KR20190109876A - 신규한 h5n3형 조류인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 H5N3형 조류인플루엔자 바이러스, 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 새로운 조류인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신은, 숙주에서 병원성 및 전염성이 높은 H5N1형 및 H5N8형 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방어력이 뛰어나기 때문에, 다양한 고병원성 H5 아형을 예방할 수 있는 범용성 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 H5N3형 조류인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물{NOVEL H5N3 AVIAN INFLUENZA VIRUS AND VACCINE COMPOSITON COMPRISING SAME}

본 발명은 신규한 H5N3형 조류인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

조류인플루엔자(Avian Influenza)는 닭과 기타 가금류에 대한 급성 바이러스성 질환으로, 일반적으로 전파가 빠르고, 임상증상이 전혀 나타나지 않는 경우부터 치사율이 100%인 경우까지 그 병원성이 매우 다양하다. 조류인플루엔자는 병원성에 따라 고병원성, 약병원성 및 비병원성의 3종류로 구분된다. 그중 고병원성 조류인플루엔자(HPAI; Highly Pathogenic Avian Influenza)는 국제수역사무국(OIE)에서 리스트 A질병으로, 국내에서는 제1종 가축 전염병으로 분류하고 있다.

조류인플루엔자의 원인체는 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스 타입 A(Infuenza virus type A)이다. A형 인플루엔자의 혈청형은 두 가지 단백질 즉, 혈구응집(Hemagglutinin) 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase)의 종류에 따라 구분되며 H 혈청형과 N 혈청형이 있다. 조류인플루엔자 바이러스는 H 혈청형이 16가지, N 혈청형이 9가지 종류가 있으며 산술적으로 존재 가능한 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 144가지이다. 현재까지 발생한 고병원성 조류인플루엔자는 모두 H5 및 H7 혈청형에 속하며, 이들 바이러스의 고병원성은 HA 단백질의 절단부위의 반복되는 염기성 단백질 때문인 것으로 알려져 있다.

가금류에 대한 H5N1 혈청형 조류인플루엔자 바이러스의 감염은 2003년 이후 아시아, 유럽, 아프리카 등을 포함한 넓은 지역에서 발생하고 있다. 조류인플루엔자 바이러스는 일반적으로 인간에게 직접 전파되지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, 1997년 H5N1 혈청형 조류인플루엔자 바이러스에 의한 인체 감염 사례가 홍콩에서 발견된 이후, H5N1, H7N7, H7N9, H9N2, H10N8의 다양한 아형의 조류인플루엔자 바이러스의 인체 감염 사례가 지속적으로 보고되고 있다.

국내에는 조류인플루엔자의 인체 감염 사례는 아직 없으나, 양계장 등의 가금류 및 야생조류에서의 고병원성 조류인플루엔자 H5N1의 발생은 2003년 이후 지속적으로 발생하고 있다. 또한, 2014년에는 H5N8이 전국 대부분 지역의 가금류에서 발생하여 축산 농가가 막대한 경제적 손해를 발생시켰다.

이러한 고병원성 조류인플루엔자로부터 발생하는 피해를 방지하기 위하여, 다양한 종류의 백신이 고안되었으나, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스는 항원성의 변이가 빈번하기 때문에 종래 개발된 백신 균주는 최근의 유행주에 대하여 충분한 방어효과를 제공하지 못하고 있는 실정이다.

본 발명의 목적은 H5N3형의 신규한 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 범용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 이용하여 가금류로부터 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해,

