ES2525177T3 - Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que comprenden hemaglutinina - Google Patents

Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que comprenden hemaglutinina Download PDF

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Sonia Trepanier
Pierre-Olivier Lavoie
Michèle DARGIS
Louis-Philippe Vezina
Nathalie Landry
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Abstract

Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina de la influenza (HA) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con (HA) del tipo A/California/04/09, en donde la secuencia de nucleótidos comprende un elemento regulador que es operativo en una planta, comprendiendo el elemento regulador un virus del mosaico de caupí (CPMV)-HT.

Description

Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que comprenden hemaglutinina
Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud PCT No. PCT/CA2009/000032, presentada el 12 de enero del 2009, que es una continuación en parte de, y reivindica prioridad de la solicitud PCT No. PCT/CA2008/001281, presentada el 11 de julio de 2008; que reivindica prioridad de la solicitud canadiense No. 2.615.372 presentada el 21 de enero de 2008; solicitud estadounidense No. 61/022775 presentada el 22 de enero de 2008; solicitud estadounidense No. 60/959414 presentada el 13 de julio de 2007; solicitud estadounidense No. 60/990603 presentada el 27 de noviembre de 2007; y solicitud estadounidense No. 61/013272 presentada el 12 de diciembre de 2007.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la producción de partículas similares a virus. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción de partículas similares a virus que comprenden antígenos de la influenza.
Antecedentes de la invención
La influenza es la causa principal de muerte en los seres humanos debido a un virus respiratorio. Los síntomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, dificultad para respirar, y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, los virus de influenza infectan a un 10-20% de la población mundial, lo que se traduce en 250
500.000 muertes al año
Los virus de influenza son virus con envoltura que brotan de la membrana plasmática de las células infectadas de mamíferos y aves. Se clasifican en los tipos A, B, o C, con base en las nucleoproteínas y antígenos de proteínas de matriz presentes. Los virus de la influenza tipo A pueden dividirse además en subtipos de acuerdo a la combinación presente de las glicoproteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA regula la capacidad del virus para unirse y penetrar la célula huésped. La NA remueve los residuos de ácido siálico terminales de las cadenas de glicano en la célula huésped y proteínas de la superficie viral, que previene la agregación viral y facilita la movilidad de virus. Actualmente, se reconocen 16 subtipos de HA (H1-H16) y 9 de NA (N1-N9). Cada virus de influenza tipo A presenta un tipo de glicoproteína HA y un tipo de NA. En general, cada subtipo exhibe especificidad de especie; por ejemplo, se sabe que todos los subtipos de HA y de NA infectan a las aves, mientras que se ha demostrado que sólo los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7 infectan a los seres humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005 ). Los virus de influenza que comprenden H5, H7 y H9 se consideran las formas más altamente patógenas del virus de influenza A, y son más susceptibles de causar pandemias futuras.
Las pandemias de influenza son causadas generalmente por virus de influenza altamente virulentos y contagiosos, y pueden conducir a niveles elevados de morbilidad y de mortalidad a nivel mundial. La aparición de nuevos subtipos de influenza A resultó en 4 grandes pandemias en el siglo 20. La gripe española, causada por un virus H1N1, en 1918 -1919 condujo a la muerte a más de 50 millones de personas en todo el mundo entre 1917 y 1920. En la actualidad, el riesgo de la aparición de un nuevo subtipo, o de la transmisión a los seres humanos de un subtipo endémico en animales, está siempre presente. Particularmente preocupante es una forma muy virulenta de influenza aviar (también llamada "gripe aviar"), cuyos brotes han sido reportados en varios países de todo el mundo. En muchos casos, esta gripe aviar puede resultar en tasas de mortalidad cercana al 100% en 48 horas. La propagación del virus de la gripe aviar (H5N1), identificada por primera vez en Hong Kong en 1997, a otros países de Asia y Europa se ha propuesto que esta vinculada a los patrones migratorios de las aves silvestres.
El método actual de combatir la influenza en los seres humanos es mediante la vacunación anual. La vacuna es generalmente una combinación de varias cepas que se prevé que serán las cepas dominantes para la próxima "temporada de gripe". La predicción es coordinada por la Organización Mundial de la Salud. Generalmente, el número de dosis de vacuna que se producen cada año no es suficiente para vacunar a la población mundial. Por ejemplo, Canadá y Estados Unidos obtienen suficientes dosis de vacunas para inmunizar a aproximadamente un tercio de su población, mientras que sólo el 17% de la población de la Unión Europea puede ser vacunada. Es evidente que la producción mundial actual de la vacuna contra la influenza sería insuficiente frente a una pandemia de gripe mundial. Incluso si la producción anual necesaria de alguna manera pudiera cumplirse en un año determinado, las cepas dominantes cambian de año en año, el almacenamiento a veces poco necesitado en el año no es práctico. Producción económica a gran escala de una vacuna efectiva contra la influenza es de gran interés para el gobierno y la industria privada por igual.
Las reservas del virus para uso en vacunas se producen en huevos fertilizados. Las partículas del virus se recolectan, y para una vacuna viral inactivada, se rompen mediante detergente para inactivación. Las vacunas atenuadas vivas se elaboran a partir de virus de la influenza que se adaptaron para crecimiento a baja temperatura lo que significa que a la temperatura corporal normal, la vacuna está atenuada. Esta vacuna está autorizada en EE.UU. para su uso en personas de 5 a 49 años de edad. Las vacunas de virus completos inactivados se tornan
inocuas mediante inactivación con agentes químicos y han sido producidas en huevos embrionarios o cultivos celulares de mamíferos. Todos estos tipos de vacuna muestran algunas ventajas y desventajas específicas. Una ventaja de las vacunas derivadas de virus completos es el tipo de inmunidad inducida por tales vacunas. En general, las vacunas de virus fraccionados inducen una fuerte respuesta de anticuerpos mientras que las vacunas elaboradas a partir de virus completos inducen tanto un anticuerpo (humoral) como una respuesta celular. A pesar de que una respuesta de anticuerpos funcionales es un criterio para obtener la licencia que se correlaciona con la protección inducida por una vacuna, existe una creciente evidencia de que una respuesta de células T también es importante en la inmunidad contra la gripe -esto también puede proporcionar una mejor protección en los ancianos.
Con el fin de inducir una respuesta celular inmune, se desarrollaron vacunas hechas de virus completos. Debido a la alta patogenicidad de la cepa de influenza (por ejemplo, H5N1), estas vacunas se producen en instalaciones BL3+. Para las cepas de influenza altamente patógenas como la H5N1, algunos fabricantes han modificado la secuencia de gen de la hemaglutinina con el fin de reducir la patogenicidad de la cepa de la influenza y volverla no virulenta y poderla producir más fácilmente en huevos embrionarios o cultivos celulares de mamíferos. Otros también utilizan cepas de influenza más seguras en las que se clonan las secuencias genéticas para las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa en una cepa donante de influenza de baja patogenicidad y de alto rendimiento (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007). Si bien estos métodos pueden producir vacunas útiles, no proporcionan una solución a la necesidad de producir altos volúmenes en forma rápida y bajo costo de vacunas en la escala necesaria para satisfacer la necesidad mundial en un año normal, y es casi seguro que será insuficiente frente a una pandemia.
Utilizando esta tecnología de genética inversa, también se podría necesitar mutar la secuencia genética de la proteína HA para que sea no virulenta. Para las cepas de influenza de alta patogenicidad, la producción de vacunas de virus completos o bien requiere de procedimientos de confinamiento o las vacunas resultantes no coinciden exactamente con la secuencia genética del virus circulante. En el caso de vacunas vivas atenuadas, todavía hay un riesgo de que la vacuna administrada pueda recombinarse con un virus de influenza del huésped, lo que conduce a un nuevo virus de la influenza.
Si bien este método mantiene el epítopo antigénico y las modificaciones postraduccionales, existen una serie de inconvenientes con este método, incluyendo el riesgo de contaminación debido al uso de virus completos y rendimientos variables dependiendo de la cepa del virus. Niveles de protección por debajo del óptimo pueden provenir de la heterogeneidad genética en el virus debido a su introducción en los huevos. Otras desventajas incluyen una amplia planificación para la obtención de los huevos, riesgos de contaminación debidos a los productos químicos utilizados en la purificación, y largos períodos de producción. También, las personas hipersensibles a las proteínas del huevo no pueden ser candidatos elegibles para recibir la vacuna.
En el caso de una pandemia, la producción de vacunas fraccionadas está limitada por la necesidad de adaptar la cepa para crecimiento en huevos y los rendimientos de producción variables obtenidos. Aunque esta tecnología se ha utilizado durante años para la producción de vacunas estacionales, difícilmente puede responder en un plazo razonable a una pandemia y la capacidad de fabricación en todo el mundo es limitada.
Para evitar el uso de huevos, se han producido también virus de influenza en cultivo de células de mamífero, por ejemplo, en células MDCK o PERC.6, o similares. Otro enfoque es la genética inversa, en la que se producen los virus mediante la transformación de células con genes virales. Estos métodos, sin embargo, también requieren del uso del virus completo, así como métodos de elaboración y ambientes de cultivo específicos.
Se han desarrollado varios productos recombinantes como candidatos para la vacuna recombinante de la influenza. Estos enfoques se han centrado en la expresión, producción y purificación de las proteínas HA y NA de la influenza tipo A, incluyendo la expresión de estas proteínas utilizando células de insecto infectadas con baculovirus (Crawford et al., 1999; Johansson, 1999), vectores virales, y constructos de vacuna de ADN (Olsen et al., 1997).
De reciente preocupación es el brote de "gripe porcina" (cepa A/ California/04/09). Un brote inicial en México trajo esta cepa viral a la atención del mundo en unos pocos días, y se ha detectado en países de todo el mundo, como un testimonio de la rapidez con que puede transmitirse la influenza, así como una prueba para la cuarentena, producción antiviral, control de la infección y en última instancia, la producción de vacunas.
Los detalles específicos de una infección por el virus de la influenza son bien conocidos. En resumen, el ciclo infeccioso se inicia por la unión de la proteína HA de la superficie del virión a un receptor celular que contienen ácido siálico (glicoproteínas y glicolípidos). La proteína NA media el procesamiento del receptor de ácido siálico, y la penetración del virus en la célula depende de la endocitosis mediada por receptor que depende de HA. En los confines ácidos de los endosomas internalizados que contienen un virión de la influenza, la proteína HA experimenta cambios conformacionales que conducen a la fusión de membranas celulares y virales y del virus sin recubrimiento y la liberación mediada por M2 de las proteínas MI de las ribonucleoproteínas asociadas con la nucleocápside (las RNP), que migran dentro del núcleo de la célula para la síntesis de ARN viral. Los anticuerpos con proteínas HA previenen la infección por el virus mediante la neutralización de la infectividad del virus, mientras que los anticuerpos co proteínas NA median su efecto en las primeras etapas de la replicación viral.
Crawford et al. (1999) describen la expresión de HA de la influenza en células de insecto infectadas con baculovirus. Las proteínas expresadas se describen como capaces de prevenir la enfermedad de la gripe letal causada por los subtipos H5 y H7 de la influenza. Johansson et al. (1999) enseñan que las proteínas HA y NA de la influenza expresadas en baculovirus inducen respuestas inmunes en animales superiores con respecto a aquellas inducidas por una vacuna convencional. Se comparó la inmunogenicidad y la eficacia de la hemaglutinina expresada en baculovirus del virus de influenza equina con un candidato a vacuna de ADN homólogo (Olsen et al., 1997). Colectivamente, estos datos demuestran que se puede inducir un alto grado de protección contra la exposición al virus de la influenza con proteínas HA o NA recombinantes, utilizando diversos enfoques experimentales y en diferentes modelos animales.
Dado que la investigación previa ha demostrado que las glicoproteínas de superficie de la influenza, HA y NA, son los principales objetivos para provocar inmunidad protectora contra el virus de la influenza y que M1 provee un objetivo conservado para inmunidad celular para la influenza, un nuevo candidato a vacuna pueden incluir estos antígenos virales como una partícula macromolecular de proteína, tal como las partículas similares a virus (VLP). Como productos de la vacuna, las VLP ofrecen la ventaja de ser más inmunogénicas que la subunidad o antígenos recombinantes y son capaces de estimular tanto una respuesta inmune humoral como celular (Grgacic y Anderson, 2006). Además, la partícula con estos antígenos de la influenza puede mostrar epítopos conformacionales que produzcan anticuerpos neutralizantes para múltiples cepas de virus de la influenza.
La producción de una cepa no infecciosa del virus de la influenza para fines de una vacuna es una forma de evitar una infección inadvertida. Alternativamente, se han investigado las partículas similares a virus (VLP) como sustitutos para el virus cultivado. Las VLP imitan la estructura de la cápside viral, pero carecen de un genoma, y por tanto no puede replicarse o proporcionar un medio para una infección secundaria.
Varios estudios han demostrado que las proteínas recombinantes de la influenza se autoensamblan en las VLP en cultivo celular usando plásmidos de expresión de mamífero o vectores de baculovirus (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham y Galarza, 2001).
Gomez-Puertas et al. (1999) describe que la formación eficiente de una VLP de influenza depende de los niveles de expresión de varias proteínas virales. Neumann et al. (2000) estableció un sistema basado en un plásmido de expresión de mamíferos para la generación de partículas similares al virus infeccioso de la influenza enteramente a partir de ADNc clonados. Latham y Galarza (2001) informaron de la formación de las VLP de influenza en células de insecto infectadas con baculovirus recombinante que coexpresa genes para HA, NA, M1 y M2. Estos estudios demostraron que las proteínas del virión de la influenza pueden autoensamblarse después de coexpresión en células eucariotas.
Gomez-Puertas et al. (2000) enseñan que, además de la hemaglutinina (HA), la proteína de matriz (M1) del virus de la influenza es esencial para la germinación de VLP a partir de células de insectos. Sin embargo, Chen et al. (2007) enseñan que podría no ser necesaria M1 para la formación de VLP, y observó que la liberación eficiente de M1 y las VLP requiere la presencia de HA y la actividad de sialidasa proporcionada por NA. La NA escinde los ácidos siálicos de las glicoproteínas en la superficie de las células que producen las VLP, y que liberan las VLP en el medio.
Quan et al 2007 enseña que una vacuna VLP producida en un sistema de expresión de baculovirus (célula de insecto) induce una inmunidad protectora contra algunas cepas del virus de la influenza (A/PR8/34 (H1N1)). Se observó que las VLP estudiadas por Quan brotan de la membrana plasmática, y se consideró que eran del tamaño y morfología correctos, similares a los obtenidos en un sistema de mamífero (células MDCK).
Las publicaciones PCT WO 2004/098530 y WO 2004/098533 enseñan la expresión del virus HN de la enfermedad de Newcastle o la gripe aviar A/Turquía/Wisconsin/68 (H5N9) en células transformadas NT-1 (tabaco) en cultivo. Las composiciones que comprenden los polipéptidos expresados en cultivo de células vegetales provocan diferentes respuestas inmunes en conejos y pollos.
Los virus en una envoltura pueden obtener su envoltura lipídica cuando 'emergen' fuera de la célula infectada y obtienen la membrana de la membrana plasmática, o de la de un orgánulo interno. Las partículas VLP y las VLP emergen de la membrana plasmática de la célula huésped. En los sistemas de células de mamíferos o de baculovirus, por ejemplo, la Influenza emerge de la membrana plasmática (Quan et al. 2007). Sólo unos pocos virus en envoltura son conocidos por infectar a las plantas (por ejemplo, los miembros de los Topovirus y Rabdovirus). Los virus conocidos con envoltura de las plantas, se caracterizan por emerger de las membranas internas de la célula huésped, y no de la membrana plasmática. Aunque se ha producido un pequeño número de las VLP recombinantes en huéspedes vegetales, ninguno se deriva de la membrana plasmática, planteando la cuestión de si se pueden producir en las plantas las VLP derivadas de la membrana plasmática, incluyendo las VLP de influenza.
Las tecnologías actuales de producción de VLP de la influenza se basan en la coexpresión de múltiples proteínas virales, y esta dependencia representa un inconveniente de estas tecnologías ya que en caso de una pandemia y de las epidemias anuales, el tiempo de respuesta es crucial para la vacunación. Un sistema más sencillo de producción
de VLP, por ejemplo, uno que se basa en la expresión de sólo una o unas pocas proteínas virales sin necesidad de la expresión de las proteínas virales no estructurales es deseable para acelerar el desarrollo de vacunas.
Con el fin de proteger a la población mundial de la influenza y para evitar futuras pandemias, los fabricantes de vacunas tendrán que desarrollar métodos rápidos y eficaces para la producción de dosis de vacunas. El uso actual de los huevos fertilizados para producir vacunas es insuficiente e implica un proceso largo.
Resumen de la invención
Un objetivo de la invención es proveer partículas mejoradas similares al virus de la influenza (VLP).
De acuerdo con la presente invención, se provee un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de un virus con envoltura unido operativamente a una región reguladora activa en una planta, el antígeno es una hemaglutinina de la influenza (HA). Preferiblemente, el antígeno es una HA de la gripa A/ California/04/09.
La HA puede comprender un péptido señal nativo, o no nativo; el péptido señal no nativo puede ser un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa.
La HA codificada por el ácido nucleico puede ser una de influenza tipo A, una de influenza B, o es un subtipo de la influenza tipo A, seleccionada de entre el grupo que comprende H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9 , H10, H11, H12, H13, H14, H15, y H16. En algunos aspectos de la invención, la HA codificada por el ácido nucleico puede ser de una influenza tipo A, y se selecciona entre el grupo que comprende H1, H2, H3, H5, H6, H7 y H9. Preferiblemente, la HA de influenza es de la cepa A/California/04/09.
La presente invención también provee un método para producir partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta, que comprende:
a) la introducción de un ácido nucleico que codifica un antígeno de un virus con envoltura, por ejemplo, una hemaglutinina de influenza (HA) de la cepa A/California/04/09, unida operativamente a una región reguladora activa en la planta, dentro de la planta, o una porción de la misma , y
b) la incubación de la planta o una porción de la misma, en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.
El método puede comprender además las etapas de cosecha de la planta y de la purificación o separación de las VLP del tejido de la planta.
El método puede comprender además, en la etapa de introducir (etapa a), un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteína chaperona.
Las una o más de una proteínas chaperonas se pueden seleccionar del grupo que comprende Hsp40 y Hsp70.
La presente invención incluye el método anterior en el que, en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico puede ser o bien expresado transitoriamente en la planta, o expresado en forma estable en la planta. Además, las VLP se pueden purificar mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método de producción de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta que comprende proporcionar una planta, o una parte de una planta, que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una HA de influenza A/California/04/09 unida operativamente a una región reguladora activa en una planta, y la incubación de la planta o parte de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.
El método puede comprender además las etapas de cosecha de la planta y de purificación o separación de las VLP del tejido de la planta.
La presente invención incluye el método anterior, en el que después de la etapa de proveer, se introduce un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteína chaperona unida operativamente a una región reguladora activa en una planta, y se incuba la planta o parte de la planta en condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.
Las una o más de una proteínas chaperonas se pueden seleccionar del grupo que comprende Hsp40 y Hsp70.
La presente invención incluye el método anterior en el que, en la etapa de introducción (etapa a), el ácido nucleico que codifica la HA de la gripe A/California/04/09 se expresa de forma estable en la planta. Además, las VLP se pueden purificar mediante cromatografía de exclusión por tamaño.
La presente invención también proporciona una partícula similar a un virus (VLP) que comprende una proteína HA del virus de la influenza, de la cepa A/California/04/09, y uno o más de un lípido derivado de una planta.
La proteína HA del VLP puede ser de influenza tipo A, influenza tipo B, o es un subtipo de HA de la influenza tipo A seleccionada del grupo que consiste de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. En algunos aspectos de la invención, la HA es de influenza tipo A, seleccionada de entre el grupo que comprende H1, H2, H3, H5, H6, H7 y H9.
También se incluye en la presente invención una composición que comprende una dosis eficaz de una VLP, la VLP que comprende una proteína HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido de la planta, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también contempla fragmentos o porciones de proteínas HA que forman las VLP en una planta.
La presente invención también se refiere a una VLP que comprende N-glicanos o N-glicanos modificados específicos de la planta que contienen HA del virus de la influenza. La proteína HA del VLP puede ser de influenza tipo A, influenza tipo B, o es un subtipo de la HA de influenza tipo A seleccionada del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 y H16. En algunos aspectos de la invención, la HA es de influenza tipo A, seleccionada de entre el grupo que comprende H1, H2, H3, H5, H6, H7 y H9.
La VLP puede comprender una proteína HA de uno, o más de un subtipo, incluyendo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16 o fragmento o porción de los mismos. Ejemplos de subtipos que comprenden dichas proteínas HA incluyen A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/ Nueva York/1995, A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003 A/ánade real/MN/33/00, A/pato/ Shanghái/1/2000, A/ánade rabudo/TX/828189/02, A/Turquía/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchara/Irán/G54/03, A/ pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5 ), A/Gaviota/Maryland/ 704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/ Florida /4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (HSN1), A/cerceta/Hong Kong/ W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/ Hong Kong/1073/1099 (H9N2), A/California/04/09 (H1N1).
En un aspecto de la invención, la proteína HA puede ser un subtipo H1, H2, H3, H5, H6, H7 o H9. En otro aspecto, la proteína H1 puede ser de la capa A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/ 59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) o A/California/04/09 (H1N1). La proteína H3 también puede ser de la cepa A/Brisbane/10/2007 (H3N2) o A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). En un aspecto adicional de la invención, la proteína H2 puede ser de la cepa A/Singapur/1/57 (H2N2). La proteína H5 puede ser de la cepa A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), o A/Indonesia/5/2005. En un aspecto de la invención, la proteína H6 puede ser de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). La proteína H7 puede ser de la cepa A/Equino/Praga/56 (H7N7). En un aspecto de la invención, la proteína H9 es de la cepa A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). En un aspecto adicional de la invención, la proteína HA puede ser de un virus de influenza que puede ser un virus de tipo B, incluyendo B/Malasia/2506/2004 o B/Florida/4/2006. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de las proteínas HA de H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o subtipos B incluyen las SEQ ID NOs: 48 -59 y 128.
La proteína HA del virus de la influenza puede ser H5 de la cepa A/Indonesia/05/05 (H5N1) o H1 de la cepa A/ California/04/09 (H1N1).
La presente invención también provee moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican una proteína HA. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender además una o más regiones reguladoras unidas operativamente a la secuencia que codifica una proteína HA. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una secuencia que codifica H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, B o C. En otro aspecto de la invención, la proteína HA codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9, o del subtipo B. La proteína H1 codificada por la molécula de ácido nucleico es de la cepa A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) o A/California/04/09 (H1N1). En un aspecto de la invención, la proteína H3 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Brisbane 10/2007 (H3N2), o A/Wisconsin/67/2005 (H3N2). En un aspecto adicional de la invención, la proteína H2 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/ Singapur/1/57 (H2N2). La proteína H5 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Anhui/ 1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), o A/Indonesia/5/2005. En un aspecto de la invención, la proteína H6 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1). La proteína H7 codificada por la molécula de ácido nucleico también puede ser de la cepa A/Equino/Praga/56 (H7N7). Además, la proteína H9 codificada por la molécula de ácido nucleico puede ser de la cepa A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). La proteína HA de subtipo B codificada por el ácido nucleico puede ser de la cepa B/Florida/4/2006, o B/ Malasia/2506/2004. Ejemplos
de secuencias de moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas HA de H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o subtipos B incluyen las SEQ ID NOs: 36 -47 y 60 -73 y 127.
La secuencia de ácido nucleico puede codificar la proteína HA del virus de la influenza de la cepa A/Indonesia/05/05 (H5N1) o de la cepa A/California/04/09 (H1N1).
Las regiones reguladoras que pueden estar operativamente unidas a una secuencia que codifica una proteína HA incluyen aquellas que son operativas en una célula vegetal, una célula de insecto o una célula de levadura. Tales regiones reguladoras pueden incluir una región reguladora de plastocianina, una región reguladora de la ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO), proteína de unión clorofila a/b (CAB), ST-LS 1, una región reguladora de la polihedrina, o una región reguladora de gp64. Otras regiones reguladoras incluyen una 5' UTR, 3' UTR o secuencias de terminación. La región reguladora de plastocianina puede ser una región reguladora de plastocianina de alfalfa; las secuencias 5' UTR, 3' UTR o terminadoras también pueden ser secuencias de alfalfa.
También se proporciona un método para inducir inmunidad a una infección por virus de la influenza en un sujeto, , comprendiendo el método la administración de una partícula similar a un virus que comprende una proteína HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido vegetal, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La partícula similar a un virus se puede administrar a un sujeto por vía oral, por vía intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutánea.
La presente invención también se refiere a una partícula similar a un virus (VLP) que comprende una o más de una proteína derivada de un virus seleccionado del grupo que consiste de influenza, sarampión, Ébola, Marburgo, y VIH, y uno o más de un lípido derivado de una célula de producción de un huésped que no es de sialilación. La proteína del VIH puede ser p24, gp120 o gp41; la proteína del virus del Ébola puede ser VP30 o VP35; la proteína del virus de Marburgo puede ser Gp/SGP; la proteína del virus del sarampión puede ser una proteína H o una proteína F.
Adicionalmente, la presente invención se refiere a una partícula similar a un virus (VLP) que comprende una proteína HA del virus de la influenza y uno o más de un lípido huésped. Por ejemplo, si el huésped es insecto, entonces la partícula similar a un virus (VLP) puede comprender una proteína HA del virus de la influenza y uno o más de un lípido de insecto, o si el huésped es una levadura, entonces la partícula similar a un virus (VLP) puede comprender una proteína HA del virus de influenza y uno o más de un lípido de levadura.
La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden las VLP de dos o más cepas o subtipos de influenza. Las dos o más subtipos o cepas se pueden seleccionar del grupo que comprende: A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/ánade real/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000, A/ánade rabudo/TX/828189/02, A/Turquía/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchara/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), o A/California/04/09 (H1N1). Las dos o más subtipos o cepas de VLP pueden estar presentes en cantidades aproximadamente equivalentes; alternativamente uno o más de los subtipos o cepas pueden ser la mayoría de las cepas o subtipos representados.
La presente invención se refiere a un método para la inducción de inmunidad a la infección por virus de la influenza en un animal u organismo objetivo que comprende la administración de una dosis eficaz de una vacuna que comprende una o más de una VLP, la VLP producida usando un huésped no de sialilación, por ejemplo un huésped vegetal, un huésped insecto, o un huésped de levadura. La vacuna se puede administrar por vía oral, por vía intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutánea. El organismo objetivo puede seleccionarse del grupo que comprende seres humanos, primates, caballos, cerdos, aves (aviar), aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, pato, oca, aves de corral, pollo, camello, canino, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, civeta, visón, garduña, hurones, animales domésticos, animales de granja, ratones, ratas, foca, ballenas y similares.
La presente invención proporciona un método para producir las VLP que contienen hemaglutinina (HA) de diferentes cepas de influenza en un huésped adecuado capaz de producir una VLP, por ejemplo, una planta, insecto o levadura. Las VLP que se producen en las plantas contienen lípidos de origen vegetal, las VLP producidas en células de insecto comprenden lípidos de la membrana plasmática de las células del insecto (generalmente denominados como "lípidos de insectos"), y las VLP producidas en levadura comprenden lípidos de la membrana plasmática de las células de levadura (generalmente denominados como "lípidos de levadura").
La presente invención también se refiere a una planta, tejido vegetal o célula de una planta que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de un virus con envoltura unido operativamente a una región reguladora activa en una planta. El antígeno puede ser una hemaglutinina de la
influenza (HA). Preferiblemente, el antígeno es una HA de la gripe A/California/04/09.
La planta puede comprender además un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de una proteína chaperona unidas operativamente a una región reguladora activa en una planta. Las una
o más proteínas chaperonas se pueden seleccionar del grupo que comprende Hsp40 y Hsp70.
La producción de las VLP en las plantas presenta varias ventajas sobre la producción de estas partículas en cultivo celular de insecto. Lípidos vegetales pueden estimular a células inmunes específicas y mejorar la respuesta inmune inducida. Las membranas vegetales están hechas de lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), y también contienen glicoesfingolípidos que son únicos para las plantas y algunas bacterias y protozoos. Los esfingolípidos son inusuales ya que ellos no son ésteres de glicerol como PC o PE, sino más bien se componen de un amino alcohol de cadena larga que forma un enlace amida con una cadena de ácido graso que contiene más de 18 átomos de carbono. PC y PE, así como glicoesfingolípidos se pueden unir a moléculas CD1 expresadas por células del sistema inmune de mamíferos tales como las células que presentan antígeno (APC) como las células dendríticas y los macrófagos y otras células incluyendo linfocitos B y T en el timo y el hígado (Tsuji M., 2006). Adicionalmente, además del efecto adyuvante potencial de la presencia de los lípidos de las plantas, la capacidad de los N-glicanos de las plantas para facilitar la captura de antígenos de glicoproteína por las células que presentan antígeno (Saint-Jore-Dupas, 2007), puede ser ventajosa para la producción de las VLP en las plantas.
Sin desear estar limitado por la teoría, se prevé que las VLP producidas por las plantas inducirán una reacción inmune más fuerte que las VLP elaboradas en otros sistemas de fabricación y que la reacción inmunitaria inducida por estas VLP producidas por las plantas será más fuerte cuando se compara con la reacción inmune inducida por las vacunas de virus vivos o atenuados completos.
Contrariamente a las vacunas elaboradas a partir de virus completos, las VLP tienen la ventaja de que no son infecciosas, por lo tanto la contención biológica restrictiva no es un problema tan importante ya que se trabaja con un virus infeccioso completo, y no se requiere para la producción. Las VLP elaboradas por las plantas de hecho proporcionan de nuevo una ventaja adicional ya que permiten que el sistema de expresión sea cultivado en un invernadero o en el campo, siendo por lo tanto significativamente más económico y adecuado para el escalamiento.
Además, las plantas no comprenden las enzimas implicadas en la síntesis y añaden residuos de ácido siálico a las proteínas. Las VLP pueden ser producidas en ausencia de neuraminidasa (NA), y no hay necesidad de coexpresar NA, o tratar las células productoras o extraer con sialidasa (neuraminidasa), para asegurar la producción de VLP en las plantas.
Las VLP producidas de acuerdo con la presente invención no comprenden proteína M1 que se sabe que se une al ARN. El ARN es un contaminante de la preparación de VLP y es indeseable en la obtención de la aprobación reglamentaria para el producto VLP.
Este resumen de la invención no describe necesariamente todas las características de la invención.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras características de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción en la que se hace referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La Figura 1A muestra una secuencia de un casete de expresión basado en plastocianina de alfalfa utilizado para la expresión de H1 de la cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1) de acuerdo con una realización de la presente invención (SEQ ID NO: 8). El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa (PDI) está subrayado. Los sitios de restricción BglII (AGATCT) y SacI (GAGCTC) utilizados para la clonación se muestran en negrita. La Figura 1B muestra un diagrama esquemático de dominios funcionales de hemaglutinina de la influenza. Después de la escisión de los fragmentos HA0, HA1 y HA2 permanecen unidos por un puente disulfuro.
La Figura 2A muestra una representación del plásmido 540 ensamblado para la expresión del subtipo H1 de HA de la cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1). La Figura 2B muestra una representación del plásmido 660 ensamblado para la expresión del subtipo H5 de HA de la cepa A/Indonesia/5/2005 (H5N1).
La Figura 3 muestra una cromatografía de exclusión por tamaño de extractos de proteínas de las hojas que producen hemaglutinina H1 o H5. La Figura 3A muestra el perfil de elución de Azul Dextrano 2000 (triángulos) y proteínas (diamantes). La Figura 3B muestra fracciones de elución de inmunodetección (transferencias tipo Western; anti H1) de H1 (A/ Nueva Caledonia/20/99 (H1N1)) después de cromatografía de exclusión por tamaño (perlas S500HR). La Figura 3C muestra el perfil de elución de H5; Azul Dextrano 2000 (triángulos) y proteínas (diamantes). La Figura 3D muestra las fracciones de elución de inmunodetección (transferencias tipo Western; anti H5) de H5 (A/ Indonesia/5/2005 (H5N1)) después de la cromatografía de exclusión por tamaño (perlas S500HR).
La Figura 4A muestra la secuencia que codifica el fragmento N terminal de H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1))
(SEQ ID NO: 1). La Figura 4B muestra la secuencia que codifica el fragmento C terminal de H1 (A/New Caledonia/ 20/99 (H1N1)) (SEQ ID NO: 2).
La Figura 5 muestra la secuencia completa que codifica HA0 de H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) (SEQ ID NO: 28).
La Figura 6 muestra la secuencia que codifica H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) flanqueada por un sitio HindIII inmediatamente secuencia arriba del ATG inicial, y un sitio SacI inmediatamente secuencia abajo del codón de detención (TAA) (SEQ ID NO: 3)
La Figura 7A muestra la secuencia del cebador Plasto-443c (SEQ ID NO: 4). La Figura 7B muestra la secuencia del cebador SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 5). La Figura 7C muestra la secuencia del cebador SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 6). La Figura 7D muestra la secuencia del cebador de HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO: 7).
La Figura 8A muestra la secuencia de aminoácidos de la H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1); SEQ ID NO: 9). La Figura 8B muestra la secuencia de aminoácidos de H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1); SEQ ID NO: 10). El péptido señal nativo se indica en negrita.
La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos del subtipo H7 de HA de la influenza (SEQ ID No: 11).
La Figura 10A muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H2 (SEQ ID NO: 12). La Figura 10B muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H3 (SEQ ID NO: 13). La Figura 10C muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H4 (SEQ ID NO: 14). La Figura 10D muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H5 (SEQ ID NO: 15). La Figura 10E muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H6 (SEQ ID NO: 16). La Figura 10F muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H8 (SEQ ID NO: 17). La Figura 10G muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H9 (SEQ ID NO: 18). La Figura 10H muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H10 (SEQ ID NO: 19). La Figura 10I muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H11 (SEQ ID NO: 20). La Figura 10J muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H12 (SEQ ID NO: 21). La Figura 10K muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H13 (SEQ ID NO: 22). La Figura 10L muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H14 (SEQ ID NO: 23). La Figura 10M muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H15 (SEQ ID NO: 24). La Figura 10N muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza A, subtipo H16 (SEQ ID NO: 25). La Figura 10O muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza B (SEQ ID NO: 26). La Figura 10P muestra la secuencia de nucleótidos de HA de la influenza C (SEQ ID NO: 27). La Figura 10Q muestra la secuencia de nucleótidos del cebador XmaI-pPlas.c (SEQ ID NO: 29). La Figura 10R muestra la secuencia de nucleótidos del cebador SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30). La Figura 10S muestra la secuencia de nucleótidos del cebador SacI-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31). La Figura 10T muestra la secuencia de nucleótidos del cebador EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32).
La Figura 11 muestra una representación esquemática de varias constructos, como se usa en la presente invención. El constructo 660 comprende la secuencia de nucleótidos para codificar el subtipo H5 de HA (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) operativamente unido al promotor de plastocianina (plasto) y el terminador (Pter); el constructo 540 comprende la secuencia de nucleótidos para codificar el subtipo H1 de HA (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) en combinación con un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDI SP), y está unido operativamente a un promotor de plastocianina (Plasto ) y el terminador (Pter); el constructo 544 ensamblado para la expresión de del subtipo H1 de HA (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)), la secuencia de nucleótidos que codifica H1 se combina con un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDI SP) y una cremallera de leucina GCN4pII (en lugar del dominio transmembrana y la cola citoplasmática de HI) y operativamente unida al promotor de plastocianina (Plasto) y el terminador (Pter); y el constructo 750 para la expresión de la región codificante de M1 de la influenza A/PR/8/34 se combina con el virus del grabado del tabaco (TEV) 5'UTR y operativamente unido con el promotor doble 35S y el terminador Nos.
La Figura 12 muestra la inmunodetección de H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)), utilizando anticuerpos anti-H5 (Vietnam), en extractos de proteína de hojas de N. benthamiana transformadas con el constructo 660 (carril 3). Se utilizó H5 comercial de la influenza A/Vietnam/1203/2004 como control positivo de la detección (carril 1), y se utilizó un extracto de proteína de las hojas transformadas con un vector vacío como control negativo (carril 2).
La Figura 13 muestra la caracterización de las estructuras de hemaglutinina por cromatografía de exclusión por tamaño. Se separaron el extracto de proteína a partir de biomasas separadas que producen H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)), H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)), H1 soluble, o H1 y M1 por filtración en gel sobre S-500 HR. Se fraccionó también H1 Comercial (A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1)) en forma de rosetas (roseta H1). La Figura 13A muestra las fracciones de elución analizadas por el contenido relativo de proteína (Nivel relativo de proteína -se muestra un perfil de elución de proteína estándar de un fraccionamiento de la biomasa). Se indica el pico de elución del Azul Dextrano 2000 (estándar de referencia de 2 MDa). La Figura 13B muestra las fracciones de elución
analizadas por la presencia de hemaglutinina por inmunotransferencia con anticuerpos anti-H5 (Vietnam) (para H5). La Figura 13C muestra las fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para H1. La Figura 13D muestra fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para H1 soluble. La Figura 13E muestra las fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para roseta H1. La Figura 13F muestra fracciones de elución analizadas para anticuerpos anti-influenza A para H1 + M1.
La Figura 14 muestra la concentración de estructuras H5 de influenza (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) mediante centrifugación en gradiente de sacarosa y examen por microscopía electrónica de fracciones concentradas de hemaglutinina. La Figura 14A muestra la caracterización de las fracciones de la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Cada fracción se analizó por la presencia de H5 mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-H5 (Vietnam) (panel superior), y por su contenido relativo de proteína y la capacidad de hemaglutinación (gráfico). La Figura 14B muestra el examen por microscopía electrónica de transmisión con coloración negativa de las fracciones reunidas 17, 18 y 19 de la centrifugación en gradiente de sacarosa. La barra representa 100 nm.
La Figura 15 muestra la purificación de las VLP H5 de influenza. La Figura 15A muestra el análisis por SDS-PAGE con teñido con azul de Coomassie del contenido de proteína en las etapas de clarificación -carril 1, extracto sin purificar; carril 2, extracto ajustado a pH 6; carril 3, extracto tratado con calor; carril 4, extracto filtrado por DE; las etapas de purificación de afinidad por fetuína: carril 5, carga; carril 6, flujo continuo; carril 7, elución (concentrado 10 veces). La Figura 15B muestra el examen por microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa de la muestra purificada de la VLP H5. La barra representa 100 nm. La Figura 15C muestra la VLP H5 aislada ampliada para mostrar detalles de la estructura. La Figura 15D muestra el producto de la VLP H5 en un SDS-PAGE reductor teñido con Coomassie (carril A) y una transferencia tipo Western (carril B) usando anticuerpo policlonal de conejo surgido contra HA de la cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1).
