CN102300990A - Tlr9的合成激动剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可用于调节Toll样受体(TLR)介导的免疫应答的合成的化学组合物。具体地,本发明涉及产生独特的细胞因子和趋化因子谱的Toll样受体9(TLR9)的激动剂。
Description
本申请要求2009年1月30日提交的美国临时专利申请No.61/148,527和2009年10月29日提交的美国临时专利申请No.61/280,065的优先权权益,通过提及而将其公开内容明确收入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及可用于调节Toll样受体(TLR)介导的免疫应答的合成的化学组合物。具体地,本发明涉及产生独特的细胞因子和趋化因子谱的Toll样受体9(TLR9)的激动剂。
相关领域的概述
Toll样受体(TLR)存在于免疫系统的许多细胞上,而且已经显示为牵涉先天性免疫应答(Hornung,V.等,(2002)J.Immunol.168:4531-4537)。在脊椎动物中,此家族由称作TLR1至TLR11的11种蛋白质组成,已知它们识别来自细菌、真菌、寄生物和病毒的病原体相关分子样式(Poltorak,a.等(1998)Science282:2085-2088;Underhill,D.M.等(1999)Nature 401:811-815;Hayashi,F.等(2001)Nature 410:1099-1103;Zhang,D.等(2004)Science 303:1522-1526;Meier,A.等(2003)Cell.Microbiol.5:561-570;Campos,M.A.等(2001)J.Immunol.167:416-423;Hoebe,K.等(2003)Nature 424:743-748;Lund,J.(2003)J.Exp.Med.198:513-520;Heil,F.等(2004)Science 303:1526-1529;Diebold,S.S.等(2004)Science 303:1529-1531;Hornung,V.等(2004)J.Immunol.173:5935-5943)。
TLR是脊椎动物识别和起始(mount)对外来分子的免疫应答的关键手段,而且还提供了将先天性和适应性免疫应答联系起来的手段(Akira,S.等(2001)Nature Immunol.2:675-680;Medzhitov,R.(2001)Nature Rev.Immunol.1:135-145)。一些TLR位于细胞表面上以检测胞外病原体并启动针对它们的应答;而其它TLR位于细胞内部以检测胞内病原体并启动针对它们的应答。
已知TLR9识别细菌DNA和合成的寡核苷酸中的未甲基化的CpG基序。(Hemmi,H.等(2000)Nature 408:740-745)。对含有CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修饰也可以影响它们经由TLR9充当免疫应答调节剂的能力(参见例如Zhao等,Biochem.Pharmacol.(1996)51:173-182;Zhao等(1996)BiochemPharmacol.52:1537-1544;Zhao等(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7:495-502;Zhao等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:3453-3458;Zhao等(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10:1051-1054;Yu,D.等(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10:2585-2588;Yu,D.等(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2263-2267;及Kandimalla,E.等(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813)。已经显示了TLR9的天然存在的激动剂产生抗肿瘤活性(例如肿瘤生长和血管发生),导致有效的抗癌症应答(例如抗白血病)(Smith,J.B.和Wickstrom,E.(1998)J.Natl.Cancer Inst.90:1146-1154)。另外,已经显示了TLR9激动剂与其它已知的抗肿瘤化合物(例如西妥昔单抗、伊立替康)协同起作用(Vincenzo,D.等(2006)Clin.Cancer Res.12(2):577-583)。
某些TLR9激动剂由含有核心CpR二核苷酸的3’-3’连接的DNA结构构成,其中R是经修饰的鸟苷(美国专利No.7,276,489)。另外,特定的化学修饰已经容许制备特定的寡核苷酸类似物,其产生免疫应答的独特调节。具体地,结构活性关系研究已经容许鉴定产生免疫应答的特定调节的合成的基序和新的基于DNA的化合物,而且这些调节与那些由未甲基化的CpG二核苷酸产生的调节不同。(Kandimalla,E.等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U S A102:6925-6930;Kandimalla,E.等(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.U S A100:14303-14308;Cong,Y.等(2003)Biochem Biophys Res.Commun.310:1133-1139;Kandimalla,E.等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.306:948-953;Kandimalla,E.等(2003)Nucleic Acids Res.31:2393-2400;Yu,D.等(2003)Bioorg.Med.Chem.11:459-464;Bhagat,L.等(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300:853-861;Yu,D.等(2002)NucleicAcids Res.30:4460-4469;Yu,D.等(2002)J.Med.Chem.45:4540-4548.Yu,D.等(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.297:83-90;Kandimalla.E.等(2002)Bioconjug.Chem.13:966-974;Yu,D.等(2002)Nucleic Acids Res.30:1613-1619;Yu,D.等(2001)Bioorg.Med.Chem.9:2803-2808;Yu,D.等(2001)Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2263-2267;Kandimalla,E.等(2001)Bioorg.Med.Chem.9:807-813;Yu,D.等(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10:2585-2588;及Putta,M.等(2006)Nucleic Acids Res.34:3231-3238)。
可以通过不同细胞因子和/或趋化因子谱来最佳地治疗不同疾病状态或状况。因而,本领域中需要新的寡核苷酸类似物化合物以提供此类“定制调节的(custom-tuned)”应答。具体地,本领域中需要具有特定且独特的化学修饰的TLR9激动剂,其提供独特的免疫应答活化谱。
发明概述
令人惊讶地,发明人已经发现了独特地修饰核心CpR二核苷酸侧翼的核酸序列、核苷酸间的联结(linkage)或连接寡核苷酸的接头产生TLR9的新型激动剂,其产生独特的体外和体内细胞因子和趋化因子谱。这种“定制调节”对含有CpR的寡核苷酸的细胞因子和趋化因子应答的能力以疾病特异性且甚至患者特异性方式提供预防和/或治疗多种疾病状况的能力。
