CN110325208A - 针对流感的疫苗接种的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述的是针对流感的疫苗接种的组合物和方法。该组合物包括重组工程流感血球凝集素多肽。还公开了在基于细胞的体系中生产重组工程流感血球凝集素多肽的方法。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求美国临时申请第62/396,041号(于2016年9月16日提交)的权益，其整体通过援引并入。
背景技术
由于流感和它的并发症，在美国，每年约36,000人死亡并且约200,000人住院。流感更多地影响老年人、年幼的人、免疫功能不全的那些人和孕妇。目前，通过疫苗接种的预防性治疗是最好的方式，用以防止流感相关的死亡、疾病以及传染病传播到高风险的个体。然而，流感对疫苗接种工作提出了重大的挑战。因为流感病毒是季节性的并且具有高突变率，新的疫苗必须每年采用正确的流感菌株来重新配制。
流感是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒。该科包括5个不同的属，其中3个是流感病毒，A、B和C。3个属都能够感染人类，但是大部分疾病是由A类型引起的，并且较低程度地由B类型和C类型引起。A类型可基于对它们表面蛋白的不同抗体反应被进一步细分为血清型(亚型)；血球凝集素(hemagglutinin)和神经氨酸苷酶(neuraminidase)(唾液酸酶)(sialidase)。血清型通常通过使用表示特定的血球凝集素的“H”符号和表示特定的神经氨酸苷酶的“N”符号来表示。导致血清型的两种最常见的人类疾病是H1N1，其引起了1918西班牙流感传染病(Spanish flu epidemic)和H3N2。任一血清型的不同流感菌株是使用属、地理位置、样品号和分离年份命名的。例如A/莫斯科(Moscow)/10/1999。
季节性流感疫苗通常包含在流感季节来临之前筛选的3个或4个不同的菌株。传统的流感疫苗包括在鸡蛋中产生的失活的全病毒并且是通过皮内注射递送(给药)的。现在有包含活的致弱病毒的疫苗，也是在鸡蛋中培养的，以鼻内喷雾的形式递送(给药)。另外，目前，市场上有无需使用蛋制成的单价疫苗这种疫苗使用昆虫细胞中的杆状病毒表达体系生产，并且包括整个血球凝集素蛋白。
在蛋中培养的传统疫苗存在几个问题。季节性疫苗的生产仅仅发生在紧迫的时间表中，允许在已经筛选季节性菌株之后生产几个月。筛选的菌株也许生长不好或生长较慢，导致在流感季节来临时疫苗给药延误。批次很容易被污染，导致进一步的延误或供应减少。由于活的培养流感病毒具有天生的突变和重组能力，产品可能是多样化的。另外，在蛋中培养的病毒对具有鸡蛋过敏的那些人来说存在危险。另一方面，重组疫苗能提供更安全更一致的产品，给药更快并且成本更低。
发明内容
在某些实施方案中，本文所描述的是包括一种或多于一种分离的工程流感多肽(one or more isolated,engineered influenza polypeptides)的组合物，其中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽：(a)包括血球凝集素HA1区，并且(b)不包括血球凝集素HA2区或跨膜区。在某些实施方案中，该组合物包括两种或多于两种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该组合物包括三种或多于三种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该组合物包括四种或多于四种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该组合物包括五种或多于五种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括指导多肽从细胞分泌的信号序列。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A或B。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型B。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自H1N1或H3N2亚型。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区大于10个氨基酸长度。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区大于40个氨基酸长度。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区小于300个氨基酸长度。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自天然发生的流感菌株，该天然发生的流感菌株选自由以下组成的组：A/莫斯科(Moscow)/10/1999、A/新喀里多尼亚(New_Caledonia)/20/1999、B/四川/379/99、A/巴拿马(Panama)/2007/1999、B/香港/330/2001、A/美国怀俄明州(Wyoming)/03/2003、B/上海/361/2002、A/威斯康星州(Wisconsin)/67/2005、B/马来西亚(Malaysia)/2506/2004、A/广岛(Hiroshima)/52/2005、B/俄亥俄州(Ohio)/1/2005、A/所罗门群岛(Solomon_Islands)/3/2006、A/布里斯班(Brisbane)/59/2007、A/布里斯班/10/2007、B/佛罗里达(Florida)/4/2006、B/布里斯班/60/2008、A/加利福尼亚(California)/7/2009、A/珀斯(Perth)/16/2009、A/维多利亚(Victoria)/361/2011、B/马萨诸塞州(Massachusetts)/02/2012和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少99％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者100％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种进一步包括肠激酶裂解序列(enterokinasecleavage sequence)(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种是在酵母中生产的。在某些实施方案中，该酵母是毕赤酵母(Pichia pastoris)。在某些实施方案中，该酵母已经被修饰以产生人类的多肽糖基化模式特征(polypeptide glycosylation pattern characteristic of a human)。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种是由多核苷酸编码的。在某些实施方案中，该核苷酸序列是经优化用于在酵母中表达的密码子。在某些实施方案中，该多核苷酸进一步包括酵母启动子区5(yeast promoter region 5)，该酵母启动子区5对编码工程流感多肽的任一种的核苷酸序列是基本的。在某些实施方案中，该组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，该组合物进一步包括免疫佐剂。
在某些实施方案中，本文所描述的是一种制备流感疫苗的方法，该方法包括制备一种或多于一种分离的工程流感多肽，其中该多肽是合成的，体外翻译或在细胞表达体系中生产，其中该一种或多于一种分离的工程流感多肽：(a)包括血球凝集素HA1区并且(b)不包括血球凝集素HA2或跨膜区。在某些实施方案中，该方法包括制备两种或多于两种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该方法包括制备三种或多于三种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该方法包括制备四种或多于四种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该方法包括制备五种或多于五种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括指导多肽从细胞分泌的信号序列。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A或B。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型B。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自H1N1或H3N2亚型。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区比10个氨基酸长度大。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区比40个氨基酸长度大。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区比300个氨基酸长度小。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种在人类受试者中产生免疫性。在某些实施方案中，HA1区的多肽序列选自包括以下组成的组：流感菌株A/莫斯科/10/1999、A/新喀里多尼亚/20/1999、B/四川/379/99、A/巴拿马/2007/1999、B/香港/330/2001、A/美国怀俄明州/03/2003、B/上海/361/2002、A/威斯康星州/67/2005、B/马来西亚/2506/2004、A/广岛/52/2005、B/俄亥俄州/1/2005、A/所罗门群岛/3/2006、A/布里斯班/59/2007、A/布里斯班/10/2007、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/2008、A/加利福尼亚/7/2009、A/珀斯/16/2009、A/维多利亚/361/2011、B/马萨诸塞州/02/2012及其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列相似性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少99％的氨基酸序列一致性：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者100％的氨基酸序列一致性：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种进一步包括裂解融合标签裂解位点的剩余部分(the remnant of a cleavedfusion tag cleavage site)。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种是在酵母中生产的。在某些实施方案中，该酵母是毕赤酵母(Pichia pastoris)。在某些实施方案中，酵母已经被修饰以产生人类的多肽糖基化模式特征(polypeptideglycosylation pattern characteristic)。在某些实施方案中，该方法进一步包括将该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种与药学上可接受的赋形剂混合。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种与免疫佐剂混合。