La Figura 16 muestra una secuencia de nucleótidos para el gen de l hemaglutinina (HA) del virus de Influenza A (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)), cds completo. Número de acceso del GenBank AY289929 (SEQ ID NO: 33)
La Figura 17 muestra una secuencia de nucleótidos para ARNm de Medicago sativa para proteína disulfuro isomerasa. Número de acceso del GenBank Z11499 (SEQ ID NO: 34).
La Figura 18 muestra una secuencia de nucleótidos para el segmento 7 del virus de la Influenza A (A/Puerto Rico/ 8/34 (H1N1)), secuencia completa. Número de acceso del GenBank NC_002016.1 (SEQ ID NO: 35).
La Figura 19 muestra la localización de la acumulación de VLP mediante observación por microscopía electrónica de transmisión de tinción positiva del tejido que produce H5. CW: pared celular, ch: cloroplasto, pm: membrana plasmática, VLP: partículas similares al virus. La barra representa 100 nm.
La Figura 20 muestra la inducción de respuestas de anticuerpos en suero 14 días después del refuerzo en ratones Balb/c vacunados con VLP H5 de la influenza producidos por plantas (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) o H5 soluble recombinante (A/Indonesia/5/2005 ( H5N1)). La Figura 20 (A) Las respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante inyección intramuscular. La Figura 20 (B) Las respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante administración intranasal. Las respuestas de anticuerpos se midieron contra los virus H5N1 completos inactivados (A/Indonesia/5/05). GMT: media geométrica de los títulos. Los valores son la GMT (ln) de títulos de punto final recíprocos de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación media. *p <0,05 comparado con H5 soluble recombinante.
La Figura 21 muestra la respuesta de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (HAI) 14 días después del refuerzo en ratones Balb/c vacunados con la VLP H5 de la influenza producidos por plantas (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) o H5 soluble recombinante (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)). Figura 21 (A) Las respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante inyección intramuscular. Figura 21 (B) Las respuestas de anticuerpos de ratones inmunizados mediante administración intranasal. Se midieron las respuestas de anticuerpos HAI utilizando virus H5N1 completos inactivados (A/Indonesia/5/05). GMT: media geométrica de los títulos. Los valores son la GMT (ln) de títulos de punto final recíprocos de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación media. * p <0,05 y ** p <0,01 en comparación con H5 soluble recombinante.
La Figura 22 muestra el efecto del adyuvante sobre la inmunogenicidad de las VLP en ratones Balb/c. Figura 22 (A) Efecto del alumbre en los ratones inmunizados por medio de inyección intramuscular. Figura 22 (B) Efecto del quitosano en ratones inmunizados mediante administración intranasal. Las respuestas de anticuerpos HAI se midieron utilizando los virus H5N1 completos inactivados (A/Indonesia/5/05). GMT: media geométrica del título. Los valores son la GMT (ln) de títulos de punto final recíprocos de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación media. * p <0,05 comparado con el correspondiente H5 soluble recombinante.
La Figura 23 muestra la respuesta de anticuerpos a la administración de la VLP H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1) A). Figura 23 (A) Isótopo de inmunoglobulina anti-Indonesia/5/05 en ratones inmunizados mediante administración
intramuscular, 30 días después del refuerzo. Los valores son la GMT (log2) de títulos de punto final recíprocos de cinco ratones por grupo. ELISA realizado usando virus H5N1 inactivados completos (A/Indonesia/5/2005) como el agente de recubrimiento. Las barras representan la desviación media. * p <0,05, ** p <0,001 comparado con el H5 soluble recombinante correspondiente (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)). Figura 23 (B) Títulos de anticuerpos contra los virus inactivados completos (A/Indonesia/5/2005 (H5N1) y (A/Vietnam/1194/04 (H5N1))). Todos los grupos son estadísticamente diferentes al control negativo.
La Figura 24 muestra el título de anticuerpos contra virus inactivados completos homólogos (A/Indonesia/5/05), 14 días después de la primera semana de la dosis (semana 2), 14 días después del refuerzo (semana 5) o 30 días después del refuerzo (7 semanas) de ratones Balb/c inmunizados con VLP H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)). GMT: media geométrica del título. Los valores son la GMT (ln) de títulos de punto final recíprocos de cinco ratones por grupo. * p <0,05 comparado con H5 soluble recombinante.
La Figura 25 muestra reactividad cruzada in vitro de los anticuerpos en suero de ratones Balb/c inmunizados con VLP H5 (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)) 30 días después del refuerzo. (A) Los títulos de anticuerpos de virus inactivados completos. (B) Títulos de inhibición de la hemaglutinación contra diversos virus inactivados completos. Los valores son la GMT (ln) de títulos de punto final recíprocos de cinco ratones por grupo. Las barras representan la desviación media. Todos los grupos son estadísticamente diferentes al control negativo. * p <0,05 comparado con el correspondiente H5 soluble recombinante. A todos los valores inferiores a 10 se les dio un valor arbitrario de 5 (1,6 para ln) y se consideran negativos.
La Figura 26 muestra la eficacia de la VLP H5 elaborada por la planta (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)). (A) Tasa de supervivencia de los ratones después de la exposición a 1.000 LD50 (4,09 x 106 CCID50) de la cepa de influenza A/Turquía/582/06 (H5N1) (B) Peso corporal de ratones inmunizados después de la exposición. Los valores son la media del peso corporal de los ratones supervivientes.
La Figura 27 muestra origen de las VLP de influenza derivados de plantas. (A) Composición de lípidos polares de las VLP de influenza purificadas. Los lípidos contenidos en un equivalente de 40 µg de proteínas, se extrajeron de VLP como se describió, se separaron por HP-TLC, y se compararon con el perfil de migración de los lípidos aislados a partir de la membrana plasmática (PM) de tabaco altamente purificada. Las abreviaturas de lípidos son las siguientes: DGDG, digalactosildiacilglicerol; gluCER, glucosil-ceramida; PA, ácido fosfático; PC, fosfatidilcolina; PE, fosfatidiletanolamina; PG, fosfatidilglicerol; PI, fosfatidilinositol; PS, fosfatidilserina; SG, esteril-glicósido. (B) Composición de lípidos neutros de las VLP de influenza purificadas. Se extrajeron los lípidos contenidos en un equivalente de 20 µg de proteínas de VLP como se describió, se separaron por HP-TLC y se compararon con la migración de sitosterol. (C) Inmunodetección de la ATPasa de la bomba de protones marcadora de la membrana plasmática (PMA) en las VLP purificadas y PM altamente purificada a partir de hojas de tabaco (PML) y células de tabaco BY2 (PMBY2). Se cargaron dieciocho microgramos de proteína en cada carril.
La Figura 28 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 774 -secuencia de nucleótidos de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 36). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 29 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI de clon 775 -secuencia de nucleótidos de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 37). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 30 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 776 -secuencia de nucleótidos de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) (SEQ ID NO: 38). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 31 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 777 -secuencia de nucleótidos de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (SEQ ID NO: 39). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 32 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 778 -secuencia de nucleótidos de B/Malasia/2506/2004 (SEQ ID NO: 40). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de
detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 33 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 779 -secuencia de nucleótidos de B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 41). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 34 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 780 -secuencia de nucleótidos de A/Singapur/1/57 (H2N2) (SEQ ID NO: 42). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 35 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 781 -secuencia de nucleótidos de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 43). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 36 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 782 -secuencia de nucleótidos de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 44). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 37 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 783 -secuencia de nucleótidos de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (SEQ ID NO: 45). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 38 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 784 -secuencia de nucleótidos de A/Equino/Praga/56 (H7N7) (SEQ ID NO: 46). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 39 muestra la secuencia que abarca desde los sitios DraIII hasta SacI del clon 785 -secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 47). La secuencia de codificación está flanqueada por una región reguladora de plastocianina, comenzando con un sitio de restricción DraIII en el extremo 5’ y por un codón de detención y un sitio SacI en el extremo 3'. Los sitios de restricción están subrayados; ATG está en negrita y subrayado.
La Figura 40A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) del polipéptido traducido a partir del clon 774 (A/Brisbane/59/2007 (H1N1)). El marco de lectura abierto del clon 774 comienza con el ATG indicado en la Figura
28. La Figura 40B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 49) del polipéptido traducido a partir del clon 775 (A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1)). El marco de lectura abierto del clon 775 comienza con el ATG indicado en la Figura 29.
La Figura 41A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 50) del polipéptido traducido a partir del clon 776 (A/Brisbane/10/2007 (H3N2)). El marco de lectura abierto del clon 776 comienza con el ATG indicado en la Figura
30. La Figura 41B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 51) del polipéptido traducido a partir del clon 777 (A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)). El marco de lectura abierto del clon 777 comienza con el ATG indicado en la Figura 31.
La Figura 42A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 52) del polipéptido traducido a partir del clon 778 (B/Malasia/2506/2004). El marco de lectura abierto del clon 778 comienza con el ATG indicado en la Figura 32. La Figura 42B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 53) del polipéptido traducido a partir del clon 779 (B/Florida/4/2006). El marco de lectura abierto del clon 779 comienza con el ATG indicado en la Figura 33.
La Figura 43A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 54) del polipéptido traducido a partir del clon 780 (A/Singapur/1/57 (H2N2)). El marco de lectura abierto del clon 780 comienza con el ATG indicado en la Figura 34. La Figura 43B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) del polipéptido traducido a partir del clon 781
(A/Anhui/1/2005 (H5N1)). El marco de lectura abierto del clon 781 comienza con el ATG indicado en la Figura 35.
La Figura 44A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 56) del polipéptido traducido a partir del clon 782 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)). El marco de lectura abierto del clon 782 comienza con el ATG indicado en la Figura
36. La Figura 44B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 57) del polipéptido traducido a partir del clon 783 (A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1)). El marco de lectura abierto del clon 783 comienza con el ATG indicado en la Figura 37.
La Figura 45A muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 58) del polipéptido traducido a partir del clon 784 (A/Equino/Praga/56 (H7N7)). El marco de lectura abierto del clon 784 comienza con el ATG indicado en la Figura 38. La Figura 45B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 59) del polipéptido traducido a partir del clon 785 (A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)). El marco de lectura abierto del clon 785 comienza con el ATG indicado en la Figura
39.
La Figura 46 muestra la inmunodetección (transferencia tipo Western) de las fracciones de elución 7-17 de las VLP producidas por plantas, después de la cromatografía de exclusión por tamaño. El pico de elución (fracción 10) de Azul Dextrano se indica por la flecha. Se muestran los subtipos de hemaglutinina H1, H2, H3, H5, H6 y H9. La hemaglutinina se detecta en las fracciones 7-14, correspondientes a la elución de las VLP.
La Figura 47 muestra un análisis de inmunotransferencia de la expresión de una serie de hemaglutinina de las cepas epidémicas anuales. Se cargaron diez y veinte microgramos de extractos de proteína de hoja en los carriles 1 y 2, respectivamente, para las plantas que expresan HA de diferentes cepas de influenza (indicados en la parte superior de las inmunotransferencias).
La Figura 48A muestra un análisis de inmunotransferencia de la expresión de una serie de hemaglutininas H5 de potenciales cepas pandémicas. Se cargaron diez y veinte microgramos de extractos de proteína en los carriles 1 y 2, respectivamente. La Figura 48B muestra un análisis de inmunotransferencia de la expresión de hemaglutinina H2, H7 y H9 de cepas de influenza seleccionadas. Se cargaron diez y veinte microgramos de extractos de proteína en los carriles 1 y 2, respectivamente.
La Figura 49 muestra una inmunotransferencia de H5 de la cepa A/Indonesia/5/2005, en extractos de proteínas de hojas de Nicotiana tabacum, agroinfiltradas con AGL1/660. Se infiltraron dos plantas (planta 1 y planta 2) y se cargaron 10 y 20 µg de proteína soluble extraída de cada planta en los carriles 1 y 2, respectivamente.
La Figura 50 muestra la reactividad cruzada in vitro de anticuerpos en suero. Títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en sueros de hurón, 14 días (A) después de primera inmunización y (B) después del segundo refuerzo con VLP H5 de influenza producidos por plantas (A/Indonesia/5/2005 (H5N1)). Las respuestas de anticuerpos HAI se midieron utilizando los siguientes virus H5N1 completos inactivados: A/pavo/Turquía/1/05, A/Vietnam/1194/04, A/Anhui/5/05 y la cepa homóloga A/Indonesia/5/05. Los valores son la GMT (log2) de títulos de punto final recíprocos de cinco hurones por grupo. Veta diagonal -A/Indonesia/6/06 (clado 2.1.3); comprobado A/pavo/Turquía/1/05 (clado 2.2); barra blanca -A/Vietnam/1194/04 (clado 1); barra negra A/Anhui/5/05. Se indican los respondedores. Las barras representan la desviación media.
La Figura 51 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 60) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de la hemaglutinina de H5 de A/Indonesia/5/2005 (constructo # 660), plastocianina de alfalfa 3 'UTR secuencias terminadora.
La Figura 52 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 61) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Nueva Caledonia/20/1999 (constructo # 540), plastocianina de alfalfa 3 'UTR secuencias terminadora.
La Figura 53 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 62) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Brisbane/59/2007 (constructo # 774), plastocianina de alfalfa 3 'UTR secuencias terminadoras.
La Figura 54 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 63) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (constructo # 775) , plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 55 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 64) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H2 de A/Singapur/1/57 (H2N2) (constructo # 780), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 56 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 65) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (constructo # 781), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 57 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 66) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (constructo # 782), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 58 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 67) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (constructo # 783), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 59 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 68) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (constructo # 785) , plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 60 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 69) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H3 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 61 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 70) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 62 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 71) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de H7 de A/Equino/Praga/56 (H7N7), plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 63 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 72) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de HA de B/Malasia/2506/2004, plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 64 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 73) de un casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5' UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina de HA de B/Florida/4/2006, plastocianina de alfalfa 3' UTR y secuencias terminadoras.
La Figura 65 muestra una secuencia de aminoácidos de consenso (SEQ ID NO: 74) para HA de A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (codificada por la SEQ ID NO: 33), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) y SEQ ID NO: 9. X1 (posición 3) es A o V; X2 (posición 52) es D o N; X3 (posición 90) es K o R; X4 (posición 99) es K o T; X5 (posición 111) es Y o H; X6 (posición 145) es V o T; X7 (posición 154) es E o K; X8 (posición 161) es R o K; X9 (posición 181) es V o A; X10 (posición 203) es D o N; X11 (posición 205) es R o K; X12 (posición 210) es T o K; X13 (posición 225) es R o K; X14 (posición 268) es W o R; X15 (posición 283) es T o N; X16 (posición 290) es E o K; X17 (posición 432) es I o L; X18 (posición 489) es N o D.
La Figura 66 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 75) de H1 Nueva Caledonia (AAP34324.1) codificada por la SEQ ID NO: 33.
La Figura 67 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 76) de H1 Puerto Rico (NC_0409878.1) codificada por la SEQ ID NO: 35
La Figura 68 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del casete de expresión número 828, desde PacI (promotor secuencia arriba) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia HT 5'UTR del CPMV subrayado con ATG mutado. Sitio de restricción ApaI (inmediatamente secuencia arriba del ATG de la secuencia de codificación de la proteína que va a ser expresada, en este caso la cadena ligera kappa C51).
La Figura 69 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 663, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina). La secuencia de codificación de H5 (de A/Indonesia/5/2005) en fusión con PDI SP está subrayada.
Figura 70 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 787, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina). La secuencia de codificación de H1 (de A/Brisbane/59/2007) en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 71 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 790, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina). La secuencia de codificación de H3 (de A/Brisbane/10/2007) en fusión con
PDI SP está subrayada.
La Figura 72 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 798, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina). La secuencia de codificación de HA de B/Florida/4/2006 en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 73 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 580, desde Pacl (secuencia arriba del promotor 35S) hasta Ascl (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H1 (de A/Nueva Caledonia/20/1999) en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 74 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 685, desde Pacl (secuencia arriba del promotor 35S) hasta Ascl (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H5 de A/Indonesia/5/2005 está subrayado.
La Figura 75 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 686, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H5 de A/Indonesia/5/2005 en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 76 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 732, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H1 de A/Brisbane/59/2007 está subrayada.
La Figura 77 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 733, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H1 de A/Brisbane/59/2007 en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 78 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 735, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H3 de A/Brisbane/10/2007 está subrayada.
La Figura 79 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 736, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de H3 de A/Brisbane/10/2007 en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 80 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 738, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de HA de B/Florida/4/2006 está subrayada.
La Figura 81 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número 739, desde PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de HA de B/Florida/4/2006 en fusión con PDI SP está subrayada.
La Figura 82 muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica Msj1 (SEQ ID NO: 114).
La Figura 83 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número R850, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de HSP40 está subrayada.
La Figura 84 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número R860, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de HSP70 está subrayada.
La Figura 85 muestra la secuencia de ácido nucleico de una porción del constructo número R870, desde HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de codificación de HSP40 está en cursiva subrayada y la secuencia de codificación de HSP70 está subrayada. A) nucleótidos 1 -5003; B) nucleótidos 5004 -9493.
La Figura 86 muestra una representación esquemática del constructo R472.
La Figura 87 muestra un análisis de inmunotransferencia de la expresión de HA usando un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa. Se cargaron veinte microgramos de extracto de proteína de la hoja obtenida de 3 plantas separadas en el SDS-PAGE a excepción de la H1 (A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1)) donde se usaron cinco microgramos. Los controles indicados (virus inactivado completo (WIV) de una cepa homóloga) se enriquecieron en cinco o veinte microgramos de plantas infiltradas en forma simulada. a) Expresión de H1 de A/Nueva Caledonia/20/99), b) expresión de H1 de A/Brisbane/59/2007, c) expresión de H3 de A/Brisbane/10/2007,
d) expresión de H5 de A/Indonesia/5/2005, e) expresión de HA de B/Florida/4/2006. Las flechas indican la inmunobanda correspondiente a HA0. SP WT: péptido señal nativo, PS PDI: péptido señal PDI de alfalfa.
La Figura 88 muestra una comparación de estrategias de expresión de HA mediante análisis de inmunotransferencia de extractos de proteínas de la hoja. Se produjo HA usando casetes basados en CPMV-HT o plastocianina-HT. Para CPMV-HT, también se compararon el péptido señal HA de tipo silvestre y el péptido señal de PDI de alfalfa. Se cargaron veinte microgramos de extracto de proteína en el SDS-PAGE para el subtipo HA analizado excepto para la H1 Nueva Caledonia para la que se cargaron cinco microgramos de proteínas. a) Expresión de H1 de A/Nueva Caledonia/20/1999, b) expresión de H1 de A/Brisbane/59/2007, c) expresión de H3 de A/Brisbane/10/2007, d) expresión de H5 de A/Indonesia/5/2005, y e) expresión de B de B/Florida/4/2006. Las flechas indican la inmunobanda correspondiente a HA0; las cepas específicas de Agrobacterium que comprenden los vectores específicos utilizados para la expresión de HA se indican en la parte superior de los carriles.
La Figura 89 muestra un inmunotransferencia de acumulación de HA cuando se coexpresa con Hsp40 y Hsp70. H1 Nueva Caledonia (AGL1/540) y H3 Brisbane (AGL1/790) se expresaron solas o coexpresadas con AGL1/R870. Se evaluó el nivel de acumulación de HA mediante análisis de inmunotransferencia de extractos de proteínas de las hojas infiltradas. Se utilizaron como controles el virus completo inactivado (WIV) de la cepa A/New Caledonia/20/99 o Brisbane/10/2007.
La Figura 90 muestra un casete de expresión basado en CPMV-HT para H1 de A/California/04/09 (constructo # 560).
La Figura 91 muestra un análisis de transferencia tipo Western de H1 de A/California/04/09 en extractos de proteínas de plantas agroinfiltradas 2 días después de la infiltración. Las muestras que corren en cada carril se presentan en la Tabla 20.
La Figura 92A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 127) del casete de expresión basado en CPMV-HT para H1 de A/California/04/09 (casete número 560). El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa que codifica la secuencia está subrayada y la secuencia de codificación de H1 madura está resaltado en negrita. La Figura 92B muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 128) de la H1 de A/California/04/09 (como la codificada por la SEQ ID NO: 127). El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa está subrayada.
La Figura 93 muestra la secuencia de nucleótidos del promotor 2X35S (SEQ ID NO: 129).
La Figura 94 muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión intermediario número 972 (SEQ ID NO: 134), desde PacI (promotor secuencia arriba) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia promotora 2X35S está subrayada. ATG mutado están en un cajón. El sitio de restricción de ApaI (inmediatamente secuencia abajo de ATG para la secuencia de codificación de la proteína que se va a expresar, en este caso HA0 de H5 A/Indonesia proteína), está sombreado.
La Figura 95 muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia nativa de H1 A/California/4/2009 (SEQ ID NO: 135). El péptido señal de H1 A/California/4/2009 nativa está subrayado. Los sitios de restricción SacI y StuI están en un cajón.
La Figura 96 muestra las secuencias de nucleótidos de la secuencia final (SEQ ID NO: 136) sintetizada que contiene la secuencia de H1 de A/California/4/2009. La porción de la proteína M del sitio de restricción de DraIII y ApaI está subrayado. PDISP está en negrita. Los sitios de restricción SacI y StuI mutados están en cajones.
La Figura 97 muestra la secuencia de nucleótidos de los fragmentos 1 (SEQ ID NO: 137), 2 (SEQ ID NO: 138) y 3 (SEQ ID NO: 139) utilizados para sintetizar la secuencia de A/California/4/2009 mediante ligación con base en PCR.
La Figura 98 muestra la secuencia de nucleótidos del casete de expresión número 560 (SEQ ID NO: 146), desde PacI (promotor secuencia arriba) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de PDISP-HAO H1 A/California/4/2009 está subrayada.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a la producción de partículas similares a virus. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción de partículas similares a virus que comprenden antígenos de la influenza.
La siguiente descripción es de una realización preferida.
La presente invención provee un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de un virus en envoltura, por ejemplo, la hemaglutinina de la influenza (HA), unida operativamente a una región reguladora activa en una planta.
Además, la presente invención provee un método para producir partículas similares al virus (VLP) en una planta. El método implica la introducción de un ácido nucleico que codifica un antígeno unido operativamente a una región reguladora activa en la planta, dentro de la planta, o porción de la planta, y la incubación de la planta o una porción de la planta bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.
Las VLP pueden ser producidas a partir virus de la influenza, sin embargo, las VLP también pueden ser producidas a partir de otro virus derivado de membrana plasmática incluyendo, pero sin limitarse a sarampión, Ébola, Marburgo, y VIH.
La invención incluye las VLP de todos los tipos de virus de la influenza que pueden infectar a los humanos, incluyendo por ejemplo, pero sin limitarse al subtipo A muy prevalente (H1N1) (por ejemplo, A/New Caledonia/20/99 (H1N1)), el subtipo A/Indonesia/5/05 (H5N1) (SEQ ID NO: 60) y el tipo B menos común (por ejemplo, la SEQ ID NO: 26, Figura 10O) y el tipo C (SEQ ID NO: 27, Figura 10P), y con las HA obtenidas a partir de otros subtipos de influenza. Las VLP de otros subtipos de influenza se incluyen también en la presente invención, por ejemplo, A/Brisbane/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO: 48), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO: 49) , A/Singapur/1/57 (H2N2; SEQ ID NO: 54), A/Anhui/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO: 55), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1; SEQ ID NO: 56), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1; SEQ ID NO: 57), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2; SEQ ID NO: 59), A/Brisbane/10/2007 (H3N2; SEQ ID NO: 50), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2; SEQ ID NO: 51), A/Equino/Praga/56 (H7N7; SEQ ID NO: 58), B/Malasia/2506/2004 (SEC ID NO: 52), B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 53) o A/California/04/09 (H1N1) (SEQ ID NO: 127).
La presente invención también se refiere a virus de la influenza que infectan a otros mamíferos o animales hospedantes, por ejemplo seres humanos, primates, caballos, cerdos, aves, aves acuáticas, aves migratorias, codornices, patos, ocas, aves de corral, pollo, camello, cánidos, perros, felinos, gatos, tigre, leopardo, algalia, visón, garduña, hurones, animales domésticos, animales de granja, ratones, las ratas, foca, ballena y similares.
Los ejemplos no limitantes de otros antígenos que pueden ser expresados en virus derivados de la membrana plasmática incluyen, la proteína de la cápside del VIH -p24; gp120, gp41 -proteínas de la envoltura, las proteínas estructurales VP30 y VP35; Gp/SGP (una proteína integral de membrana glicosilada) de filovirus, por ejemplo Ébola
o Marburgo, o la proteína H, y la proteína F de paramixovirus, por ejemplo, sarampión.
La invención también incluye, pero no se limita a, las VLP derivadas de la influenza que obtienen una envoltura lipídica de la membrana plasmática de la célula en la que las proteínas de las VLP se expresan. Por ejemplo, si la VLP se expresa en un sistema basado en una planta, la VLP puede obtener una envoltura lipídica de la membrana plasmática de la célula.
Generalmente, el término "lípido" se refiere a moléculas de origen natural, solubles en grasa (lipofílicas). El término también se utiliza más específicamente para referirse a ácidos grasos y sus derivados (incluidos los tri, di y monoglicéridos y fosfolípidos), así como otros metabolitos que contienen esterol solubles en grasa o esteroles. Los fosfolípidos son un componente importante de todas las membranas biológicas, junto con glicolípidos, esteroles y proteínas. Los ejemplos de fosfolípidos incluyen fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y similares. Los ejemplos de esteroles incluyen zoosteroles (por ejemplo, colesterol) y fitoesteroles (por ejemplo, sitosterol) y esteril-glucósido. Se han identificado más de 200 fitoesteroles en varias especies de plantas, siendo los más comunes campesterol, estigmasterol, ergosterol, brasicasterol, delta-7estigmasterol, delta-7-avenasterol, daunosterol, sitosterol, 24-metilcolesterol, colesterol o beta-sitosterol. Como un experto en la técnica entenderá, la composición lipídica de la membrana plasmática de una célula puede variar con las condiciones de cultivo o de crecimiento de la célula u organismo del que se obtiene la célula.
Las membranas celulares comprenden generalmente bicapas lipídicas, así como proteínas para varias funciones. Se pueden encontrar concentraciones localizadas de lípidos particulares en la bicapa lipídica, denominados ‘balsas lipídicas’. Sin desear estar limitado por la teoría, las balsas lipídicas pueden tener funciones importantes en endo y exocitosis, la entrada o salida de virus u otros agentes infecciosos, la transducción de señales entre células, la interacción con otros componentes estructurales de la célula u organismo, tales como matrices intracelular y extracelulares.
Con referencia al virus de la influenza, el término "hemaglutinina" o "HA", como se usa aquí, se refiere a una glicoproteína que se encuentra en el exterior de las partículas virales de influenza. HA es una glicoproteína tipo I de membrana homotrimérica, que generalmente comprende un péptido señal, un dominio HA1, y un dominio HA2 que comprende un sitio de anclaje que abarca la membrana en el terminal C y una pequeña cola citoplasmática (Figura 1B). Las secuencias de nucleótidos que codifican HA son bien conocidas y están disponibles -véase, por ejemplo, la base BioDefence Public Health (virus de la influenza; véase URL: biohealthbase.org) o en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (véase URL: ncbi.nlm.nih.gov), ambas se incorporan aquí como referencia.
El término "homotrímero" u "homotrimérico" indica que un oligómero está formado por tres moléculas de proteína HA. Sin desear estar limitado por la teoría, la proteína HA se sintetiza como proteína precursora monomérica (HA0)
de aproximadamente 75 kDa, que se ensambla en la superficie en una proteína trimérica alargada. Antes de que ocurra la trimerización, la proteína precursora se escinde en un sitio de escisión conservado de activación (también denominado como péptido de fusión) en 2 cadenas de polipéptidos, HA1 y HA2 (que comprende la región transmembrana), unidas por un enlace disulfuro. El segmento de HA1 puede ser de 328 aminoácidos de longitud, y el segmento de HA2 puede ser de 221 aminoácidos de longitud. Aunque esta escisión puede ser importante para la infectividad del virus, puede que no sea esencial para la trimerización de la proteína. La inserción de HA dentro de la membrana del retículo endoplasmático (ER) de la célula huésped, la escisión del péptido señal y la glicosilación de proteínas son eventos cotraduccionales. El replegamiento correcto de HA requiere la glicosilación de la proteína y la formación de 6 enlaces disulfuro dentro de la cadena. El trímero de HA se ensambla en el complejo cis y trans-Golgi, en donde el dominio transmembrana juega un papel en el proceso de trimerización. Las estructuras cristalinas de las proteínas HA tratadas con bromelina, que carecen del dominio transmembrana, han mostrado una estructura altamente conservada entre las cepas de influenza. También se ha establecido que HA sufre grandes cambios conformacionales durante el proceso de infección, que requiere que el HA0 precursor se escinda en el 2 cadenas de polipéptido HA1 y HA2. La proteína HA puede ser procesada (es decir, comprende los dominios HA1 y HA2), o puede ser no procesada (es decir, comprende el dominio HA0).
La presente invención se refiere al uso de una proteína HA que comprende el dominio transmembrana e incluye los dominios HA1 y HA2, por ejemplo, la proteína HA puede ser HA0, o HA procesada que comprende HA1 y HA2. La proteína HA se puede utilizar en la producción o la formación de las VLP utilizando un sistema de expresión de una planta, o una célula de una planta.
La HA de la presente invención puede ser obtenida de cualquier subtipo. Por ejemplo, la HA puede ser del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o de influenza tipo B. La HA recombinante de la presente invención también puede comprender una secuencia de aminoácidos basada en la secuencia de cualquier hemaglutinina conocida en la técnica -véase, por ejemplo, la base BioDefence Public Health (virus de la influenza; véase URL: biohealthbase.org) o el Centro Nacional de Información Biotecnológica (véase URL: ncbi.nlm.nih.gov). Además, la HA puede basarse en la secuencia de una hemaglutinina que se aísla a partir de uno
o más virus de influenza emergentes o recientemente identificados.
La presente invención también incluye las VLP que comprenden las HA obtenidas de uno o más de un subtipo de la influenza. Por ejemplo, las VLP puede comprender uno o más de una HA del subtipo H1 (codificada por la SEQ ID NO: 28), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 15), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 16), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 11), H8 (codificada por la SEQ ID NO: 17), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 18), H10 (codificada por la SEQ ID NO: 19), H11 (codificada por la SEQ ID NO: 20), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 21), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 27), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 23), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 24), H16 (codificada por la SEQ ID NO: 25), o influenza tipo B (codificada por la SEQ ID NO: 26), o una combinación de las mismas. Una o más de una HA de uno o más de uno de los subtipos de influenza pueden ser coexpresados dentro de una planta o célula de insecto para garantizar que la síntesis de una o más de una HA resulte en la formación de las VLP que comprende una combinación de las HA obtenidas a partir de uno o más de un subtipo de influenza. La selección de la combinación de las HA puede ser determinada por el uso pretendido de la vacuna preparada a partir de la VLP. Por ejemplo una vacuna para uso en la inoculación de aves puede comprender cualquier combinación de subtipos de HA, mientras que las VLP útiles para la inoculación de seres humanos puede comprender subtipos de uno o más de uno de los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2 , N3 y N7. Sin embargo, se pueden preparar otras combinaciones de subtipos de HA dependiendo del uso del inóculo.
Por lo tanto, la presente invención está dirigida a una VLP que comprende uno o más de un subtipo de HA, por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más subtipos de HA.
La presente invención también provee ácidos nucleicos que codifican hemaglutininas que forman las VLP cuando se expresan en plantas.
Los ejemplos de ácidos nucleicos pueden comprender secuencias de nucleótidos de hemaglutinina a partir de cepas seleccionadas de subtipos de influenza. Por ejemplo, un subtipo A (H1N1) tal como A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33), el subtipo A/Indonesia/5/05 (H5N1) (que comprende el constructo # 660; SEQ ID NO: 60) y el tipo B menos común (por ejemplo, SEQ ID NO: 26, Figura 10O), y el tipo C (SEQ ID NO: 27, Figura 10P), y con las HA obtenidas de otros subtipos de influenza. Las VLP de otros subtipos de influenza se incluyen también en la presente invención, por ejemplo, A/Brisbane/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO: 36), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO: 37), A/Singapur/1/57 (H2N2; SEQ ID NO: 42), A/Anhui/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO: 43), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1; SEQ ID NO: 44 ), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1; SEQ ID NO: 45), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2; SEQ ID NO: 47), A/Brisbane/10/2007 (H3N2; SEQ ID NO: 38), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2; SEQ ID NO: 39), A/Equino/Praga/56 (H7N7; SEQ ID NO: 46), B/Malasia/2506/2004 (SEC ID NO: 40), B/Florida/4/2006 (SEQ ID NO: 41) o A/California/04/09 (H1N1) (SEQ ID NO: 127).
El plegamiento correcto de las hemaglutininas puede ser importante para la estabilidad de la proteína, la formación
de multímeros, la formación de las VLP y la función de la HA (capacidad de hemoaglutinación), entre otras características de hemaglutininas de influenza. El plegamiento de una proteína puede estar influido por uno o más factores, incluyendo, pero no limitado a, la secuencia de la proteína, la abundancia relativa de la proteína, el grado de apiñamiento intracelular, la disponibilidad de cofactores que pueden unirse o asociarse transitoriamente con la proteína plegada, parcialmente plegada o no plegada, la presencia de una o más proteínas chaperonas, o similares.
Las proteínas de choque térmico (Hsp) o las proteínas del estrés son ejemplos de proteínas chaperonas, que pueden participar en varios procesos celulares, incluyendo la síntesis de proteínas, el tráfico intracelular, la prevención de un mal plegamiento, la prevención de la agregación de proteínas, el montaje y desmontaje de los complejos de proteínas, plegamiento de proteínas, y desagregación de proteínas. Los ejemplos de tales proteínas chaperonas incluyen, pero no se limitan a, Hsp60, Hsp65, Hsp70, Hsp90, Hsp100, Hsp20-30, Hsp10, Hsp100-200, Hsp100, Hsp90, Lon, TF55, las FKBP, ciclofilinas, ClpP, GrpE, ubiquitina, calnexina, y proteína disulfuro isomerasas. Véase, por ejemplo, Macario, A. J. L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25: 59 -70. 1995; Parsell, D. A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27: 437 -496 (1993); la patente estadounidense No. 5.232.833. En algunos ejemplos, un grupo particular de proteínas chaperonas incluye Hsp40 y Hsp70.
Los ejemplos de Hsp70 incluyen Hsp72 y Hsc73 de células de mamífero, DnaK de bacterias, particularmente micobacterias tales como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis (tales como el bacilo de Calmette-Guerin: denominado en el presente documento como Hsp71). DnaK de Escherichia coli, levadura y otros procariotas, y BIP y Grp78 de eucariotas, tales como A. thaliana (Lin et al. 2001 (Cell Stress and Chaperones
6: 201 -208). Un ejemplo particular de una Hsp70 es Hsp70 de A. thaliana (codificada por la SEQ ID NO: 122, o la SEQ ID NO: 123). Hsp70 es capaz de unirse específicamente a ATP así como a polipéptidos y péptidos no plegados, participando así en el plegamiento y despliegue de proteínas, así como en el montaje y desmontaje de complejos de proteínas.
Los ejemplos de Hsp40 incluyen DnaJ de procariotas tales como E. coli y micobacterias, y HSJ1, HDJ1 y Hsp40 de eucariotas, tales como alfalfa (Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40: 397 -408). Un ejemplo particular de una Hsp40 es MSJ1 de M. sativa (codificada por las SEQ ID NOs: 121, 123 o 114). Hsp40 desempeña un papel como chaperona molecular en el plegado de proteínas, tolerancia térmica y replicación del ADN, entre otras actividades celulares.
Entre las Hsp, Hsp70 y su cochaperona, Hsp40, están involucradas en la estabilización de la traducción y los polipéptidos recientemente sintetizados antes de que la síntesis esté completa. Sin desear estar limitado por la teoría, Hsp40 se une a los parches hidrófobos de polipéptidos no plegados (nacientes o recién transferidos), facilitando así la interacción del complejo Hsp70-ATP con el polipéptido. La hidrólisis de ATP conduce a la formación de un complejo estable entre el polipéptido, Hsp70 y ADP, y la liberación de Hsp40. La asociación del complejo Hsp70-ADP con los parches hidrófobos del polipéptido impide su interacción con otros parches hidrófobos, impidiendo el plegamiento incorrecto y la formación de agregados con otras proteínas (revisado en Hartl, FU. 1996. Nature 381: 571 -579).
De nuevo, sin desear estar ligado por la teoría, a medida que aumenta la producción de proteínas en un sistema de expresión de proteína recombinante, los efectos de aglomeración en la expresión de proteína recombinante pueden dar lugar a la agregación y/o una acumulación reducida de la proteína recombinante resultante de la degradación de un polipéptido mal plegado. Las proteínas chaperonas nativas puede ser capaces de facilitar el plegamiento correcto de bajos niveles de proteína recombinante, pero a medida que los niveles de expresión aumentan, las chaperonas nativas pueden convertirse en un factor limitante. Los altos niveles de expresión de la hemaglutinina en las hojas agroinfiltradas pueden conducir a la acumulación de polipéptidos de hemaglutinina en el citosol, y coexpresión de una o más de una proteínas chaperonas tales como Hsp70, Hsp40 o tanto Hsp70 como Hsp40 puede aumentar la estabilidad en el citosol de las células que expresan los polipéptidos en las células, reduciendo así el nivel de polipéptidos de hemaglutinina mal plegados o agregados, y aumentando el número de polipéptidos que se acumulan como hemaglutinina estable, que exhiben características estructurales terciarias y cuaternarias que permiten la hemaglutinación y/o la formación de partículas similares a virus.
Por lo tanto, la presente invención también provee un método de producción de las VLP de la influenza en una planta, en el que un primer ácido nucleico que codifica una HA de la influenza es coexpresada con un segundo ácido nucleico que codifica una chaperona. Los primero y segundo ácidos nucleicos se pueden introducir a la planta en la misma etapa, o se pueden introducir secuencialmente a la planta. La presente invención también proporciona un método para la producción de las VLP de la influenza en una planta, donde la planta comprende el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico se introduce posteriormente.
La presente invención también proporciona una planta que comprende un ácido nucleico que codifica una o más de una hemaglutinina de la influenza y un ácido nucleico que codifica una o más de una chaperonas.
