CN107320721B - 一种疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种疫苗组合物及其制备方法。本发明疫苗组合物含有包括禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原以及佐剂；本发明疫苗组合物对禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤2型和禽白血病J型病毒均具有良好的免疫效果。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种疫苗组合物及其制备方法。
背景技术
H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要临床表现仅为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。更重要的是，该亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，也有机会在人类大流行，给人类健康带来了严重的威胁。目前H9N2亚型是我国鸡群中存在的AIV主要亚型，占禽流感总发病率的90％以上。各种防控措施中，疫苗免疫为最重要的措施。目前，虽然H9亚型禽流感灭活疫苗已广泛应用，该病也得到了有效控制，但是近几年来H9亚型禽流感在免疫鸡群中时有发生。为此，通过高适应载体表达高质量的有效抗原同时减少原有的生产成本达到针对同源/非同源H9亚型AIV流行株提供免疫保护的疫苗尤为必要。
我国的禽流感H9亚型主要是通过鸡胚尿囊腔接种流感病毒而获得，该生产体系具有一些缺陷，如大流行时疫苗的供给量往往受到SPF鸡胚数量的限制；有些毒株无法在鸡胚中复制，因此难以获得足够量的病毒，只有鸡胚适应株才能获得高产量病毒；受体结合特异位点的变异导致抗原性降低；疫苗生产下游技术一成不变且十分繁重、易于污染等等。利用动物传代细胞生产禽流感疫苗，能够在短期内大量增殖病毒，且无外源因子污染，能较好的维持病毒抗原稳定，弥补传统鸡胚生产体系的诸多不足。
国内外现在采用的动物传代细胞培养禽流感病毒主要是MDCK细胞，且在培养过程中需要添加一定量的胰蛋白酶，这对大规模生产带来一些繁琐，而采用本专利所述的动物传代细胞LMH细胞在培养流感病毒时无需添加胰蛋白酶，且培养出的流感病毒血凝价和免疫原性明显好于MDCK细胞培养的。
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，临床上常常出现包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20-40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。
禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。
禽呼肠孤病毒在全球的感染十分普遍，病毒可感染鸡、火鸡及其他禽类。病毒性关节炎主要发生于肉鸡，也可发生于蛋鸡和火鸡。病毒的易感性与年龄有关，日龄越大易感性越低，1日龄雏鸡最易感，16周龄以后显著降低。传播途径分为垂直传播与水平传播两种方式，其中垂直传播的几率比较低，不同毒株的水平传播能力差异较大，病毒可长期存在于盲肠扁桃体和跗跖关节内，因此带毒鸡是潜在的接触感染源。
目前，禽白血病已经呈世界性分布,欧洲、亚洲、非洲、南美洲、北美洲的一些国家和地区均有禽白血病的发生,如荷兰、瑞士、德国、法国、捷克、英国、美国、朝鲜、韩国、日本、澳大利亚、马来西亚、哥斯达黎加、以色列、伊朗等很多国家和地区报道了禽白血病的发生，严重危害了这些国家的养鸡业的发展。
自禽白血病被报道以来，世界各国的禽白血病疫情此起彼伏，给世界养禽业造成了巨大的损失。到目前为止，还没有有效的治疗药物，也没有可以用于预防的疫苗，防制禽白血病难度很大。因此，国内外涉及到养禽的相关部门、企业与人员对禽白血病高度重视。在国外，一些大型肉用型种鸡公司已在过去几十年中花巨资对种鸡群的ALV感染开展了系统的净化工作，已把ALV的感染率降低到了非常低的程度。到20世纪的80年代，西方各主要养禽国家已经将经典的外源性ALV(ALV-A和ALV-B)从鸡群中基本消除。1987年以后世界上发达国家的大型种鸡公司就宣布将外源性ALV净化了。但在中国，不同类型鸡群如何实施净化，还没有成熟经验。我国政府有关部门已经着手制定禽白血病的检测技术、净化措施等方面的示范与相关标准的研究。由于禽白血病病毒的特殊性质，导致净化此病方面遇到极大的挑战。因此开发一种高效的疫苗是防治和净化该病的重要武器。
目前禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型主要还是通过SPF鸡胚载体进行病毒增殖，病毒滴度不高且用SPF鸡胚载体大规模生产其生产成本非常昂贵；目前国内还没有用传代细胞源细胞进行该病毒增殖，进而用其生产灭活疫苗。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种疫苗组合物及其制备方法。本发明疫苗组合物包括禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原以及佐剂，对禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤2型和禽白血病J型病毒均具有良好的免疫效果。
本发明通过以下技术方案实现：
一种疫苗组合物，所述禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原以及佐剂。
优选地，所述禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原均为灭活全病毒抗原。