在某些实施方案中，本文所描述的是一种用于使受试者对流感产生免疫的方法，该方法包括施用包括一种或多于一种分离的工程流感多肽的组合物，其中该一种或多于一种分离的工程流感多肽：(a)包括血球凝集素HA1区并且(b)不包括血球凝集素HA2区或跨膜区。在某些实施方案中，该组合物包括两种或多于两种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该组合物包括三种或多于三种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该组合物包括四种或多于四种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该组合物包括五种或多于五种分离的工程流感多肽。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括指导多肽从细胞分泌的信号序列。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A或B。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型B。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自H1N1或H3N2亚型。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区比10个氨基酸长度大。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区比40个氨基酸长度大。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区比250个氨基酸长度小。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种在人类受试者中产生免疫性。在某些实施方案中，HA1区的多肽序列选自包括以下组成的组：流感菌株A/莫斯科/10/1999、A/新喀里多尼亚/20/1999、B/四川/379/99、A/巴拿马/2007/1999、B/香港/330/2001、A/美国怀俄明州/03/2003、B/上海/361/2002、A/威斯康星州/67/2005、B/马来西亚/2506/2004、A/广岛/52/2005、B/俄亥俄州/1/2005、A/所罗门群岛/3/2006、A/布里斯班/59/2007、A/布里斯班/10/2007、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/2008、A/加利福尼亚/7/2009、A/珀斯/16/2009、A/维多利亚/361/2011、B/马萨诸塞州/02/2012和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少99％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者100％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种进一步包括裂解融合标签裂解位点的剩余部分。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种是在酵母中生产的。在某些实施方案中，该酵母是毕赤酵母(Pichia pastoris)。在某些实施方案中，该酵母已经被修饰以产生人类的多肽糖基化模式特征(polypeptide glycosylation patterncharacteristic)。在某些实施方案中，该组合物进一步包括施用药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，该组合物进一步包括施用免疫佐剂。在某些实施方案中，该受试者是人类。
在某些实施方案中，本文所描述的是采用流感疫苗测定受试者对免疫的反应的方法，该方法包括：获得受试者的生物样品，该受试者已经被施用包括一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的组合物，该一种或多于一种分离的工程流感多肽包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合；和检测受试者的抗体和该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种之间的相互作用，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该受试者是人类受试者。在某些实施方案中，该生物样品包括血液、血浆或血清。在某些实施方案中，检测受试者的抗体和该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种之间的相互作用(该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一种至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20和其组合)包括进行酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA)或同源免疫分析(homogenous immunoassay)。在某些实施方案中，该方法进一步包括测定对一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种具有特异性的抗体滴度，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。
在某些实施方案中，本文所描述的是制备流感疫苗的方法，该方法包括：在细胞表达体系中表达一种或多于一种工程流感多肽，其中该一种或多于一种工程流感多肽：(a)包括血球凝集素HA1区和(b)不包括血球凝集素HA2区或跨膜区。在某些实施方案中，该方法进一步包括分离表达的一种或多于一种工程流感多肽。在某些实施方案中，该细胞表达体系包括酵母细胞。在某些实施方案中，该酵母细胞是毕赤酵母。在某些实施方案中，该毕赤酵母酵母细胞(Pichia pastoris yeast cell)是菌株GS115。在某些实施方案中，该酵母已经被修饰以产生人类的多肽糖基化模式特征。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少99％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者100％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，一种或多于一种工程流感多肽是从编码该一种或多于一种工程流感多肽的核酸表达的。在某些实施方案中，该核酸被整合到细胞表达体系的基因组中。在某些实施方案中，该方法进一步包括将该一种或多于一种表达的工程流感多肽的任一种与药学上可接受的赋形剂混合。在某些实施方案中，该方法进一步包括将该一种或多于一种表达的工程流感多肽的任一种与免疫佐剂混合。
在某些实施方案中，本文描述的是表达结构(expression construct)，其包括：编码指导多肽从细胞分泌的信号序列的第一多核苷酸；编码一种或多于一种工程流感多肽的第二多核苷酸，其中该一种或多于一种工程流感多肽：(a)包括血球凝集素HA1区和(b)不包括血球凝集素HA2区或跨膜区；编码裂解位点的第三多核苷酸和编码用于纯化的标签的第四多核苷酸，其中第二多核苷酸是经优化用于在酵母中表达的密码子。在某些实施方案中，所有第一多核苷酸、第二多核苷酸、第三多核苷酸或第四多核苷酸均是经优化用于在酵母中表达的密码子。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种来自流感类型A或B。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种来自流感类型B。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种来自流感类型A。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种来自H1N1或H3N2亚型。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种的HA1区大于10个氨基酸长度。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种的HA1区大于40个氨基酸长度。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种的HA1区小于300个氨基酸长度。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种在人类中是产生免疫性的。在某些实施方案中，HA1区的多肽序列选自包括以下组成的组：流感菌株A/莫斯科/10/1999、A/新喀里多尼亚/20/1999、B/四川/379/99、A/巴拿马/2007/1999、B/香港/330/2001、A/美国怀俄明州/03/2003、B/上海/361/2002、A/威斯康星州/67/2005、B/马来西亚/2506/2004、A/广岛/52/2005、B/俄亥俄州/1/2005、A/所罗门群岛/3/2006、A/布里斯班/59/2007、A/布里斯班/10/2007、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/2008、A/加利福尼亚/7/2009、A/珀斯/16/2009、A/维多利亚/361/2011、B/马萨诸塞州/02/2012和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者至少99％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。在某些实施方案中，该一种或多于一种工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，该氨基酸序列具有与以下任一者100％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:2和其组合。在某些实施方案中，该表达结构是多核苷酸并且被维持在酵母细胞中。在某些实施方案中，该酵母是毕赤酵母。在某些实施方案中，该酵母已经被修饰以产生人类的多肽糖基化模式特征。在某些实施方案中，该表达结构(expression construct)被整合到基因组中。在某些实施方案中，该酵母被储存在包括本文描述的多个酵母细胞的主细胞库(master cell bank)中，其中该主细胞库包括与低温防腐剂(cryopreservative)混合的酵母细胞。在某些实施方案中，该低温防腐剂是甘油。