如此,本发明提供了新的基于寡核苷酸的化合物等,所述化合物经由其作为激动剂与TLR9的相互作用来个别地提供独特的免疫应答谱。依照本发明的TLR9激动剂的特征在于特定且独特的化学修饰,该化学修饰提供其独特的免疫应答活化谱。
依照本发明的TLR9激动剂在多种细胞类型和多种体外和体内实验模型中诱导免疫应答,其中每种激动剂提供独特的免疫应答谱。依照本发明的TLR9激动剂单独地、与其它药物组合或共施用、或者作为用作疫苗的抗原的佐剂可用于预防和/或治疗多种疾病。它们作为研究免疫系统,及比较各种动物物种诸如人和小鼠的免疫系统的工具也是有用的。
如此,在第一个方面,本发明提供了TLR9的基于寡核苷酸的激动剂(“化合物”)。
在第二个方面,本发明提供了药物配制剂,其包含依照本发明的基于寡核苷酸的TLR9激动剂和药学可接受载体。
在第三个方面,本发明提供了疫苗。依照此方面的疫苗包含依照本发明的药物配制剂,而且进一步包含抗原。
在第四个方面,本发明提供了用于在受试者,特别是人中产生TLR9介导的免疫应答的方法,所述方法包括对所述受试者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。
在第五个方面,本发明提供了用于治疗性处理患有疾病或病症的患者的方法,所述方法包括对所述患者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。
在第六个方面,本发明提供了用于预防疾病或病症的方法,所述方法包括对有风险形成疾病或病症的患者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。
在第七个方面,本发明提供了一种用于使癌细胞对电离辐射敏感的方法。依照本发明的此方面的方法包括对患者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗,并用电离辐射治疗患者。
附图简述
图2A和2B描绘了表达TLR9的HEK293细胞中的NF-kB活性,所述表达TLR9的HEK293细胞依照下文实施例2来培养、处理并分析。简言之,用0(PBS/培养基)、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0μg/ml依照本发明的免疫调节性寡核苷酸刺激HEK293细胞达18小时,并使用SEAP(人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式)测定法来测定NF-κB水平。图2A和2B更一般地表明施用依照本发明的含有新的碱基、接头、和/或独特修饰的免疫调节性寡核苷酸产生独特的TLR9活化谱。
图3A和3B描绘了来自人PBMC的细胞因子和趋化因子浓度,所述人PBMC依照下文实施例3来分离、培养、处理并分析。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液分离PBMC,并将其与0(PBS)、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0μg/ml依照本发明的免疫调节性寡核苷酸一起培养24小时。收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。图3A和3B更概括地表明施用依照本发明的含有新的碱基、接头、和/或独特修饰的免疫调节性寡核苷酸产生独特的细胞因子和趋化因子谱。
图4A和4B描绘了来自人的类浆细胞树突细胞(pDC)的IFN-γ浓度,所述人的类浆细胞树突细胞(pDC)依照下文实施例3来分离、培养、处理并分析。简言之,自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离pDC,并将其与1μg/ml依照本发明的免疫调节性寡核苷酸一起培养24小时。收集上清液,并通过Luminex多重测定法来分析细胞因子和趋化因子水平。图4A和4B更一般地表明施用依照本发明的含有新的碱基、接头、和/或独特修饰的免疫调节性寡核苷酸产生独特的细胞因子和趋化因子谱。
图5A和5B描绘了由依照本发明的免疫调节性寡核苷酸诱导的人B细胞增殖。依照下文实施例4来分离、培养、处理并分析人B细胞。简言之,将自新鲜获得的健康人志愿者的PBMC分离的人B细胞与0、0.1、0.3、1.0、3.0、或10.0μg/ml依照本发明的免疫调节性寡核苷酸一起培养68小时,并用3H-胸苷脉冲6-8小时。使用液体闪烁计数器来测定3H-胸苷摄取。图5A和5B更概括地表明施用依照本发明的含有新的碱基、接头、和/或独特修饰的免疫调节性寡核苷酸产生独特的细胞增殖谱,其随碱基组成、独特的修饰、和所施用的寡核苷酸量而变化。
图6A和6B描绘了依照下文实施例5处理的C57BL/6小鼠中的血清IL-12诱导。简言之,给小鼠皮下注射1mg/kg剂量的依照本发明的免疫调节性寡核苷酸后2小时,收集血清,并通过Luminex多重测定法分析细胞因子和趋化因子水平。图6A和6B更概括地表明体内施用依照本发明的含有新的碱基、接头、和/或独特修饰的免疫调节性寡核苷酸产生独特的TLR9活化谱,其会在多种疾病中得到应用。
发明详述
本发明提供了新的基于寡核苷酸的化合物,该化合物经由其作为激动剂与TLR9的相互作用来个别地提供独特的免疫应答谱。依照本发明的TLR9激动剂的特征在于独特的化学修饰,该化学修饰提供其独特的免疫应答活化谱。
依照本发明的TLR9激动剂在多种细胞类型和多种体内和体外实验模型中诱导免疫应答,其中每种激动剂提供独特的免疫应答谱。因此,它们作为研究免疫系统,及比较各种动物物种诸如人和小鼠的免疫系统的工具是有用的。依照本发明的TLR9激动剂单独地、与其它药物组合或共施用、或者作为用作疫苗的抗原的佐剂也可用于预防和/或治疗多种疾病。
在连同附图阅读时,可以通过以下描述更完整地理解本发明的目的、其各种特征、及发明本身,其中下列术语具有所赋予的意义。
术语“2’-取代的核苷”或“2’-取代的阿拉伯糖苷”一般地包括如下的核苷或阿糖核苷(arabinonucleoside):其中戊糖或阿拉伯糖部分的2’位置处的羟基基团被取代而产生2’-取代的或2’-O-取代的核糖核苷。在某些实施方案中,此类取代是用含有1-6个饱和或不饱和碳原子的低级烃基基团的取代,用卤素原子的取代,或用具有6-10个碳原子的芳基的取代;其中此类烃基或芳基可以是未取代的或可以是取代的,例如用卤素、羟基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代。2’-O-取代的核糖核苷或2’-O-取代的阿拉伯糖苷的例子包括但不限于2’-氨基、2’-氟、2’-烯丙基、2’-O-烷基和2’-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷,2’-O-甲基核糖核苷或2’-O-甲基阿拉伯糖苷和2’-O-甲氧基乙氧基核糖核苷或2’-O-甲氧基乙氧基阿拉伯糖苷。
在方向上使用时,术语“3’”一般指多核苷酸或寡核苷酸中的某个区域或位置在同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的3’(朝向寡核苷酸的3’位置)。
在方向上使用时,术语“5’”一般指多核苷酸或寡核苷酸中的某个区域或位置在同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一区域或位置的5’(朝向寡核苷酸的5’位置)。
术语“约”一般意味着精确的数字不是至关重要的。如此,寡核苷酸中的核苷残基的数目不是至关重要的,而且少1或2个核苷残基或具有1个到几个额外核苷残基的寡核苷酸预期为上文所描述的每个实施方案的等同方案。
术语“气道炎症”一般包括但不限于由变应原引起的呼吸道炎症,包括哮喘。
术语“变应原”一般指暴露于受试者后引发变应性应答的抗原或分子(通常为蛋白质)的抗原性部分。通常,受试者对变应原是变应性的,如按照例如风团和潮红测试(wheal and flare test)或本领域已知的任何方法所表明的。即使仅有一小部分的受试者在暴露于分子后表现出变应性(例如IgE)免疫应答,也称该分子为变应原。