본 발명의 일 구현예는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌을 코딩하는 유전자를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스를 제공한다. 상기 헤마글루티닌 유전자는 A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3)로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 바이러스는 기탁번호 KCTC 13416BP의 바이러스일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는 상기 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 혈청형 또는 H5N8 혈청형 바이러스 감염을 예방할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 사독 백신일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 백신 조성물을 가금류에 투여하는 단계를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 새로운 저병원성 H5N3형 조류인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신은, 안정성이 우수할 뿐만 아니라, 숙주에서 병원성 및 전염성이 높은 H5N1형 및 H5N8형 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방어력이 뛰어난 장점이 있다. 따라서, 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스 균주는 다양한 고병원성 H5 아형을 예방할 수 있는 범용성 백신으로 개발이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 조류인플루엔자 바이러스를 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 조류인플루엔자 바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 단백질의 아미노산 서열과 A/Environment/Korea/W149/2006주의 헤마글루티닌 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 조류인플루엔자 바이러스 A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3)주와 H5N1 혈청형 및 H5N8 혈청형의 바이러스 주와 상동성을 확인하여 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물의 고병원성 H5N1 혈청형 바이러스에 대한 백신 효능을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물의 고병원성 H5N8 혈청형 바이러스에 대한 백신 효능을 확인한 결과이다.

본 발명의 일 구체예는, 동물 또는 사람에서 다양한 고병원성 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 감염을 예방하기 위하여, 상기 고병원성 조류인플루엔자 바이러스와 방어 혈청형이 같으면서도 병원성이 없는 신규한 H5N3 혈청형 조류인플루엔자 바이러스를 이용하여 제조한 백신주에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)을 코딩하는 유전자를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스를 제공할 수 있다.

일반적으로, 헤마글루티닌은 조류인플루엔자 바이러스의 외피에 존재하는 단백질로, 감염된 경우 숙주에서 면역 반응을 일으키는 주요 원인 중 하나이다. HA 단백질 항원의 분절부위 중 RRKKR/GLFG 아미노산 배열은 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스(Highly Pathogenic Avian Influenza; HPAI)로 분류되는 기준이 된다. 본 발명의 일 구체예에 따른 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌 단백질을, 코딩하는 유전자는 RRKKR/GLFG 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함하지 않으면서도, 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 HA 단백질과 상동성이 높아 백신으로 활용시 이의 방어가 가능하다.

상기 HA 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386197의 아미노산 서열 또는 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 헤마글루티닌 또는 이의 유전자는 상기 헤마글루티닌의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 9의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

구체적으로, 상기 헤마글루티닌 유전자는 A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3)로부터 유래될 수 있다. 천안 지역의 야생조류 분변시료를 특정병원체부재란 (specific pathogen free eggs, SPF eggs)에 접종하고, 72시간 배양하여 요막강액을 채취하여 바이러스를 확보하였다(도 1 참조). 이와 같이, 본 발명의 일 구체예에서 분리에 성공한 신규 조류인플루엔자 바이러스를 "A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3)"로 명명하였다. 도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 조류인플루엔자 바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 단백질의 아미노산 서열과 A/Environment/Korea/W149/2006주의 헤마글루티닌 단백질의 아미노산 서열과 비교하여 나타낸 것이다.

구체적으로, 주요 방어 유전자인 상기 헤마글루티닌 유전자의 아미노산 서열을 분석한 결과(서열번호 1), 본 발명의 일 구체예에 따른 조류인플루엔자 바이러스는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(low pathogenic avian influenza A virus, LPAI)로 분류되면서도 고병원성 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자와 상동성이 매우 높은 것을 확인하였다.

도 3을 참고하면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌 단백질은 2003년부터 2017년까지 보고된 H5N1 고병원성 국내분리주 및 2014년부터 2017년까지 보고된 H5N8 고병원성 국내분리주와 최소 88% 이상의 높은 아미노산 상동성을 나타내었다. 따라서, 저병원성의 조류인플루엔자를 고병원성 조류인플루엔자에 대한 백신으로 활용함으로써, 안정성이 높은 백신 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 상기 바이러스는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중합효소 단백질 B1(Polymerase Subunit B1, PB1)를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중합효소 단백질 B2(Polymerase Subunit B2, PB2)를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중합효소 단백질 A(Polymerase Subunit A, PA)를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 핵단백질(Neucleoprotein; NP)을 코딩하는 유전자, 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴라미다아제(Neuraminidase; NA) 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 매트릭스 단백질(Matrix; M)을 코딩하는 유전자 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 비구조성 단백질(Nonstructural protein; NS) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함할 수 있다.