Se ha propuesto que el procesamiento de una secuencia del péptido señal (SP) del terminal N durante la expresión y/o secreción de hemaglutininas de influenza juega un papel en el proceso de plegamiento. El término "péptido
señal" se refiere generalmente a una secuencia corta (alrededor de 5 -30 aminoácidos) de aminoácidos, que se encuentra generalmente en el terminal N de un polipéptido de hemaglutinina que pueden dirigir la translocación del polipéptido recientemente traducido a un orgánulo particular, o ayudar en el posicionamiento de dominios específicos del polipéptido. El péptido señal de hemaglutininas dirige la translocación de la proteína en el retículo 5 endoplasmático y se han propuesto que ayuda en el posicionamiento del dominio proximal del terminal N con respecto a un dominio de anclaje a la membrana del polipéptido naciente de hemaglutinina para ayudar en la escisión y el plegado de la hemaglutinina madura. La remoción de un péptido señal (por ejemplo, por una peptidasa señal), puede requerir la escisión precisa y la remoción del péptido señal para proveer la hemaglutinina madura esta escisión precisa puede depender de cualquiera de varios factores, incluyendo una porción o la totalidad de los
10 péptidos señal, la secuencia de aminoácidos que flanquea el sitio de escisión, la longitud del péptido señal, o una combinación de éstos, y no se pueden aplicar todos los factores a cualquier secuencia dada.
Un péptido señal puede ser nativo a la hemaglutinina que está siendo expresada, o una hemaglutinina recombinante que comprende un péptido señal de un primer tipo, subtipo o cepa de influenza con el equilibrio de la hemaglutinina de un segundo tipo, subtipo o cepa de influenza. Por ejemplo, el SP nativo de los subtipos de HA: H1, H2, H3, H5,
15 H6, H7, H9 o influenza tipo B puede usarse para expresar la HA en un sistema de una planta.
Un péptido señal también puede ser no nativo, por ejemplo, de una proteína estructural o hemaglutinina de un virus distinto de la influenza, o de un polipéptido de una planta, animal o bacteriano. Un ejemplo de un péptido señal es aquel de la proteína disulfuro isomerasa (PDISP) de la alfalfa (nucleótidos 32-103 del acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17; secuencia de aminoácidos MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE).
20 La presente invención también provee una hemaglutinina de la influenza que comprende un péptido señal nativo, o no nativo, y ácidos nucleicos que codifican tales hemaglutininas.
Las proteínas HA de la influenza presentan una gama de similitudes y diferencias con respecto al peso molecular, punto isoeléctrico, tamaño, complemento de glicano y similares. Las propiedades fisicoquímicas de las diferentes hemaglutininas pueden ser útiles para permitir la diferenciación entre las HA expresadas en un sistema de planta,
25 célula de insecto o de levadura, y puede ser de especial utilidad cuando más de un HA es coexpresada en un solo sistema. Ejemplos de tales propiedades fisicoquímicas se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 1: Propiedades fisicoquímicas de hemaglutininas de la influenza
Clon
Cepas de influenza AA Glicanos Peso molecular (kDA) Punto isoeléctrico
No.
Tipo HA0 HA1 HA2 HA0 HA1 HA2 HA0 HA0 1 HA1 HA1 1 HA2 HA21 HA0 HA1 HA2
774
H1 A/Brisbane/59/2007 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6.4 7.5 5.3
775
H1 A/IslasSalomón/3/2006 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6.1 6.7 5.3
776
H3 A/Brisbane/10/2007 550 329 221 12 11 1 62 80 37 54 25 27 8.5 9.6 5.2
777
H3 A/Wisconsin/67/2005 550 329 221 11 10 1 62 79 37 52 25 27 8.8 9.6 5.3
778
B B/Malasia/2506/2004 570 347 223 12 8 4 62 80 38 50 24 30 8.0 9.7 4.5
779
B B/Florida/4/2006 569 346 223 10 7 3 62 77 38 48 24 29 8.0 9.7 4.5
780
H2 A/Singapur/1/57 547 325 222 6 4 2 62 71 36 42 25 28 6.0 7.5 4.9
781
H5 A/Anhui/1/2005 551 329 222 7 5 2 62 73 37 45 25 28 6.2 8.9 4.7
782
H5 A/Vietnam/1194/2004 552 330 222 7 5 2 63 74 38 45 25 28 6.4 9.1 4.8
783
H6 A/Cerceta/HongKong/W312/97 550 328 222 5 3 62 75 37 45 25 30 5.7 5.9 5.6
784
H7 A/Equino/Praga/56 552 331 221 8 4 2 62 71 37 43 25 28 8.9 9.7 4.9
785
H9 A/HongKong/1073/99 542 320 199 6 7 2 61 75 36 46 23 26 8.4 9.5 5.3
La presente invención también incluye secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11, que codifican HA de H1, H5 o H7, respectivamente. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un complemento de la SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 1. Estas secuencias de nucleótidos que se hibridan con SEQ ID o un complemento de la SEQ ID codifican una proteína hemaglutinina que, cuando se expresa forma una VLP, y la VLP induce la producción de un anticuerpo cuando se administra a un sujeto. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de una planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura de uno o más tipos o subtipos de influenza. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
La presente invención también incluye las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 47. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con la SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un complemento de la SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 , SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO : 47. Estas secuencias de nucleótidos que se hibridan con la SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 , SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47 o un complemento de la SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47 codifican una proteína hemaglutinina que, cuando se expresa forma una VLP, y la VLP induce la producción de un anticuerpo cuando se administra a un sujeto. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de la planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura de uno o más tipos o subtipos de influenza. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
En algunas realizaciones, la presente invención también incluye las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o SEQ ID NO: 47, que codifican HA a partir de los subtipos H1, H2, H3, H5, H7 o H9 de la influenza A, o HA a partir de la influenza tipo
B. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 , SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47. La presente invención también incluye una secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con un complemento de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47. Estas secuencias de nucleótidos que se hibridan con la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47 o un complemento de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47 codifican una proteína hemaglutinina que, cuando se expresa forma una VLP, y la VLP induce la producción de un anticuerpo cuando se administra a un sujeto. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de la planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura de uno o más tipos o subtipos de influenza. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
La hibridación bajo condiciones de hibridación rigurosas es conocida en la técnica (véase, por ejemplo Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds 1995 y suplementos; Maniatis et al., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook y Russell, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición 2001, cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia). Un ejemplo de una de tales condiciones de hibridación rigurosas puede ser de aproximadamente 16 -20 horas de hibridación en 4 X SSC a 65 ºC, seguido de lavado en 0,1 X SSC a 65 ºC durante una hora, o 2 lavados en 0,1 X SSC a 65 ºC cada uno durante 20 o 30 minutos. Alternativamente, un ejemplo de una condición de hibridación rigurosa podría ser durante la noche (16 -20 horas) en 50% de formamida, 4 x SSC a 42 ºC, seguido de lavado en 0,1 X SSC a 65 ºC durante una hora, o 2 lavados en 0,1 X SSC a 65 ºC cada uno durante 20 o 30 minutos, o durante la noche (16 -20 horas), o hibridación en un amortiguador de fosfato acuoso de Church (7% de SDS; amortiguador deNaPO4 0,5 M de pH 7,2; EDTA 10 mM) a 65 ºC, con 2 lavados, ya sea a 50 ºC en 0,1 X SSC, 0,1% de SDS durante 20 o 30 minutos cada uno, o 2 lavados a 65 ºC en 2 X SSC, 0,1% de SDS durante 20 o 30 minutos cada uno.
Adicionalmente, la presente invención incluye secuencias de nucleótidos que se caracterizan por tener aproximadamente 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o cualquier cantidad intermedia, de identidad de secuencia o similitud de secuencia, con la secuencia de nucleótidos que codifica HA a partir de H1 (SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 127), H5 (SEQ ID NO: 3) o H7 (SEQ ID NO: 11), en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de la planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que sea capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
Adicionalmente, la presente invención incluye secuencias de nucleótidos que se caracterizan por tener aproximadamente 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o cualquier cantidad intermedia, de identidad de secuencia o similitud de secuencia, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 , SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de la planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
Adicionalmente, la presente invención incluye secuencias de nucleótidos que se caracterizan por tener aproximadamente 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% o cualquier cantidad intermedia, de identidad de secuencia o similitud de secuencia, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 127 o la SEQ ID NO: 47, en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de la planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
Del mismo modo, la presente invención incluye tiene las HA asociadas con los siguientes subtipos de H1 (codificada por la SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 127), H2 (codificada por la SEQ ID NO: 12), H3 (codificada por la SEQ ID NO: 13), H4 (codificada por la SEQ ID NO: 14), H5 (codificada por la SEQ ID NO: 15), H6 (codificada por la SEQ ID NO: 16), H7 (codificada por la SEQ ID NO: 11), H8 (codificada por la SEQ ID NO: 17), H9 (codificada por la SEQ ID NO: 18), H10 (codificado por la SEQ ID NO: 19), H11 (codificada por la SEQ ID NO: 20), H12 (codificada por la SEQ ID NO: 21), H13 (codificada por la SEQ ID NO: 27), H14 (codificada por la SEQ ID NO: 23), H15 (codificada por la SEQ ID NO: 24), H16 (codificada por la SEQ ID NO: 25), o influenza tipo B (codificada por la SEQ ID NO: 26); véanse las Figuras 10A a 10O), y las secuencias de nucleótidos que se caracterizan por tener aproximadamente de 70 a 100%
o cualquier cantidad intermedia, de 80 a 100% o cualquier cantidad intermedia, 90 -100% o cualquier cantidad intermedia, o 95 -100% o cualquier cantidad intermedia, de identidad de secuencia con H1 (SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 127), H2 (SEQ ID NO: 12), H3 (SEC ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 11), H8 (SEQ ID NO: 17), H9 (SEQ ID NO: 18), H10 (SEQ ID NO: 19), H11 (SEQ ID NO: 20), H12 (SEQ ID NO: 21), H13 (SEQ ID NO: 27), H14 (SEQ ID NO: 23), H15 (SEQ ID NO: 24), H16 (SEQ ID NO: 25), en donde la secuencia de nucleótidos codifica una proteína hemaglutinina que cuando se expresa forma una VLP, y que la VLP induce la producción de un anticuerpo. Por ejemplo, la expresión de la secuencia de nucleótidos dentro de una célula de la planta forma una VLP, y la VLP puede ser utilizada para producir un anticuerpo que es capaz de unirse a HA, incluyendo HA, HA0, HA1 o HA2 madura. La VLP, cuando se administra a un sujeto, induce una respuesta inmune.
Una "respuesta inmune" se refiere generalmente a una respuesta del sistema inmune adaptativo. El sistema inmune adaptativo comprende generalmente una respuesta humoral, y una respuesta mediada por células. La respuesta humoral es el aspecto de la inmunidad que está mediada por anticuerpos secretados, producidos en las células del linaje de linfocitos B (células B). Los anticuerpos secretados se unen a antígenos en la superficie de los microbios invasores (tales como virus o bacterias), que los marca para su destrucción. La inmunidad humoral se utiliza generalmente para referirse a la producción de anticuerpos y los procesos que lo acompañan, así como las funciones efectoras de anticuerpos, incluyendo la activación de células Th2 y la producción de citoquinas, la generación de células de memoria, la promoción de opsonina de la fagocitosis, la eliminación de patógenos y similares. Los términos "modular" o "modulación" o similares se refieren a un aumento o disminución en una respuesta o parámetro particular, tal como se determina por cualquiera de varios ensayos generalmente conocidos o usados, algunos de los cuales se ejemplifican en este documento.
Una respuesta mediada por células es una respuesta inmunitaria que no implica anticuerpos sino que implica la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno, y la liberación de varias citoquinas en respuesta a un antígeno. La inmunidad mediada por células se utiliza generalmente para referirse a alguna activación de células Th, activación de células Tc y respuestas mediadas por células T. La inmunidad mediada por células es de particular importancia en la respuesta a las infecciones virales.
Por ejemplo, la inducción de linfocitos T CD8 positivos específicos del antígeno se puede medir usando un ensayo ELISPOT; la estimulación de linfocitos T CD4 positivos se puede medir usando un ensayo de proliferación. Los títulos de anticuerpos anti-influenza se pueden cuantificar usando un ensayo ELISA; también se pueden medir isotipos de anticuerpos específicos de antígeno o de reactividad cruzada usando anticuerpos anti-isotipo (por ejemplo, anti-IgG, IgA, IgE o IgM). Los métodos y técnicas para realizar tales ensayos son bien conocidos en la técnica.
También se puede utilizar un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI, o HAI) para demostrar la eficacia de los anticuerpos inducidos por una vacuna, o una composición de vacuna puede inhibir la aglutinación de glóbulos rojos (RBC) por HA recombinante. Los títulos de anticuerpos inhibitorios de hemaglutinación de las muestras de suero pueden ser evaluados por HAI a través de microtitulación (Aymard et al. 1973). Se pueden utilizar eritrocitos de cualquiera de varias especies -por ejemplo, caballo, pavo, pollo o similar. Este ensayo brinda información indirecta sobre el montaje del trímero de HA en la superficie de la VLP, lo que confirma la presentación adecuada de los sitios antigénicos sobre las HA.
Los títulos de HAI de reactividad cruzada también se puede utilizar para demostrar la eficacia de una respuesta inmune a otras cepas de virus relacionadas con el subtipo de vacuna. Por ejemplo, el suero de un sujeto inmunizado con una composición de vacuna de una primera cepa (por ejemplo, las VLP de A/Indonesia/5/05) se puede utilizar en un ensayo de HAI con una segunda cepa de partículas virales o virus completos (por ejemplo, A/Vietnam/1194/2004), y el título de HAI determinado.
La presencia o los niveles de citoquina también pueden ser cuantificados. Por ejemplo, una respuesta de células auxiliares T (Th1/Th2) se caracteriza por la medición de células secretoras de IFN-γ e IL-4 utilizando ELISA (por ejemplo, los kits OptEIA de BD Biosciences). Se pueden cultivar células mononucleares de sangre periférica (PBMC)
o esplenocitos obtenidos de un sujeto, y se analiza el sobrenadante. Los linfocitos T también pueden ser cuantificados mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), usando etiquetas fluorescentes específicas del marcador y métodos como los conocidos en la técnica.
También puede llevarse a cabo un ensayo de microneutralización para caracterizar una respuesta inmune en un sujeto, véase, por ejemplo los métodos de Rowe et al., 1973. Los títulos de neutralización de virus se pueden obtener de varias maneras, incluyendo: 1) la enumeración de las placas de lisis (ensayo de placa) después de la fijación / coloración con cristal violeta de las células; 2) la observación microscópica de la lisis celular en cultivo; 3) detección por ELISA y espectrofotométrica de proteína del virus NP (correlación con la infección por el virus de las células huésped)
La identidad de secuencia o la similitud de secuencias se pueden determinar mediante un programa de comparación de secuencias de nucleótidos, tal como aquel suministrado en DNASIS (por ejemplo, usando, pero sin limitarse a, los siguientes parámetros: penalización de 5 por GAP, # de diagonales superiores 5, penalización de 10 por GAP fijo, ktupla 2, brecha flotante 10, y tamaño de la ventana 5). Sin embargo, se conocen bien en la técnica otros métodos de alineación de secuencias para comparación, por ejemplo, los algoritmos de Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2: 482), Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 2444), y mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y BLAST), o mediante alineación manual e inspección visual.
El término "dominio de hemaglutinina" se refiere a un péptido que comprende ya sea el dominio de HA0, o los dominios de HA1 y HA2 (alternativamente denominados fragmentos HA1 y HA2). HA0 es un precursor de los fragmentos HA1 y HA2. El monómero HA generalmente puede subdividirse en 2 dominios funcionales -el dominio
del vástago y la cabeza globular, o de dominio de cabeza. El dominio del vástago está involucrado en la infectividad y patogenicidad del virus a través del cambio conformacional que puede experimentar cuando se expone a pH ácido. El dominio del vástago puede subdividirse a la vez en 4 subdominios o fragmentos -el subdominio de fusión o péptido (un tramo hidrófobo de aminoácidos que participan en la fusión con la membrana del huésped en el estado conformacional de pH ácido); el subdominio del vástago (puede acomodar las dos o más conformaciones), el dominio transmembrana o subdominio (TmD) (implicado en la afinidad de la HA para balsas de lípidos), y la cola citoplasmática (subdominio de la cola citoplasmática) ( Ccola) (involucrada en la secreción de HA). La cabeza globular se divide en 2 subdominios, el subdominio RB y el dominio de esterasa vestigial (E). El subdominio E puede estar parcial o totalmente enterrado y no expuesto a la superficie de la cabeza globular, por lo tanto, algunos anticuerpos surgidos contra HA se unen al subdominio RB.
El término "partícula similar a un virus" (VLP), o "partículas semejantes a virus" o "VLP" se refiere a las estructuras que se autoensamblan y comprenden proteínas estructurales tales como la proteína HA de la influenza. Las VLP son generalmente morfológica y antigénicamente similares a viriones producidos en una infección, pero carecen de la información genética suficiente para replicarse y por lo tanto no son infecciosas. En algunos ejemplos, las VLP puede comprender una única especie de proteína, o más de una especie de proteína. Para las VLP que comprenden más de una especie de proteína, la especie de proteína puede ser de la misma especie de virus, o puede comprender una proteína de un especie diferente, género, subfamilia o familia de virus (según lo señalado por la nomenclatura ICTV). En otros ejemplos, uno o más de las especies de proteína que comprenden una VLP pueden ser modificadas a partir de la secuencia de origen natural. Las VLP pueden ser producidas en células huésped adecuadas, incluyendo células huésped de insecto y de planta. Después de la extracción de la célula huésped y después del aislamiento y purificación adicional en condiciones adecuadas, las VLP se puede purificar como estructuras intactas.
Las VLP producidas a partir de proteínas derivadas de la influenza, de acuerdo con la presente invención no comprenden la proteína M1. Se sabe que la proteína M1 se une a ARN (Wakefield y Brownlee, 1989), que es un contaminante de la preparación de la VLP. La presencia de ARN no es deseada en la obtención de la aprobación reglamentaria para el producto de la VLP, por lo tanto, una preparación de VLP que carece de ARN puede ser ventajosa.
Las VLP de la presente invención se pueden producir en una célula huésped que se caracteriza por que carece de la capacidad de sializar proteínas, por ejemplo una célula vegetal, una célula de insecto, hongo y otros organismos, incluyendo la esponjas, celentéreo, anélida, artrópoda, moluscos, nematelmintos, troquelmintos, platelmintos, quetognatos, tentaculados, clamidia, espiroquetas, bacterias Gram positivas, cianobacterias, arqueobacterias, o similares. Véase, por ejemplo Glycoforum (URL: glycoforum.gr.jp/science/word/evolution/ES-A03E.html), o Gupta et al, 1999. Nucleic Acids Research 27: 370 -372; o Toukach et al., 2007. Nucleic Acids Research 35: D280 -D286; o URL: glycostructures.jp (Nakahara et al., 2008. Nucleic Acids Research 36: D368 -D371; publicado en línea el 11 de octubre de 2007 doi: 10.1093/NAR/gkm833). Las VLP producidas como se describe en el presente documento por lo general no comprenden neuraminidasa (NA). Sin embargo, la NA puede ser coexpresada con HA siendo deseable que las VLP comprendan HA y NA.
Una VLP producida en una planta de acuerdo con algunos aspectos de la invención puede formar un complejo con lípidos derivados de la planta. La VLP puede comprender un péptido HA0, HA1 o HA2. Los lípidos derivados de plantas pueden estar en la forma de una bicapa lipídica, y pueden comprender además una envoltura que rodea la VLP. Los lípidos derivados de plantas pueden comprender componentes lipídicos de la membrana plasmática de la planta donde la VLP es producida, incluyendo, pero sin limitarse a, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), glicoesfingolípidos, fitoesteroles o una combinación de los mismos. Un lípido de origen vegetal puede alternativamente ser denominado como un "lípido de la planta. Se conocen ejemplos de fitoesteroles en la técnica, e incluyen, por ejemplo, estigmasterol, sitosterol, 24-metilcolesterol y el colesterol -véase, por ejemplo, Mongrand et al., 2004.
Las VLP pueden ser evaluadas por la estructura y tamaño, por ejemplo, ensayo de hemaglutinación, microscopía electrónica, o por cromatografía de exclusión por tamaño.
Para la cromatografía de exclusión por tamaño, se pueden extraer las proteínas solubles totales del tejido de la planta por homogeneización (Polytron) de la muestra de material vegetal triturado congelado en amortiguador de extracción, y se remueve el material insoluble por centrifugación. La precipitación con PEG también puede ser beneficiosa. La proteína soluble se cuantifica, y se pasa el extracto a través de una columna SephacrylMR. Se puede utilizar Azul Dextrano 2000 como estándar de calibración. Después de la cromatografía, se pueden analizar las fracciones adicionalmente por inmunotransferencia para determinar el complemento de proteína de la fracción.
Sin desear estar limitado por la teoría, la capacidad de HA para unirse a RBC de diferentes animales es impulsada por la afinidad de HA por ácidos siálicos α2,3 o α2,3 y la presencia de estos ácidos siálicos en la superficie de RBC. Las HA equina y aviar de virus de influenza aglutinan eritrocitos de todas las diferentes especies, incluyendo pavos, pollos, patos, conejillos de indias, seres humanos, ovejas, caballos y vacas; mientras que las HA humanas se unirán
a los eritrocitos de pavo, pollos, patos, conejillos de indias, humanos y ovejas (véase también Ito T. et al., 1997, Virology, vol 227, p 493 -499 y Medeiros R et al., 2001, Virology, vol 289 p.74 -85). En las Tablas 2A y 2B se muestran ejemplos de la reactividad de las especies las HA de diferentes cepas de la influenza.
Tabla 2A: Especies de RBC enlazadas por las HA de cepas seleccionadas de la gripe estacional.
Estacional
Cepa No Origen Caballo Pavo
H1
A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 774 Humano + ++
A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1)
775 Humano + ++
H3
A/Brisbane/10/2007 (H3N2) 776 Humano + ++
A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)
777 Humano + ++
B
B/Malaysia/2506/2004 778 Humano + ++
B/Florida/4/2006
779 Humano + ++
Tabla 2B: Especies de RBC enlazadas por las HA de cepas seleccionadas de la gripe pandémica.
Pandemia
Cepa No Origen Caballo Pavo
H2
A/Singapur/1/57 (H2N2) 780 Humano + ++
H5
A/Anhui/1/2005 (H5N1) 781 Hu-Av ++ +
A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)
782 Hu-Av ++ +
H6
A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) 783 Aviar ++ +
H7
A/Equino/Praga/56 (H7N7) 784 Equino ++ ++
H9
A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) 785 Humano ++ +
Un fragmento o porción de una proteína, polipéptido o proteína de fusión incluye un péptido o polipéptido que comprende un subconjunto del complemento de aminoácidos de una proteína o polipéptido particular, siempre que el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. El fragmento puede, por ejemplo, comprender una región antigénica, una región que induce una respuesta al estrés, o una región que comprende un dominio funcional de la proteína o polipéptido. El fragmento también puede comprender una región o dominio común para las proteínas de la misma familia general, o el fragmento puede incluir suficiente secuencia de aminoácidos para identificar específicamente la proteína de longitud completa de la que se deriva.
Por ejemplo, un fragmento o porción pueden comprender aproximadamente desde 60% hasta aproximadamente 100%, de la longitud de la longitud completa de la proteína, o cualquier cantidad intermedia, siempre y cuando el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. Por ejemplo, aproximadamente desde 60% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 70% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 80% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 90% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente desde 95% hasta aproximadamente 100%, de la longitud de la longitud completa de la proteína, o cualquier cantidad intermedia. Alternativamente, un fragmento o porción puede ser de aproximadamente 150 a aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad intermedia, dependiendo de la HA, y siempre que el fragmento puede formar una VLP cuando se expresa. Por ejemplo, un fragmento puede ser de 150 hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad intermedia, de aproximadamente 200 hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad intermedia, de aproximadamente 250 hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad intermedia, de aproximadamente 300 hasta aproximadamente 500 o cualquier cantidad intermedia, de aproximadamente 350 hasta aproximadamente 500 aminoácidos, o cualquier cantidad intermedia, de aproximadamente 400 hasta aproximadamente 500 o cualquier cantidad intermedia, de aproximadamente 450 hasta aproximadamente 500 o cualquier cantidad intermedia, dependiendo de la HA, y siempre que el fragmento pueda formar una VLP cuando se expresa. Por ejemplo, pueden removerse aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos, o cualquier cantidad intermedia de la terminal C, el
terminal N o tanto el terminal N como el C de una proteína HA, siempre que el fragmento puede formar una VLP cuando se expresa.
La numeración de los aminoácidos en cualquier secuencia dada son relativos a la secuencia particular, sin embargo un experto puede determinar fácilmente la 'equivalencia' de un aminoácido particular en una secuencia basada en la estructura y/o la secuencia. Por ejemplo, si se removieron 6 aminoácidos del terminal N en la construcción de un clon para cristalografía, esto cambiaría la identidad numérica específica del aminoácido (por ejemplo, respecto a la longitud completa de la proteína), pero no modificaría la posición relativa del aminoácido en la estructura.
Las comparaciones de una secuencia o secuencias pueden realizarse usando un algoritmo de BLAST (Altschul et al., 1990. J. Mol Biol. 215: 403 -410). Una búsqueda por BLAST permite la comparación de una secuencia de consulta con una secuencia específica o grupo de secuencias, o con una biblioteca o base de datos mayor (por ejemplo, GenBank o GenPept) de secuencias, e identificar no sólo las secuencias que muestran 100% de identidad, sino también aquellos con menor grado de identidad. Se pueden comparar secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos utilizando un algoritmo de BLAST. Además, la identidad entre dos o más secuencias puede determinarse alineando las secuencias juntas y determinando el % de identidad entre las secuencias. La alineación puede llevarse a cabo utilizando el algoritmo BLAST (por ejemplo como se encuentra disponible a través del GenBank; URL: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/ usando parámetros predeterminados: Programa: blastn; Base de datos: nr; Esperar: 10; filtro: predeterminado; Alineación: por parejas; códigos genéticos de consulta: Estándares (1)), o BLAST2 a través de EMBL URL: emb1-heidelberg.de/Services/index.html utilizando parámetros predeterminados: Matriz BLOSUM62; Filtro: predeterminado, filtro de eco: encendido, Esperar: 10, corte: predeterminado; Hebra: ambas; Descripciones: 50, Alineaciones: 50; o FASTA, utilizando los parámetros predeterminados), o mediante la comparación manual de las secuencias y calcular el % de identidad.
La presente invención describe, pero no se limita a, la clonación de un ácido nucleico que codifica HA en un vector de expresión de la planta, y la producción de las VLP de la influenza de la planta, adecuado para la producción de vacunas. Los ejemplos de tales ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, una influenza A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) virus HA (por ejemplo, SEQ ID NO: 61), una HA de A/California/04/09 (SEQ ID NO: 127), una HA de A/Indonesia/5/05 subtipo (H5N1) (por ejemplo, SEQ ID NO: 60), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 36, 48, 62), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 37, 49, 63), A/Singapur/1/57 (H2N2) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 42, 54, 64), A/Anhui/1/2005 (H5N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 43, 55, 65), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 44, 56, 66), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 45, 57, 67), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 47, 59, 68), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 38, 50, 69), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 39, 51, 70), A/Equino/Praga/56 (H7N7) (por ejemplo, la SEQ ID NO: 46, 58, 71), B/Malasia/2506/2004 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 40, 52, 72), B/Florida/4/2006 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 41, 53, 73). Los números correspondientes del clon o del constructo para estas cepas se proporcionan en la Tabla 1. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes a las SEQ ID NOs: 36 -47 comprenden una plastocianina secuencia arriba y unida operativamente a la secuencia de codificación de la HA para cada uno de los tipos o subtipos, como se ilustra en las Figuras 28 -39. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes a las SEQ ID NOs: 60 -73 comprenden un casete de expresión de HA que comprende un promotor de plastocianina de alfalfa y 5 'UTR, la secuencia de codificación de hemaglutinina HA, plastocianina 3' UTR de alfalfa y secuencias de terminación, como se ilustra en las Figuras 51 -64.
Las VLP también se pueden utilizar para producir reactivos compuestos de proteínas estructurales recombinantes de influenza que se autoensamblan en estructuras proteicas macromoleculares homotípicas inmunogénicas y funcionales, incluyendo partículas subvirales de influenza y VLP de influenza, en células huésped transformadas, por ejemplo, células vegetales o células de insectos.
Por lo tanto, la invención provee VLP, y un método para la producción de las VLP virales en un sistema de expresión vegetal, a partir de la expresión de una sola proteína de la envoltura. Las VLP pueden ser VLP de influenza, o las VLP producidas a partir de otros virus derivados de la membrana plasmática incluyendo, pero sin limitarse a, sarampión, Ébola, Marburgo y VIH.
También se pueden utilizar las proteínas de otros virus con envoltura, por ejemplo, pero sin limitarse a Filoviridae (por ejemplo, virus del Ébola, el virus de Marburgo, o similares), Paramyxoviridae (por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio, neumovirus, o similares), Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana 1, virus de inmunodeficiencia humana 2, virus 1 de leucemia de células T humanas, o similares), Flaviviridae (por ejemplo, encefalitis del Nilo Occidental, virus del Dengue, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, o similares), Bunyaviridae (por ejemplo, Hantavirus o similares), Coronaviridae (por ejemplo coronavirus, SARS, o similares), como es conocido por los expertos en la técnica. Ejemplos no limitantes de antígenos que pueden expresarse en virus derivados de la membrana plasmática incluyen, la proteína de la cápside del VIH -p24; glicoproteínas gp120 o gp41 del VIH, proteínas de Filovirus incluyendo VP30 o VP35 del virus del Ébola o Gp/SGP del virus de Marburgo o la proteína H o la proteína F del paramixovirus del sarampión. Por ejemplo, P24 del VIH (por ejemplo, GenBank referencia gi: 19172948) es la proteína obtenida por la traducción y escisión de
la secuencia de gag del genoma del virus del VIH (por ejemplo, GenBank referencia gi: 9629357); gp 120 y gp41 del VIH son glicoproteínas obtenidas por la traducción y escisión de la proteína gp160 (por ejemplo, GenBank referencia gi: 9629363), codificada por env del genoma del virus VIH. VP30 del virus del Ébola (GenPept Referencia gi: 55770813) es la proteína obtenida por la traducción de la secuencia vp30 del genoma del virus del Ébola (por ejemplo, GenBank referencia gi: 55770807); VP35 del virus del Ébola (GenPept Referencia gi: 55770809) es la proteína obtenida por la traducción de la secuencia vp35 del genoma del virus del Ébola. GP/SGP del virus de Marburgo (GenPept referencia gi: 296965) es la proteína obtenida por la traducción de la (secuencia) del genoma del virus de Marburgo (GenBank referencia gi: 158539108). La proteína H (GenPept referencia gi: 9626951) es la proteína de la secuencia H del genoma del virus del sarampión (GenBank referencia gi: 9626945); la proteína F (GenPept referencia gi: 9626950) es la proteína de la secuencia F del genoma del virus del sarampión.
Sin embargo, se pueden utilizar otras proteínas de la envoltura dentro de los métodos de la presente invención, tal como lo sabe un experto en la técnica.
La invención, por lo tanto, proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica p24 del VIH, gp120 del VIH, gp41 del VIH, VP30 del virus del Ébola, VP35 del virus del Ébola, Gp/SGP del virus de Marburgo, la proteína H o la proteína F del virus del sarampión. La molécula de ácido nucleico puede estar ligada operativamente a una región reguladora activa en una célula de insecto, levadura o planta, o en un tejido de una planta particular.
La presente invención proporciona, además, la clonación de un ácido nucleico que codifica una HA, por ejemplo, pero sin limitarse a, HA del virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1) o una HA de la cepa de influenza A/California/04/09 en un vector de expresión de planta o de insecto (por ejemplo, vectores de expresión de baculovirus) y la producción de candidatos de vacunas de la influenza o reactivos compuestos de proteínas estructurales recombinantes de influenza que se autoensamblan en estructuras de proteínas macromoleculares homotípicas funcionales e inmunogénicas, incluyendo partículas subvirales de influenza y VLP de la influenza, en células transformadas de plantas o células transformadas de insectos.
El ácido nucleico que codifica la HA de los subtipos de la influenza, por ejemplo, pero sin limitarse a, A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/California/04/09 (H1N1) A/Indonesia/5/05 el subtipo (H5N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006 se pueden expresar, por ejemplo, utilizando un sistema de expresión de baculovirus en una línea celular apropiada , por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (por ejemplo, línea celular Sf-9; ATCC PTA-4047). También se pueden utilizar otras líneas de células de insectos.
El ácido nucleico que codifica la HA puede, alternativamente, ser expresado en una célula de una planta, o en una planta. El ácido nucleico que codifica HA se puede sintetizar por transcripción inversa y reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando ARN de HA. Como ejemplo, el ARN puede ser aislado del virus de influenza humana A/New Caledonia/20/99 (H1N1) o del virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1), o de otros virus de la influenza por ejemplo, A/California/04/09 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, o de células infectadas con un virus de influenza. Para la transcripción inversa y PCR, pueden usarse cebadores de oligonucleótidos específicos para ARN de HA, por ejemplo, pero sin limitarse a, secuencias de HA del virus de influenza humana A/New Caledonia//20/99 (H1N1) o las secuencias de HA0 del virus de influenza humana A/Indonesia/5/05 (H5N1), o las secuencias de HA de los subtipos de influenza A/California/04/09 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/ Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006. Además, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico que codifica HA usando métodos como aquellos conocidos por un experto en la técnica.
Las copias de ADNc resultantes de estos genes pueden clonarse en un vector de expresión adecuado según lo requerido por el sistema de expresión del huésped. A continuación se describen ejemplos de vectores de expresión apropiados para las plantas, alternativamente, un vector de expresión de baculovirus, por ejemplo, pFastBacl (Invitrogen), resultando en plásmidos basados en pFastBacl, usando métodos conocidos, y se puede utilizar la información proporcionada por las instrucciones del fabricante.
La presente invención está dirigida además a una construcción génica que comprende un ácido nucleico que codifica HA, como se describió anteriormente, unido operativamente a un elemento regulador que es operativo en una planta. Los ejemplos de elementos reguladores operativos en una célula vegetal y que pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a una región reguladora de plastocianina (patente estadounidense No. 7.125.978; que se incorpora aquí como referencia), o una región reguladora de la ribulosa 1,5
bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO; patente estadounidense No. 4.962.028; que se incorpora aquí como referencia), proteína de enlazamiento de clorofila a/b (CAB; Leutwiler et al; 1986; que se incorpora aquí como referencia), ST-LS1 (asociada con el complejo que emite oxígeno del fotosistema II y descrito por Stockhaus et al. 1987, 1989; que se incorpora aquí como referencia). Un ejemplo de una región reguladora de plastocianina es una secuencia que comprende los nucleótidos 10 -85 de la SEQ ID NO: 36, o una región similar de cualquiera de las SEQ ID NOS: 37 -47. Un elemento regulador o región reguladora puede mejorar la traducción de una secuencia de nucleótidos a la que está ligada operativamente -la secuencia de nucleótidos puede codificar una proteína o polipéptido. Otro ejemplo de una región reguladora es aquella derivada de las regiones no traducidas del virus del mosaico del caupí (CPMV), que puede ser utilizada preferentemente para traducir la secuencia de nucleótidos a la que está unida operativamente. Esta región reguladora del CPMV comprende un sistema CMPV-HT -véase, por ejemplo, Sainsbury et al., 2008, Plant Physiology 148: 1212 -1218.
Si la construcción se expresa en una célula de insecto, los ejemplos de elementos reguladores operativos en una célula de insecto incluyen, pero no se limitan al promotor de la polihedrina (Possee y Howard 1987. Nucleic Acids Research 15: 10.233 -10.248), el promotor gp64 (Kogan et al., 1995. J Virology 69: 1452 -1461) y similares.
Por lo tanto, un aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una región reguladora y una secuencia que codifica una HA de la influenza. La región reguladora puede ser un elemento regulador de plastocianina, y la HA de la influenza se puede seleccionar de un grupo de cepas de la influenza o subtipos, que comprende A/California/04/09 (H1N1), A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/05 subtipo (H5N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), A/Equino/Praga/56 (H7N7), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006. Las secuencias de ácido nucleico que comprende un elemento regulador de plastocianina y una HA de la influenza se ejemplifican en este documento por las SEQ ID NOs: 36 -47.
Se sabe que puede haber diferencias de secuencia en la secuencia de las secuencias de aminoácidos de hemaglutinina de la influenza, o los ácidos nucleicos que los codifican, cuando el virus de la influenza se cultiva en huevos, o en células de mamífero, (por ejemplo, células MDCK) o cuando se aíslan de un sujeto infectado. Los ejemplos no limitantes de tales diferencias se ilustran aquí, incluyendo el Ejemplo 18. Además, como un experto en la técnica lo notaría, se puede observar una variación adicional dentro de hemaglutininas de influenza obtenida a partir de las nuevas cepas a medida que se siguen produciendo mutaciones adicionales. Debido a la conocida variabilidad de secuencia entre diferentes hemaglutininas de influenza, la presente invención incluye las VLP que se pueden elaborar utilizando cualquier hemaglutinina de la influenza a condición de que cuando se exprese en un huésped tal como se describe en el presente documento, la hemaglutinina de la influenza forme una VLP.
Los alineaciones de secuencias y las secuencias de consenso se pueden determinar usando cualquiera de los diversos paquetes de software conocidos en la técnica, por ejemplo MULTALIN (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881 -10890), o se puede alinear secuencias en forma manual y se pueden determinar las similitudes y diferencias entre las secuencias determinadas.
La estructura de las hemaglutininas está bien estudiada y se sabe que las estructuras están altamente conservadas. Cuando se superponen estructuras de la hemaglutinina, se observa un alto grado de conservación estructural (msd <2A). Esta conservación estructural se observa a pesar de que la secuencia de aminoácidos puede variar en algunas posiciones (véase, por ejemplo, Skehel y Wiley, 2000 Ann Rev. Biochem 69: 531 -69; Vaccaro et al. 2005). Regiones de hemaglutininas están también bien conservadas, por ejemplo:
-
Dominios estructurales: La poliproteína HA0 se escinde para proporcionar HA madura. HA es un homotrímero comprendiendo cada monómero un dominio de unión al receptor (HA1) y un dominio de anclaje a la membrana (HA2) unidos por un único enlace disulfuro; los 20 residuos del terminal N de la subunidad HA2 también se pueden denominar como el dominio o secuencia de fusión de HA. También está presente una región de "cola" (en la parte interna de la envoltura de la membrana). Cada hemaglutinina comprende estas regiones o dominios. Las regiones o dominios individuales están típicamente conservados en longitud.
