CN102245203A - 用于季节性和大流行保护的联合流感疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明流感疫苗接种方案针对季节性毒株或大流行毒株。目前，季节性疫苗一般包含来自两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株的抗原。本发明大流行疫苗针对H5N1甲型流感病毒株。本发明的一个目的是提供制备可引起对季节性和大流行毒株免疫的疫苗的深入和改良的途径。

Description

用于季节性和大流行保护的联合流感疫苗
本申请要求2008年6月12日提交的美国临时申请号61/131,918，2009年3月31日提交的英国专利申请号0905570.8之权利，以上所述两者全部内容纳入本文作参考。
技术领域
本发明属于对抗流感病毒感染的疫苗领域，尤其是包含来自当前季节性毒株和大流行毒株的抗原的疫苗。
背景技术
本发明流感疫苗接种方案针对季节性毒株或大流行毒株。目前，季节性疫苗一般包含来自两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株的抗原。本发明大流行疫苗针对H5N1甲型流感病毒株。
参考文献1中公开了引起对季节性和大流行毒株产生免疫的疫苗。本发明的一个目的是提供制备可引起对季节性和大流行毒株免疫的疫苗的深入和改良的途径。
发明内容
本发明提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第一容器中H1N1、H3N2和B抗原的浓度范围各自是25-35μg/ml，例如约30μg/ml(通常质量比例是1∶1∶1)。所述第二容器中大流行抗原的理想浓度范围是5-20μg/ml，例如约15μg/ml。如通常用于灭活流感疫苗那样，这些抗原浓度以流感病毒血凝素表示。
与在制造过程中制成4价疫苗相比，在一个药盒内分开保存大流行疫苗和季节性疫苗使得更易于改动最终疫苗的毒株特征。因为大流行病毒的毒株变化，这点尤其重要。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第二容器中大流行抗原的浓度范围是5-20μg/ml，例如约15μg/ml。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第一和第二容器中水性疫苗的体积基本相同，各自范围是约0.4-0.6ml，如约0.5ml。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第一容器中水性疫苗的体积基本是所述第二容器中水性疫苗的两倍。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述各容器是硼硅玻璃小瓶。每一小瓶可包含一次或多次(例如10次)给药的材料。所述小瓶可配有丁基橡胶制成的瓶塞。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述H5N1甲型流感病毒株属于进化支1、2或者4。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述H5N1毒株选自下组，或者具有引发与选自下组的毒株的血凝素交叉反应的抗血凝素抗体的血凝素：A/Vietnam/1203/2004、A/Vietnam/1194/2004、A/鸭/Hunan/795/2002、A/Indonesia/5/2005、A/天鹅/Mongolia/244/2005、A/鸡/India/NIV33487/2006、A/Anhui/1/2005、A/斑头雁/Quighai/lA/2005、A/暗绿绣眼鸟(Japanese white eye)/Hong Kong/1038/2006、A/火鸡/Turkey/1/2005、A/鹅/Guiyang/337/2006、A/鸭/Laos/3295/2006、A/Cambodia/R0405050/2007和A/喜鹊/Hong Kong/5052/2007。
在一些实施方式中，所述第一容器包含佐剂，但是所述第二容器没有佐剂。在其它实施方式中，所述第一容器包含佐剂并且所述第二容器也包含佐剂。在其它实施方式中，所述第一容器没有佐剂，但是所述第二容器包含佐剂。在其它实施方式中，所述第一和第二容器不含佐剂，但是所述药盒中装有含有水包油乳液佐剂但不含抗原的第三容器。在其它实施方式中，所述第一和第二容器不含佐剂，但是所述药盒中装有含有水包油乳液佐剂和非流感抗原的第三容器。合适的佐剂详述如下。
使用这些药盒时，所述容器中的内容物可在使用时混合，然后作为组合疫苗方便给予病人。可以任何顺序混合这些内容物。例如，当容器为小瓶时，可以通过针头将所述第二容器中的内容物抽到注射器中，然后注入所述第一容器中。混合后，将混合的内容物抽到注射器中(与之前的相同或不同)。抽取的针头可直接用于注射，或丢弃并利用适合注射(例如IM注射)的针头替换。
本发明还提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、大流行甲型流感病毒株(例如H5毒株，如H5N1)和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有水包油乳液佐剂。
本发明提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的冻干灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1的抗原。所述第二容器最好包括水包油乳液。
本发明提供一种药盒，其装有：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、大流行甲型流感病毒株(例如H5毒株，如H5N1)和乙型流感病毒株的抗原的冻干灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有水包油乳液佐剂。
本发明还提供包含多个分离室的注射器，其中：(i)第一室，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二室，其中装有含有来自大流行毒株例如H5毒株，如H5N1的抗原的水性灭活流感疫苗。因此两种水性组分可互相分离地装在同一注射器中，当推动时，导致组分混合。在一些实施方式中，所述第一室包含佐剂。在其它实施方式中，所述第二室包含佐剂。在其它实施方式中，第三小室包含佐剂。多室注射器是已知的，例如可参见参考文献2-9等。
疫苗制备
目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗，疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。流感抗原也可以病毒体形式出现。本发明可与这些疫苗类型结合使用，但通常与灭活疫苗结合使用。
采用灭活病毒时，该疫苗可包含完整的病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种物质处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或它们的组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。
可通过各种方法由含病毒液体收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。
用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托NP9等)处理纯化的病毒颗粒以获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂，包括′吐温-醚′裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献10-15等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十四烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质转染胺试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)进行。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒颗粒材料分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXTM、FLUZONETM和FLUSHIELDTM产品是裂解疫苗。
纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。例如FLUVIRINTM、AGRIPPALTM和INFLUVACTM产品。
另一种形式的灭活流感抗原是病毒体[16](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)。病毒体可通过用去污剂溶解流感病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括：加入病毒膜糖蛋白至磷脂过量，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。本发明可用于储存大量病毒体，如INFLEXAL VTM和INVAVACTM产品。
流感病毒可被减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。
HA是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μg HA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如在儿科应用或大流行状况中，或者是使用佐剂时。采用了分数剂量如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8，以及较高剂量(如3x或9x剂量[17，18])。除非另有说明，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5μg等/毒株。除大流行毒株外，疫苗中优选包含质量基本相同的每种毒株的HA，例如每种毒株的HA质量在每种毒株平均HA质量的正负10％之内，优选平均值的正负5％之内。大流行毒株的HA质量优选为非大流行毒株的平均质量的1/2或1/4。
就活疫苗而言，利用组织培养感染剂量中值(TCID50)而非HA含量来衡量剂量，TCID50一般为106-108(优选为106.5-107.5)/毒株。
本发明所用的毒株可以具有野生型病毒中的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA去除决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))能使病毒在禽类动物中具有高度致病性。本发明所用的乙型流感病毒的血凝素优选在氨基酸197位上具有Asn，以提供糖基化位点[19]。
细胞系
除了使用SPF鸡蛋作为病毒生长的培养基外(从感染鸡蛋的尿囊液中收集病毒)，还可使用支持流感病毒复制的细胞系。细胞系通常是哺乳动物来源。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠，牛，灵长类(包括人和猴)及犬细胞，但不优选使用灵长类细胞。可使用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞包括例如，非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系[20-22]。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如CLDK和MDCK细胞系。
因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、CLDK、HKCC、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6[23]、FRhL2、WI-38等。合适的细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[24]、Coriell细胞库[25]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。
最优选的细胞系是具有哺乳动物类型糖基化的细胞系。哺乳动物细胞系的次优选替代方式是可以在禽细胞系上培养病毒[例如参考文献26-28]，这些细胞系包括衍生自鸭(如鸭视网膜)或母鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[26.29]和鸭视网膜细胞[27]。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[30]。也可利用鸡胚成纤维细胞(CEF)。然而，与使用禽类细胞相比，使用哺乳动物细胞系意味着该疫苗可能不含禽类DNA和鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)，从而降低变应原性。
用于培养流感病毒的最优选的细胞系是来自马-达二氏犬肾的MDCK细胞系[31-34]。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献31公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系(′MDCK 33016′，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，参考文献35公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系(′B-702′，保藏号FERM BP-7449)。参考文献36公开了非致瘤性MDCK细胞，包括′MDCK-S′(ATCC PTA-6500)、′MDCK-SF101′(ATCC PTA-6501)、′MDCK-SF102′(ATCC PTA-6502)和′MDCK-SF103′(PTA-6503)。参考文献37公开了非常容易感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。
可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。也可使用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。
优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养细胞系。在本发明中，如果培养基中没有人或动物血清来源的添加剂，则称为无血清培养基。生长于此类培养物中的细胞天然包含蛋白质本身，但是无蛋白质培养基理解为在其中细胞的倍增(例如感染前)发生于没有蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质的条件下，但是可以人选包含病毒生长必须的蛋白质，如胰蛋白酶或其它蛋白酶。
在病毒复制过程中，支持流感病毒复制的细胞系优选在37℃以下(如30-36℃，或约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)培养[38]。
在培养细胞中增殖流感病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养毒株接种体接种培养的细胞；将感染细胞培养所需时间以增殖病毒，并根据病毒效价或抗原表达进行测定(例如，在接种后培养24至168小时)；收集增殖的病毒。用1∶500-1∶1，优选1∶100-1∶5，更优选1∶50-1∶10的病毒(由PFU或TCID50测定)：细胞比接种培养的细胞。将病毒加入到细胞悬液中，或施加于单层细胞，病毒在细胞上吸收至少60分钟但通常小于300分钟，优选90-240分钟，温度为25℃-40℃，优选28℃-37℃。可通过冻融或酶作用去除感染的细胞培养物(如单层)，以提高收获的细胞上清液的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(″m.o.i.″)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以释放病毒，所述蛋白酶可以在培养过程的任何合适阶段加入，例如接种前、接种同时或接种后[38]。
在优选实施方式中，尤其是使用MDCK细胞时，来自主工作细胞库中的细胞系传代不超过40次群体倍增水平。
病毒接种体和病毒培养物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[39]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。
宿主细胞DNA
用细胞系培养病毒时，标准实践是最大程度减少最终疫苗中残留的细胞系DNA的含量，以最大程度降低该DNA的致癌活性。
因此，按照本发明制备的疫苗组合物优选含有小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)残留的宿主细胞DNA/剂量，但可能存在痕量宿主细胞DNA。