术语“变态反应”一般包括但不限于食物变态反应、呼吸系统变态反应和皮肤变态反应。
术语“抗原”一般指被抗体或T细胞或B细胞抗原受体识别和选择性结合,而且引发特异性免疫应答的物质。抗原可以包括但不限于肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸及其组合。抗原可以是天然的或合成的,而且一般诱导对所述抗原特异性的免疫应答。
术语“癌症”一般指,但不限于由异常的或不受控制的细胞增殖和/或分裂引起的任何恶性生长或肿瘤。癌症可以在人和/或动物中发生,而且可以发生在任何和所有组织中。用本发明治疗患有癌症的患者可以包括施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗以影响异常的或不受控制的细胞增殖和/或分裂。
术语“载体”一般涵盖任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含有脂质的囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知用于药物配制剂的其它材料。应当理解的是,载体、赋形剂、或稀释剂的特征会取决于用于特定应用的施用路径。含有这些材料的药学可接受配制剂的制备记载于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990。
术语“药学可接受的”或“生理学可接受的”一般指不干扰依照本发明的化合物的效率,且与生物学系统如细胞、细胞培养物、组织、或生物体相容的材料。优选地,生物学系统是活的生物体,诸如脊椎动物。
术语“共施用”或“共施用的”一般指在时间上足够接近地施用至少两种不同物质以调节免疫应答。在一些优选的实施方案中,共施用指同时施用至少两种不同物质。
术语“药学有效量”一般指足以影响期望的生物学效应,诸如有益的结果的量。如此,“药学有效量”会取决于其被施用的背景。药学有效量可以在一次或多次预防性或治疗性施用中施用。
术语“与...组合”一般指施用依照本发明的化合物和可用于治疗疾病或状况的另一种药剂。所述施用可以以任何次序完成,包括同时施用,以及相隔几秒至数天或相隔几小时至几天、或相隔几小时的时间上有间隔的次序。此类组合处理还可以包括施用依照本发明的化合物和/或独立地所述其它药剂超过一次。依照本发明的化合物和其它药剂的施用可以通过相同或不同路径进行。
术语“受试者”或“患者”一般指哺乳动物,诸如人。哺乳动物一般包括但不限于人、非人灵长类、大鼠、小鼠、猫、犬、马、牛、奶牛(cows)、猪、绵羊和兔。
术语“激酶抑制剂”一般指在细胞中拮抗或抑制磷酸化依赖性细胞信号传导和/或生长途径的分子。激酶抑制剂可以是天然存在的或合成的,而且包括具有要作为口服治疗剂施用的潜力的小分子。激酶抑制剂具有快速且特异性抑制靶标激酶分子的激活的能力。蛋白质激酶是有吸引力的药物靶物,这部分是因为它们调节极其多种信号传导和生长途径,而且包括许多不同蛋白质。因此,它们在治疗牵涉激酶信号传导的疾病,包括癌症、心血管疾病、炎性病症、糖尿病、黄斑变性和神经病学病症中具有极大的潜力。激酶抑制剂的例子包括但不限于盐酸埃罗替尼(erlotinib hydrochloride)吉非替尼(gefitinib)甲苯磺酸索拉非尼(sorafenib tosylate)苹果酸舒尼替尼(sunititnib malate)达沙替尼(dasatinib)(SprycelTM)、凡德他尼(vandetanib)(ZactimaTM)、拉帕替尼(lapatinib)(TykerbTM)、西罗莫司(temsirolimus)和甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)
术语“哺乳动物”明确意图包括温血的脊椎动物,包括但不限于人。
术语“经修饰的核苷”一般指包含经修饰的杂环碱基、经修饰的糖模块、或其任意组合的核苷。在一些实施方案中,经修饰的核苷是非天然的嘧啶或嘌呤核苷,如本文中所描述的。出于本发明的目的,术语“经修饰的核苷”、“嘧啶或嘌呤类似物”或“非天然存在的嘧啶或嘌呤”可互换使用,指包含非天然存在的碱基和/或非天然存在的糖模块的核苷。出于本发明的目的,若碱基不是鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶,则认为它是非天然的。
术语“调节”或“调节性”一般指变化,诸如应答升高或TLR9介导的应答的定性差异。
术语“接头”一般指可以经由糖、碱基、或主链通过共价或非共价键合而附接于寡核苷酸的任何模块。接头可以用于附接两个或更多个核苷或者可以被附接于寡核苷酸中的5’和/或3’端核苷酸。在本发明的某些实施方案中,此类接头可以是非核苷酸接头。
术语“非核苷酸接头”一般指可以通过共价或非共价键合而附接于寡核苷酸的与核苷酸联结不同的化学模块。优选地,此类非核苷酸接头长约2埃至约200埃,而且可以为顺式或反式取向。
术语“核苷酸联结”一般指在相邻核苷之间经由其糖连接两个核苷的化学联结(例如3’-3’、2’-3’、2’-5’、3’-5’),其由磷原子和带电荷或中性基团组成(例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或烃基膦酸酯)。
术语“基于寡核苷酸的化合物”指由多个连接起来的核苷单元形成的多聚核苷。核苷单元可以是病毒、细菌、细胞碎片、siRNA和微小RNA的一部分或者可以部分由病毒、细菌、细胞碎片、siRNA和微小RNA制成。所述寡核苷酸也可以从现有的核酸来源(包括基因组或cDNA)获得,但是优选是通过合成方法生成的。在优选的实施方案中,每个核苷单元包括杂环碱基和呋喃戊糖基、海藻糖、阿拉伯糖、2’-脱氧-2’-取代的核苷、2’-脱氧-2’-取代的阿拉伯糖、2’-O-取代的阿拉伯糖或己糖基团。核苷残基可以通过多种已知的核苷间联结之任一种而彼此偶联。所述核苷间联结包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烃基膦酸酯、烃基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、磷酸三酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硅氧烷、碳酸酯、烷氧羰基、氨基乙酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、吗啉代(morpholino)、硼代(borano)、硫醚、桥接氨基磷酸酯(bridged phosphoramidate)、桥接亚甲基膦酸酯、桥接硫代磷酸酯、和砜核苷间联结。术语“基于寡核苷酸的化合物”还涵盖具有一个或多个立体特异性的核苷间联结(例如(Rp)-或(Sp)-硫代磷酸酯、烃基膦酸酯、或磷酸三酯联结)的多核苷。如本文中所使用的,术语“寡核苷酸”和“二核苷酸”明确意图包括具有任何所述核苷间联结的多核苷和二核苷,无论所述连接是否包含磷酸根基团。在某些优选的实施方案中,这些核苷间联结可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯联结,或其组合。
术语“肽”一般指具有足以影响生物学应答(例如抗体生成或细胞因子活性)的长度和组成的氨基酸寡聚物,无论所述肽是否为半抗原。术语“肽”可以包括经修饰的氨基酸(无论是天然存在的还是非天然存在的),其中所述修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化、脂化(lipidization)和甲基化。
术语“TLR9激动剂”一般指能够增强、诱导或调节由TLR9介导的免疫刺激的基于寡核苷酸的化合物。
术语“治疗/处理”一般指意图获得有益的或期望的结果的方法,其可以包括减轻症状或延迟或改善疾病进展。
在第一个方面,本发明提供了TLR9的基于寡核苷酸的激动剂(“化合物”)。在下文表I中显示了依照本发明的某些TLR9激动剂。在此表中,除非在指明的情况中,基于寡核苷酸的TLR9激动剂均具有硫代磷酸酯(PS)联结。然而,本领域技术人员应当认可可以使用磷酸二酯(PO)联结,或PS和PO联结的混合。除非在指明的情况中,否则所有核苷酸均是脱氧核糖核苷酸。
