CN111718909A - 一种禽流感h9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，通过对病毒灭活工艺的优化，可以显著提高疫苗制剂的安全性，减少应激反应，提高免疫效果。

Description

一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法
技术领域
本发明属于动物疫苗领域，具体是涉及一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法。
背景技术
根据致病性不同， 禽流感可分为低致病性禽流感和高致病性禽流感。现高病性禽流感以H7N9亚型为代表，低致病性禽流感以H9N2亚型为代表。H9N2 亚型禽流感是我国禽类中传播速度快、流行范围广的禽流感；各种日龄的鸡都易感，临床严重程度有较大的差异，但造成经济损失都很大，产蛋鸡产蛋下降10%-60%或绝产，肉鸡和育雏或育成鸡死淘率在10%~80%不等；与大肠杆菌、禽传染性支气管炎、鸡传染性喉气管炎、新城疫、各种免疫抑制病原体协同感染， 尤其容易与大肠杆菌继发感染。
国内外的禽流感防治实践表明，疫苗免疫是防止禽流感爆发、避免造成巨大损失的主要措施。目前应用于禽流感的常规疫苗主要是全病毒灭活苗，全病毒灭活苗具有很多优点，其便于储备，当确定禽流感暴发的病毒亚型后，便可马上将储备的疫苗用于紧急预防接种。同时全病毒灭活苗还可制备成针对几种不同亚型病毒的多价疫苗，且亚型抗原之间不产生免疫干扰。全病毒灭活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫应答反应，并在以往发生禽流感的过程中，可控制疫情的进一步蔓延与扩散，减少经济损失。
病毒灭活疫苗的生产工艺一般分为病毒的扩增、灭活、纯化和/或裂解。国内的禽流感灭活疫苗的生产工艺中，灭活过程都是使用甲醛溶液作为灭活剂，其灭活能达到很好的效果，但是甲醛灭活不仅灭活了病毒也破坏了病原体的免疫原性，并且甲醛灭活时间比较长，易受温度、pH值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生应激性反应。所以需要寻找更加安全可靠的灭活剂进行病毒的灭活。本发明通过选择适合的灭活剂，对灭活条件进行优化，确定最佳的灭活工艺参数。
发明内容
本发明提供一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，采用本发明病毒灭活处理，可以显著提高疫苗制剂的安全性，减少应激反应，提高免疫效果。
本发明提供如下技术方案：
一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，包括以下步骤：
（1）病毒的接种和培养：选择制备疫苗用LMH细胞进行传代培养，待LMH细胞密度达1.0×106-1.5×106个/mL时接种禽流感病毒H9亚型，并加入细胞维持液进行繁殖培养；
（2）病毒收集、浓缩和纯化：将步骤（1）中细胞培养液进行冻融3次，于4℃、6000-8000rpm条件离心10-20min后，收集禽流感病毒H9亚型上清液，将上述上清液超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒毒液；
（3）病毒灭活：在负压生产区，根据病毒液的量分别加入终浓度为0.025%-0.1％的BPL（β-丙内酯），至于2-8℃恒温摇床中，分别灭活16-48ｈ后，终止反应，获得含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液。
（4）疫苗制备：将白油、吐温、硬脂酸铝混合制备油相，将步骤3中灭活后的禽流感病毒的溶液与油相按照体积比1:2混合乳化，制备得到禽流感H9亚型疫苗。
本发明所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法中，优选的，步骤（2）中离心速率7000rpm，离心时间15min。
本发明所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法中，优选的，步骤（3）中灭活温度2-4℃，灭活时间24-48h。更优选的，灭活温度4℃，灭活时间24h。
本发明所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法中，终止反应的方法包括：加BPL用量5％亚硫酸钠终止反应；或者并在37℃条件下水解2小时使丙内酯发生水解进而终止反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）BPL灭活疫苗诱导鸡产生抗体的能力要优于传统的甲醛灭活疫苗。（2）通过对灭活工艺条件的优化，筛选出最佳灭活工艺条件，灭活BPL浓度0.05％的BPL，灭活温度4℃，灭活时间24-48h。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1：灭活工艺条件优化
试验材料：H9N2亚型禽流感病毒
灭活方法：（1）病毒的接种和培养：选择制备疫苗用LMH细胞进行传代培养，待LMH细胞密度达1.0×106-1.5×106个/mL时接种禽流感病毒H9亚型，并加入细胞维持液进行繁殖培养；（2）病毒收集、浓缩和纯化：将步骤（1）中细胞培养液进行冻融3次，于4℃、7000rpm条件离心15min后，收集禽流感病毒H9亚型上清液，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒毒液；（3）病毒灭活：在负压生产区，根据病毒液的量分别加入终浓度为0.005%、0.015%、0.025%、0.05%、0.1％的BPL，至于4℃恒温摇床中，分别灭活2、4、8、16、24、48ｈ后，并在37℃条件下水解2小时使丙内酯发生水解，以便获得含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液。
测试方法：灭活后样品按照生产规程灭活检验要求接SPF鸡胚，孵育后72ｈ检测血凝价，并盲传一代，检测血凝价。
测试结果： 由表1可知，BPL的浓度和灭活时间会对禽流感病毒的灭活效果会产生影响；低浓度（0.005%、0.015%）时，灭活48h，不会对病毒的活性产生影响。 当BPL浓度≥0.025%，灭活24h，病毒能够完全灭活。特别是当BPL浓度≥0.05%时，灭活16h，病毒能够完全灭活。
表1 ：不同浓度BPL灭活禽流感病毒结果
Figure 957300DEST_PATH_IMAGE002
注：血凝检测结果为0，判定为“－”，病毒已完全灭活；血凝检测结果不为0，判定为“＋”，病毒未完全灭活。
不同灭活温度对灭活效果影响。
灭活方法：灭活方法同表1，调整灭活时间为24h，并改变灭活温度，具体调整如表2所示。
测试结果：由表2可知，灭活温度会对BPL灭活禽流感病毒结果产生影响；当BPL浓度为0.025%时，灭活温度优选2-4h；当BPL浓度为0.05%时，灭活温度优选2-6h。
表2：不同温度对BPL灭活禽流感病毒结果
Figure 121565DEST_PATH_IMAGE004
注：血凝检测结果为0，判定为“－”，病毒已完全灭活；血凝检测结果不为0，判定为“＋”，病毒未完全灭活。
实施例2：疫苗制备
疫苗制备：将白油94份、吐温6份、硬脂酸铝1.5份混合制备油相，将禽流感病毒的溶液与油相按照体积比1:2混合乳化，制备得到禽流感H9亚型疫苗。
表3：不同灭活工艺制备得到的疫苗
Figure 97611DEST_PATH_IMAGE006
实施例4：BPL灭活疫苗安全性检验
测试方法：60羽SPF鸡随机分为6组，每组10羽，其中1-5组用５批BPL灭活疫苗安全性评价，每羽鸡胸部肌肉注射2.5mL。6组空白对照组，不接种。
安全性试验结果：观察免疫14d后，各处理组鸡均健康，剖检观察疫苗吸收良好，未出现异常。
实施例5： BPL灭活疫苗效力试验
测试方法：360羽SPF鸡随机分为6组，每组60羽，1-4组分别用表3灭活疫苗1-4免疫接种，5组用甲醛灭活对照组疫苗的免疫接种，6组作为空白对照组，比较BPL灭活疫苗的免疫效果。每羽鸡胸部肌肉注射0.5mL，免疫后14ｄ、21ｄ逐羽采血分离血清，进行抗体检测。
测试结果：由表4可知，由BPL灭活的禽流感病毒制成灭活疫苗对免疫动物安全，并且能保持良好的免疫原性，21ｄ的免疫效价为8 log2左右，同比的甲醛灭活疫苗免疫效价只有７log2左右，说明BPL灭活疫苗诱导鸡产生抗体的能力要优于甲醛灭活疫苗。此外，通过对比疫苗1-4免疫效果发现，疫苗2的免疫效果最佳，可见灭活的工艺体检会对疫苗的免疫效果产生显著影响；具体的机理有待进一步研究。
表4 免疫效果测试
Figure 467675DEST_PATH_IMAGE008
凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。所有配方中百分比均为重量百分比。本发明组合物各制剂的加工工艺均为现有技术，根据不同情况可以有所变化。

