CN111084150A - 一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法,该方法主要利用鸡传染性支气管炎病毒JS株感染动物，得到鸡传染性支气管炎病理模型,本发明构建稳定且重复性好的鸡传染性支气管炎病理模型，该模型可为下一步进行药物的抗病毒治疗和评估病毒灭活疫苗的免疫保护效果提供研究工具。

Description

一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法。

技术背景

鸡传染性支气管炎病(Avian infectious bronchitis disease,IB)是一种由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的急性、高度传染性疾病，主要影响鸡的呼吸道、肾脏和生殖系统，感染后以喷嚏、咳嗽和呼吸啰音等呼吸道症状为主，蛋鸡主要表现为产蛋率下降、蛋品质下降和生长缓慢等，雏鸡的死亡率较高，特别是会伴随其它病毒性或细菌性疾病的继发感染，现已成危害我国养禽业的主要疫病之一，给养禽业带来巨大的经济损伤，养禽业现已把鸡传染性支气管炎的免疫列入预防免疫程序。

IBV为单股正链RNA病毒，多呈圆形或多边形，属冠状病毒科冠状病毒属。病毒粒子直径大约120nm，表面有大约20nm的棒状纤突，形成类似冠状病毒。基因组全长27.6kb，基因组编码4种主要结构蛋白，即纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)以及小膜蛋白(E)，S蛋白是IBV主要抗原蛋白，也是目前防控IBV研究较多的蛋白。

1931年Schalk等首次报道了呼吸道型传染性支气管炎病，临床表现为主要张口呼吸、咳嗽、气管啰音等呼吸道症状；1962年Wintefield等首次报道肾型IB，主要表现为肾脏肿大和尿酸盐沉积等剖检变化；1986年Elhouadfi等首次分离到嗜肠型IBV毒株。1972年邝荣禄在我国广东首次报道，随后在全国陆续出现流行；1982年辛朝安等首次报道了肾型IBV在我国的发生；1995年杜元钊在胶东地区分离到IBV变异株，其主要侵害病鸡的卵巢和输卵管等生殖器官；有研究学者在1996年分离到腺胃型IBV毒株。

建立科学可靠的鸡传染性支气管炎病理模型不仅能更好地研究其病理生理学变化，探讨发病机制及防治机理，而且能够用于评估新型治疗药物的有效性及安全性，从而可为药物的临床应用及探索合理、有效的治疗方法提供实验依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是建立鸡传染性支气管炎病毒感染模型，为如何治疗或预防鸡传染性支气管炎病提供基础。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，包括以下步骤：

s1.用鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈诱导感染动物；

s2.12h后再用鸡传染性支气管炎病毒JS株感染动物，攻毒12h-24h小时后构建得到所述动物模型；

所述鸡传染性支气管炎病毒JS株的NCBI序列号为EU031525.1。

进一步的，上述步骤s1中鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈的菌液制备是采用无菌LB营养琼脂平板复苏，37℃培养24h，挑取单个菌落接种于50mL LB液体培养基，37℃震荡培养24h，通过梯度稀释，涂布LB平板计数得到大肠杆菌菌液浓度为6.85×10⁸CFU/mL，将培养的菌液用无菌的PBS稀释1000倍得到。

进一步的，上述步骤s2中使用的鸡传染性支气管炎病毒JS株通过以下步骤制备：a1.将1日龄SPF鸡蛋置于37℃恒温培养箱孵化机中孵育至9日龄，通过鸡胚尿囊液注射鸡传染性支气管炎病毒JS毒株0.1mL/胚，石蜡封闭，将接种了毒株的鸡胚继续置于孵化机中孵育，每隔12h照蛋一次，弃去24h内死亡胚，于72h时将活胚置于4℃冰箱过夜，次日无菌收集尿囊液，反复传代3 次，将得到的鸡胚尿囊液收集保存于-20℃冰箱备用；

a2.将上述所收集的鸡胚尿囊液作10倍稀释，取10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹五个梯度接种病毒稀释液，接种到9日龄鸡胚，7d后收取尿囊液，通过荧光定量PCR 法检测病毒梯度，用Reed-Muench两氏法计算EID50，最终结果为10^-6.5。

进一步的，上述步骤s2中鸡传染性支气管炎病毒JS株感染所述动物的剂量具体为10^-6.5EID50。

进一步的，所述动物均为14-15日龄的SPF白来航鸡。

进一步的，所述步骤s1中鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈诱导感染动物通过喉头气管接种方式，所述步骤s2中鸡传染性支气管炎病毒JS株感染动物通过喉头气管接种方式进行。