表I
G1=7-脱氮-dG;G2=阿拉伯糖G;G=2’-O-甲基核糖核苷酸;o=磷酸二酯联结;X1=1,2,4-丁三醇接头;X3=2-羟甲基-1,3-丙二醇接头;m=顺,反-1,3,5-环已三醇接头;Z=1,3,5-戊三醇接头。
对来自表I的TLR9激动剂测试在表达TLR9的HEK293细胞中的免疫刺激活性,如实施例2中所描述的。图2中所显示的结果表明对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰会在施用后18小时改变其TLR9介导的NF-kB活化谱。更一般地,这些数据表明可以使用对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰来提高或降低NF-kB活性。
对来自表I的TLR9激动剂测试在针对IL-12、IL-6、IFN-α、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、和MCP-1的人PBMC测定法中的免疫刺激活性,如实施例3中所描述的。图3中所显示的结果表明对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰会在人PBMC中改变其TLR9介导的IL-12、IL-6、IFN-α、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、和/或MCP-1活化谱。更一般地,这些数据表明可以使用对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰来提高或降低IL-12、IL10、IL-8、IL-6、IFN-α、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、IL-1Rα、IL-2R和MCP-1活性。
对来自表I的TLR9激动剂测试在针对IL-12、IL-6、IFN-α、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、和TNFα的人pDC测定法中的免疫刺激活性,如实施例3中所描述的。图4中所显示的结果表明对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰会在人pDC中改变其TLR9介导的免疫活化谱。更一般地,这些数据表明可以使用对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰来提高或降低IL-12、IL-6、IFN-α、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、和TNFα活性。
对来自表I的TLR9激动剂测试在人B细胞增殖测定法中的免疫刺激活性,如实施例4中所描述的。图5中所显示的结果表明对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰会改变其TLR9介导的B细胞增殖活性,而且此活化谱可以是剂量依赖性的,这取决于化学修饰。更一般地,这些数据表明可以使用对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰来调节B细胞增殖。
对来自表I的TLR9激动剂测试在C57B1/6小鼠中的体内免疫刺激活性,如实施例5中所描述的。图6中所显示的结果表明对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰会在小鼠模型中改变其体内TLR9介导的免疫活化谱。更一般地,这些数据表明对3’-3’连接的寡核苷酸的特定的化学修饰可以改变体内细胞因子和/或趋化因子浓度,其在许多疾病中会得到应用。
如上文所描述的,在第一个方面,本发明提供了TLR9的基于寡核苷酸的合成的激动剂。基于对碱基、糖、联结或接头的某些化学修饰,TLR9的激动剂在与其它TLR9激动剂分子联合和/或成双(duplex)时可以拥有升高的稳定性,同时保留易接近的5’端。
在一些实施方案中,非核苷酸接头可以包括但不限于1,2,4-丁三醇、顺,反-1,3,5-环己三醇、1,3,5-戊三醇或2-羟甲基-1,3-丙二醇。
1,2,4-丁三醇
顺,反-1,3,5-环己三醇
1,3,5-戊三醇
2-羟甲基-1,3-丙二醇
在第二个方面,本发明提供了药物配制剂,其包含依照本发明的基于寡核苷酸的TLR9激动剂(“化合物”)和药学可接受载体。
活性化合物以足以向患者投递药学有效量而不在所治疗的患者中引起严重毒性效果的量包含在药学可接受载体或稀释剂中。可以基于要投递的母体化合物的重量,或者通过本领域技术人员已知的其它手段来计算药学可接受衍生物的有效剂量范围。若衍生物本身展现出活性,则可以如上文使用衍生物的重量,或者通过本领域技术人员已知的其它手段来评估有效剂量。
在第三个方面,本发明提供了疫苗。依照此方面的疫苗包含依照本发明的药物配制剂,而且进一步包含抗原。抗原是一种引发特异性免疫应答的分子。此类抗原包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质和复合物或其任意组合。任选地,任何此类抗原可以与免疫原性蛋白质或肽,诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)、霍乱毒素B亚基、或任何其它免疫原性载体蛋白连接。
依照本发明的疫苗可以进一步包含许多佐剂之任一种,包括但不限于弗氏完全佐剂、匙孔血蓝蛋白(KLH)、单磷酰基脂质A(MPL)、明矾、和皂苷,包括QS-21、咪喹莫特(imiquimod)、R848、TLR激动剂或其组合。
在第四个方面,本发明提供了用于在受试者中产生TLR9介导的免疫应答的方法,所述方法包括对所述受试者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。在一些实施方案中,受试者是人。在优选的实施方案中,对需要免疫刺激的受试者施用化合物、药物配制剂或疫苗。在某些优选的实施方案中,受试者是人。
在依照本发明此方面的方法中,施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗可以通过任何合适的路径,包括但不限于胃肠外、口服、肿瘤内、舌下、经皮、表面、鼻内、气雾剂、眼内、气管内、直肠内、粘膜、阴道、通过基因枪、皮肤贴片或以滴眼剂或漱口剂形式。化合物、药物配制剂或疫苗的施用可以使用已知规程以有效减少疾病的症状或替代标志物的剂量和时间段来实施。在系统施用时,优选地,以如下的剂量施用化合物、药物配制剂或疫苗,所述剂量足以保持血液水平为约0.0001微摩尔-约10微摩尔的依照本发明的化合物。对于局部施用,比这低得多的浓度可以是有效的,而且可以在没有严重毒性效果的情况中耐受高得多的浓度。优选地,依照本发明的化合物的总剂量范围为每天每名患者约0.001mg至每天每kg体重约200mg。可以期望以单一治疗事件对受试者同时或序贯施用治疗有效量的一种或多种本发明的治疗性组合物。
在某些优选的实施方案中,与另一种药剂共施用或联合施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗,所述另一种药剂包括但不限于化疗剂、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、siRNA分子、适体、核酶、靶向性治疗剂、激酶抑制剂、肽、蛋白质、基因疗法载体、用于增强免疫应答的特异性或强度的DNA疫苗和/或佐剂、放射性同位素、和电离辐射。
依照本发明此方面的方法可用于预防性或治疗性处理人或动物疾病。例如,所述方法可用于成年人及小儿科和兽医疫苗应用。所述方法还可用于免疫系统的模型研究。