Claims (7)

1.一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）病毒的接种和培养：选择制备疫苗用LMH细胞进行传代培养，待LMH细胞密度达1.0×106-1.5×106个/mL时分别接种禽流感病毒H9亚型，并加入细胞维持液进行繁殖培养；
（2）病毒收集、浓缩和纯化：将步骤（1）中细胞培养液进行冻融3次，于4℃、6000-8000rpm条件离心10-20min后，收集禽流感病毒H9亚型上清液，将上述上清液超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型病毒毒液；
（3）病毒灭活：在负压生产区，根据病毒液的量加入终浓度为0.025%-0.1％的BPL（β-丙内酯），至于2-8℃恒温摇床中，灭活16-48h后，终止反应，获得含有灭活H9亚型禽流感病毒的溶液；
（4）疫苗制备：将白油、吐温、硬脂酸铝混合制备油相，将步骤（3）中灭活后的禽流感病毒的溶液与油相按照体积比1:2混合乳化，制备得到禽流感H9亚型疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（2）中离心速率为离心速率7000rpm，离心时间15min。
3.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（3）中灭活温度2-4℃，灭活时间24-48h。
4.根据权利要求3所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（3）中灭活温度4℃，灭活时间24h。
5.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，其特征在于：步骤（3）中，病毒液的量加入终浓度为0.05％的BPL，至于4℃恒温摇床中，灭活24h。
6.根据权利要求1所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法，其特征在于：终止反应的方法包括：在37℃条件下水解2小时使丙内酯发生水解进而终止反应。
7.权利要求1-6任一项所述的一种禽流感H9亚型疫苗生产中的灭活病毒的方法制备获得的疫苗制剂。
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