所述疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.细胞制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5～10％v/v新生牛血清和1.0～1.2％v/v双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤2型病毒接种；将DF-1细胞用胰酶消化分散，用含5～10％v/v新生牛血清和0.8～1.0％v/v双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽白血病病毒J型接种；
S2.病毒的接种和培养：分别将禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤S1制备的LMH细胞；将禽白血病病毒J型毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤S1制备的DF-1细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，再用细胞维持液于37℃、5％CO2培养120小时，得细胞培养液；
S3.病毒收集、浓缩和纯化：将步骤S2得到的病变的细胞培养液冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型病毒液；
S4.病毒灭活：采用0.05％～0.2％福尔马林灭活上述步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型制苗病毒液，即为疫苗抗原；
S5.疫苗组合物的配制，即得。
优选地，所述步骤S2中细胞维持液包含DMEM/F12培养液93～95％，新生牛血清2～4％，右旋糖苷0.5％～2％，甘油1～2％和双抗0.8～1.0％。
优选地，所述步骤S5疫苗组合物的配制方法，包括以下步骤：
I.油相制备：按以下重量份称取各物质：优质注射用白油90～92份，卵磷脂1～5份，硬脂酸铝1～3份，司班-802～6份；先将白油缓慢加温至75～85℃，待完全溶解后依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸铝，搅拌至均匀；
II.水相制备：将灭活后的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型按体积比1:1:1:1混合均匀得抗原混合液，向抗原混合液中加入灭菌后的吐温-80、巴戟天多糖和丙氨酸，搅拌至均匀；各24份加入灭菌后的吐温-804份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
III.乳化：按油相:水相＝2:1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为10000～15000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.2～0.8mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500～17500rpm乳化3～7min，即得。
优选地，所述油相中各物质及其重量份为：优质注射用白油91份，卵磷脂3份，硬脂酸铝2份，司班-804份。
优选地，所述水相中各物质重量份为：抗原混合液85～90份、吐温2～6份、巴戟天多糖3～7份和丙氨酸1～5份。
优选地，所述水相中各物质重量份为：抗原混合液88份、吐温-804份、巴戟天多糖5份和丙氨酸3份。
与现有技术相比，本发明疫苗组合物具有以下技术优点：
(1)本发明疫苗组合物含有禽流感四联灭活疫苗，对禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤2型和禽白血病J型病毒均具有良好的免疫效果。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1一种疫苗组合物
所述疫苗组合物，由禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原以及佐剂组成。
实施例2一种疫苗组合物的制备方法
所述疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.细胞制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和1.0％v/v双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤2型病毒接种；将DF-1细胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和1.0％v/v双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽白血病病毒J型接种；
S2.病毒的接种和培养：分别将禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型毒种按终体积1:120接种到步骤S1制备的LMH细胞、将禽白血病病毒J型毒种按终体积1:150接种到步骤S1制备的DF-1细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，再用细胞维持液于37℃、5％CO2培养120小时，得细胞培养液；所述步骤S2中细胞维持液包含DMEM/F12培养液94％，新生牛血清2％，右旋糖苷1.5％，甘油1.6％和双抗0.9％；
S3.病毒收集、浓缩和纯化：将步骤S2得到的病变的细胞培养液冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型病毒液；
S4.病毒灭活：采用0.15％福尔马林灭活上述步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型制苗病毒液，即为疫苗抗原；
S5.疫苗组合物的配制，即得；所述疫苗组合物的配制方法，包括以下步骤：
