显示了对H3N2 Moscow毒株的高滴度(图16C以及16D)。第二个组合的血清(H1-wt.HA0+H3-tPA.HA0.dTM)显示了对两个毒株高水平的中和滴度。
总之，编码全长H1HA的H1HA构建体(作为缺少跨膜结构域的对立形式)既在单价免疫情势(regimen)中又在二价免疫情势中诱导了高水平的防御H1毒株的保护抗体。相反，既编码全长H3 H又编码缺少跨膜结构域形式的构建体在诱导保护抗体中是有效的。
实施例6.用多种药剂免疫(Immunization with Multiple Agents)
在此所述的密码子优化的核酸(以及在此所述的其它的组合物)可与能诱导对流感病毒抗原免疫应答的其它的药剂组合使用。在以下试验种，在0周，将编码H1 HA以及H3 HA(H1-HA0.wt+H3-HA0.dTM；每一DNA250微克/剂)密码子优化的DNAs施用于兔，紧跟着在第4周用Fluzone(AventisPasteur)强化-从灭活的流感病毒制备的流感病毒疫苗。另一组兔在0周以及第4周仅施用Fluzone。通过肌肉注射施用Fluzone(0.25ml/剂)。检查在第8周从两组兔采集的血清。
通过ELISA测定HA特异性IgG应答。结果显示于图17A以及17B中。仅施用了Fluzone的动物的血清含有对H1HA的少于200,000的IgG滴度以及对H3HA的少于1,250,000的IgG滴度。相反，施用二价H1 HA、H3HA已接触抗原和(prime)Fluzone强化的兔的血清显示了很高的HA特异性IgG滴度。对H1 HA的滴度大约是1,200,000。对H3HA的滴度大约是3,500,000。这些结果显示DNA已接触抗原以及Fluzone强化方案在诱导HA特异性抗体方面比只用Fluzone更有效。
其它实施例
已描述了本方面的许多实施例。然而，可以理解在没有偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做各种修改。相应地，其它的实施例也在上述权利要求的范围内。

Claims (43)

1.分离的核酸分子，含有：
编码流感病毒型血凝素(HA)多肽或其抗原性片段，或流感病毒神经氨酸酶(NA)多肽或其抗原性片段的序列，其中，所述序列为在人类细胞中表达进行了密码子优化。
2.根据权利要求1的核酸，其中所述序列编码选自甲型流感病毒下列亚型的HA多肽：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14以及H15。
3.根据权利要求1的核酸，其中所述序列编码H1亚型或H3亚型的HA多肽，并且其中所述序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或至少含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的30个连续核苷酸的片段具有至少90％的同一性。
4.根据权利要求1的核酸分子，其中所述序列还编码在天然状态下不与流感病毒HA多肽相关的前导肽。
5.根据权利要求1的核酸分子，其中所述序列编码HA的胞外区。
6.根据权利要求3的核酸分子，其中所述序列与SEQ ID NO：7或SEQID NO：8有5-200个核苷酸不同。
7.根据权利要求1的核酸，其中所述序列编码N2亚型的NA多肽、且与SEQ ID NO：5具有至少90％的同一性。
8.根据权利要求7的核酸分子，其中所述序列与SEQ ID NO：9有5-150个核苷酸不同。
9.分离的核酸分子，含有编码流感病毒M2多肽胞外区的两个或多个拷贝的序列。
10.根据权利要求9的核酸分子，还含有编码流感病毒HA或NA多肽的序列、且所述多肽与所述M2多肽胞外区的两个或多个拷贝形成融合物。
11.核酸表达载体，含有权利要求1-10中任一项的核酸分子。
12.组合物，含有：
(a)权利要求1-10中任一项的核酸分子；
(b)哺乳动物启动子，其与所述核酸分子可操作地连接、并指导编码所述流感病毒多肽的mRNA的转录；以及
(c)哺乳动物多腺苷酸化信号，其与所述核酸分子可操作地连接。
13.根据权利要求12的组合物，其中的哺乳动物启动子是巨细胞病毒立即早期启动子。
14.根据权利要求12的组合物，其中的多腺苷酸化信号从牛生长激素基因获得。
15.根据权利要求12的组合物，还含有可药用载体。