附图说明
图1描述了分离的工程流感多肽的生产的图解视图。
图2描述了本公开的工程血球凝集素多肽的非限制性实施方式的简图。
图3阐明了描述在分离/纯化本公开的工程血球凝集素多肽期间采取的步骤的工艺流程图。
图4显示了分离的工程血球凝集素多肽的coomassie染色的SDS-PAGE凝胶。
图5A显示了细胞反应器培养12小时之后进行的上清液中的工程血球凝集素多肽的coomassie染色的SDS-PAGE凝胶。
图5B显示了细胞反应器培养12小时之后进行的上清液中的工程血球凝集素多肽的western印迹。
图6A显示了纯化之前(泳道1)和之后(泳道4)工程血球凝集素多肽的Coomassie染色的SDS-PAGE凝胶；泳道2描述了来自通过从上样Ni柱得到的流的工程血球凝集素多肽；泳道3描述了从Ni柱的冲洗步骤得到的工程血球凝集素多肽。
图6B显示了纯化之前(泳道1)和之后(泳道4)工程血球凝集素多肽的western印迹；泳道2描述了来自通过从上样Ni柱得到的流的工程血球凝集素多肽；泳道3描述了从Ni柱的冲洗步骤得到的工程血球凝集素多肽。
本发明的详细描述
某些定义
如本文所用的“分离的”与“纯化的”同义，意思是在基于细胞的生产体系中生产的多肽经历一个或多个去除杂质的步骤，比如非流感蛋白和多肽；细胞膜或细胞壁成份和从基于细胞的体系分泌的，不是流感多肽的因子；比如糖类、脂类、多肽类或其它小分子。去除杂质的步骤包括但不限制于有机萃取、沉淀、浓缩、过滤、超滤、切向流过滤、透析、离心、超离心、包括使用亲和柱或树脂的液相色谱法。分离步骤可导致不同含量的杂质。例如在分离之后，工程流感多肽包括小于10％、5％、2％或1％的杂质。
如本文所用的“工程的”与“修饰的”同义，意思是当与该特定多肽的天然序列相比时，流感多肽具有一个或多个区别。该区别可以是从NH2末端或C末端删除一个或多个氨基酸或添加一个或多个氨基酸到NH2末端或C末端。该区别还可以是给定的野生型流感多肽中的一个或多个点突变。
如本文所用的“约”意思是具有所述数值的10％。
相比参照多肽序列的百分比(％)序列一致性是在比对序列和引入空位(gaps)(如果必要)以实现最大的百分比序列一致性之后，并且不把任何保守性取代看作序列一致性的一部分，与参照多肽序列中氨基酸残基一致的候选序列(candidate sequence)中的氨基酸残基的百分比。用于测定百分比氨基酸序列一致性目的的比对可以以已知的各种各样的方式实现，比如使用公开可用的计算机软件，比如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。用于比对序列的合适参数能够被测定，包括需要在被比较的序列的整个长度上实现最大比对的算法。然而，为了本文的目的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2，生成％氨基酸序列一致性数值。该ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech,Inc.授权的，并且源代码已利用用户文档提交到美国著作权办公室，华盛顿，20559，其中，登记为美国著作权登记号TXU510087。ALIGN-2程序从加利福尼亚州南旧金山Genentech,Inc.公开可得，或可从源代码编译。该ALIGN-2程序应当被编译以供UNIX操作系统(包括数字UNIXV4.0D)使用。所有的序列比较参数都是通过ALIGN-2编程设置并且没有改变。
在ALIGN-2被用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A相比、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列一致性(或者其可表达为给定氨基酸序列A具有或包括相比、与或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列一致性)的计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中被标记为一致匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对B的％氨基酸序列一致性不等于B相对A的％氨基酸序列一致性。除非另有说明，本文使用的所有％氨基酸序列一致性数值是，如在上段中描述的，使用ALIGN-2计算机程序得到的。
工程血球凝集素多肽
流感血球凝集素(HA)蛋白形成在成熟的流感病毒体的表面上表达的同源三聚体复合物中。该蛋白具有两个主要区：球状HA1和α-螺旋状HA2。HA1介导细胞通过结合靶细胞表面的唾液酸进入流感。在pH约6.0时，细胞使病毒体内在化到核内体/溶酶体室(endosomal/lysosomal compartment)中之后，HA蛋白的构象改变使得HA2区将病毒锚定体到核内体室的脂质二重层中，允许进入宿主细胞的细胞质中和病毒复制。
本文描述的是包括一种或多于一种分离的工程流感多肽的组合物。该多肽对针对流感的预防接种是有用的。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括HA蛋白。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括HA蛋白的片段。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段是HA1区。在某些实施方案中，HA1区片段可通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸或更少的氨基酸延伸到HA2区中。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段：(a)包括HA1区和(b)不包括HA2区或跨膜区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括大于10个氨基酸。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括大于40个氨基酸。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括大于50个氨基酸。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括大于100个氨基酸。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括小于300个来自HA蛋白的NH2末端的氨基酸。在某些实施方案中，该300个来自HA蛋白的NH2末端的氨基酸缺少流感信号序列。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段不包括HA2区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段不包括跨膜区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括SEQ IDNOs:1-20中任一者所示的氨基酸。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括具有与SEQ IDNOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少80％一致的氨基酸序列的HA1区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少90％一致的氨基酸序列的HA1区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少95％一致的氨基酸序列的HA1区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少97％一致的氨基酸序列的HA1区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少98％一致的氨基酸序列的HA1区。在某些实施方案中，该HA蛋白的片段包括具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少99％一致的氨基酸序列的HA1区。在某些实施方案中，该HA蛋白在半胱氨酸残基处还未被修饰或突变。
该一种或多于一种分离的、工程流感多肽可以几种方式被修饰以增加多肽的免疫原性或增加基于细胞的蛋白生产体系(cell-based protein production system)的产量。在某些实施方案中，该跨膜区可被删除以提高溶解度，和/或允许从细胞分泌。在某些实施方案中，信号肽被连接到流感多肽的任一种的NH2末端以指导从细胞蛋白生产体系分泌。在某些实施方案中，该信号肽是酵母α-因子信号序列(yeast alpha factor signalsequence)。在某些实施方案中，该信号肽包括SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，该信号肽包括与SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列80％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，该信号肽包括与SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列90％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，该信号肽包括与SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列95％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，该信号肽包括与SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列98％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，该信号肽包括与SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列99％一致的氨基酸序列。在某些实施方案中，该多肽包括一个或多个纯化标签以便于重组多肽的纯化，比如：多组氨酸标签(poly-histidine tag)(例如5-10个组氨酸残基长度)；6xHIS标签；多谷氨酰胺标签；c-MYC标签(EQKLISEEDL)；FLAG标签(DYKDDDDK)；V5标签(GKPIPNPLLGLDST)；VSV-标签(YTDIEMNRLGK)；Xpress标签或其任意组合)。