I.油相制备：按以下重量份称取各物质：优质注射用白油91份，卵磷脂3份，硬脂酸铝2份，司班-804份；先将白油缓慢加温至80℃，待完全溶解后依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸铝，搅拌至均匀；
II.水相制备：将灭活后的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型按体积比1:1:1:1混合均匀得抗原混合液，向抗原混合液中加入灭菌后的吐温-80、巴戟天多糖和丙氨酸，搅拌至均匀；所述水相中各物质重量份为：抗原混合液88份、吐温-804份、巴戟天多糖5份和丙氨酸3份。
III.乳化：按油相:水相＝2:1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为13000rpm，温度10℃的情况下，将水相以0.6mL/s的速度加入油相中，再继续以速度16000rpm乳化5min，即得。
实施例3一种疫苗组合物的制备方法
所述疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.细胞制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5％v/v新生牛血清和1.0％v/v双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤2型病毒接种；将DF-1细胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和0.8％v/v双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽白血病病毒J型接种；
S2.病毒的接种和培养：分别将禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型毒种按终体积1:50接种到步骤S1制备的LMH细胞、将禽白血病病毒J型毒种按终体积1:50接种到步骤S1制备的DF-1细胞，并在37℃吸附60分钟后吸弃病毒液，再用细胞维持液于37℃、5％CO2培养120小时，得细胞培养液；所述细胞维持液包含DMEM/F12培养液93％，新生牛血清2％，右旋糖苷2％，甘油2％和双抗1.0％；
S3.病毒收集、浓缩和纯化：将步骤S2得到的病变的细胞培养液冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型病毒液；
S4.病毒灭活：采用0.2％福尔马林灭活上述步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型制苗病毒液，即为疫苗抗原。
S5.疫苗组合物的配制，即得；所述疫苗组合物的配制方法，包括以下步骤：
I.油相制备：按以下重量份称取各物质：优质注射用白油90份，卵磷脂5份，硬脂酸铝3份，司班-802份；先将白油缓慢加温至85℃，待完全溶解后依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸铝，搅拌至均匀；
II.水相制备：将灭活后的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型按体积比1:1:1:1混合均匀得抗原混合液，向抗原混合液中加入灭菌后的吐温-80、巴戟天多糖和丙氨酸，搅拌至均匀；所述水相中各物质重量份为：抗原混合液85份、吐温6份、巴戟天多糖7份和丙氨酸1份；
III.乳化：按油相:水相＝2:1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为10000rpm，温度10℃的情况下，将水相以0.2mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500rpm乳化3min，即得。
实施例4一种疫苗组合物的制备方法
所述疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.细胞制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和1.2％v/v双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤2型病毒接种；将DF-1细胞用胰酶消化分散，用含10％v/v新生牛血清和0.8％v/v双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽白血病病毒J型接种；
S2.病毒的接种和培养：分别将禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型毒种按终体积1:500接种到步骤S1制备的LMH细胞、将禽白血病病毒J型毒种按终体积1:500接种到步骤S1制备的DF-1细胞，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，再用细胞维持液于37℃、5％CO2培养120小时，得细胞培养液；所述细胞维持液包含DMEM/F12培养液95％，新生牛血清2％，右旋糖苷0.5％，甘油1.5％和双抗1.0％；
S3.病毒收集、浓缩和纯化：将步骤S2得到的病变的细胞培养液冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型病毒液；
S4.病毒灭活：采用0.2％福尔马林灭活上述步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型制苗病毒液，即为疫苗抗原；
S5.疫苗组合物的配制，即得；所述疫苗组合物的配制方法，包括以下步骤：
I.油相制备：按以下重量份称取各物质：优质注射用白油92份，卵磷脂1份，硬脂酸铝3份，司班-806份；先将白油缓慢加温至85℃，待完全溶解后依次加入卵磷脂、司班-80和硬脂酸铝，搅拌至均匀；