-
Todas las hemaglutininas contienen el mismo número y la ubicación de puentes disulfuro intra e intermoleculares. La cantidad y la ubicación en la secuencia de aminoácidos de las cisteínas que participan en la red de puentes de disulfuro se conservan entre las HA. Ejemplos de estructuras que ilustran la característica de puentes disulfuro intra e intermoleculares y otros aminoácidos conservados y sus posiciones relativas se describen en, por ejemplo, Gamblin et al 2004 (Science 303: 1838 -1842). Los ejemplos de estructuras y secuencias incluyen 1RVZ, 1RVX, 1RVT, 1RV0, 1RUY, 1RU7, disponibles a partir del Banco de datos de Proteínas (Berman et al. 2003. Nature Structural Biology 10: 980; URL: rcsb.org)
-
Cola citoplasmática -la mayoría de las hemaglutininas comprenden 3 cisteínas en posiciones conservadas. Una o más de estas cisteínas puede estar palmitoilada como una modificación post-transducción.
Una variación de aminoácidos se tolera en hemaglutininas de los virus de influenza. Esta variación proporciona nuevas cepas que son continuamente identificadas. La infectividad entre las nuevas cepas puede variar. Sin embargo, se mantiene la formación de trímeros de hemaglutinina, que posteriormente forman las VLP. La presente invención, por lo tanto, proporciona una secuencia de aminoácidos de hemaglutinina, o un ácido nucleico que
5 codifica una secuencia de aminoácidos de hemaglutinina, que forma las VLP en una planta, e incluye secuencias conocidas y secuencias variantes que se pueden desarrollar.
La Figura 65 ilustra un ejemplo de tal variación conocida. Esta figura muestra una secuencia de aminoácidos de consenso (SEQ ID NO: 74) para HA de las siguientes cepas H1N1:
A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (codificada por la SEQ ID NO: 33),
10 A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48),
A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49) y
SEQ ID NO: 9. X1 (posición 3) es A o V; X2 (posición 52) es D o N; X3 (posición 90) es K o R; X4 (posición 99) es K
o T; X5 (posición 111) es Y o H; X6 (posición 145) es V o T; X7 (posición 154) es E o K; X8 (posición 161) es R o K; X9 (posición 181) es V o A; X10 (posición 203) es D o N; X11 (posición 205) es R o K; X12 (posición 210) es T o K;
15 X13 (posición 225) es R o K; X14 (posición 268) es W o R; X15 (posición 283) es T o N; X16 (posición 290) es E o K; X17 (posición 432) es I o L; X18 (posición 489) es N o D.
Como otro ejemplo de tal variación, una alineación de secuencia y una secuencia consenso para la HA de A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (codificada por la SEQ ID NO: 33), A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 48), A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 49), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) y la SEQ ID NO: 9 se muestra a continuación
20 en la Tabla 3.
Tabla 3: Alineación de secuencia y secuencia de consenso para HA de cepas seleccionadas de H1N1
SEQ ID NO. Secuencia
La secuencia de consenso indica en letras mayúsculas aminoácidos comunes a todas las secuencias en una
posición designada; las letras minúsculas indican los aminoácidos comunes a al menos la mitad, o la mayoría de las secuencias; el símbolo ! es uno cualquiera de I o V; el símbolo $ es uno cualquiera de L o M; el símbolo% es uno cualquiera de F o Y; el símbolo # es uno cualquiera de N, D, Q, E, B o Z; el símbolo "." es ningún aminoácido (por ejemplo, una supresión); X en la posición 3 es uno cualquiera de A o V; X en la posición 52 es uno cualquiera de E o
5 N; X en la posición 90 es K o R; X en la posición 99 es T o K; X en la posición 111 es uno cualquiera de Y o H; X en la posición 145 es uno cualquiera de V o T; X en la posición 157 es K o E; X en la posición 162 es R o K; X en la posición 182 es V o A; Xen laposición 203es N o D; Xen la posición 205 es R o K; Xenla posición210 es To K; X en la posición 225 es K o Y; X en la posición 333 es H o una supresión; X en la posición 433 es I o L; X en la posición 49) es N o D.
10 Como otro ejemplo de tal variación, una alineación de secuencia y una secuencia consenso para la HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 55), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) y A/Indonesia/5/2006 (H5N1) (SEQ ID NO: 10) se muestra a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4: Alineación de secuencia y secuencia de consenso para HA de cepas seleccionadas de H1N1
SEQ ID NO. Secuencia
La secuencia de consenso indica en letras mayúsculas aminoácidos comunes a todas las secuencias en una posición designada; las letras minúsculas indican aminoácidos comunes para al menos la mitad, o la mayoría de las secuencias; el símbolo! es uno cualquiera de I o V; el símbolo $ es uno cualquiera de L o M; el símbolo% es uno 5 cualquiera de F o Y; el símbolo # es uno cualquiera de N, D, Q, E, B o Z; X en la posición 102 es cualquiera de T, V
o A; X en la posición 110 es cualquiera de S, D o N; X en la posición 156 es cualquiera de S, K o T.
Las alineaciones y secuencias de consenso anteriormente ilustradas y descritas son ejemplos no limitantes de variantes en las secuencias de aminoácidos de hemaglutinina que se pueden utilizar en diversas realizaciones de la invención para la producción de las VLP en una planta.
10 Un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos se puede determinar fácilmente, ya que los codones para cada aminoácido son conocidos en la técnica. La provisión de una secuencia de aminoácidos, por lo tanto, enseña las secuencias de ácido nucleico degeneradas que la codifican. La presente invención, por lo tanto,
proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la hemaglutinina de esas cepas y subtipos de influenza descritos en este documento (por ejemplo, A/California/04/09 (H1N1), A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003 A/pato/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000 A/ánade rabudo/TX/828189/02, A/Turquía/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchara/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/ gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1 ), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)), así como las secuencias degeneradas que codifican las hemaglutininas anteriores.
Además, se puede determinar fácilmente una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico, ya que el codón o codones para cada aminoácido son conocidos. La provisión de un ácido nucleico, por lo tanto, enseña una secuencia de aminoácidos codificada por el mismo. La invención, por lo tanto, proporciona secuencias de aminoácidos de la hemaglutinina de esas cepas y subtipos de influenza descritas en este documento que se divulgan en el presente documento (por ejemplo, A/California/04/09 (H1N1), A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003 A/pato/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000 A/ánade rabudo/TX/828189/02, A/Turquía/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchara/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1 ), A/Brisbane 10/2007 (H3N2), A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)).
En las plantas, las VLP de la influenza brotan de la membrana plasmática (véase el Ejemplo 5, y la Figura 19), por lo tanto, la composición de lípidos de las VLP refleja su origen. Las VLP producidas de acuerdo con la presente invención comprenden HA de uno o más de un tipo o subtipo de influenza, formando complejo con lípidos derivados de la planta. Los lípidos de la planta pueden estimular células inmunes específicas y mejorar la respuesta inmune inducida. Las membranas vegetales están hechas de lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE), y también contienen glicoesfingolípidos, saponinas, y fitoesteroles. Además, también se encuentran balsas de lípidos en las membranas plasmáticas de la planta -estos microdominios se enriquecen en esfingolípidos y esteroles. En las plantas, se sabe que se producen una variedad de fitoesteroles, incluyendo estigmasterol, sitosterol, 24metilcolesterol y colesterol (Mongrand et al., 2004).
PC y PE, así como glicoesfingolípidos se pueden unir a moléculas CD1 expresadas por células del sistema inmune de mamíferos tales como células presentadoras de antígeno (las APC) como células dendríticas y macrófagos y otras células incluyendo linfocitos B y T en el timo y el hígado (Tsuji M, 2006). Las moléculas CD1 son estructuralmente similares a las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y su papel es presentar antígenos glicolípidos a células NKT (células asesinas naturales T). Tras la activación, las células NKT activan las células inmunes innatas tal como las células NK y las células dendríticas, y también activan células inmunitarias adaptativas tales como las células B productoras de anticuerpos y las células T.
Se puede encontrar una variedad de fitoesteroles en una membrana plasmática -el complemento específico puede variar dependiendo de la especie, las condiciones de crecimiento, los recursos de nutrientes o estado patógeno, para nombrar unos pocos factores. Generalmente, el beta-sitosterol es el más abundante fitoesterol.
Los fitoesteroles presentes en una VLP de influenza formando complejo con una bicapa lipídica, tal como una envoltura derivada de membrana plasmática pueden proporcionar una composición de vacuna ventajosa. Sin desear estar limitado por la teoría, las VLP producidas por plantas que forman complejo con una bicapa lipídica, tal como una envoltura derivada de una membrana plasmática, pueden inducir una reacción inmune más fuerte que las VLP elaboradas en otros sistemas de expresión, y pueden ser similares a la reacción inmune inducida por las vacunas de virus enteros vivos o atenuados.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una VLP que forma complejo con una bicapa lipídica derivada de la planta. En algunas realizaciones, la bicapa lipídica que se deriva de la planta puede comprender la envoltura de la VLP.
La VLP producida dentro de una planta puede incluir una HA que comprende N-glicanos específicos de la planta. Por lo tanto, esta invención también proporciona una VLP que comprende HA que tiene N-glicanos específicos de la planta.
Además, la modificación de N-glicano en plantas es conocida (véase por ejemplo la solicitud de patente
estadounidense No. 60/944.344; que se incorpora aquí como referencia) y se puede producir HA que tiene Nglucanos modificados. Se puede obtener HA que comprende un patrón de glicosilación modificado, por ejemplo, con N-glicanos fucosilados, xilosilados reducidos, o ambos, fucosilados y xilosilados, o se puede obtener HA que tiene un patrón de glicosilación modificado, en donde la proteína carece de fucosilación, xilosilación, o ambos, y comprende mayor galactosilación. Además, la modulación de las modificaciones posteriores a la traducción, por ejemplo, la adición de galactosa terminal puede resultar en una reducción de la fucosilación y xilosilación de la HA expresada cuando se compara con una planta de tipo silvestre que expresa HA.
Por ejemplo, que no debe considerarse como limitante, la síntesis de HA que tiene un patrón de glicosilación modificado se puede lograr mediante la coexpresión de la proteína de interés junto con una secuencia de nucleótidos que codifica beta-1,4-galactosiltransferasa (GalT), por ejemplo, pero sin limitarse a GalT de mamífero, o GalT humana; sin embargo también se puede utilizar GalT de otra fuentes. El dominio catalítico de GalT también se puede fusionar a un dominio CTS (es decir, la cola citoplasmática, dominio transmembrana, región del vástago) de N-acetilglucosaminil transferasa (GNT1), para producir una enzima híbrida GNT1-GalT, y la enzima híbrida puede ser coexpresada con HA. La HA también puede ser coexpresada junto con una secuencia de nucleótidos que codifica N-acetilglucosaminil transferasa III (GnT-III), por ejemplo, pero sin limitarse a GnT-III de mamíferos o GnT-III humana, también se puede utilizar GnT-III de otras fuentes. Además, también se puede utilizar una enzima híbrida GNT1-GnT-III, que comprende la CTS de GNT1 fusionada a GnT-III.
Por lo tanto la presente invención también incluye las VLP que comprenden HA que tiene N-glicanos modificados.
Sin desear estar limitado por la teoría, la presencia de N-glicanos de plantas en HA puede estimular la respuesta inmune mediante la promoción de la unión de HA mediante las células presentadoras de antígeno. La estimulación de la respuesta inmune usando N-glicano de planta ha sido propuesto por Saint-Jore-Dupas et al. (2007). Además, la conformación de la VLP puede ser ventajosa para la presentación del antígeno, y mejora el efecto adyuvante de VLP cuando forma complejo con una capa de lípidos derivada de la planta.
Por "región reguladora", "elemento regulador" o "promotor" se entiende una porción de ácido nucleico típicamente, pero no siempre, secuencia arriba de la región de codificación de la proteína de un gen, que puede estar compuesto ya sea por ADN o por ARN, o tanto ADN como ARN. Cuando se activa una región reguladora, y en asociación operativa, o unida operativamente, con un gen de interés, esto puede resultar en la expresión del gen de interés. Un elemento regulador puede ser capaz de mediar la especificidad del órgano, o el control de la activación temporal o de desarrollo del gen. Una "región reguladora" incluye elementos promotores, elementos promotores centrales que exhiben una actividad basal del promotor, elementos que son inducibles en respuesta a un estímulo externo, elementos que median la actividad del promotor, tales como elementos reguladores negativos o potenciadores transcripcionales. "Región reguladora", como se usa en este documento, también incluye elementos que son activos después de la transcripción, por ejemplo, elementos reguladores que modulan la expresión génica, tal como potenciadores de la traducción y de la transcripción, represores de la traducción y de la transcripción, secuencias de activación secuencia arriba, y determinantes de la inestabilidad del ARNm. Varios de estos últimos elementos pueden estar situados cerca a la región de codificación.
En el contexto de esta descripción, el término "elemento regulador" o "región reguladora" se refiere típicamente a una secuencia de ADN, por lo general, pero no siempre, secuencia arriba (5') a la secuencia de codificación de un gen estructural, que controla la expresión de la región de codificación proporcionando el reconocimiento para la ARN polimerasa y/o otros factores requeridos para la transcripción para el inicio en un sitio particular. Sin embargo, se entiende que otras secuencias de nucleótidos, localizadas dentro de intrones, o 3' de la secuencia también pueden contribuir a la regulación de la expresión de una región de codificación de interés. Un ejemplo de un elemento regulador que permite el reconocimiento para la ARN polimerasa u otros factores transcripcionales para asegurar el inicio en un sitio particular es un elemento promotor. La mayoría, pero no todos, los elementos promotores eucariotas contienen una caja TATA, una secuencia de ácido nucleico conservada compuesta de pares de bases de los nucleótidos adenosina y timidina, usualmente situados aproximadamente 25 pares de bases secuencia arriba de un sitio de inicio transcripcional. Un elemento promotor comprende un elemento promotor basal, responsable de la iniciación de la transcripción, así como otros elementos reguladores (como se enumera más arriba) que modifica la expresión del gen.
Hay varios tipos de regiones reguladoras, incluidas aquellas que están reguladas por el desarrollo, inducibles o constitutivas. Una región reguladora que está regulado por el desarrollo, o que controla la expresión diferencial de un gen bajo su control, se activa dentro de ciertos órganos o tejidos de un órgano en momentos específicos durante el desarrollo de ese órgano o tejido. Sin embargo, algunas regiones reguladoras que están regulados por el desarrollo puede ser preferentemente ser activas dentro de ciertos órganos o tejidos en etapas de desarrollo específicas, también pueden ser activas en una forma regulada por el desarrollo, o en un nivel basal en otros órganos o tejidos también dentro de la planta. Los ejemplos de regiones reguladoras específicas del tejido, por ejemplo, véase una región reguladora específica, que incluyen al promotor de napina, y al promotor de cruciferina (Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595 -599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125 -130). Un ejemplo de un promotor específico de las hojas incluye al promotor de plastocianina (Figura 1b; patente estadounidense No. 7.125.978, que se
incorpora aquí como referencia).
Una región reguladora inducible es una que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o de genes en respuesta a un inductor. En la ausencia de un inductor, no se transcribirán las secuencias de ADN o de genes. Normalmente, el factor de la proteína que se une específicamente a una región reguladora inducible para activar la transcripción puede estar presente en una forma inactiva, que es luego directa o indirectamente convertida en la forma activa por el inductor. Sin embargo, el factor de la proteína también puede estar ausente. El inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, un metabolito, un regulador del crecimiento, un herbicida o un compuesto fenólico o un estrés fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente a través de la acción de un agente patógeno o enfermedad tal como un virus. Una célula de una planta que contiene una región reguladora inducible puede estar expuesta a un inductor mediante la aplicación en forma externa del inductor a la célula o la planta tal como mediante rocío, riego, calentamiento o métodos similares. Los elementos reguladores inducibles se pueden derivar ya sea de genes de plantas o bien no vegetales (por ejemplo, Gatz, C. y Lenk, I. R. P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352 -358; que se incorpora como referencia). Los ejemplos de potenciales promotores inducibles incluyen, pero no se limitan a, un promotor inducible por tetraciclina (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 48, 89 -108; que se incorpora como referencia), el promotor inducible por esteroides (Aoyama, T. y Chua, N. H., 1997, Plant J. 2, 397 -404; que se incorpora como referencia) y el promotor inducible por etanol (Salter, M. G., et al., 1998, Plant Journal 16, 127 -132;. Caddick, M. X., et al., 1998, Nature Biotech 16, 177 -180, que se incorporan como referencia), genes IB6 y CKI1 inducibles por citoquinina (Brandstatter, I. y Kieber, J. J., 1998, Plant Cell 10, 1009 -1019; Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982 -985; que se incorporan como referencia) y el elemento inducible por auxina, DR5 (Ulmasov, T., et al, 1997, Plant Cell 9, 1963 -1971; que se incorpora como referencia).
Una región reguladora constitutiva dirige la expresión de un gen a través de las diversas partes de una planta y continuamente durante todo el desarrollo de la planta. Los ejemplos de elementos reguladores constitutivos conocidos incluyen promotores asociados con el transcripto 35S del CaMV (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810 812), la actina 1 de arroz (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3: 1155 -1165), la actina 2 (An et al., 1996, Plant J., 10: 107 -121), o tms 2 (patente estadounidense No. 5.428.147, que se incorpora aquí como referencia), y genes para triosafosfato isomerasa 1 (Xu et al., 1994, Plant Physiol 106: 459 -467), gen para ubiquitina 1 del maíz (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637 -646), los genes 1 y 6 para ubiquitina de Arabidopsis (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637 -646), y el gen para el factor 4A de iniciación de la traducción del tabaco (Mandel et al., 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995 -1004). El término "constitutivo" como se usa en el presente documento no indica necesariamente que un gen bajo el control de la región reguladora constitutiva se exprese al mismo nivel en todos los tipos de células, sino que el gen se expresa en una amplia gama de tipos de células a pesar de que se observa a menudo una variación en abundancia. Los elementos reguladores constitutivos se pueden acoplar con otras secuencias para mejorar aún más la transcripción y/o la traducción de la secuencia de nucleótidos a la que están unidos operativamente. Por ejemplo, el sistema CMPV-HT (Sainsbury et al., 2008, Plant Physiology 148: 1212 1218) se deriva de las regiones no traducidas del virus del mosaico del caupí (COMV) y demuestra una mejor traducción de la secuencia de codificación asociada.
Por "nativo" se entiende que la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos es de origen natural, o de "tipo silvestre".
Por "operativamente unido o enlazado" se entiende que las secuencias particulares, por ejemplo, un elemento regulador y una región codificante de interés, interactúan ya sea directa o indirectamente para llevar a cabo una función prevista, tal como la mediación o la modulación de la expresión génica. La interacción de las secuencias operativamente enlazadas puede, por ejemplo, estar mediada por las proteínas que interactúan con las secuencias operativamente unidas.
Las una o más de una secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden expresar en cualquier planta huésped adecuada que se transforma por la secuencia de nucleótidos, o constructos o vectores de la presente invención. Los ejemplos de huéspedes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cultivos agrícolas incluyendo alfalfa, canola, Brassica spp., maíz, Nicotiana spp., alfalfa, patata, ginseng, guisante, avena, arroz, soja, trigo, cebada, girasol, algodón y similares.
Los uno o más constructos genéticos quiméricos de la presente invención pueden comprender además una región no traducida 3'. Una región no traducida 3' se refiere a aquella porción de un gen que comprende un segmento de ADN que contiene una señal de poliadenilación y cualquier otra señal reguladora capaz de efectuar el procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza normalmente efectuando la adición de pistas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. Las señales de poliadenilación se reconocen comúnmente por la presencia de homología con la forma canónica 5'-AATAAA-3' aunque no son infrecuentes las variaciones. Una o más de las construcciones genéticas quiméricas de la presente invención pueden también incluir otros potenciadores, ya sea potenciadores de traducción o de transcripción, según sea necesario. Estas regiones potenciadoras son bien conocidas para las personas expertas en la técnica, y pueden incluir el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. El codón de inicio debe estar en fase con el marco de
lectura de la secuencia de codificación para asegurar la traducción de toda la secuencia.
Los ejemplos no limitantes de regiones 3' adecuadas son los las regiones 3' no traducidas transcritas que contienen una señal de poliadenilación de los genes del plásmido que inducen el tumor (Ti) en Agrobacterium, tales como la nopalina sintasa (gen Nos) y genes de plantas tales como los genes para la proteína de almacenamiento de soja, la subunidad pequeña del gen para la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBlSCO, patente estadounidense No. 4.962.028; que se incorpora aquí como referencia), el promotor usado en la regulación de la expresión de plastocianina (Pwee y Gray 1993; que se incorpora aquí como referencia). En la patente estadounidense No.
7.125.978 (que se incorpora aquí como referencia) se describe un ejemplo de un promotor de plastocianina.
Como se describe en el presente documento, se ha encontrado que los promotores que comprenden secuencias potenciadoras con eficiencia demostrada en la expresión en la hoja, son eficaces en la expresión transitoria. Sin desear estar limitado por la teoría, la unión de elementos reguladores secuencia arriba de un gen fotosintético por la unión a la matriz nuclear puede mediar una expresión fuerte. Por ejemplo hasta -784 desde el sitio de inicio de la traducción del gen de plastocianina de guisante puede ser utilizado para mediar una expresión fuerte del gen reportero.
Para ayudar en la identificación de células de plantas transformadas, se pueden manipular adicionalmente los constructos de esta invención para incluir marcadores seleccionables de plantas. Los marcadores seleccionables útiles incluyen enzimas que proporcionan resistencia a compuestos químicos tales como un antibióticos, por ejemplo, gentamicina, higromicina, kanamicina, o herbicidas tales como fosfinotricina, glifosato, clorosulfurona, y similares. Del mismo modo, se pueden usar enzimas que permiten la producción de un compuesto identificable por cambio de color, tal como GUS (beta-glucuronidasa), o luminiscencia, tal como luciferasa o GFP.
También se consideran parte de esta invención plantas transgénicas, células de plantas o semillas que contienen el constructo de gen quimérico de la presente invención. Los métodos de regeneración de plantas enteras a partir de células de plantas también son conocidos en la técnica. En general, las células de plantas transformadas se cultivan en un medio apropiado, que puede contener agentes selectivos tales como antibióticos, donde se usan marcadores seleccionables para facilitar la identificación de las células de plantas transformadas. Una vez que se forma el callo, se puede fomentar la formación de brotes mediante el empleo de las hormonas vegetales apropiadas de acuerdo con los métodos conocidos y se transfieren los brotes a medio de enraizamiento para la regeneración de las plantas. Se pueden utilizar luego las plantas para establecer generaciones repetitivas, ya sea a partir de semillas o utilizando técnicas de propagación vegetativa. Las plantas transgénicas también se pueden generar sin el uso de cultivos de tejidos.
También se consideran parte de esta invención las células de plantas transgénicas, árboles, levaduras, bacterias, hongos, insectos y animales que contienen el constructo del gen quimérico que comprende un ácido nucleico que codifica HA0 recombinante para la producción de VLP, de acuerdo con la presente invención.
Los elementos reguladores de la presente invención también se pueden combinar con una región de codificación de interés para la expresión dentro de un rango de organismos huésped que son susceptibles a la transformación, o la expresión transitoria. Tales organismos incluyen, pero no se limitan a plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, por ejemplo pero sin limitarse a maíz, plantas de cereales, trigo, cebada, avena, Nicotiana spp, Brassica spp, soja, judías, guisantes, alfalfa, patata, tomate , ginseng, y Arabidopsis.
Los métodos para la transformación estable, y la regeneración de estos organismos están establecidos en la técnica y son conocidos por un experto en la técnica. El método de obtención de plantas transformadas y regeneradas no es crítica para la presente invención.
Por "transformación" se entiende la transferencia interespecífica estable de la información genética (secuencia de nucleótidos) que se manifiesta genotípicamente, fenotípicamente o ambos. La transferencia interespecífica de información genética a partir de un constructo quimérico a un huésped puede ser hereditaria y la transferencia de información genética considerada estable, o la transferencia puede ser transitoria y la transferencia de información genética no es heredable.
Por el término "materia vegetal", se entiende cualquier material derivado de una planta. La materia vegetal puede comprender una planta entera, tejido, células, o cualquier fracción de las mismas. Además, la materia vegetal puede comprender componentes intracelulares de la planta, componentes extracelulares de la planta, extractos líquidos o sólidos de las plantas, o una combinación de los mismos. Además, la materia vegetal puede comprender plantas, células de plantas, tejidos, un extracto líquido, o una combinación de los mismos, de las hojas de la planta, tallos, frutos, raíces o una combinación de los mismos. La materia vegetal puede comprender una planta o porción de la misma que no haya sido sometida a ninguna etapa de procesamiento. Una porción de una planta puede comprender materia vegetal. Sin embargo, también se contempla que el material vegetal pueda ser sometido a etapas de procesamiento mínimas como se define a continuación, o de procesamiento más riguroso, incluyendo la purificación parcial o sustancial de proteínas usando técnicas comúnmente conocidas dentro de la técnica, incluyendo, pero sin
limitarse a cromatografía, electroforesis y similares.
Por el término "procesamiento mínimo" se entiende la materia vegetal, por ejemplo, una planta o porción de la misma que comprende una proteína de interés que se purifica parcialmente para producir un extracto de la planta, homogeneizado, fracción de homogenizado de plantas o similares (es decir, mínimamente procesados). La purificación parcial puede comprender, pero no se limitan a romper las estructuras celulares de las plantas, creando así una composición que comprende componentes vegetales solubles y componentes vegetales insolubles que se pueden separar por ejemplo, pero sin limitarse a, mediante centrifugación, filtración o una combinación de los mismos. En este sentido, las proteínas secretadas en el espacio extracelular de la hoja o de otros tejidos podrían ser obtenidas fácilmente usando vacío o extracción por centrifugación, o se podrían extraer los tejidos bajo presión mediante el paso a través de rodillos o de molienda o similar para exprimir o liberar la proteína libre desde dentro del espacio extracelular. Un procesamiento mínimo también podría implicar la preparación de extractos crudos de proteínas solubles, ya que estas preparaciones tendrían una contaminación insignificante a partir de productos vegetales secundarios. Además, un procesamiento mínimo puede implicar la extracción acuosa de la proteína soluble de las hojas, seguido por precipitación con cualquier sal adecuada. Otros métodos pueden incluir maceración a gran escala y la extracción del jugo con el fin de permitir el uso directo del extracto.
La materia vegetal, en la forma de material de planta o tejido puede ser suministrado por vía oral a un sujeto. La materia vegetal puede ser administrada como parte de un suplemento dietético, junto con otros alimentos, o encapsulado. La materia vegetal o tejido también se puede concentrar para mejorar o aumentar la palatabilidad, o se puede suministrar junto con otros materiales, ingredientes o excipientes farmacéuticos, según sea necesario.
Ejemplos de un sujeto u organismo objetivo que las cuales se pueden suministrar las VLP de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, primates, aves, aves acuáticas, aves migratorias, codorniz, pato, oca, aves de corral, pollo, cerdo, ovejas, equino, caballo, camello, canino, perros, felino, gatos, tigre, leopardo, algalia, visón, garduña, hurones, animales domésticos, animales de granja, conejos, ratones, ratas, cobayas y otros roedores, foca, ballena y similares. Tales organismos objetivo son ejemplos, y no deben ser considerados limitativos para las aplicaciones y usos de la presente invención.
Se contempla que una planta que comprende la proteína de interés, o que expresa la VLP que comprende la proteína de interés puede ser administrada a un sujeto u organismo objetivo, en una variedad de formas dependiendo de la necesidad y de la situación. Por ejemplo, la proteína de interés obtenida de la planta puede ser extraída antes de usarla ya sea en forma cruda, parcialmente purificada, o purificada. Si se va a purificar la proteína, entonces se puede producir ya sea en plantas comestibles o no comestibles. Además, si se administra la proteína en forma oral, se puede cosechar el tejido de la planta y se administra directamente al sujeto, o se puede secar el tejido recogido antes de su administración, o se puede permitir que un animal paste sobre la planta sin necesidad de cosechar previamente. También se considera dentro del alcance de esta invención administrar tejidos de la planta cosechada como un complemento alimenticio en la alimentación animal. Si se administra el tejido de la planta a un animal con poco o ninguna transformación, se prefiere que el tejido de la planta que se administra sea comestible.
El silenciamiento de genes posterior a la transcripción (PTGS) puede estar implicado en la limitación de la expresión de transgenes en las plantas, y se puede utilizar la coexpresión de un supresor de silenciamiento del virus Y de la patata (HcPro) para contrarrestar la degradación específica de los ARNm del transgén (Brigneti et al., 1998). Se conocen supresores del silenciamiento alternativos en la técnica y pueden ser utilizados como se describe aquí (Chiba et al., 2006, Virology 346: 7 -14; que se incorpora aquí como referencia), por ejemplo pero sin limitarse a, TEV-p1/HC-Pro (virus p1/HC-Pro de grabado del tabaco), BYV-p21, p19 del virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV p19), proteína de la cápside del virus que arruga el tomate (TCV -CP), 2b del virus del mosaico del pepino; CMV-2b), p25 del virus X de la patata (PVX-p25), p11 del virus M de la patata (PVM-p11), p11 del virus S de la patata (PVS-p11), p16 del virus que quema el arándano, (BScV-p16), p23 del virus de la tristeza de los cítricos (CTV-p23), p24 del virus 2 asociado con el enrollamiento de la hoja de la vid, (GLRaV-2 p24), p10 del virus A de la vis, (GVA-p10), p14 del virus B de la vid (GVB-p14), p10 del virus latente Heracleum (HLV-p10), o p16 del virus latente común del ajo (GCLV-p16). Por lo tanto, un supresor de silenciamiento, por ejemplo, pero no limitado a, HC-Pro, TEV -p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 o GVA-p10, pueden ser coexpresados junto con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés para garantizar aún más altos niveles de producción de proteínas dentro de una planta.
Además, se pueden producir las VLP que comprenden una combinación de subtipos de HA. Por ejemplo, las VLP puede comprender uno o más de una HA del subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, tipo B, o una combinación de los mismos. La selección de la combinación de las HA se puede determinar mediante el uso previsto de la vacuna preparada a partir de la VLP. Por ejemplo una vacuna para su uso en la inoculación de aves puede comprender cualquier combinación de subtipos de HA, mientras que las VLP útiles para la inoculación de seres humanos puede comprender subtipos de uno o más de uno de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 o B. Sin embargo, se pueden preparar otras combinaciones de subtipos de HA dependiendo del uso de la VLP. Con el fin de producir las VLP que comprenden combinaciones de subtipos de HA, el subtipo HA deseado
puede ser coexpresado en la misma célula, por ejemplo una célula de una planta.
Además, las VLP producidas como se describe en este documento no comprenden neuraminidasa (NA). Sin embargo, NA puede ser coexpresada con HA siempre y cuando se deseen las VLP que comprenden HA y NA.
Por lo tanto, la presente invención incluye además un vector adecuado que comprende el constructo quimérico adecuado para uso con cualquiera de los sistemas de expresión estable o transitorio. La información genética puede ser suministrada también dentro de uno o más de un constructo. Por ejemplo, se puede introducir una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de interés en un constructo, y se puede introducir una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que modifica la glicosilación de la proteína de interés usando un constructo separado. Estas secuencias de nucleótidos pueden entonces coexpresarse dentro de una planta. Sin embargo, también puede usarse un constructo que comprende una secuencia nucleotídica que codifica tanto la proteína de interés como la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés. En este caso, la secuencia de nucleótidos comprendería una primera secuencia que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés operativamente enlazada a una región promotora o reguladora, y una segunda secuencia que comprende una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés, la segunda secuencia operativamente enlazada a una región promotora o reguladora.
Por "coexpresado" se entiende que dos, o más de dos, secuencias de nucleótidos se expresan aproximadamente al mismo tiempo dentro de la planta, y dentro del mismo tejido de la planta. Sin embargo, las secuencias de nucleótidos no necesitan ser expresados exactamente al mismo tiempo. Más bien, las dos o más secuencias de nucleótidos se expresan de una manera tal que los productos codificados tienen la oportunidad de interactuar. Por ejemplo, la proteína que modifica la glicosilación de la proteína de interés puede ser expresada ya sea antes o durante el período en que se expresa la proteína de interés por lo que tiene lugar la modificación de la glicosilación de la proteína de interés. Las dos o más de dos secuencias de nucleótidos pueden ser coexpresadas utilizando un sistema de expresión transitorio, donde se introducen las dos o más secuencias dentro de la planta más o menos al mismo tiempo en condiciones tales que ambas secuencias se expresan. Alternativamente, una planta de plataforma que comprende una de las secuencias de nucleótidos, por ejemplo la secuencia que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés, se puede transformar, ya sea de manera transitoria o de manera estable, con una secuencia adicional que codifica la proteína de interés. En este caso, la secuencia que codifica la proteína que modifica el perfil de glicosilación de la proteína de interés puede ser expresada dentro de un tejido deseado, durante una etapa de desarrollo deseada, o su expresión puede ser inducida utilizando un promotor inducible, y la secuencia adicional que codifica la proteína de interés puede ser expresada bajo condiciones similares y en el mismo tejido, para asegurar que las secuencias de nucleótidos se coexpresen.
Los constructos de la presente invención pueden introducirse en células vegetales usando plásmidos Ti, plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa de ADN, microinyección, electroporación, infiltración, y similares. Para revisiones de tales técnicas véase por ejemplo Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Nueva York VIII, páginas 421 -463 (1988); Geierson y Corey, Plant Molecular Biology, 2da Ed. (1988); y Miki e Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. En Plant Metabolism, 2da Ed. DT. Dennis, DH Turpin, D. D. Lefebrve, D. B. Layzell (eds), Addison-Wesley, Langmans Ltd. Londres, páginas 561 -579 (1997). Otros métodos incluyen incorporación directa de ADN, el uso de liposomas, electroporación, por ejemplo usando protoplastos, microinyección, microproyectiles o bigotes, e infiltración al vacío. Véase, por ejemplo, Bilang, et al. (Gene 100: 247 -250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104 -112, 1991), Guerche et al. (Plant Science
52: 111 -116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30 -36, 1987), Klein et al., Nature 327: 70 -73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229 -1231, 1985), DeBlock et al., Plant Physiology 91: 694 -701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach y Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler y Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu y Lomonossoff (J. Virol Meth, 105: 343 -348, 2002,), patentes de los Estados Unidos Nos. 4.945.050; 5.036.006; 5.100.792; 6.403.865; 5.625.136, (todos los cuales se incorporan aquí como referencia).
Se pueden utilizar métodos de expresión transitoria para expresar los constructos de la presente invención (véase Liu y Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105: 343 -348; que se incorpora aquí como referencia). Alternativamente, se puede utilizar un método expresión transitoria con base en el vacío, como lo describen Kapila et al. 1997 (incorporado aquí como referencia). Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, pero no se limitan a, un método de agroinoculación o agroinfiltración, sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos transitorios como se señaló anteriormente. Ya sea con agroinoculación o agroinfiltración, una mezcla de agrobacterias que comprende el ácido nucleico deseado entra en los espacios intercelulares de un tejido, por ejemplo las hojas, la parte aérea de la planta (incluyendo el tronco, hojas y flores), otra porción de la planta (tallo, raíz, flor), o la planta completa. Después de cruzar la epidermis del Agrobacterium infecta y transfiere copias de ADN-t en las células. El ADN-t se transcribe de forma episomal y se traduce el ARNm, lo que conduce a la producción de la proteína de interés en las células infectadas, sin embargo, el paso del ADN-t dentro del núcleo es transitorio.
Si la secuencia de nucleótidos de interés codifica un producto que es directa o indirectamente tóxico para la planta, a
continuación, utilizando el método de la presente invención, tal toxicidad puede reducirse en toda la planta, expresando selectivamente la secuencia de nucleótidos de interés dentro de un tejido deseado o en una etapa deseada de desarrollo de la planta. Además, el período de tiempo limitado de la expresión resultante de la expresión transitoria puede reducir el efecto cuando se produce un producto tóxico en la planta. Se pueden utilizar un promotor inducible, un promotor específico del tejido o un promotor específico de la célula, para la expresión selectiva directa de la secuencia de interés.
Las VLP de HA recombinante de la presente invención se puede usar junto con vacunas existentes contra la influenza, para complementar las vacunas, volviéndolas más eficaces, y para reducir la administración de las dosificaciones necesarias. Como es sabido por una persona experta en la técnica, la vacuna puede ser dirigida contra uno o más de un virus de la influenza. Algunos ejemplos de vacunas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las disponibles comercialmente de Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, MedImmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals y similares.
Si se desea, las VLP de la presente invención pueden mezclarse con un adyuvante adecuado como sería conocido para un experto en la técnica. Además, la VLP se puede utilizar en una composición de vacuna que comprende una dosis eficaz de la VLP para el tratamiento de un organismo objetivo, como se definió anteriormente. Además, la VLP producida de acuerdo con la presente invención se puede combinar con las VLP obtenidas utilizando diferentes proteínas de la influenza, por ejemplo, neuraminidasa (NA).
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para la inducción de inmunidad al virus de la influenza en un organismo animal u objetivo que comprende la administración de una dosis eficaz de una vacuna que comprende una o más de una VLP. La vacuna se puede administrar por vía oral, por vía intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutánea.
La administración de las VLP producidas de acuerdo con la presente invención se describe en el Ejemplo 6. La administración de la VLP de H5 elaborada por la planta resultó en una respuesta significativamente mayor en comparación con la administración de HA soluble (véanse las Figuras 21A y 21B).
Como se muestra en las Figuras 26A y 26B, la administración a un sujeto las VLP de H5 A/Indonesia/5/05 produjo protección cruzada a una exposición con influenza A/Turquía/582/06 (H5N1; "Turquía H5N1"). La administración de las VLP de H5 Indonesia antes de la exposición no dio lugar a ninguna pérdida de masa corporal. Sin embargo, en sujetos a los cuales no se les administró VLP de H5, pero se expusieron a Turquía H5N1, exhibieron una pérdida significativa de masa corporal, y varios sujetos murieron.
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las VLP de influenza producidas por plantas que comprenden la proteína viral hemaglutinina H5 inducen una respuesta inmune específica para las cepas de influenza patógenas, y que las partículas similares a virus pueden brotar de una membrana plasmática de la planta.
Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición que comprende una dosis eficaz de una VLP que comprende una proteína HA de virus de la influenza, uno o más de un lípido de la planta, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La proteína HA del virus de la influenza puede ser H5 Indonesia/5/2006, A/Brisbane/50/2007, A/Islas Salomón 3/2006, A/Brisbane/10/2007, A/Wisconsin/67/2005, B/Malasia/2506/2005, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57, A/Anhui/1/2005, A/Vietnam/1194/2004, A/Cerceta/Hong Kong/W312/97, A/Equino/Praga/56, A/California/04/09 (H1N1) o A/Hong-Kong/1073/99. También se proporciona un método para inducir inmunidad a una infección por virus de la influenza en un sujeto. El método comprende la administración de la partícula similar a un virus que comprende una proteína HA del virus de la influenza, uno o más de un lípido de la planta, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La partícula similar a un virus se puede administrar a un sujeto por vía oral, por vía intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, o subcutánea.