在某些实施方案中，该纯化标签包括SEQ ID NO:21中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，该纯化标签被共价地连接到多肽的NH2末端。在某些实施方案中，该纯化标签被共价地连接到多肽的C末端。在某些实施方案中，该一种或多于一种流感多肽的任一种包括HA多肽和纯化标签之间的裂解位点。在某些实施方案中，该裂解位点是肠激酶/肠肽酶裂解位点。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种由NH2末端α分泌因子信号肽、流感血球凝集素蛋白的HA1区和多组氨酸纯化标签组成。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括NH2末端α分泌因子信号肽、具有SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列的流感血球凝集素蛋白的HA1区和多组氨酸纯化标签。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种由NH2末端α分泌因子信号肽、SEQID NOs:1-20中任一者所示的流感血球凝集素蛋白的HA1区和多组氨酸纯化标签组成。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种由NH2末端α分泌因子信号肽、流感血球凝集素蛋白的HA1区、肠激酶裂解位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和多组氨酸纯化标签组成。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种由NH2末端α分泌因子信号肽、具有SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列的流感血球凝集素蛋白的HA1区、肠激酶裂解位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和多组氨酸纯化标签组成。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种由具有SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列的流感血球凝集素蛋白的HA1区、肠激酶裂解位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和多组氨酸纯化标签组成。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种由具有SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列的流感血球凝集素蛋白的HA1区和肠激酶裂解位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)组成。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽小于50kDa。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽小于40kDa。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽大于10kDa。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽大于20kDa。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽大于30kDa。
不同生物体显示不同的蛋白质的氨基酸残基的糖基化模式。通常，高甘露糖聚糖(high-mannose glycan)连接内质网(ER)中的天冬酰胺并且在通过ER和高尔基体(ER andGolgi apparatus)的随后转运期间被修饰。对于在细胞表达体系中生产的蛋白质，不同体系可生成不同类型的聚糖。例如，从昆虫细胞生产的蛋白质倾向于缺少末端唾液酸苷化(terminal sialyation)。然而，在人类中，大多数天冬酰胺连接的聚糖显示了通过将末端唾液酸或N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid)(Neu5Ac)连接到N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)(GlcNAc)修饰。该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种可以模仿人类糖基化的方式被糖基化。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽的所有N-连接的聚糖(N-linked glycans)中大于50％包括唾液酸或N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic acid)(Neu5Ac)。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽的所有N-连接的聚糖中大于60％包括唾液酸或N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽的所有N-连接的聚糖中大于70％包括唾液酸。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽的所有N-连接的聚糖中大于80％包括唾液酸或N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。在某些实施方案中，分离的工程流感多肽的所有N-连接的聚糖中大于90％包括唾液酸或N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)。
流感的菌株和HA多肽
本申请公开记载了用于生产工程流感多肽的柔性平台(flexible platform)，其可广泛地适用于任何可溶的流感多肽或抗原。在某些实施方案中，本公开的组合物包括一种或多种来自任何菌株的HA多肽，该菌株目前在流感疫苗生产中使用或可与人类疾病相关出现。在某些实施方案中，该组合物包含至少1种、2种、3种、4种或5种不同的流感HA多肽，每种来自不同的菌株。在某些实施方案中，该流感HA多肽可来源于任何H1N1或H3N2菌株。在某些实施方案中，该流感HA多肽可来源于任何H5N1菌株。在某些实施方案中，流感HA多肽可来源于下列菌株中的任意1种、2种、3种、4种或5种：A/莫斯科/10/1999；A/新喀里多尼亚/20/1999；B/四川/379/1999；A/巴拿马/2007/1999；B/香港/330/2001；A/美国怀俄明州/03/2003；B/上海/361/2002；A/威斯康星州/67/2005；B/马来西亚/2506/2004；A/广岛/52/2005；B/俄亥俄州
/1/2005；A/所罗门群岛/3/2006；A/布里斯班/59/2007；A/布里斯班/10/2007；B/佛罗里达/4/2006；B/布里斯班/60/2008；A/加利福尼亚/7/2009；A/珀斯/16/2009；A/维多利亚/361/2011；B/马萨诸塞州/02/2012和其组合。
通过使用融合标签裂解位点(fusion tag cleavage site)(其便于从工程流感多肽去除纯化标签)，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种可被连接纯化标签。融合标签裂解位点包括例如肠激酶裂解位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、Facto Xa裂解位点(Ile-Glu或Asp-Gly-Arg-X)、HRV3C蛋白酶(Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-X)、TEV蛋白酶(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly-X)或凝血酶裂解位点。在某些实施方案中，该一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括融合标签裂解位点的剩余部分，即酶裂解融合标签裂解位点之后保留的氨基酸。例如，肠激酶在特定序列处特异地裂解多肽，Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-X，其中X是在赖氨酸的C末端处的，除了脯氨酸之外的任何氨基酸，制得剩余部分(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)。
分离的工程多肽的混合物
本公开的分离的工程流感多肽对针对流感的预防性疫苗有用。目前的季节性流感疫苗由至少3种，有时4种不同的流感菌株组成。在某些实施方案中，本文所描述的是包括一种或多于一种分离的工程流感多肽的组合物。在某些实施方案中，是包括两种或多于两种分离的工程流感多肽的组合物。在某些实施方案中，是包括三种或多于三种分离的工程流感多肽的组合物。在某些实施方案中，是包括四种或多于四种分离的工程流感多肽的组合物。在某些实施方案中，是包括五种或多于五种分离的工程流感多肽的组合物。在某些实施方案中，本文所描述的是基本上由一种或多于一种分离的工程流感多肽组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由两种或多于两种分离的工程流感多肽组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由三种或多于三种分离的工程流感多肽组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由四种或多于四种分离的工程流感多肽组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由五种或多于五种分离的、工程流感多肽组成的组合物。在某些实施方案中，本文所描述的是基本上由一种或多于一种分离的工程流感多肽和免疫佐剂组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由两种或多于两种分离的工程流感多肽和免疫佐剂组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由三种或多于三种分离的工程流感多肽和免疫佐剂组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由四种或多于四种分离的工程流感多肽和免疫佐剂组成的组合物。在某些实施方案中，是基本上由五种或多于五种分离的工程流感多肽和免疫佐剂组成的组合物。基本上由……组成的意思是该组合物包含列举的成分加上非活性、惰性的成分，该非活性、惰性成分仅仅用于保存、稳定、溶解或给组合物提供体积和黏性，而没有给予疫苗额外的抗原性或免疫原性。
用于生产工程血球凝集素多肽的基于细胞的体系