在第五个方面,本发明提供了用于治疗性处理患有疾病或病症患者的方法,所述方法包括对该患者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。在多个实施方案中,要治疗的疾病或病症是癌症、传染病、气道炎症、炎性病症、变态反应、哮喘或由病原体或变应原引起的疾病。病原体包括例如细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒、和朊病毒。如本发明的第四个方面所描述的实施施用。
在第六个方面,本发明提供了用于预防疾病或病症的方法,所述方法包括对有风险形成疾病或病症的患者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。在多个实施方案中,要预防的疾病或病症是癌症、气道炎症、炎性病症、传染病、变态反应、哮喘或由病原体引起的疾病。病原体包括但不限于细菌、寄生物、真菌、病毒、类病毒、和朊病毒。如本发明的第四个方面所描述的实施施用。有风险形成疾病或病症的患者一般是已经或者将暴露于疾病或病症的一种或多种病因学媒介或成因条件和/或具有疾病或病症的遗传素因的患者。
在第七个方面,本发明提供了一种用于使癌细胞对电离辐射敏感的方法。依照本发明此方面的方法包括对患者施用与电离辐射组合的依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。在某些优选的实施方案中,以约1.56Gy/分钟施用电离辐射。在某些优选的实施方案中,一周两次或一周四次以约3Gy的辐射施用辐射疗法。在备选的实施方案中,在第一天(第0天)对患者施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗,并在此后2天(第2天)、此后4天(第4天)、和此后9天(第9天)以约3Gy的辐射施用辐射疗法。在某些实施方案中,用化合物、药物配制剂的预处理在y-照射前约2小时至约6小时。
在依照本发明的任何方法中,可以与可用于预防或治疗疾病或状况的任何其它药剂共施用或联合施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗,所述任何其它药剂不消除依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗的免疫刺激效果。在依照本发明的任何方法中,可用于预防或治疗疾病或状况的其它药剂包括但不限于疫苗、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、siRNA分子、适体、核酶、靶向性治疗剂、TLR激动剂、激酶抑制剂、肽、蛋白质、基因疗法载体、用于增强免疫应答的特异性或强度的DNA疫苗和/或佐剂、或共刺激分子诸如细胞因子、趋化因子、蛋白质配体、反式活化因子、肽和含有经修饰的氨基酸的肽。例如,在癌症的预防和/或治疗中,期望与化疗性化合物、单克隆抗体、放射性同位素、或电离辐射共施用或联合施用依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗。依照本发明的方法中使用的优选的化疗剂包括但不限于吉西他滨(gemcitabine)、氨甲蝶呤(methotrexate)、长春花新碱(vincristine)、阿霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、含非糖的氯乙基亚硝基脲类(chloroethylnitrosourea)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、多柔比星(doxorubicin)、达卡巴嗪(dacarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、弗拉吉林(fragyline)、葡甲胺GLA(Meglamine GLA)、戊柔比星(valrubicin)、亚硝脲氮芥(carmustaine)和聚苯丙生(poliferposan)、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索(Lometexol)、格拉默来(Glamolec)、CI-994、TNP-470、/托泊替康(Topotecan)、PKC412、伐司朴达(Valspodar)/PSC833、/米托蒽醌(Mitroxantrone)、苏拉明六钠盐(Metaret)/苏拉明(Suramin)、巴马司他(Batimastat)、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马米司他(Marmistat)、BB2516/马米司他(Marmistat)、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乳杆菌制剂DP 2202、FK 317、溶链菌制剂(Picibanil)/OK-432、AD32/戊柔比星(Valrubicin)、/锶衍生物、泰道(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、阿霉素脂质体(Evacet)/多柔比星脂质体(liposomaldoxorubicin)、优他散(Yewtaxan)/紫杉醇、/紫杉醇、希罗达(Xeload)/卡培他滨(Capecitabine)、氟铁龙(Furtulon)/去氧氟尿苷(Doxifluridine)、西克罗派(Cyclopax)/口服紫杉醇、口服紫杉烷(Taxoid)、SPU-077/顺铂(Cisplatin)、HMR 1275/夫拉平度(Flavopiridol)、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFTTM(替加氟(Tegafur)/尿嘧啶(Uracil))、/左旋咪唑(Levamisole)、恩尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增强剂、依立替康(Campto)/左旋咪唑(Levamisole)、/依立替康(Irinotecan)、图莫得(Tumodex)/雷利特塞(Ralitrexed)、/克拉屈滨(Cladribine)、Paxex/紫杉醇、/多柔比星脂质体、楷莱(Caelyx)/多柔比星脂质体、/氟达拉滨(Fludarabine)、表阿霉素(Pharmarubicin)/表柔比星(Epirubicin)、/阿糖胞苷(Cytarabine)、ZD1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺(Bis-Naphtalimide)、LU 103793/海兔毒素(Dolastain)、楷替/多柔比星脂质体、/吉西他滨(Gemcitabine)、ZD0473YM 116、碘接种(Iodine seeds)、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、/异环磷酰胺(Ifosfamide)、美司钠(Mesna)、/尼泊苷(Teniposide)、/碳铂(Carboplatin)、顺铂(Plantinol)/顺铂(cisplatin)、依托泊苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD9331、/多西紫杉醇(Docetaxel)、鸟嘌呤阿糖苷(guanine arabinoside)前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂诸如苯丙氨酸氮芥(melphelan)和环磷酰胺(cyclophosphamide)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、白消安(Busulfan)、碳铂(Carboplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorombucil)、盐酸阿糖胞苷(Cytarabine HCl)、更生霉素(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(Daunorubicin HCl)、磷雌氮芥(Estramustine phosphate