상기 PB1 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 10의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386194의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, PB1 또는 이의 유전자는 상기 중합효소 단백질 B1의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 PB2 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 11의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386195의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, PB2 또는 이의 유전자는 상기 중합효소 단백질 B2의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 11의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 PA 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 12의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386193의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, PA 또는 이의 유전자는 상기 중합효소 단백질 A의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 서열번호 12의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 NP 유전자는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386192의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, NP 또는 이의 유전자는 상기 핵단백질의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 13의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 NA 유전자는 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 14의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386196의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, NA 또는 이의 유전자는 상기 뉴라미다아제의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 서열번호 14의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 매트릭스 단백질 유전자는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 15의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386191의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 매트릭스 단백질 또는 이의 유전자는 그 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 7의 아미노산 서열 또는 서열번호 15의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 NS 유전자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 또는 서열번호 16의 염기서열을 포함할 수 있다. 이는 구체적으로 GenBank Accession: MG386190의 염기서열을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, NS 또는 이의 유전자는 상기 비구조성 단백질의 기능을 변형시키지 않는 내에서 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 16의 염기서열과 약 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94% 이상, 바람직하게는, 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는, 약 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

한편, 상기 A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3) 바이러스는 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2017년 12월 7일자로 기탁되었으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 13416BP를 부여받았다. 이러한 본 발명의 일구체예에 따른 신규한 기탁번호 KCTC 13416BP의 균주는, 유정란에서 고생산성을 나타내고 있어 백신 제조 비용을 절감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 고병원성 H5형 조류인플루엔자 바이러스에 대하여 높은 방어력을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은, 전술한 본 발명의 일 구체예에 따른 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물을 제공할 수 있다. 본원에서 사용한 용어, "백신 조성물"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 조성물을 의미한다.

상기 백신 조성물은 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물에 투여됨으로써, 특히 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 혈청형 또는 H5N8 혈청형 바이러스 감염을 예방할 수 있으며, 예를 들어, H5N1 혈청형의 A/chicken/Korea/ES/2003주, A/Wild duck/Korea/SNU50-5/2009주, A/Environment/Korea/W149/2006주, H5N8 혈청형의 A/Environment/Korea/ma452/2016주에 대한 감염을 예방할 수 있다. 나아가 고병원성 H5 혈청형의 아형의 감염을 예방하는 범용성 백신일 수 있다.

상기 백신 조성물은 약독화된 생독 백신, 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(Synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(Genetic enginerring vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 사독 백신이 바람직하다.

본원에서 사용한 용어 "사독 백신"은 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다. 상기 백신 조성물은 대개 비경구적으로, 즉 근육 내 또는 피하 내로 투여되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 백신은 활성 성분으로서 조류인플루엔자 바이러스를 유효량, 즉 독성 바이러스에 의한 공격(항원 투여)에 대항하여 백신 접종된 조류 또는 그들의 자손에서 면역을 유도할 조류인플루엔자 바이러스 물질을 면역화시키는 양으로 포함한다. 본원에서 면역은 백신접종되지 않은 군에 비해 백신접종 후 조류 집단에서 상당히 높은 레벨의 보호를 유도하는 것으로 정의된다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 백신 조성물은 추가적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 보조제, 면역강화제 등을 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적 예시로서, 물, 생리 식염수, 증류수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적당한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산매 등이 있다. 또한, 상기 면역강화제는, 무기 면역강화제로서 예를 들면, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트 또는 유기 면역강화제로서 예를 들면, CpG DNA 또는 폴리 A 또는 미생물 및 이의 추출물 및 오일 면역강화제일 수 있다. 또한, 상기 추가로 포함되는 제제들은 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 공지의 물질을 더 모두 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 사독 백신은 보조적 활성을 갖는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 또한, 백신 조성물에 안정제, 불활화제, 항생제, 보존제, 등이 추가로 사용될 수 있다. 백신의 투여 경로에 따라 백신 항원은 완충용액 등과도 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제공할 수 있다.