优选每15μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。更优选每50μg血凝素中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量＜10ng(如＜1ng、＜100pg)的疫苗。
任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。
在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献40和41公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理(可以在病毒生长过程中使用)，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理(可以在病毒颗粒破坏过程中使用)。也可采用β-丙内酯去除。
现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是已验证的实验[42，43]。可通过数学和可以量化的条件来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检测了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可采用三种DNA定量的基本技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[44]；免疫测定方法，如ThresholdTM系统[45]；和定量PCR[46]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(Molecular Devices)的ThresholdTM系统是皮克水平总DNA的定量实验，已用于监测生物药品中污染DNA的水平[45]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTecTM实验室服务公司(AppTecTM Laboratory Services)、BioRelianceTM公司奥西科技公司(Althea Technologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNA ThresholdTM系统的比较参见参考文献47。
毒株选择
按照本发明产生的疫苗至少包括四种流感病毒株。一般单独培养不同毒株，收获病毒并制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。
甲型流感病毒目前展示十六种HA亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。本发明可保护免受一种或多种流感A病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的感染。本文提供的疫苗至少包含H1毒株、H3毒株和大流行毒株。在一些实施方式中，所述H3毒株与A/Moscow/10/99发生交叉反应。在其它实施方式中，所述H3毒株与A/Fujian/411/2002发生交叉反应。
大流行流感毒株的特征是：(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有数十年在人群中没有发现的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，以至于疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它对人有致病性。大流行毒株可包括H2、H5、H7或H9亚型毒株，例如H5N1、H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7毒株。通常是H5N1毒株。本发明使用的其它大流行毒株可来自2009年从猪传播至人的H1N1毒株。因此大流行毒株可以是具有相对于SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：14更相关的血凝素的H1毒株(即使用相同算法和参数进行比对时，相对于SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：14具有更高的序列相同性)。
乙型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但乙型流感病毒株分为两种不同的谱系。这些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA[48]。当前乙型流感病毒株是B/Victoria/2/87-样或B/Yamagata/16/88-样。通常可从抗原性区分这些毒株，但氨基酸序列的不同也可以区分这两种谱系，例如B/Yamagata/16/88-样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对′Lee40′HA序列进行编号)的HA蛋白[49]。在一些实施方式中，所述乙型流感毒株是B/Victoria/2/87样毒株。在其它实施方式中，所述乙型流感毒株是B/Yamagata/16/88样毒株。
本发明所用的流感病毒可以是重配病毒，并可通过逆向遗传学技术获得。逆向遗传学技术[如50-54]能够用质粒在体外制备含有所需基因组节段的流感病毒。该技术一般包括表达(a)例如，由polI启动子或噬菌体RNA聚合酶启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子编码病毒蛋白的DNA分子，以便在细胞中表达两种类型的DNA，导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。可采用不同质粒产生各病毒RNA的质粒方法[55-57]，这些方法也包括使用质粒表达所有或一些病毒蛋白(例如仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，一些方法中至多使用12种质粒。为了降低所需的质粒数量，近期方法[58]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A vRNA节段的序列)上，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感A mRNA转录物的序列)上。参考文献58方法的优选方面包括：(a)在单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)在单一质粒上的所有8种vRNA编码区段。一个质粒上包含NA和HA节段而另外六个节段位于另一质粒上也可能是有利的。
作为使用polI启动子编码病毒RNA节段的替换方式，可能使用噬菌体聚合酶启动子[59]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。因为polI启动子的物种特异性，对于许多细胞类型(例如MDCK)更宜使用噬菌体聚合酶启动子，但必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。在其它技术中，可能使用polI和polII双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[60，61]。
因此，流感A病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个节段，HA和N节段来自疫苗毒株，即6∶2重配毒株)的一个或多个RNA节段。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的重配病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA节段。甲型流感病毒可包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自AA/6/60流感病毒(A/Ann Arbor/6/60)的病毒区段。乙型流感病毒可包括不到6个(即0、1、2、3、4或5个)来自AA/1/66流感病毒(B/Ann Arbor/1/66)的病毒区段。本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含在哺乳动物(如人)流感病毒中起源的至少一个RNA区段。它可包含在禽流感病毒中起源的NS区段。
其抗原可包含在本发明组合物中的毒株可以是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[62]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[63]。