Las composiciones de acuerdo con diversas realizaciones de la invención pueden comprender las VLP de dos o más cepas o subtipos de la influenza. "Dos o más" se refiere a dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10 o más cepas o subtipos. Las cepas o subtipos representados pueden ser de un solo subtipo (por ejemplo, todos H1N1,
o todos H5N1), o pueden ser una combinación de subtipos. Los ejemplos de subtipos y cepas incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en el presente documento (por ejemplo, A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), A/Indonesia/5/2006 (H5N1), A/pollo/Nueva York/1995, A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8), A/Texas/32/2003, A/pato/MN/33/00, A/pato/Shanghái/1/2000 A/ánade rabudo/TX/828189/02, A/Turquía/Ontario/6118/68 (H8N4), A/pato cuchara/Irán/G54/03, A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7), A/pato/Inglaterra/56 (H11N6), A/pato/Alberta/60/76 (H12N5), A/Gaviota/Maryland/704/77 (H13N6), A/Ánade real/Gurjev/263/82, A/pato/Australia/341/83 (H15N8), A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3), B/Lee/40, C/Johannesburgo/66, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1), A/Brisbane 10/2007 (H3N2) , A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006, A/Singapur/1/57 (H2N2), A/Anhui/1/2005 (H5N1), A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1), A/Equino/Praga/56 (H7N7), A/California/04/09 (H1N1) o A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)).
La elección de la combinación de cepas y subtipos puede depender de la zona geográfica de los sujetos susceptibles a ser expuestos a la influenza, la proximidad de especies animales a una población humana que va a ser inmunizada (por ejemplo, especies de aves acuáticas, animales de granja tales como cerdos, etc.) y las cepas que portan, están expuestos a, o puedan estar expuestos a, las predicciones de la deriva antigénica dentro de subtipos o cepas, o combinaciones de estos factores. Los ejemplos de combinaciones utilizadas en años anteriores se encuentran disponibles (véase URL: who.int/csr/dieease/influenza/vaccine recomendaciones1/en). Algunas o todas estas cepas se pueden emplear en las combinaciones mostradas, o en otras combinaciones, en la producción de una composición de vacuna.
Más particularmente, se pueden incluir ejemplos de combinaciones de las VLP a partir de dos o más cepas o subtipos seleccionados de entre el grupo que comprende: A/California/04/09 (H1N1), A/Brisbane/59/2007 (H1N1), un virus similar a A/Brisbane/59/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), un virus similar a A/Brisbane/10/2007 (H3N2), B/Florida/4/2006 o un virus similar a B/Florida/4/2006.
Otra ejemplo de combinación puede incluir las VLP a partir de dos o más cepas o subtipos seleccionados del grupo que comprende A/Indonesia/5/2005, un virus similar a A/Indonesia/5/2005, A/Vietnam/1194/2004, un virus similar a A/Vietnam/1194/2004, A/Anhui/1/05, un virus similar a A/Anhui/1/05, A/oca/Guiyang/337/2006, un virus similar a A/oca/Guiyang/337/2006, A/pollo/Shanxi/2/2006, un virus similar a A/pollo/Shanxi/2/2006, A/California/04/09 (H1N1)
o un virus similar a A/California/04/09 (H1N1).
Otro ejemplo de combinación puede incluir las VLP de las cepas de influenza A/pollo/Italia/13474/99 (tipo H7) o A/Pollo/Columbia Británica/04 (H7N3).
Otro ejemplo de combinación puede incluir las VLP de A/pollo/Hong Kong/G9/97 o A/Hong Kong/1073/99. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de A/Islas Salomón/3/2006. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de A/Brisbane/10/2007. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de A/Wisconsin/67/2005. Otro ejemplo de combinación puede comprender las VLP de las cepas o subtipos B/Malasia/2506/2004, B/Florida/4/2006 o B/Brisbane/3/2007.
Las dos o más VLP pueden ser expresadas de forma individual, y las VLP purificadas o semipurificadas posteriormente combinadas. Alternativamente, las VLP pueden ser coexpresadas en el mismo huésped, por ejemplo una planta. Las VLP se pueden combinar o producir en una relación deseada, por ejemplo aproximadamente razones equivalentes, o se pueden combinar de tal manera que uno o subtipo o cepa comprende la mayoría de las VLP en la composición.
Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden las VLP de dos o más cepas o subtipos.
Las VLP de virus en envoltura generalmente adquieren su envoltura de la membrana de la que brotan. Las membranas plasmáticas de la planta tienen un complemento de fitoesteroles que puedan tener efectos inmunoestimuladores. Para investigar esta posibilidad, se administraron las VLP de H5 producidas por plantas a animales en presencia o en ausencia de un adyuvante, y la HAI (respuesta de anticuerpos para inhibición de la hemaglutinación) determinada (Figuras 22A, 22B). En ausencia de un adyuvante añadido, las VLP de H5 producidas por plantas, demuestran una HAI significativa, indicativo de una respuesta inmune sistémica a la administración del antígeno. Además, los perfiles de isotipos de anticuerpos de las VLP administradas en presencia o en ausencia de adyuvante son similares (Figura 23A).
La Tabla 5 enumera secuencias proporcionadas en diversas realizaciones de la invención.
Tabla 5: Descripción de la secuencia de identificadores de secuencia.
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
1
fragmento H1 del terminal N Figura 4a
2
fragmento H1 del terminal C Figura 4b
3
secuencia de codificación de H5 Figura 6
4
cebador Plato-443c Figura 7a
5
cebador SpHA(Ind)-Plasto.r Figura 7b
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
6
cebador Plasto-SpHA(Ind).c Figura 7c
7
cebador HA(Ind)-Sac.r Figura 7d
8
Secuencia del casete de expresión con base en plastocianina de alfalfa usada para la expresión de H1 Figura 1
9
secuencia peptídica de HA1 (A/Nueva Caledonia/20/99) Figura 8a
10
secuencia peptídica de HA5 (A/Indonesia/5/2006) Figura 8b
11
Secuencia de codificación del subtipo H7 de influenza A (A/pollo/Nueva York/1995) Figura 9
12
Secuencia de codificación del subtipo H2 de influenza A (A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8)) Figura 10a
13
Secuencia de codificación del subtipo H3 de influenza A (A/Texas/32/2003) Figura 10b
14
Secuencia de codificación del subtipo H4 de influenza A (A/ánade real/MN/ 33/00) Figura 10c
15
Secuencia de codificación del subtipo H5 de influenza A (A/pato/Shanghái/ 1/2000) Figura 10d
16
Secuencia de codificación del subtipo H6 de influenza A (A/ánade rabudo/TX/ 828189/02) Figura 10e
17
Secuencia de codificación del subtipo H8 de influenza A (A/Turquía/Ontario/ 6118/68(H8N4)) Figura 10f
18
Secuencia de codificación del subtipo H9 de influenza A (A/pato cuchara/Irán/ G54/03) Figura 10g
19
Secuencia de codificación del subtipo H10 de influenza A (A/pollo/Alemania/ N/1949(H10N 7)) Figura 10h
20
Secuencia de codificación del subtipo H11 de influenza A (A/pato/Inglaterra/ 56(H11N6)) Figura 10i
21
Secuencia de codificación del subtipo H12 de influenza A (A/pato/Alberta/ 60/76(H12N5)) Figura 10j
22
Secuencia de codificación del subtipo H13 de influenza A (A/Gaviota/ Maryland/704/77(H13N6)) Figura 10k
23
Secuencia de codificación del subtipo H14 de influenza A (A/Ánade real/ Gurjev/263/82) Figura 10l
24
Secuencia de codificación del subtipo H15 de influenza A (A/pato/Australia/ 341/83 (H15N8)) Figura 10m
25
Secuencia de codificación del subtipo H16 de influenza A (A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99(H16N3)) Figura 10n
26
secuencia de codificación de HA de influenza B (B/Lee/40) Figura 10o
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
27
secuencia de codificación de HA de influenza C (C/Johannesburgo/66) Figura 10p
28
secuencia de H1 de HAO completa Figura 5
29
Cebador XmaI-pPlas.c Figura 10q
30
Cebador SacI-ATG-pPlas.r Figura 10r
31
Cebador SacI-PlasTer.c Figura 10s
32
Cebador EcoRI-PlasTer.r Figura 10t
33
A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1), GenBank Acceso No. AY289929 Figura 16
34
proteína disulfuro isomerasa de M. Sativa, GenBank Acceso No. Z11499 Figura 17
35
A/.Puerto Rico/8/34 (H1N1), GenBank Acceso No. NC_002016.1 Figura 18
36
Clon 774: ADN de DraIII hasta Sac1 que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Figura 28
37
Clon 775: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) Figura 29
38
Clon 776: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) Figura 30
39
Clon 777: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) Figura 31
40
Clon 778: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de B/Malaysia/2506/2004 Figura 32
41
Clon 779: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de B/Florida/4/2006 Figura 33
42
Clon 780: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Singapur/1/57 (H2N2) Figura 34
43
Clon 781: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) Figura 35
44
Clon 782: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) Figura 36
45
Clon 783: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) Figura 37
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
46
Clon 784: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Equino/Praga/56 (H7N7) Figura 38
47
Clon 785: ADN de DraIII hasta Sacl que comprende una región reguladora de plastocianina operativamente enlazada a una secuencia que codifica HA de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Figura 39
48
Clon 774 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) Figura 40A
49
Clon 775 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) Figura 40B
50
Clon 776 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) Figura 41A
51
Clon 777 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) Figura 41B
52
Clon 778 Secuencia de aminoácidos de HA de B/Malasia/2506/2004 Figura 42A
53
Clon 779 Secuencia de aminoácidos de HA de B/Florida/4/2006 Figura 42B
54
Clon 780 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Singapur/1/57 (H2N2) Figura 43A
55
Clon 781 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) Figura 43B
56
Clon 782 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) Figura 44A
57
Clon 783 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/ 97 (H6N1) Figura 44B
58
Clon 784 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Equino/Praga/56 (H7N7) Figura 45A
59
Clon 785 Secuencia de aminoácidos de HA de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) Figura 45B
60
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Indonesia/5/2005 (Constructo # 660), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 51
61
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Nueva Caledonia/20/1999 (Constructo # 540), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 52
62
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Brisbane/59/2007 (constructo #774), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 53
63
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H1 de A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (constructo #775), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 54
64
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H2 de A/Singapur/1/57 (H2N2) (constructo # 780), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 55
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
65
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Constructo # 781), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 56
66
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H5 de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (Constructo # 782), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 57
67
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (Constructo # 783), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 58
68
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Constructo # 785), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 59
69
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H3 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 60
70
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 61
71
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de H7 de A/Equino/Praga/56 (H7N7), 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 62
72
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de HA de B/Malasia/2506/2004, 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 63
73
Casete de expresión de HA que comprende al promotor de plastocianina de alfalfa y 5’ UTR, secuencia de codificación de hemaglutinina de HA de B/Florida/4/2006, 3’ UTR de plastocianina de alfalfa y secuencias terminadoras Figura 64
74
Secuencia de aminoácidos de consenso de la SEQ ID NO: 49, 48, 33 y 9 Figura 65
75
Secuencia de aminoácidos de H1 Nueva Caledonia (AAP34324.1) codificada por la SEQ ID NO: 33 Figura 66
76
Secuencia de aminoácidos de H1 Puerto Rico (NC_0409878.1) codificada por la SEQ ID NO: 35
 Figura 67
77
pBinPlus.2613c
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
78
Mut-ATG115.r
79
Mut-ATG161.c
80
LC-C5-1.110r
81
Casete de expresión número 828, de PacI (promotor secuencia arriba) hasta AscI (inmediatamente secuencia arriba del terminador NOS). Figura 68
82
SpPDI-HA(Ind).c
83
Constructo número 663, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina). Figura 69
84
SpPDI-H1B.c
85
SacI-H1B.r
86
Constructo número 787, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina) Figura 70
87
H3B-SpPDI.r
88
SpPDI-H3B.c
89
H3(A-Bri).982r
90
Constructo número 790, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador de plastocianina). Figura 7
91
HBF-SpPDI.r
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
92
SpPDI-HBF.c
93
Plaster80r
94
Constructo número 798, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor de plastocianina) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo Del terminador de plastocianina). Figura 72
95
Apal-SpPDI.c
96
StuI-H1(A-NC).r
97
Constructo número 580, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 73
98
ApaI-H5 (A-Indo).1c
99
H5 (A-Indo)-StuI.1707r
100
Constructo número 685, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 74
101
Constructo número 686, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS) Figura 75
102
ApaI-H1B.c
103
StuI-H2B.r
104
Constructo 732, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 76
105
Constructo número 733, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 77
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
106
ApaI-H3B.c
107
StuI-H3B.r
108
Constructo número 735, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 78
109
Constructo número 736, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 79
110
ApI-HBF.c
111
StuI-HBF.r
112
Constructo número 738, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 80
113
Constructo número 739, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 81
114
Secuencia de codificación de Msj1 de M. Sativa Figura 82
115
Hsp-40Luz.lc
116
Hsp40Luz-SacI.1272r
117
Hsp40Luz-Plasto.r
118
Hsp70Ara-SacI.1956r
119
Hsp70Ara-Plasto.r
120
Constructo número 739, de PacI (secuencia arriba del promotor 35S) hasta AscI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS).
121
Constructo número R850, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 83
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
122
Constructo número R860, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS) Figura 84
123
Constructo número R870, de HindIII (en el sitio de clonación múltiple, secuencia arriba del promotor) hasta EcoRI (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). Figura 85
124
supP19-plasto.r
125
supP19-1c
126
SupP19-SacI.r
127
Secuencia de nucleótidos del casete de expresión basado en CPMV-HT para H1 de A/California/04/09 (casete número 560). Figura 92A
128
Secuencia de aminoácidos de H1 de A/California/04/09 Figura 92B
129
Promotor 2x35S Figura 93
130
cebador PacI-MCS-2X35S.c
131
cebador CPMV 5’UTR-2X35S.r
132
cebador 2X35S-CPMV 5’UTR.c
133
cebador ApaI-M prot.r
134
vector intermediario 972 Figura 94
135
H1 de A/California/4/2009 Figura 95
136
porción de CPMV M (sitio de restricción de DraIII hasta ApaI), péptido señal de PDISP de alfalfa,HA0 de hemaglutinina de A/California/4/2009 con el sitio de restricción SacI y StuI mutado Figura 96
137
Fragmento 1 Figura 97
(continuación)
SEQ ID No.
Descripción de la secuencia En la divulgación
138
Fragmento 2 Figura 97
139
Fragmento 3 Figura 97
140
cebador DraIII-MProt#2.c
141
cebador H1 Cal.390r
142
cebador H1 Cal.310c
143
cebador H1 Cal.1159r
144
cebador H1 Cal.1081c
145
cebador StuI-H1 Cal.r
146
SpPDI-H1 A/California/4/2009 (en el casete de expresión 2X35S/ CPMV-HT) constructo 560 Figura 98
La invención se describirá ahora en detalle a modo de referencia sólo para los siguientes ejemplos no limitativos.
5 Métodos y materiales
1. Montaje de casetes de expresión con base en plastocianina para HA nativa
Todas las manipulaciones se realizaron utilizando los protocolos generales de biología molecular de Sambrook y Russell (2001; que se incorpora aquí como referencia). La primera etapa de clonación consistió en el montaje de un plásmido receptor que contiene elementos reguladores secuencia arriba y secuencia abajo del gen de plastocianina 10 de alfalfa. El promotor de plastocianina y las secuencias 5'UTR fueron amplificados a partir de ADN genómico de alfalfa usando los cebadores de oligonucleótidos XmaI-pPlas.c (SEQ ID NO: 29; Figura 10Q) y SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30; Figura 10R). El producto de amplificación resultante fue digerido con XmaI y SacI y se ligó en pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Australia), previamente digerido con las mismas enzimas, para crear el pCAMBIApromoPlasto. Del mismo modo, se amplificaron las secuencias 3'UTR y el terminador del gen de
15 plastocianina a partir del ADN genómico de alfalfa utilizando los siguientes cebadores: SacI-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31; Figura 10S) y EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32; Figura 10T), y se digirió el producto con SacI y EcoRI antes de ser insertado en los mismos sitios de pCAMBIApromoPlasto para crear pCAMBIAPlasto.
Se sintetizó un fragmento que codifica la hemaglutinina de la cepa de la influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1; Acc. No. LANL ISDN125873) mediante Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, EE.UU). El fragmento producido, que contiene la 20 región de codificación completa de H5 incluyendo el péptido señal nativo flanqueado por un sitio HindIII
inmediatamente secuencia arriba del ATG inicial, y un sitio SacI inmediatamente secuencia abajo del codón de detención (TAA), se presenta en la SEQ ID NO: 3 ( Figura 6). Se clonó la región codificante de H5 en un casete de expresión basado en plastocianina por el método de ligadura basado en PCR presentado en Darveau et al. (1995). En resumen, se obtuvo una primera amplificación por PCR usando los cebadores Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 5 7A) y SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 5; Figura 7B) y pCAMBIApromoPlasto como plantilla. En forma paralela, se llevó a cabo una segunda amplificación con los cebadores Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO: 6; Figura 7C) y HA(Ind)Sac.r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) con el fragmento de codificación de H5 como plantilla. Se mezcló la amplificación obtenida a partir de ambas reacciones y la mezcla sirvió como plantilla para una tercera reacción (reacción de ensamblaje) usando Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) como
10 cebadores. El fragmento resultante se digirió con BamHI (en el promotor de plastocianina) y SacI (en el extremo 3' del fragmento) y se clonó en pCAMBIAPlasto previamente digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante, denominado 660, se presenta en la Figura 2B (véase también la Figura 11).
Se ensamblaron los casetes de expresión de hemaglutinina números 774 a 785 de la siguiente manera. Se sintetizó un fragmento sintético que comprende la secuencia de codificación completa de la hemaglutinina (desde ATG hasta
15 detención) flanqueado en 3' por las secuencias del gen de plastocianina de alfalfa correspondientes a los primeros 84 nucleótidos secuencia arriba del ATG de plastocianina y terminando con un sitio de restricción DraIII. Los fragmentos sintéticos también comprendían un sitio SacI inmediatamente después del codón de detención.
Los fragmentos sintéticos de hemaglutinina fueron sintetizados por Top Gen Technologies (Montreal, QC, Canadá), Epoch Biolabs (Sugar Land, TX, EE.UU.). Los fragmentos sintetizados se representan en las Figuras 28 a 39 y
20 corresponden a la SEQ ID NO: 36 hasta la SEQ ID NO: 47. Para el montaje de los casetes de expresión completos, se digirieron los fragmentos sintéticos con DraIII y SacI y se clonaron en pCAMBIAPlasto previamente digeridos con las mismas enzimas. La Tabla 6 presenta los casetes producidos con el correspondiente HA y otras referencias en el texto.
Tabla 6: Casetes de expresión de hemaglutinina ensamblados a partir de fragmentos sintéticos de DraIII -Sacl
Número de casete
HA correspondiente Fragmento sintético Casete completo
Figura
SEQ ID NO del fragmento sintético Figura SEQ ID NO del casete final
774
HA de A/Brisbane/59/2007 (H1N1) 28 36 53 62
775
HA de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1) 29 37 54 63
776
HA de A/Brisbane 10/2007 (H3N2) 30 38 60 69
777
HA de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) 31 39 61 70
778
HA de B/Malasia/2506/2004 32 40 63 72
779
HA de B/Florida/4/2006 33 41 64 73
780
HA de A/Singapur/1/57 (H2N2) 34 42 55 64
781
HA de A/Anhui/1/2005 (H5N1) 35 43 56 65
782
HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) 36 44 57 66
783
HA de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) 37 45 58 67
784
HA de A/Equino/Praga/56 (H7N7) 38 46 62 71
785
HA de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) 39 47 59 68
Montaje de casetes de expresión de fusión de PDISP/HA con base en plastocianina H1 de A/Nueva Caledonia/20/99 (número del constructo 540)
El marco de lectura abierto del gen para H1 de la cepa de influenza A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) se sintetizó en dos fragmentos (Plant Biotechnology Institute, National Research Council, Saskatoon, Canadá). Un primer fragmento sintetizado corresponde a la secuencia de codificación de H1 de tipo silvestre (GenBank acceso No. AY289929; SEQ ID NO: 33; Figura 16) que carece de la secuencia de codificación del péptido señal en el extremo 5' y la secuencia de codificación del dominio transmembrana en el extremo 3'. Se añadió un sitio de restricción BglII en el extremo 5' de la secuencia de codificación y un sitio dual SacI/StuI inmediatamente secuencia abajo del codón de detención en el extremo del terminal 3’ del fragmento, para producir la SEQ ID NO: 1 (Figura 5A). También se sintetizó un segundo fragmento que codifica el extremo del terminal C de la proteína H1 (que comprende un dominio transmembrana y una cola citoplasmática) desde el sitio KpnI hasta el codón de detención, y flanqueado en 3' por sitios de restricción SacI y StuI (SEQ ID NO: 2; Figura 5B).
El primer fragmento H1 fue digerido con BglII y SacI y se clonó en los mismos sitios de un vector binario (pCAMBIAPlasto) que contiene el promotor de plastocianina y 5'UTR fusionado al péptido señal del gen para la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa (PDI) (nucleótidos 32 -103; acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) dando como resultado un gen quimérico PDI-H1 corriente abajo de los elementos reguladores de plastocianina. La secuencia del casete a base de plastocianina que contiene el péptido señal de PDI se presenta en la Figura 1 (SEQ ID NO: 8). El plásmido resultante contenía la región de codificación de H1 fusionada al péptido señal PDI y flanqueado por elementos reguladores de plastocianina. La adición de la región de codificación del extremo del terminal C (que codifica el dominio transmembrana y la cola citoplasmática) se obtuvo mediante la inserción del fragmento sintetizado (SEQ ID NO: 2; Figura 5B) previamente digerido con KpnI y SacI, en el plásmido de expresión de H1. El plásmido resultante, denominado 540, se presenta en la Figura 11 (véase también la Figura 2A).
H5 de A/Indonesia/5/2005 (constructo número 663)
El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDISP) (nucleótidos 32 -103; Acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) estaba enlazado a la secuencia de codificación de HA0 de H5 de A/Indonesia/5/2005 de la siguiente forma. Se amplificó la secuencia de codificación de H5 con los cebadores SpPDI-HA(Ind).c (SEQ ID NO: 82) y HA(Ind)-SacI.r (SEQ ID NO: 7; Figura 7D) utilizando el constructo número 660 (SEQ ID NO: 60; Figura 51) como plantilla. El fragmento resultante consistía en la secuencia de codificación de H5 flanqueada, en 5', por los últimos nucleótidos que codifican PDISP (incluyendo un sitio de restricción BglII), y en 3', por un sitio de restricción SacI. El fragmento fue digerido con BglII y SacI y se clonó dentro del constructo número 540 (SEQ ID NO: 61; Figura 52) previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. El casete final, número llamado constructo número 663 (SEQ ID NO: 83), se presenta en la Figura 69.
H1 de A/Brisbane/59/2007 (constructo 787)
El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDISP) (nucleótidos 32 -103; Acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) estaba enlazado a la secuencia de codificación de H1 de A/Brisbane HA0/59/2007 de la siguiente forma. La secuencia de codificación H1 se amplificó con los cebadores SpPDI-H1B.c (SEQ ID NO: 84) y SacI-H1B.r (SEQ ID NO: 85) utilizando la construcción de 774 (SEQ ID NO: 62; Figura 53) como plantilla. El fragmento resultante consistía en la secuencia de codificación flanqueada H1, en 5', por los últimos nucleótidos que codifican PDISP (incluyendo un sitio de restricción BglII), y en 3', por un sitio de restricción SacI. El fragmento fue digerido con BglII y SacI y se clonó en número constructo 540 (SEQ ID NO: 61; Figura 52) previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. El casete final, número llamado constructo 787 (SEQ ID NO: 86), se presenta en la Figura 70.
H3 de A/Brisbane/10/2007 (constructo número 790)
El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDISP) (nucleótidos 32 a 103; Acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) estaba enlazado a la secuencia de codificación de HA0 de H3 de A/Brisbane HA0/10/2007 de la siguiente forma. PDISP estaba enlazado a la secuencia de codificación de H3 por el método de ligadura basado en PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)). En una primera ronda de PCR, se amplificó un segmento del promotor de plastocianina fusionado a PDISP usando los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y H3B-SpPDI.r (SEQ ID NO: 87) con el constructo 540 (SEQ ID NO: 61; Figura 52) como plantilla. En forma paralela, se amplificó otro fragmento que contiene una porción de la secuencia de codificación de H3 de A/Brisbane/10/2007 (desde el codón 17 hasta el sitio de restricción SpeI) con cebadores SpPDI-H3B.c (SEQ ID NO: 88) y H3( A-Bri).982r (SEQ ID NO: 89) utilizando el constructo 776 (SEQ ID NO: 69; Figura 60) como plantilla. Se mezclaron luego los productos de amplificación y se usaron como plantilla para una segunda ronda de amplificación (reacción de ensamblaje) con cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y H3(A-Bri).982r (SEQ ID NO: 89). El fragmento resultante se digirió con BamHI (en el promotor de plastocianina) y SpeI (en la secuencia de codificación de H3) y se clonó en el constructo número 776 (SEQ ID NO: 69; Figura 60), previamente digerido con las mismas enzimas de restricción para producir el constructo número 790 (SEQ ID NO: 90). El constructo se presenta en la Figura 71.
HA de B/Florida/4/2006 (constructo número 798)
El péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDISP) (nucleótidos 32 -103; Acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) estaba enlazado a la secuencia de codificación de HA0 de HA de B/Florida/4/2006 por el método de ligación basado en la PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)). En una primera ronda de amplificación, se amplificó una porción del promotor de plastocianina fusionado a la PDISP usando los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y HBF-SpPDI.r (SEQ ID NO: 91) con un constructo número 540 (SEQ ID NO: 61; Figura 52) como plantilla. En forma paralela, se amplificó otro fragmento que contiene una porción de la secuencia de codificación de HB B/Flo fusionada con el terminador de plastocianina con los cebadores SpPDI-HBF.c (SEQ ID NO: 92) y Plaster80r (SEQ ID NO: 93) utilizando el constructo número 779 (SEQ ID NO: 73; Figura 64) como plantilla. Los productos de la PCR se mezclaron a continuación y se utilizaron como plantilla para una segunda ronda de amplificación (reacción de ensamblaje) con cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y Plaster80r (SEQ ID NO: 93). El fragmento resultante se digirió con BamHI (en el promotor de plastocianina) y AflII (en la secuencia d codificación de HA de B/Florida/4/2006) y se clonó en el constructo número 779 (SEQ ID NO: 73; Figura 64), previamente digerido con la mismas enzimas de restricción para producir el constructo número 798 (SEQ ID NO: 94). El casete de expresión resultante se presenta en la Figura 72.
Montaje de casetes de expresión con base en CPMV-HT
Los casetes de expresión CPMV-HT utilizan el promotor 35S para controlar la expresión de un ARNm que comprende una secuencia de codificación de interés flanqueada, en 5' por los nucleótidos 1 -512 del ARN2 del virus del mosaico del caupí (CPMV) con ATG mutado en las posiciones 115 y 161 y en 3', por los nucleótidos 3.330
3.481 del ARN2 del CPMV (correspondientes a la 3' UTR), seguido por el terminador NOS. Se utilizó el plásmido pBD-CS-1LC, (Sainsbury et al. 2008; Plant Biotechnology Journal. 6: 82 -92 y la publicación PCT WO 2007/135480), para el montaje de casetes de expresión de hemaglutinina basados en CPMV-HT. La mutación de ATG en la posición 115 y 161 del ARN2 del CPMV se realizó utilizando un método de ligación basado en la PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)). Se llevaron a cabo dos PCR independientes usando PBD-C5-1LC como plantilla. Los cebadores para la primera amplificación son pBinPlus.2613c (SEQ ID NO: 77) y Mut-ATG115.r (SEQ ID NO: 78). Los cebadores para la segunda amplificación fueron Mut-ATG161.c (SEQ ID NO: 79) y LC-C5-1.110r (SEQ ID NO: 80). Los dos fragmentos obtenidos se mezclan a continuación y se utiliza como plantilla para la tercera amplificación utilizando pBinPlus.2613c (SEQ ID NO: 77) y LC-C5-1.110r (SEQ ID NO: 80) como cebadores. El fragmento resultante se digiere con Pacl y Apal y se clona dentro de PBD-C5-1LC digerido con la misma enzima. La secuencia del casete de expresión generado, llamado 828, se presenta en la Figura 68 (SEQ ID NO: 81).
Montaje de SpPDI-H1 de A/Nueva Caledonia/20/99 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 580).
Se clonó una secuencia que codifica el péptido señal PDI de alfalfa fusionado a HA0 de H1 de A/Nueva Caledonia/20/99 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG inicial) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) y StuI-H1(A -NC).r (SEQ ID NO: 96) utilizando el constructo número 540 (SEQ ID NO: 61; Figura 52) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con las enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 580 (SEQ ID NO: 97).
Montaje de SpPDI-H1 de A/California/4/2009 en el casete de expresión de 2X35S/CPMV-HT (constructo número 560)
Se clonó un fragmento que codifica el péptido señal PDI de alfalfa fusionado a HA0 de H1 de A/California/4/2009 en 2X35S-CPMV-HT de la siguiente manera.
En primer lugar se creó un vector intermediario que contiene el promotor 2X35S en el casete de expresión de CPMV-HT en reemplazo del promotor 35S utilizado anteriormente. Se realizó el cambio de promotor mediante el método de ligación basado en la PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)). Se amplificó un primer fragmento que contiene el promotor 2X35S de la SEQ ID NO: 129 (Figura 93) por PCR con los cebadores:
Pacl-MCS-2X35S.c (SEQ ID NO130):
AATTGTTAATTAAGTCGACAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCAAC
y CPMV 5'UTR-2X35S.r: (SEQ ID NO: 131):
TCAAAACCTATTAAGATTTTAATACCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC
usando un plásmido que contiene el promotor 2X35S como plantilla. En forma paralela, se realizó una segunda PCR
con los cebadores: 2X35S-CPMV 5'UTR.c (SEQ ID NO: 132): TTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGG y Apal-M prot.r (SEQ ID NO: 133): TCTCCATGGGCCCGACAAATTTGGGCAGAATATACAGAAGCTTA usando el constructo 685 (SEQ ID NO: 100; Figura 74) como plantilla. Se mezclaron luego los dos fragmentos
obtenidos y se usaron como plantilla para una segunda ronda de PCR (reacción de montaje) utilizando cebadores PacI-MCS-2X35S.c (SEQ ID NO: 130) y Apal-M prot.r (SEQ ID NO: 133). Se digirió luego el fragmento resultante con Pacl y Apal y se clonó en el constructo 685 (SEQ ID NO: 100; Figura 74) digerido con las mismas enzimas de restricción. La secuencia del vector intermediario, llamado 972 (SEQ ID NO: 134), se presenta en la Figura 94.
Se obtuvo la secuencia nativa de H1 de A/California/4/2009 de la base de datos GISAID (número de acceso EPI176470) y se presenta en la Figura 95 (SEQ ID NO: 135). Una secuencia de nucleótidos que comprende una porción de la proteína M del CPMV (en el casete de expresión de CPMV-HT) desde el sitio de restricción DraIII hasta Apal junto con el péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa de la alfalfa (PDISP) (nucleótidos 32 -103; Acceso No. Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17) y HA0 de la hemaglutinina de A/California/4/2009 con el sitio de restricción mutado de SacI y StuI se presentan en la Figura 96 (SEQ ID NO: 136). Se sintetizó la secuencia mediante DNA2.0 (Menlo Park, CA, EE.UU.) en tres fragmentos diferentes. Se ensamblaron el fragmento 1 (SEQ ID NO: 137; Figura 97), 2 (SEQ ID NO: 138; Figura 97) y 3 (SEQ ID NO: 139; Figura 97) utilizando el método de ligación basado en la PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)). En una primera ronda de amplificación, se hicieron tres PCR diferentes. El primer fragmento se amplificó usando el cebador:
DraIII-MProt # 2.c (SEQ ID NO: 140) ATGCTAATATCACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCC y H1 Cal.390r (SEQ ID NO: 141) GCTTAATTGCTCTCTTAGCTCCTCATAATCGATGAAATCTCC usando el vector pJ201 (vector DNA2.0 patentado) que contiene el fragmento 1 (SEQ ID NO: 139) como plantilla. El
segundo fragmento se amplificó usando los cebadores: H1 Cal.310c (SEQ ID NO: 142) TGGAAACACCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAG y H1 Cal.1159r (SEQ ID NO: 143) CTGCATATCCTGACCCCTGCTCATTTTGATGGTGATAACCGT utilizando el vector pJ201 (vector ADN2.0 patentado) que contiene el fragmento 2 (SEQ ID NO: 138) como plantilla.
Finalmente, se amplificó el último fragmento usando los cebadores: H1 Cal.1081c (SEQ ID NO: 144) TTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTT y StuI-H1 Cal.r (SEQ ID NO: 145) TATTAGGCCTTTAAATACATATTCTACACTGTAGAGACCCATTAG usando el vector pJ201 (vector DNA2.0 patentado) que contiene el fragmento 3 (SEQ ID NO139) como plantilla. En
una segunda ronda de PCR (reacción de ensamblaje), se mezclaron luego los tres fragmentos de amplificación y se utilizaron como plantilla con cebadores DraIII-MProt # 2.c (SEQ ID NO: 140) y StuI-H1 Cal.r (SEQ ID NO: 145). Se digirió el fragmento resultante con DraIII y StuI y se insertó en el constructo 972 (SEQ ID NO: 134) digerido con las mismas enzimas de restricción. La secuencia de nucleótidos del constructo resultante se denominó 560 (SEQ ID NO: 146; Figura 98).
Montaje de H5 de A/Indonesia/5/2005, en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 685).
Se clonó la secuencia de codificación de H5 de A/Indonesia/5/2005 en CPMV-HT como sigue. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores ApaI-H5 (A-Indo).1C (SEQ ID NO: 98) y H5 (A-Indo)-StuI.1707r (SEQ ID NO: 99) utilizando el constructo número 660 (SEQ ID NO: 60; Figura 51) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 685 (SEQ ID NO: 100).
Montaje de SpPDI-H5 de A/Indonesia/5/2005, en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 686).
Se clonó una secuencia que codifica el péptido señal PDI de alfalfa fusionado a HA0 de H5 de A/Indonesia/5/2005 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores ApaI-SpPDl.c (SEQ ID NO: 95) y H5 (A-Indo)-StuI.1707r (SEQ ID NO: 99) utilizando el constructo número 663 (SEQ ID NO: 83) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 686 (SEQ ID NO: 101).
Montaje de H1 de A/Brisbane/59/2007 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 732).
Se clonó la secuencia de codificación de HA de H1 de A/Brisbane/59/2007 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores ApaI-H1B.c (SEQ ID NO: 102) y StuI-H1B.r (SEQ ID NO: 103) usando el constructo número 774 (SEQ ID NO: 62; Figura 53) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 732 (SEQ ID NO: 104).
Montaje de SpPDI-H1 de A/Brisbane/59/2007 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 733).
Se clonó una secuencia que codifica péptido el péptido PDI de alfalfa fusionado a HA0 de H1 de A/Brisbane/59/2007 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores Apal-SpPDl.c (SEQ ID NO: 95) y StuI-H1B.r (SEQ ID NO: 103) usando el constructo número 787 (SEQ ID NO: 86) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 733 (SEQ ID NO: 105).
Montaje de H3 de A/Brisbane/10/2007 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 735).
Se clonó la secuencia de codificación de HA de H3 de A/Brisbane/10/2007 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores ApaI-H3B.c (SEQ ID NO: 106) y StuI-H3B.r (SEQ ID NO: 107) usando el constructo número 776 (SEQ ID NO: 69) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 735 (SEQ ID NO: 108).
Montaje de SpPDI-H3 de A/Brisbane/10/2007 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 736).
Se clonó una secuencia que codifica al péptido señal PDI de alfalfa fusionado a HA0 de H3 de A/Brisbane/10/2007 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores Apal-SpPDl.c (SEQ ID NO: 95) y StuI-H3B.r (SEQ ID NO: 107) usando el constructo número 790 (SEQ ID NO: 90) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó número constructo 736 (SEQ ID NO: 109).
Montaje de HA de B/Florida/4/2006 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 738).
Se clonó la secuencia de codificación de HA de B/Florida/4/2006 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores Apal-HBF.c (SEQ ID NO: 110) y StuI-HBF.r (SEQ ID NO: 111) usando el constructo número 779 (SEQ ID NO: 73; Figura 64) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y
StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 738 (SEQ ID NO: 112).
Montaje de SpPDI-HA de B/Florida/4/2006 en el casete de expresión de CPMV-HT (constructo número 739).
Se clonó una secuencia que codifica el péptido señal PDI de la alfalfa fusionada a HA0 de B/Florida/4/2006 en CPMV-HT de la siguiente manera. Se añadieron los sitios de restricción Apal (inmediatamente secuencia arriba de ATG) y StuI (inmediatamente secuencia abajo del codón de detención) a la secuencia de codificación de hemaglutinina mediante la realización de una amplificación por PCR con cebadores ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) y hemaglutinina StuI-HBF.r (SEQ ID NO: 111) usando el constructo número 798 (SEQ ID NO: 94) como plantilla. Se digirió el fragmento resultante con enzimas de restricción Apal y StuI y se clonó en el constructo número 828 (SEQ ID NO: 81) digerido con las mismas enzimas. El casete resultante se denominó constructo número 739 (SEQ ID NO: 113).
Montaje de casetes de expresión de chaperonas
Se ensamblaron dos casetes de expresión de proteína de choque térmico (Hsp). En un primer casete, se controla la expresión de la HSP70 citosólica de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) (Athsp70-1 en Lin et al. (2001) Cell Stress and Chaperones 6: 201 -208) mediante un promotor quimérico que combina elementos de los promotores de la nitrito reductasa de la alfalfa (Nir) y Plastocianina de la alfalfa (Nir/Plasto). Se ensambló también un segundo casete que comprende la región de codificación de la HSP40 citosólica de alfalfa (MsJ1; Frugis et al. (1999) Plant Molecular Biology 40: 397 -408) bajo el control del promotor quimérico Nir/Plasto.
Se ensambló primero un plásmido aceptor que contiene el promotor de nitrito reductasa de la alfalfa (Nir), el gen reportero GUS y el terminador NOS en el vector binario de la planta. Se digirió el plásmido pNir3K51 (descrito previamente en la patente de Estados Unidos No. 6.420.548) con HindIII y EcoRI. Se clonó el fragmento resultante en pCAMBIA2300 (Cambia, Canberra, Australia) digerido por la misma enzima de restricción para producir pCAMBIA-Nir3K51.