본원에서 사용한 용어 "개체"란 개체에 전파시킬 수 있는 모든 종류의 동물, 예를들어 개과 동물, 족제비과 동물, 고양이과 동물, 돼지과 동물, 설치류 및 영장류 및 조류임이 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 비둘기, 쥐, 사람이다.

상기 백신 조성물을 이러한 개체에 투여함으로써, 해당 개체에 보호성 면역 반응을 유도하거나 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 상기 면역 반응은 백신 조성물 또는 이를 포함하는 백신 중에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 서프레서 T 세포, 세포독성 T 세포 및 감마-델타 T 세포의 생산 또는 활성화, 숙주에서 치료학적 또는 보호 면역학적 반응을 나타내어 새로운 감염에 대한 내성이 증진되거나 질환의 임상적 중증도가 감소되는 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 보호 면역 반응일 수 있다.

상기 보호는 감염된 숙주가 통상적으로 나타내는 임상적 징후의 감소 또는 부재, 보다 신속한 회복 시간 또는 보다 낮아진 지속시간 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물에서 보다 낮은 바이러스 역가에 의해 입증된다. 상기에서 유효량은 면역 반응을 유도하여 닭에서 닭 전염성 후두기관염 바이러스 감염의 빈도수 또는 이의 중증도를 감소시킬 수 있는 백신의 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 백신 조성물의 제조

A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3)주(상기 균주는 전라북도 정읍시 소재 한국생명공학연구원 전북분원 생물자원센터에 2017. 12. 7.자로 기탁하여, KCTC 13416BP의 기탁번호를 부여받았다)를 PBS를 이용하여 1/1000로 희석 후, 특정병원체부재란(SPF란)에서 48시간 배양하여 요막강액을 채취하였다. 채취한 바이러스는 0.5% 닭 적혈구를 이용하여 혈구응집반응 역가를 (2⁸ HA) 측정하였다. 그리고, 초원심기를 이용하여 4℃ 냉장상태에서 24,000rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 바이러스를 정제 및 농축하였다. 이렇게 농축된 바이러스 (2¹⁰ HA 역가)를 0.1% 포르말린 첨가 후 4℃에서 72시간 처리하여 불활화여 사독백신용 항원을 제작하였으며, 면역보강제와 같은 첨가제는 포함되지 않았다.

실험예 1. 백신 조성물의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 효능 확인

실시예 1.에서 제조한 백신의 면역원성을 확인하기 위하여, 6주령 SPF 마우스 총 20마리에 마리당 0.1 ml씩 2주 간격으로 2차 근육 내 접종하였다. 다음으로, 2주가 지난 다음 H5N1 혈청형 A/Environment/Korea/W149/2006 국내 분리주와 H5N8 혈청형 A/Environment/Korea/ma452/2016 국내 분리주인 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 5배의 MLD50(50% mouse lethal dose, 50%의 마우스 치사량 감염량)로 공격 접종하였다. 이후, 2주 동안 체중변화와 생존율을 관찰하여 백신의 방어 효과를 조사하여 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5를 참고하면, 기존의 H5N1 공격접종 대조군의 생존율과 H5N8 공격접종 대조군의 생존율이 각각 40, 20%에 그치는 반면, 본 발명에 따른 백신 투여 그룹은 모두 100% 생존하는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 저병원성으로 투여 대상 개체에 대한 안정성이 높으면서도, H5N1 및 H5N8 조류인플루엔자 바이러스 두 종류 모두의 감염을 효과적으로 방어하는 것을 알 수 있다. 따라서, 다양한 고병원성 H5 아형을 예방할 수 있는 범용성 백신으로 개발이 가능할 것으로 예상된다.

실험예 2. 백신 조성물의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 효능 비교

실시예 1.에서 제조한 백신과 상용화 Re-5 백신을 6주령 SPF 마우스 총 5마리에 마리당 0.1 ml씩 2주 간격으로 2차 근육 내 접종하였다. 다음으로, 2주가 지난 다음 채혈한 혈청과 베트남에서 분리된 고병원성 H5N1 (A/Chicken/Vietnam/AI-1302/2013), H5N6 (A/Chicken/Vietnam/AI-1702/2017)에 대한 HI (hemagglutinin inhibition, 혈구응집 억제시험) test를 수행하여, 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다.