在从患者中分离到细胞培养系统中复制之间的任何阶段未通过鸡蛋进行传代的那些毒株尤其有用。MDCK细胞可专门用于从分离至病毒复制的所有步骤。
在一些实施方式中，本发明所用毒株具有血凝素，该血凝素具有与含Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖相比，更偏向于结合含Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好。人流感病毒结合具有Sia(α-2，6)Gal末端二糖(α-2，6连接至半乳糖的唾液酸)的受体寡糖，而蛋和Vero细胞具有含Sia(α-2，3)Gal末端二糖的受体寡糖。人流感病毒在细胞如MDCK中的生长提供了血凝素选择压，从而维持了天然的Sia(α2，6)Gal结合，这点与鸡蛋传代不同。
为了确定病毒是否具有相对于含Sia(α2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(α2，6)Gal末端二糖的寡糖的结合偏好，可利用各种分析试验。例如，参考文献64描述了测定流感病毒受体-结合活性的固相酶联试验，以便对亲合常数进行灵敏的定量测定。参考文献65采用固相试验，该试验评估病毒与两种不同的唾液酸糖蛋白的结合(卵类粘蛋白，具有Sia(α2，3)Gal决定簇；和猪α2巨球蛋白，具有Sia(α2，6)Gal决定簇)，也描述了评价针对两种受体类似物：游离唾液酸(Neu5Ac)和3′-唾液酸乳糖(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc)的病毒结合试验。参考文献66报道了采用能够清楚区分α2，3或α2，6连接受体偏好的聚糖试验。参考文献67报道了一种基于经酶促修饰包含Sia(α2，6)Gal或Sia(α2，3)Gal的人红细胞的凝集的试验。根据试验类型，可利用病毒本身直接进行试验，或者可利用从病毒纯化的血凝素间接进行试验。
在一些实施方式中，本发明所用流感毒株具有与鸡蛋来源的病毒糖基化模式不同的糖蛋白(包括血凝素)。因此，所述糖蛋白包含鸡蛋中未见的糖形。
当使用大流行毒株时，除非另有表明，通常为来自H5血凝素亚型的甲型流感病毒，如H5N1毒株。在H5亚型中，毒株可以属于进化支0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。
自2003以来在禽类中流行的H5N1病毒中大多数的血凝素(HA)序列属于两个不同的系统发生进化支。在柬埔寨、泰国和越南流行的进化支1病毒引起了2004年和2005年期间那些国家的以及2006年的泰国的人感染。进化支2病毒自2003年起在中国和印度尼西亚的鸟类中流行，在2005年和2006年期间向西传播至中东、欧洲和非洲。自2005年晚期，进化支2病毒主要引起人感染。已区分出进化支2的多种亚进化支；其中三种亚进化支1、2和3地理分布不同，迄今主要引起人病例感染。并且已知进一步的细分，例如进化支2.3中有四种细分，包括2.3.2和2.3.4。
在2006年8月至2007年3月期间，在禽类中持续流行或再次出现并已经与非洲、亚洲和欧洲散发人感染相联系的H5N1病毒的HA序列中大部分落入以前指定的系统发生进化支和亚进化支。进化支1病毒引起泰国和越南的鸟类爆发，以及泰国的人感染。进化支2.1病毒继续在家禽中循环，并引起印度尼西亚的人感染。进化支2.2病毒引起非洲、亚洲和欧洲一些国家的鸟类爆发，并且与埃及、伊拉克和尼日利亚的人感染有关。在亚洲零星分离出进化支2.3病毒，引起中国和老挝的人感染。
此外，在亚洲的局部爆发期间从家禽体内分离出一些不在这些分类中的病毒。这些病毒落入新兴进化支，以A/鹅/Guiyang/337/2006(进化支4)和A/鸡/Shanxi/2/2006(进化支7)为代表。目前总共定义了10个进化支，编号为0-9。
作为本文参考，每一进化支的原型毒株及其血凝素基因的编码序列如下：
本文中从系统发育的角度将进化支1H5病毒定义为这样一种甲型流感病毒，利用如Phylip软件包[68]中所用DNADIST算法进行评估时(例如，使用Kimura 2-参数距离和方阵)，其血凝素编码序列与A/HongKong/213/03毒株的编码序列(SEQ ID NO：1)相关性高于进化支0以及2-9中任何毒株的任何编码序列(SEQ ID NO：2-10)。相似的，进化支2病毒的血凝素编码序列与A/Indonesia/5/05毒株编码序列(SEQ ID NO：2)的相关性高于进化支0、1和3-9中任何毒株的任何编码序列(SEQ ID NO：1和3-10)。其它进化支的系统发育定义相似，血凝素的编码序列与来自SEQ ID NO：1-10的相关编码序列的相关性高于SEQ ED NO：1-10中的其它序列。
从核酸序列观点出发，本文可将进化支1病毒定义为这样一种甲型流感病毒，其具有的血凝素编码序列与A/HongKong/213/03毒株(SEQ ID NO：1)的序列相同性高于SEQ ID NO：2-10的任何序列。其它进化支的定义相似，血凝素编码序列与来自SEQ ID NO：1-10的相关编码序列的相关性高于SEQ ED NO：1-10中的其它序列。
从氨基酸序列的观点出发，参考特征性HA突变，本文可将H5病毒定义为属于一特定的进化支[69]。例如，进化支3病毒可具有一个或多个下列氨基酸残基，这些残基不同于进化支1和2：Asn-45、Ser-84、Asn-94、Asn-124、Leu-138、Ser-144、Glu-212、Ser-223、和/或Arg-325。进化支2的病毒可以包含进化支1和3所没有的Asp-124。进化支1病毒可具有一个或多个下列氨基酸残基，这些残基不同于进化支2和3：Ser-124、Leu-129。
进化支2内部至少鉴定到三种亚进化支：2.1、2.2和2.3。从系统发育观点出发，本文将进化支2.1H5病毒定义为血凝素编码序列与A/Indonesia/5/05毒株的编码序列(SEQ ID NO：2)的相关性高于A/Anhui/1/2005毒株(SEQ ID NO：11)或A/火鸡/Turkey/1/05毒株(SEQ IDNO：12)。相似的，从系统发育观点出发，本文将进化支2.2H5病毒定义为血凝素编码序列与A/火鸡/Turkey/1/05毒株的编码序列(SEQ ID NO：12)的相关性高于A/Anhui/1/2005毒株(SEQ ID NO：11)或A/hidonesia/5/05毒株(SEQ ID NO：2)。最后，从系统发育观点出发，本文将进化支2.3H5病毒定义为血凝素编码序列与A/Anhui/1/0毒株的编码序列(SEQ ID NO：11)的相关性高于A/火鸡/Turkey/1/05(SEQ ID NO：11)或A/Indonesia/5/05毒株(SEQ ID NO：2)。
在一些实施方式中，亚进化支2.2中的毒株的HA包含一个或多个下列序列：Ile-223、Ile-230、Ile-517、ΔSer-133；具有REGRRRKR序列(SEQ IDNO：13)的切割位点。HA基因可包含一个或多个下列核苷酸：A-41、A-142、A-209、A-295、G-433、A-467、A-496、C-610、A-627、A-643、C-658、T-661、T-689、T-727、G-880、C-937、G-1006、T-1012、A-1019、T-1177、A-1235、T-1402、C-1415、T-1480、C-1510、T-1614、C-1615、A-1672、G-1708(其中任何核苷酸可能改变或不改变相关密码子的编码氨基酸)。NA基因可包含核苷酸A-743，它不改变相关密码子的编码氨基酸。
有用的是，本发明4-价混合物中包括来自三种不同甲型流感病毒血凝素亚型(例如，H1、H3、H5)，但少于三种不同的甲型流感病毒神经氨酸酶亚型(例如两种：N1和N2)的抗原。这种安排来自使用多种共有某神经氨酸酶亚型的甲型流感病毒株，如H1N1和H5N1。该共有的N亚型能够增强交叉保护[70]。
药物组合物
本发明药盒可用于临用前制备免疫原性药物组合物(例如，疫苗)。除流感抗原外，这类组合物通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献71。在许多实施方式中，也可包含佐剂。
在给药时，本发明组合物通常是水性形式。
组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。疫苗优选应基本不含(如＜10μg/ml)含汞物质，如硫柳汞[14，72]。更优选无汞的疫苗。特别优选无防腐剂的疫苗，可包含琥珀酸α-生育酚以替代含汞化合物[14]。在一些实施方式中，当药盒中的多于一个容器中装有抗原时，这些容器各自包含防腐剂，但是在其它实施方式中，仅有一个含有抗原的容器包含防腐剂。当佐剂与抗原储存于不同的容器时，佐剂最好不含汞。然而混合后，防腐剂的来源通常不明确。