本公开的分离的、工程流感多肽是从基于细胞的蛋白质生产体系纯化的，该基于细胞的蛋白质生产体系已经被编码工程流感多肽的核酸转化、转染或感染。在某些实施方案中，该基于细胞的蛋白质生产体系稳定地被核酸转化使得该核酸整合到该基于细胞的蛋白质生产体系的至少一个染色体中。在某些实施方案中，真核细胞是酵母。在某些实施方案中，该酵母是毕赤酵母菌株。在某些实施方案中，该毕赤酵母菌株是GS115、KM71H、SMD1168、BG08、BG、09、BG10、BG11或SMD1168H。在某些实施方案中，该毕赤酵母菌株是GS115。在某些实施方案中，该毕赤酵母的菌株被修饰以在使用该体系生产的多肽中产生人类糖基化模式。在某些实施方案中，该毕赤酵母的菌株被修饰以删除内源酵母糖基化途径。在某些实施方案中，该酵母包括编码甘露糖苷酶I、甘露糖苷酶II、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(N-acetylglucosaminyl transferase I)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II和尿苷5′-二磷酸(UDP)-N-乙酰葡糖胺(uridine 5′-diphosphate(UDP)-N-acetylglucosamine)转运体中任一种的人类基因。在某些实施方案中，该毕赤酵母的菌株被修饰以在N-连接聚糖上产生末端唾液酸苷化。在某些实施方案中，该毕赤酵母的菌株被修饰以在N-连接聚糖上产生末端唾液酸苷化。在某些实施方案中，该基于细胞的蛋白质纯化体系不包括昆虫细胞。在某些实施方案中，该基于细胞的蛋白质纯化体系不包括蛋。
编码工程血球凝集素蛋白的核酸
本公开的分离的工程流感多肽可在基于细胞的蛋白质生产体系中生产，该基于细胞的蛋白质生产体系已经被核酸修饰以表达工程流感多肽。因此，本文描述的工程流感多肽的任一种可被核酸编码。在某些实施方案中，该核酸是质粒。在某些实施方案中，该质粒包括用于在大肠杆菌中增殖的起源和复制。在某些实施方案中，该核酸在适合用于转化酵母的质粒上编码。在某些实施方案中，该质粒适合在酵母中同源重组。在某些实施方案中，该质粒包括针对酵母营养缺陷型(yeast auxotrophy)(比如组氨酸、色氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸或尿嘧啶)的基因。在某些实施方案中，该质粒具有对氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、G418、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、杀稻瘟菌素(blasticidin)、博莱霉素(zeocin)或其任意组合产生抗生素抗性的基因。在某些实施方案中，该质粒是pPIC9SHUTTLE。在某些实施方案中，该核酸是能够经受在酵母中同源重组的线性单链或双链DNA分子。在某些实施方案中，该核酸是包括本公开的工程流感多肽的任一种的双链线性DNA分子。在某些实施方案中，该核酸是包括本公开的工程流感多肽的任一种的PCR产物。在某些实施方案中，该核酸包括编码SEQ IDNOs:1-20中所示的多肽中任一者的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码SEQ ID NOs:1-20中所示的多肽中任一者的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码具有与SEQ IDNOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少80％一致的氨基酸序列的多肽的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少90％一致的氨基酸序列的多肽的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少95％一致的氨基酸序列的多肽的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少97％一致的氨基酸序列的多肽的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少98％一致的氨基酸序列的多肽的序列。在某些实施方案中，该核酸包括编码具有与SEQ ID NOs:1-20中任一者所示的氨基酸序列至少99％一致的氨基酸序列的多肽的序列。在某些实施方案中，该工程流感多肽是被已经是经优化用于在酵母中表达的密码子的核酸密码。
疫苗接种的受试者
在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽向个体施用以引起个体的初次免疫反应。在某些实施方案中，该个体是人类、猪或鸡。在某些实施方案中，该个体是人类。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽向先前遭受流感疫苗接种的个体施用以提高先前经受流感疫苗接种的个体的免疫反应。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽向具有至少一个与流感相关的死亡关联的风险因素的个体施用，比如2岁以下的儿童、孕妇、免疫功能不全的个体、罹患COPD/肺气肿的个体、65岁以上的个体、经诊断携带HIV的个人、接受化学疗法或放射治疗的个人或具有基因免疫缺陷紊乱的个人(比如X-SCID)施用。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽经向具有鸡蛋过敏的个体施用。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽经向具有严重的鸡蛋过敏的个体将。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽适合用于向具有严重的鸡蛋过敏的个体施用。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽与免疫佐剂混合向个体施用。在某些实施方案中，将该一种或多于一种分离的工程流感多肽与药学上可接受的载剂、载体或赋形剂混合向个体施用。
给药方案和用量
在某些实施方案中，本公开的一种或多于一种分离的工程流感多肽被配制为用于通过肌肉注射施用的液体。在某些实施方案中，该液体形式在一次性小瓶或注射器中配制。在某些实施方案中，该液体形式是可冻干的并且可用合适的液体(比如无菌水或盐水)重构。在某些实施方案中，该液体形式经配制用于0.1和1.0mL之间的剂量。在某些实施方案中，该液体形式经配制用于0.2和0.8mL之间的剂量。在某些实施方案中，该液体形式经配制用于0.4和0.6mL之间的剂量。在某些实施方案中，该液体形式经配制用于约0.5mL的剂量。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度是在1μg/mL和100μg/mL之间。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度是在10μg/mL和100μg/mL之间。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度是在40μg/mL和60μg/mL之间。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度大于1μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度大于10μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度大于20μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度大于40μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度小于100μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度小于80μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种的浓度小于60μg/mL。在某些实施方案中，该分离的工程流感多肽的任一种被季节性地施用或一年一次施用。在某些实施方案中，将本公开的一种或多于一种分离的工程流感多肽以治疗上或预防上可接受的量向受试者施用。预防上可接受的量是引起足以防止或减少随后自然感染流感菌株的影响的抗体反应的量，相当于用于免疫的量。该预防上可接受的量可根据在该分离的工程流感多肽组合物中使用的精确的菌株或免疫佐剂改变。
免疫佐剂
在某些实施方案中，本文描述的是包括以有效增加免疫反应的量的一种或多于一种分离的工程流感多肽和免疫佐剂的物质的组合物。在某些实施方案中，该佐剂包括目前在流感疫苗接种中使用的佐剂，比如MF59、使用鲨烯(squalene)的水包油乳液。在某些实施方案中，该佐剂是无机盐。在某些实施方案中，该佐剂包括明矾盐。在某些实施方案中，该佐剂包括磷酸铝或氢氧化铝。在某些实施方案中，该佐剂包括Quil A或肥皂精QS-21。在某些实施方案中，该佐剂包括N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷酰胺(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine)(MDP)。在某些实施方案中，该佐剂包括弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)，比如CFA或IFA；Montanide；佐剂65(Adjuvant 65)；Lipovant或其任意组合。在某些实施方案中，该佐剂包括细胞因子，比如干扰素γ或GM-CSF。在某些实施方案中，本文所描述的佐剂包括一个或多个Toll样受体(TLR)配体。在某些实施方案中，该TLR配体是LPS或CpG寡核苷酸。在某些实施方案中，该TLR配体通过TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9中任一者激活信号。
药学上可接受的载剂、载体或赋形剂(Pharmaceutically acceptable vehicle,
carrier,or
excipient)