16.根据权利要求12的组合物，还含有与该分离的核酸结合的微粒，其中该微粒适于皮内、肌肉或粘膜施用。
17.细胞，含有权利要求1-10中任一项的核酸分子。
18.分离的多肽，由权利要求1-10中任一项的核酸分子编码。
19.根据权利要求18的多肽，其中该多肽在哺乳动物细胞中产生。
20.分离的抗体或其抗原结合片段，与权利要求18的多肽特异性结合。
21.核酸组合物，含有：
(a)第一序列，其编码第一流感病毒亚型的第一类型流感病毒多肽；
(b)第二序列，其编码第二流感病毒亚型的所述第一类型流感病毒多肽。
22.权利要求21的核酸组合物，其中第一以及第二序列编码血凝素(HA)多肽或其抗原性片段、流感病毒神经氨酸酶(NA)多肽或其抗原性片段、或流感病毒膜离子通道(M2)多肽或其抗原性片段。
23.根据权利要求21的核酸组合物，其中第一流感病毒亚型以及第二流感病毒亚型都是甲型流感病毒的亚型；其中第一流感病毒亚型以及第二流感病毒亚型都是乙型流感病毒的亚型；或其中第一流感病毒亚型是甲型流感病毒的亚型而第二流感病毒亚型是乙型流感病毒的亚型。
24.根据权利要求23的核酸组合物，其中第一以及第二亚型都是甲型流感病毒的亚型。
25.根据权利要求24的核酸组合物，其中第一亚型是甲型流感病毒的H1N1而第二亚型是甲型流感病毒的H3N2。
26.权利要求21的核酸组合物，其中一种或全部两种序列为在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化。
27.根据权利要求26的核酸组合物，其中该组合物含有与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至少具有90％同一性的序列。
28.根据权利要求21的核酸组合物，还含有第三序列，其编码第三流感病毒亚型的所述第一类型流感病毒多肽。
29.根据权利要求21所述的核酸组合物，还含有第三序列，其编码第二类型的流感病毒多肽。
30.根据权利要求21的核酸组合物，还含有流感病毒多肽。
31.药物组合物，含有权利要求21-30任一项的核酸组合物。
32.根据权利要求12、21-30中任一项的核酸组合物，其还含有佐剂。
33.核酸组合物，其含有：
(a)序列，其编码第一流感病毒亚型的第一流感病毒多肽；以及
(b)第二序列，其编码第一流感病毒亚型或第二流感病毒亚型的第二流感病毒多肽；
其中序列(a)以及序列(b)为在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化。
34.根据权利要求33的核酸组合物，其中第一流感病毒多肽以及第二流感病毒多肽选自血凝素(HA)多肽或其抗原性片段、流感病毒神经氨酸酶(NA)多肽或其抗原性片段、或流感病毒膜离子通道(M2)多肽。
35.根据权利要求33的核酸组合物，还含有编码第三流感病毒多肽的序列。
36.根据权利要求34的核酸组合物，其中第一多肽是含有与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5至少具有90％同一性的序列的流感病毒HA多肽。
37.根据权利要求33的核酸组合物，还含有流感病毒多肽。
38.药物组合物，含有权利要求33-37中任一项的核酸组合物。
39.根据权利要求33-37中任一项的核酸组合物，还含有佐剂。
40.在受试者中诱导对一或多种流感病毒多肽的免疫应答的方法，该方法包括：对该受试者施用权利要求11、21或33的组合物，其施用量足以使所述序列表达一或多种流感病毒多肽，且其表达量足以在该受试者体内诱导免疫应答。
41.根据权利要求40方法，还包括对该受试者施用含有流感病毒多肽的第二组合物。
42.根据权利要求41的方法，其中的第二组合物含有流感病毒粒子。
43.产生流感病毒多肽的方法，该方法包括：
提供权利要求1-10中任一项的核酸分子；以及
在产生由所述核酸分子编码的流感病毒多肽的条件下在宿主细胞中表达所述核酸。
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PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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