为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和/或氯化镁等。当佐剂和抗原存储于不同的容器时，两个容器中均可含有氯化钠。
组合物的渗透压可以为200mθsm/kg-400mθsm/kg，优选为240-360mθsm/kg，也可以在290-310mθsm/kg的范围内。
组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化铝佐剂联用时)；或柠檬酸缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。当佐剂和抗原存储于不同的容器时，两种容器中均可含有缓冲液。
组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。
该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有＜1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量＜0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。
本发明组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为′吐温′)、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(′CTAB′)或脱氧胆酸钠，特别用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中辛苯聚糖-10和聚山梨醇酯80各自的含量可以小于1mg/ml。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。当佐剂与抗原存储于不同的容器时，含有抗原的容器常常包含去污剂(例如，包含抗原与聚山梨酯80和辛苯聚醇10)。
该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即多剂量药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或除此之外)，该组合物可包含在装有用于取出物质的无菌接头的容器中。
流感疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。在本发明的一些实施方式中，可以更高剂量给予组合物，例如，约1ml，例如混合两个0.5ml的体积后。
组合物和药盒优选储存于2-8℃。不应冷冻。理想地，应避光保存。
佐剂
在使用时，本发明组合物宜包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受该组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。水包油乳液佐剂(尤其是含有鲨烯的佐剂)的存在被证明可增强季节性[73]和大流行[74，75]流感疫苗的免疫应答毒株交叉反应性。
乳液佐剂可包含在3-价季节性药盒组分中、1-价大流行药盒组分中，或作为单独的药盒组分。
本发明所用的水包油乳液通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳液。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。
本发明可使用的油诸如动物油(如鱼油)或植物油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的代表例子。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用来自其它谷类，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草(teff)、黑小麦(triticale)等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯(不是种籽油中天然产生的)。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它方法的步骤是本领域众所周知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的代表例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。也可采用鲨烯的饱和类似物鲨烷。鱼油，包括鲨烯和鲨烷，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。优选鲨烯。
其他有用的油是生育酚，它宜包含在针对老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用[76]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液[77]。存在各种生育酚(α、β、γ、δ、ε或ξ)，但通常使用α-生育酚。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚。已知琥珀酸α-生育酚与流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐剂[14]。
可使用油的混合物，例如，鲨烯和α-生育酚的混合物。油含量通常为2-20％(体积)。
可通过′HLB′(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽(Brij)表面活性剂)，如三甘醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。用于乳液的最优选的表面活性剂是聚山梨酯80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯；吐温80)。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂的用量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。
优选含鲨烯的水包油乳液，特别是含有聚山梨酯80的那些乳液。本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·鲨烯、聚山梨酯80和去水山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5％鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[78-80]，参考文献81的第10章和参考文献82的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·鲨烯、生育酚和聚山梨酯80的亚微米乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过下述方法制备一种这样的乳液：将吐温80溶解于PBS得到2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(‘3d-MPL’)。此种类型的另一种有用乳液可包含(每个人用剂量)0.5-10mg鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[83]。
·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。该乳液可含有磷酸盐缓冲液。
含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL。水相可含有磷酸盐缓冲液。
鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(″普流罗尼克TM L121″)的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽的递送载体，已与苏氨酰-MDP一起使用，例如″SAF-I″佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烯、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[84]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如″AF″佐剂(5％鲨烯、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)[85]。优选微流体化。