在某些实施方案中，本文所描述的是包括一种或多于一种分离的工程流感多肽和药学上可接受的载剂、载体或赋形剂的物质的组合物。在某些实施方案中，该药学上可接受的载剂、载体或赋形剂包括pH缓冲剂或pH改性剂。在某些实施方案中，该pH缓冲剂或pH改性剂包括碳酸氢钠、HEPES、MOPS、MEPES、磷酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、柠檬酸、抗坏血酸，或其任意组合。在某些实施方案中，该药学上可接受的载剂、载体或赋形剂包括盐溶液。在某些实施方案中，该盐溶液包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化血红素(hemin chloride)、苄索氯铵或其任意组合。在某些实施方案中，该药学上可接受的载剂、载体或赋形剂包括碳水化合物。在某些实施方案中，该碳水化合物包括蔗糖、右旋糖、海藻糖、乳糖、纤维素、山梨醇、半乳糖、右旋糖酐、黄原胶或其任意组合。在某些实施方案中，该药学上可接受的载剂、载体或赋形剂包括氨基酸或蛋白质。在某些实施方案中，该氨基酸或蛋白质包括明胶、卵蛋白、酵母提取物、谷氨酸盐、白蛋白。在某些实施方案中，该药学上可接受的载剂、载体或赋形剂包括乳化剂。在某些实施方案中，该乳化剂包括辛酚聚氧乙烯醚(octylphenolethoxylate)(Triton X-100)，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80(吐温80)，脱氧胆酸钠(sodiumdeoxy cholate)或其任意组合。在某些实施方案中，该药学上可接受的载剂、载体或赋形剂包括螯合剂。在某些实施方案中，该螯合剂包括乙二胺四乙酸钠(EDTA)，EGTA或其任意组合。在某些实施方案中，该载体是聚D,L-丙交酯-共-乙交酯(poly D,L-lactide-co-glycolide)(PLGA)。
主细胞库和转基因酵母
在某些实施方案中，本文描述的是包括酵母的主细胞库，该酵母包括编码整合到它的基因组中构建转基因酵母菌株的一种或多于一种流感多肽的核酸。在一些实施方案中，该主细胞库包括多种酵母细胞，每种都包括编码来自整合到它的基因组中构建转基因酵母菌株的不同的流感菌株的流感多肽的核酸。在某些实施方案中，该流感多肽是包括HA1区的工程多肽。在某些实施方案中，该流感多肽(a)包括血球凝集素HA1区，和(b)不包括血球凝集素HA2区或跨膜区。在某些实施方案中，该核酸被保留在质粒或酵母人工染色体的染色体之外。在某些实施方案中，该核酸被整合到染色体位置(定位)。在某些实施方案中，该酵母是毕赤酵母。在某些实施方案中，该毕赤酵母是GS115菌株。在某些实施方案中，该转基因酵母是通过被线性质粒，PCR产物或合成的双链DNA分子转化构建的。在某些实施方案中，该转基因酵母是通过同源重组构建的。在某些实施方案中，该主细胞库包括适合冰冻到至少约-80°或-80°以下的冷冻保存剂。在某些实施方案中，该主细胞库包括在10和30％之间的甘油，并且适合在约-80°或-80°以下长期储存。在某些实施方案中，该主细胞库可将转基因酵母菌株保存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。
实施例
下面的实施例用于说明目的，不是对本公开范围的限制。
实施例1-用于针对流感病毒的免疫接种的分离的工程流感多肽的酵母生产
参考图1，在步骤I中，选择合适的流感多肽用于进一步修饰和分子工程1。实例性的工程血球凝集素多肽的原理图显示在图2中。在这种情况下，全长血球凝集素多肽的HA1区被限定了。可选择地，限定的HA1区的结构可利用蛋白结构建模软件来检查，比如Swiss-Model。参见，Arnold et al.“The SWISS-MODEL Workspace:A web-based environmentfor protein structure homology modelling,”Bioinformatics,22,195-201。如果HA1多肽片段的整体三级结构没有保持，那么该多肽可通过从原始全长血球凝集素多肽删除或添加残基被进一步修饰以更好地在表达之后保持结构。在任何情况中，这个HA1区将缺少流感信号序列和全长HA蛋白的跨膜结构区，以及HA2区的实质部分。这应当留下可溶的抗原HA1多肽。
在测定抗原HA1序列后，可将完整结构工程化，允许该多肽在酵母体系中有效地生产。第一，添加6个组氨酸残基组成的多组氨酸序列，并且可选择地，将肠激酶裂解位点(DDDDK)添加在HA多肽序列和多组氨酸标签之间。该肠激酶裂解位点允许在纯化之后或纯化期间去除多组氨酸标签以便该标签不出现在最终多肽制剂中。此外，分泌的前导序列，比如将酵母α因子信号肽添加到NH2末端以指导从酵母分泌。在这个步骤之后，氨基酸序列应该包括完全可溶的HA1序列，其缺少HA2和跨膜区，以及内源HA信号序列；外加NH2末端α因子分泌前导和C末端6xHIS纯化标签，其通过肠激酶裂解位点从完全可溶的HA1序列分离。在测定多肽的氨基酸序列之后，将DNA序列从这个氨基酸序列反翻译，并且可选择地，该序列可以是导致在酵母中高表达水平的优化密码子。然后将限制性位点添加到侧翼完整结构(flank the full construct)以便于克隆到穿梭载体。然后DNA序列可通过本领域已知的方法来合成并且市售可得。
在合成之后，将编码工程HA1多肽的DNA克隆到有利于在酵母中同源重组的穿梭载体(例如，pPIC9SHUTTLE)中。简言之，将编码工程HA1多肽的DNA利用限制性内切酶消化并且连接到已经用同样的酶消化的穿梭载体(即，质粒载体)。在实施连接反应之后，将连接的穿梭质粒/工程HA1多肽DNA转入大肠杆菌(E.coli)(例如，DH5α)，并且将转化的细菌利用包含选择性抗生素(例如，卡那霉素(Kanamycin))的板筛选，该选择性抗生素对应于出现在穿梭质粒/工程HA1多肽中的抗生素抗性基因。将该板在37°孵化过夜，筛选在抗生素筛选下生长的菌落用于进一步分析。然后使菌落在液体培养物中生长到高密度，并且质粒DNA利用碱裂解方法来制备。然后可将质粒DNA通过限制性酶切作图(restriction mapping)、PCR或测序分析以证实编码工程HA1多肽的DNA的准确性。
参考图1，步骤II，一旦设计，构建和制备编码工程HA1多肽的穿梭质粒，可将它通过细胞工程2引入合适的酵母体系。将该穿梭质粒通过限制性内切酶消化线性化并且转入酵母，在该酵母中它通过同源重组平稳地整合到基因组中。使毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115在30°在500mL的丰富培养基(rich media)(例如，YPD)中生长到对数生长期(在590nm O.D为1.5)，获取、洗涤并且重新悬浮在1mL的1M山梨醇中。然后将酵母细胞通过电穿孔法利用20μg的编码工程HA1多肽的线性穿梭质粒转化，电穿孔法为1500V,25μF,200Ω，5-10秒，电极间隙为0.2cm。然后使细胞在基于葡糖糖的恢复培养基中生长，并且接种在基本培养基上，该基本培养基对应于营养缺陷型GS115菌株和出现在编码工程HA1多肽的线性穿梭质粒上的筛选标记(例如，组氨酸)。第一轮的筛选导致GS115菌落具有至少一个整合的一拷贝的编码工程HA1多肽的线性穿梭质粒。
在第一轮的筛选之后，在第二轮的筛选中筛选具有整合的多拷贝质粒的GS115菌落。筛选第一筛选标记(组氨酸)之后是对出现在编码工程HA1多肽的线性穿梭质粒上的第二标记(代谢甲醇能力)进行筛选。在将GS115菌落已经在缺少组氨酸的基础培养基上筛选之后，将该菌落被重新接种在另加甲醇的组氨酸基础培养基上以筛选能够在甲醇存在下生长的菌落。在这个步骤中，可在不同的甲醇浓度进行多个不同的筛选以筛选或多或少对甲醇敏感，并且应当表达不同水平的工程HA多肽的GS115。从这个第二轮的筛选，筛选菌落并且测试用于工程HA1多肽的表达和分泌。这可利用任何合适的蛋白分析技术(比如SDS-PAGE、ELISA或Western印迹)完成。
参考图1，步骤III，可选中筛选的GS115菌落并且在生物过程工程步骤3中按比例放大用于大规模蛋白质分离和纯化。图3详细描述了纯化的步骤。例如，可将GS115菌落从低温冷冻存货(cryopreserved frozen stock)301解冻，生长在低容量起子培养(starterculture)302中并且利用补料分批反应体系(fed-batch reactor system)303扩大，该补料分批反应体系具有甲醇梯度为64小时内3.6mL/h/L到10.9mL/h/L的速率。在达到最大细胞密度后，可将上清液通过离心分离305获取，将该上清液过滤306以去除细胞碎片，然后经过超滤307以去除高分子量蛋白聚合物或低分子量成分。可将工程流感HA多肽上样到镍柱308上，并且可将未结合或微弱结合的蛋白和细胞成分在步骤309借助6xHIS标签冲洗。可将多肽从柱310利用咪唑梯度，或通过肠激酶裂解位点的裂解洗脱，产生重组流感抗原4。
作为选择，“冷冻存货(frozen stock)”或“主细胞库(master cell bank)”可通过在20-30％甘油中冷冻GS115菌落来构建，并且储存在-80℃或-80℃以下。这有利于通过允许立即解冻快速生成疫苗和按比例放大已经筛选用于优化表达和有效生产的菌落。
实施例2-用于针对流感病毒的免疫接种的分离的工程流感多肽的酵母生产，
通过IMAC纯化
图4到6显示了通过本文描述的方法生产流感多肽。纯化过程在84小时的诱导之后开始，将该样品在20,000g，在4℃离心分离20分钟，然后将上清液在具有孔径为10kDa的Pellicon XL Ultrafiltration Module Biomax(Millipore,Darmstaddt,Germany)中浓缩。将浓缩液通过0.45μm的膜(Pall Corporation,USA)过滤并且储存在4℃用于在IMAC柱中进一步加工。纯化是在IMAC预装载的色谱柱(1和5mL His Trap FF(GE Healthcare,UK))上实施的，过程如下：将上清液倒入预先平衡的Ni+柱中。使用PBS作为流动相。将上清液用10mL的PBS冲洗，随后用10mL PBS+10mM咪唑(Imidazole)再次冲洗。将蛋白用10mL的PBS+500mM咪唑洗脱，将洗脱体积过滤通过10kDa膜(Amicon,Millipore,Darmstadt,Germany)以使盐排出样品。将该过程重复三次并且最终将浓缩HA用分光光度计(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)和Bradford试验(PierceTM Coomassie Bradford Protein Assay Kit,Life Technologies)评估，并且在SDS-PAGE凝胶中可视化。
SDS-PAGE分析
蛋白生产和纯化过程是通过SDS-PAGE利用标准Laemmli方法证实的。对毕氏酵母(P.pastoris)菌落样品来说，将每个菌落的100μL的上清液用甲醇-氯仿方法浓缩并且将小球在速度真空浓缩器(Speed Vac Concentrator)(Savant Instruments Inc.,Farmingdale,NY,USA)中干燥；将样品重新悬浮在10μL的miliQ水和10μL上样缓冲液中、变性并用于电泳分析。将凝胶用Coomassie亮蓝R250(Bio-Rad,Hercules,CA)染色，并且用图像扫描器III(GE Healthcare,Amersham,UK)扫描。将生成的图像用密度测定软件在TotalLab(TotalLab,Biostat,Jahnsdorf,Germany)上分析。图4显示了来自2个表达工程血球凝集素蛋白的不同酵母菌株的纯化之后的总蛋白的Coomassie染色显示了高水平的表达。工程血球凝集素蛋白是位于大约30kDa的暗带。图5A显示了来自表达工程血球凝集素蛋白的酵母菌株的纯化之后的总蛋白的Coomassie染色，是在诱导之后12小时做出的。图6A显示了纯化之前(泳道1)和之后(泳道4)来自酵母菌株的纯化之后的总蛋白的Coomassie染色；泳道2描述了来自通过从上样镍柱得到的流的工程血球凝集素多肽；泳道3描述了从镍柱的冲洗步骤得到的工程血球凝集素多肽。泳道4显示了高纯血球凝集素多肽制剂。