sodium)、依托泊苷(Etoposide)(VP16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)(5-FU)、氟他胺(Flutamide)、羟基脲(羟基尿素)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide acetate)(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、盐酸双氯乙基甲胺(Mechlorethamine HCl)(氮芥)、巯嘌呤、美司钠(Mesna)、米托坦(Mitotane)(邻对滴滴滴(o.p’-DDD))、盐酸米托蒽醌(Mitoxantrone HCl)、奥曲肽(Octreotide)、普卡霉素(Plicamycin)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine HCl)、链佐星(Streptozocin)、枸橼酸他莫昔芬(Tamoxifen citrate)、硫代鸟嘌呤(Thioguanine)、塞替派(Thiotepa)、长春碱(Vinblastine sulfate)、安吖啶(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、红细胞生成素、六甲蜜胺(Hexamethylmelamine)(HMM)、白介素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG;丙酮双脒腙;MGBG)、喷司他丁(Pentostatin)(2’-脱氧考福霉素)、司莫司汀(Semustine)(甲基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VM-26)和硫酸长春地辛(Vindesine sulfate)。优选的单克隆抗体包括但不限于(Glaxo-Welcome)、(IDEC/Genentech/Hoffman la Roche)、(Wyeth)、(Millennium)、(IDEC and ScheringAG)、(Corixa/GSK)、(Imclone/BMS)、(Genentech)和(Genentech/Hoffman la Roche)。
或者,可用于预防或治疗疾病或状况的药剂可以包括编码抗原或变应原的DNA载体。在这些实施方案中,依照本发明的化合物、药物配制剂或疫苗可以不同地充当佐剂和/或产生直接的免疫调节效果。
本文中所引用的专利和出版物反映本领域中的知识水平,并且在此通过提及而将其完整收录。这些专利和出版物的教导与本说明书间的任何冲突应当有利于后者来解决。本领域技术人员仅使用常规的实验便应当认可,或者能够确认与本文中所描述的具体物质和方法的许多等同方案。
以下实施例例示了进行和实施本发明的例示性模式,但是并不想要限制本发明的范围,因为可以利用备选的方法来获得相似的结果。
实施例1:
含有免疫刺激性模块的基于寡核苷酸的化合物的合成
使用自动化DNA合成仪(OligoPilot II,AKTA,(Amersham)和/或Expedite8909(Applied Biosystem))遵循图1中所概述的平行合成规程按1μmol至0.1mM规模合成依照本发明的化学实体。
5’-DMT dA、dG、dC和T亚磷酰胺购自Proligo(Boulder,CO)。5’-DMT 7-脱氮-dG和araG亚磷酰胺获自Chemgenes(Wilmington,MA)。DiDMT-甘油接头固体支持物获自Chemgenes。1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖(ribofuranosyl))-2-氧-7-脱氮-8-甲基-嘌呤亚酰胺(amidite)获自Glen Research(Sterling,VA),2’-O-甲基核糖核苷亚酰胺获自Promega(Obispo,CA)。依照本发明的所有化合物均是硫代磷酸酯主链经修饰的。
通过31P和1H NMR谱来表征所有核苷亚磷酰胺。使用由提供商推荐的正常偶联循环来在特定位置处掺入经修饰的核苷。合成后,使用浓氢氧化铵来使化合物脱保护,并通过反相HPLC、脱三苯甲基化,再进行透析来纯化所述化合物。将呈钠盐形式的纯化的化合物在使用前冻干。通过CGE和MALDI-TOF MS来测试纯度。通过LAL测试来测定内毒素水平,内毒素水平低于1.0EU/mg。
实施例2:
细胞培养条件和试剂
将表达小鼠TLR9的HEK293或293XL细胞(Invivogen,San Diego,CA)在5%CO2培养箱中在250μL/孔补充有10%热灭活的FBS的DMEM中的48孔板中培养。在80%汇合时,在培养基中存在4μL/mL Lipofectamine(Invitrogen,Carlsbad,CA)的条件下用400ng/mL SEAP(人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式)报告质粒(pNifty2-Seap)(Invivogen)瞬时转染培养物。将质粒DNA和Lipofectamine分别在无血清的培养基中稀释,并于室温温育5分钟。温育后,将稀释的DNA和Lipofectamine混合,并将混合物于室温温育20分钟。在细胞培养板的每孔中加入含有100ng质粒DNA和1μL Lipofectamine的25μLDNA/Lipofectamine混合物的等分试样,并继续培养4小时。
来自表I的免疫调节性化合物在表达小鼠TLR9的HEK293细胞中的细胞
因子诱导
转染后,将培养基用新鲜的培养基替换,将来自表I的个别免疫调节性化合物以0、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0μg/ml的浓度添加至培养物,并继续培养18小时。在化合物处理结束时,使用SEAP(人胚胎碱性磷酸酶的分泌形式)测定法依照制造商的方案(Invivogen)来测定NF-κB的水平。简言之,从每个处理取出30μl培养物上清液,与对硝基苯磷酸底物一起温育,并通过读板仪以405nm测量所生成黄色(Putta MR等,Nucleic Acids Res.,2006,34:3231-8)。
实施例3:
来自表I的免疫调节性化合物在人PBMC、pDC、和小鼠脾细胞中的细胞因子
诱导
人PBMC分离
通过Ficoll密度梯度离心法(Histopaque-1077,Sigma)来分离来自新鲜抽取的健康志愿者血液(CRB Laboratories,Brighton,MA)的外周血单核细胞(PBMC)。
人pDC分离
使用BDCA4细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)依照制造商的说明书通过正向选择自新鲜获得的健康人志愿者的血液PBMC分离人的类浆细胞树突细胞(pDC)。
使用5x106个细胞/ml将人PBMC在48孔板中分配(plate)。使用1X106个细胞/ml将人pDC在96孔皿中分配。将来自表I的个别免疫调节性化合物在DPBS(pH 7.4;Mediatech)中溶解,以0、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0μg/ml的剂量添加至细胞培养物。然后,将细胞于37℃温育24小时,并收集上清液以进行Luminex多重或ELISA测定法。在某些实验中,通过三明治式ELISA来测量IFN-α、IL-6和/或IL-12的水平。需要的试剂(包括细胞因子抗体和标准品)购自PharMingen。
细胞因子Luminex多重
在某些实验中,通过Luminex多重测定法来测量培养物上清液中的IL-1Rα、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-γ、MIP-1α、MIP-β、MCP-1和IL-12p40p70水平,所述Luminex多重测定法在Luminex 100仪上使用Biosource人多重细胞因子测定试剂盒实施,并使用由Applied CytometrySystems(Sacramento,CA)供应的StarStation软件来分析数据。