·含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳剂优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[86]。该乳剂也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)。该乳液可包含TLR4激动剂[87]。这类乳液可以被冻干。
·角鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[88]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％鲨烯、4％泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献89述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
·不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，参见参考文献90、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N，N-二-十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
·皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[91]。
·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[92]。
·包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[92]。
不管是以独立形式存在还是已经与至少一种抗原混合，乳液可在递送时即时与包含抗原的独立组分混合。这两种组分是液体时，混合两种液体的体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。
抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，很少(如果有)血凝素会进入该乳液的油相。
药盒组分的包装
适用于本发明药盒组分的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)等。这些容器应无菌。可将容器包装在一起成为药盒，如装在同一个盒子里。
组分装在药瓶中时，药瓶可由玻璃或塑料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。药瓶可包括单一剂量的疫苗，或者可以包括一个以上剂量(′多剂量′药瓶)，如10个剂量。有用的药瓶由无色玻璃制成。与钠钙玻璃相比，更优选硼硅酸盐玻璃。药瓶可具有由丁基橡胶制成的瓶塞。
药瓶可以有适合的帽(如Luer锁)，以便将注射器插入该帽。该瓶帽可以位于密封层或覆盖物内侧，以便在去除密封层或覆盖物后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶装有瓶帽，以便无菌地取出其内含物。
某组分包装到注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。注射器的活塞可带有抑止装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽可由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，那么针头优选装有丁基橡胶护罩。有用的注射器是以商品名″Tip-Lok″TM销售的注射器。
容器可标注有半剂量体积，以利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。
可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个盒子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。
通常多组分产品包含多于病人给药所需的材料，以便在材料传送中出现损失时，仍可以得到完全的最终剂量体积。因此独立的容器可包含过度灌装的材料，例如超过5-20％体积的材料。
治疗方法和疫苗的给药
混合后，本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供了一种在患者中产生免疫应答的方法，包括将混合的本发明组合物给予患者的步骤。
本发明也提供一种在患者中产生免疫应答的方法，包括混合本发明药盒中容器(或注射器室)内容物和将混合的内容物给予患者的步骤。
本发明也提供用作药物的本发明药盒。
本发明还提供A和B在制备在病人中产生免疫应答的药物中的应用，其中A是第一容器的内容物，B是第二容器的内容物，如上所述。所述应用还可包含使用C，其中C是第三容器的内容物，如上所述。
这些方法和应用通常用于产生抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法是本领域众所周知的。人类研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价对同源病毒感染产生约50％保护作用)[93]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。
可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[94-96]、口服[97]、口颊、舌下、皮内[98，99]、经皮、透皮[100]给药等。
可利用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选患者是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院患者、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而该疫苗不只适用于这些人群，可以在更广泛的人群中使用。
本发明优选组合物的功效满足CHMP标准的1、2或3。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(＞60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。
可以通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如初免采用胃肠道外途径而加强免疫采用粘膜途径，或者初免采用粘膜途径而加强免疫采用胃肠道外途径等。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于包含新HA亚型的疫苗。一般以至少1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约12周、约16周等)的间隔给予多个剂量。
在一个典型的免疫计划中，在给予本发明的组合物(包含至少4种流感毒株，包括A-H3、A-H1、A-H5和B)之前，分别给予病人至少一次三价季节性流感疫苗(包括A-H3、A-H1和B抗原)，以及至少一次大流行流感疫苗(通常是单价A-H5疫苗)。可使用该4-价疫苗对这两种免疫应答进行加强。因此病人可能已经具有可分化为抗体分泌型浆细胞的记忆B细胞，所述抗体对抗A-H3、A-H1、B和A-H5血凝素中的每一种。通常至少预先给予A-H5疫苗两次。
本发明提供了一种在病人中产生对抗4种流感病毒株(H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、大流行流感病毒如H5N1甲型流感病毒株和乙型流感病毒株)的免疫应答的方法，包括以下步骤：(i)给予第一种流感病毒疫苗，包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原；(ii)给予第二种流感病毒疫苗，包含来自大流行流感病毒，如H5N1甲型流感病毒的抗原；和(iii)给予第三种流感病毒疫苗，包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、大流行流感病毒和乙型流感病毒的抗原，其中步骤(i)和(ii)可(a)同时或(b)以任一顺序进行，但在步骤(iii)之前。本发明还提供用于本方法的第一疫苗和第二疫苗。第一疫苗通常为3-价，第二疫苗为1-价，第三疫苗为4-价。