Se clonaron las secuencias de codificación para Hsp70 y Hsp40 por separado en el plásmido aceptor pCAMBIANir3K51 por el método de ligación basado en la PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)).
Para Hsp40, se amplificó la secuencia de codificación Msj 1 (SEQ ID NO: 114) por RT-PCR a partir de ARN total de hoja de la alfalfa (ecotipo Rangelander) usando cebadores Hsp40Luz.1c (SEQ ID NO: 115) y Hsp40Luz-SacI.1272r (SEQ ID NO: 116). Se llevó a cabo una segunda amplificación con los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y Hsp40Luz-Plasto.r (SEQ ID NO: 117) con el constructo 660 (SEQ ID NO: 60; Figura 51) como plantilla. Se mezclaron luego los productos de la PCR y se usaron como plantilla para una tercera amplificación (montaje de reacción) con los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y Hsp40Luz-SacI.1272r (SEQ ID NO: 116). Se digirió el fragmento resultante con Hpal (en el promotor de plastocianina) y se clonó en pCAMBIANir3K51, previamente digerido con Hpal (en el promotor Nir) y SacI, y se presentó con T4 ADN polimerasa para generar extremos romos. Se seleccionaron los clones obtenidos para la orientación correcta y se secuenciaron para la integridad de secuencia. El plásmido resultante, denominado R850, se presenta en la Figura 83 (SEQ ID NO: 121). Se amplificó la región de codificación de la Athsp70-1 por RT-PCR a partir del ARN de la hoja de Arabidopsis usando los cebadores Hsp70Ara.1c (SEQ ID NO: 118) y Hsp70Ara-SacI.1956r (SEQ ID NO: 119). Se llevó a cabo una segunda amplificación con los cebadores Plato-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y Hsp70Ara-Plasto.r (SEQ ID NO: 120) con el constructo 660 (SEQ ID NO: 60; Figura 51) como plantilla. Se mezclaron luego los productos de la PCR y se usaron como plantilla para una tercera amplificación (montaje de reacción) con los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y Hsp70ARA-SacI.1956r (SEQ ID NO: 119). Se digirió el fragmento resultante con Hpal (en el promotor de plastocianina) y se clonó en pCAMBIANir3K51 digerido con Hpal (en el promotor Nir) y SacI y se presentó con T4 ADN polimerasa para generar extremos romos. Se seleccionaron los clones obtenidos para la orientación correcta y se secuenciaron para la integridad de secuencia. El plásmido resultante, denominado R860, se presenta en la Figura 84 (SEQ ID NO: 122).
Se ensambló un plásmido de expresión dual Hsp de la siguiente forma. Se digirió R860 con BsrBl (secuencia abajo del terminador NOS), se lo trató con T4 ADN polimerasa para generar un extremo romo, y se digirió con Sbfl (secuencia arriba del promotor quimérico NIR/Plasto). Se clonó el fragmento resultante (promotor quimérico Nir/Plasto -secuencia de codificación HSP70 -terminador Nos) en R850 previamente digerido con Sbfl y SmaI (ambos localizados en el sitio de clonación múltiple secuencia arriba del promotor quimérico Nir/Plasto). El plásmido resultante, denominado R870, se presenta en la Figura 85 (SEQ ID NO: 123).
Montaje de otros casetes de expresión
Casete de expresión de H1 soluble
El casete que codifica la forma soluble de H1 se preparó mediante el reemplazo de la región que codifica para el dominio transmembrana y la cola citoplasmática en 540 por un fragmento que codifica la variante de la cremallera de leucina GCN4 pll (Harbury et al., 1993, Science 1993; 262: 1401 -07). Este fragmento se sintetizó con los sitios de flanqueo KpnI y SacI para facilitar la clonación. El plásmido resultante de este reemplazo fue denominado 544 y el casete de expresión se ilustra en la Figura 11.
Casete de expresión de M1 de A/Puerto Rico/8/34/
Se sintetizó una fusión entre la 5'UTR del virus del grabado del tabaco (TEV) y el marco de lectura abierto del gen M1 de la influenza A/PR/8/34 (Acceso # N_002016) con un sitio de flanqueo SacI añadió secuencia abajo del codón de detención. Se digirió el fragmento con Swal (en la 5'UTR del TEV) y SacI, y se clonó en un casete de expresión basado en 2X35S/TEV en un plásmido binario pCAMBIA. El plásmido resultante horada la región de codificación de M1 bajo el control de un promotor 2X35S/TEV y 5'UTR y el terminador NOS (constructo 750; Figura 11).
Casete de expresión de HcPro
Se preparó un constructo HcPro (35HcPro) como se describe en Hamilton et al. (2002). Se secuenciaron todos los clones para confirmar la integridad de los constructos. Se usaron los plásmidos para transformar Agrobacterium tumefaciens AGL1 (AGL1; ATCC, Manassas, VA 20108, EE.UU.) mediante electroporación (Mattanovich et al., 1989). Se confirmó la integridad de todas las cepas de A. tumefaciens mediante mapeo de restricción.
Casete de expresión de P19
Se enlazó la secuencia de codificación de la proteína p19 del virus del enanismo arbustivo del tomate (TBSV) con el casete de expresión de la plastocianina de alfalfa por el método de ligación basado en la PCR presentado en Darveau et al. (Methods in Neuroscience 26: 77 -85 (1995)). En una primera ronda de PCR, se amplificó un segmento del promotor de plastocianina usando los cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y supP19plasto.r (SEQ ID NO: 124) con el constructo 660 (SEQ ID NO: 60; Figura 51) como plantilla. En forma paralela, se amplificó otro fragmento que contiene la secuencia de codificación de p19 con los cebadores supP19-1c (SEQ ID NO: 125) y SupP19-SacI.r (SEQ ID NO: 126) usando el constructo 35S:p19 como se describe en Voinnet et al. (The Plant Journal 33: 949 -956 (2003)) como plantilla. Se mezclaron luego los productos de amplificación y se utilizaron como plantilla para una segunda ronda de amplificación (montaje de reacción) con cebadores Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; Figura 7A) y SupP19-SacI.r (SEQ ID NO: 126). Se digirió el fragmento resultante con BamHI (en el promotor de plastocianina) y SacI (al final de la secuencia de codificación de p19) y se clonó en el constructo número 660 (SEQ ID NO: 60; Figura 51), previamente digerido con las mismas enzimas de restricción para producir el constructo número R472. El plásmido R472 se presenta en la Figura 86.
3. Preparación de la biomasa vegetal, el inóculo, la agroinfiltración, y la cosecha
Se cultivaron plantas de Nicotiana benthamiana o de Nicotiana tabacum a partir de las semillas en suelos llenos con un sustrato comercial de musgo de turba. Se permitió que crecieran las plantas en el invernadero bajo un fotoperíodo de 16/8 y un régimen de temperatura de 25 ºC durante el día / 20 ºC durante la noche. Tres semanas después de la siembra, se recolectaron las plántulas individuales, se trasplantaron en macetas y se dejaron crecer en el invernadero durante tres semanas adicionales en las mismas condiciones ambientales. Antes de la transformación, se removieron los brotes apicales y axilares en diversos momentos como se indica a continuación, ya sea pellizcando los brotes de la planta, o por tratamiento químico de la planta.
Se cultivaron agrobacterias transfectadas con cada constructo en un medio YEB suplementado con ácido 2-[Nmorfolino]etanosulfónico (MES) 10 mM, acetosiringona 20 µM, 50 µg/ml de kanamicina y 25 µg/ml de carbenicilina pH 5,6 hasta que alcanzaron una DO600 entre 0,6 y 1,6. Se centrifugaron las suspensiones de Agrobacterium antes de usarlas y se resuspendieron en medio de infiltración (MgCl2 10 mM y MES 10 mM, pH 5,6). Se llevó a cabo una infiltración con jeringa como lo describen Liu y Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105: 343 -348). Para la infiltración al vacío, se centrifugaron suspensiones de A. tumefaciens, se resuspendieron en el medio de infiltración y se almacenaron durante la noche a 4 ºC. En el día de la infiltración, se diluyeron los lotes de cultivo en 2,5 volúmenes de cultivo y se dejaron calentar antes de su uso. Se colocaron plantas enteras de N. benthamiana o
N. tabacum boca abajo en la suspensión bacteriana en un tanque de acero inoxidable hermético bajo un vacío de 20 -40 Torr durante 2 min. Después de la infiltración con jeringa o al vacío, se devolvieron las plantas al invernadero durante un período de incubación de 2 -6 días hasta la cosecha. A menos que se especifique lo contrario, todas las infiltraciones se realizaron como una co-infiltración con AGL1/35S-HCPro en una proporción de 1:1, a excepción de las cepas que tienen un casete de CPMV-HT que fueron co-infiltradas con la cepa AGL1/R472 en una proporción de
1:1.
4. Muestreo de hojas y la extracción de la proteínas total
Después de la incubación, se cosechó la parte aérea de las plantas, se congeló a -80 ºC, moliendo en trozos. Se
extrajeron las proteínas solubles totales mediante homogeneización (Polytron) de cada muestra de material vegetal triturada y congelada en 3 volúmenes de Tris 50 mM frío, pH 7,4, NaCl 0,15 M, y fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM. Después de la homogeneización, se centrifugaron las suspensiones a 20.000 g durante 20 min a 4 ºC y se conservaron estos extractos crudos clarificados (sobrenadante) para los análisis. Se determinó el contenido total de proteínas de los extractos crudos clarificados por el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) usando albúmina de suero bovino como patrón de referencia.
5.
Cromatografía de exclusión por tamaño del extracto de proteína
Se empacaron y equilibraron las columnas de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de 32 ml de SephacrylMR S-500 de perlas de alta resolución (S-500 HR: GE Healthcare, Uppsala, Suecia, Cat. No. 17-0613-10), con amortiguador de equilibrado/elución (Tris 50 mM pH 8, NaCl 150 mM). Se cargaron 1,5 ml de extracto de proteína cruda en la columna seguido por una etapa de elución con 45 ml de amortiguador equilibrado / elución. Se recolectó la elución en fracciones de 1,5 ml, se controló el contenido relativo de proteína de las fracciones eluidas mediante la mezcla de 10 µL de la fracción con 200 µL de reactivo colorante diluido de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Se lavó la columna con 2 volúmenes de columna de NaOH 0,2 N seguido por 10 volúmenes de columna de Tris 50 mM pH 8, NaCl 150 mM, etanol al 20%. Cada separación fue seguida por una calibración de la columna con Azul Dextrano 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EE.UU.). Se compararon los perfiles de elución de Azul Dextrano 2000 y las proteínas huésped solubles entre cada separación para asegurar la uniformidad de los perfiles de elución entre las columnas utilizadas.
6.
Análisis de proteína e inmunotransferencias
Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de proteína BCA (Pierce Bioquímicos, Rockport IL). Se separaron las proteínas por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y se tiñeron con Azul de Coomassie. Se escanearon los geles teñidos y se realizó un análisis de densitometría usando el software ImageJ (NIH).
Se precipitaron las proteínas de la fracción de la elución a partir de SEC con acetona (Bollag et al., 1996), se resuspendieron en 1/5 de volumen en amortiguador de equilibrado / elución y se separaron por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y se electrotransfirieron sobre membranas de difluoruro de polivinileno (PVDF) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN) para la inmunodetección. Antes de la inmunotransferencia, se bloquearon las membranas con leche desnatada al 5% y Tween-20 al 0,1% en solución salina amortiguada con Tris (TBS-T) durante 16-18h en4 ºC.
Se realizó la inmunotransferencia mediante incubación con un anticuerpo adecuado (Tabla 6), en 2 µg/ml en leche desnatada al 2% en TBS-Tween 20 al 0,1%. Los anticuerpos secundarios utilizados para la detección de quimioluminiscencia fueron como se indican en la Tabla 4, se diluyó como se indicó en leche descremada al 2% en TBS-Tween 20 al 0,1%. Se detectaron los complejos inmunorreactivos mediante quimioluminiscencia utilizando luminol como el sustrato (Roche Diagnostics Corporation). Se llevó a cabo la conjugación de la enzima de peroxidasa de rábano picante de anticuerpo IgG humana mediante el uso del kit de conjugación de peroxidasa activada EZ-Link Plus® (Pierce, Rockford, IL). Los virus completos inactivados (WIV), que se utilizaron como controles de detección para los subtipos H1, H3 y B, fueron adquiridos al Instituto Nacional de Estándares Biológicos y de Control (NIBSC).
Tabla 6: Condiciones de electroforesis, anticuerpos y diluciones para inmunotransferencia de proteínas expresadas.
Subtipo HA
Cepa de influenza Condición de la electroforesis Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario Dilución
H1
A/California/0 4/09 (H1N1) Reductora FII 10-I50F 4 µg/ml Antirratón de cabra (JIR 115-035-146) 1:10 000
H1
A/Brisbane/59 /2007 (H1N1) Reductora FII 10-I50 4 µg/ml Antirratón de cabra (JIR 115-035-146) 1:10 000
H1
A/Islas Salomón/3/ 2006 (H1N1) Reductora NIBSC 07/104 1:2000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H1
A/Nueva Caledonia/ 20/ 99 (H1N1) Reductora FII 10-I50 4 µg/ml Antirratón de cabra (JIR 115-035-146) 1:10 000
H2
A/Singapur/1 /57 (H2N2) No reductora NIBSC 00/440 1:1000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
(continuación)
Subtipo HA
Cepa de influenza Condición de la electroforesis Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario Dilución
H3
A/Brisbane/10 /2007 (H3N2) No reductora TGA AS393 1:4000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H3
A/Brisbane/10 /2007 (H3N2) No reductora NIBSC 08/136 1:1000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H3
A/Wisconsin/6 7/2005 (H3N2) No reductora NIBSC 05/236 1:1000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H5
A/Indonesia/5/2005 (H5N1) Reductora ITC IT-003005V 1:4000 Anticonejo de cabra (JIR 111-035-144) 1:10 000
H5
A/Anhui/1/2005 (H5N1) Reductora NIBSC 07/338 1:750 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H5
A/Vietnam/1194/ 2004 (H5N1) No reductora ITC IT-003005 1:2000 Anticonejo de cabra (JIR 111-035-144) 1:10 000
H6
A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) No reductora BEI NR 663 1:500 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H7
A/Equino/Praga/56 (H7N7) No reductora NIBSC 02/294 1:1000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
H9
A/Hong Kong/1073/ 99 (H9N2) Reductora NIBSC 07/146 1:1000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
B
B/Malasia/25 06/2004 No reductora NIBSC 07/184 1:2000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
B
B/Florida/4/20 06 No reductora NIBSC 07/356 1:2000 Antioveja de conejo (JIR 313-035-045) 1:10 000
FII: Fitzgerald Industries International, Concord, MA, EE.UU; NIBSC: National Institute for Biological Standards and Control; JIR: Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU; BEI NR: Biodefense and emerging infections research resources repository; ITC: Immune Technology Corporation, Woodside, NY, EE.UU; TGA: Therapeutic Goods Administration, Australia.
El ensayo de hemaglutinación para H5 se basó en un método descrito por Nayak y Reichl (2004). En resumen, se realizaron diluciones seriales dobles de las muestras de ensayo (100 µl) en placas de microtitulación de 96 pozos
5 con fondo en V que contenían 100 µL de PBS, dejando 100 µL de la muestra diluida por pozo. Se añadieron 100 µL de una suspensión al 0,25% de glóbulos rojos pavo (Bio Link Inc., Syracuse, NY) a cada pozo, y se incubaron las placas durante 2 h a temperatura ambiente. Se registró el recíproco de la mayor dilución que muestra hemaglutinación completa como actividad de HA. En forma paralela, se diluyó un estándar recombinante de HA en PBS y se hizo una corrida como control en cada placa.
10 7. Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa
Se combinaron un mililitro de las fracciones 9, 10 y 11 eluidas de la cromatografía de filtración en gel en la biomasa que contenía H5, se cargó en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa de 20 -60% (p/v), y se centrifugó 17,5 horas a 125 000 g (4 ºC). Se fraccionó el gradiente en 19 fracciones de 3 ml a partir de la parte superior, y se dializaron para eliminar la sacarosa antes de los ensayos de hemaglutinación y de los análisis inmunológicos.
8. Microscopía electrónica
Se colocaron 100 µL de las muestras que se iban a examinar en un tubo de ultracentrifugación Airfuge (Beckman Instruments, Palo Alto, CA, EE.UU.). Se colocó una rejilla en la parte inferior del tubo que luego se centrifugó durante 5 min a 120 000 g. Se retiró la rejilla, se la secó suavemente, y se la colocó en una gota de ácido fosfotúngstico al 3% a pH 6 para la tinción. Se examinaron las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi 7100 (TEM) (para las imágenes de las Figuras 14B, 15B y 15C).
Para las imágenes en la Figura 19, se fijaron bloques de hojas de aproximadamente 1 mm3 en PBS que contenía glutaraldehído al 2,5% y se lavaron en PBS que contenía sacarosa al 3% antes de una etapa posterior de fijación en tetróxido de osmio al 1,33%. Se embebieron muestras fijadas en resina Spurr y se colocaron capas ultrafinas sobre una rejilla. Se tiñeron las muestras positivamente con acetato de uranilo al 5% y citrato de plomo al 0,2% antes de la observación. Se examinaron las rejillas en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi 7100 (TEM).
9. Análisis de lípidos de la membrana plasmática
Se obtuvieron las membranas plasmáticas (PM) de hojas de tabaco y se cultivaron las células BY2 después del fraccionamiento celular de acuerdo con Mongrand et al. mediante partición en un sistema de polímero acuoso de dos fases con polietilenglicol 3350 / dextrano T-500 (6,6% cada uno). Todas las etapas se realizaron a 4 ºC.
Se extrajeron los lípidos y se purificaron de las diferentes fracciones de acuerdo con Bligh y Dyer. Se separaron los lípidos polares y neutros por HP-TLC monodimensional usando los sistemas de disolventes descritos en Lefebvre et al. Se detectaron los lípidos de las fracciones de PM después de la tinción con acetato de cobre como lo describen Macala et al. Se identificaron los lípidos por comparación de su tiempo de migración y con el de los patrones (todos los estándares se obtuvieron a través de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU., a excepción de SG que se obtuvo a través de Matreya, Pleasant Gap, PA, EE.UU.).
10.
Purificación de las VLP de H5 (A/Indonesia/5/2005)
Se homogenizaron hojas infiltradas congeladas con 660 de N. benthamiana en 1,5 volúmenes de Tris 50 mM pH 8, NaCl 150 mM y meta-bisulfito de sodio al 0,04% usando un mezclador comercial. Se complementó el extracto resultante con PMSF 1 mM y se ajustó a pH 6 con ácido acético 1 M antes de ser calentado a 42 ºC durante 5 min. Se añadió tierra de diatomeas (DE) al extracto tratado con calor para adsorber los contaminantes precipitados por el cambio del pH y el tratamiento con calor, y se filtró la suspensión a través de un filtro de papel Whatman. Se centrifugó el extracto clarificado resultante a 10.000 x g durante 10 minutos a RT para eliminar el DE residual, se lo pasó a través de filtros Acropack 20 de 0,8/0,2 µm y se lo cargó en una columna de afinidad de fetuína -agarosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , EE.UU.). Después de una etapa de lavado en NaCl 400 mM, Tris 25 mM pH 6, se eluyeron las proteínas enlazadas con NaCl 1,5 M, MES 50 mM pH 6. Se complementaron las VLP eluidas con Tween-80 hasta una concentración final de 0,0005% (v/v). Se concentraron las VLP sobre una membrana Amicon de 100 kDa MWCO, se centrifugó a 10.000 x g durante 30 minutos a 4 ºC y se resuspendieron en PBS pH 7,4 con Tween-80 al 0,01% y timerosal al 0,01%. Se esterilizaron a través de un filtro las VLP suspendidas antes de uso.
11.
Estudios en animales.
Ratones
Los estudios sobre la respuesta inmune a la administración de VLP de influenza se realizaron con ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories). Se dividieron al azar setenta ratones en catorce grupos de cinco animales. Se usaron ocho grupos para inmunización intramuscular y se utilizaron seis grupos para probar por la ruta de administración intranasal. Todos los grupos fueron inmunizados en un regimiento de dos dosis, realizando la inmunización de refuerzo 3 semanas después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron los ratones no anestesiados ya sea con la vacuna de VLP de H5 producida por plantas (A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (0,1, 1, 5 o 12 µg), o un antígeno de hemaglutinina de control (H5). La H5 de control que contenía hemaglutinina recombinante soluble producida con base en la cepa A/Indonesia/5/05 H5N1 y purificada a partir de un cultivo de células 293 (Inmune Technology Corp., Nueva York, EE.UU.) (utilizado 5 µg por inyección a menos que se indique lo contrario). El amortiguador de control era PBS. Este antígeno consiste de los aminoácidos 18 -530 de la proteína HA, y tiene una etiqueta de His y un sitio de escisión modificado. La microscopía electrónica confirmó que este producto comercial no está en la forma de las VLP.
Para medir el efecto del adyuvante, se inmunizaron dos grupos de animales con 5 µg de la vacuna de H5 de las VLP producidas por plantas más un volumen de 2% de Alhydrogel (alumbre, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EE.UU.) o con 5 µg de hemaglutinina recombinante purificada a partir de un cultivo de células 293 más 1 volumen de alumbre. Se dividieron setenta ratones al azar en catorce grupos de cinco animales. Se usaron ocho grupos para la inmunización intramuscular y se utilizaron seis grupos para probar la ruta de administración intranasal. Todos los grupos fueron inmunizados de acuerdo con un régimen de refuerzo principal, la inmunización de refuerzo se realizó 3 semanas después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron los ratones no anestesiados con la VLP de H5 producida por plantas (0,1, 1, 5 o 12 µg), o el antígeno hemaglutinina (HA) de control (5 µg) o PBS. Todas las preparaciones de antígeno se mezclaron con 1% de Alhydrogel (alumbre, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EE.UU.) en una proporción de 1:1 en volumen antes de las inmunizaciones. Para medir el efecto del adyuvante, se inmunizaron dos grupos de animales ya sea con 5 µg de vacuna de H5 de VLP producidas por plantas o con 5 µg de antígeno HA de control sin ningún adyuvante.
Para la administración intranasal, se anestesiaron brevemente los ratones por inhalación de isoflurano usando una cámara de inducción automatizada. Luego fueron inmunizados mediante la adición de 4 µl gota/fosa nasal con la vacuna de VLP producida por plantas (0,1 o 1 µg), o con antígeno HA de control (1 µg) o con PBS. Todas las preparaciones de antígeno se mezclaron con 1% de glutamato de quitosano (Protosan, Novamatrix / FMC BioPolymer, Noruega) antes de las inmunizaciones. Luego los ratones respiran en las soluciones. Para verificar el efecto del adyuvante con la ruta de administración intranasal, se inmunizaron dos grupos de animales con 1 µg de vacuna de H5 de VLP producida por la planta o con 1 µg de antígeno HA de control.
Hurones
Se utilizaron diez grupos de 5 hurones (machos, 18 -24 semanas de edad, masa de aproximadamente 1 kg). El tratamiento para cada grupo es como se describe en la Tabla 7. El adyuvante utilizado fue 2% de Alhydrogel (alumbre) (Superfos Biosector, Dinamarca) (final = 1%). La composición de la vacuna fueron las VLP de A/Indonesia/5/05 (H5N1) asociadas a la membrana producidas como se describió. El control de vacunas (control positivo) fue un H5 recombinante enlazado a la membrana totalmente glicosilada de la cepa Indonesia producido utilizando adenovirus en cultivo de células 293 por Immune Technology Corporation (TTC).
Tabla 7. Grupos de tratamiento
Grupo
n Producto inyectado a los animales Vía de administración Adyuvante
1
5 PBS (control negativo) i. m.* -
2
5 Vacuna-planta, 1 µg i. m. -
3
5 Vacuna-planta, 1 µg i. m. Alumbre
4
5 Vacuna-planta, 5 µg i. m. -
5
5
Vacuna-planta, 5 µg i. m. Alumbre
6
5 Vacuna-planta, 7,5 µg i. m. -
7
5 Vacuna-planta, 15 µg i. m. -
8
5 Vacuna-planta, 15 µg i. m. Alumbre
9
5 Vacuna-planta, 30 µg i. m. -
10
5 Vacuna-control, 5 µg i. m. -
* i. m.: intramuscular
Se evaluó el estado general de salud y apariencia de los hurones (peso corporal, temperatura rectal, postura, piel, patrones de movimiento, respiración, excrementos) regularmente durante el estudio. Se inmunizaron los animales mediante inyección intramuscular (0,5 -1,0 de volumen total) en los cuádriceps en el día 0, 14 y 28; para los protocolos que incorporan adyuvante, se combinó la composición de la vacuna con Alhydrogel inmediatamente antes de la inmunización en una proporción en volumen de 1:1). Se obtuvieron las muestras de suero en el día 0 antes de la inmunización, y en el día 21 y 35. Los animales fueron sacrificados (desangramiento / punción cardiaca) en los días 40 -45, y se recogieron los bazos y se realizaron necropsias.
Se pueden cuantificar los títulos de anticuerpos anti-influenza en ensayos de ELISA utilizando virus H5N1 inactivados, homólogos y heterólogos.
Los títulos de anticuerpos inhibidores de hemaglutinación de muestras de suero (pre-inmune, día 21 y día 35) fueron evaluados por HAI de microtitulación como se describe (Aymard et al. 1973). En resumen, los sueros fueron pretratados con enzima destructora del receptor, inactivados con calor y mezclados con una suspensión de eritrocitos (glóbulos rojos-RBC lavados). Se recomiendan los RBC lavados de caballo (10%) de Lampire y teniendo en cuenta que el ensayo puede variar dependiendo de la fuente de los RBC (dependiendo del caballo), se probaron los RBC lavados de 10 caballos para seleccionar el lote más sensible. Alternativamente, se pueden utilizar RBC de pavo. El título de anticuerpos se expresó como el recíproco de la mayor dilución que inhibe completamente la hemaglutinación.
Títulos de reactividad cruzada de HAI: se midieron los títulos de HAI de hurones inmunizados con una vacuna para el A/Indonesia/5/05 (clado 2.1) usando cepas de influenza H5N1 inactivadas de otro subclado o clado tal como el clado 1 Vietnam cepas A/Vietnam/1203/2004 y A/Vietnam/1194/2004 o el A/Anhui/01/2005 (subclado 2.3) o el A/pavo/Turquía/1/05 (subclado 2.2). Todos los análisis se realizaron sobre muestras individuales.
Análisis de los datos: El análisis estadístico (ANOVA) se realizó sobre todos los datos para establecer si las diferencias entre los grupos son estadísticamente significativas.
Diseño experimental para exposición letal (ratones)
Se dividieron al azar ciento veintiocho ratones en dieciséis grupos de ocho animales, siendo un grupo no inmunizado y no expuesto (control negativo). Todos los grupos fueron inmunizados mediante administración intramuscular en un régimen de dos dosis, siendo realizada la segunda inmunización 2 semanas después de la primera inmunización.
Para la administración intramuscular en las patas traseras, se inmunizaron ratones no anestesiados con la VLP de H5 producida por plantas (1, 5 o 15 µg), o 15 µg de antígeno HA de control o PBS. Todas las preparaciones de antígeno se mezclaron con un volumen de 1% de Alhydrogel antes de las vacunas (alumbre, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, EE.UU.).
Durante el periodo de inmunización, se pesaron los ratones una vez a la semana y fueron observados y controlados por las reacciones locales en el sitio de la inyección.
Veintidós días después de la segunda inmunización, se expusieron los ratones anestesiados por vía intranasal (i.n.) en un laboratorio de contención BL4 (P4-Jean Mérieux-INSERM, Lyon, Francia) a una dosis infecciosa para el 50% del cultivo celular (CCID50) con 4,09 x 106 virus de influenza A/Turquía/582/06 (amablemente proporcionada por el doctor Bruno Lina, de la Universidad de Lyon, Lyon, Francia). Después de la exposición, se observaron los ratones por los síntomas clínicos de enfermedad y fueron pesaron diariamente, durante un periodo de catorce días. Los ratones con síntomas de infección grave y pérdida de peso ≥ 25% fueron sacrificados después de la anestesia.
Recolección de sangre, lavados nasales y de pulmón y recolección del bazo
Se realizó una recolección de sangre de la vena safena lateral catorce días después de la primera inmunización y catorce días después de la segunda inmunización en animales no anestesiados. Se recogió el suero por centrifugación a 8000 g durante 10 min.
Cuatro semanas después de la segunda inmunización, los ratones fueron anestesiados con gas CO2 e inmediatamente después de terminar, se utilizó una punción cardíaca para recoger la sangre.
Después de sangrado final, se insertó un catéter en la tráquea hacia los pulmones y se colocó un ml de una solución fría de un cóctel inhibidor de PBS-proteasa en una jeringa de 1 cc unida al catéter y se inyectó en los pulmones y luego se la removió para su análisis. Este procedimiento de lavado se realizó dos veces. Los lavados pulmonares se centrifugaron para remover los desechos celulares. Para los lavados nasales, se insertó un catéter hacia la zona nasal y se introdujeron 0,5 ml de la solución del cóctel inhibidor de PBS-proteasa a través del catéter en los pasajes nasales y luego se recogieron. Se centrifugaron los lavados nasales para remover los desechos celulares. La recolección del bazo se realizó en ratones inmunizados por vía intramuscular con 5 µg de la vacuna con adyuvante producida por plantas o 5 µg de antígeno H5 recombinante con adyuvante, así como en ratones inmunizados en forma intranasal con 1 µg de la vacuna con adyuvante producida por plantas o 1 µg de antígeno H5 recombinante con adyuvante. Los bazos recolectados fueron colocados en RPMI complementado con gentamicina y hechos puré en un tubo cónico de 50 ml con el émbolo de una jeringa de 10 ml. Se lavaron los bazos hechos puré 2 veces y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min y se resuspendieron en amortiguador de lisis ACK durante 5 min a temperatura ambiente. Se lavaron los esplenocitos en PBS-gentamicina, se resuspendieron en RPMI al 5% y se hizo el recuento. Se utilizaron los esplenocitos para el ensayo de proliferación.
Títulos de anticuerpos
Se midieron los títulos de anticuerpos anti-influenza de los sueros a los 14 días después de la primera inmunización, así como 14 y 28 días después de la segunda inmunización. Se determinaron los títulos mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), utilizando el virus inactivado A/Indonesia/5/05 como el antígeno de recubrimiento. Los títulos de punto final se expresaron como el valor recíproco de la dilución más alta que alcanzó un valor de DO de al menos 0,1 mayor que el de las muestras de control negativo.
Para la determinación de la clase de anticuerpo (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM), se evaluaron los títulos por ELISA como se describió previamente.
Títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI)
Se midieron los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) de los sueros a los 14 y 28 días después de la segunda inmunización como se describió previamente (WHO 2002; Kendal 1982). Se usaron preparaciones de virus inactivados de cepas A/Indonesia/5/05 o A/Vietnam/1203/2004 para poner a prueba las muestras de suero de ratón para la actividad de HI. Los sueros fueron pretratados con enzima II destructora del receptor (RDE II) (Denka Seiken Co., Tokio, Japón) preparado a partir de Vibrio cholerae (Kendal 1982). Se llevaron a cabo ensayos de HI con 0,5% de glóbulos rojos de pavo. Se definieron los títulos de anticuerpos de HI como el recíproco de la dilución más alta que causa la inhibición completa de la aglutinación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión transitoria de la hemaglutinina del virus de la influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1) por agroinfiltración en plantas de N. benthamiana
La capacidad del sistema de expresión transitorio para producir hemaglutinina de la influenza se determinó a través de la expresión del subtipo H5 de la cepa A/Indonesia/5/05 (H5N1). Tal como se presenta en la Figura 11, se ensambló primero la secuencia de codificación del gen de la hemaglutinina (GenBank, acceso No. EF541394), con su péptido señal nativo y el dominio transmembrana, en el casete de expresión de plastocianina -promotor, 5'UTR, 3'UTR y secuencias de terminación de la transcripción a partir del gen de plastocianina de alfalfa -y se insertó el casete ensamblado (660) en un plásmido binario pCAMBIA. Se transfectó luego este plásmido en Agrobacterium (AGL1), creando la cepa recombinante AGL1/660, que se usó para la expresión transitoria.
Se infiltraron plantas de N. benthamiana con AGL1/660, y se recogieron las hojas después de un periodo de incubación de seis días. Para determinar si se acumuló H5 en las hojas agroinfiltradas, se extrajo primero la proteína a partir del tejido de la hoja infiltrada y se analizó mediante transferencia tipo Western utilizando anticuerpos policlonales anti-H5 (Vietnam). Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 12), que corresponde en tamaño a la forma HA0 no escindida de hemaglutinina de la influenza. La H5 comercial utilizada como control positivo (A/Vietnam/1203/2004; Protein Science Corp., Meriden, CT, EE.UU.) se detectó como dos bandas de aproximadamente 48 y 28 kDa, que corresponden al peso molecular de los fragmentos HA1 y HA2, respectivamente. Esto demostró que la expresión de H5 en hojas infiltradas trae como resultado la acumulación del producto de traducción no escindido.
Se demostró la formación de trímeros de HA activos por la capacidad de los extractos de proteína cruda de hojas trasformadas con AGL1/660 de aglutinar glóbulos rojos de pavo (datos no presentados).
Ejemplo 2: Caracterización de estructuras que contienen hemaglutinina en extractos de plantas, usando la cromatografía de exclusión por tamaño
El montaje de la hemaglutinina de la influenza producida por la planta en estructuras de alto peso molecular se evaluó mediante filtración en gel. Se fraccionaron los extractos de proteína cruda de las plantas infiltradas con AGL1/660 (1,5 ml) por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en columnas HR S-500 de SephacrylMR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EE.UU.). Se evaluaron las fracciones de elución para determinar su contenido de proteína total y la abundancia de HA usando inmunodetección con anticuerpos anti-HA (Figura 13A). Como se muestra en la Figura 13A, se produjo un pico temprano por la elución de Azul Dextrano (2 MDa) en la fracción 10, mientras que la mayor parte de las proteínas del huésped fueron retenidas en la columna y eluyeron entre las fracciones 14 y 22. Cuando se concentraron las proteínas de 200 µL de cada fracción de elución SEC (5 veces) por precipitación con acetona y se analizaron por transferencias tipo Western (Figura 15A, H5), se encontró principalmente hemaglutinina (H5) en las fracciones 9 a 14 (Figura 13B). Sin desear estar limitado por la teoría, esto sugiere que la proteína HA o bien se había ensamblado en una gran superestructura o se había unido a una estructura de alto peso molecular.
Se ensambló un segundo casete de expresión con la secuencia de ácido nucleico de H1 de A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33; Figura 16; GenBank, acceso No. AY289929) para producir el constructo 540 (Figura 11). Se diseñó un constructo de un gen quimérico con el fin de producir una forma trimérica soluble de H1 en el que se originó el péptido señal a partir de un gen para la proteína disulfuro isomerasa de la planta, y se reemplazó el dominio transmembrana de H1 por la variante pII de la cremallera de leucina GCN4, un péptido que se ha demostrado que se auto-ensambla para formar trímeros (Harbury et al., 1993) (casete 544, Figura 11). Aunque carece del dominio transmembrana, esta forma trimérica soluble era capaz de hemaglutinación (datos no presentados).
Los extractos de proteína de las plantas infiltradas con AGL1/540 o AGL1/544 se fraccionaron por SEC y se examinó la presencia de las fracciones eluidas de H1 por transferencias tipo Western con anticuerpos anti-influenza A (Fitzgerald, Concord, MA, EE.UU.). En las hojas infiltradas con AGL1/540, se acumuló H1 principalmente como una estructura de muy alto peso molecular, con el pico sesgado hacia estructuras de tamaño más pequeño (H1; Figura 13C). En las hojas infiltradas con AGL1/544, se acumuló la forma soluble de H1 como trímeros aislados como se demuestra por el patrón de elución de filtración en gel que es paralelo al perfil de elución de la proteína huésped (H1 soluble; Figura 13D). En comparación, las rosetas de H1 (Protein Science Corp., Meriden, CT, EE.UU.), que consisten en micelas de 5 -6 trímeros de hemaglutinina eluyeron en las fracciones 12 a 16 (Figura 13E), antes que la forma soluble de H1 (Figura 13D) y después de la H1 nativa (Figura 13C).
Para evaluar el impacto de la coexpresión de M1 en el montaje de hemaglutinina en la estructura, se ensambló un casete de expresión de M1 usando el ácido nucleico correspondiente a la secuencia de codificación de la M1 de A/PR/8/34 (H1N1) (SEQ ID NO: 35; Figura 18; GenBank acceso No. NC_002016). El constructo se denominó 750 y se presenta en la Figura 11. Para la coexpresión de M1 y H1, se mezclaron las suspensiones de AGL1/540 y AGL1/750 en un volumen igual antes de la infiltración. La coinfiltración de múltiples suspensiones de Agrobacterium permite la coexpresión de múltiples transgenes. El análisis de transferencias tipo Western de fracciones de elución SEC muestra que la coexpresión de M1 no modificó el perfil de elución de las estructuras de H1, pero dio como resultado una disminución en la acumulación de H1 en las hojas agroinfiltradas (véase la Figura 13F).
Ejemplo 3: Aislamiento de estructuras H5 por centrifugación en gradiente de sacarosa y observación bajo microscopio electrónico
La observación de la estructura de la hemaglutinina bajo microscopio electrónico (EM) requiere un nivel de concentración y de pureza más alta que la obtenida a partir de SEC en extractos de proteína de la hoja en bruto. Para permitir la observación de las estructuras de H5 por EM, se concentró primero un extracto de proteína de la hoja en bruto mediante precipitación con PEG (20% de PEG), seguido por resuspensión en volúmenes de 1/10 del amortiguador de extracción. El extracto de proteína concentrada se fraccionó mediante filtración en gel HR S-500 y re reunieron las fracciones de elución 9, 10, y 11 (correspondientes al volumen vacío de la columna) y se aislaron adicionalmente de las proteínas del huésped por ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa del 20 -60%. Se fraccionó el gradiente de sacarosa a partir de la parte superior y se dializaron y concentraron las fracciones en una unidad filtrante para centrifugación de 100 NMWL antes del análisis. Como se muestra en las transferencias tipo Western y los resultados de la hemaglutinación (Figura 14A), H5 se acumula principalmente en las fracciones 16 a 19 que contenían ~60% de sacarosa, mientras que la mayor parte de las proteínas del huésped alcanzó su punto máximo en la fracción 13. Las fracciones 17, 18 y 19 se agruparon, se tiñeron negativamente, y se observaron bajo EM. El examen de la muestra demostró claramente la presencia de estructuras esféricas con púas que varían en tamaño desde 80 hasta 300 nm que se correspondía con las características morfológicas de las VLP de la influenza (Figura 14B).