마우스에 백신접종 후 채혈한 혈청의 HI test 결과
백신 종류	H5N1	H5N6
PBS	<10	<10
실시예 1에 따른 백신	320	320
상용화 백신 (Re-5)	320	80

표 1에 나타난 바와 같이, 본원발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물이 상용화 백신보다 다양한 아형의 고병원성 바이러스에 대한 항체역가가 도출된 것을 알 수 있다.

실험예 3. 백신 조성물의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대한 효능 비교

3주령된 SPF 닭을 대상으로 실시예 1.에서 제조한 백신과 상용화 Re-5 백신을 총 3마리에 0.5 ml씩 2주 간격으로 2차 근육 내 접종하였다. 다음으로, 2주가 지난 다음 채혈한 혈청과 고병원성 H5N1 (A/Environment/Korea/W149/2006), H5N8 (A/Environment/Korea/ma452/2016)과 저병원성 H5N3 (A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015) 조류인플루엔자 바이러스에 대한 HI test를 수행하여, 그 결과를 아래 표 2에 나타내었다.

닭에 백신접종 후 채혈한 혈청의 HI test 결과
백신 종류	H5N1	H5N3	H5N8
PBS	<10	<10	<10
실시예 1에 따른 백신	320	320	40
상용화 백신 (Re-5)	320	80	<10