本发明还提供一种在病人中产生(如加强)免疫应答的方法，包括给予病人流感病毒疫苗，所述疫苗包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、大流行流感病毒(例如H5甲型流感病毒，如H5N1)和乙型流感病毒的抗原，其中病人以前分别接受过(a)包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，3-价)，以及(b)包含来自大流行流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，1-价)。
本发明还提供一种在病人中产生(如加强)免疫应答的方法，包括给予病人流感病毒疫苗，所述疫苗包含来自H1N1甲型流感病毒，H3N2甲型流感病毒，大流行流感病毒(例如H5甲型流感病毒，如H5N1)和乙型流感病毒的抗原，之后分别给予病人(a)包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，3-价)，以及(b)包含来自大流行流感病毒的抗原的流感病毒疫苗(例如，1-价)。
可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时(在健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一用药咨询或访问期间)给予患者，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给药。
相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员进行的同一用药咨询或访问期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸的乙酯和磷酸盐(1∶1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLUTM)。
第一和第二容器的具体实施方式
在一些实施方式中，所述第一容器(或注射器室)包括含有来自甲型流感病毒H1N1和H3N2毒株的抗原以及来自乙型流感病毒的抗原的3-价流感疫苗，并且所述第二容器(或注射器室)包括含有来自甲型流感病毒H5N1毒株，例如A/VietNam/1194/2004毒株(如NIBRG-14)或A/火鸡/Turkey/1/05毒株(如NIBRG-23)的抗原的1-价流感疫苗。在一个实施方式中，所述3-价疫苗是从鸡蛋或MDCK细胞培养的病毒中制备的纯化表面抗原疫苗，并且所述1-价疫苗也是从鸡蛋或MDCK细胞培养的病毒中制备的纯化表面抗原疫苗。所述3-价疫苗不含佐剂，但是所述1-价疫苗含有水包鲨烯乳液作为佐剂。所述3-价疫苗包含15μg HA/毒株，但所述1-价疫苗包含7.5μg HA。给予人时将3-价和1-价疫苗以1∶1体积比混合，例如得到1ml的给药体积。
所述1-价疫苗的制备如下：将0.25ml乳液(2x强度)与0.25ml散装抗原混合得到所需的最终浓度，例如与FLUADTM类似，但含有1/2抗原剂量的H5N1毒株。
在另一实施方式中，所述3-价疫苗是从鸡蛋培养的病毒中制备的灭活疫苗(通常是裂解疫苗)，并且所述1-价疫苗是从鸡蛋培养的病毒中制备的裂解疫苗。所述3-价疫苗不含佐剂，所述1-价疫苗含有佐剂，但是它们均与水包鲨烯乳液混合。所述3-价疫苗每一剂量包含15μg HA/毒株，但所述1-价疫苗每一剂量包含3.75μg HA。因此每一剂量的4-价混合产品包含H1N1、H3N2和乙型流感病毒HA各15μg 以及3.75μg H5N1病毒HA。所述1-价容器中的抗原浓度可以是15μg/ml。所述1-价疫苗可包含硫柳汞(例如，20μg/ml或10μg/ml)。所述乳液包含鲨烯、DL-α-生育酚和聚山梨酯80，质量比例分别为2.2∶2.45∶1，例如1068∶1186∶485。人用剂量由3-价和1-价疫苗和乳液混合得到，例如由0.5ml 3-价、0.25ml 1-价和0.25ml乳液混合得到。
给药方案
本发明还提供了4-价流感疫苗的给药方案，其中在6-18个月间分别给予病人两次4-价疫苗。所述4-价疫苗可如上所述即时制备，或者预混(例如，厂商以4-价混合疫苗进行发售)。
因此本发明提供了一种对人进行免疫的方法，包括以下步骤：(a)给予该人第一4-价流感疫苗；然后在180天至540天后(b)给予同一人第二4-价流感疫苗。
本发明还提供了通过该方法对人进行免疫的第一和第二4-价流感疫苗。
本发明还提供了第一和第二4-价流感疫苗在制备对人进行免疫的药物中的应用，其中第一和第二疫苗以180天至540天的间隔给予同一人。
本发明还提供第一4-价流感疫苗在制备对人进行预先免疫的药物的应用，其中在180天至540天后给予所述人第二4-价流感疫苗。
本发明还提供了第二4-价流感疫苗在制备对人进行免疫的药物的应用，其中在第一次给予疫苗前180天至540天给予所述人第一4-价流感疫苗。
第一4-价疫苗通常包括的免疫原来自：(i)H1N1甲型流感病毒株；(ii)H3N2甲型流感病毒株；(iii)H5N1甲型流感病毒株；和(iv)乙型流感病毒株。第二4-价疫苗通常包括的免疫原也来自：(i)H1N1甲型流感病毒株；(ii)H3N2甲型流感病毒株；(iii)H5N1甲型流感病毒株；和(iv)乙型流感病毒株。第一和第二疫苗可以相同，但是通常有至少一种毒株不同，例如，它们可包含来自不同A/H1N1毒株和/或不同A/H3N2毒株和/或不同A/H5N1毒株和/或不同B毒株的血凝素。因此在一些实施方式中，第一4-价疫苗和第二4-价疫苗中仅有一种血凝素相同。在一些实施方式中，第一4-价疫苗和第二4-价疫苗中仅有两种血凝素相同。在一些实施方式中，第一4-价疫苗和第二4-价疫苗中仅有三种血凝素相同。在比较不典型的实施方式中，第一4-价疫苗和第二4-价疫苗中四种血凝素都相同。
如果不包含来自H5N1甲型流感病毒的免疫原，第一和第二疫苗可包含来自另一种非-H1和非-H3甲型流感亚型的免疫原；例如来自H2、H5(但不是H5N1)、H7或H9甲型流感病毒，例如H5N3、H9N2、H2N2、H7N1或H7N7毒株的免疫原。
第一和第二4-价疫苗通常类型相同，即都是活病毒疫苗，都是全病毒颗粒疫苗，都是裂解病毒颗粒疫苗，都是纯化表面抗原疫苗，或者都是病毒体疫苗。通常第一和第二疫苗都是灭活的。
第一和第二4-价疫苗可以都包含佐剂。合适的佐剂如上所述。然而在一些实施方式中，仅第一疫苗含有佐剂。在比较不典型的实施方式中，两种疫苗都不含佐剂。
通常两种疫苗在连续流感季节进行给药，例如相距10-14个月，如相距11、12或13个月给药。
概述
术语“含有”包括“包含”以及“由…组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
术语″基本上″不排除″完全″，如″基本上不含″Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语″基本上″。
与数值x相关的术语“约”是任选的，其表示(例如)x±10％。
除非另有说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的方法不要求任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。
将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的情况下培养细胞。
当某化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可被合适的前药所替换。
当细胞底物用于重配或反向遗传学方法时，或用于培养病毒时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如Ph Eur总纲5.2.3所述的细胞底物。
附图简述
无附图。
具体实施方式
制备包含来自A/H1N1、A/H3N2和乙型流感毒株的纯化表面糖蛋白的季节性流感疫苗。抗原浓度为每毫升30μg HA/毒株，相当于15μg/毒株/剂量。
基于来自甲型流感病毒H5N1毒株(进化支1)的纯化表面糖蛋白制备前大流行疫苗。最终抗原浓度为15μg HA/ml，相当于7.5μg/剂量。将2x强度的散装抗原与MF59水包油乳液佐剂(2x强度)以1∶1体积比混合得到最终疫苗(1x强度)。
使用时将这两种疫苗各0.5ml混合，以组合形式给予病人，总体积为1ml。为了比较，其它病人在不同手臂上分别接受这两种疫苗。给予两组对照季节性疫苗或者前大流行疫苗。
将总共405个健康成人(年龄18-40岁)随机等分为8个治疗组(49-52个对象/组)。在第1天，三组在一只手臂接受前大流行疫苗，另一手臂同时接受季节性疫苗(′锥形′组)，另外三组接受前大流行疫苗和季节性疫苗的即时混合物和(′混合′组)。在第22天，来自′锥形′和′混合′组的对象仅接受前大流行疫苗、混合疫苗，或者不接受疫苗。两个交叉对照组在第1天接受前大流行或季节性疫苗，并在第22天换成接受另一疫苗。