II.水相制备：将灭活后的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型按体积比1:1:1:1混合均匀得抗原混合液，向抗原混合液中加入灭菌后的吐温-80、巴戟天多糖和丙氨酸，搅拌至均匀；所述水相中各物质重量份为：抗原混合液90份、吐温2份、巴戟天多糖3份和丙氨酸1份；
III.乳化：按油相:水相＝2:1的体积比，现将油相倒入乳化罐，搅拌转速为10000rpm，温度10℃的情况下，将水相以0.2mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500rpm乳化3min，即得。
对比例1一种疫苗组合物的制备方法
所述疫苗组合物的制备方法，与实施例2的区别在于所述细胞维持液中不含右旋糖苷，甘油含量增加至4％，其他步骤均与实施例2类似。
对比例2一种疫苗组合物的制备方法
所述疫苗组合物的制备方法，与实施例2的区别在于所述油相中不含卵磷脂，其他步骤均与实施例2类似。
对比例3一种疫苗组合物的制备方法
所述疫苗组合物的制备方法，与实施例2的区别在于所述水相中不含巴戟天多糖，其他步骤均与实施例2类似。
试验例1疫苗组合物中的病毒含量测定
1、试验材料：实施例2、实施例3、实施例4和对比例1的步骤S3制备的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液。
2、试验方法：
分别检测实施例2、实施例3、实施例4和对比例1的步骤S3制备的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液的TCID50。
2.1、TCID50的检测方法：
分别将收集的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液分别用于超滤浓缩；将上述离心后的上清液分别用50K中空纤维柱将其浓缩后，取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-85个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加含1～2％新生牛血清、适量双抗和2mM谷氨酰胺的DMEM培养液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50；
2.2、EID50的检测方法
将收集的禽流感H9亚型细胞病毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液保存备用。将上述离心浓缩后的禽流感病毒H9亚型上清液用PBS按照10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5个稀释度经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1mL/胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，于37℃培养箱中培养观察7天，每天记录鸡胚死亡情况，如果有死亡鸡胚放入4℃冰箱保存，观察时间结束后利用Reed-Muench方法计算离心收获的上清液的EID50；
2.3、HA的检测方法：
按微量法在V型血凝试验微量板上进行，鸡红细胞浓度为1％(V/V)，反应总量均为0.050mL。
3.试验结果：试验结果如表1所示。
表1疫苗组合物中的病毒含量检测表
实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
禽流感病毒H9亚型(TCID<sub>50</sub>) 10<sup>8.9</sup> 10<sup>8.6</sup> 10<sup>8.8</sup> 10<sup>8.2</sup>
禽流感病毒H9亚型(EID<sub>50</sub>) 10<sup>8.8</sup> 10<sup>8.5</sup> 10<sup>8.6</sup> 10<sup>7.8</sup>
禽流感病毒H9亚型(HA) 2<sup>10.1</sup> 2<sup>9</sup> 2<sup>10</sup> 2<sup>8</sup>
禽腺病毒4型(TCID<sub>50</sub>) 10<sup>8.9</sup> 10<sup>8.6</sup> 10<sup>8.7</sup> 10<sup>7.6</sup>
禽呼肠孤病毒2型(TCID<sub>50</sub>) 10<sup>8.8</sup> 10<sup>8.6</sup> 10<sup>8.7</sup> 10<sup>8.0</sup>
禽白血病病毒J型(TCID<sub>50</sub>) 10<sup>9.0</sup> 10<sup>8.7</sup> 10<sup>8.8</sup> 10<sup>7.7</sup>
由表1可知，本发明制备得到的疫苗组合物中病毒含量高，禽流感病毒H9亚型≥108.6TCID50，禽流感病毒H9亚型≥108.5EID50，禽流感病毒H9亚型HA≥29，禽腺病毒4型≥108.6TCID50，禽呼肠孤病毒2型≥108.6TCID50，禽白血病病毒J型≥108.7TCID50，可以有效的提高禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型四联灭活疫苗的疫苗效果。说明本发明细胞维持液中添加右旋糖苷可以有效提高病毒的增殖，增加疫苗的病毒含量，提高疫苗的疫苗效果。
试验例2疫苗效力试验
取21日龄SPF鸡60只，分为六组，每组10只，分别相应注射实施例2、
实施例3、实施例4及对比例1～3制备得到的疫苗组合物，注射剂量为0.3mL/只。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，分别测定其禽流感病毒H9亚型HI抗体效价，如表2所示。
表2免疫后不同时间(天)禽流感病毒H9亚型抗体水平