Ejemplo 4: Purificación de las VLP de H5 de influenza de biomasa vegetal
Además de un contenido abundante de proteínas solubles, los extractos de hoja de planta contienen una mezcla compleja de azúcares solubles, ácidos nucleicos y lípidos. El extracto crudo se clarificó mediante un cambio de pH y tratamiento térmico seguido por filtración sobre tierra de diatomeas (véase la sección Material y método para una descripción detallada del método de clarificación). La Figura 15A (carriles 1-4) presenta un gel teñido con azul de Coomassie que compara el contenido de proteína en las distintas etapas de clarificación. Una comparación del contenido de proteína en el extracto bruto (carril 1) y en el extracto clarificado (carril 4) revela la capacidad de las etapas de clarificación para reducir el contenido global de proteína y remover la mayor parte del contaminante principal visible a 50 kDa en los extractos de la hoja en bruto. La banda de 50 kDa corresponde a la subunidad grande de RuBisCO, que representa hasta el 30% de las proteínas totales de las hojas.
Las VLP de H5 de influenza se purificaron a partir de estos extractos clarificados por cromatografía de afinidad en una columna de fetuína. Una comparación de la fracción de carga (Figura 15A, carril 5) con el flujo que la atraviesa (Figura 15A, carril 6) y las VLP eluidas (Figura 15A, carril 7) demuestra la especificidad de la columna de afinidad de fetuína para las VLP de H5 de influenza en extracto clarificado de plantas.
El procedimiento de purificación dio como resultado una pureza de más del 75% en H5, como se determinó por densitometría en el gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie (Figura 15A, carril 7). A fin de evaluar la calidad estructural del producto purificado, se concentró la H5 purificada en una unidad de filtración por centrifugación de 100 NMWL (límite de peso molecular nominal) y se examinó bajo EM después de tinción negativa. La Figura 15B muestra un sector representativo que muestra la presencia profusa de las VLP. Un examen más detenido confirmó la presencia de picos en las VLP (Figura 15C).
Como se muestra en la Figura 15D, se purificaron las VLP de H5 hasta aprox. 89% de pureza a partir de extracto de hoja clarificado por cromatografía de afinidad en una columna de fetuína, con base en la densidad de hemaglutinina H5 teñida con azul de Coomassie y en la determinación del contenido total de proteína por el método BCA.
La bioactividad de las VLP de HA se confirmó por su capacidad de aglutinar los glóbulos rojos de pavo (datos no presentados).
Figura 15D también confirma la identidad de la VLP purificada visualizada por transferencia tipo Western e inmunodetección con un suero policlonal anti-H5 (A/Vietnam/1203/2004). Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa y corresponde en tamaño a la forma HA0 no escindida de hemaglutinina de la influenza. La Figura 15c muestra la estructura de la VLP de la vacuna con los picos de hemaglutinina que cubren su estructura.
Se formularon VLP para la inmunización de ratones por filtración a través de un filtro de 0,22 µm; se midió el contenido de endotoxina usando el kit de detección de la endotoxina LAL (lisado de amebocitos de Limulus) (Lonza, Walkserville, MS, EE.UU.). La vacuna filtrada contenía 105,8 ± 11,6% EU/ml (unidades de endotoxina/ml).
Ejemplo 5: Localización de las VLP de influenza en plantas
Para localizar las VLP y confirmar su origen en la membrana plasmática, se fijaron secciones de hojas delgadas de plantas productoras de H5 y se examinaron bajo TEM después de la tinción positiva. La observación de células de la hoja indicó la presencia de las VLP en las cavidades extracelulares formadas por la invaginación de la membrana plasmática (Figura 19). La forma y posición de las VLP observadas demostró que a pesar de la aposición de sus membranas plasmáticas sobre la pared celular, las células de las plantas tienen la plasticidad requerida para producir las VLP de influenza derivadas de su membrana plasmática y acumularlas en el espacio apoplástico.
Ejemplo 6: Análisis de lípidos de la membrana plasmática
Se obtuvo una confirmación adicional de la composición y el origen de las VLP de influenza de plantas, a partir de los análisis del contenido de lípidos. Se extrajeron los lípidos de las VLP purificadas y se comparó su composición con los de las membranas plasmáticas de tabaco altamente purificadas por cromatografía en capa fina de alto rendimiento (HP-TLC). Los patrones de migración de lípidos polares y neutros de las VLP y las membranas plasmáticas de control fueron similares. Las VLP purificadas contenían los principales fosfolípidos (fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina) y esfingolípidos (glucosil-ceramida) que se encuentran en la membrana plasmática (Figura 27A), y ambas contenían esteroles libres como los únicos lípidos neutros (Figura 27b). Sin embargo, la inmunodetección de un marcador de proteína de la membrana plasmática (ATPasa) en extractos purificados de VLP mostró que la bicapa lipídica de VLP no contiene una de las principales proteínas asociadas con las membranas plasmáticas de la planta, lo que sugiere que las proteínas del huésped pueden haber sido excluidas de las membranas durante el proceso de brote de las VLP de las células de la planta (Figura 27C).
Ejemplo 7: Inmunogenicidad de las VLP de H5 y el efecto de la vía de administración
Se les administró a los ratones las VLP de H5 producidas por las plantas por inyección intramuscular, o intranasal (inhalación). Se inyectaron 0,1 a 12 µg de las VLP en forma intramuscular en ratones, con alumbre como adyuvante, de acuerdo con los métodos descritos. Se observaron picos de títulos de anticuerpos con la más baja cantidad de antígeno, en una magnitud similar a aquella de 5 µg de hemaglutinina soluble recombinante (H5) (Figura 20A).
Se administraron 0,1 a 1 µg de las VLP de H5 producidas por las plantas por vía intranasal con un adyuvante de quitosano previsto para una respuesta de anticuerpos mayor a aquella de la H5 soluble recombinante con un adyuvante de alumbre (Figura 20B).
Para ambas vías de administración, y en un rango de cantidades de antígeno, se observó seroconversión en todos los ratones analizados. El antígeno recombinante soluble H5 confirió títulos de HI bajos (<1/40) o insignificantes (1 < 1/10 para H5 recombinante sin adyuvante).
Ejemplo 8: Título de anticuerpos de hemaglutinación-inhibición (HAI) de VLP de H5
Figura 21A, B ilustra la respuesta de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación (HAI) 14 días después de un "refuerzo" con VLP de H5 producidas por plantas, o H5 soluble recombinante. Cuando se administra a dosis más baja de antígeno (0,1 µg) por vía intramuscular se produce una respuesta de HAI superior a una administración 10 veces mayor (5 µg) de H5 soluble recombinante. Dosis crecientes de VLP de H5 proporcionaron un modesto aumento en HAI sobre la dosis más baja.
La respuesta a la HAI después de la administración intranasal se incrementó significativamente en los ratones a los que se les administró las VLP de H5 producidas por plantas (1,0 o 0,1 µg) en comparación con aquellos a los que se les administró 1 µg de H5 soluble recombinante, que fue similar al control negativo. Todos los ratones inmunizados mediante inyección intramuscular de VLP de H5 (de 0,1 a 12 µg) tuvieron mayores títulos de HAI que los ratones inmunizados con el antígeno H5 de control (Figura 21A). Para la misma dosis de 5 µg, las VLP indujeron títulos de HAI 20 veces superiores que la dosis correspondiente del antígeno H5 de control. Las VLP también indujeron títulos significativamente mayores de HAI que el antígeno HA de control cuando se suministró a través de la vía intranasal (Figura 21b). Para una dosis dada de VLP de H5 los niveles de títulos de IHA fueron más bajos en los ratones inmunizados por vía intranasal que para los ratones inmunizados por vía intramuscular; 1 µg de VLP indujo una media del título de HAI de 210 cuando se administra en forma i.m. mientras que la misma dosis indujo una media del título de HAI de 34 administrada en forma i.n.
Cuando se administran por vía intramuscular, todas las dosis de VLP indujeron un nivel alto de anticuerpos capaces de unirse a virus inactivados completos homólogos (Figuras 20a y 24). No se encontró una diferencia significativa entre la vacuna de VLP producida por una planta y el antígeno H5 de control (excepto el grupo de VLP de 12 µg 14 días después del refuerzo), ya que ambas preparaciones de antígeno inducen altos títulos de anticuerpos de unión contra la cepa homóloga. Sin embargo, cuando se administran por vía intranasal, las VLP indujeron títulos de anticuerpos de enlazamiento más altos de lo que lo hizo el antígeno H5 de control (Figura 20b). Cuando se mezcla con quitosano, la inmunización con un microgramo de VLP indujo un título medio de Ab recíproco de 5 500, 8,6 veces mayor que el nivel encontrado en ratones inmunizados con 1 µg del antígeno HA de control (título medio de Ab recíproco de 920).
A continuación, se investigó la inmunogenicidad de las VLP de influenza derivadas de plantas mediante un estudio de intervalos de dosis en ratones. Se inmunizaron grupos de cinco ratones BALB/c por vía intramuscular dos veces a intervalos de 3 semanas con 0,1 µg a 12 µg de VLP que contienen HA de la influenza A/Indonesia/5/05 (H5N1) formulada en alumbre (proporción 1:1). Los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI o HAI), utilizando antígeno del virus completo inactivado (A/Indonesia/05.05 (H5N1)), se midieron en sueros recogidos 14 días después de la segunda inmunización. La inmunización con dosis de VLP tan bajas como 0,1 µg indujo la producción de anticuerpos que inhiben los virus de aglutinar eritrocitos en diluciones altas (Figura 21A). La inmunización en forma paralela de ratones con 5 µg de antígeno H5 de control con alumbre como adyuvante sin VLP (también de A/Indonesia/5/05) induce una respuesta de HI que fue 2-3 registros menor que la lograda con la dosis más baja de VLP .
Para ambas vías de administración, y en un intervalo de cantidades de antígeno, la respuesta de HAI es superior en los ratones a los que se les administraron las VLP.
Ejemplo 9: Efecto de adyuvante sobre la inmunogenicidad de las VLP de H5
Las VLP de H5 producidas por la planta tienen origen en la membrana plasmática (Figura 19, Ejemplo 5). Sin desear estar limitado por la teoría, los virus con envoltura o las VLP de virus con envoltura generalmente adquirir su envoltura de la membrana de la que brotan. Las membranas plasmáticas de las plantas tienen un complemento de fitoesterol que rara vez, si es que alguna vez se encuentran en células animales, y varios de estos esteroles, se ha demostrado que presentan efectos inmunoestimuladores.
Se administraron las VLP de H5 producidas por las plantas por vía intramuscular (Figura 22A) o intranasal (Figura 22B) a ratones en presencia o en ausencia de un adyuvante, y se determinó la HAI (respuesta de anticuerpos de inhibición de la hemaglutinación). Las VLP, en presencia o en ausencia de un adyuvante añadido (alumbre o quitosano, como en estos ejemplos) en cualquiera de los sistemas de administración demostró una inhibición significativamente mayor de la hemaglutinina HAI que la H5 soluble recombinante. Incluso en ausencia de un adyuvante añadido (es decir, alumbre o quitosano), las VLP de H5 producidas por la planta demuestran una HAI significativa, indicativa de una respuesta inmune sistémica a la administración del antígeno.
El alumbre mejoró el nivel medio de los títulos de HAI en un factor de 5 para la administración intramuscular de VLP (Figura 22a) y en un factor de 3,7 para el antígeno H5 de control. Cuando se administra en forma i.m., 5 µg de las VLP indujeron una media del título de HAI 12 veces mayor que la dosis correspondiente de antígeno H5 de control. El quitosano no reforzó el nivel medio de HAI del antígeno H5 de control (Figura 22b) mientras que aumentó el nivel medio de HAI de los ratones inmunizados con 1 µg de VLP administradas en forma i.n. por un factor de 5 veces.
Ejemplo 10: Isotipos de anticuerpos
Ratones a los que se les administraron VLP de H5 producidas por las plantas o H5 soluble recombinante en presencia o en ausencia de alumbre como un adyuvante añadido demostraron una variedad de isotipos de inmunoglobulina (Figura 23A).
En presencia de un adyuvante añadido, los perfiles de isotipos de anticuerpos de las VLP y el H5 recombinante son similares, siendo IgG1 el isotipo dominante. Cuando las VLP o H5 recombinante se administran sin un adyuvante añadido, la respuesta de IgG1 se reduce, pero sigue siendo la respuesta al isotipo dominante para las VLP, con IgM, IgG2a, IgG2b e IgG3 manteniendo títulos similares que en presencia de un adyuvante añadido. Los títulos de IgG1, IgG2a e IgG2b se reducen notablemente cuando se administra H5 recombinante sin un adyuvante añadido (Figura 23A).
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las VLP producidas por plantas no requieren un adyuvante añadido para provocar una respuesta de anticuerpos en un huésped.
Los títulos de anticuerpos contra las cepas del virus de la influenza inactivados completos (A/Indonesia/5/05; A/Vietnam/1203/04) en los ratones a los que se les administraron las VLP producidas por plantas o HA recombinante soluble por vía intramuscular en presencia de un antígeno añadido se ilustran en la Figura 23B. No se observa ninguna diferencia significativa en los títulos de anticuerpos para estas cepas de la influenza en ratones a los que se les administró 1 µg o 5 µg de las VLP o 5 µg de HA soluble.
Ejemplo 11: Reactividad cruzada de anticuerpos en suero inducidos por la vacuna de VLP de H5
La reactividad cruzada de anticuerpos en suero inducidos por VLP de H5 se evaluó contra los virus completos de influenza inactivados de diferentes cepas. Todas las dosis de VLP (desde 0,1 hasta 12 µg), así como 5 µg de antígeno HA de control indujeron altos títulos de anticuerpos de enlazamiento contra una cepa del clado 1 (A/Vietnam/1194/04), la cepa homóloga A/Indonesia/5/05 del clado 2.1, y una cepa del clado 2.2 A/pavo/Turquía/1/05 (Figura 25A).
Sin embargo, sólo la VLP producida por una planta indujo un título de HAI contra la cepa A/pavo/Turquía/1/05 (Figura 25b). Los títulos de HAI para A/Indonesia/5/05 fueron altos para las VLP.
Ejemplo 12: Protección cruzada conferida por la inmunización con VLP de H5 producidas por plantas
Los ratones a los que previamente se les había administrado un régimen de dos dosis de las VLP de H5 de A/Indonesia/5/05 H5 VLP como se describió, fueron posteriormente expuestos por vía intranasal con el virus infeccioso de la influenza A/Turquía/582/06 (H5N1) ("Turquía H5N1"), y observados. La dosis administrada, por animal, fue de 10 DL50 (4,09 X 105 CCID50).
A los 7 días después de la exposición, sólo el 37,5% de los ratones a los que se les administró la vacuna de control de PBS había sobrevivido a la exposición a Turquía H5N1 (Figura 26A). 100% de los animales a los que se les administró el antígeno de control (HA) o 1, 5 o 15 µg de las VLP de H5 de Indonesia sobrevivieron hasta 17 días después de la exposición, cuando se dio por terminado el experimento.
Se controló también la masa corporal de los ratones durante el experimento, y se graficó la masa promedio de los ratones supervivientes (Figura 26B). Los ratones a los que se les administró 1, 5 o 15 µg de las VLP de H5 de Indonesia antes de la exposición no perdieron masa en forma apreciable durante el transcurso del experimento, y en particular los ratones a los que se les administró 5 µg de las VLP parecen haber ganado masa en forma significativa. Los ratones de control negativo (sin exposición a Turquía H5N1) no ganaron o perdieron masa corporal en forma apreciable. Los ratones de control positivo (a los que no se les administró las VLP, pero expuestas a Turquía H5N1) exhibieron una pérdida significativa de masa corporal durante el transcurso del experimento, y tres de estos ratones murieron. Como la masa corporal es un promedio de todos los ratones en la cohorte, la eliminación de los ratones 'más enfermos' (los 3 que murieron) puede conducir a un aumento global aparente en la masa, sin embargo téngase en cuenta que la masa corporal promedio de la cohorte de control positivo está todavía significativamente por debajo de las cohortes negativas o las tratadas con VLP.
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las VLP de influenza producidas por plantas que comprenden la proteína viral hemaglutinina H5 inducen una respuesta inmune específica para las cepas de influenza patógenas, y que las partículas similares al virus pueden brotar de una membrana plasmática de la planta.
Estos datos, por lo tanto, demuestran que las plantas son capaces de producir partículas similares al virus de la influenza, y también por primera vez, que las partículas similares al virus pueden brotar de una membrana plasmática de la planta.
Además, utilizando la tecnología de expresión transitorio actual, se produjo un primer lote de antígeno sólo 16 días después de obtener la secuencia de la HA objetivo. Bajo los rendimientos actuales para las VLP de H5, y en un ejemplo de dosis de 5 µg por sujeto, cada kg de hoja infiltrada pueden producir 20.000 dosis de vacuna. Esta combinación única de simplicidad de la plataforma, aumento de la capacidad y potente inmunogenicidad proporciona lo necesario, entre otras realizaciones, para un nuevo método de respuesta en el contexto de una pandemia.
Ejemplo 13: Caracterización de estructuras que contienen hemaglutinina (H1, H2, H3, H5, H6 y H9) en extractos de plantas, usando la cromatografía de exclusión por tamaño
Se evaluó el montaje de la hemaglutinina de la influenza producida por la planta de diferentes subtipos en estructuras de alto peso molecular mediante filtración en gel. Se fraccionaron los extractos de proteínas concentradas o crudas de plantas infiltradas con AGL1/660, AGL1/540, AGL1/783, AGL1/780, AGL1/785 y AGL1/790 (1,5 ml) por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en columnas HR S-500 de SephacrylMR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Piscataway, NJ, EE.UU.). Como se muestra en la Figura 46, eluyó un pico temprano de Azul Dextrano (2 MDa) en la fracción 10. Cuando se concentraron (5 veces) las proteínas de 200 µL de cada fracción de elución por SEC mediante precipitación con acetona y se analizaron por transferencias tipo Western (Figura 46), se encontraron principalmente hemaglutininas en las fracciones 7 a 14, lo que indica la incorporación de HA en las VLP. Sin desear estar limitado por la teoría, esto sugiere que la proteína HA o bien había sido ensamblada en un gran superestructura o se había unido a una estructura de alto peso molecular, independientemente del subtipo producido. En la Figura 46, se produjeron H1 de la cepa A/Nueva Caledonia/20/1999 y H3 de la cepa A/Brisbane/10/2007 utilizando casetes que contienen péptidos señal PDI. Los resultados obtenidos indican que la sustitución del péptido señal nativo por el de la PDI de alfalfa no afecta a la capacidad de HA para ensamblarse en partículas.
Ejemplo 14: Expresión transitoria de la hemaglutinina del virus de la influenza estacional por agroinfiltración en plantas de N. benthamiana que utilizan la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre
La capacidad del sistema de expresión transitoria para producir hemaglutininas de influenza estacional se determinó a través de la expresión del subtipo H1 a partir de cepas A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (plásmido # 774), A/Nueva Caledonia/20/1999 (H1N1) (plásmido # 540) y A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (plásmido # 775), del subtipo H3 a partir de las cepas A/Brisbane/10/2007 (plásmido # 776) y A/Wisconsin/67/2005 (plásmido # 777) y del tipo B a partir de cepas B/Malasia/2506/2004 (linaje Victoria) (plásmido # 778) y B/Florida/4/2006 (linaje Yamagata) (plásmido # 779). Las secuencias de codificación del gen de la hemaglutinina se ensamblaron primero en el casete de expresión de plastocianina -promotor, 5'UTR, 3'UTR y secuencias de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de la alfalfa -y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. Se transfectaron luego los plásmidos en Agrobacterium (AGL1), produciendo cepas de Agrobacterium AGL1/774, AGL1/540, AGL1/775, AGL1/776, AGL1/777, AGL1/778 y AGL1/779, respectivamente.
Se infiltraron plantas de N. benthamiana con AGL1/774, AGL1/540, AGL1/775, AGL1/776, AGL1/777, AGL1/778 y AGL1/779 y se recolectaron las hojas después de un período de incubación de seis días. Para determinar si se acumuló H1 en las hojas agroinfiltradas, se extrajo primero la proteína a partir de tejido de la hoja infiltrada y se analizó por transferencias tipo Western utilizando anticuerpos anti-HA (véase la Tabla 6 para los anticuerpos y las condiciones utilizadas para la detección de cada subtipo de HA). Para la HA de las cepas H1, se detectó una única banda de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 47), que corresponde en tamaño a la forma HA0 no escindida de hemaglutinina de la influenza. Esto demostró que la expresión de diferentes cepas epidémicas anuales de hemaglutinina en hojas infiltradas da como resultado la acumulación del producto de traducción no escindido. Usando estas estrategias de expresión y de inmunodetección, no se detectó la expresión de HA de influenza del subtipo H3 o de tipo B en los extractos de proteína cruda (Figura 47).
Ejemplo 15: Expresión transitoria de la hemaglutinina del virus de la influenza pandémica potencial por agroinfiltración en plantas de N. benthamiana que utilizan la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre
Se determinó la capacidad del sistema de expresión transitoria para producir potenciales hemaglutininas de influenza a través de la expresión del subtipo H5 a partir de cepas A/Anhui/1/2005 (H5N1) (plásmido # 781), A/Indonesia/5/2005 (H5N1) ( plásmido # 660) y A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (plásmido # 782), el subtipo H2 de la cepa A/Singapur/1/1957 (H2N2) (plásmido # 780), el subtipo H6 de la cepa A/Cerceta/Hong Kong/W312/1997 (H6N1) (plásmido # 783), el subtipo H7 de la cepa A/Equino/Praga/1956 (H7N7) (plásmido # 784) y, finalmente H9 de la cepa A/Hong Kong/1073/1999 (H9N2) (plásmido # 785). Se ensamblaron primero las secuencias de codificación del gen de la hemaglutinina en el casete de expresión de plastocianina -promotor, 5'UTR, 3'UTR y secuencias de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa -y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. Se transfectaron luego los plásmidos en Agrobacterium (AGL1), que produce de cepas de Agrobacterium AGL1/781, AGL1/660, AGL1/782, AGL1/780, AGL1/783, AGL1/784 y AGL1/785.
Se infiltraron plantas de N. benthamiana con AGL1/781, AGL1/660, AGL1/782, AGL1/780, AGL1/784 y AGL1/785, y se recolectaron las hojas después de un período de incubación de seis días. Para determinar si se acumuló H5 en las hojas agroinfiltradas, se extrajo primero la proteína a partir de tejido de la hoja infiltrada y se analizó por transferencias tipo Western utilizando anticuerpos anti-HA apropiados (véase la Tabla 6 para los anticuerpos y las condiciones utilizadas para la detección de cada subtipo de HA). Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa en extractos de plantas transformadas con constructos de expresión H5 y H2 (Figura 48a y b), que corresponde en tamaño a la forma HA0 no escindida de hemaglutinina de la influenza. Esto demostró que la expresión de diferentes cepas pandémicas potenciales de hemaglutinina en hojas infiltradas da como resultado la acumulación del producto de traducción no escindido. Utilizando estas estrategias de expresión y de inmunodetección, no se detectó la expresión de HA de la influenza de H7 y H9 en los extractos de proteína cruda (Figura 48b).
Ejemplo 16: Expresión transitoria de H5 por agroinfiltración en plantas de N. tabacum
La capacidad del sistema de expresión transitoria para producir hemaglutinina de la influenza en hojas de Nicotiana tabacum se analizó a través de la expresión del subtipo H5 de la cepa A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (plásmido # 660). Se ensamblaron las secuencias de codificación de gen de la hemaglutinina primero en el casete de expresión de plastocianina -promotor, 5'UTR, 3'UTR y secuencias de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa -y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. A continuación, se transfectaron los plásmidos en Agrobacterium (AGL1), que produce la cepa AGL1/660.
Se infiltraron plantas de N. tabacum con AGL1/660 y se recogieron las hojas después de un período de incubación de seis días. Para determinar si se acumuló H5 en las hojas agroinfiltradas, se extrajeron primero las proteínas de las hojas infiltradas y se analizaron mediante transferencias tipo Western utilizando anticuerpos anti-H5. Se detectó una banda única de aproximadamente 72 kDa en los extractos (Figura 49), que corresponde en tamaño a la forma HA0 no escindida de hemaglutinina de la influenza. Esto demostró que la expresión de hemaglutinina en hojas de N. tabacum infiltradas dio como resultado la acumulación del precursor de HA0 no escindido.
Ejemplo 17: Inmunogenicidad de la vacuna de VLP de H5N1 producida por la planta de A/Indonesia/5/05 (H5N1) en hurones
Se llevó a cabo un estudio de escalonamiento de dosis en hurones para evaluar la inmunogenicidad de las VLP derivadas de plantas. La reactividad cruzada in vitro de anticuerpos en el suero inducida por la vacuna de VLP de H5 en 3 dosis (1, 5 y 15 µg) se evaluó mediante la inhibición de la hemaglutinación de otras tres cepas de H5N1 A/pavo/Turquía/1/05 (clado 2.2), A/Vietnam/1194/04 (clado 1) y A/Anhui/5/05 (todos virus completos inactivados), utilizando suero tomado 14 días después de la primera dosis de la vacuna (Figura 50A), y 14 días después de la segunda dosis (Figura 50 B). Para todas las 3 concentraciones de dosis, se observó reactividad cruzada
Ejemplo 18: Análisis de los resultados de inmunogenicidad de acuerdo con criterios del CHMP.
El comité de la agencia europea para evaluación de medicamentos de uso humano (CHMP) (http://www.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.html) establece tres criterios (aplicados después de la segunda dosis) para la eficacia de la vacuna: 1 -Número de seroconversión o un aumento significativo de los títulos de HI (4 veces) > 40%; 2 -Aumento de la media geométrica de al menos 2,5; 3 -la proporción de sujetos que alcanzaron un título de HI de 1/40 debe ser de al menos el 70%. El análisis de estos criterios en el modelo de hurón se muestra en las Tablas 8 -11. (*) Es indicativo de que cumplen o superan los criterios del CHMP. Un resumen del análisis de la inmunogenicidad cruzada en relación con los criterios del CHMP para obtener la licencia se muestra en la Tabla 12.
Los animales fueron evaluados diariamente con respecto al peso corporal, la temperatura y el estado general. No se registraron señales de enfermedad o malestar durante el estudio. El peso corporal y la temperatura estaban dentro de los rangos normales durante el estudio. La vacuna era segura y tolerada por los animales.
Tabla 8: Datos para la cepa homóloga (A/Indonesia/5/05)
Día
Criterios Grupo de estudio
1
1 µg con 5 5 µg con 7,5 15 15 µg con 30 5 µg
mg
adyuvante µg adyuvante µg µg adyuvante µg ITC
% de
0% 100% 0% 100 % * 20% 20% 80% * 0% 0%
incremento
4 veces el
título de HI.
14 (después de la primera inyección)
Incremento de la media geométrica. % del título de HI de 0% 7,6 0% 15,6 * 1,3 1,2 11,2 * 0% 0%
1/40
0% 60% 0% 100% * 20% 0% 80% * 0% 0%
Media del título de HI
38 78 56
% de
0% 100% * 0% 60% * 0% 0% 40% * 0% 0%
incremento
4 veces el
título de HI.
35 (14 días
Incremento de la media 0% 10,8 * 0% 5,9 * 0,7 0% 4* 0% 0%
después del
geométrica.
refuerzo)
% del título de HI de
1/40
0% 100 % * 0% 100% * 0% 0% 100 % * 0% 0%
Media del título de HI
411 465 217
Tabla 9: Datos para la cepa heteróloga (A/Vietnam/1194/04) (continuación)
Día
Criterios Grupo de estudio
1
1 µg con 5 5 µg con 7,5 15 15 µg con 30 5 µg
mg
adyuvante µg adyuvante µg µg adyuvante µg ITC
14 (después de la primera inyección)
% de incremento 4 veces el título de HI. Incremento de la media geométrica. 0% 1,2 0 % 1,2 0% 1,3
% del título de HI de 1/40
0% 0% 0%
Día
Criterios Grupo de estudio
1
1 µg con 5 5 µg con 7,5 15 15 µg con 30 5 µg
mg
adyuvante µg adyuvante µg µg adyuvante µg ITC
35 (después del refuerzo)
% de incremento 4 veces el título de HI. Incremento de la media geométrica. 60% 2,3 80% * 5,1 * 60% 1,78
% del título de HI de 1/40
0 % 80% * 20 %
Tabla 10: Datos para la cepa heteróloga (A/pavo/Turquía/1/05) Tabla 12: Resumen de los análisis de inmunogenicidad cruzada en relación con los criterios del CHMP para obtener la licencia.
Día
Criterios Grupo de estudio
1 mg
1 µg con adyuvante 5 µg 5 µg con adyuvante 7,5 µg 15 µg 15 µg con adyuvante 30 µg 5 µg ITC
14
% de incremento 4 veces el título de HI. 40% 20 % 60%
(después de la primera inyección)
Incremento de la media geométrica. 1,9 1,7 2,8
% del título de HI de
1/40
40% 20% 40%
35
% de incremento 4 veces el título de HI. 80% * 100% * 80% *
(después del refuerzo)
Incremento de la media geométrica. % del título de HI de 10,6 * 20,8 * 7,7 *
1/40
100 % * 100% * 100 % *

Tabla 11: Datos para la cepa heteróloga (A/Anhui/5/05)
Día
Criterios Grupo de estudio
1 mg
1 µg con adyuvante 5 µg 5 µg con adyuvante 7,5 µg 15 µg 15 µg con adyuvante 30 µg 5 µg ITC
14
% de incremento 4 veces el título de HI. 40% 20 % 80%
(después de la primera inyección)
Incremento de la media geométrica. 1,8 1,3 6,4
% del título de HI de
1/40
20% 20% 80%
35
% de incremento 4 veces el título de HI. 100% * 100% * 60% *
(después del refuerzo)
Incremento de la media geométrica. % del título de HI de 11,8 * 14,4 * 3 *
1/40
100 % * 80% * 80 % *
Cepa
Criterios Grupo de estudio
1 µg con adyuvante
5 µg con adyuvante 15 µg con adyuvante
A/pavo/Turquía/1/05 (clado 2.2)
% de incremento 4 veces el título de HI. Incremento de la media geométrica. % del título de HI de 1/40 80% * 10,6 * 100% * 100% * 20,8 * 100% * 80% * 7,7 * 100% *
A/Anhui/1/05 (clado 2.3)
% de incremento 4 veces el título de HI. Incremento de la media geométrica. % del título de HI de 1/40 100% * 11,8 * 100% * 100% * 14,4 * 80% * 60% * 3* 80% *
A/Vietnam/1194/04 (clado 1)
% de incremento 4 veces el título de HI. Incremento de la media geométrica. % del título de HI de 1/40 60% 2,3 0% 80% * 7,1 * 80% * 60% 1,78 20%
Ejemplo 19: Selección de secuencias de nucleótidos de hemaglutinina
Las secuencias de nucleótidos de la HA fueron recuperadas de una base de datos de secuencia de la influenza (véase URL: flu.lanl.gov), o de las fuentes de virus de la influenza del NCBI (Bao et al., 2008. J. Virology 82 (2): 596 601; véase URL: ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Para varias de las secuencias de ácido nucleico de HA, se enumeran múltiples entradas en las bases de datos (Tabla 13). Alguna variación se asocia principalmente con el 5 sistema de cultivo (Origen -MDCK, huevo, ARN viral desconocido/aislado clínico); por ejemplo, el sitio de glicosilación en la posición 194 (numeración de la proteína madura) de la HA está ausente cuando el virus de la influenza tipo B se expresa en fluido alantoideo de los huevos (véase también Chen et al., 2008). Para algunas secuencias, pueden faltar los dominios (por ejemplo, clones incompletos, artefactos de secuenciación, etc.). Se discuten generalmente dominios y subdominios de hemaglutinina de la influenza en la descripción. Los dominios o
10 subdominios de una primera secuencia se pueden combinar con un dominio de una segunda secuencia existente, por ejemplo se puede combinar el péptido señal de una primera secuencia de una cepa con el resto de la secuencia de codificación de hemaglutinina de una segunda cepa para proporcionar una secuencia de codificación completa.
Tabla 13: Variación de los subtipos de la influenza para las secuencias de codificación de HA seleccionadas
Referencia No.
Cepa
de la base de datos de Origen SP HA1 HA2 DTm Divergencia
secuencia
189: R o G, 220:
H1
A/Islas Salomón/3/ 20 06 ISDN2315 58 (registro de la vacuna) MDCK S S S S K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
189: R G, 220: K
A/Islas Salomón/3/ 20 06
ISDN2381 90 Huevo S S S S (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
189: R o G, 220:
A/Islas Salomón/3/ 20 06
EU100724 ? S S S S K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
189: R o G, 220:
K (MDCK) T
A/Islas Salomón/3/ 20 06
ISDN2209 51 MDCK S S N N (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R
(Huevo)
189: R o G, 220:
A/Islas Salomón/3/ 20 06
ISDN2209 53 Huevo S S N N K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L
(MDCK) R (Huevo)
(continuación)
Cepa
Referencia No. de la base de datos de secuencia Origen SP HA1 HA2 DTm Divergencia
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU124137 Huevo S S N N 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU124135 MDCK S S N N 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
A/Islas Salomón/3/ 2006
EU124177 MDCK S S S S 189: R o G, 220: K (MDCK) T (Huevo), 249: Q (MDCK) R (Huevo), 550: L (MDCK) R (Huevo)
H1
A/Brisbane/59/ 2007 ISDN2826 76 MDCK S S S 203: D/I/N D es el más abundante en H1
A/Brisbane/59/ 2007
ISDN2851 01 Huevo S S N N 203: D/I/N D es el más abundante en H1
A/Brisbane/59/ 2007
ISDN2857 77 Huevo S S S S 203: D/I/N D es el más abundante en H1
A/Brisbane/59/ 2007
ISDN2826 77 Huevo S S S S 203: D/I/N D es el más abundante en H1
H3
A/Brisbane/10/2007 ISDN2748 93 Huevo S S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2576 48 MDCK N S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2567 51 Huevo S S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
(continuación)
Cepa
Referencia No. de la base de datos de secuencia Origen SP HA1 HA2 DTm Divergencia
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2737 57 Huevo S S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2737 59 Huevo S S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
EU199248 Huevo N S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
EU199366 Huevo S S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2570 43 Huevo N S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
EU199250 MDCK N S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2753 57 Huevo N S N N 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
A/Brisbane/ 10/2007
ISDN2604 30 Huevo N S S S 202: V/G, 210:L/P, 215: del Ala, 242: S/I
H3
A/Wisconsin/67/ 2005 ISDN1314 64 (Registro de la vacuna) ¿ N S S N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/S
A/Wisconsin/67/ 2005
DQ865947 ¿ N S parcial N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/S
A/Wisconsin/67/ 2005
EF473424 ¿ N S S N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/S
A/Wisconsin/67/ 2005
ISDN1387 23 Huevo N S S S 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/S
A/Wisconsin/67/ 2005
E473455 Huevo N S S S 138: A/S 156: H/Q 186: GN 196: H/S
A/Wisconsin/67/ 2005
ISDN1387 24 ¿ N S S S 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/S
(continuación) (continuación) (continuación)
Cepa
Referencia No. de la base de datos de secuencia Origen SP HA1 HA2 DTm Divergencia
B
B/Malasia/ 2506/ 2004 ISDN1266 72 (Registro de la vacuna) Huevo S S N N 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/2506/ 2004
EF566433 Huevo S S N N 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/2506/ 2004
ISDN2312 65 Huevo S S S S 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/2506/ 2004
ISDN2315 57 MDCK S S S S 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/2506/ 2004
EF566394 MDCK S S N N 120 K/N 210 T/A
B/Malasia/2506/ 2004
EU124274 Huevo S S S S 120 K/N 210 T/A
B/Malaysia/ 2506/2004
EU 124275 MDCK S S S S 120 K/N 210 T/A
B/Malaysia/ 2506/2004
ISDN1247 76 MDCK S S N N 120 K/N 210 T/A
B
B/Florida/4/ 2006 ISDN2616 49 Huevo S S S N Carece de sitio de glicosilación en la posición 211; 10 aminoácidos de DTm/cola citoplasmática
B/Florida/4/ 2006
EU100604 MDCK N S N N
B/Florida/4/ 2006
ISDN2180 61 MDCK N S N N
B/Florida/4/ 2006
ISDN2857 78 Huevo S S S S Incluye cola citoplasmática
B
B/Brisbane/3 /2007 ISDN2566 28 Huevo N S N N Carece de sitio de glicosilación en la posición 211
B/Brisbane/ 3/2007
ISDN2637 82 Huevo S S S S Carece de sitio de glicosilación en la posición 211
B/Brisbane/ 3/2007
ISDN2637 83 MDCK S S S S
Cepa
Referencia No. de la base de datos de secuencia Origen SP HA1 HA2 DTm Divergencia
H5
A/Vietnam/1194/ 2004 ISDN3868 6 (Registro de la vacuna) ¿ S S S S
A/Vietnam/1194/ 2004
AY651333 ? S S S S
A/Vietnam/1194/ 2004
EF541402 ? S S S S
H5
A/Anhui1/1/ 2005 DQ37928 (Registro de la vacuna) ? S S S S
A/Anhui1/1/ 2005
ISDN1314 65 Huevo S S S S
H7
A/Pollo/Italia/13474/ 1999 AJ91720 Gen de ARN S S S S
H7
A/Equino/Praga/56 AB298277 (Reclasificado en el laboratorio) ? S S S S 152 (R/G)
169 (T/I)
208 (N/D) (sitio de glicosilación eliminado)
A/Equino/Praga/56
X62552 ? S S S S
H9
A/Hong Kong/1073/ 1999 AJ404626 ? S S S S
A/Hong Kong/1073/ 1999
AB080226 ? N S N N
H2
A/Singapur/ 1/1957 AB296074 ? S S S S
A/Singapur /1/1957
L20410 RNA S S S S
A/Singapur /1/1957
L11142 ? S S S S
H2
A/Japón/305/ 1957 L20406 ? S S S S
A/Japón/305 /1957
L20407 ? S S S S
Cepa
Referencia No. de la base de datos de secuencia Origen S P HA1 HA2 DTm Divergencia
A/Japón/305 /1957
CY014976 ? S S S S
A/Japón/305 /1957
AY209953 ? S S N N
A/Japón/305 /1957
J02127 ? S S S S
A/Japón/305 /1957
DQ508841 ? S S S S
A/Japón/305 /1957
AY643086 ? S S S N
A/Japón/305 /1957
AB289337 ? S S S S
A/Japón/305 /1957
AY643085 ? S S S S
A/Japón/305 /1957
AY643087 Resistente a fármacos S S S N
H6
A/Cerceta/Hong Kong/W312/1997 (H6N1) AF250479 Huevo S S S S
S, N -Sí, No, respectivamente SP -presencia de secuencia de péptido señal S/N HA1 -dominio completo de HA1 S/N HA2 -dominio completo de HA2 S/N DTm -dominio transmembrana completo S/N
Cepa: H1 de A/Islas Salomón/3/2006 Se compararon ocho secuencias de aminoácidos, y se identificaron las variaciones. (Tabla 14). La posición 171 exhibió una variación de glicina (G) o de arginina (R) en algunas secuencias. Tabla 14. Variación de aminoácido de A/Islas Salomón/3/2006
Aminoácido #*
MDCK Huevo
212
K T
241
Q R
542
L R
Numeración de la partida M
Cepa: H1 de A/Brisbane/59/2007 La posición 203 exhibió una variación de ácido aspártico (D), isoleucina (I) o asparagina (N).