进一步的，根据所述方法构建的鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型，可应用于在鸡传染性支气管炎病毒的药物治疗。

生物保藏说明：

(1).本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒JS株的NCBI序列号为： EU031525.1。该鸡传染性支气管炎病毒JS株由扬州大学兽医学院预防兽医国家重点学科开放实验室分离，经过RT-PCR鉴定和鸡胚传代纯化，吴艳涛老师惠赠，曾于2008年发表在论文：《IBV分离株的生物学特性鉴定及其流行病学分析[D]》. 吴培培.扬州大学,2008。

(2).本发明所述鸡大肠杆菌O₇₈标准菌株购自于中国兽医药品监察所，保藏编号为CVCC1418。

本发明的有益效果在于，利用一株具有代表性的鸡传染性支气管炎病毒 JS株，可以构建稳定且重复性好的鸡传染性支气管炎病理模型，该模型可为下一步进行药物的抗病毒治疗和评估病毒灭活疫苗的免疫保护效果提供研究工具。

附图说明

图1为攻毒24h后各组动物的临床表现，其中a代表攻毒后动物出现羽毛松乱的临床表现、b代表攻毒后动物出现昏睡的临床表现、c代表攻毒后动物出现张口呼吸的临床表现。

图2为攻毒后96h各组动物的气管病理剖检变化，其中d代表剖检C组动物气管出血的病理现象、e代表剖检D组动物气管出血的病理现象、f代表剖检D组动物点状出血的病理现象、g代表剖检D组动物透明粘液的病理现象。

图3为攻毒后96h各组动物病毒载毒量。

具体实施方式

本发明公开了一种鸡传染性支气管炎病的模型建立，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述毒株和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的毒株和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施案例1：大肠杆菌菌液制备

实验发现，使用低剂量的大肠杆菌提前喉头气管接种，可以使鸡的喉头气管粘膜轻度损伤，使IBV感染时更容易侵入感染机体。因此本发明首先采用鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈诱导感染动物。首先取本实验室-80℃冰箱保存的大肠杆菌O₇₈标准菌株，采用无菌LB营养琼脂平板复苏，37℃培养24h，挑取单个菌落接种于50mL LB液体培养基，37℃震荡培养24h，通过梯度稀释，涂布LB平板计数得到大肠杆菌菌液浓度为6.85×10⁸CFU/mL，将培养的菌液用无菌的PBS稀释1000倍，4℃冰箱保存备用。

实施案例2：毒株复壮

将1日龄SPF鸡蛋置于37℃恒温培养箱孵化机中孵育至9日龄，通过鸡胚尿囊液注射本实验室保存的IBV JS毒株，0.1mL/胚，石蜡封闭，将接种了毒株的鸡胚继续置于孵化机中孵育，每隔12h照蛋一次，弃去24h内死亡胚，于72h时将活胚置于4℃冰箱过夜，次日无菌收集尿囊液。反复传代3次，将得到的鸡胚尿囊液收集保存于-20℃冰箱，备用。

将50枚9日龄鸡胚随机分为5组，每组10枚；将上述所收集的鸡胚尿囊液作10倍稀释，取10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹五个梯度接种病毒稀释液，接种 7d后收取尿囊液，通过荧光定量PCR法检测病毒梯度，Reed-Muench两氏法计算EID₅₀，最终结果为10^-6.5。

实施案例3：利用鸡传染性支气管炎病毒JS株制备鸡传染性支气管炎病动物模型一、鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的制备

结合本实验室前期临床治疗和人工模型建立试验，通过肌肉注射和喉头气管接种两种不同途径接种10^-6.5EID₅₀/只与0.2mL/只、0.1mL/只和0.05mL/只三种不同剂量相结合，摸索建立15日龄SPF鸡的鸡传染性支气管炎病毒JS株感染模型最佳的接种途径和感染剂量，最终确定接种途径为喉头气管接种，接种剂量为10^-6.5EID₅₀ 0.2mL/只。

将56只1日龄的SPF鸡，置于扬州大学比较医学中心负压隔离器饲养， 5日龄断喙，饲养至14日龄称重、随机分为4组，分组后分笼饲养，具体分组与处理方法见下表1。雏鸡感染鸡传染性支气管炎JS毒株后，实时观察感染后各组雏鸡的精神状态，羽毛情况、采食、饮水、粪便情况、呼吸情况、咳嗽以及是否有支气管啰音等临床症状，每隔12h观察记录一次，连续观察10天。