人免疫细胞的活化。
自新鲜获得的健康人血液PBMC分离人的类浆细胞树突细胞(pDC),并与50μg/ml来自表I的个别免疫调节性化合物或对照一起培养24小时。用荧光偶联的单抗(CD123、CD80、CD86)对细胞染色,并在FC500MPL细胞计数器上收集数据。使用FlowJo软件来分析CD123+细胞上的CD80和CD86的均值荧光强度,并表示为相对于PBS对照的倍数变化。
自新鲜获得的健康人血液PBMC分离人髓样树突细胞(mDC),并与50μg/ml来自表I的个别免疫调节性化合物或对照一起培养24小时。用荧光偶联的单抗(CD11c、CD80、CD40)对细胞染色,并在FC500MPL细胞计数器上收集数据。使用FlowJo软件来分析CD11c+细胞上的CD80和CD40的均值荧光强度,并表示为相对于PBS对照的倍数变化。
实施例4:
在存在来自表I的免疫调节性化合物的情况中的人B细胞增殖
使用CD19细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)依照制造商的说明书通过正向选择自PBMC分离人B细胞。
用于测定法的培养基由补充有1.5mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需氨基酸、50μM 2-巯基乙醇、100IU/ml青霉素-链霉素混合物和10%热灭活的胎牛血清的RPMI 1640培养基组成。
在96孔平底板中用不同浓度的来自表I的个别免疫调节性化合物一式三份刺激每ml总共0.5X106个B细胞(即1X105/200μl/孔)达一段总共68小时的时间。68小时后,用每孔20μl RPMI 1640培养基(无血清)中的0.75μCi[3H]-胸苷(1Ci=37GBq;Perkin Elmer Life Sciences)对细胞脉冲,并在6-8小时后收获。然后,使用细胞收获仪来收获平板,并使用标准的液体闪烁技术来测定放射性掺入。在一些情况中,将相应的[3H]-T(cpm)转换成增殖指数,并照此报告。
实施例5:
用TLR9激动剂化合物处理的小鼠模型中的体内细胞因子分泌
C57BL/6小鼠(5-6周龄)获自Taconic Farms,Germantown,NY,并依照Idera Pharmaceutical的IACUC批准的动物方案来维持。以0.25或1.0mg/kg(单剂)给小鼠(n=3)皮下注射来自表I的个别的免疫调节性化合物。免疫调节性化合物施用后2小时通过眶后出血来收集血清,并通过三明治式ELISA或Luminex多重测定法来测定IL-12、IL-10、IL-6、IP-10、KC、MCP1、MIG、MIP-1α和TNF-α浓度。图6中显示了结果,并表明体内施用含有免疫调节性化合物的新化学组合物产生独特的细胞因子和趋化因子谱。所有试剂(包括细胞因子和趋化因子抗体和标准品)均购自PharMingen.(San Diego,CA)。
实施例6:
寡核苷酸的辐射敏化
使用已建立的方法(参见例如Wang,H..,Nan,L..,Yu,D.,Agrawal,S.和Zhang,R.,Clin.Cancer Res.,7:3613-3624(2001),Wang,H.,Wang,S.,Nan,L.,Yu,D.,Agrawal,S.and Zhang,R.,IntI.J.Oncol.,20:745-752(2002),Prasad,G.,Wang,H.,Agrawal,S.和Zhang,R.Anticancer Res.,22:107-116(2002),Wang,H.,Nan,L.,Yu,D.,Lindsey,J.R.,Agrawal,S.和Zhang,R.,Mol.Med.,8:184-198(2002),Wang,H.,Yu,D.,Agrawal,S.和Zhang,R.,Prostate,54:194-205(2003))来建立LNCaP、PC-3、MCF-7、MDA-MB-468、或PANC-1异种移植物的模型。简言之,MCF-7、MDA-MB-468、和PANC-1模型使用雌性无胸腺裸鼠(nu/nu,4-6周龄)。对于LNCaP体内模型,使用雄性SCID小鼠(4-6周龄),而对于PC-3模型,使用雄性无胸腺裸鼠(nu/nu,4-6周龄)。所有小鼠获自Frederick癌症研究和开发中心(Frederick,MD,USA)。将培养的细胞用无血清培养基清洗,并在相同的培养基中重悬。然后,将此悬浮液(5x106个细胞,0.2ml小鼠)注射到小鼠的左腹股沟区中。注射前将BMMx与此悬浮液以1∶1(LNCaP)或1∶5(PC-3,MCF-7、MDA-MB-468、和PANC-1)的比率组合。通过一般临床观察及通过体重和肿瘤生长来监测小鼠。通过使用测径器通过测量肿瘤的长和短直径来记录肿瘤生长。使用公式1/2a x b2来计算肿瘤质量(按g计),其中“a”和“b”分别是长和短直径(按cm计)。
在对照组(5小鼠/组)外,将携带LNCaP、PC-3、MCF-7、MDA-MB-468、或PANC-1异种移植物的小鼠随机分成多个处理组。通过以25mg/kg的剂量5次/周腹膜内(i.p.)注射(体积,5~1/g体重)来给予溶解于无菌生理盐水(0.9%NaCl)中的免疫聚物(immunomer)或无活性的免疫聚物对照。首先用70-100微升1∶6.7比率的氯胺酮(20mg/ml)和甲苯噻嗪(20mg/ml)的混合物来麻醉辐射组中的小鼠,然后在特殊设计的铅屏蔽下放置,使得仅肿瘤被暴露于辐射束。通过60CO Picker单元辐照器(JL Shepard Co.,Glendale,CA,USA)[1.56Gy/分钟]施用y-照射。动物一周两次(LNCaP)、一周四次(PC-3)、或在第2天、第4天、和第9天三次(MCF-7、MDA-MB-468和PANC-1)接受3Gy的辐射。在照射前4小时用寡聚物预处理寡聚物/辐射组合组中的小鼠。
与用盐水处理的对照相似,无活性免疫聚物对照对肿瘤生长没有影响。单独的免疫聚物化合物会显示抗肿瘤活性,单独的辐射也会。与任一单独的处理相比,与辐射组合的免疫聚物化合物会显示改善的或协同的抗肿瘤活性。
Claims (16)
1.一种免疫调节性化合物,其包含具有选自SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、10、11、12、13、14、15、16、和17的序列的基于寡核苷酸的化合物。
2.一种组合物,其包含权利要求1的免疫调节性化合物和生理学可接受载体。
3.一种用于在受试者中产生免疫应答的方法,该方法包括对所述受试者以药学有效量施用依照权利要求1的化合物。
4.一种用于治疗性处理患有调节免疫应答会是有益的疾病或病症的受试者的方法,所述方法包括对所述受试者以药学有效量施用依照权利要求1的化合物。
5.权利要求4的方法,其中所述疾病或病症是癌症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体或变应原引起的疾病。
6.依照权利要求4的方法,其进一步包括施用一种或多种化疗性化合物、靶向性治疗剂、疫苗、佐剂、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、siRNA分子、适体、核酶、TLR激动剂、激酶抑制剂、肽、蛋白质、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子、放射性同位素或电离辐射、或其组合。