Cepa: H3 de A/Brisbane/10/2007 Se observaron variaciones de secuencia en 5 posiciones (Tabla 15). En la posición 215, se observa una supresión en dos secuencias muestreadas. Tabla 15: H3 a partir de la variación de aminoácido de A/Brisbane/10/2007
Origen
202, 210, 215, 235, 242*
ISDN274893
Huevo V L -Y I
ISDN273759
Huevo G P A S I
EU 199248
Huevo G P A S I
EU199366
Huevo G P A S I
ISDN273757
Huevo V L -S S
ISDN257043
Huevo G P A S I
EU199250
MDCK G L A S I
ISDN375357
Huevo G P A S I
ISDN260430
Huevo G P A S I
ISDN256751
Huevo G P A S I
ISDN257648
MDCK G L A S I
* Numeración de la partida M
Cepa: H3 de A/Wisconsin/67/2005 Se observaron variaciones de secuencia en esta cepa en 4 posiciones (Tabla 16). Tabla 16: H3 a partir de la variación de aminoácido de A/Wisconsin/67/2005
Origen
138, 156, 186, 196
ISDN138724
Desconocido A H G H
DQ865947
Desconocido S H V Y
EF473424
Desconocido A H G H
ISDN138723
Huevo S Q V Y
ISDN 131464
Desconocido A H G H
EF473455
Huevo A H G H
*Numeración de la proteína madura
10 Cepa: B de B/Malasia/2506/2004
Se observa una variación en dos posiciones (Tabla 17). La posición 120 no es un sitio de glicosilación; la posición 210 está implicada en la glicosilación; se elimina esta glicosilación tras el cultivo en huevos.
Tabla 17: Hemaglutinina a partir de la variación de aminoácido de B/Malasia/2506/2004
Aminoácido #*
MDCK Huevo
120
K N
210
T A
* Numeración de la mitad de SP
Cepa: hemaglutinina de B/Florida/4/2006; ISDN261649 Las variaciones observadas incluyen una variación en la secuencia de aminoácidos en la posición 211, que depende 5 del sistema de cultivo. La asparagina (N) se encuentra en las secuencias aisladas de células MDCK, mientras que el
ácido glutámico (D) se encuentra en la secuencia aislada de huevos. La posición 211 es un sitio de glicosilación, y se elimina tras el cultivo en huevos. Cepa: H2 de A/Singapur/1/1957 Se observaron variaciones de secuencia en 6 posiciones (Tabla 18).
10 Tabla 18: H2 a partir de una variación de aminoácido de A/Singapur/1/1957
Origen
Aminoácido No. 166 168 199\236 238 358
L20410
Viral RNA K E T L S V
L11142
Desconocido E G K L S I
AB296074
Desconocido K G T Q G V
Consenso A/Japón/305/1957
K G T Q/L G V
1 Numeración de la proteína madura
Cepas: H5 de A/Vietnam/1194/2004 y H5 de A/Anhui/1/2005 No se observaron variaciones en la secuencia de aminoácidos después de la alineación de las secuencias primarias de cualquiera de estas cepas H5.
15 Cepa: H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/1997
Sólo una entrada fue variable para la cepa (AF250179).
Cepa: H7 de A/Equino/Praga/56
Se encontraron un total de 2 entradas de secuencias en las bases de datos. Se excluyó la entrada AB298877 ya que
es una reclasificación de laboratorio. 20 Cepa: H9 de A/Hong Kong/1073/1999; AJ404626
Se encontraron un total de 2 entradas de secuencias en las bases de datos. Sólo una estaba completa.
Ejemplo 20. Expresión transitoria de hemaglutinina del virus de la influenza fusionada a un péptido señal de una
proteína secretada por la planta.
Se investigó también el efecto de la modificación del péptido señal sobre el nivel de acumulación de HA para otras 25 hemaglutininas mediante la expresión de las HA subtipo A a partir de las cepas A/Brisbane/59/2007 (H1N1)
(plásmido # 787), A/Nueva Caledonia/20/1999 (H1N1) (plásmido # 540), a partir de las cepas A/Brisbane/10/2007
(H3N2) (plásmido 790) y A/Indonesia/5/2005 (H5N1) (plásmido # 663) y del tipo B a partir de las cepas B/Florida/4/2006 (plásmido # 798) fusionada con el péptido señal (SP; nucleótidos 32 -103) de la proteína disulfuro isomerasa de alfalfa (PDI; número de acceso Z11499; SEQ ID NO: 34; Figura 17). Se ensamblaron fusiones del gen de SP-hemaglutinina de la PDI en el casete de expresión de plastocianina -promotor, 5'UTR, 3'UTR y secuencias de terminación de la transcripción del gen de plastocianina de alfalfa -y se insertaron los casetes ensamblados en un plásmido binario pCAMBIA. Los plásmidos se transfectaron a continuación en Agrobacterium (AGL1), produciendo cepas de Agrobacterium AGL1/787, AGL1/540, AGL1/790, AGL1/663 y AGL1/798, respectivamente.
Se infiltraron plantas de N. benthamiana con AGL1/787, AGL1/540, AGL1/790, AGL1/663 y AGL1/798. En forma paralela, se infiltró una serie de plantas con AGL1/774, AGL776, AGL1/660 y AGL1/779, para efectos de comparación. Se cosecharon las hojas después de un periodo de incubación de seis días y se extrajeron las proteínas de las hojas infiltradas y se analizaron por transferencias tipo Western utilizando los anticuerpos anti-HA apropiados. Se mejoró considerablemente la expresión de HA de H1/Brisbane y H3/Brisbane por medio del uso del SP de PDI en comparación con la expresión observada para las mismas HA con su péptido señal nativo (Fig. 87b y c, respectivamente). Se confirmó la expresión de una tercera HA del subtipo H1 (cepa A/New Caledonia/20/1999) usando esta estrategia de reemplazo del SP (Fig. 87a). La modificación del péptido señal no condujo a un aumento sustancial en la acumulación de HA para H5 (A/Indonesia/5/2005) (Figura 87d), y no se detectó señal para HA de la cepa B/Florida/4/2006, independientemente del péptido señal utilizado para la expresión (Figura 87e). Para todas las condiciones en las que se detectó la expresión de HA, se observó una única banda inmunorreactiva con un peso molecular de aproximadamente 72 kDa (Fig. 87a a d), corresponde en tamaño al precursor de HA0 no escindida.
Ejemplo 21. Expresión de HA bajo el control del casete de expresión de CPMV-HT.
Se utilizó un casete de expresión de CPMV-HT (Sainsbury et al. 2008 Plant Physiology 148: 1212 -1218, véase también el documento WO 2007/135480) que comprende secuencias no traducidas del ARN2 del virus del mosaico del caupí (CPMV) para la expresión de algunos hemaglutininas en plantas transgénicas. Se expresaron HA de A/Nueva Caledonia/20/1999 (H1), A/Brisbane/59/2007 (H1), A/Brisbane/10/2007 (H3), A/Indonesia/5/2005 (H5) y B/Florida/4/2006 (B) bajo el control de CPMV-HT en plantas de N. benthamiana, agroinfiltradas como se describe. Después de la incubación, se recogieron las hojas, se extrajeron y se compararon los contenidos de HA en extractos de proteína por transferencias tipo Western. Como se muestra en la Figura 88, el casete de expresión de CPMV-HT condujo a un mayor nivel de expresión de HA que el casete de plastocianina, independientemente del péptido señal utilizado. Además, para la cepa B de B/Florida/4/2006, el uso del casete de expresión de CPMV-HT permitió la detección de la acumulación de HA que permaneció indetectable bajo estas condiciones de inmunodetección cuando se expresa bajo el casete de plastocianina.
Tabla 19: Casete de expresión usado para la expresión de hemaglutininas de influenza con péptidos señal nativos o de PDI
Cepa Agro
HA expresada Péptido señal Casete de expresión
AGL1/560
H1 (A/California/04/09) PDI 2X35S/CPMV-HT
AGL1/540
H1 (A/New Caledonia/20/99) PDI Plastocianina
AGL1/580
H1 (A/New Caledonia/20/99) PDI CPMV-HT
AGL1/774
H1 (A/Brisbane/59/2007) nativo Plastocianina
AGL1/787
H1 (A/Brisbane/59/2007) PDI Plastocianina
AGL1/732
H1 (A/Brisbane/59/2007) nativo CPMV-HT
AGL1/776
H3 (A/Brisbane/10/2007) nativo Plastocianina
AGL1/790
H3 (A/Brisbane/10/2007) PDI Plastocianina
AGL1/735
H3 (A/Brisbane/10/2007) nativo CPMV-HT
AGL1/736
H3 (A/Brisbane/10/2007) PDI CPMV-HT
AGL1/660
H5 (A/Indonesia/5/2005) nativo Plastocianina
AGL1/685
H5 (A/Indonesia/5/2005) nativo CPMV-HT
(continuación)
Cepa Agro
HA expresada Péptido señal Casete de expresión
AGL1/779
B (B/Florida/4/2006) nativo Plastocianina
AGL1/798
B (B/Florida/4/2006) PDI Plastocianina
AGL1/738
B (B/Florida/4/2006) nativo CPMV-HT
AGL1/739
B (B/Florida/4/2006) PDI CPMV-HT
Ejemplo 22. Coexpresión con Hsp70 y Hsp40 en combinación con la modificación del péptido señal.
Hsp70 y Hsp40 citosólicos (constructo número R870) de origen vegetal fueron coexpresados con H1 de Nueva
5 Caledonia (constructo número 540) o H3 de Brisbane (constructo número 790), ambos con un péptido señal de origen vegetal (péptido señal de PDI de alfalfa). Se llevó a cabo la coexpresión mediante la agroinfiltración de plantas de N. benthamiana con una suspensión bacteriana que contiene una mezcla (proporción 1:1:1) de AGL1/540, AGL1/R870, AGL1/35SHcPro (Para H1) o AGL1/790, AGL1/R870 y AGLI/35SHcPro (para H3). Las plantas de control fueron agroinfiltradas con una mezcla (proporción 1:2) de AGL1/540, AGLI/35SHcPro (para H1) o
10 AGL1/790, AGL1/35SHcPro (para H3). Después de la incubación, se recolectaron las hojas, se extrajeron y se compararon los contenidos de HA en extractos de proteínas mediante transferencias tipo Western (Figura 89). En las condiciones ensayadas, los resultados obtenidos indican que la coexpresión de Hsp70 y Hsp40 no aumentó el nivel de acumulación de hemaglutinina para H1 de Nueva Caledonia. Sin embargo, para H3 de Brisbane, las transferencias tipo Western indicaron claramente que la coexpresión de Hsp70 y Hsp40 citosólicos resultó en un
15 aumento significativo en el nivel de acumulación de hemaglutinina.
Ejemplo 23. Expresión de H1 de A/California/04/09 bajo el control del casete de expresión de 2X35S/CPMV-HT.
Se utilizó también un casete de expresión de CPMV-HT para la expresión de H1 de A/California/04/09 (constructo # 560, Figuras 90, 98) en plantas de N. benthamiana, agroinfiltradas como se describe. Después de 2 días de incubación, se recogieron las hojas, se extrajeron y se compararon los contenidos de HA en extractos de proteína
20 mediante transferencias tipo Western. Como se muestra en la Figura 91, el casete de expresión de CPMV-HT condujo a una expresión significativa de HA 2 días después de la infiltración. Las VLP producidas a partir de la expresión de HA en plantas demostraron la aglutinación de glóbulos rojos.
Tabla 20: muestras para cada carril de la transferencia tipo Western ilustrada en la Figura 91.
Carril #
Descripción
1
10 ng de H1 (A/Bri/59/07) Control positivo (ITC, IT-003-0052p)
2
40 ng de H1N1 (A/NC/20/99) Control positivo (NISBC, 06/170)
3
40 ng de H1 (A/Bri/59/07) Control positivo (NISBC, 08/100)
4
Planta infiltrada en forma simulada Control negativo
5
BW09-I001-560-1 2X35S-CPMV HT H1 A/California/4/09
6
BW09-I001-560-2 2X35S-CPMV HT H1 A/California/4/09
7
BW09-I001-560-3 2X35S-CPMV HT H1 A/California/4/09
8
BW09-I001-560-6 2X35S-CPMV HT H1 A/California/4/09
25 Todas las citas se incorporan como referencia. La presente invención ha sido descrita con respecto a una o más realizaciones.
Listado de secuencias
<110> Medicago Inc.
<120> Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que comprenden hemaglutinina
<130> 1088-0013
5 <140> EP
<141> 2009-07-02
<150> PCT/CA2008/001281
<151> 2008-07-11
<150> PCT/CA2008/000032
10 <151> 2009-01-12
<160> 146
<170> PatentIn versión 3.4
<210> 1
<211> 1556
15 <212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 1 <210> 2
<211> 219
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 2
<210> 3
<211> 1719
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 3
<210> 4
<211> 25
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador Plasto-443c
<400> 4
gtattagtaa ttagaatttg gtgtc
25
10
<210> 5
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> cebador SpHA(Ind)-Plasto.r
<400> 5
gcaagaagaa gcactatttt ctccattttc tctcaagatg atta
44
<210> 6
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador SpHA(Ind)-Plasto.r
5 <400> 6
ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt cttgc 45
<210> 7
<211> 38
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador HA(Ind)-Sac.r
<400> 7 actttgagct cttaaatgca aattctgcat tgtaacga 38
15 <210> 8
<211> 1471
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> casete de expresión basado en plastocianina de alfalfa
<400> 8
<210> 9
<211> 565
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 9
<210> 10
<211> 568
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 10
<210> 11
<211> 1629
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 11
<210> 12
<211> 1773
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 12
<210> 13
<211> 1086
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 13
<210> 14
<211> 1048
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 14
<210> 15
<211> 1707
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 15
<210> 16
<211> 1050
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 16
<210> 17
<211> 1698
<212> ADN 10 <213> Virus de la influenza
<400> 17
<210> 18
<211> 1363
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 18
<210> 19
<211> 1727
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 19
<210> 20
<211> 1698
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 20
<210> 21
<211> 1695
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 21
<210> 22
<211> 1701
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 22
<210> 23
<211> 1749
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 23
<210> 24
<211> 1762
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 24
<210> 25
<211> 1760
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 25
<210> 26
<211> 1882
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 26
<210> 27
<211> 2073
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 27
<210> 28
<211> 1670
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> secuencia que codifica HA0 de H1 (A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1)
<400> 28 <210> 29
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador XmaI-pPlas.c
<400> 29
agttccccgg gctggtatat ttatatgttg tc 32
<210> 30
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador SacI-ATG-pPlas.r
<400> 30
aatagagctc cattttctct caagatgatt aattaattaa ttagtc
46
<210> 31
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador SacI-PlasTer.c
<400> 31
aatagagctc gttaaaatgc ttcttcgtct cctatttata atatgg
46
<210> 32
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador EcoRI-PlasTer.r
<400> 32
ttacgaattc tccttcctaa ttggtgtact atcatttatc aaagggga
48
<210> 33
<211> 1711
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 33
<210> 34
<211> 1781
<212> ADN
<213> Medicago sativa
<400> 34
<210> 35
<211> 1027
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 35 <210> 36
5 <211> 1788
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 774 -secuencia de nucleótidos de A/Brisbane/59/2007 (H1N1)
10 <400> 36 <210> 37 <211> 1788
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 775 -secuencia de nucleótidos de A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1)
<400> 37 <210> 38
<211> 1791
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 776 -secuencia de nucleótidos de A/Brisbane 10/2007 (H3N2)
<400> 38
<210> 39
<211> 1791
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 777 -secuencia de nucleótidos de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)
<400> 39
<210> 40
<211> 1848
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 778 -secuencia de nucleótidos de B/Malasia/2506/2004
<400> 40
<210> 41
<211> 1845
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 779 -secuencia de nucleótidos de B/Florida/4/2006
<400> 41
<210> 42
<211> 1779
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 780 -secuencia de nucleótidos de A/Singapur/1/57 (H2N2)
<400> 42 <210> 43
<211> 1794
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 781 -secuencia de nucleótidos de A/Anhui/1/2005 (H5N1)
<400> 43
<210> 44
<211> 1797
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 782 -secuencia de nucleótidos de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1)
<400> 44
<210> 45
<211> 1791
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 783 -secuencia de nucleótidos de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1)
<400> 45
<210> 46
<211> 1803
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 784 -secuencia de nucleótidos de A/Equino/Praga/56 (H7N7)
<400> 46
<210> 47
<211> 1773
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 785 -secuencia de nucleótidos de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)
<400> 47
<210> 48
<211> 565
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 774 (A/Brisbane/59/2007 (H1N1)
<400> 48
<210> 49
<211> 565
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 775 (A/Islas Salomón 3/2006 (H1N1)
<400> 49
<210> 50
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 776 (A/Brisbane/10/2007 (H3N2)
<400> 50
<210> 51
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 777 (A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)
<400> 51
<210> 52
<211> 585
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 778 (B/Malasia/2506/2004)
<400> 52
<210> 53
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> clon 779 (B/Florida/4/2006)
<400> 53
<210> 54
<211> 562
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 780 (A/Singapur/1/57 (H2N2))
<400> 54
<210> 55
<211> 567
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 781 (A/Anhui/1/2005 (H5N1))
<400> 55
<210> 56
<211> 568
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 782 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1))
<400> 56
<210> 57
<211> 566
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 783 (A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1))
<400> 57
<210> 58
<211> 570
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 784 (A/Equino/Praga/56 (H7N7))
<400> 58
<210> 59
<211> 560
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> clon 785 (A/Hong Kong/1073/99 (H9N2))
<400> 59
<210> 60
<211> 3111
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H5 de A/Indonesia/5/2005 (Constructo # 660)
<400> 60
<210> 61
<211> 3123
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H1 de A/Nueva Caledonia/20/1999 (Constructo # 540)
<400> 61
<210> 62
<211> 3088
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> H1 de A/Brisbane/59/2007 (Constructo #774)
<400> 62
<210> 63
<211> 3102
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> H1 de A/Islas Salomón/3/2006 (H1N1) (Constructo # 775)
<400> 63
<210> 64
<211> 3093
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H2 de A/Singapur/1/57 (H2N2) (Constructo # 780)
<400> 64
<210> 65
<211> 3108
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H5 de A/Anhui/1/2005 (H5N1) (Constructo # 781)
<400> 65
<210> 66
<211> 3111
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H5 de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) (Constructo # 782)
<400> 66
<210> 67
<211> 3105
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> H6 de A/Cerceta/Hong Kong/W312/97 (H6N1) (Constructo # 783)
<400> 67
<210> 68
<211> 3087
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H9 de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (Constructo # 785)
<400> 68
<210> 69
<211> 3105
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H3 de A/Brisbane/10/2007 (H3N2)
<400> 69
<210> 70
<211> 3105
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H3 de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)
<400> 70
<210> 71
<211> 3117
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H7 de A/Equino/Praga/56 (H7N7)
<400> 71
<210> 72
<211> 3162
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HA de B/Malasia/2506/2004
<400> 72
<210> 73
<211> 3159
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HA de B/Florida/4/2006
<400> 73
<210> 74
<211> 565
<212> PRT 5 <213> Virus de la influenza
<220>
<221> característica nueva
<222> (3)..(3)
<223> Xaa puede ser Ala o Val
10 <220>
<221> característica nueva
<222> (52)..(52)
<223> Xaa puede ser Asp o Asn
<220>
<221> característica nueva
<222> (90)..(90)
<223> Xaa puede ser Lys o Arg
<220>
<221> característica nueva
<222> (99)..(99)
<223> Xaa puede ser Lys o Thr
<220>
<221> característica nueva
<222> (111)..(111)
<223> Xaa puede ser Tyr o His
<220>
<221> característica nueva
<222> (145)..(145)
<223> Xaa puede ser Val o Thr
<220>
<221> característica nueva
<222> (157)..(157)
<223> Xaa puede ser Glu Lys
<220>
<221> característica nueva
<222> (162)..(162)
<223> Xaa puede ser Arg o Lys
<220>
<221> característica nueva
<222> (182)..(182)
<223> Xaa puede ser Val o Ala
<220>
<221> característica nueva
<222> (203)..(203)
<223> Xaa puede ser Asp o Asn
<220> <221> característica nueva
<222> (205)..(205)
<223> Xaa puede ser Arg o Lys
<220>
<221> característica nueva
<222> (210)..(210)
<223> Xaa puede ser Thr o Lys
<220>
<221> característica nueva
<222> (225)..(225)
<223> Xaa puede ser Arg o Lys
<220>
<221> característica nueva
<222> (268)..(268)
<223> Xaa puede ser Trp o Arg
<220>
<221> característica nueva
<222> (283)..(283)
<223> Xaa puede ser Thr o Asn
<220>
<221> característica nueva
<222> (290)..(290)
<223> Xaa puede ser Glu o Gly
<220>
<221> característica nueva
<222> (432)..(432)
<223> Xaa puede ser Ile o Leu
<220>
<221> característica nueva
<222> (489)..(489)
<223> Xaa puede ser Asn o Asp
<400> 74
<210> 75
<211> 565
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 75
<210> 76
<211> 252
<212> PRT
<213> Virus de la influenza
<400> 76
<210> 77
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> pBinPlus.2613c
<400> 77 aggaagggaa gaaagcgaaa ggag 24
<210> 78
<211> 56
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Mut-ATG115.r
<400> 78 gtgccgaagc acgatctgac aacgttgaag atcgctcacg caagaaagac aagaga 56
<210> 79
<211> 52
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Mut-ATG161.c
<400> 79 gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc ga 52
<210> 80
<211> 25
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> LC-C5-1.110r
<400> 80 tctcctggag tcacagacag ggtgg 25
<210> 81
<211> 2065
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Casete de expresión número 828
<400> 81
<210> 82
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SpPDI-HA(Ind).c
<400> 82 gttccttctc agatcttcgc tgatcagatt tgcattggtt accatgca 48
<210> 83
<211> 3218
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 663, de HindIII
<400> 83
<210> 84
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SpPDI-H1B.c
<400> 84 ttctcagatc ttcgctgaca caatatgtat aggctaccat gctaacaac 49
<210> 85
<211> 47
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5 <220>
<223> SacI-H1B.r
<400> 85 cttagagctc ttagatgcat attctacact gtaaagaccc attggaa 47
<210> 86
10 <211> 3206
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 787, de HindIII
15 <400> 86
<210> 87
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H3B-SpPDI.r
<400> 87
tgtcatttcc gggaagtttt tgagcgaaga tctgagaagg aacca
45
<210> 88
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SpPDI-H3B.c
<400> 88
tctcagatct tcgctcaaaa acttcccgga aatgacaaca gcacg
45
<210> 89
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H3(A-Bri).982r
<400> 89
ttgcttaaca tatctgggac agg 23
<210> 90
<211> 3212
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 790, de HindIII
<400> 90
<210> 91
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HBF-SpPDI.r
<400> 91
gttattccag tgcagattcg atcagcgaag atctgagaag gaaccaacac
50
<210> 92
<211> 50
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SpPDI-HBF.c
<400> 92
cagatcttcg ctgatcgaat ctgcactgga ataacatctt caaactcacc
50
<210> 93
<211> 28
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Plaster80r
<400> 93
caaatagtat ttcataacaa caacgatt 28
<210> 94
<211> 3269
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 798, de HindIII
<400> 94
<210> 95
<211> 45
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ApaI-SpPDI.c
<400> 95
ttgtcgggcc catggcgaaa aacgttgcga ttttcggctt attgt
45
10
<210> 96
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> StuI-H1(A-NC).r
<400> 96
5
aaaataggcc tttagatgca tattctacac tgcaaagacc ca 42
<210> 97
<211> 3079
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Constructo número 580, de PacI
<400> 97
<210> 98
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ApaI-H5 (A-Indo).1c
<400> 98
tgtcgggccc atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaat
39
<210> 99
<211> 37
5
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> H5 (A-Indo)-StuI.1707r
<400> 99
10
aaataggcct ttaaatgcaa attctgcatt gtaacga 37
<210> 100
<211> 3067
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Constructo número 685, de PacI
<400> 100
<210> 101
<211> 3091
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 686, de PacI
<400> 101
<210> 102
<211> 45
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ApaI-H1B.c
<400> 102
tgtcgggccc atgaaagtaa aactactggt cctgttatgc acatt
45
10
<210> 103
<211> 46
<212> ADN
266
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> StuI-H2B.r
<400> 103
5
aaataggcct ttagatgcat attctacact gtaaagaccc attgga 46
<210> 104
<211> 3058
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Constructo 732, de PacI
<400> 104
<210> 105
<211> 3079
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 733, de PacI
<400> 105
<210> 106
<211> 48
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> ApaI-H3B.c
<400> 106
ttgtcgggcc catgaagact atcattgctt tgagctacat tctatgtc
48
10
<210> 107
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> StuI-H3B.r
<400> 107
aaaataggcc ttcaaatgca aatgttgcac ctaatgttgc cttt
44
<210> 108
<211> 3061
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 735, de PacI
<400> 108
<210> 109
<211> 3085
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 736, de PacI
<400> 109
<210> 110
<211> 46
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> ApI-HBF.c
<400> 110 ttgtcgggcc catgaaggca ataattgtac tactcatggt agtaac 46
10 <210> 111
<211> 46
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> StuI-HBF.r
<400> 111 aaaataggcc tttatagaca gatggagcat gaaacgttgt ctctgg 46
<210> 112
<211> 3115
20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 738, de PacI
<400> 112
<210> 113
<211> 3142
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número 739, de PacI
<400> 113
<210> 114
<211> 1272
<212> ADN
<213> Medicago sativa
<400> 114
gctcaacagt ag 1272
<210> 115
<211> 20
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hsp-40Luz.1c
<400> 115 10 atgtttgggc gcggaccaac 20
<210> 116
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hsp40Luz-SacI.1272r
<400> 116
agctgagctc ctactgttga gcgcattgca c
31
<210> 117
<211> 36
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hsp40Luz-Plasto.r
<400> 117
gttggtccgc gcccaaacat tttctctcaa gatgat
36
<210> 118
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hsp70Ara.1c
<400> 118
atgtcgggta aaggagaagg a 21
<210> 119
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hsp70Ara-SacI.1956r
<400> 119
agctgagctc ttagtcgacc tcctcgatct tag
33
<210> 120
<211> 37
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hsp70Ara-Plasto.r
5 <400> 120
tccttctcct ttacccgaca ttttctctca agatgat 37
<210> 121
<211> 4402
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número R850, de HindIII
<400> 121
<210> 122
<211> 5086
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número R860, de HindIII
<400> 122
<210> 123
<211> 9493
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo número R870, de HindIII
<400> 123
<210> 124
<211> 34
<212> ADN
5
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> supP19-plasto.r
<400> 124
ccttgtatag ctcgttccat tttctctcaa gatg
34
10
<210> 125
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
15
<223> supP19-1c
<400> 125
atggaacgag ctatacaagg
20
<210> 126
<211> 32
20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SupP19-SacI.r
<400> 126 5 agtcgagctc ttactcgctt tctttttcga ag 32
<210> 127
<211> 3462
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> A/California/04/09 (casete número 560)
<400> 127
<210> 128
<211> 573
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> A/California/04/09
<400> 128
<210> 129
<211> 747
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> promotor 2X35S
<400> 129
<210> 130 <211> 3505
<211> 43
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador PacI-MCS-2X35S.c
<400> 130
aattgttaat taagtcgaca agcttgcatg cctgcaggtc aac
43
<210> 131
<211> 48
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador CPMV 5’UTR-2X35S.r
<400> 131
tcaaaaccta ttaagatttt aatacctctc caaatgaaat gaacttcc
48
<210> 132
<211> 49
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador 2X35S-CPMV 5’UTR.c
<400> 132
ttggagaggt attaaaatct taataggttt tgataaaagc gaacgtggg
49
<210> 133
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador ApaI-M prot.r
<400> 133
tctccatggg cccgacaaat ttgggcagaa tatacagaag ctta 44
<210> 134
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> casete de expresión número 972
<400> 134
<210> 135
<211> 1701
<212> ADN
<213> Virus de la influenza
<400> 135
<210> 136
<211> 2056
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> para ser sintetizado que contiene H1 A/California/4/2009
<400> 136
<210> 137
<211> 714
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> fragmento sintetizado 1
<400> 137
5 <210> 138
<211> 849
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 10 <223> fragmento sintetizado 2
<400> 138
<210> 139
<211> 651
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> fragmento sintetizado 3
<400> 139
<210> 140
<211> 48
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador DraIII-MProt#2.c
<400> 140 atgctaatat cacgtagtgc ggcgccatta aataacgtgt acttgtcc 48
10 <210> 141
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> cebador H1 Cal.390r
<400> 141 gcttaattgc tctcttagct cctcataatc gatgaaatct cc 42
<210> 142
<211> 42
20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador H1 Cal.310c <400> 146
<400> 142
tggaaacacc tagttcagac aatggaacgt gttacccagg ag
42
<210> 143
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador H1 Cal.1159r
<400> 143
ctgcatatcc tgacccctgc tcattttgat ggtgataacc gt
42
<210> 144
<211> 42
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador H1 Cal.1081c
<400> 144
ttgaaggggg gtggacaggg atggtagatg gatggtacgg tt
42
<210> 145
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador StuI-H1 Cal.r
<400> 145
tattaggcct ttaaatacat attctacact gtagagaccc attag
45
<210> 146
<211> 3520
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> casete de expresión número 560
Referencias: Aymard, H. M., M. T. Coleman, W. R. Dowdle, W. G. Laver, G. C. Schild, and R. G. Webster. 1973. Influenza virus neuraminidase-inhibition test procedures. Bull. W.H.O. 48: 199-202
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15 hemagglutinin. Science 303: 1838-1842.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina de la influenza (HA) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con (HA) del tipo A/California/04/09, en donde la secuencia de nucleótidos comprende un elemento regulador que es operativo en una planta, comprendiendo el elemento regulador un virus del mosaico de caupí (CPMV)-HT.
  2. 2.
    El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la HA comprende un péptido señal nativo o no nativo y/o opcionalmente en donde el péptido señal no nativo es un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa.
  3. 3.
    Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina de la influenza (HA) que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con (HA) del tipo A/California/04/09, en donde el HA comprende un péptido señal de proteína disulfuro isomerasa, operativamente enlazado a una región reguladora activa en una planta.
  4. 4.
    El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la secuencia de hemaglutinina de la influenza se selecciona a partir de la SEQ ID NO: 127 y 135.
  5. 5.
    Un método de producción de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta que comprende:
    a) introducir el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 en la planta, o porción de la planta, y
    b) incubar la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.
  6. 6. El método de la reivindicación 5, que comprende además las etapas de
    c) cosechar la planta, y
    d) purificar las VLP, en donde las VLP están en un intervalo de tamaño de 80 -300 nm.
  7. 7.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 -6, en donde en la etapa de introducción (etapa a), se introduce el ácido nucleico en la planta en una forma transitoria o se introduce el ácido nucleico en la planta de forma tal que sea estable.
  8. 8.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 -7, en donde en la etapa de introducción (etapa a), se introduce un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteínas chaperonas en la planta, en donde las una o más proteínas chaperonas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de Hsp40 y Hsp70.
  9. 9.
    Un método de producción de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta que comprende:
    a) proporcionar una planta, o una porción de una planta, que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, y
    b) incubar la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.
  10. 10.
    Una planta que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4.
  11. 11.
    La planta de la reivindicación 10, que comprende además un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteínas chaperonas operativamente enlazadas a una región reguladora activa en la planta, en donde las una o más proteínas chaperonas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de Hsp40 y Hsp70.
  12. 12.
    Una partícula similar a un virus (VLP) producida en una planta, comprendiendo la VLP una hemaglutinina del virus de la influenza (HA) codificada por el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, y uno o más de un lípido derivado de una planta y/o opcionalmente teniendo N-glicanos o N-glicanos modificados específicos de la planta.
  13. 13.
    Una partícula similar a virus (VLP) producida por el método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 -9 y / o opcionalmente contando con N-glicanos, o N-glicanos modificados específicos de la planta.
  14. 14.
    Una composición que comprende una dosis eficaz de la VLP de una cualquiera de las reivindicaciones 12 -13 para inducir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  15. 15.
    Una vacuna que comprende una dosis eficaz de la VLP de una cualquiera de las reivindicaciones 12 -13 para inducir una respuesta inmune.
  16. 16.
    La partícula similar a virus de cualquiera de las reivindicaciones 12 -13, la composición de la reivindicación 14 o la vacuna de la reivindicación 15 para su uso en la inducción de inmunidad a una infección por virus de la influenza en un sujeto.
    Fig. 1B Fig. 2A Fig. 2B
    Fig 5
    HA0 de H1 (SEQ ID NO: 28)
    Fig. 8A
    Secuencia del péptido HA1 (SEQ ID NO: 9)
    Fig. 8B
    Secuencia del péptido HA5 (SEQ ID NO: 10)
    FIG. 9
    Subtipo H7 (SEQ ID NO: 11)
    >BHB 940420 | gb: AF071776 | Símbolo : HA |Nombre : hemaglutinina precursor | Organismo: Virus A/pollo/Nueva York/1995 de la influenza A Cromosoma : 4 | Subtipo : H7 | Huésped : Ave
    Fig. 10A
    >gi|408516|gb|L11132.1|FLADE88HA gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A (A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8)), cds completa
    Fig. 10B
    >BHB2107299|GB: EF473574 | Símbolo: HA | Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/Texas/32/2003 de la Influenza A| Segmento: 4| Subtipo: H3| Huésped: Humano
    Fig. 10C
    >BHB1050162| gb: DQ021859| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/Ánade real/MN/33/00 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H4 |Huésped: Ave
    Fig. 10D
    >BHB 950029 |gb: AF501235| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/pato/Shangai/1/2000 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H5 |Huésped: Ave
    Fig. 10E
    >BHB 1049778 |gb: DQ021667| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/Ánade rabudo/TX/828189/02 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H6 |Huésped: Ave
    Fig. 10F
    >gi | 221317 |dbj | D90304.1 | FLAHAH8N4 Virus (A/Turquia/Ontario/6118/68 (H8N4) de la influenza A)) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10G
    >BHB 954830 |gb: AM087218| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/pato cuchara/Iran/G54/03 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H9 |Huésped: Ave
    Fig. 10H
    >gi | 324365 | gb | M21647.1| FLAMS84HA Virus (A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10I
    >gi | 221307 | dbj | D90306.1| FLAHAHA11N Virus (A/pato/Inglaterra/56(H11N6) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10J
    >gi | 221309 | dbj | D90307.1| FLAHAHA12N Virus (A/pato/Alberta/60/76(H12N5) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10K
    >gi | 221311| dbj | D90308.1| FLAHAHA13N Virus (A/gaviota/Meryland/704/77(H13N6) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10L
    >gi | 324045| gb | M35997.1| FLAHA1424 A/ánade real/Gurjev/263/82 de la influenza A gen de hemaglutinina subtipo H14
    Fig. 10M
    >gi | 126068| gb | L43916.1| FLAHEMAC A/pato/Australia/341/83 de la influenza A mARN de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10N
    >gi | 56425020| gb | AY684891.1|Virus (A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3) de la influenza A) gen (HA) de hemaglutinina, cds completo
    Fig. 10O
    Influenza B (SEQ ID NO: 26)
    >gi | 325175| gb | K00423.1|FLBHAZO Influenza B/Lee/40, hemaglutinina (seg 4), segmento completo
    Fig. 10P
    Influenza C (SEQ ID NO: 27)
    >gi | 325317| gb | M17B68.1|FLCHAJO Influenza C/Johannesburgo/66 (H16N3) ARN de hemaglutinina esterasa (seg 4), cds completo
    1-H5 comercial (A/Vietnam/1203/2004) (750 ng) 2-Extracto de proteína de hoja de imitación (37,5 µg) 3-Extracto de proteína de hoja de una planta infiltrada con R660 (37,5 µg)
    Fig. 65
    Consenso de la SEQ ID NO: 49, 48, 33 Y 9
    SEQ ID NO: 74
    Figura 68 Figura 69 Figura 70 Figura 71 Figura 72 Figura 73 Figura 74 Figura 75 Figura 76 Figura 77 Figura 78 Figura 79 Figura 80 Figura 81 Figura 82 Figura 83 Figura 84 Figura 85A Figura 85B Figura 86
    Fig. 93
    Secuencia promotora 2x35S (SEQ ID NO: 129)
    Fig. 94
    Casete de expresión intermedia número 972 desde Pacl (promotor secuencia arriba) hasta Ascl (inmediatamente secuencia bajo del terminador NOS). La secuencia del promotor 2X35S está subrayada. ATG mutado está entre una caja. El sitio de restricción Apal (inmediatamente secuencia debajo de ATG para la secuencia que codifica la proteína que va a ser expresada, en este caso HA0 de H5 de A/Indonesia), está sombreado. (SEQ ID NO: 134)
    Fig. 95
    Secuencia de H1 nativa de A/California/4/2009. El péptido señal de H1 nativa de A/California/4/2009 está subrayado. Los sitios de restricción Sacl y Stul están entre cajones. (SEQ ID NO: 135)
    Fig. 96
    Secuencia final que va a ser sintetizada que contiene la secuencia de H1 de A/California/4/2009. La porción de la proteína M desde el sitio de restricción Dralll hasta Apal está subrayada. PDISP está en negrita. Los sitios de restricción Sacl y Stul mutados están entre cajones. (SEQ ID NO: 136)
    Fig. 97
    Fragmento 1 sintetizado (SEQ ID NO: 137)
    Fragmento 2 sintetizado (SEQ ID NO: 138)
    Fragmento 3 sintetizado (SEQ ID NO: 139)
    Fig. 98
    Casete de expresión número 560, desde Pacl (promotor secuencia arriba) hasta Ascl (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS). La secuencia de PDISP-HA0 H1 de A(California/4/2009 está subrayada. (SEQ ID NO: 146)
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