表1试验设计方案

结果显示，攻毒后24h，C组和D组雏鸡开始出现羽毛松乱(如附图1 中a)、精神沉郁、昏睡(如附图1中b)、不愿运动、张口呼吸(如附图1中c)、咳嗽和气管啰音等临床症状，48h后严重雏鸡可出现拉水样粪便、呼吸困难。

二、气管剖检病变率观察

在攻毒后96h时各组随机挑选6只鸡进行剖检，观察期病理气管的剖检变化，并将肾和肺一半保存于固定液，一半迅速放入液氮，保存于-80℃冰箱；试验结束(攻毒后10d)后剖杀剩余所有雏鸡，并观察记录其剖检变化。

结果表明：剖检可见C组鸡气管出血(如附图2中d)，D组试验鸡可见气管出血(如附图2中e)，点状出血(如附图2中f)且有透明粘液(如附图2 中g)。

三、核酸提取及病毒载毒量检测

用Ttizol法提取肾组织病毒核酸，检测肾组织中病毒载量的变化情况，具体步骤是：

(1).取50mg肾组织，加入1mL Trizol充分研磨，将组织研磨物置于1.5mL 无菌无酶离心管中，充分振荡15s，室温静置5min，4℃12000r/min离心10min；小心吸取上清于新的1.5mL无菌无酶管中。加入200μl预冷的三氯甲烷，剧烈震荡15s，静置3min，4℃，12000r/min离心10min；吸取上层清液，加入等体积三氯甲烷，剧烈震荡15s，室温静置3min，4℃12000r/min离心10min；吸取上层水相，加入500μl异丙醇，颠倒混匀，静置10min，4℃12000r/min 离心10min；小心弃去上清，加入1mL 75％乙醇，弃去乙醇，干燥记得白色沉淀，白色沉淀即为RNA，加入40μl无酶水，测量RNA浓度；可重复一次加入75％乙醇再弃去乙醇干燥。

(2).Trizol法提取病毒RNA后经反转录获取cDNA，反转录在ABI Simpliampthermal Cycler PCR仪上进行，使用TAKARA PrimeScript TMRT reagent Kit(PerfectReal Time)，总体积为20μl，其中：5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0μl；PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0μl；RT Primer Mix^*4 1.0 μl；RNase Free Dh₂O 4.0μl及待测RNA样品10.0μl。反转录反应条件：37℃ 15min，85℃5sec，4℃。

(3).通过荧光定量PCR进行病毒载量的定量，于ABI 7500FAST荧光定量PCR仪上进行，反应体系总体积20μl，其中TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10.0μl，荧光定量特异性上游引物(10uM)0.8μl，特异性下游引物(10uM) 0.8ul，ROX Reference Dye Ⅱ0.4μl，RNase-Free water 2.0μl，待测cDNA模板量2.0ul。荧光定量PCR反应条件为：90℃30s(×1)；95℃5s，60℃34s (×40)；60℃1min；95℃15s。其中：

上游引物IBV-F序列：GCTTTTGAGCCTAGCGTT；

下游引物IBV-R序列：TGCATCTTCCCAACTGCCGC；

上游引物GAPDH-F序列：ATGGCATCCAAGGAGTGA；

下游引物GAPDH-R序列：GGGAGACAGAAGGGAACAG。

每次进行荧光定量PCR时内参和待测样品均设三个重复孔，取三个重复孔Ct值的平均值作为最终的Ct值，采用2的法对荧光定量PCR数据结果进行分析。

通过荧光定量PCR法检测各试验组肾组织中的IBV的mRNA表达量，结果显示C组和D组试验鸡均检测出IBV的mRNA的表达量，D组与C组相比，其病毒表达量极显著高于C组(P<0.01)。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1657

<212> DNA

<213> 鸡传染性支气管炎病毒(INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS STRAIN)