Figure BDA0001346296470000111
由表2可知，本发明制备得到疫苗组合物能够免疫SPF鸡能产生高水平的抗禽流感病毒H9亚型的HI抗体，而且本发明实施例2～4疫苗组合物产生的抗禽流感病毒H9亚型的HI抗体效价均高于对比例1抗体效价，说明将右旋糖苷添加到细胞维持液中能够增强免疫效果；本发明实施例2～4疫苗组合物产生的抗禽流感病毒H9亚型的HI抗体效价均高于对比例2、3抗体效价，说明本发明添加的佐剂对免疫原具有保护作用，同时能够强化免疫功效。
免疫后35天测定禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型血清中和抗体效价，结果如表3所示。
表3禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型血清中和抗体
效价
Figure BDA0001346296470000112
Figure BDA0001346296470000121
由表3可知，本发明疫苗组合物免疫SPF鸡能产生高水平的禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型中和抗体，且抗体效价均高于对比例1～3，因此说明本发明疫苗组合物对禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型均具有良好的免疫效果。

Claims (5)

1.一种疫苗组合物，其特征在于，包括禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原以及佐剂；
所述疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.细胞制备：将LMH细胞用胰酶消化分散，用含5％～10％v/v新生牛血清和1.0％～1.2％v/v双抗的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤2型病毒接种；将DF-1细胞用胰酶消化分散，用含5～10％v/v新生牛血清和0.8％～1.0％v/v双抗的DMEM/F12培养液在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽白血病病毒J型接种；
S2.病毒的接种和培养：分别将禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型和禽呼肠孤病毒2型毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤S1制备的LMH细胞；将禽白血病病毒J型毒种按终体积1:50～1:500接种到步骤S1制备的DF-1细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，再用细胞维持液于37℃、5％CO2培养120小时，得细胞培养液；
S3.病毒收集、浓缩和纯化：将步骤S2得到的病变的细胞培养液冻融2～3次，于4℃、5000rpm的条件下离心8～12min，分别收集禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型上清液，接着进行TCID50和EID50检测，合格后，将上述上清液分别超滤浓缩，得禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型病毒液；
S4.病毒灭活：采用0.05～0.2％福尔马林灭活上述步骤S3得到的禽流感病毒H9亚型、禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型制苗病毒液，即为疫苗抗原；
S5.疫苗组合物配制，即得；
所述步骤S2中细胞维持液包含DMEM/F12培养液93～95％，新生牛血清2～4％，右旋糖苷0.5％～2％，甘油1～2％和双抗0.8～1.0％；
所述步骤S5疫苗的配制方法，包括以下步骤：
I.油相制备：按以下重量份称取各物质：优质注射用白油90～92份，卵磷脂1～5份，硬脂酸铝1～3份，司盘-80 2～6份；先将白油缓慢加温至75～85℃，待完全溶解后依次加入卵磷脂、司盘-80和硬脂酸铝，搅拌至均匀；
II.水相制备：将灭活后的禽流感病毒H9亚型抗原、灭活后禽腺病毒4型、禽呼肠孤病毒2型和禽白血病病毒J型按体积比1:1:1:1混合均匀得抗原混合液，向抗原混合液中加入灭菌后的吐温-80、巴戟天多糖和丙氨酸，搅拌至均匀；
III.乳化：按油相:水相＝2:1的体积比，先将油相倒入乳化罐，搅拌转速为10000～15000rpm，温度10～20℃的情况下，将水相以0.2～0.8mL/s的速度加入油相中，再继续以速度13500～17500rpm乳化3～7min，即得。
2.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述禽流感病毒H9亚型抗原、禽腺病毒4型抗原、禽呼肠孤2型病毒抗原和禽白血病J型抗原均为灭活全病毒抗原。
3.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述油相中各物质及其重量份为：优质注射用白油91份，卵磷脂3份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份。
4.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述水相中各物质重量份为：抗原混合液85～90份、吐温-80 2～6份、巴戟天多糖3～7份和丙氨酸1～5份。
5.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述水相中各物质重量份为：抗原混合液88份、吐温-80 4份、巴戟天多糖5份和丙氨酸3份。
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