8.依照权利要求6的方法,其中所述化疗剂选自:吉西他滨、氨甲蝶呤、长春花新碱、阿霉素、顺铂、含非糖的氯乙基亚硝基脲类、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、弗拉吉林、葡甲胺GLA、戊柔比星、亚硝脲氮芥和聚苯丙生、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索、格拉默来、CI-994、TNP-470、/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、/米托蒽醌、苏拉明六钠盐/苏拉明、巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马米司他、BB2516/马米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乳杆菌制剂DP 2202、FK 317、溶链菌制剂/OK-432、AD 32/戊柔比星、/锶衍生物、泰道/替莫唑胺、阿霉素脂质体/多柔比星脂质体、优他散/紫杉醇、/紫杉醇、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、西克罗派/口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR 1275/夫拉平度、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFTTM(替加氟/尿嘧啶)、左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、依立替康/左旋咪唑、/依立替康、图莫得/雷利特塞、/克拉屈滨、Paxex/紫杉醇、/多柔比星脂质体、楷莱/多柔比星脂质体、/氟达拉滨、表阿霉素/表柔比星、/阿糖胞苷、ZD1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺、LU 103793/海兔毒素、楷替/多柔比星脂质体、/吉西他滨、ZD 0473YM 116、碘接种、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、/异环磷酰胺、/美司钠、/尼泊苷、/碳铂、顺铂(Plantinol)/顺铂(cisplatin)、依托泊苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、/多西紫杉醇、鸟嘌呤阿糖苷前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂诸如苯丙氨酸氮芥和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、碳铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖胞苷、更生霉素、盐酸柔红霉素、磷雌氮芥、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(羟基尿素)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸双氯乙基甲胺(氮芥)、巯嘌呤、美司钠、米托坦(邻对滴滴滴(o.p’-DDD))、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸丙卡巴肼、链佐星、枸橼酸他莫昔芬、硫代鸟嘌呤、塞替派、长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG;丙酮双脒腙;MGBG)、喷司他丁(2’-脱氧考福霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛。
9.一种用于预防性处理有风险形成调节免疫应答会是有益的疾病或病症的受试者的方法,所述方法包括对所述受试者以药学有效量施用依照权利要求1的化合物。
10.权利要求9的方法,其中所述疾病或病症是所述受试者中的癌症、气道炎症、炎性病症、传染病、皮肤病症、变态反应、哮喘或由病原体或变应原引起的疾病。
11.依照权利要求9的方法,其进一步包括施用一种或多种化疗性化合物、靶向性治疗剂、疫苗、佐剂、抗原、抗体、细胞毒剂、变应原、抗生素、反义寡核苷酸、siRNA分子、适体、核酶、TLR激动剂、激酶抑制剂、肽、蛋白质、DNA疫苗、佐剂、共刺激分子、放射性同位素或电离辐射、或其组合。
13.依照权利要求9的方法,其中所述化疗剂选自:吉西他滨、氨甲蝶呤、长春花新碱、阿霉素、顺铂、含非糖的氯乙基亚硝基脲类、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博来霉素、多柔比星、达卡巴嗪、紫杉醇、弗拉吉林、葡甲胺GLA、戊柔比星、亚硝脲氮芥和聚苯丙生、MMI270、BAY 12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索、格拉默来、CI-994、TNP-470、/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、/米托蒽醌、苏拉明六钠盐/苏拉明、巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN 698、TA 2516/马米司他、BB2516/马米司他、CDP 845、D2163、PD183805、DX8951f、乳杆菌制剂DP 2202、FK 317、溶链菌制剂/OK-432、AD 32戊柔比星、/锶衍生物、泰道/替莫唑胺、阿霉素脂质体/多柔比星脂质体、优他散/紫杉醇、/紫杉醇、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、西克罗派/口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR 1275/夫拉平度、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFTTM(替加氟/尿嘧啶)、左旋咪唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增强剂、依立替康/左旋咪唑、/依立替康、图莫得/雷利特塞、/克拉屈滨、Paxex/紫杉醇、/多柔比星脂质体、楷莱/多柔比星脂质体、/氟达拉滨、表阿霉素/表柔比星、/阿糖胞苷、ZD1839、LU 79553/双-萘二甲酰亚胺、LU 103793/海兔毒素、楷替/多柔比星脂质体、/吉西他滨、ZD 0473YM 116、碘接种、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、/异环磷酰胺、/美司钠、/尼泊苷、/碳铂、顺铂(Plantinol)/顺铂(cisplatin)、依托泊苷(Vepeside)/依托泊苷(Etoposide)、ZD 9331、/多西紫杉醇、鸟嘌呤阿糖苷前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂诸如苯丙氨酸氮芥和环磷酰胺、氨鲁米特、天冬酰胺酶、白消安、碳铂、苯丁酸氮芥、盐酸阿糖胞苷、更生霉素、盐酸柔红霉素、磷雌氮芥、依托泊苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(羟基尿素)、异环磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH-释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸双氯乙基甲胺(氮芥)、巯嘌呤、美司钠、米托坦(邻对滴滴滴(o.p’-DDD))、盐酸米托蒽醌、奥曲肽、普卡霉素、盐酸丙卡巴肼、链佐星、枸橼酸他莫昔芬、硫代鸟嘌呤、塞替派、长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、红细胞生成素、六甲蜜胺(HMM)、白介素2、米托胍腙(甲基-GAG;丙酮双脒腙;MGBG)、喷司他丁(2’-脱氧考福霉素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸长春地辛。
14.一种用于治疗哺乳动物中的癌症的方法,包括对患有肿瘤的哺乳动物与电离辐射组合施用依照权利要求1的化合物。
15.依照权利要求14的方法,其中在第0天时施用依照权利要求1的化合物,且在第2天、第4天和第9天时以约3Gy的辐射施用辐射。
16.权利要求14的方法,其中在用电离辐射治疗前约1小时至约4天施用所述化合物。
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