<400> 1

atgttgggga agtcaccgtt tttagtgacc attttgtgtg cactatgtag tgcaaatttg 60

tttgataata attatgtgta ctactaccaa agtgctttta gaccgccaaa tgggtggcac 120

ctacaagggg gtgcttatgc agtagtcagt tctgttaatc atactagtaa tgccggttct 180

gcaggagggt gcactgttgg tgttattaag gatgtttata atacaagtgt ggcttccata 240

gctatgacag cacctcttca gggtatggct tggtctaagt cacaattttg tagtgcacac 300

tgtaattttt ctgaaattac agtttttgtt acacattgtt atagtagtgg tactgggtct 360

tgtcctataa caggcatgat cccacgtgat catattcgta tttctgcaat gaaaaatggt 420

tctttatttt ataatttaac agttagcgta tctaaatacc ctaattttaa atcttttcaa 480

tgtgttaaca acctcacatc tgtttatcta aatggtgatc ttgtttttac ttccaataaa 540

actactgatg ttacgtcagc aggtgtgtat tttaaagcag gtggacctgt aaattatagt 600

gttatgaaag aatttaaggt tcttgcttac tttgttaatg gtacagcaca agatgtaatt 660

ttgtgcgata attcccccaa gggtttgctg gcttgtcaat ataacactgg caatttttca 720

gatggctttt atccttttac taatagtact ttagttaggg aaaagttcat tgtctatcgc 780

gaaagtagtg ttaatactac tctggcgtta actaatttca cttttactaa tgtaagtaat 840

gcaccgccta atagtggtgg tgttcatact tttcctttat atcaaacaca aacagcccag 900

agtggttatt ataattttaa tttgtcattt ctgagtcagt ttgtgtataa ggcaagtgat 960

tttatgtatg ggtcttacca ccctagttgt tcttttagac cagaaaccat taatagtggt 1020

ttgtggttta attctttgtc agtttctctt acttatggac ccctacaggg agggtgtaag 1080

caatctgttt ttagtggtaa ggcaatgtgt tgttatgcct actcttataa tggcccaagg 1140

gcatgtaaag gtgtttattc aggtgaatta agcatgaatt ttgaatgtgg attgctggtt 1200

tatgttacta agagtgatgg ctctcgtata cagactagaa cggagccctt agtattaacg 1260

caacacaatt ataataatat tactttagat aagtgtgttg cctataatat atatggcaga 1320

gtaggccaag gttttattac taatgtgact gattctgctg ctaattttag ttatttagca 1380

gatggtgggt tagctatttt agatacgtcg ggtgccatag atgtttttgt tgtacagggc 1440

agctatggtc ttaattatta caaggttaat ccttgtgaag atgttaacca acagtttgta 1500

gtgtctggtg gcaatatagt tggcattctt acttctagaa atgaaacagg ttctgaacag 1560

gttgagaacc agttttatgt taagttaacc agtagctcac atcgtcgcag gcgttctatt 1620

ggccaaaatg taacaagttg cccttatgtt agttatg 1657

Claims (7)

1.一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

s1.用鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈诱导感染动物；

s2.12h后再用鸡传染性支气管炎病毒JS株感染动物，攻毒12h-24h小时后构建得到所述动物模型；

所述鸡传染性支气管炎病毒JS株的NCBI序列号为EU031525.1。

2.根据权利要求1所述的一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤1中鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈的菌液制备是采用无菌LB营养琼脂平板复苏，37℃培养24h，挑取单个菌落接种于50mL LB液体培养基，37℃震荡培养24h，通过梯度稀释，涂布LB平板计数得到大肠杆菌菌液浓度为6.85×10⁸CFU/mL，将培养的菌液用无菌的PBS稀释1000倍得到。

3.根据权利要求1或2所述的一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤2中使用的鸡传染性支气管炎病毒JS株通过以下步骤制备：

a1.将1日龄SPF鸡蛋置于37℃恒温培养箱孵化机中孵育至9日龄，通过鸡胚尿囊液注射鸡传染性支气管炎病毒JS毒株0.1mL/胚，石蜡封闭，将接种了毒株的鸡胚继续置于孵化机中孵育，每隔12h照蛋一次，弃去24h内死亡胚，于72h时将活胚置于4℃冰箱过夜，次日无菌收集尿囊液，反复传代3次，将得到的鸡胚尿囊液收集保存于-20℃冰箱备用；

a2.将上述所收集的鸡胚尿囊液作10倍稀释，取10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹五个梯度接种病毒稀释液，接种到9日龄鸡胚，7d后收取尿囊液，通过荧光定量PCR法检测病毒梯度，用Reed-Muench两氏法计算EID50，最终结果为10^-6.5。

4.根据权利要求3所述的一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤2中鸡传染性支气管炎病毒JS株感染所述动物的剂量具体为10^-6.5EID50。

5.根据权利要求4所述的一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，其特征在于，所述动物为14-15日龄的SPF白来航鸡。

6.根据权利要求5所述的一种鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型的建立方法，其特征在于所述步骤1中鸡大肠杆菌标准菌株O₇₈诱导感染动物通过喉头气管接种方式，所述步骤2中鸡传染性支气管炎病毒JS株感染动物通过喉头气管接种方式进行。

7.权利要求6所述方法构建的鸡传染性支气管炎病毒感染动物模型，其特征在于，可应用于在鸡传染性支气管炎病毒的药物治疗。

Images