Western印迹
western印迹分析是根据标准协议完成的，将从Erlenmeyer锥形瓶收集的样品上样到Western印迹，与样品相同的浓度上样在SDS-PAGE上。从毕赤酵母得到的HA的两个的纯度可以被证实。将样品以1g/L的浓度上样并且在10％的SDS-PAGE凝胶上电泳，然后转移到硝化纤维Hybond-ECL膜(Amercham Biosciences,UK)上。然后将该膜用PBS溶液和3％的脱脂牛奶阻断一小时。然后将该膜用洗涤缓冲液，PBS-Tween 20(1:1000)洗涤3次。然后将该膜浸入具有用1X PBS稀释1:100的抗组氨酸抗体的溶液中，并且在25℃和100rpm下孵化1小时。进行多于3次的洗涤，将具有辣根过氧化物酶的第二标签(ThermoScientific,Waltham,MA,USA)以用PBS1:10,000稀释加入。对于免疫染色来说，颜色是通过加入Tetra methyl-bencinidyn(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)形成的，最后，将该膜用Canon EOS 450D相机拍照。图5B显示了在诱导之后12小时做出的工程血球凝集素蛋白的western印迹。图6B显示了纯化之前(泳道1)和之后(泳道4)工程血球凝集素蛋白的western印迹；泳道2描述了来自通过从上样镍柱得到的流的工程血球凝集素多肽；泳道3描述了从镍柱的冲洗步骤得到的工程血球凝集素多肽。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，对本领域技术人员来说很明显这样的实施方式仅仅通过实施例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和代替方案。应理解本文描述的本发明的实施方式的各种各样的替代方案可以用于实现本发明。
序列
SEQ ID NO:1
>A/莫斯科/10/1999_(B_C_D)
STGRICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVAQNGTSSACKRRSIKSFFSRLNWLHQLENRYPALN
VTMPNNDKFDKLYIWGVHHPSTDSVQTSVYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGVSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:2
>A/新喀里多尼亚/20/1999_(B_C_D_E_F_G)
GIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYVNNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQRALYHTENAYVSVVSSHYSRRFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPWYAFALSRGFGSGIITSNA
SEQIDNO:3
>B/四川/379/99(B)
TRGKLCPTCLNCTDLDVALGRPMCVGITPSAKASILHEIKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEKIRLSTQNVINAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPRDNNKTAT
NPLTVEVPHICTKEEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGITTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGILLPQKV
SEQIDNO:4
>A/巴拿马/2007/1999(_C_D)
STGRICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPHCDGFQNKEWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVAQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLHQLNYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVLHPSTDSDQISLYAQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGVSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:5
>B/香港/330/2001_(_C_D)
KTRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSAKVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLP
NLLRGYERIRLSNHNVINAEKAPGGPYKIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNENNKTATNSLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDSETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQ
SEQIDNO:6
>A/美国怀俄明州/03/2003_(E_)
STGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPAL
NVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDSEQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDIS SRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:7
>B/上海/361/2002_(_E_F)
TDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKALGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICT
EGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKG
SEQIDNO:8
>A/威斯康星州/67/2005_(_G_H)
STGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNDESFNWTGVTQNGTSSSCKRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALN
VTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDNDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:9
>B/马来西亚/2506/2004_(_G_H)
ETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNK
TATNSLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNEXQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQ
SEQIDNO:10
>A/广岛/52/2005_(G)
STGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACKRRSNNSFFSRLNWLTQLKFKYPALK
VTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDNDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQ IDNO:11
>B/俄亥俄州/1/2005_(G)
LDVALGRPKCTGNIPSAEVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAEKAPGGPYKIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNSLTIEVPYICTE
GEDQITIWGFHSDSETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGS
SEQIDNO:12
>A/所罗门群岛/3/2006_(H)
GIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISRESWSYIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTTTGVSASCSHNGESSFYKNLLWLTGKNGLYPNLSKSYAN
NKEKEVLVLWGVHHPPNIGDQRALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDREGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNA
SEQIDNO:13
>A/布里斯班/59/2007_(I_J_)
GIAPLQLGNCSVAGWILGNPECELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGHFADYEELREQLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHTVTGVSASCSHNGESSFYRNLLWLTGKNGLYPNLSKSYANNKEKEVLVLWGVHHPPNIGNQKALYHTENAYVSVVSSHYSRKFTPEIAKRPKVRDQEGRINYYWTLLEPGDTIIFEANGNLIAPRYAFALSRGFGSGIINSNA
SEQIDNO:14
>A/布里斯班/10/2007_(I_J_)
STGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSNNSFFSRLNWLTHLKFKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPGTDNDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:15
>B/佛罗里达/4/2006_(I)
RTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVKPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKN
ATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGSFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQK
SEQIDNO:16
>B/布里斯班/60/2008_(_J_K_L_M_N_O_P_)
ETRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGKIPSARVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAENAPGGPYKIGTSGSCPNITNGNGFFATMAWAVPKNDKNKT
ATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQ
SEQ ID NO:17
>A/加利福尼亚/7/2009
GVAPLHLGKCNIAGW～GNPECESLSTASSWSYIVETSSSDNGTCYPGDFINYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGTSKYSKKFKPEIAVRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLLVPRYAFAMERNAGSGIIISD
SEQIDNO:18
>A/珀斯/16/2009_(_K_L)
STGEICDSPHQILDGKNCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKYASNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSKNSFFSRLNWLTHLNFKYPALN
VTMPNNEQFDKLYIWGVLHPGTDKDQIFLYAQASGRITVSTKRSQQTVSPNIGSRPRVRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:19
>A/维多利亚/361/2011(M_N_O_)
SIGEICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSYKSANCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFNNESFNWTGVTQNGTSSACIRRSNNSFFSRLNWLTHLNFKYPALNVTMPNNEQFDKLYIWGVHHPGTDKDQIFLYAQSSGRITVSTKRSQQAVIPNIGSRPRIRNIPSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRS
SEQIDNO:20
>B/马萨诸塞州/02/2012_(_N_O_)
KTRGKLCPDCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLANLLRGYENIRLSTQNVIDAEKAPGGPYRLGTSGSCPNATSKSGFFATMAWAVPKDNNKNATNPLTVEVPYICAEGEDQITVWGFHSDDKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPDQTEDGGLPQSGRIVVDYMMQKPGKTGTIVYQRGVLLPQK
SEQIDNO:21
>HIS-标签
HHHHHH
SEQ ID NO:22
>信号肽
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLE
Claims (36)
1.一种组合物，所述组合物包括一种或多于一种分离的工程流感多肽，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽：(a)包括血球凝集素HA1区，并且(b)不包括血球凝集素HA2区或跨膜区。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包括两种或多于两种分离的工程流感多肽。
3.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包括三种或多于三种分离的工程流感多肽。
4.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包括四种或多于四种分离的工程流感多肽。
5.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物包括五种或多于五种分离的工程流感多肽。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括指导多肽从细胞分泌的信号序列。
7.根据权利要求1或6所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A或B。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型B。
9.根据权利要求7所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自流感类型A。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种来自H1N1或H3N2亚型。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区大于10个氨基酸长度。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区大于40个氨基酸长度。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种的HA1区小于300个氨基酸长度。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种在人类中是产生免疫性的。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的组合物，其中HA1区的多肽序列选自包括以下流感菌株组成的组：A/莫斯科/10/1999、A/新喀里多尼亚/20/1999、B/四川/379/99、A/巴拿马/2007/1999、B/香港/330/2001、A/美国怀俄明州/03/2003、B/上海/361/2002、A/威斯康星州/67/2005、B/马来西亚/2506/2004、A/广岛/52/2005、B/俄亥俄州/1/2005、A/所罗门群岛/3/2006、A/布里斯班/59/2007、A/布里斯班/10/2007、B/佛罗里达/4/2006、B/布里斯班/60/2008、A/加利福尼亚/7/2009、A/珀斯/16/2009、A/维多利亚/361/2011、B/马萨诸塞州/02/2012及其组合。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与以下任一者至少95％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。
17.根据权利要求1到16中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与以下任一者至少99％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种包括氨基酸序列，所述氨基酸序列具有与以下任一者100％的氨基酸序列一致性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和其组合。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种进一步包括裂解融合标签裂解位点的剩余部分。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的组合物，其中所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种是在酵母中生产的。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中所述酵母是毕赤酵母。
22.根据权利要求19所述的组合物，其中所述酵母已经被修饰用以产生人类的多肽糖基化模式特征。
23.一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码权利要求16到18所述的工程流感多肽的任一种的核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中编码权利要求16到18所述的多肽的任一种的核苷酸序列是经优化用于在酵母中表达的密码子。
25.根据权利要求23所述的多核苷酸，所述多核苷酸进一步包括编码权利要求1到18所述的工程流感多肽的任一种的核苷酸序列的酵母启动子区5’。
26.一种酵母细胞，所述酵母细胞包括权利要求23或24中任一项所述的多核苷酸。
27.一种主细胞库，所述主细胞库包括多个权利要求25所述的酵母细胞，其中所述主细胞库包括与冷冻保存剂混合的酵母细胞。
28.一种药物组合物，所述药物组合物包括权利要求1到22中任一项所述的一种或多于一种分离的工程流感多肽和药学上可接受的赋形剂。
29.根据权利要求28任一项所述的药物组合物，所述药物组合物进一步包括免疫佐剂。
30.一种制备流感疫苗的方法，所述方法包括制备权利要求1到22所述的一种或多于一种分离的工程流感多肽，其中所述多肽是从酵母细胞表达体系生产和/或分离的。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述酵母是毕赤酵母。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述酵母已经被修饰用以产生人类的多肽糖基化模式特征。
33.根据权利要求30到32任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种和药学上可接受的赋形剂混合。
34.根据权利要求30到32任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述一种或多于一种分离的工程流感多肽的任一种和免疫佐剂混合。
35.一种使受试者对流感产生免疫的方法，所述方法包括向受试者施用包括权利要求1到22中任一项所述的一种或多于一种分离的工程流感多肽的组合物或权利要求28或29中任一项所述的药物组合物。
36.包括权利要求1到22中任一项所述的一种或多于一种分离的工程流感多肽的组合物或权利要求28或29中任一项所述的药物组合物用于使受试者对流感产生免疫的方法。
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