표 2에 나타난 바와 같이, 본원발명의 일 실시예에 따른 백신 조성물은 상용화 백신보다 다양한 아형의 고병원성 바이러스에 대해서 면역원성을 가지는 것을 알 수 있다. 따라서, 본원발명에 따른 백신 조성물은 가금류로부터 고병원성 조류인플루엔자 바이러스 감염을 보다 효과적으로 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> NOVEL H5N3 AVIAN INFLUENZA VIRUS AND VACCINE COMPOSITON COMPRISING SAME <130> FPD/201712-0046/C <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 759 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hemagglutinin <400> 1 Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Ser Gln Ser Arg Thr 1 5 10 15 Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys 20 25 30 Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys 35 40 45 Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met 50 55 60 Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys 65 70 75 80 Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Ile Val Ser Pro Leu Ala Val 85 90 95 Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Val His Tyr Pro 100 105 110 Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly 115 120 125 Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg 130 135 140 Val Asp Thr Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala 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Met Val Gly Arg 355 360 365 Arg Ala Thr Ala Ile Leu Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu 370 375 380 Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val 385 390 395 400 Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly 405 410 415 Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His 420 425 430 Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn 435 440 445 Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu 450 455 460 Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Val Ser Leu Arg Gly Val Arg Val 465 470 475 480 Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val 485 490 495 Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Val Leu 500 505 510 Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr 515 520 525 Ile Thr Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser 530 535 540 Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Thr Val 545 550 555 560 Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr 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Lys Arg Ser Tyr Leu Ile Arg Ala Leu Thr Leu 210 215 220 Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala 225 230 235 240 Ile Ala Thr Pro Gly Met Gln Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu 245 250 255 Thr Leu Ala Arg Ser Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro 260 265 270 Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys 275 280 285 Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly 290 295 300 Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Met Phe Leu Ala 305 310 315 320 Met Ile Thr Tyr Ile Thr Arg Asn Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val 325 330 335 Leu Ser Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly 340 345 350 Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile 355 360 365 Pro Ala Glu Met Leu Ala Asn Ile Asp Leu Lys Tyr Phe Asn Glu Ser 370 375 380 Thr Arg Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Ile Asp Gly Thr 385 390 395 400 Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser 405 410 415 Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Lys Arg Tyr Thr 420 425 430 Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala 435 440 445 Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp 450 455 460 Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Val Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys 465 470 475 480 Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe 485 490 495 Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe 500 505 510 Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr 515 520 525 Val Ile Lys Asn Asn Met Ile Asn Asn Asp Leu Gly Pro Ala Thr Ala 530 535 540 Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg 545 550 555 560 Cys His Arg Gly Asp Thr Gln Ile Gln Thr Arg Arg Ser Phe Glu Leu 565 570 575 Lys Lys Leu Trp Glu Gln Thr Arg Ser Lys Ala Gly Leu Leu Val Ser 580 585 590 Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile Arg Asn Leu His Ile Pro Glu 595 600 605 Val Cys Leu Lys Trp Glu Leu Met Asp Glu Asp Tyr Gln Gly Arg Leu 610 615 620 Cys Asn Pro Leu Asn Pro 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aaggcagaac atctgacatg 1320 aggactgaaa tcataagaat gatggaaaat gccagaccag aagatgtgtc attccagggg 1380 cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcaacgaacc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440 atgagtaatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggagtatga caattaa 1497 <210> 14 <211> 1410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Neuraminidase <400> 14 atgaatccaa atcagaagat aataacaatt ggtgtagtga atactactct atcaacaata 60 gcccttctta ttggaattgg gaatctaatc ttcaacactg tcatacatga gaaaataggg 120 gaccaccaaa ctgtggtata tccaacaata acagccccag tggtgccaaa ctgcagtgac 180 accacaatca catacaacaa cactgtgata cataacataa caacgacaat aataaccgaa 240 gcggaaaagc atttcaaatc ctcactgccg ctatgcccct tccgaggttt cttccccttt 300 cacaaggaca atgcaatacg attgggtgag aacaaagacg taatagtcac aagggagccc 360 tatgtcagtt gtgacaatga taattgctgg tcttttgccc tcgctcaagg ggctctactg 420 gggactaaac acagcaatgg gaccatcaag gacaggacac catatagatc gctgatccgg 480 ttcccaatag gaacagctcc agtactgggc aattacaaag agatatgtgt tgcctggtca 540 agtagcagtt gcttcgatgg aaaggaatgg atgcatgtct gcatgactgg gaacgacaat 600 gatgcgagtg gccaaataat atatgcaggg aaaatgacag actccattaa atcatggaga 660 aaggatatac taagaactca agagtctgaa tgtcaatgca ttgacgggac ctgtgttgta 720 gctgtaacag atggtcctgc ggctaatagt gcagaccacc gaatttactg gatacgagaa 780 ggtaaggtaa tgaagtatga aaacattccc aaaacaaaaa tacagcattt agaagaatgt 840 tcttgttatg tggacatcga tgtgtactgc atatgtaggg acaattggaa aggttctaat 900 aggccttgga tgaggatcaa taatgagacc atactagaaa cagggtacgt atgcagcaaa 960 ttccactcag atacccccag gccagccgat ccttcgacag tatcgtgtga ttccccaagt 1020 aatgttaatg gaggacctgg agtcaaagga tttggcttca aaactggtga tgatgtatgg 1080 ctgggaagga ctgtatcaac cagtggaaga tcaggctttg agatcatcaa agtcacagag 1140 gggtggatca attctcccaa tcatgccaaa tcagttacac aaacattagt gtcaaacaat 1200 gattggtcag gttactcagg gagcttcatt gttgagaaca atggctgctt tcagccctgc 1260 ttctatattg aacttatacg gggaaggccc aataagaacg atgacgtttc ttggacgagc 1320 aacagcatag ttactttctg tggactagac aatgaacctg gatcgggaaa ttggcctgat 1380 ggttccaaca ttgggtttat gcccaagtaa 1410 <210> 15 <211> 982 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matrix protein <400> 15 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcgtcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagag acttgaagat gtctttgcag ggaaaaacac cgatctcgag 120 gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atactgtcac ctctgactaa ggggatttta 180 gggtttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 caaaatgccc taaatggaaa tggagaccca aacaacatgg acagggcagt caaactgtac 300 aggaaactga agagagagat aacattccat ggggctaaag aagttgcact cagttactca 360 accggtgcac ttgccagttg tatgggtctc atatacaaca gaatggggac ggtgaccaca 420 gaagtggcgt ttggcctagt gtgtgccacc tgtgagcaga ttgctgattc acagcatcgg 480 tctcacagac agatggtaac taccaccaac ccactaatca ggcatgaaaa cagaatggtg 540 ctggccagca ctacggctaa ggctatggag cagatggctg ggtcgagtga gcaggcagcg 600 gaagcaatgg aggttgccag ccaggctagg cagatggtgc aggcgatgag gaccattgga 660 actcacccta gctccagtgc cggtctgaaa gatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720 cagaaacgga tgggagtgca aatgcagcga ttcaagtgat cctctcgtta ttgccgcaag 780 tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaatgcat 840 ttatcgtcgc cttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acggaaggag tgcctgagtc 900 tatgagggaa gagtatcggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960 tgtcaacata gagctggagt aa 982 <210> 16 <211> 838 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nonstructural protein <400> 16 atggattcca acactgtgtc aagctttcag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattccttg accggcttcg ccgagatcag 120 aagtctctga gaggaagagg cagcactctt ggtctggaca tcgaaacagc tactcgagcg 180 ggaaagcaga tagtggagcg gattctggaa gaagaatctg atgaggcact taaaatgact 240 attgcttcag tgccggcttc acgctaccta actgacatga ctcttgaaga gatgtcaaga 300 gactggttca tgctcatgcc caaacagaaa gtggcaggtt ccctttgcat tagaatggac 360 caggcaataa tggataaaaa catcatattg aaagcaaact tcagtgtgat ttttgaccga 420 ctggaaaccc taatactact tagagctttc acagaagaag gagcaattgt gggagaaatc 480 tcaccattac cttcccttcc aggacatact gatgaggatg tcaaaaatgc aattggggtc 540 ctcatcggag gacttgaatg gaatgataac acagttcgag tctctgaaac tctacagaga 600 ttcgcttgga gaagcagtaa tgaggatggg agacctccac tccctccaaa acagaaacgg 660 aaaatggcga gaacaattga gtcagaagtt tgaagaaata agatggctga ttgaagaagt 720 gcgacataga ttgaagatta cagagaacag cttcgaacag ataacgttta tgcaagcctt 780 acaactattg cttgaagtag agcaagagat aagaactttc tcgtttcagc ttatttaa 838