在第1、22和43天，通过血凝反应(HI)、微量中和(MN)和单径向溶血(SRH)评价抗体。以用于评价季节性疫苗的CHMP标准(CPMP/BWP/214/96)对结果进行诠释。
除过去接受过流感疫苗的对象比例(总体平均：15％)外，研究组间的基线特征通常相似。在HI分析中，在接受季节性疫苗的7组中，在所有三种季节性毒株首次接种免疫后，均达到了用于评价疫苗免疫效果的所有三个CHMP标准。接受两次前大流行疫苗的4组中，在第二次疫苗接种后，H5N1毒株的SRH实验结果满足所有CHMP标准，而与共同给予季节性疫苗所用的方法无关。在MN H5N1实验中观察到的结果相当。
当与季节性流感疫苗组合给予时，含佐剂的H5N1前大流行疫苗具有免疫原性且耐受良好。单独、同时或者与前大流行疫苗混合给予季节性疫苗时，对季节性流感病毒株的免疫应答相似。
在单独的工作中，作为扩大研究的一部分，18-40岁间的99名健康成人在季节性疫苗(2007季节)给药前或者给药后3周接受一次前大流行疫苗的给药。1年后使用混有季节性疫苗(2008季节)的来自不同毒株(进化支2)的抗原给予加强H5N1剂量。在1、2和3周后通过HI、MN和SRH测量对抗两种H5毒株的抗体以评价交叉反应性，并评价血清转化(SC)和血清保护(≥40，SP)。
在单剂量初免后，接种3周后前大流行疫苗得到相似的对抗同源和异源病毒的SC(＞40％)和SP(＞40％)率。异源加强免疫在一周内明显产生回忆应答，表明在超过90％对象中产生免疫记忆，得到的SC和SP率与双剂量同源初免后观察到的相同。同源和异源毒株产生的SC和SP均达到并超过了CHMP标准。
因此，单次给予前大流行疫苗足以启动免疫记忆，持续至少一年。而且，异源加强免疫引起超过CHMP许可标准的回忆免疫应答。因此可将H5N1的异源毒株与季节性疫苗联用，在单次前大流行初免给药后1年进行加强免疫。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可以进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
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Claims (22)

1.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第一容器中H1N1、H3N2和乙型流感抗原各自的浓度范围是25-35μg/ml(血凝素)。
2.如权利要求1所述的药盒，其特征在于，所述第二容器中H5N1抗原的浓度范围是5-20μg/ml(血凝素)，例如范围是10-20μg/ml(血凝素)。
3.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第二容器中H5N1血凝素抗原的浓度范围是5-20μg/ml。
4.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第一和第二容器中水性疫苗的体积基本相同，各自范围是约0.4-0.6ml。
5.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述第一容器中水性疫苗的体积基本是所述第二容器中水性疫苗体积的两倍。
6.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述每种容器是硼硅玻璃小瓶。
7.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗，其特征是所述H5N1甲型流感病毒株属于进化支1、2或者4。
8.如权利要求7所述的药盒，其特征在于，所述H5N1甲型流感病毒株属于进化支2.1、2.2或2.3。
9.如权利要求1-8中任一项所述的药盒，其特征在于，所述第一容器不含佐剂，但是所述第二容器含有佐剂。
10.如权利要求1-8中任一项所述的药盒，其特征在于，所述第一和第二容器均不含佐剂，并且所述药盒包含含有水包油乳液佐剂的第三容器。
11.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、H5N1甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有水包油乳液佐剂。
12.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的冻干灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有含有来自H5N1甲型病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗。
13.如权利要求12所述的药盒，其特征在于，所述第二容器包含水包油乳液。
14.一种药盒，其包括：(i)第一容器，其中装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、H5N1甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的冻干灭活流感疫苗；和(ii)第二容器，其中装有水包油乳液佐剂。
15.一种含有多个分离室的注射器，其中：(i)第一室装有含有来自H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗；和(ii)第二室装有含有来自H5N1甲型病毒株的抗原的水性灭活流感疫苗。
16.如权利要求1-15中任一项所述的药盒或注射器，其特征在于，所述H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、乙型流感病毒株和H5N1甲型流感病毒株都是用鸡蛋培养的。
17.如权利要求1-15中任一项所述的药盒或注射器，其特征在于，所述H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、乙型流感病毒株和H5N1甲型流感病毒株都是用细胞培养物培养的。
18.如权利要求17所述的药盒或注射器，其特征在于，所述容器中不含禽类DNA、卵清蛋白和卵类粘蛋白。
19.如权利要求1-15中任一项所述的药盒或注射器，其特征在于，所述H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株和乙型流感病毒株用第一基材培养，H5N1甲型流感病毒株用第二基材培养，其中所述基材中一种是鸡蛋，另外一种是细胞培养物。
20.一种在病人中产生对抗4种流感病毒株(H1N1甲型流感病毒株、H3N2甲型流感病毒株、H5N1甲型流感病毒株和乙型流感病毒株)的免疫应答的方法，所述方法包括以下步骤：(i)给予第一种流感病毒疫苗，其包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原；(ii)给予第二种流感病毒疫苗，其包含来H5N1甲型流感病毒，如H5N1甲型流感病毒的抗原；和(iii)给予第三种流感病毒疫苗，其包含来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、H5N1甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原，其中步骤(i)和(ii)可(a)同时或(b)以任一顺序进行，但在步骤(iii)之前进行。
21.一种在病人中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予病人含有来自H1N 1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、H5N1甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗，其中所述病人以前分别接受过(a)含有来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的3-价流感病毒疫苗，以及(b)含有来自H5N1甲型流感病毒的抗原的单价流感病毒疫苗。
22.一种在病人中产生免疫应答的方法，所述方法包括给予病人含有来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒、H5N1甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的流感病毒疫苗，之后分别给予所述病人(a)含有来自H1N1甲型流感病毒、H3N2甲型流感病毒和乙型流感病毒的抗原的3-价流感病毒疫苗，以及(b)含有来自H5N1甲型流感病毒的抗原的单价流感病毒疫苗。
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