Claims (12)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)을 코딩하는 유전자를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 헤마글루티닌을 코딩하는 유전자는 A/Aquatic bird/South Korea/sw007/2015(H5N3)로부터 유래된, 조류인플루엔자 바이러스.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 헤마글루티닌을 코딩하는 유전자는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 바이러스는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중합효소 단백질 B1(Polymerase Subunit B1, PB1)를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중합효소 단백질 B2(Polymerase Subunit B2, PB2)를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중합효소 단백질 A(Polymerase Subunit A, PA)를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 핵단백질(Neucleoprotein; NP)을 코딩하는 유전자, 서열번호 6의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴라미다아제(Neuraminidase; NA) 유전자, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 매트릭스 단백질(Matrix; M)을 코딩하는 유전자 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 비구조성 단백질(Nonstructural protein; NS) 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 바이러스는 기탁번호 KCTC 13416BP의 바이러스인, 조류인플루엔자 바이러스.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
   
7. 제6항에 있어서,
   서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HA 단백질을 항원으로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
   
8. 제6항에 있어서,
   서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 PB1 단백질, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 PB2 단백질, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 PA 단백질, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 NP 단백질, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 NA 단백질, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 매트릭스 단백질 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 NS 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단백질을 항원으로 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
   
9. 제6항에 있어서,
   상기 조성물은 고병원성 조류인플루엔자 H5N1 혈청형 또는 H5N8 혈청형 바이러스 감염을 예방하는, 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
   
10. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 사독 백신인, 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
    
11. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및 보조제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 더 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 백신 조성물.
    
12. 제6항에 따른 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 감염을 예방하는 방법.

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